Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης
Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (αγγλ. PCR, εκ του polymerase chain reaction) είναι μία μέθοδος βιοχημείας και μοριακής βιολογίας για την απομόνωση και τον πολλαπλασιασμό μίας αλληλουχίας DNA, μέσω της ενζυμικής αναπαραγωγής του DNA χωρίς τη χρήση ζωντανών μικροοργανισμών, όπως το βακτήριο E. coli ή οι ζύμες.[1]
Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μία in vitro μέθοδος που μπορεί να πραγματοποιηθεί χωρίς περιορισμούς στη μορφή του χρησιμοποιούμενου DNA. Μπορεί ακόμα να διαφοροποιηθεί εκτενώς για την πραγματοποίηση ποικίλων μεθόδων γενετικής επέμβασης. Με τη χρήση της, συγκεκριμένα θραύσματα DNA μπορούν να κλωνοποιηθούν σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα απουσία ζωντανών κυττάρων.
Αντίδραση πολυμεράσης
[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]Με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μια συγκεκριμένη περιοχή του γονιδιώματος μπορεί να πολλαπλασιαστεί μέχρι και δισεκατομμύρια φορές, δεδομένου ότι είναι γνωστή η νουκλεοτιδική του αλληλουχία.[2] Η αλληλουχία του γονιδίου (ή «θραύσματος DNA») είναι απαραίτητη για το σχεδιασμό των συνθετικών DNA ολιγονουκλεοτιδίων, το καθένα συμπληρωματικό με μία από τις αλυσίδες του δίκλωνου DNA. Τα ολιγονουκλεοτίδια που θα χρησιμοποιηθούν ως εκκινητές πρέπει να δεσμεύονται σε θέσεις αντίθετες από την αλληλουχία που πρόκειται να ενισχυθεί, με άλλα λόγια καθορίζουν τα άκρα του θραύσματος DNA που πρόκειται να ενισχυθεί.
Στάδια
[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]Ένας πλήρης κύκλος μιας αντίδρασης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης περιλαμβάνει τρία στάδια:
- Αποδιάταξη του DNA (denaturation)
- Προσαρμογή των εκκινητών στο DNA εκμαγείο (annealing)
- Επιμήκυνση των εκκινητών (extension).
Ένας πλήρης τέτοιος κύκλος περιλαμβάνει επώαση των δειγμάτων σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες και γίνεται στις μέρες μας αυτόματα από ειδικά μηχανήματα, τους θερμοκυκλωτές (thermal cyclers). Σε μια τυπική αντίδραση, το δίκλωνο DNA αποδιατάσσεται με θέρμανση στους 95°C. Στη συνέχεια, οι εκκινητήρες σε περίσσια προσαρμόζονται με υβριδισμό στις συμπληρωματικές αλληλουχίες του DNA εκμαγείου με μείωση της θερμοκρασίας του δείγματος στους 50-60°C. Ακολουθεί επώαση στους 72°C για την επιμήκυνση των εκκινητών από μία θερμοάντοχη πολυμεράση, παρουσία των τεσσάρων νουκλεοτιδίων.
Καθώς η διαδικασία επαναλαμβάνεται, οι νεοσύστατοι κλώνοι με τη σειρά τους χρησιμοποιούνται ως εκμαγεία για την in vitro σύνθεση του DNA. Μετά από μερικούς κύκλους το επικρατές προϊόν είναι ένα DNA θραύσμα που το μέγεθος του οποίου αντιστοιχεί στην μεταξύ των δύο αρχικών εκκινητήρων απόσταση. Στη πράξη 20 με 30 κύκλοι της αντίδρασης είναι αρκετοί για την αποτελεσματική ενίσχυση του DNA θραύσματος. Σε κάθε κύκλο που διαρκεί περίπου πέντε λεπτά η ποσότητα του DNA διπλασιάζεται. Η όλη διαδικασία κλωνοποίησης ενός DNA θραύσματος σε ένα in vitro σύστημα (χωρίς κύτταρα) διαρκεί μερικές ώρες, σε σχέση με τις μερικές μέρες που απαιτούνται για τις in vivo διαδικασίες κλωνοποίησης.[3]
Χρήσεις και παραλλαγές
[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]Η PCR είναι εξαιρετικά επιλεκτική και ευαίσθητη μέθοδος, έχει δυνατότητα ανίχνευσης ενός και μόνο μορίου DNA σε ένα μείγμα.
Η τεχνολογία PCR αντικαθιστά τον υβριδισμό κατά Southern για τη διάγνωση γενετικών ασθενειών και για την ανίχνευση λοιμωδών νόσων (ιογενών ή μικροβιακών λοιμώξεων κτλ.). Επιπλέον, στην ιατροδικαστική από ένα απλό ίχνος αίματος ή άλλων ιστών (ακόμα και από ένα κύτταρο) μπορεί να αναγνωριστεί η ταυτότητα ενός ατόμου (γενετικό αποτύπωμα – genetic fingerprint). Τέλος, η PCR βρίσκει εφαρμογή και στην Παλαιοντολογία, αφού με την βοήθειά της μπορούμε να πολλαπλασιάσουμε DNA που έχει απομονωθεί από απολιθώματα.[4]
Επιπρόσθετα, μικροποσότητες RNA μπορούν να αναλυθούν με τον ίδιο τρόπο, μετά την αντίστροφη μεταγραφή τους σε DNA από το ένζυμο της ανάστροφης τρανσκριπτάσης (RT-PCR – reverse transcription PCR). Πιο πρόσφατα, κατά τη διάρκεια της πανδημίας του κορωνοϊού 2019-21, η παραλλαγή RT-PCR της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την ανίχνευση του ιϊκού γενετικού υλικού (RNA) και θεωρείται πολύ αξιόπιστη μέθοδος.[5]
Αναφορές
[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]- ↑ J. M. Berg· J. L. Tymoczko· G. J. Gatto· L. Stryer (2015). Βιοχημεία. Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης. σελ. 148-149.[νεκρός σύνδεσμος]
- ↑ «Polymerase Chain Reaction (PCR) Fact Sheet». Genome.gov. 9 Μαρτίου 2019. Ανακτήθηκε στις 6 Ιουλίου 2021.
- ↑ «Αρχειοθετημένο αντίγραφο». Αρχειοθετήθηκε από το πρωτότυπο στις 11 Σεπτεμβρίου 2007. Ανακτήθηκε στις 4 Σεπτεμβρίου 2007.
- ↑ palaeo-electronica.org https://palaeo-electronica.org/2002_2/editor/r_and_p.htm. Ανακτήθηκε στις 5 Ιουλίου 2021. Missing or empty
|title=(βοήθεια) - ↑ «COVID-19 diagnostic testing». Mayo Clinic. 6 Μαΐου 2021. Ανακτήθηκε στις 6 Ιουλίου 2021.
Εξωτερικοί σύνδεσμοι
[Επεξεργασία | επεξεργασία κώδικα]
- PCR at Home - Άρθρο του Scientific American στην έκδοση Ιουλίου 2000 για την διεξαγωγή αντιδράσεων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης με οικιακό χαμηλού κόστους εξοπλισμό.
- Η αμερικανική πατέντα για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Αρχειοθετήθηκε 2011-10-16 στο Wayback Machine.
- Αφηγημένο κινούμενο σχέδιο και ανάλυση βήμα προς βήμα της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης Αρχειοθετήθηκε 2007-09-27 στο Wayback Machine. - Από την εταιρεία Sumanas η οποία προσφέρει εκπαιδευτικά πολυμέσα. Απαιτείται η χρήση του Adobe Flash.
- Κινούμενο σχέδιο που δείχνει την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης - Από το Εργαστήριο Ντόλαν της Εκμάθησης DNA στο εργαστήριο του Κολντ Σπρινγκς Χάρμπορ. Απαιτείται η χρήση του Adobe Flash. Τα περιεχόμενα των παραπάνω συνδέσμων είναι στα αγγλικά.