Why regulation of gene expression is important?

•Cellular function is largely dictated by the set of macromolecules inside the cell.
•Different macromolecules accumulate to different levels under different growth 
conditions and in different cell types.
•Diseases can be caused by aberrant control of gene expression: too much or too little 
of a protein; wrong time and wrong place for a protein.
   
Transcription of DNA into RNA by 
RNA polymerase­­­an overview
1.  Requires DNA template, four ribonucleotide 
 Template (non
5’ triphosphates, Mg+2.  
­coding) strand
2.  De novo synthesis: does not require a primer.
Low fidelity compared to DNA polymerase: 
errors 1/104­105 (105 higher than DNA 
polymerase).
 
3.  Activity highly regulated in vivo: at initiation, 
elongation and termination.

4.  The nucleotide at the 5’ end of an RNA strand 
retains all three of its phosphate groups; all 
subsequent nucleotides release pyrophosphate 
(PPi) when added to the chain and retain only 
their α phosphate (red). 

5.  The released PPi is subsequently hydrolyzed 
by pyrophosphatase to Pi, driving the 
equilibrium of the overall reaction toward chain 
elongation. 

6. Growth of the transcript always occurs in the 
    Non­template 
5’­to­3’ direction. (coding) strand
 E. coli RNA polymerase holoenzyme bound to DNA

Subunit      Stoichiometry  Role

     in holoenzyme
α 2 Binds regulatory sequences/proteins
β 1 Forms phosphodiester bonds
β’1   
σ 1  Promoter recognition
ω1  RNAP assembly
A single RNA polymerase makes multiple types of RNAs (rRNA, tRNA and 
   
mRNA) in prokaryotes.
 Typical E.coli promoters recognized by an RNA polymerase 
holoenzyme containing σ70

Strong promoters: close to consensus sequences and spacing
Weak promoters: contain multiple substitutions at the ­35 and ­10 regions
   
 Dissociation of RNAP and purification of σ 
by ion­exchange chromatography

α β
σ
α
β’
ω
[NaCl]

[protein]

Carboxymethyl­ (­CO2­2) or 
phospho­ (­PO3­2) cellulose Fraction number

σ α β
α β’
   
ω
 The dissociable sigma subunit gives promoter specificity to 
prokaryotic RNA polymerase (RNAP)

α β α σ β
+ σ
α α
β’ β’
ω ω

Core enzyme Holoenzyme

No specific promoter binding;  Specific promoter binding;  weak 
tight non­specific DNA binding  non­specific DNA binding (Kd 
(Kd ~5 x 10­12 M) ~10­7 M); finds promoter 10,000 
times faster.

   
 Transcription initiation by prokaryotic RNA polymerase
Holoenzyme “sliding and scanning”
Promoter
α β ­35 ­10
σ
α
β’

Closed complex α σ β
α
β’
Sigma separates 
rNTPs from the core 
PPi once a few 
phosphodiester 
Core enzyme bonds are formed
Open complex; initiation α β
α
5’pppA β’ σ
   
mRNA
 Interactions of various sigma factors of E. coli with the same 
core polymerase to form holoenzymes with different promoter­
binding specificity

Sigma
Factor Promoters Recognized Promoter Consensus

­35 Region ­10 Region
σ70 Most genes TTGACAT TATAAT
σ32 Genes induced by heat shock TCTCNCCCTTGAA CCCCATNTA
σ28 Genes for motility and chemotaxis CTAAA CCGATAT
σ38 Genes for stationary phase and stress response ? ?

­24 Region ­12 Region
σ54 Genes for nitrogen metabolism & other functions  CTGGNA
TTGCA

Heat­shock response:
High temperature induces the production of σ32, which binds to the core 
polymerase to form a unique holoenzyme for recognition of the promoters of heat­
shock induced genes. 
   
 Rho­independent prokaryotic transcription termination

The core polymerase pauses after 
synthesizing a hairpin. If the hairpin is 
really a terminator, RNA will dissociate 
from the DNA strand as the A­U pairing 
is unstable. Once the RNA is gone, DNA 
duplex reforms and the core is driven off, 
    as it has low affinity for dsDNA.
 Rho­dependent transcription termination

Rho­binding Site 
(non­contiguous
structural features
in RNA): Stop 
signals not 
recognized by 
RNAP alone.

Rho: forms RNA­dependent hexameric ATPase, 
translocates along RNA 5’­to­3’, pulling RNA 
away when it reaches the transcription bubble. termination

   
Platt, Ann. Rev. Biochem. 55: 339 (1986)
 Three types of RNA polymerase in eukaryotic nuclei
Type Location RNA synthesized Effect of α­amanitin

I Nucleolus Pre­rRNA for 18, 5.8 and 28S rRNAs Insensitive

II Nucleoplasm Pre­mRNA, some snRNAs Sensitive to 1 µg/ml
III Nucleoplasm  Pre­tRNAs, 5S rRNA, some snRNAs Sensitive to 10 µg/ml

•  α­amanitin from Amanita Phalloides binds tightly to RNA Pol II and blocks 
transcriptional elongation.
•  RNA Pol I transcribe 1 gene at ~200 copies. The gene for the 45S pre­rRNA is 
present in tandem array.
•  RNA Pol II transcribe ~25,000 genes;
•  RNA Pol III transcribe 30­50 genes at variable copy numbers.

(Also­ Organelle RNAPs in Mitochondria and Chloroplasts.  Encoded by organelle 
genomes.  Similar to bacterial RNAPs.)
   
Comparison of 3­D structures of bacterial and eukaryotic RNA polymerases

   
   
 Transcription start sites can be mapped by S1 protection 
and primer extension
Obtained in vitro or in vivo
•Mapping the start site for 
synthesis of a particular 
mRNA often helps identify 
the DNA regulatory 
sequences that control its 
Red dot: 32P end label
transcription, because 
some of the regulatory 
elements are located near 
the start site.
•The position of the start 
site can be mapped from 
the length of the labeled 
probe segment protected 
from S1 digestion (S1 
protection) or the 
resulting extension 
product (primer 
extension) on 
polyacrylamide­urea gel 
(same as DNA sequencing 
gel). 
   
 Core Promoter Elements

   
In vitro stepwise assembly of the 
RNA Pol II pre­initiation complex 
(PIC) at core promoter for basal 
transcription

   
 Basal (‘General’) Transcription Factors for RNA Polymerase II

   
Total: 43­44 polypeptides and over 2 million daltons.
 “Gel shift”:  electrophoretic mobility shift assay 
(EMSA) for studying DNA­protein interactions

*
Protein­DNA complex

*
Free DNA probe
ON: protein mixture loaded onto an ion­exchange 
1. Prepare labeled DNA probe column.
2. Bind protein Fraction 1­22: fractions eluted from the column with 
3. Native gel electrophoresis increasing salt concentrations.

Advantage: sensitive Disadvantage: requires stable complex; 
  little information about where protein is 
 
binding on DNA
 Stepwise assembly of pre­initiation complex (PIC) 
as revealed by gel shift assay

   
 Eukaryotic transcription cycle

Only the 
unphosphorylated 
RNA Pol II enters 
PIC.

The TFIIH complex 
has both helicase 
and kinase activities 
that can unwind 
DNA and 
phosphorylate the 
CTD tail of RNA 
Pol II.
Release of 
TFIIE and then 
IIH during the 
synthesis of the 
initial 60­70nt.
   
 CTD
FCP1 2 5
CTD
Recycling 2
2 5

Pol II
2 5
5
Pol II

TFIIH P­TEFb
CycT1
CTD CTD
CDK9 2 5 2 5
5
2 5 2 5
5
2 2
5 2 5 2 5
Pol II Pol II Pol II Pol II
5 5 5

+1
5’ cap
RNA
Promoter 
PIC  clearance Release  Productive 
assembly & pausing  from 
pausing elongation
for capping

 
CTD heptapeptide repeats: 27­52 x (YS
  2
PTS5PS)
 Cis­acting control elements

(a) Genes of multicellular organisms contain both promoter­proximal elements and 
enhancers (collectively referred to as cic­acting control elements) as well as a TATA 
box or other core promoter element(s).
(b) Enhancers function in a distance, position and orientation­independent manner. Long 
distance interactions are achieved by forming looped DNA.
(c)    Most yeast genes contain only one regulatory region, called an upstream activating 
sequence (UAS), and a TATA box, which is ≈90 base pairs upstream from the start 
site. (Also note: many yeast genes do not contain introns).
(d)  In multicellular organisms, one standard promoter­proximal element is a GC­box 
(GGGCGGGC) recognized by the “constitutive” transcriptional activator Sp1.
   
DNA affinity chromatography for purification of Sp1

   
 DNase I footprinting: a common technique 
for identifying protein­binding sites in DNA. 

1.  A DNA fragment is labeled at one end with 
32
P (red dot).

2.   Portions of the sample then are digested 
with DNase I in the presence and absence of a 
protein that binds to a specific sequence in the 
fragment. 

3.  A low concentration of DNase I is used so 
that on average each DNA molecule is cleaved 
just once (vertical arrows). 

4.  The two samples of DNA then are separated 
from protein, denatured to separate the 
strands, and electrophoresed. The resulting gel 
is analyzed by autoradiography, which detects 
only labeled strands and reveals fragments 
extending from the labeled end to the site of 
cleavage by DNase I.
   
 Analyses of affinity­purified Sp1 protein

DNase I footprint  SDS­PAGE/
on SV40 promoter   silverstain

Sp1

Lane 2 contains 
total cell proteins 
prior to affinity 
purification;
Lanes 3&4 contain 
purified Sp1 
protein washed off 
the affinity column.

   
NaCl
 In vitro transcription assay to measure Sp1 activity

•The adenovirus DNA 
template used here does not 
contain any Sp1­binding sites 
(GC­box) and is therefore 
used as a negative control.

•In vitro transcription 
reactions contain template 
DNA, labeled ribonucleoside 
triphosphates, and purified 
general transcription factors 
and RNA Pol II. Purified Sp1 
is added to the reactions 
indicated with “+”.

   
 In vivo assay for transcription factor activity

• Host cells should lack the 
gene encoding protein X 
and the reporter protein.

• The production of 
reporter­gene RNA 
transcripts or the activity 
co­transfection of the encoded protein can 
be assayed.

• If reporter­gene 
transcription is greater in 
the presence of the X­
encoding plasmid, then X 
is an activator; if 
Reporter­gene
    products transcription is less, then 
X is a repressor.
   
 The Production of DNA Microarrays and Their Use in 
Monitoring Global Gene Transcription 

   
 Regulation of prokaryotic transcription
1. Single­celled organisms with short doubling times must respond extremely 
rapidly to their environment. 
2. Half­life of most mRNAs is short (on the order of a few minutes).
5. Coupled transcription and translation occur in a single cellular compartment.

  Therefore, transcription initiation is usually the major control point.

Most prokaryotic genes are regulated in units called operons (Jacob and 
Monod, 1960)
Operon: a coordinated unit of gene expression consisting of one or more related 
genes and the operator and promoter sequences that regulate their transcription. 
The mRNAs thus produced are “polycistronic’—multiple genes on a single 
transcript.

   
 The trp operon: two kinds of negative regulation

(low trp levels)

(high trp levels)

Tryptophan + trp repressor dimer

 Trp­repressor complex 
activated for DNA 
binding

Binds Operator; blocks 
RNAP binding & 
represses transcription;
Tryptophan a co­repressor
   
   
Translation of part of the leader mRNA to produce the leader peptide  

What is the attenuator?
The attenuator is a Rho­independent transcription terminator! 

  Presence of Trp codons within the leader peptide is highly significant! 
 
 Attenuation is mediated by the tight coupling of 
transcription and translation
•The ribosome translating the trp leader mRNA follows closely behind the RNA 
polymerase that is transcribing the DNA template.
•Alternative conformation adopted by the leader mRNA.

  completed

UUU 3’

and blocking sequence 2
•The stalled 
Incomplete ribosome is 
     leader  waiting for 
    peptide tryptophanyl­
tRNA.
•The 2:3 pair is 
not an attenuator 
and is more 
    stable than the 
3:4 pair.
 Two­step decoding process for translating nucleic acid sequences in 
mRNA into amino acid sequences in proteins

   
 The PhoR/PhoB two­component regulatory system in E. coli
In response to low phosphate 
concentrations in the 
environment and periplasmic 
space, a phosphate ion 
dissociates from the periplasmic 
domain of the sensor protein 
PhoR. This causes a 
conformational change that 
activates a protein kinase 
transmitter domain in the 
cytosolic region of PhoR. The 
activated transmitter domain 
transfers an ATP γ­phosphate to 
a histidine in the transmitter 
domain. This phosphate is then 
transferred to an aspartic acid in 
the response regulator PhoB. 
Phosphorylated PhoB then 
activate transcription from genes 
encoding proteins that help the 
cell to respond to low phosphate, 
including phoA, phoS, phoE, 
    and ugpB.
Activation of σ 54­containing RNA polymerase at glnA promoter by NtrC

•The glnA gene encodes glutamine 
synthetase, which synthesizes glutamine 
from glutamic acid and ammonia.  
• The σ54­containing RNA polymerase 
binds to the glnA promoter, forming a 
(kinase) closed complex, before being activated.
• In response to low levels of glutamine, a 
protein kinase called NtrB phosphorylates 
dimeric NtrC, which then binds to two 
sequence elements (called enhancer) 
located at –108 and ­140.
• The bound phosphorylated NtrC dimers 
interact with the bound σ54­polymerase, 
causing the intervening DNA to form a 
loop. 
• The ATPase activity of NtrC then 
stimulates the polymerase to unwind the 
template strands at the start site, forming 
an open complex. Transcription of the 
glnA gene can then begin.