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Motivo adyacente de protoespaciador

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El motivo adyacente de protoespaciador (del inglés Protospacer adjacent motif (PAM)) es una secuencia de ADN de 2-6 pares de bases inmediatamente después de la secuencia de ADN dirigida por la nucleasa Cas9 en el sistema inmune adaptativo bacteriano CRISPR.[1]​ PAM es un componente del virus o plásmido invasor, pero no es un componente del locus CRISPR bacteriano. Cas9 no se unirá con éxito o escindirá la secuencia de ADN objetivo si no es seguido por la secuencia PAM.[2]​[3]​ [4]​ [5]​ PAM es un componente de orientación esencial (que no se encuentra en el genoma bacteriano) que distingue a la bacteria en si del material de ADN, evitando así que el locus CRISPR sea atacado y destruido por nucleasas.[6]​

Espaciadores / protoespaciadores

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Los loci de CRISPR en una bacteria contienen "espaciadores" (ADN viral insertado en un locus CRISPR) que en sistemas inmunes adaptativos de tipo II se crearon a partir de ADN viral o plasmídico invasor (denominado "protoespaciadores"). En la invasión subsiguiente, la nucleasa Cas9 se une a tracrRNA: crRNA que guía Cas9 a la secuencia de protospacer invasora. Pero Cas9 no escindirá la secuencia protospacer a menos que haya una secuencia PAM adyacente. El espaciador en los loci bacterianos CRISPR no contendrá una secuencia PAM, y por lo tanto no se cortará por la nucleasa. Sin embargo, el protospacer en el virus o plásmido invasor contendrá la secuencia PAM y, por lo tanto, será escindido por la nucleasa Cas9.[4]​ Para la edición de genes, se guıan los ARN guıa (gRNAs) para realizar la función del complejo tracrRNA: crRNA en el reconocimiento de las secuencias génicas que tienen una secuencia PAM en el extremo 3 '.[7]​[8]​

Secuencias PAM

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La PAM canónica es la secuencia 5'-NGG-3 'donde "N" es cualquier nucleobase seguido de dos nucleobases de guanina ("G").[9]​ Los ARN guías (gRNAs) pueden transportar Cas9 a cualquier parte del genoma para la edición de genes, pero no se puede editar en cualquier sitio distinto al que Cas9 reconoce como PAM. El PAM canónico se asocia con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes (designado SpCas9), mientras que diferentes PAM se asocian con las proteínas Cas9 de las bacterias Neisseria meningitidis, Treponema denticola y Streptococcus thermophilus.[10]​ 5'-NGA-3 'puede ser un altamente eficiente no-canónico PAM para las células humanas, pero la eficiencia varía con la ubicación del genoma.[11]​ Se han realizado intentos para que el ingeniero Cas9s reconozca diferentes PAMs para mejorar la capacidad de CRISPR-Cas9 para hacer la edición de genes en cualquier ubicación del genoma deseada.[12]​

El Cas9 de Francisella novicida reconoce la secuencia PAM canónica 5'-NGG-3 ', pero ha sido diseñado para reconocer la PAM 5'-YG-3' (donde "Y" es una pirimidina[13]​), añadiendo así al rango de posibles objetivos Cas9[14]​ La nucleasa Cpf1 de Francisella novicida reconoce la PAM 5'-TTTN-3 '[15]​ o 5'-YTN-3'.[16]​

Aparte de CRISPR-Cas9 y CRISPR-Cpf1, existen sin duda muchas nucleasas y PAMs aún no descubiertas.[17]​

CRISPR/C2c2 de la bacteria Leptotrichia shahii es CRISPR guiado por ARN que se dirige al ARN en lugar del ADN. El PAM no es relevante para un CRISPR dirigido a ARN, aunque una guanina que flanquea el objetivo afecta la eficacia, y ha sido designado Sitio de Acompañamiento de Protospaciador (en inglés Protospacer Flanking Site - PFS).[18]​

GUIDE-Seq

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Se ha ideado una tecnología llamada GUIDE-Seq para analizar los cortes erróneos ("off-target") producidos por dicha edición de genes.[19]​ El requisito de PAM puede ser explotado para dirigirse específicamente a mutaciones de un solo nucleótido heterocigotos, mientras que no ejercen efectos aberrantes en los alelos de tipo salvaje[20]​

Véase también

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Enlaces externos

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Referencias

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  1. ↑ Shah SA, Erdmann S, Mojica FJ, Garrett RA (2013). «Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity». RNA Biology 10 (5): 891-899. PMC 3737346. PMID 23403393. doi:10.4161/rna.23764. 
  2. ↑ Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Almendros C (2009). «Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system». Microbiology (journal) 155 (Pt 3): 733-740. PMID 19246744. doi:10.1099/mic.0.023960-0. 
  3. ↑ Shah SA, Erdmann S, Mojica FJ, Garrett RA (2013). «Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity». RNA Biology 10 (5): 891-899. PMC 3737346. PMID 23403393. doi:10.4161/rna.23764. Archivado desde el original el 4 de septiembre de 2014. 
  4. ↑ a b Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E (2012). «A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity». Science 337 (6096): 816-821. PMID 22745249. doi:10.1126/science.1225829. 
  5. ↑ =Sternberg SH, Redding S, Jinek M, Greene EC, Doudna JA (2014). «DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9». Nature 507 (7490): 62-67. PMC 4106473. PMID 24476820. doi:10.1038/nature13011. 
  6. ↑ Mali P, Esvelt KM, Church GM (2013). «Cas9 as a versatile tool for engineering biology». Nature Methods 10 (10): 957-963. PMC 4051438. PMID 24076990. doi:10.1038/nmeth.2649. 
  7. ↑ Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM (2013). «RNA-guided human genome engineering via Cas9». Science 339 (6121): 823-826. PMC 3712628. PMID 23287722. doi:10.1126/science.1232033. 
  8. ↑ Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F (2013). «Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems». Science 339 (6121): 819-823. PMC 3795411. PMID 23287718. doi:10.1126/science.1231143. 
  9. ↑ Anders C, Niewoehner O, Duerst A, Jinek M (2014). «Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease». Nature 513 (7519): 569-573. PMC 4176945. PMID 25079318. doi:10.1038/nature13579. 
  10. ↑ Esvelt KM, Mali P, Braff JL, Moosburner M, Yaung SJ, Church GM (2013). «Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing». Nature Methods 10 (11): 1116-1123. PMC 3844869. PMID 24076762. doi:10.1038/nmeth.2681. 
  11. ↑ Zhang Y, Ge X, Yang F, Zhang L, Zheng J, Tan X, Jin ZB, Qu J, Gu F (2014). «Comparison of non-canonical PAMs for CRISPR/Cas9-mediated DNA cleavage in human cells». Scientific Reports 4: 5405. PMC 4066725. PMID 24956376. doi:10.1038/srep05405. 
  12. ↑ Kleinstiver BP, Prew MS, Tsai SQ, Topkar VV, Nguyen NT, Zheng Z, Gonzales AP, Li Z, Peterson RT, Yeh JR, Aryee MJ, Joung JK (2015). «Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities». Nature 523 (7561): 481-485. PMID 26098369. doi:10.1038/nature14592. 
  13. ↑ «Nucleotide Codes, Amino Acid Codes, and Genetic Codes». KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. 15 de julio de 2014. Consultado el 6 de abril de 2016. 
  14. ↑ Hirano H, Gootenberg JS, Horii T, Abudayyeh OO, Kimura M, Hsu PD, Nakane T, Ishitani R, Hatada I, Zhang F, Nishimasu H, Nureki O (2016). «Structure and Engineering of Francisella novicida Cas9». Cell (journal) 164 (5): 950-961. PMC 4899972. PMID 26875867. doi:10.1016/j.cell.2016.01.039. 
  15. ↑ =Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, Volz SE, Joung J, van der Oost J, Regev A, Koonin EV, Zhang F (2015). «Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system». Cell (journal) 163 (3): 759-771. PMID 26422227. doi:10.1016/j.cell.2015.09.038. 
  16. ↑ Fonfara I, Richter H, Bratovič M, Le Rhun A, Charpentier E (2016). «The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA». Nature 532 (7600): 517-521. PMID 27096362. doi:10.1038/nature17945. 
  17. ↑ «Even CRISPR». The Economist. ISSN 0013-0613. Consultado el 27 de mayo de 2016. 
  18. ↑ Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, Joung J, Slaymaker IM, Cox DB, Shmakov S, Makarova KS, Semenova E, Minakhin L, Severinov K, Regev A, Lander ES, Koonin EV, Zhang F (2016). «C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector». Science. PMID 27256883. doi:10.1126/science.aaf5573. 
  19. ↑ Tsai SQ, Zheng Z, Nguyen NT, Liebers M, Topkar VV, Thapar V, Wyvekens N, Khayter C, Iafrate AJ, Le LP, Aryee MJ, Joung JK (2015). «GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleas». Nature Biotechnology 33 (2): 187-197. PMC 4320685. PMID 25513782. doi:10.1038/nbt.3117. 
  20. ↑ Li Y, Mendiratta S, Ehrhardt K, Kashyap N, White MA, Bleris L (2016). «Exploiting the CRISPR/Cas9 PAM Constraint for Single-Nucleotide Resolution Interventions». PLoS One 11 (1): e0144970. PMC 4720446. PMID 26788852. doi:10.1371/journal.pone.0144970. Archivado desde el original el 14 de marzo de 2016. 
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