Les Milieux de Cultures
Les Milieux de Cultures
Les Milieux de Cultures
Le bouillon nutritif crée un environnement liquide (absence d’agar) enrichi en éléments nutritifs et
est employé afin de favoriser la croissance et le maintien des bactéries.
La gélose nutritive présente une composition identique à celle du bouillon, à l'exception de la
présence d'agar, responsable de la solidification du milieu à température ambiante.
Le bouillon permet la croissance des bactéries permettant par la suite des repiquages et/ou la
réalisations de divers tests d'antibiorésistance, d’étude de croissance, d'identification des espèces
etc.
La gélose permet de vérifier la pureté d’une souche ou de réaliser des isolements.
Composition/principe de fonctionnement :
Pour réaliser les tests on utilise une bande en plastique contenant un certain nombre de mini-
puit (selon le type de galerie). Chaque mini-puit (tubules) contient un substrat déshydraté
selon la réaction recherchée, qui peut être :
- Un milieu de culture traditionnel ou modifié, additionné parfois d’un réactif (fer III
par exemple)
- Ou un substrat de l’enzyme recherchée (et éventuellement un inducteur de sa
synthèse)
Les tubules contiennent deux zones : une zone aérobie « cupule » et une zone anaérobie
« tube », voir schéma.
Les tubules sont ensemencées avec une culture bactérienne pure et calibrée. Pour ceux dont
l’annotation (nom du test) est encadrée, la cupule doit être remplie de manière à créer un
ménisque pour réaliser l’aérobiose. Pour les tubules dont le sigle est souligné, la cupule doit
être remplie d’huile de paraffine soit pour créer l’anaérobiose, soit pour maintenir en
solution les molécules ou ions volatiles produits par la réaction et ainsi assurer le virage de
l’indicateur coloré de pH. Les tubules dont le sigle n’est ni souligné ni encadré nécessite un
remplissage du tube uniquement. (Voir image 2 pour illustration)
Enfin, les creux du support de la galerie doivent être remplis d'eau pour former une chambre
humide, puis la galerie est posée dans le support et le couvercle par-dessus. L'ensemble est
incubé à une température adaptée pendant 24 à 48 h.
Cupule
Tube
Substrat
LECTURE :
Les tests sont groupés par trois successivement de gauche à droite et la lecture se fait en
codifiant les résultats par triplets de tubules. les derniers triplets peuvent inclure des
caractères bactériens comme la morphologie, le Gram, etc. qui ne sont pas révélés par la
galerie mais qui sont indispensables à son interprétation.
Attention, certains tests se rendent après ajout d’un révélateur (ex : test TDA se révèle avec
ajout de chlorure de fer II)
Les tests rendant un résultat négatif sont toujours codés 0 alors que le code affecté aux tests
positifs varie selon la position du test dans le triplet : 1 pour le premier test, 2 pour le
second, 4 pour le troisième.
Les 3 résultats du triplet sont additionnés et donne un chiffre compris en 0 et 9 pour chaque
triplet.
L’ensemble des chiffres obtenu pour chaque triplet forme un code d'au moins 7 chiffres qui
correspond au profil biochimique du micro-organisme étudié.
Le code obtenu est ensuite entré dans la base de données gérée par la société ‘’Biomérieux’’
qui rend alors une identification de la bactérie.
Rq : La plupart des souches d’Haemophilus spp ne poussent pas sur la gélose au sang frais du a l’absence
NAD=facteur V (voir gélose chocolat). S. aureus produit le NAD comme sous-produit métabolique lorsqu’il
pousse dans un milieu de culture contenant du sang. Par conséquent, Haemophilus spp peut croître sur
la gélose au sang de mouton très près des colonies de Staphylococcus aureus, ce phénomène est connu
sous le nom de Satellitisme.
Étude de caractère hémolytique :
L'un des avantages significatifs de la gélose au sang est sa capacité à favoriser la croissance
d'organismes pathogènes qui produisent des enzymes extracellulaires capables de provoquer
une hémolyse.
En observant les schémas d'hémolyse produits par les bactéries en croissance, les
microbiologistes peuvent mieux comprendre les caractéristiques et la virulence des organismes
étudiés.
Les trois principaux types d’hémolyse sont α- hémolyse, β-hémolyse et γ-hémolyse.
γ-hémolyse est en fait non-hémolyse et apparaît comme une croissance simple sans
changement dans le milieu.
Hémolyse β Hémolyse α
Culture de Streptocoque A Culture de Streptococcus pneumoniae
sur gélose au sang sur gélose au sang
24h à 37°C en atmosphère enrichie en 24h à 37°C en atmosphère enrichie en
CO2 CO2
Hémolyse γ
Culture de Staphylococcus sur gélose au
sang.24h à 37°C en atmosphère.
GELOSE BAIRD PARKER
Intérêt d’utilisation :
Milieu sélectif utilisé pour l’identification et le dénombrement de Staphylococcus aureus.
Sur ce milieu les colonies de Staphylococcus aureus sont noires et brillantes (réduction du
tellurite), avec un fin liseré blanc, entouré d'une zone claire (lecithinase).
Les staphylocoques à coagulase négative sont presque totalement inhibés et si, cependant,
une culture apparaissait, les zones d’éclaircissement seraient absentes (pas de lecithinase).
Composition :
- Peptone de caséine 10g
- Extrait de viande 5g
- Extrait de levure 1g
- Chlorure de lithium 5g
- Glycine 12g
- Pyruvate de sodium 10g
- Agar 20g
Solution de jaune d’oeuf 50ml
Tellurite de potassium à 10g/l 10ml
pH 7,2
Principe de fonctionnement :
La glycine et le chlorure de lithium : ont une action inhibitrice contre des organismes autres que
le Staphylococcus aureus.
Le pyruvate de sodium : Stimule la croissance du Staphylococcus aureus sans détruire la
sélectivité du milieu de culture.
L'additif tellurite : Près de 100% des Staphylocoques à coagulase positive sont capables de
réduire la tellurite, qui produit des colonies noires
Le jaune d'œuf : a un rôle enrichissant mais permet également aux staphylocoques qui
contiennent de la lécithinase de décomposer le jaune d'œuf (lipolyse) et créer des zones claires
autour des colonies.
COMPOSITION
PRINCIPE ET LECTURE
La présence de lactose et de bromocrésol pourpre permet de connaitre le caractère lactose des
bactéries.
• Le milieu vire au jaune ou coloration jaune des colonies : acidification du milieu par
fermentation du lactose = lactose +
• Le milieu reste violet : pas d’acidification du milieu = lactose –
Généralités Composition
La gélose BCYE (Buffered Charcal Yeast
Extract) est une gélose non sélective
GVPC
utilisée
pour la culture des Legionella. composition gélose GVPC
ingrédients gramme/litre
Cette gélose non sélective ne convient pas Extrait de levure 10g
pour la recherche des Legionella dans les Charbon activé 2,0g
prélèvements plurimicrobiens, comme les Tampon ACES/KOH 12,8g
sécrétions bronchopulmonaires. Il faut alors 2-oxoglutarate 1,0g
ensemencer une gélose sélective, appelée Pyrophosphate Ferrique 0,25g
GVPC, qui correspond à une gélose BCYE Chlorhydrate de cytéine 0,4g
dans laquelle ont été ajouté de la glycine, de Glycine 3,0g
la vancomycine, de la polymyxine B et du Polymixine B 80kUI
cycloheximide. Vancomycine 1mg
Cycloheximide 80mg
La vancomycine inhibe les bactéries à Gram
Agar 12,0g
positif alors que la polymyxine B inhibe une très
grande partie des bactéries à gram négatif. Le pH=6,8
cycloheximide inhibe de nombreuses levures et Eau distillée qsp 1L
La gélose BCYE est généralement brun-noir et contient du
moisissures. charbon actif, ce qui luidonne une couleur sombre.
BCYE
Fonctionnement/lecture Microorganisme
Les Legionella sont des bactéries très Caractéristiques macro et microphénotypiques :
exigeantes, elles ont par exemple besoin pour
leur croissance de milieux contenant du fer et de Les bactéries du genre Legionella sont des
la cystéine. bacilles Gram négatif.
Généralités Composition
Gélose Cetrimide, ou gélose pseudomonas Cetrimide, Suspendre les composants, poudre déshydratée, dans l'eau
est un milieu sélectif et différentiel utilisé pour l'isolement (45,3 g dans 1000 ml d'eau purifiée/distillée). Ajouter 10 ml
et l'identification de Pseudomonas aeruginosa à partir de glycérol et faire bouillir pour dissoudre complètement.
d'eau et d'échantillons cliniques. Stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
Refroidir le milieu à environ 50°C et verser dans des boîtes
Le cétrimide est un composé d'ammonium quaternaire de Petri stériles.
ayant une activité bactéricide contre un large éventail
d'organismes Gram-positifs et certains organismes
Gram-négatifs, y compris des espèces de pseudomonas
autres que Pseudomonas
composition
aeruginosa .
ingrédients gramme/litre
peptone de gélatine 20g
Chlorure de magnesium 1,4g
Pyoverdine
Sulfate de potassium 10g
Cétrimide 0,3g
Pyocyanine Glycérol 10ml
Gélose 13,6g
Fonctionnement/lecture Microorganisme
Le pouvoir sélectif repose sur le cétrimide, un
ammonium quaternaire capable d’inhiber un très grand
nombre de bactéries. Cette gélose devient hautement
sélective de Pseudomonas aeruginosa si on l’incube à
42°C. Cette gélose existe avec ou sans acide
nalidixique.
Gelose cétrimide sous UV
Caractéristiques macrophénotypiques :
P.aeruginosa peut être identifié en raison de sa Forme et structure : Pseudomonas aeruginosa est une
production caractéristique de pyocyanine, un pigment de bactérie Gram négative, généralement en forme de
phénazine bleu, soluble dans l'eau et non fluorescent, bacilles(bâtonnets) droits.
couplé à sa morphologie coloniale et à l'odeur Mobilité : Elle est généralement mobile grâce à ses
caractéristique de raisin de l'aminoacétophénone. flagelles.
Croissance : Elle se développe facilement dans divers
Sur ce milieu, les souches de Pseudomonas aeruginosa milieux de culture, y compris les milieux sélectifs comme la
produisent également un autre pigment, appelé gélose au cetrimide.
pyoverdine ou fluoresceine. Ce pigment jaune-vert est Caractéristiques microphénotypiques :
fluorescent lorsque les cultures sont placées sous Pigmentation : Pseudomonas aeruginosa est souvent
lampe UV. pigmentée, produisant des pigments tels que la pyocyanine
(bleu-vert), la pyoverdine (jaune-vert) et la pyorubine(rouge).
Le chlorure de magnésium et le sulfate de Oxydase-positivité : Cette bactérie est oxydase-positive, ce
dipotassium améliorent la production de pigments de qui signifie qu'elle possède l'enzyme cytochrome c oxydase.
pyoverdine et de pyocyanine qui se combinent pour Production d'enzymes : Pseudomonas aeruginosa est
donner des colonies vertes caractéristiques de connue pour produire une variété d'enzymes telles que des
Pseudomonas aeruginosa. protéases, des lipases, des exotoxines, et d'autres facteurs
de virulence.
Résistance aux antibiotiques : Elle peut développer une
La peptone de gélatine fournit les nutriments
résistance à de nombreux antibiotiques, ce qui la rend
nécessaires à P.aeruginosa. Le chlorure de sodium
parfois difficile à traiter.
maintient l'équilibre osmotique dans le milieu.
Maladies associées à Pseudomonas aeruginosa :
Infections nosocomiales/ Infections respiratoires/
Infections cutanées/ Infections urinaires/ Sepsis et
infections sanguines
gélose de Chapman
Définition et composition :
La gélose Chapman est un milieu d’isolement sélectif utilisé pour la recherche des Staphylococcus.
Il peut être utilisé par exemple lors de l’analyse des selles, des prélèvements ORL oudes suppurations
cutanées.
Ce milieu est à la fois une gélose sélective et différentielle. Le milieu sélectionnera des organismes qui
peuvent vivre dans des zones à forte concentration en sel (chlorure de sodium) et la fermentationdu
mannitol, mise en évidence par le virage au jaune de l’indicateur pH (rouge de phénol), permet
d’orienter le diagnostic.
Principe :
• La sélectivité de ce milieu est basée sur la présence de chlorures de sodium (7.5%) qui inhibe
la plupart des bactéries à Gram négatif et à Gram positif.
• La différenciation est basée sur la capacité à fermenter ou non le mannitol (le seul sucre du
milieu). S'il y a fermentation, cela induit une acidification qui entraîne, à des niveaux de PH
inférieurs à 6.9, une coloration jaune du milieu en présence de rouge de phénol (indicateur
de PH)
Ensemencement et incubation :
Ensemencer en stries directement à partir de l’échantillon à étudier. Et incuber pendant 24 à 48h à
37° Celsius.
Interprétation :
Les staphylocoques aureus forment des colonies luxuriantes, pigmentées, entourées d’une
auréole jaune due à la fermentation du mannitol. Les staphylocoques non pathogènes forment
en général depetites colonies rouges qui ne modifient pas la teinte du milieu.
Note : le changement de couleur du milieu démontre la fermentation du mannitol, PAS la
couleur dela colonie. Ceci est particulièrement important car de nombreux microcoques sont
pigmentés.
Plusieurs espèces de Staphylococcus autres que S. aureus sont positives au mannitol et
produisent des colonies de couleur jaune entourées de zones jaunes (ex: S. capitis, S. xylosus,
S. cohnii, S. sciuri,
S. simulans..). Par conséquent, des tests biochimiques supplémentaires sont nécessaires à
l’identification de S. aureus ou d’autres espèces
A. Staphylococcus aureus : Un grand
halojaune autour de la croissance
indique la
fermentation du mannitol.
B. Staphylococcus epidermidis :
Croissancemais pas de changement de
couleur du milieu indiquant l'absence de
fermentation du mannitol.
C. Staphylococcus saprophyticus: Un
petit halo jaune autour de la croissance
indique lafermentation du mannitol. (10
% de S.
saprophyticus fermentent le mannitol
-Chapman avec oxacilline peut être utilisé pour dépister la présence de SARM
(Staphylococcus aureus Résistant à la Methicilline) dans les échantillons nasaux, car le sel à
7,5% et 6 g d'oxacilline dans ce milieu inhibent la plupart des autres organismes qui
colonisent normalement les narines.
- L'ajout de 5% v/v d'émulsion de jaune d'œuf permet la détection de l'activité lipase des
staphylocoques ainsi que la fermentation du mannitol. Le sel nettoie l'émulsion de jaune
d'œuf et la production de lipase est détectée sous la forme d'une zone opaque jaune autour
des colonies.
-Les entérocoques et les streptocoques du groupe D peuvent se développer sur ce milieu et
présenter une légère fermentation du mannitol. Cependant les colonies sont petites et peuvent
facilement êtredifférenciées des staphylocoques par coloration de Gram ou par le test de la
catalase.
La gélose citrate de Simmons
INTÉRÊT
La gélose citrate de Simmons est un milieu de culture pour la différenciation des bactéries gram
négatives sur la base de l'utilisation comme la seule source de carbone du citrate.
COMPOSITION
PRINCIPE
Seules les bactéries possédant une citrate perméase ( enzyme) peuvent utiliser le citrate comme
seule source de carbone.
La lecture de l’utilisation du citrate comme seule source de carbone est possible grâce à la présence
d’un indicateur de pH, le bleu de bromothymol.
L'oxydation du citrate entraîne la libération de CO2 volatil et la consommation de H+ : Il en résulte une
alcalinisation du milieu ( le pH augmente) révélée par le virage du bleu de bromothymol à sa teinte
basique (bleu).
TECHNIQUE
Bactéries citrate + :
klebsiella pneumoniae, Enterobacter, Citrobacter, Providencia, Proteus mirabilis, Serratia, vibrio
cholerae, Pseudomonas, Salmonella enteritidis et membres des sous-genres Salmonella II, III et IV.
Bactéries citrate - :
Escherichia coli, Shigella, Yersinia, Edwardsiella
la gélose“CLED”
Cystine-Lactose-Electrolytes Déficient
Composition La gélose CLED est composée de: peptones, extrait de viande, L-cystine (la L-cystine est un
acide aminé soufré), lactose, Bleu de Bromothymol (indicateur de pH), agar et d’eau
distillée..
Principe Fonctionnement : Lecture :
de fonctionnement/ -Bactéries lactose (+) alors les colonies
• Il favorise la croissance des agents
lecture sont jaunâtres.
pathogènes urinaires, tout en permettant
Escherichia, Citrobacter, Enterobacter,
d’éviter les phénomènes d’envahissement
Klebsiella ...
par les Proteus de part la faible teneur en
électrolytes du milieu.
-Bactéries lactose (-) alors les colonies
• Le milieu permet une détermination sont vertes, bleues ou incolores.
quantitative des pathogènes urinaires dont Serratia, Salmonella, Shigella, Proteus,
“Proteus” lorsque des anses calibrées sont Providencia, Yersinia, Pseudomonas,
utilisées pour l’inoculation. Staphylococcus, Enterococcus …
Maladies associées Les bactéries qui se développent au milieu de géloses CLED peuvent être responsables
de différentes infections urinaires. Par exemple, la cystite est une infection de la vessie qui
peut provoquer des douleurs et des envies fréquentes d'uriner. La pyélonéphrite, quant à elle,
est une infection des reins qui peut entraîner de la fièvre, des douleurs lombaires et une
sensation de malaise général.
Figure :
A : Proteus vulgaris (coloration bleue par décalage du pH vers >7,6)
B : Escherichia coli (coloration jaune verdâtre par production d’acide due à la
fermentation du lactose)
GELOSE MAC CONKEY
Intérêt de l’utilisation
C’est un milieu sélectif des Enterobacteriacea et bacilles GRAM négatif. La base nutritive est
ordinaire, seules les bactéries non exigeantes y sont cultivées. Le désoxycholate de sodium et le
cristal violet inhibe la croissance des bactéries à Gram positif. Son utilisation est généralement
recommandée pour le diagnostic des infections urinaires et pour la recherche d’Escherichia coli
dans l’eau, les aliments, les produits laitiers et les préparations pharmaceutiques.
La composition
• Si le milieu est incolore ou jaune, il n’y a donc pas d’acidification du milieu. Il n’y a pas
de fermentation du lactose, les colonies sont donc des bactéries non- fermentatrice de
lactose.
Espèces bactériennes
Enterobacter aerogenes ; Klebsiella pneumoniae ; Pseudomonas aeruginosa ;Klebsiella
oxytoca ; Escherichia Coli ; Bacillus cereus.
Macro phénotypique Micro phénotypique
Enterobacter Colonies collantes Bacille Gram négatif, mobile,
aérogènes d'apparence humide, asporulée.
Circulaires, bombées, rose
clair
Maladies provoquées
- Enterobacter aerogenes à infections nosocomiales (bactériémie, pneumonie,
méningite).
- Klebsiella pneumoniae à Maladie respiratoire comme pneumonie et d'abcès
pulmonaires d'origine communautaire ou nosocomiale.
L'infection du lobe supérieur est plus fréquente.
- Pseudomonas aeruginosa à infections externes mineures à des maladies graves,
aggravé par d’autre pathologie grave.
- Klebsiella oxytoca à infections respiratoire ou urinaires, de bactériémies et
d'infections neuro-méningées post traumatiques ou post-chirurgicales.
- Escherichia Coli à diarrhées sanglantes, productrice de toxine à l’origine du
syndrome hémolytique et urémique.
GELOSE MUELLER-HINTON
DEFINITION
La gélose de Mueller-Hinton est utilisé comme milieu de référence pour réaliser la technique
d’antibiogramme sur gélose ou bien comme milieu de base pour préparer tout inoculum
bactérien.
Elle peut également être enrichie en facteur de croissances et/ou en sang afin de réaliser
l’antibiogramme des germes fragiles.
PRINCIPE
La précision des résultats d’antibiogramme est assurée par la standardisation de la composition
du milieu utilisé. C’est une gélose libre, qui contribue à réguler le taux de diffusion des
antibiotiques plus efficacement que les autres types de milieux. Des variations de pH, de
concentration en cations divalents ou/et en thymidine peuvent entraîner des différences dans
les résultats obtenus. Par conséquent, le bouillon Mueller-Hinton Bio-Rad est faiblement
concentré en thymine et en thymidine et la concentration en calcium et en magnésium est
contrôlée. Cette formulation permet d'assurer l'exactitude de Concentrations Minimales
Inhibitrices (CMI) obtenues avec les souches de contrôle recommandées par les références
internationales.
COMPOSITION ET PREPARATION
La composition peut être ajustée afin d’avoir les performances optimales. Sa formule type
pour 1L de milieu :
- Hydrolysat acide de caséine… 17,5g
- Extrait de viande… 2,0g
- Amidon soluble… 1,5g
- Agar agar bactériologique… 17,0g
Afin d’être prête à l’emploi, son pH doit être de 7,3 +/- 0,1 à 25°C.
Dissoudre les 35g de poudre, dans 1L d’eau distillée. Porter à ébullition jusqu’à l’obtention d’une
dissolution complète. Refroidir à 47°C, bien mélanger. Enfin, répartir en tubes ou flacons et
stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.
PROTOCOL D’UTILISATION
- Utiliser une culture pure de la souche, présentant l’opacité standard d’une suspension
de sulfate de Baryum. ( densité 0,5 sur l’échelle de Mac ).
- Plonger un écouvillon dans la culture, et ensemencer sur la gélose 2 à 3 fois, en la
tournant de 60° à chaque passage, afin d’obtenir un ensemencement homogène.
- Laisser sécher les boites 10 minutes.
- Poser les disques imprégnés de quantités spécifiques d’antibiotiques ou autres agents
antimicrobiens de sorte à ce qu’ils adhèrent bien à la gélose. Ils doivent être déposés à 15mm
minimum de la périphérie de la boîte de manière à ce que les zones d’inhibition ne se
chevauchent pas.
- Incuber à 37°C durant 18 à 24 heures.
Il faut mesurer la zone d’inhibition puis se reporter aux tableaux d’interprétation des zones
d’inhibition fournis par les fabricants de disques d’antibiotiques afin d’établir la corrélation entre
la zone d’inhibition et la concentration minimale inhibitrice. En général, plus la zone d’inhibition
est grande, plus l’agent antimicrobien a été efficace.
GELOSE TSI
UTILISATION
Le milieu TSI (Triple Sugar Iron) est un milieu combiné, utilisé surtout pour l’identification
présomptives des Entérobactéries basé sur la fermentation du glucose du lactose du
Saccharose la production H2S et la formation de gaz.
Ce milieu présente une pente ou un culot de couleur jaune, rouge ou noir.
COMPOSITION
- Production de gaz :
Produit un décollement de la gélose au fond du tube.
- Production d’H2S :
La production d’H2S se fait seulement en milieu acide donc la bactérie étant capable de
produire du sulfure de dihydrogène à partir du thiosulfate de sodium aura aussi métaboliser
le glucose, ce qui entrainera la formation d’un précipité noir dans le culot même si le milieu
est censé être jaune.
LECTURE ET INTERPRETATION
Intérêt d’utilisation :
Le milieu viande foie (VF) permet de déterminer le type respiratoire d’une bactérie, c’est-à-
dire définir son comportement vis-à-vis du dioxygène.
Composition :
Pour 1 L de milieu viande foie préparé en tube pour la détermination du type respiratoire :
- Base viande foie (30,0 g) : généralement de la viande hachée provenant d'animaux,
tels que du bœuf ou de l'agneau. La viande fournit des nutriments riches en protéines
et en facteurs de croissance pour les bactéries. Le foie riche en nutriments essentiels,
tels que des vitamines, des acides aminés et des sels minéraux, qui favorisent la
croissance des bactéries.
- Agar (6,0 g) : gélifiant extrait d'algues marines. Il est ajouté à la gélose viande-foie pour
solidifier le milieu et créer une surface solide sur laquelle les bactéries peuvent se
développer.
- Glucose (2,0 g) : source d’énergie
- A pH 7,4
Principe de fonctionnement :
On dissout 38g de poudre de milieu par litre puis on procède à un autoclavage classique.
L'autoclave est un stérilisateur à vapeur, il utilise la chaleur humide sous forme de vapeur
saturée sous pression pour arriver à une température supérieure au point d'ébullition, jusqu'à
135-137°C. Le milieu est donc stérilisé mais l’eau ne boue pas et préserve ainsi les ingrédients.
Lecture :
Le tube présente deux zones dans lesquelles la composition en oxygène est différente. Les
bactéries en fonction de leur type respiratoire vont se développer dans une ou dans les deux
zones.
La lecture des résultats se fait comme illustrée dans l’image ci-dessous :
La gélose viande-foie peut être utile pour la culture de germes anaérobies stricts telles que les
Clostridium :
Caractères macro phénotypique :
- Grandes colonies
- Odeur très intense
- Caractère hémolytique (induit la destruction des globules rouges)
- Souvent mobile
Caractères micro phénotypique :
- Genre sporulant (spores sub-terminaux à terminaux déformants visibles par
colorationnégative ou par coloration positive : vert malachite 5 %)
- Oxydase négative : ne possède pas l’enzyme cytochrome c oxydase.
Maladies associées :
Quelques espèces sont toxigènes et peuvent causer des maladies non contagieuses résultant
de l'introduction accidentelle dans l'organisme du germe et de sa toxine. Les 4 maladies
principales en sont le botulisme, le tétanos, la gangrène gazeuse et l'entérotoxémie.
LES GELOSES SANG CUIT « CHOCOLAT »
DEFINITION
Les géloses chocolat sont des géloses au sang frais (Voir fiche gélose sang) que l’on « cuit »
sous agitation dans un bain Marie à 80 °C.
PRINCIPE
La cuisson la lyse des globule rouge qui relargue dans le milieu des nutriment notamment le
NAD (Facteur V) et l’oxydation de l’hémoglobine (facteur X) c’est ce qui donne la couleur
marron.
Ces gélose sont utilisées la culture et l'isolement de microorganismes exigeants qui ne
cultivent pas ou mal sur gélose au sang frais telque Neisseria gonorrhoeae et Haemophilus*.
*Par exemple : La culture de Haemophilus dépend de la présence du Facteur V (non présent
dans le milieu dans la gélose au sang frais)
VARIANTE
La gélose au chocolat
Application
La gélose au Chocolat est obtenue en ajoutant au milieu de base une solution
d'hémoglobine et non du sang frais.
Composition
La gélose chocolat est préparée à un Ph = 7,2
Ingrédients Gm/L
Peptone trypsique de caséine 7.5
Peptone pepsique de viande 7.5
Fécule de maïs 1.0
Phosphate de potassium, dibasique 4.0
Phosphate de potassium,
monobasique 1.0
Chlorure de sodium 5.0
Hémoglobine 10.0
Agar 15.0
Utilisation
Son utilité augmente en particulier lors de l'ensemencement d'échantillons normalement
stériles, tels que le Liquide céphalo rachidien et le liquide articulaire.
SUPPLEMENTATION
• Les géloses chocolats peuvent être supplémentées en facteur inhibiteur tels que des
antibiotiques
•
Cas des Neisseria
Le milieu utilisé, nommé Thayer et Martin, est une gélose Chocolat supplémentée en vitamines
additionnée de, pour 1 L de milieu :
Vancomycine : 3,0 mg
Colimycine: 7,5 mg
Fungizone = Amphotéricine B : 2,0 mg
et parfois de Trimetroprime
L'addition des inhibiteurs est réalisée avec celle du supplément.
La vancomycine inhibe de nombreux Gram +, la Colimycine de nombreux Gram - et
l'amphotéricine les champignons, en particulier les levures du genre Candida.
-Haemophilus influenzae :
méningites, bactériémies, arthrites septiques, pneumonies, trachéobronchites, otit es
moyennes aiguës, conjonctivites, sinusite et épiglottites aiguës
-Haemophilus influenzae sont des bactéries Gram négatives pouvant provoquer une
infection des voies respiratoires, qui peut se propager à d’autres organes, méningite,
épiglottite (infection d’une partie du tissu recouvrant le larynx)
LA GELOSE BEA
UTILISATION
La gélose à la bile, à l’esculine et à l’azide de sodium (BEA) est un milieu d’isolement
sélectif des bactéries du genre Enterococcus. .
COMPOSITION
PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT
• L'azide de sodium provoque l’inhibition des bactéries contaminantes à Gram négatif.
• La bile de bœuf empêche la croissance des bactéries à Gram positif.
• Les entérocoques hydrolysent l'esculine en glucose et en esculétine. l’hydrolyse de
l’esculine est révélée par le citrate de fer ammoniacal : réaction entre le produit de
dégradation de l’esculine et les ions Fer III formant d’un précipité noir.
LECTURE
les colonies typiques des entérocoques présentent de petites colonies translucides et un
halo brun à noir.
ATTENTION : Les staphylocoques et les levures peuvent donner des colonies opaques sans
halo noir. Il est indispensable d’identifier les microorganismes suspects, notamment pour
écarter toute confusion avec les Listeria qui peuvent donner des colonies similaires à celles des
entérocoques.
PATHOGENE TYPE ET MALADIES ASSOCIES
Les entérocoques font partie de la flore intestinale normale. Ce sont des bactéries non mobile,
anaérobies facultatifs à Gram positif. Enterococcus faecalis et E. faecium provoquent toute
une gamme d'infections, dont des endocardites, des infections urinaires, des prostatites, des
infections intra-abdominales, une cellulite et des infections de plaies, ainsi que des
bactériémies concomitantes.
LA GELOSE CIN
UTILISATION
La gélose Yersinia CIN (Cefsulodine-Irgasan-Novobiocine) permet l’isolement sélectif de
Yersinia enterocolitica.
COMPOSITION
Peptone de viande
Peptone de caséine
Extrait de levure
Mannitol Mélange CIN :
Pyruvate de sodium Cefsulodine 15 µg
Chlorure de sodium Irgasan 4 µg
Sulfate de magnésium Novobiocine 2,5 µg
Mélange de sels biliaires
Rouge neutre
Cristal violet
Agar
PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT
L'orientation diagnostique de Yersinia enterocolitica est basée sur sa capacité à fermenter
le mannitol. Cette fermentation induit une acidification du milieu qui provoque une
coloration rouge du centre des colonies en présence de rouge neutre (indicateur de pH).
Cette acidification peut aussi induire la formation d'une zone de précipitation des sels
biliaires autour de la colonie.
LECTURE
Caractéristiques microphénotypiques
• Enzymes produites : uréase (enzyme qui permet de résister à l’acidité de l’estomac)
permet de distinguer Y. enterolitica de Yersinia pestis (uréase négative)
MALADIE
3e cause de diarrhée bactérienne en France
• Entérite aiguë
• Entérocolite
• Iléite terminale
LA GELOSE HEKTOEN
UTILISATION
La gélose Hektoen est un milieu d’isolement sélectif des bacilles à Gram négatif non
exigeants et utilisé pour la recherche des Salmonella et des Shigella dans les selles.
COMPOSITION
Peptone: Source d’Azote et de nutriments ( 12g )
Lactose ( 12g )
Saccharose ( 12g ) sucres
Salicine ( 2g )
Désoxycholate de sodium ( 9g ) Inhibiteurs de la
fuchsine acide ( 100mg ) croissance des bactéries Gram-positives.
Extrait de viande: Fournit des éléments nutritifs.
Bleu de bromothymil ( 65mg )
Rouge neutre (5g), Indicateur différentiel
Vert brillant (5g)
Thiosulfate de sodium (5g ):
Extrait de levure ( 3g )
Citrate ferrique ammoniacal ( 5g ) Chlorure de sodium ( 5g )
Agar ( 15g )
Eau distillée ( qsp 1L )
Ph ( 7,5 )
PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT
Le désoxycholate de sodium inhibe la croissance des bactéries à Gram positif.
Ce milieu permet de détecter simultanément l’utilisation du lactose, du saccharose et de la
salicine. Cette utilisation se traduit par une acidification et donc un virage du bleu de
bromothymol au jaune.
LECTURE
Avec 3 glucides, ce milieu est davantage discriminant que les milieux contenant seulement le
lactose comme la gélose SS.
Ainsi Hecktoen permet de différencier Proteus vulgaris qui est lactose – et saccharose + des
Salmonella lactose – et saccharose - alors que la gélose SS ne le permet pas.
Le thiosulfate de sodium est une source de souffre à partir de laquelle certaines bactéries
forment du sulfure d’hydrogène (H2S). Ce dernier réagit avec les ions ferriques pour former
un précipité noir de sulfure de fer.
PATHOGENE TYPE
S. flexneri
Entérobactéries Gram négatifs, immobiles ; dépourvus de spores. Certaines souches de
certaines espèces peuvent être dotées d'une capsule.
Les souches se différencient sur un plan antigénique par la structure de l'antigène O. Il n'y a
pas d'antigène H, les Shigelles étant dépourvues de cils.
MALADIE
La shigellose ou dysenterie bacillaire est une maladie infectieuse d'origine bactérienne. Elle
est causée par l'un des divers types de la bactérie Shigella. La shigellose est caractérisée par
une gastro-entérite aiguë, dont les selles sont habituellement accompagnées de sang et de
mucus, causés par des abcès des parois intestinales, provoqués par l'envahissement de ces
bactéries.
LA GELOSE PALCAM
UTILISATION
La gélose PALCAM est un milieu sélectif utilisé pour la différenciation et l’isolement de
Listeria monocytogenes et des autres Listeria
COMPOSITION
La composition peut être ajustée de façon à obtenir des performances optimales.
Pour 1 litre de milieu complet :
- Peptones ........................................................................... ..................23,00 g
- Extrait autolytique de levure ................................................................. 3,00 g
- Glucose ................................................................................................. 0,50 g
- Amidon. ................................................................................................ 1,00 g
- D-mannitol ........................................................................................... 10,00 g
- Esculine. ............................................................................................... 0,80 g
- Citrate ferrique ammoniacal. ................................................................ 0,50 g
- Chlorure de sodium ............................................................................. 5,00 g
- Chlorure de lithium.. ............................................................................ 15,00 g
- Polymyxine B sulfate ......................................................................... 10,0 mg
- Ceftazidime... ..................................................................................... 20,0 mg
- Acriflavine. ............................................................................................ 5,0 mg
- Rouge de phénol .................................................................................. 0,08 g
- Agar agar bactériologique ................................................................... 10,00 g
PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT
Le principe sur la recherche du caractère esculinase + de L.monocytogenes et son caractére
mannitol negatif.
• La fermentation du mannitol par les germes contaminants qui pourraient cultiver est
mise en évidence par le virage au jaune du rouge de phénol, permettant ainsi
d’orienter le diagnostic. L. monocytogenes ne présentera pas le virage et le milieu
apparait jaune.
Les peptones et l’extrait de levure favorisent une excellente croissance des Listeria.
Le glucose et l’amidon représentent les sources énergétiques de la croissance bactérienne.
Le chlorure de sodium maintient l’équilibre osmotique.
LECTURE
Après 24 ou 48 heures d’incubation, les Listeria forment des colonies vert-olive à centre
concave typique, entourées d’un halo noir. Lorsque les colonies sont confluentes, le milieu
de culture prend une couleur brun noir.
La gélose PALCAM est très sélective, cependant il est parfois possible d’observer des cultures
de staphylocoques ou d’entérocoques. Ces microorganismes contaminants fermentent le
mannitol en produisant des colonies jaunes (avec une auréole jaune), se différenciant ainsi
aisément des colonies de Listeria.
MALADIE
Listeriose : fièvre plus ou moins élevée, accompagnée de maux de tête et, parfois, de
troubles digestifs (nausées, diarrhées, vomissements, etc.). Des complications neurologiques
(méningite, encéphalite).
LA GELOSE SABOUREAU
UTILISATION
La gélose Sabouraud est une gélose non sélective utilisée pour cultiver en microbiologie
médicale, les levures, les moisissures et les dermatophytes (champignon de la peau).
COMPOSITION
• Peptone.................... 10 g
• Glucose massé.............. 20 g
• Agar-agar.................. 15 g
• Eau distillée (qsp)........ 1 000 ml
• vitamines et facteurs de croissance
• pH = 6,0
• Antibiotiques diverses
PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT
C’est une gélose glucosée présentant un pH légèrement acide (5,6) pour favoriser la culture
des champignons.
Cependant l’acidité du milieu ne suffit pas pour inhiber la croissances de toutes bactéries.
Pour rendre ce milieu sélectif des champignons, on ajoute un ou plusieurs antibiotiques à
large spectre, voir un antifongique pour isoler les dermatophytes.
Ainsi, il existe :
la gélose Sabouraud + chloramphénicol (inhibe GRAM +)
la gélose Sabouraud + chloramphénicol + gentamicine (inhibe GRAM-).
Enfin, on peut aussi ajouter de l’actidione (cycloheximide) pour inhiber les moisissures et
certaines espèces de levures et permettre plus facilement d’isoler les dermatophytes. La
gélose alors utilisée est souvent une gélose Sabouraud + chloramphénicol + gentamicine +
actidione.
Levures :
Cryptococuss neoformans
Moisissures :
Aspergillus niger
MALADIES
- Candida albicans : Candidose
- Aspergillus : Aspergillose
-Cryptococcus neoformans : Cryptococcose
LA GELOSE SELECTIVES CAMPYLOBACTER
UTILISATION
Les géloses sélectives des Campylobacter sont toutes des géloses riches contenant des
antibiotiques et un antifongique. Elles sont utilisées principalement pour la recherche des
Campylobacter dans les selles.
COMPOSITION
Les géloses contiennent du sang (sang de mouton ou sang de cheval laqué) permettant à la
fois d’enrichir le milieu et de neutraliser les dérivés oxygénés toxiques produit par
campylobacter lors de la culture.
Dans cetains milieu le sang a été remplacé par du charbon activé (gélose Karmali et la gélose
CCDA)
PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT
Basé sur les agents sélectionnant qu’ils contiennent, Il existe plusieurs types de géloses
campylobacter
GRAM +
GRAM -
Antifongiques
Agents sélectifs utilisés dans différents milieux de culture sélectifs des Campylobacter
LECTURE
PATHOGENE TYPE
Campylobacter jejuni
Caractéristiques Macro-Phénotypiques :
Caractéristiques microphénotypiques :
Type Microscopique : Bacilles en forme de spirale.
Forme : Courbées, en spirale, en forme de virgule.
Mobilité : Hautement mobiles, souvent avec des mouvements en spirale.
MALADIE
- Campylobactériose : infections gastro-intestinales humaines souvent liées
à la consommation de produits contaminés.
LA GELOSE SS
UTILISATION
La gélose Salmonella Shigella (SS) est un milieu d’isolement sélectif, inhibant les bactéries
à Gram positif et utilisé pour la recherche des Salmonella dans les selles.
COMPOSITION
PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT
Les sels biliaires associés au vert brillant inhibent la culture des bactéries à Gram positif et
partiellement celle de certaines bactéries à Gram négatif.
La gélose Salmonella Shigella, porte mal son nom. Initialement utilisée à la fois pour la
recherche des Salmonella et des Shigella, elle s’avère peu performante pour la culture des
Shigella. Les Shigella cultivent beaucoup mieux sur la gélose Hektoen.
LECTURE
Le thiosulfate de sodium est une source de souffre à partir de laquelle certaines bactéries
forment du sulfure d’hydrogène (H2S). Ce dernier réagit avec les ions ferriques pour former
un précipité noir de sulfure de fer.
• les Salmonella forment des colonies incolores avec ou sans centre noir : Lactose –
et H2S + ou –
• les Shigella forment des colonies incolores sans centre noir : Lactose – et H2S –
• les coliformes dont Escherichia coli forment des colonies rouges/roses : Lactose + et
H2S –
Ce milieu contenant un seul glucide (le lactose) est moins discriminant que le milieu Hektoen
qui en contient 3 (lactose, saccharose et salicine).
Culture mixte de
Salmonella (Lactose- H2S+) et
Escherichia coli (Lactose+ H2S-)
Culture mixte de
Shigella (Lactose- H2S-) et
Escherichia coli (Lactose+ H2S-)
PATHOGENE TYPE
S. enterica
Entérobactéries bacilles à Gram négatif, mobiles pour la plupart (ciliature péritriche)
(certaines sont immobiles), aéro-anaérobies facultatifs, oxydase -, nitrate réductase +,
fermentative du glucose, lactose -, H2S + (ou - 9), uréase -, lysine décarboxylase +, utilisant la
voie des acides mixtes, indole-, ne possédant pas la bêta-galactosidase, à forte contagiosité,
responsables de gastro-entérites, toxi-infections alimentaires et des fièvres typhoïde et
paratyphoïde (S. Typhi et S. Paratyphi).
UTILISATION
La gélose TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Saccharose) est un milieu d’isolement sélectif
utilisé pour la rechercher des Vibrio entéropathogènes (cholerae, parahaemolyticus) dans
les selles.
COMPOSITION
PRINCIPE DE FONCTIONNEMENT
La bile de bœuf inhibe les bactéries à Gram positif et le pH alcalin favorise la culture des Vibrio.
La croissance des entérocoques et des entérobactéries n’est cependant que ralentie.
LECTURE
La présence de saccharose et de deux indicateurs de pH (le bleu de bromothymol et le bleu
de thymol) permet de connaitre le caractère saccharose des bactéries.
• Les vibrios (saccharose +) forment des colonies jaunes par acidification du milieu par
fermentation.
Le thiosulfate de sodium est une source de souffre à partir de laquelle certaines bactéries
forment du sulfure d’hydrogène (H2S). Ce dernier réagit avec les ions ferriques pour former
un précipité noir de sulfure de fer.
MALADIE
Vibrio cholerae est l’agent responsable du cholera.
La bactérie produit une toxine appelée « toxine cholerique » provoque au niveau des cellules
intestinales une sécrétion importante de chlorure de sodium et provoque, par osmose, le
déplacement de forte quantité d’eau en direction de la lumière intestinale. Ceci induit des
diarrhées cholérique est très importante en volume, avec des pertes en eau qui peuvent
atteindre 15 à 20 litres par jour occasionnant en même temps un déséquilibre ionique avec
acidose et hypokaliémie.
Les échantillons cliniques contenant un petit nombre de Vibrio doivent être inoculés dans un
milieu d'enrichissement avant d'être étalés sur un milieu sélectif, tel que TCBS Agar.
INTÉRÊT
Le milieu Hugh et Leifson ou MEVAG permet de déterminer la voie d’attaque (oxydative ou
fermentative) d’un sucre (glucose, lactose, etc) utilisé comme source d’énergie par une
bactérie.
VOIE OXYDATIVE: le glucose est utilisé en présence de dioxygène via la glycolyse puis le
cycle de Krebs (respiration).
VOIE FERMENTATIVE: le glucose est utilisé en absence de dioxygène les réactions
métabolique forme des catabolites acides (acide lactique par exemple)
COMPOSITION
TECHNIQUE
On utilise des milieux contenant un seul glucide et un indicateur de pH pour pouvoir étudier
l’acidification éventuelle du milieu.
LECTURE
Composition
Composant Quantité (g/L) Rôle
pH 7
Principe
• recherche de l’uréase
L’uréase dégrade l’urée selon la réaction suivante :
Urée + H2O 2 NH4+ + CO32-
Les ions CO 2-3vont entraîner une forte alcalinisation du milieu qui sera révélée par un viragede l’indicateur
de pH (le rouge de phénol) à sa teinte basique (rouge).
Ensemencement
• Ensemencer avec quelques gouttes de suspension bactérienne ou avec une colonie prélevée àl’anse sur
un milieu solide.
• Incubation 24 heures à 37°.
1. Lecture
Recherche de
l'uréase Ajout de réactif de Recherche de
Kovacs la tryptophanase
(production d’indole)
Ajout de chlorure de
fer III
Recherche de
Milieu la TDA
Urée-Indole
Caractère
Observation Interprétation Conclusion
recherché
Alcalinisation du milieu
La bactérie possède l’uréase
due à la dégradation de
Milieu rouge
Uréase l’urée
Elle est dite uréase +
(lecture après
24 heures
d’incubation)
La bactérie ne possède pas l’uréase
Pas d’alcalinisation du
Milieu orangé
milieu
(inchangé) Elle est dite uréase -
Après avoir effectué la lecture, séparer le milieu urée indole en deux (prélever une partie du milieu et le
transvaser dans un tube à hémolyse propre) puis réaliser les tests suivants :
Indole
Composition:
Base nutritive riche gélosée, contenant
différentes peptones qui favorisent la croissance
des germes urinaires, du tryptophane et un
mélange de substrats chromogènes pour détecter
des activités enzymatiques spécifiques pour la
détection des micro-organismes uropathogènes.