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Snake and Spider Toxins Methods and Protocols

1st Edition Avi Priel
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Snake and Spider Toxins Methods and Protocols 1st
Edition Avi Priel Digital Instant Download
Author(s): Avi Priel
ISBN(s): 9781493998449, 1493998447
Edition: 1st
File Details: PDF, 5.66 MB
Year: 2019
Language: english
Methods in
Molecular Biology 2068
Avi Priel Editor
Snake and
Spider Toxins
Methods and Protocols
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY
Series Editor
John M. Walker
School of Life and Medical Sciences
University of Hertfordshire
Hatfield, Hertfordshire, UK
For further volumes:

http://www.springer.com/series/7651
For over 35 years, biological scientists have come to rely on the research protocols and
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constitute the key ingredient in each and every volume of the Methods in Molecular Biology
series. Tested and trusted, comprehensive and reliable, all protocols from the series are
indexed in PubMed.
Snake and Spider Toxins
Methods and Protocols
Edited by
Avi Priel
Faculty of Medicine, School of Pharmacy, Institute for Drug Research, The Hebrew University
of Jerusalem, Jerusalem, Israel
Editor
Avi Priel
Faculty of Medicine
School of Pharmacy
Institute for Drug Research
The Hebrew University of Jerusalem
Jerusalem, Israel
ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)

Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-4939-9844-9 ISBN 978-1-4939-9845-6 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9845-6
© Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2020

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The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
This Humana imprint is published by the registered company Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer
Nature.
The registered company address is: 233 Spring Street, New York, NY 10013, U.S.A.
Preface
In addition to being scientific discipline in toxicology, the research of animal toxins provides
powerful tools for the deciphering of various biological mechanisms; both their toxic effects
and extensive use as experimental tools consequent from their coevolution with their
targets. Specifically, snake and spider toxins serve as excellent sources for our understanding
of the development of peptide toxins, and different labs throughout the world routinely
employ a wide array of these toxins for studying complex biological processes. As such,
various methodologies have been developed for both handling and investigating peptide
toxins and their use as molecular tools. The goal of this book is to share common techniques
and protocols across different biological disciplines for the study and application of snake
and spider peptide toxins.
This book comprises of 16 chapters, including 2 overviews (Part I) describing the use of
toxins in the process of drug development and the analysis of bioactivity of complex
mixtures like venoms. The next 14 chapters provide detailed protocols describing the
extraction of venom glands and the recombinant production of toxins (Part II), the
characterization of toxins from the RNA level to peptide structure determination (Part
III), and the determination of toxins’ biological function (Part IV). These protocols employ
different cellular and animal models and various techniques involving toxins.
Snake and Spider Toxins: Methods and Protocols is the outcome of the joint effort of
36 contributors from 10 countries. I wish to thank each of the authors for their contribution
and willingness to share their valuable knowledge. Finally, I wish to thank Prof. John Walker
for his guidance and help throughout the process of editing this book.
Jerusalem, Israel Avi Priel
v
Contents
Preface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Contributors. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix
PART I OVERVIEW
1 Snake- and Spider-Venom-Derived Toxins as Lead Compounds
for Drug Development . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Philip Lazarovici
2 Analytics for Bioactivity Profiling of Complex Mixtures
with a Focus on Venoms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Marija Mladic, Wilfried M. A. Niessen, Govert W. Somsen,
and Jeroen Kool
PART II TOXINS PURIFICATION AND PRODUCTION
3 Venom Collection from Spiders and Snakes: Voluntary

and Involuntary Extractions (“Milking”) and Venom Gland Extractions . . . . . . . 53
William K. Hayes, Gerad A. Fox, and David R. Nelsen
4 Production and Purification of Recombinant Toxins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
Matan Geron
PART III TOXINS CHARACTERIZATION
5 RNA-Sequencing of Snake Venom Glands . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

Khin Than Yee, Olga Vasieva, and Ponlapat Rojnuckarin
6 Exploring Toxin Evolution: Venom Protein Transcript Sequencing
and Transcriptome-Guided High-Throughput Proteomics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
Cassandra M. Modahl, Jordi Durban, and Stephen P. Mackessy
7 Three-Dimensional Structure Determination of Peptides Using
Solution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
Christina I. Schroeder and K. Johan Rosengren
8 Determining the Structures of the Snake and Spider Toxins by X-Rays . . . . . . . . 163
Anwar Ullah, Rehana Masood, Zafar Hayat, and Ahmed Hafeez
9 MALDI-TOF Mass Spectrometric Profiling of Spider Venoms. . . . . . . . . . . . . . . . 173
Ondrej Šedo, Stano Pekár, and Zbyněk Zdráhal
PART IV CHARACTERIZATION OF TOXINS FUNCTION
10 Methods for Evaluation of a Snake Venom-Derived Disintegrin

in Animal Models of Human Cancer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
Stephen D. Swenson, Catalina Silva-Hirschberg,
and Francis S. Markland
vii
viii Contents
11 Cell-Based Adhesion Assays for Isolation of Snake Venom’s Integrin

Antagonists . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
Philip Lazarovici, Cezary Marcinkiewicz, and Peter I. Lelkes
12 Using C. elegans to Study the Effects of Toxins in Sensory Ion Channels
In Vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225
Valeria Vásquez
13 Measurements of Cell Death Induced by Snake and Spider’s Venoms
and Derived Toxins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
Yossi Maatuf, Avi Priel, and Philip Lazarovici
14 Using Toxins in Brain Slice Recordings . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269
Alexey Bingor and Rami Yaka
15 High-Throughput Calcium Imaging Screen of Toxins’ Function
in Dissociated Sensory Neurons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 275
Yossi Maatuf and Avi Priel
16 Synthesizing and Expressing Native Ion Channels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283
Shana L. Geffeney and Charles T. Hanifin
Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291
Contributors
ALEXEY BINGOR Faculty of Medicine, School of Pharmacy, Institute for Drug Research, The
Hebrew University of Jerusalem, Jerusalem, Israel
JORDI DURBAN Unidad de Venómica Evolutiva y Traslacional, Instituto de Biomedicina de
València, Consejo Superior de Investigaciones Cientı́ficas, València, Spain
GERAD A. FOX Department of Earth and Biological Sciences, School of Medicine, Loma
Linda University, Loma Linda, CA, USA
SHANA L. GEFFENEY Department of Biology, Utah State University-Uintah Basin, Vernal,
UT, USA
MATAN GERON Faculty of Medicine, School of Pharmacy, The Institute for Drug Research,
The Hebrew University of Jerusalem, Jerusalem, Israel
AHMED HAFEEZ Department of Biosciences, COMSATS University, Islamabad, Pakistan
CHARLES T. HANIFIN Department of Biology, Utah State University-Uintah Basin, Vernal,
UT, USA
ZAFAR HAYAT Department of Biosciences, COMSATS University, Islamabad, Pakistan
WILLIAM K. HAYES Department of Earth and Biological Sciences, School of Medicine, Loma
Linda University, Loma Linda, CA, USA
JEROEN KOOL AIMMS Division of BioMolecular Analysis, Vrije Universiteit Amsterdam,
Amsterdam, The Netherlands
PHILIP LAZAROVICI Faculty of Medicine, School of Pharmacy, Institute for Drug Research,
The Hebrew University of Jerusalem, Jerusalem, Israel
PETER I. LELKES Department of Bioengineering, College of Engineering, Temple University,
Philadelphia, PA, USA
YOSSI MAATUF Faculty of Medicine, School of Pharmacy, Institute for Drug Research, The
STEPHEN P. MACKESSY School of Biological Sciences, University of Northern Colorado,
Greeley, CO, USA
CEZARY MARCINKIEWICZ Department of Bioengineering, College of Engineering, Temple
University, Philadelphia, PA, USA
FRANCIS S. MARKLAND Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Keck School of
Medicine, University of Southern California, Los Angeles, CA, USA; Norris Comprehensive
Cancer Center, Keck School of Medicine, University of Southern California, Los Angeles,
CA, USA
REHANA MASOOD Department of Biochemistry, Shaheed Benazir Bhutto Women University,
Peshawar, Pakistan
MARIJA MLADIC AIMMS Division of BioMolecular Analysis, Vrije Universiteit Amsterdam,
Amsterdam, The Netherlands
CASSANDRA M. MODAHL School of Biological Sciences, University of Northern Colorado,
Greeley, CO, USA; Department of Biological Sciences, National University of Singapore,
Singapore, Singapore
DAVID R. NELSEN Department of Biology, Southern Adventist University, Collegedale, TN,
USA
WILFRIED M. A. NIESSEN AIMMS Division of BioMolecular Analysis, Vrije Universiteit
Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands; Hyphen MassSpec, Voorhout, The Netherlands
ix
x Contributors
STANO PEKÁR Faculty of Science, Department of Botany and Zoology, Masaryk University,
Brno, Czech Republic
AVI PRIEL Faculty of Medicine, School of Pharmacy, Institute for Drug Research, The
PONLAPAT ROJNUCKARIN Faculty of Medicine, Department of Medicine, Chulalongkorn
University, Bangkok, Thailand
K. JOHAN ROSENGREN School of Biomedical Sciences, The University of Queensland,
Brisbane, QLD, Australia
CHRISTINA I. SCHROEDER Institute for Molecular Bioscience, The University of Queensland,
Brisbane, QLD, Australia
ONDREJ ŠEDO Central European Institute of Technology, Masaryk University, Brno, Czech
Republic
CATALINA SILVA-HIRSCHBERG Department of Molecular Microbiology and Immunology,
Keck School of Medicine, University of Southern California, Los Angeles, CA, USA;
Primary Speciality Center San Lazaro, Santiago, Chile, USA; Norris Comprehensive
Cancer Center, Keck School of Medicine, University of Southern California, Los Angeles,
CA, USA
GOVERT W. SOMSEN AIMMS Division of BioMolecular Analysis, Vrije Universiteit
Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands
STEPHEN D. SWENSON Department of Biochemistry and Molecular Medicine, Keck School of
Medicine, University of Southern California, Los Angeles, CA, USA; Department of
Neurological Surgery, Keck School of Medicine, University of Southern California, Los
Angeles, CA, USA
ANWAR ULLAH Department of Biosciences, COMSATS University, Islamabad, Pakistan
OLGA VASIEVA Institute of Integrative Biology, University of Liverpool, Liverpool, UK;
Ingenet Ltd, London, UK
VALERIA VÁSQUEZ Department of Physiology, College of Medicine, University of Tennessee
Health Science Center, Memphis, TN, USA
RAMI YAKA Faculty of Medicine, School of Pharmacy, Institute for Drug Research, The
KHIN THAN YEE Biochemistry Research Division, Department of Medical Research, Yangon,
Myanmar
ZBYNĚK ZDRÁHAL Central European Institute of Technology, Masaryk University, Brno,
Czech Republic; Faculty of Science, National Centre for Biomolecular Research, Masaryk
University, Brno, Czech Republic
Part I
Overview
Chapter 1
Snake- and Spider-Venom-Derived Toxins as Lead

Compounds for Drug Development
Philip Lazarovici
Abstract
Snake and spider venoms have been developed by nature as a defense mechanism against predators or to
immobilize their prey by blocking the cardiovascular, respiratory, and/or nervous systems. Consequently,
predators are deterred from approaching their prey by painful sensations. At a molecular level, the targeted
physiological systems are blocked or stimulated by peptide toxins which, once injected into the body,
modulate, though not exclusively, important cell membrane ion channels and receptors. Millions of years of
constant evolution have led to the evolvement of complex venom libraries of optimized protein toxins,
making them more potent, more selective, resistant to proteases, less immunogenic, and improved in terms
of pharmacokinetic (PK) properties. The resulting advantage is that they induce long-term and potent
pharmacodynamic (PD) effects toward unique molecular targets of therapeutic importance such as coagu-
lation cascade proteins, receptors, and ionic channels. This optimization process has been enabled by the
diversification of peptide sequences (mainly by gene duplication) and an upscaling of the complexity of
toxin peptide scaffold structures, through implementation of multiple disulfide bridges and sequence-active
motif diversification, leading to a wide diversity of chemical structures. This combination of pharmaceutical
properties has made venom toxins valuable both as pharmacological tools and as leads for drug develop-
ment. These highly tunable molecules can be tailored to achieve desirable biocompatibility and biodegrad-
ability with simultaneously selective and potent therapeutic effects. This brief overview provides basic
definitions, rules, and methodologies and describes successful examples of a few drugs developed from
snake toxins that are currently used in the clinic for therapy of several diseases as well as new molecular
entities in clinical development based on spider-venom-derived peptide toxins.
Key words Snake, Spider, Venom, Toxin, Peptide, Protein, Lead compound, Drug, Therapeutic
applications
1 Introduction
The key motivation behind this overview was the observation that
during the last decades there has been a surge in pharmaceutical
projects exploiting the extraordinary biological potency and target
selectivity of snakes and spider venom toxins to develop novel drugs
and diagnostics for human diseases [1], or as tools to study mam-
malian cell physiology and pharmacology [2, 3]. The pioneering
Avi Priel (ed.), Snake and Spider Toxins: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 2068,
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9845-6_1, © Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2020
3
4 Philip Lazarovici
studies of Bristol-Myers Squibb Co. in developing the angiotensin-

converting enzyme inhibitor, captopril [4], based on identification
and characterization of Brazilian pit viper (Bothrops jararaca)
venom peptides was a turning point which stimulated many phar-
maceutical companies to invest in venom-based drug discovery
programs. To date, several of the currently FDA-approved drug
products are developed based on some snake venom toxins and are
characterized by distinct cardiovascular therapeutic effects by tar-
geting thrombin, fibrinogen, and integrin receptors [5]. Rapid
advances in proteomics, genomics, and transcriptomics of spider
venoms have since resulted in affordable new technology platforms
[6, 7] that also stimulate the use of spider venom peptides for drug
discovery and clinical development. Therefore, this overview is
presenting pharmaceutical definitions, principles, and methodolo-
gies which may further contribute to the use of snake and spider
venom toxins as lead compounds in drug discovery. We anticipate
that combining the huge amount of information on this topic in
one brief overview will facilitate and promote future research on
venomics as a platform for drug discovery and development. This
primer is organized as answers to major, basic essential questions:
What is a classical synthetic lead compound in drug discovery? Can
peptides be used as lead compounds for drug development? What
do the “most desired” peptide drugs look like? Why do snake- and
spider-venom-derived toxins represent good lead compounds for
peptide drug development? Which therapeutic applications are
known for drugs developed from snake-venom-derived protein
toxins and spider-venom-derived toxin peptides? What is a com-
mon preclinical pipeline for drug development based on snake- and
spider-venom-derived protein/peptide toxins?
2 What Is a Classical Synthetic Lead Compound in Drug Discovery?
Drug discovery encompasses processes ranging from target selec-

tion and validation to the selection of a drug candidate. While
comprehensive drug discovery workflows are implemented pre-
dominantly in the big pharma, early discovery focuses on academia
serves to identify probe molecules that can serve as tools to study
targets or pathways. A successful early discovery program is built on
strong established target definition and validation using a diverse
set of pharmacological and cell-based assays with functional rele-
vance to the biological system being studied. The drug discovery
process involves the use of high-throughput screening (HTS) tech-
niques to screen thousands of compounds from large to small
organic synthetic molecule libraries to identify potential drug can-
didates for a given target (receptor, ionic channel, enzyme, etc.).
The molecules which show good activity in the HTS assay are called
“actives.” These are compounds that show good pharmacological
Venom Derived Toxins in Drug Development 5
activity for the specific molecular target investigated based on

potent inhibitory concentration 50% (IC50) or effective concentra-
tion 50% (EC50) values. Structurally similar “actives” are clustered
into groups called “clusters” and rescreened. From the top “clus-
ter,” the most active compounds are resynthesized with high purity
and rescreened for potency and physical properties upon checking
for compliance with Lipinski’s rule of five. This pharmaceutical rule
claims that drug molecules must have a molecular weight less than
500 g/mol, a partition coefficient (logP—a measure of hydropho-
bicity) less than 5, no more than 5 hydrogen bond donors, and no
more than 10 hydrogen bond acceptors [8]. The best compounds
from these screens are selected for further screening and are called
“hits.” From these “hits” several compounds are selected for fur-
ther optimization, based on good structure-activity relationship
(SAR) and pharmacokinetic ADME (adsorption, distribution,
metabolism, elimination) as well as toxicity (safety) profiles. These
are known as the “lead compounds.” These compounds are used as
templates for designing other compounds through chemical mod-
ifications and/or protein engineering and are screened using
in vitro and in vivo assays. The compounds with the best pharma-
cological and pharmacokinetic profiles are finally selected as “drug
candidates” [9].
3 Can Peptides Be Used as Lead Compounds for Drug Development?
Peptides have the potential to provide drugs with the specificity and
efficacy of large protein molecules combined with the smaller dose
size, simpler routes of delivery, and lower cost of manufacturing
as found with small, non-peptide molecules. They are, therefore,
uniquely suited for the treatment of many chronic diseases which
impact large patient populations. Peptides are a unique group of
molecules. The 20 natural amino acids, along with many more
non-natural amino acids and a series of posttranslational modifica-
tions, such as sugar and lipid incorporation, enable them to gener-
ate incredibly diverse molecules which the body sees as natural. This
means that our immune system is generally tolerant of them and
can pass them safely through the body without accumulation. They
have the exquisite selectivity of other biologics such as antibodies
but, are much smaller—making them both easier to manufacture
and able to reach places that antibodies can’t. In addition, they
break down to amino acids which are easily eliminated from the
human body.
Therapeutic peptides have taken a long time to come of age.
Many of the early peptide-based therapeutics were obtained from
animal tissue. The first chemical synthesis of a therapeutic peptide
was that of oxytocin hormone in 1953. Recombinant synthesis of
proteins was introduced in 1974, and recombinant human insulin,
6 Philip Lazarovici
the first approved peptide therapeutic to be manufactured by

recombinant fermentation, was introduced in 1982. All in all,
about 65 peptide-based drug products have reached FDA approval,
most of them in the last three decades. Many of these peptides are
hormones containing up to 41 amino acids which can be prepared
by common solid-phase synthetic approaches [10]. In spite of the
increasing rate of approval and the large number of candidates in
the pharmaceutical pipe, therapeutic peptides as a drug class still
face significant challenges. They are generally perceived as being
(1) rapidly eliminated in vivo, unless chemical modifications are
made; (2) labile during storage at ambient temperatures; and
(3) not orally available, requiring injection and being associated
with self-administration compliance issues. These challenges might
be considered as a list of independent hurdles, but if a peptide-
based drug is to be designed rationally for use in the clinic, all these
challenges should be addressed early in a more integrative approach
for each drug candidate and development process. Unfortunately,
this is often not the case. Most candidates take “injectables” as
default and, having started down that path, reach later stage clinical
development with a number of built-in formulation issues, which
remain unresolved until post-approval modifications can be made.
Changes in formulation or delivery modality in late clinical trials
can put the approval process at risk, so many decisions that will
profoundly affect the market success of the drug product need to be
considered and fixed early in the drug research and development
process.
4 What Do the “Most Desired” Peptide Drugs Look Like?
Although there are exceptions, such as human parathyroid hor-

mones, luteinizing hormone-releasing hormones, and other pep-
tides that have to be administered in a pulsatile manner to have
therapeutic efficacy, there is little doubt that the preferred thera-
peutic form would be an orally delivered tablet or capsule contain-
ing a long-acting peptide drug that is stable at ambient
temperatures and costs no more than the injectable equivalent.
Although an oral formulation may not always be possible, other
non-parenteral or alternative delivery platforms may be more than
adequate to achieve a suitable drug form of sufficient efficacy and
satisfactory compliance. There is never going to be a single set of
guidelines for reaching that goal, but a rational evaluation of the
intended drug at the start of the development process can help
achieve this goal. The first question has to be whether, the chosen
peptide in its present form is a suitable candidate for treating its
intended clinical therapeutic indication. If the peptide is eliminated
rapidly in vivo, as most peptide sequences are, chemical modifica-
tions to the peptide, either within the sequence or by conjugation
to a polymer or a lipid, need to be considered to obtain a therapeu-

tic “prodrug” candidate that is less easily degraded or less amenable
to renal clearance. There is now a wide range of natural and syn-
thetic polymeric conjugates available, including polyethylene glycol
(PEG), hydroxyethyl starch (HES), human serum albumin (HSA),
XTEN (a recombinant polypeptide), PAS (a recombinant polypep-
tide containing only proline, serine, and alanine), polyglutamic
acid, etc. By making a covalent modification, a new molecular entity
(NME) is created that may have markedly different pharmacoki-
netic, pharmacodynamic, and immunogenic characteristics. If the
conjugation is reversible, the active pharmaceutical ingredient
(API) will have the nature of a prodrug, which does not need to
interact directly with the drug target; if it is non-reversible, then
interaction with the target is obligatory. Covalent conjugation
typically reduces potency, but this should be more than compen-
sated for by the extended half-life. An alternative approach is to
incorporate the peptide into a biodegradable long-acting-release
(LAR) matrix, such as a poly D, L-lactide-co-glycolide (PLGA)
polymer, or a hydrogel. Because the release profile of an LAR
matrix can be designed, it is possible to program biphasic or multi-
phasic release of the peptide drug [11, 12].
5 Why Snake- and Spider-Venom-Derived Toxins Represent Good Lead

Compounds for Peptide Drug Development?
The pharmaceutical industry is currently facing unparalleled chal-

lenges to develop innovative new drugs. Although the low annual
number of new drugs approved by the Food and Drug Administra-
tion (FDA) has not changed much or even decreased, research and
development (R&D) investment per drug is escalating at a rapid
rate. Both safety and efficacy hurdles are responsible for the rising
cost in drug discovery and development. The purpose of drug
design is to find the optimal structure that possesses high specificity
for the biological target while decreasing the likelihood of side
effects. HTS of combinatorial chemical libraries is very expensive,
thus contributing heavily to drug development cost, forcing the
pharmaceutical companies to rely more on academic and in
house innovation, and rekindling their interest in natural products
as a source of NMEs. The complex molecular scaffolds found in
venom toxins represent a wide chemical diversity that is unmatched
by synthetic molecules [13, 14]. Indeed, the opportunity of using
venom-derived toxins for drug development can be considered as
the optimal phase of “the nature drug discovery program”
operating over hundreds of millions of years of evolution resulting
with very potent and selective hits. With scientific advancements in
modern molecular and cellular biology, analytical chemistry, and
pharmacology, the unique properties of natural products including
8 Philip Lazarovici
venoms and toxins are being harnessed in order to exploit the

chemical and structural biodiversity of these types of products in
relation to their therapeutic effect. Often, new toxins of interest in
drug design units are used for the rearrangement of chemical
entities in order to generate new molecules which can be formu-
lated into clinically useful drugs [15]. Snakes and spider venoms are
abundant natural sources of NMEs, which have been relentlessly
enhanced by evolution through natural selection [16]. Since most
venomous animals rely heavily on their venom for survival, a con-
stant selection pressure exists on toxin potency and efficacy. As a
result, toxins typically possess good pharmaceutical characteristics
such as low molecular mass, stability, folding by disulfide bridges
apart from high selectivity, and affinity for a wide variety of molec-
ular targets in mammalian physiological systems. This activity is
more difficult to replicate by the synthesis of small molecules,
making therefore snake and spider toxins extremely valuable as
lead compounds in drug development. However, there are many
technological issues to overcome, as toxin peptides are hard to
obtain and characterize and the amount obtained, in particular
from spider venom, is insufficient to perform all the necessary
animal experiments and in vitro assays. Fortunately, novel meth-
odologies of heterologous protein expression in bacteria, yeast,
insect, and mammalian cells, as well as up scaling peptide chemical
synthesis, help to provide enough quantities and allow chemical
and pharmacological improvement of these toxins.
5.1 Which Many snakes specifically evolved to immobilize vertebrate prey

Therapeutic through the use of large amounts of venom injected into their
Applications Are prey by fangs or teeth. The complex synergistic action of venom
Known for Drugs on prey tissue is mediated by its composition including several
Developed from dozen of different families of toxic proteins and peptides with or
Snake-Venom-Derived without enzymatic activity [17]. Phospholipases A2, metallopro-
Protein Toxins? teases, serine proteases, and three-finger toxins are the most abun-
dant protein constituents of snake venom. Some of these are
neurotoxins targeting and modifying the neuromuscular junction
synaptic activity, using different types of pre- and postsynaptic
nicotinic and muscarinic receptors, or serve as acetylcholine esterase
inhibitors. Other toxins modulate the cardiovascular system, repre-
sented by a wide range of pro- and anticoagulant proteins, disin-
tegrins which block integrin receptors with different relative
selectivity, fibrinolytic agents, natriuretic peptides, etc. Some of
these toxins have been developed into research and diagnostic
tools or drugs used to treat diseases of the cardiovascular system,
such as blood coagulopathies and high blood pressure. To under-
stand this approach we should exemplify two antiplatelet (antico-
agulant) drugs in the clinic, tirofiban and integrilin; a compound in
clinical trials for heart failure therapy, named Cenderitide; and an
antiplatelet (anticoagulant) compound in preclinical research,
named Vipegitide (Table 1).
Table 1
Selected, FDA-approved drugs and new molecular entities in chemical trials and preclinical research, developed from snake-venom-derived protein
toxin
Development Pharmacological Therapeutic Administration

Name phase Snake name definition Target application routes Reference
Captopril Drug in clinic Pit vipera Non-peptide mimetic ACEb Hypertension Oral, iv [43]
inhibitor
Tirofiban Saw-scaled viperc Non-peptide mimetic αIIb β3 Integrin ACSd iv [44]
antagonist
Integrilin Pygmy rattlesnakee 6 aa - Cyclic peptide αIIb β3 Integrin ACSd iv [19]
antagonist
Cenderitide Clinical trials Eastern green mambaf 37 aa - Peptide agonist Guanylyl cyclase CHFg iv [45]
receptors A and B
Vipegitide Preclinical Israeli viperh 13 aa - Peptidomimetic α2β1 Integrin Thrombosis iv [24]
research antagonist
Textilinin Australian common Recombinant protein Plasmin Fibrinolysis, iv [46]
brown snakei 7000 Da inhibitor hemorrhage
Haempatch Factor Xa-like protein Thrombin Hemorrhage iv [47]
CoVase Factor Va-like protein Thrombin Hemorrhage iv [47]
a
Bothrops jararaca
b
Angiotensin-converting enzyme
c
Echis carinatus
d
Acute coronary syndrome
e
Sistrurus miliarius barbouri
f
Dendroaspis angusticeps
g
Chronic heart failure
h
Vipera palaestinae
i
Pseudonaja textilis
Venom Derived Toxins in Drug Development
iv intravenous, aa amino acid

9
10 Philip Lazarovici
Members of the snake-venom-derived “disintegrin” peptide

family containing the Arg-Gly-Asp (RGD) amino acid sequence
are among the most potent inhibitors of the binding of adhesive
proteins to platelet glycoprotein (GP) IIb-IIIa. The first antiplatelet
drug derived from a snake venom disintegrin was Tirofiban (Aggra-
stat). Tirofiban is a non-peptide molecule that was developed based
on the structure of the RGD tripeptide motif present in the parent
disintegrin molecule, echistatin isolated from the venom of the
saw-scaled viper [18]. Through the synthesis and optimization of
the RGD-motif lead peptide, a peptidomimetic was developed and
optimized which ultimately led to the development of this selective
inhibitor of platelet aggregation (Table 1). However, GPIIb-IIIa
antagonists containing the RGD sequence are not integrin specific
and inhibit the adhesive functions of many other RGD-dependent
integrins resulting in many side effects. The disintegrin peptide,
barbourin, isolated from the southeastern pigmy rattlesnake, con-
tains a conservative amino acid substitution of Lys (K) for Arg
(R) in the RGD sequence resulting with a KGD motif highly
specific for GPIIb-IIIa. Using this information, a series of confor-
mational constrained, disulfide-bridged peptides, containing the
KGD amino acid sequence, were synthesized. Incorporation of
the KGD sequence into a cyclic peptide template, followed by
systematic optimization of the cyclic ring size, optimization of
secondary hydrophobic binding-site interactions, and derivatiza-
tion of the lysyl side-chain functionality of the KGD sequence,
has resulted in peptide analogs which display inhibitory potency
and GPIIb-IIIa selectivity comparable to that of barbourin
[19]. Eptifibatide (Integrilin), the drug derivative of barbourin, is
a cyclic heptapeptide that mimics the tertiary structure found in the
parent toxin which allows it to bind receptors with the KGD
integrin recognition sequence (Table 1). Eptifibatide is a competi-
tive antagonist for the activated platelet glycoprotein IIb/IIIa
receptor. Its mechanism of action involves preventing the binding
and cross-linking of fibrinogen to the platelet surface. Arterial
injury induced by percutaneous coronary interventions (PCI)
such as balloon angioplasty and stenting and the spontaneously
occurring disease process known as the acute coronary syndrome
(ACS) share a common underlying pathophysiology. In both situa-
tions, disruption of integrity of the arterial wall initiates a cascade of
platelet activation, adhesion, and aggregation. Ultimately, this
pathological process may proceed to arterial thrombosis unless
controlled or modified. Advances in understanding how the plate-
let plays a pivotal role in this process have significantly enhanced
therapy for patients with ACS and have resulted in important
reductions in thrombotic complications from PCI procedures.
Central to these advances has been the understanding of eptifiba-
tide interaction with platelets. The binding of eptifibatide to the
integrin receptor involves displacement of receptor-associated Ca2+
from the activated binding site. Through a series of small clinical

trials and laboratory studies an effective dose schedule was deter-
mined. Modeling of the drug based on its two-compartment phar-
macokinetics defined the role of a double-bolus initiation of
therapy. In a large-scale clinical trial using this double bolus fol-
lowed by infusion regimen in PCI procedures, clinical efficacy was
shown to be significantly improved [20]. To date, in addition to the
dual-antiplatelet therapy of aspirin and clopidogrel and systematic
stent implantation, the use of the eptifibatide proved beneficial in
improving early outcome of percutaneous coronary intervention
(PCI), especially in higher risk clinical and/or anatomical subsets
(Table 1).
Another snake venom, toxin-based compound, in clinical trials
for heart failure, is Cenderitide (Table 1). Cenderitide consists of the
5-amino acid amino-terminus and the 17-amino acid disulfide ring of
C-type natriuretic peptide (CNP) to which the 15-amino acid
carboxy-terminal of Dendroaspis natriuretic peptide (DNP) was
fused. DNP is a natriuretic peptide (NP) isolated from the venom
of the eastern green mamba snake (Dendroaspis angusticeps). CNP is
considered to be the oldest member of the family of natriuretic
peptides, which, contrary to its name, does not exhibit kidney effects.
It lacks a carboxyl-terminus and is highly specific for binding to the
particulate guanylyl cyclase receptor B (pGC-B). Furthermore, the
lack of a carboxyl-terminus renders CNP highly susceptible to cleav-
age by neprilysin (NEP). Physiologically, CNP via activation of
pGC-B exhibits anti-fibrotic properties and is also involved in bone
metabolism and repair of the vascular endothelium. Atrial NP (ANP),
brain NP (BNP), and snake DNP, however, bind to pGC-A and
regulate body fluid homeostasis and induce natriuresis and vasodila-
tion. Thus, the chimeric peptide Cenderitide, also termed CD-NP,
was designed to combine the beneficial effects of CNP, which inhibits
fibrosis, and DNP which exerts natriuretic activities by simulta-
neously activating both pCG-A and pCG-B receptors. Cenderitide
was evaluated in 12 clinical trials for therapeutic efficacy in stable,
chronic heart failure, preservation of left ventricular function, and
moderate kidney dysfunction (ClinicalTrials.Gov). Four-hour infu-
sion of Cenderitide was found to be safe and well tolerated, and
significantly increased plasma cGMP levels and urinary cGMP excre-
tion without adverse effects, with no change in blood pressure,
indicating a favorable safety profile and expected pharmacological
effects in human heart failure [21].
Another, typical basic methodology to select a lead compound
from a snake venom is exemplified by our preclinical studies using
disintegrins from the venom of Vipera palestinae, to develop Vipe-
gitide, an antiplatelet (anticoagulant) lead compound [22–25]. In
the first step, the snakes were maintained under good laboratory
practice (GLP) conditions and were manually milked over 1 year,
and the venom from several snakes was pooled to several gram
quantities (alternatively the venom can be purchased from several
reliable commercial sources). In the second step, the venom was

extracted in cold water and separated by high-pressure liquid chro-
matography (HPLC) on C18 column, using a linear gradient of
increasing acetonitrile concentration. HTS of the fractions, used in
cell adhesion assays of cells overexpressing α2β1 integrin, identified
fraction 12 as active (selective antagonist of α2β1). The third step of
purification used ion-exchange chromatography that was per-
formed with a Mono Q column resulting with a very pure protein
named VP 12 [26]. Purity of VP 12 was tested by SDS-PAGE
under reduced and non-reduced conditions indicating a dimeric
structure of this molecule. In the next step, the amino acid
sequences of the two subunits of VP 12 were established by a
combination of mass spectrometry and N-terminal sequencing of
their proteolytic fragments. For this purpose, the VP 12 molecule
was reduced and cysteines were ethylpyridylated (EP); the ethylpyr-
idylated subunits were separated on reverse-phase HPLC and
named VP 12A and VP 12B. Thereafter, MALDI-TOF mass spec-
troscopic analysis of unmodified VP 12 yielded a single molecular
ion of 30,387 Da, whereas EP-VP 12A and EP-VP 12B subunits
showed 15,981 Da and 15,893 Da, respectively. Based on these
values, we calculated the number of cysteines in the VP 12 molecule
using the equation: NCys ¼ (MPE MNat)/106.3, where NCys is
a number of cysteine residues per molecule, MPE is the mass of the
reduced and ethylpyridylated protein, MNat is the mass of the
native protein, and 106.3 is the mass increment due to the
ethylpyridylation of one thiol group. NCys ¼ [(15,981 +
15,893) 30,387]/106.3 ¼ 13.99; therefore, the calculated num-
ber of cysteines in the whole molecule was 14. Based on the
structure of other C-lectin-type protein isoforms, which has similar
activity as VP 12, we predicted that each subunit contained an equal
number of seven cysteines. Complete amino acid sequences of both
subunits of VP 12 were established using a standard procedure
including N-terminal sequencing of separated EP subunits and
their tryptic, overlapping fragments, indicating that VP 12 belongs
to the C-type lectin-related protein family [26]. In another
approach, to specifically isolate additional antagonists targeting
the α2β1 integrin, we developed a protocol based on affinity chro-
matography using extracellular recombinant α2β1 integrin-A
domain, immobilized to a resin, resulting with the isolation of the
toxin VP-i. We found that VP-i binds to the α2 integrin A domain
and that it significantly inhibited adhesion of various cells to type I
collagen as well as cell migration. Moreover, we found that VP-i
differed structurally from the previously purified VP 12, although
not functionally, and therefore represented another venom lead
compound which can be utilized for further drug development
[25]. In the next steps, linear and folded peptides containing the
integrin-binding motif W1KTSRTSHY9 were used as lead com-
pounds to synthesize a novel peptidomimetic antagonist of α2β1
integrin, with platelet aggregation-inhibiting activity, named Vipe-

gitide. Vipegitide is a 13-amino acid, folded peptidomimetic mole-
cule, containing two α-aminoisobutyric acid residues at positions
6 and 8, but found not stable in human serum. Substitution of
glycine and tryptophan residues at positions 1 and 2, respectively,
with a unit of two polyethylene glycol (PEG) molecules yielded the
peptidomimetic Vipegitide-PEG2, which was stable in human
serum for over 3 h. Vipegitide and Vipegitide-PEG2 were charac-
terized by high potency (7 1010 M and 1.5 1010 M, respec-
tively) and intermediate efficacy (40% and 35%, respectively) as well
as selectivity toward α2 integrin in inhibition of adhesion of α1/
α2 integrin-overexpressing cells toward respective collagen ligands.
Interaction of both peptidomimetics with an extracellular active
domain of α2 integrin was confirmed in a cell-free receptor-binding
assay using recombinant α2 integrin extracellular A-domain. Integ-
rin α2β1 receptor is found on the platelet membrane and triggers
collagen-induced platelet aggregation. Vipegitide and Vipegitide-
PEG2 inhibited α2β1 integrin-mediated adhesion of human and
murine platelets under static and flow conditions by 50%. They
efficiently blocked collagen I-induced platelet aggregation in
platelet-rich plasma and whole-human blood. Higher potency of
Vipegitide than Vipegitide-PEG2 was consistent with results of
computer modeling of these molecules in water. These peptidomi-
metic NMEs were acutely tolerated in mice upon intravenous bolus
injection of 50 mg/kg. These results underline the use of Vipegi-
tide and Vipegitide-PEG2 molecules as platelet aggregation-
inhibiting lead drug compounds and pharmacological tools in
antithrombotic therapy [24]. Table 1 also presents additional
snake venoms derived NMEs in preclinical research: (1) textilinin-1,
a selective plasmin inhibitor whose application as an anti-
fibrinolytic agent can reduce blood loss associated with surgeries;
(2) haempatch, a factor Xa-like protein characterized by potent
procoagulant effects developed as a hemostatic agent to reduce
blood loss resulting from surgery or trauma; and (3) CoVase, a
procoagulant cofactor that may have applications as a systemic
antibleeding agent in the treatment of hemorrhage. Finally, it is
important to note that a wide range of other protein toxins found
in snake venoms have been used in the development of laboratory
diagnostic kits available in hematology laboratories of hospitals, to
measure levels of fibrinogen, prothrombin, blood-clotting factors,
and protein C associated with hemostatic disorders.
5.2 Which At present, about 39,000 species of spiders exist worldwide. With the
Therapeutic exception of several hundred species, all of these are poisonous using
Applications Are their venom’ toxins for prey catching. Some spiders beeing small
Known for Spider- produce small amounts of venom. However, they contain very
Venom-Derived Toxin potent toxins to quickly paralyze their prey therefore, explaining
Peptides? the minute amount of venom produced. Once the pray is paral-
yzed, the spiders ingest the liquefied tissues due to hydrolytic activity
of venom enzymes. The main components of spider venoms are

large-molecular-weight enzymes and peptides of molecular weight
between 1 and 10 kDa. The high number of molecular targets
known to be modulated by spider toxins, with high selectivity and
potency, makes the spider venom-isolated peptides attractive lead
compounds. These peptides’ primary sequence is typically less than
45-amino acid residues in length, forming a three-dimensional fold
structure, known as the “inhibitor cystine knot (ICK) motif,” which
confers to these toxins’ chemical, thermal, and biological stability.
ICK is defined as an antiparallel β-sheet stabilized by a cysteine knot
comprising a ring formed by two disulfide bridges and the interven-
ing sections of polypeptide backbone, with a third disulfide bridge
piercing the ring to create a pseudo-knot. In addition, spider venom
contains small peptides without disulfide bonds, which permeate
cells’ plasma membrane by pore formation. Since spiders employ
their venom to paralyze the prey, it is not surprising that these
venoms mainly contain peptides that fast paralyze the nervous system
by targeting and modulating the activity of neuronal ion channels
and ligand-gated ion channel receptors such as sodium channels
(NaV), potassium channels (KV), calcium channels (CaV), acid-
sensing ion channels (ASIC), mechanosensitive channels (MS), tran-
sient receptor potential channels (TRP), and certain purinergic
receptors (P2X). Not only do most of these peptides have selectivity
for a given category of ion channel, but also they can have anything
from relative selectivity to exquisite selectivity for a given channel
subtype [27]. This potential for high target affinity in the range of
picomolar to nanomolar and selectivity for ionic channels and recep-
tor subtypes makes spider-venom peptides an ideal natural source of
lead compounds for therapy of pain and channelopathies (such as
epilepsy and arrhythmias), diseases caused by disturbed function of
ion channel subunits. Although a wide range of generic names have
been reported for spider peptide toxins, in the last decade a more
rational nomenclature for naming peptide toxins has been adopted
by ArachnoServer and UniProtKB [28], helping in pharmaceutical
applications. Although none of the spider-venom-derived peptide
toxins and related analogs have emerged yet as drugs in the clinic,
many of them are in preclinical development and/or clinical trials
predominantly targeting NaVs and CaVs. Voltage-gated NaVs and
voltage-gated CaVs play key roles in action potential generation in
sensory pain-mediating neurons and consequently these channels
have become important targets for the development of analgesic
drugs. In Table 2 we present selected spider-venom-derived NMEs
targeting NaV and CaV, investigated by academic laboratories and
pharma companies, to envision their potential for pain therapeutic
applications.
The NaV channel family is comprised of nine subtypes,
NaV1.1–NaV1.9, and spider-venom peptides have been identified
that target each of these subtypes. NaV1.7, NaV1.8, and NaV1.9
are expressed predominantly in nociceptive neurons and are
Table 2
Selected new molecular peptide entities in preclinical research for analgesia (iv injection), developed
from spider-venom-derived peptide toxins
Name Spider name Pharmacological definition Target Reference

CcoTx-1 Ceratogyrus cornuatus 33 aa Peptide inhibitor NaV1.7 [29]
GpTx-1 Grammostola porteri 34 aa Peptide inhibitor [30, 48]
ProTx-II Thrixopelma pruriens 30 aa Peptide inhibitor [49, 50]
JNJ 63955918 ProTx-II peptide analog [33]
HwTx-IV Ornithoctonus huwena 35 aa Peptide inhibitor [51]
ω-Aga-IVA Agelenopsis aperta 48 aa Peptide inhibitor CaV2.1 [52, 53]
ω-Aga-IVB [54]
HwTx-X Ornithoctonus huwena 28 aa Peptide inhibitor CaV2.2 [55]
SNX-325 Segestria florentina 49 aa Peptide inhibitor [56]
CSTX-1 Cupiennius salei 74 aa Peptide inhibitor CaV1.1–1.4 [57]
ω-TRTX-Cc1a Pelinobius muticus 39 aa Peptide inhibitor CaV1.2/1.3 [58]
thought to play important roles in pain signaling. The 1.7 subtype

of the voltage-gated sodium channels (NaV) has emerged as one of
the hottest drug targets for channel modulators over the past
decade. Thus, selective inhibitors of NaV1.7 based mainly on
tarantula spider venom toxins, are potential leads for development
of future analgesic drugs towards different types of pain. During
this process of drug development caution must be taken since
nonspecific blockades of other NaV subtypes (lack of selectivity)
may lead to substantial side effects, including seizures, arrhythmias,
and impaired motor function. Pfizer Co. developed potent and
selective blockers of NaV1.7 with improved therapeutic properties
using ceratotoxin-1 (CcoTx1) isolated from the venom of the
tarantula Ceratogyrus cornuatus [29]. Employing structure-activity
relationship and chemical modification, the research and develop-
ment group of the company created potent (IC50 in nanomolar
range) and selective (80-fold and 20-fold over the closely related
NaV1.2 and NaV1.6 channels, respectively, and 1000-fold over
skeletal NaV1.4 and cardiac NaV1.5 channels) peptide drug inhi-
bitors of NaV1.7. Amgen Co. identified and characterized GpTx-1,
a known antagonist of TTX-sensitive sodium channels, from the
venom of another tarantula spider, Grammostola porteri [30].
GpTx-1 was first reported as a CaV channel blocker after isolation
from venom of the closely related Chilean tarantula, Grammostola
rosea, and named GTx1 as also identified in the venom of the
Chilean copper tarantula, Paraphysa scrofa. On the basis of its
potency and selectivity, GpTx-1 was used as a lead compound to
target Nav1.7. The synthetic, folded-analog (Ala5, Phe6, Leu26,
Arg28) GpTx-1 was found to be very potent (IC50 of 1.6 nM
against NaV1.7) and selective (about thousand fold less selective
for NaV1.4, and NaV1.5) peptide drug inhibitors of NaV1.7

[31]. Merck Co. focused their development program on optimiz-
ing ProTX-II as a lead compound for a painkiller drug selectively
targeting NaV1.7 [32]. Protoxin-II (ProTX-II) was isolated from
the Peruvian green velvet tarantula, Thrixopelma pruriens, and is
composed of 30 amino acids and 3 disulfide bonds which adopt an
ICK motif structure. ProTx-II inhibits both tetrodotoxin-sensitive
and tetrodotoxin-resistant voltage-gated sodium channels. ProTx-
II inhibits activation by shifting the voltage dependence of channel
activation to more positive potentials. ProTx-II blocks NaV1.7
with an IC50 value of 300 pM, and NaV1.2, NaV 1.5, and NaV
1.6 with IC50 of 41 nM, 79 nM, and 26 nM, respectively. Using
ProTX-II as a scaffold, Janssen Co. screened a library of over 1500
venom-derived peptides and identified JNJ63955918 as a potent,
highly selective, closed-state Nav1.7 blocking peptide. They show
that JNJ63955918 induced a pharmacological insensitivity to pain
that closely recapitulates key features of the Nav1.7 knockout phe-
notype seen in mice. Moreover they demonstrated that this NME
has a high degree of selectivity, coupled with a closed-state-depen-
dent mechanism of action which is required for strong efficacy.
Their research indicated that peptides such as JNJ63955918 may
represent a viable, non-opioid alternative, for the pharmacological
treatment of severe pain [33]. Medimmune Co. developed a triple
mutant of HwTx-IV (E1G, E4G, Y33W) which is one of the most
potent blockers of NaV1.7 reported to date (IC50 of 500 pM).
Huwentoxin IV (HwTx-IV) lead compound is a 35-amino acid
peptide toxin which also adopts an ICK fold, inhibiting NaV1.7
with an IC50 of 26 nM, isolated from the venom of the Chinese
bird-eating spider Selenocosmia huwena. Characterization of the
toxin-channel interaction revealed that the peptide binds to one
of the four voltage sensor domains (VSDs) of the NaV1.7 channel,
in contrast to small molecules-local anesthetic drugs that modulate
the pore region. The channel pore is more highly conserved among
the different NaV1 subtypes compared to the VSDs, making VSDs
attractive targets for the development of selective drugs
[31, 34]. There are many reports indicating the existence of drug
development programs at academic institutions and companies, as
described above, which have further optimized the potencies and
selectivity of other spider-venom-derived peptide lead compounds
as inhibitors of NaV1.7. The huge pharmaceutical advantage of
spider-venom-derived toxin peptides, as emphasized in Table 2
with tarantula-derived lead compounds, demonstrates the strong
opportunity and feasibility for development of more selective anal-
gesic drugs targeting NaV1.7.
The CaV family of channels is composed of about ten subtypes
denoted CaV1.1–1.4 (L-type), CaV2.1 (P/Q-type), CaV2.2
(N-type), CaV2.3 (R-type), and CaV3.1–3.3 (T-type) based on
their biophysical, electrophysiological, and pharmacological
properties. CaV2.1, CaV2.2, and CaV3 are the best validated tar-
gets for the development of analgesic drugs [35]. This was sup-
ported by the pharmaceutical development of the nonnarcotic pain
reliever Ziconotide (Prialt), an ICK peptide (derived from the
venom of the cone snail Conus magus) selectively targeting
CaV2.2 which is an FDA-approved analgesic drug available in the
clinic. Many spider-venom-derived toxins target and inhibit CaV
channels, but very few of these peptides display selectivity for a
particular CaV channel subtype. For example, PnTx3-6, a neuro-
toxin purified from the venom of the spider Phoneutria nigriventer
is a nonselective blocker of CaV1, CaV2.1, CaV2.2, and CaV2.3 by
physically occluding the channels that was shown to be analgesic in
mice models of neuropathic pain [36, 37]. This lack of complete
selectivity does not necessarily exclude this peptide toxin from the
drug development process, since different chemical modifications
may eventually lead to a more selective lead compound. Table 2
presents a few selected examples of spider-venom-derived NMEs,
developed by pharma companies or reported in academic research,
targeting CaVs, to envision their potential for pain therapeutic
applications. Pfizer Co. was among the first to use, as lead
compounds, spider-venom-derived ω-agatoxin- IVA and IVB,
48-amino acid peptides isolated from the venom of the American
funnel-web spider Agelenopsis aperta that target CaV2.1 channels
with nanomolar high affinity. These peptides are the most selective
CaV2.1 blockers described to date, which upon binding to the
channel shift the activation voltage of the channel to nonphysiolo-
gical positive potentials and confer relief from different types of
pain. Other spider-venom-derived toxin peptides that display selec-
tivity for other calcium channel subtypes, the CaV2.2 channels, are
HWTX-X, a 28-amino acid peptide with three disulfide bridges
ICK toxin peptide, purified from the venom of the spider Ornithoc-
tonus huwena and SNX-325, a 49-amino acid peptide with four
disulfide bonds from the venom of the spider Segestria florentina.
However, the characterization of the analgesic effect of these toxins
has not yet been reported. Other spider-venom-derived toxin pep-
tides target with relative selectivity neuronal CaV1.1-1.4. Typical
examples are represented by CSTX-1, a 74-amino acid peptide with
four disulfide bridge toxin isolated from the venom of the hunting
spider Cupiennius salei and ω-TRTX-Cc1a, a 39-amino acid pep-
tide with three disulfide bridges from the venom of the tarantula
Citharischius crawshayi (now Pelinobius muticus). Table 2 indicates
that the spider-venom-derived peptide toxin NMEs in preclinical
research for analgesia, using the intravenous delivery route, are ICK
peptides in the range of 30–74 amino acids folded by three or four
cysteine bridges. Drug development of these peptides may result
with smaller size lead compounds. Definitely, further screening of
spider venoms might provide a source of NMEs for drug develop-
ment to cope with the unmet clinical need for selective inhibitors of
Fig. 1 A flowchart of the screening, identification, lead discovery, and in vitro and
in vivo preclinical development of drug candidates of new molecular entities,
based on snake- and spider-derived protein/peptide toxins. Bioassay-guided
CaV2.1 in pain relief. Continued methodologies and technical

advances in the spider-venom-based drug discovery process are
likely to uncover many new leads for other therapeutic applications
besides analgesia.
6 What Is a Common Preclinical Pipeline for Drug Development Based

on Snake- and Spider-Venom-Derived Protein/Peptide Toxins?
As a consequence of their high potency and selectivity, snake- and

spider-venom-derived proteins and peptide toxins have proved par-
ticularly useful for in vitro and in vivo proof-of-concept pharmaco-
logical studies. However, to use them for drug development, a
number of important issues associated with the development of
the suitable lead compound, its safety, pharmacokinetics and phar-
macodynamics, and delivery route need to be investigated. Opti-
mization of toxin-derived lead compound structure-activity
relationships, efficient delivery to peripheral and central targets,
and its therapeutic index will help to determine whether or not
these peptide toxins can be considered candidates for drug devel-
opment. In the preceding sections we surveyed a number of snake-
and spider-venom peptides with successful potential therapeutic
applications (Tables 1 and 2). The snake and spider “venomics to
drug” approach, as presented in Fig. 1, starts with collection of
venom and its fractionation by gel permeation, ion exchange, and
reverse-phase HPLC, followed by bioassay-guided screening to
detect active toxins (Fig. 1, steps 1, 2). They are characterized by
a combination of N-terminal sequencing, SDS-PAGE, and mass
spectrometric determination of the molecular masses and the cys-
teine content (Fig. 1, steps 2–5). Protein fractions indicating a
single electrophoretic band, molecular mass, and N-terminal
Fig. 1 (continued) isolation and purification approaches are based on pharma-

cological screening of crude venoms fractions obtained by gel permeation, ion
exchange, and/or reverse-phase high-performance liquid chromatography
(HPLC). Purified venom peptides are sequenced using mass spectroscopy
and/or Edman degradation. Alternatively, sequence-based venom peptide dis-
covery incorporating transcriptomics, proteomic, and bioinformatic approaches
can contribute to the identification of bioactive venom protein/peptide toxin hit,
making it a complementary and additive strategy to the pharmacological
screening-based toxin drug discovery. Synthetic or recombinant toxins can be
prepared and evaluated by the same pharmacological assays. Structure-activity
relationship (SAR) studies will further generate lead compounds which are
refined based on optimal potency, selectivity, efficacy, and safety. Characteriza-
tion of these compounds’ pharmacokinetics (ADME properties) and safety pro-
files will allow the selection of drug candidates to be evaluated in animal disease
models and the clinical trials
sequence can be straightforwardly assigned by BLAST analysis to a

known protein family (Fig. 1, step 6). Large-molecular-weight
toxins are reduced and cysteines are ethylpyridylated (EP); the
ethylpyridylated subunits are again separated on reverse-phase
HPLC and processed for MALDI-TOF mass spectroscopic analy-
sis. Toxins indicating heterogeneous or blocked C- or N-termini
are analyzed by SDS-PAGE and the bands of interest are subjected
to reduction, carbamidomethylation, and in-gel tryptic digestion.
The resulting tryptic peptides are then analyzed by MALDI-TOF
mass fingerprinting followed by amino acid sequence determina-
tion of selected doubly and triply charged peptide ions by collision-
induced dissociation tandem mass spectrometry (Fig. 1, steps 4,
5). In general, snake and spider venoms were screened in medium-
to high-throughput assays against targets of therapeutic interest
(receptors, ionic channels), and then “hit isolated fractions” were
chromatographically fractionated and the individual fractions were
rescreened in order to isolate proteins/peptides responsible for
bioactivity. In some cases, incomplete sequence information
acquired via MS/MS and/or Edman degradation was used for
designing primers to amplify transcripts encoding the toxin of
interest from a venom gland cDNA library and used for production
of recombinant toxins and purified spider peptides were submitted
for solid-phase peptide synthesis. Both approaches were carried out
in milligram scale (Fig. 1, step 7). Technologies such as nanoscale
nuclear magnetic resonance (NMR) for structure determination,
full-length combinatorial chemical synthesis, transcriptomics, and
proteomics are all crucial and complementary technologies for the
successful development of snake- and spider-venom-derived toxins
as lead drug compounds in steps 1–7 described in Fig. 1. Once the
protein or peptide sequence is identified, the minimal binding
motif (sequence) to the receptor or ionic channel is further deter-
mined (Fig. 1, step 7a) and used for the synthesis of cyclic, small-
molecule mimetics of venom peptide toxins (Fig. 1, step 8). The
peptide motif that mediates the interaction of these peptides with
their cognate integrin receptors or ion channels can be remarkably
small (3–10 amino acids). As long as high-quality amounts of
protein/peptide toxins are available, this enables their crystallogra-
phy and X-ray analysis, computer modeling, design of non-peptide
mimetic, identification of small-molecule mimetics via in silico
screening of chemical libraries, or a combination of these
approaches. In general, active, cyclic, and small peptides are
obtained following the study of structure-function relationships
(SAR) (Fig. 1, step 8). Achieving water solubility and adequate
affinity to the receptor/ionic channel site is the main goal of the
“venomics to drug” pipeline research and is critical in this step
(Fig. 1, step 9). To reach sufficient selectivity and potency in vivo
it is necessary to find NMEs with binding affinities in the low
nanomolar or even picomolar range. Binding assays are relatively
simple and highly suitable for calculating the affinity for the molec-
ular target. Molecules with high affinity move on to further molec-
ular and cellular assays that determine the functional effects on the
target molecule in order to distinguish agonistic from antagonistic
receptor effects or openers or closers of ionic channels. Binding and
functional assays define the in vitro segment of this selection pro-
cess. Refined lead candidate molecules with sufficient binding affin-
ity, selectivity, and functional efficacy and a good therapeutic
window (Fig. 1, steps 9, 10), estimated by cell death in vitro assays
(see Chap. 11), are taken forward into in vivo safety and pharmaco-
kinetic evaluation and selection processes (Fig. 1, step 11). Based
on the data achieved, the optimal molecules from the ADME and
toxicological evaluations are selected as drug candidates (Fig. 1,
step 12) and in general licensed by academic laboratories or further
developed by pharma companies toward clinical trials (Fig. 1, step
13). From the ADME point of view, we would like to stress that in
the spider-venom-derived peptide toxins, the structure is stabilized
by an ICK motif. When rapid hydrolysis proves to be disadvanta-
geous for a spider-venom peptide of therapeutic interest, strategies
such as D-amino acid substitution of susceptible residues, cycliza-
tion to reduce conformational flexibility, protection of the termini
via C-terminal amidation, or use of N-terminal alkylation could be
employed to improve metabolic stability (proteolytic resistance).
Because of their inherent proteolytic resistance, the plasma half-life
of ICK peptides is likely to be determined by the rate at which they
are metabolized and eliminated. There are different strategies that
can be employed to reduce their degradation and clearance rates,
such as increasing the peptide mass by PEGylation, conjugation to
carrier proteins, or making peptides more hydrophobic in order to
enhance their nonspecific binding to serum albumin. As empha-
sized in Tables 1 and 2, for cardiovascular diseases and chronic
conditions such as persistent pain, injection of snake- and spider-
venom-derived proteins or peptide drugs is likely to be an accept-
able route of administration. In certain pathologies, alternative
local routes of administration such as intranasal, dermal, pulmo-
nary, and/or intrathecal may be a viable option if the difficulties
associated with peptide delivery are outweighed by the benefits of
treatment. Generally, however, oral delivery is likely to be desirable
but not yet considered for snake- and spider-venom-derived pro-
tein/peptide drugs. A major barrier to successful oral delivery of
peptide and protein molecules is their inherent instability in the
lumen of the gastrointestinal tract. In human gastric fluid, the
larger peptide drugs including somatostatin, calcitonin, secretin,
glucagon, and insulin are metabolized rapidly, while the smaller
peptides like oxytocin, vasopressin, and desmopressin, containing
disulfide bridges between their cysteine amino acids, partially
cyclize their structure and result in high resistance to pepsin cleav-
age and show good stability in gastric fluids. In human small
intestinal fluid, however, both small and large peptides degraded
rapidly with the exception of the cyclic peptide cyclosporine and the
disulfide bridge-containing peptides octreotide and desmopressin,
which showed good stability [38]. We would like to propose that
the intrinsic stability of ICK peptides is likely to facilitate the
development of oral delivery strategies since they will presumably
have much higher stability in the gastrointestinal tract and as a
result increased bioavailability upon oral delivery. In case of unsat-
isfactory results, the snake- and spider-derived drug candidates may
be improved by substituting the disulfide bond cyclization to back-
bone cyclization to increase stability and methylation to increase
intestinal permeability. The approach of backbone cyclization is a
general method well accepted in medicinal chemistry, by which
conformational constraint is imposed on peptides. In backbone
cyclization, a peptidomimetic is formed by covalently interconnect-
ing atoms in the backbone (N and/or C) of a target linear peptide
to form a ring. The advantage of backbone cyclization over other
modes of peptide cyclization is that cyclization is achieved mainly
using backbone atoms and not side chains that are essential for
biological activity. This method has been shown to dramatically
enhance the metabolic stability of substance P in serum without
affecting its selectivity for neurokinin receptor [39] and similarly for
somatostatin analogs [40]. Recent structural studies on libraries of
cyclic hexapeptides led to the identification of common backbone
conformations that are very important to the oral availability of
peptides [41]. With this background we predict that the presence of
N-methylated cis-peptide bonds at certain locations of snake- and
spider-derived-peptide drug candidates may increase their meta-
bolic stability and intestinal permeability through a suitable confor-
mational preorganization [42].
The high degree of method innovation in the field of snake and
spider toxins will generate a new wave of drug research and devel-
opment. Interdisciplinary research using new technologies, as
described in this book, will be essential for the future success of
using snake and spider toxins as novel NMEs that can make signifi-
cant contributions to the cure of human diseases. Through the
combination of venomics (a combination of MS and molecular
biology methodology), transcriptomics, proteomics, recombinant
proteins molecular pharming, and combinatorial peptide synthesis,
the contribution of snake and spider toxins to the future drug
development seems to be very promising.
Acknowledgments
Philip Lazarovici holds the Jacob Gitlin Chair in Physiology and is

affiliated and supported by the Adolph and Klara Brettler Medical
Research Center, the David R Bloom Center for Pharmacy, and the
Grass Center for Drug Design and Synthesis of Novel Therapeutics
at the Hebrew University of Jerusalem, Israel.
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Chapter 2
Analytics for Bioactivity Profiling of Complex Mixtures

with a Focus on Venoms
Marija Mladic, Wilfried M. A. Niessen, Govert W. Somsen, and Jeroen Kool
Abstract
This chapter introduces bioactivity and bioaffinity terms in relation to mixture profiling and gives the
significance of bioactivity and/or bioaffinity profiling of biologically active mixtures in general, and for
bioactive mixtures in drug discovery research in particular. Further, the chapter gives an overview of the
common and less common analytical approaches for bioactivity profiling of bioactive mixtures. Special focus
is put on bioassay-guided fractionation as the standard technique employed (in identification and purifica-
tion of bioactive molecules from a bioactive mixture), and on state-of-the-art post-column bioactivity
profiling approaches, also providing examples and limitations of these analytical methods. On-column and
pre-column bioactivity profiling analytics is also discussed. Examples of bioactive molecules identified and
purified from different natural products are given with emphasis on molecules isolated from animal venoms.
Finally, this chapter briefly discusses the importance of bioactivity profiling of metabolic mixtures in drug
discovery.
Key words Analytical approaches, Bioactivity profiling, Natural products, Venoms, Drug discovery,
Metabolic mixtures
1 Bioactivity/Bioaffinity Profiling of Mixtures for Toxin Identification, Drug

Discovery, and Natural Product Profiling
Bioactivity describes the property of a compound or a set of com-

pounds to modulate biochemical and physiological functions of
living organisms. Identification of bioactive compounds in mix-
tures, such as venoms, plant extracts, and metabolic mixtures, is
an important challenge in different scientific and application fields
that are often highly intertwined. Most of the times, bioactive
compounds are present in very complex mixtures. These mixtures
can at the same time contain multiple bioactives with different
mechanisms of action or with synergistic and/or antagonistic
effects.
Bioactivity profiling of a mixture of compounds means bioac-
tivity assessment of mixture constituents and identification of
Avi Priel (ed.), Snake and Spider Toxins: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 2068,
https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9845-6_2, © Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2020
27
28 Marija Mladic et al.
possibly present bioactives. Bioactivity profiling is generally

directed at finding bioactives for a particular target, most often a
drug target. Commonly, it is used in different screening programs
that aim at the identification of bioactive compounds from different
sample sources. Identifying toxins in venoms for better understand-
ing of venom functioning, for example, is an important research
field. In close relation to this, discovery of new biopharmaceutical
lead compounds from venoms is an important topic within phar-
maceutical sciences. The analysis of metabolic mixtures of drugs
generated either in vivo or in vitro for potential bioactive metabo-
lites represents yet another application of bioactivity profiling. Fur-
thermore, bioactivity profiling of mixtures is important in
toxicology, forensics, natural product sciences, and environmental
and food analysis. In all these fields, a combination of similar
analytical and biological tools is used in order to identify biologi-
cally active compounds from the large variety of complex mixtures.
In this introductory chapter, analytical approaches for bioactivity
profiling of mixtures of interest are discussed, providing a complete
picture of the state of the art in the analysis of biologically active
samples. Special attention will be devoted to venom analysis and
bioactivity-guided identification of toxins.
An important tool in identification and characterization of
venom toxins, and in discovery of new lead compounds, is high-
throughput screening (HTS). HTS is the process of testing large
libraries of diverse chemical structures against disease targets to
identify “hits,” i.e., bioactive compounds, that modulate a particu-
lar biochemical pathway. HTS assays are performed in 96-, 384-, or
1536-well microtiter plates. Robotics, liquid-handling devices, and
sensitive detectors are brought together with advanced data proces-
sing and control software to optimize sample throughput. Based on
ligand-target interactions, HTS is characterized by its simplicity,
rapidness, low cost, and high efficiency, as well as a high informa-
tion outcome. HTS has been developed to rapidly conduct millions
of chemical, genetic, and/or pharmacological tests in order to
identify potential drug candidates [1]. HTS is an excellent tool
for testing the bioactivity of large libraries of pure compounds.
However, the identification of one or more bioactive components
in a mixture requires a combination of analytical strategies for
separation and chemical detection, often involving mass spectrom-
etry (MS) and/or nuclear magnetic resonance spectroscopy
(NMR), with biological assays for the bioactivity detection. Very
often, bioactive mixtures are analyzed by their bioaffinity rather
than their bioactivity. Bioaffinity represents the property of a com-
pound to bind to the target protein, which is generally considered
as the precondition for the compound to cause a biological effect.
In case of venoms, bioactivity is directly probed by measuring, e.g.,
coagulopathic properties, phospholipid hydrolysis, and/or cyto-
lytic activities. Prior to bioactivity assessment, extraction from the
Analytics for Bioactivity Profiling of Complex Mixtures with a Focus on Venoms 29
starting material (for example a venom or plant extract) and

pre-concentration of the compounds of interest may be needed.
Finally, the correct attribution of bioactivity to a certain chemical
structure has to be confirmed by additional tests and full character-
ization of the bioactive compound is required, chemically, pharma-
cologically, as well as toxicologically.
1.1 Bioassay-Guided Over the years, different strategies have been developed for bioac-
Fractionation tivity analysis of complex mixtures, such as venoms, and identifica-
tion of the bioactive components (e.g., venom-derived toxins). The
first and still most frequently used approach is (bio)assay-guided
fractionation (BGF), which was initially introduced for profiling
natural extracts of plants. Similar approaches (often under different
names) were developed and used in other fields where bioactivity
profiling of complex mixtures is of interest [2]. A well-known
example in this regard is effect-directed analysis (EDA) used for
bioactivity assessment and identification of toxic pollutants present
in environmental samples. As the main focus of this book is toward
analytical strategies for toxin identification, bioactivity profiling of
environmental extracts will not be discussed further. Strategies
used in this particular research field were recently reviewed by
Jonker et al. [3].
The BGF approach has been successfully used for identification
of many lead compounds from natural products, such as animal
venoms and extracts from plants. The traditional BGF is a multistep
approach which most often consists of four steps after optional
sample preparation: (1) initial separation of the mixture of interest
followed by low-resolution fractionation (microfractionation);
(2) bioassaying of collected fractions and identification of the bio-
active fraction(s); (3) an additional (preferably orthogonal) separa-
tion step, followed by fractionation and bioactivity assessment
performed on the bioactive fraction to isolate the pure compound
for chemical analysis; and (4) (chemical analysis and) structure
elucidation of the bioactive compound. In many cases, after two
rounds of fractionation, the fractions are still too complex for
bioactive compound identification and further rounds of fractiona-
tions are needed. The sample preparation that precedes BGF can be
simple dilution of a lyophilized sample with optional centrifuga-
tion, as is often done in case of animal venoms. In case of plant
material, the sample preparation step usually includes grinding and
sawing of starting material followed by subsequent extraction of the
bioactive sample using different organic solvents. The choice of the
initial separation highly depends on the nature of the sample ana-
lyzed, but most often it is performed using liquid chromatography
(LC) based on reversed-phase (RPLC), size-exclusion (SEC), or
ion-exchange (IEX) separation mechanisms. SEC and IEX are
especially useful for the initial separation of mixtures mainly con-
taining peptides and proteins such as animal venoms [4, 5]. Other
30 Marija Mladic et al.
approaches include gel chromatography followed by LC [6] or

preparative TLC [7]. Subsequent fractionation of the separated
mixture, also known as microfractionation, is performed manually
in low resolution (long time intervals for fraction collection), gen-
erally resulting in 1 mL fractions. The bioactivity testing of the
fractions collected is usually performed after freeze-drying and
reconstitution in a bioassay-compatible solvent, and it may include
multiple up-concentration or dilution pipetting steps. From our
point of view (see below), this approach is to be considered as
off-line bioactivity testing since the bioassays are performed sepa-
rately from the separation and detection. A variety of in vivo and
in vitro bioassays are employed for the bioactivity assessment. Tra-
ditionally, bioassays included testing of the fractions on isolated
animal organs or tissues or testing on whole animals. With the
development of cell culturing techniques and the possibility of
isolation and/or overexpression of venom toxins (e.g., peptides
and enzymes), the choice and the possibilities of bioassays have
drastically increased. Many successful applications of various bioas-
says using the BGF approach have been reported since for snake
and insect venoms and for plant extracts [4, 7–12]. When one or
more bioactive fractions are found, efforts are put in chemical
analysis of the bioactive compound. Depending on the complexity
of the bioactive fractions, an orthogonal separation can be per-
formed with another round of microfractionation and bioassaying.
In some cases, only one step of separation, fractionation, and
bioactivity testing is needed. After sufficiently pure samples have
been obtained, the chemical analysis of the bioactive compound is
performed using high-resolution MS and NMR. MS is widely used
because of its high sensitivity and the amount of information it
provides. In the case of small molecules, UV-VIS data (absorbance
of ultraviolet or visible light spectrometry) obtained with photodi-
ode array (PDA) detectors can be useful in dereplication (identifi-
cation of already known compounds) and assigning of an unknown
bioactive compound to a certain chemical class [13]. However,
NMR is most often needed for the final confirmation of the struc-
ture. This requires relatively high amounts of pure compounds. In
case of bioactive peptides and proteins, MS-based proteomics
approaches are widely used for amino acid sequencing, and for
the characterization of posttranslational modifications and the posi-
tions of cysteine bridges. However, MS-based proteomics
approaches do not provide full structure characterization. There
may be issues with distinguishing between the isomeric amino acids
leucine and isoleucine. For characterization of the 3D structures of
proteins, other techniques like X-ray crystallography, electron
microscopy, and NMR are needed. Huge efforts put in isolation
of sufficient material for NMR prolong the time needed for identi-
fication of the bioactive. Finally, full chemical and pharmacological
characterization of the compound is performed. Compounds
Analytics for Bioactivity Profiling of Complex Mixtures with a Focus on Venoms 31
obtained from natural products, such as venoms, plants, and micro-

organisms, using the BGF approach have often reached the market
as drugs in their original form. However, next to that, semisyn-
thetic approaches, pharmacophore identification, and structure-
activity relationship [14] studies on these compounds resulted in
many new drugs with improved properties. This is for instance the
case for various betalactam [15, 16] and aminoglycoside [17] anti-
biotics and for statins [18].
1.2 Pre-column and Even though highly successful and still widely used, the BGF
On-Column approach is very laborious and time consuming. Therefore, many
Approaches for academic groups have put significant effort in the development of
Bioaffinity Profiling of alternative approaches for analysis of bioactive mixtures [19]. Part
Mixtures of these efforts were due to advances in separation sciences, in
hyphenation of separation technologies to MS, and especially in
hyphenation of bioassays to separation techniques and MS detec-
tion [20]. Approaches based on protein-ligand affinity separation
will be briefly discussed here first (see Jonker et al. [19] for an
elaborate discussion).
Different techniques based on ultrafiltration, size-exclusion
separation, and centrifugation can be used to analyze affinity of
compounds binding to a solubilized target. Continuous ultrafiltra-
tion [21, 22] is a technique for bioaffinity screening of mixtures by
injecting the target protein into an ultrafiltration chamber, featur-
ing a molecular weight cutoff membrane, after which a bioactive
mixture can be pumped through the chamber. After washing, a
disruption step or sufficient elution time for the bound ligands to
dissociate from the target protein allows processing of the eluted
ligands toward MS for identification. This technique has been
applied in a HTS format for screening of a compound library for
affinity toward a Streptococcal enzyme [23]. Furthermore, online
coupling of ultrafiltration with LC–MS was developed to screen
natural extracts and other mixtures for bioaffinity toward the rele-
vant targets [24–26]. Pulsed ultrafiltration is a further development
and improvement of this approach [27]. In pulsed ultrafiltration,
continuous infusion is replaced by injection of a small amount of
sample into the ultrafiltration unit. Molecules that do not bind to
the target protein are flushed away through the molecular weight
cutoff membrane using a continuous buffer flow. Again, sufficient
elution time or use of a dissociation buffer allows migration of the
ligands toward the MS for their subsequent identification. Pulsed
ultrafiltration has been applied in a metabolic stability study [28]
and in the screening for inhibitors of the retinoid X receptor
[29]. In the field of natural extract screening, the use of pulsed
ultrafiltration has been described for affinity selection of cyclooxy-
genase inhibitors from medicinal plants [30].
SEC coupled to MS can be applied as an affinity selection
method to screen binding of multiple ligands to a receptor
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municipale ou ceux que me fournissait un cabinet de lecture assez
bien au courant des nouveautés.
C’est alors que Balzac me fut révélé. Je le lus tout entier, d’un
seul trait et, quand j’eus fini, je le relus encore et encore. Balzac, ce
géant dont l’œuvre domine le XIXe siècle, me fit comprendre la
société contemporaine en ses origines, sa structure, ses vices et ses
avortements. Comme il insuffla une vie intense à tous les
personnages de la Comédie humaine, ceux-ci m’apparaissaient aussi
réels que si je les avais coudoyés dans la rue ou fréquentés à
domicile. Littéralement, Rastignac, Rubempré, Pons, Nucingen,
Philippe Bridau, Hulot, Esther, Eugénie Grandet, Madame de
Mortsauf, Jenny Cadine et tous les autres, respiraient, agissaient
autour de moi. L’empire du génie balzacien sur mon imagination fut
extraordinaire.
J’étais trop jeune, j’ignorais trop complètement la religion, la
politique, la sociologie pour saisir toute la portée de ces romans — si
l’on peut appeler « romans » de pareilles anatomies du Vrai. C’est
seulement des années plus tard que j’ai perçu la sagesse incluse
dans des livres comme le Médecin de campagne et le Curé du village
et que j’ai admis les principes qui coordonnent toutes les parties du
monument élevé par Balzac à l’Église et à la Monarchie.
Mais, dès cette époque, tout ce qu’il grava de son burin
irrésistible aux profondeurs de mon être contribua, sans doute, à
former quelques-uns des éléments de ma réaction future contre la
folie révolutionnaire.
Immédiatement, je reçus de lui des enseignements précieux pour
ma formation littéraire.
Sous son influence j’écrivis un conte, bien entendu plein de
gaucherie et de réminiscences ingénues, dont je n’ai gardé qu’un
souvenir très vague, l’ayant détruit presqu’aussitôt, tant il me parut
au-dessous de mon modèle. Tout ce que je me rappelle, c’est que j’y
racontais, à travers force descriptions prolixes, les avatars d’un
disciple de Pythagore voué à la métempsycose. Voilà le thème ;
quant aux développements, je les ai oubliés.
Peu à peu, le démon de la littérature me posséda de nouveau et
d’une façon si entière que je fus obligé d’abandonner les projets que
j’avais conçus pour mon avenir. Naguère, encouragé par mes
supérieurs, je méditais d’entrer à l’École de Saumur, puis, une fois
officier, de poursuivre ma carrière dans l’armée d’Afrique.
L’idée n’était pas déraisonnable. Mais, de par Balzac, de par
quelques autres livres aussi — les poèmes et les proses de
Baudelaire, les romans de Barbey d’Aurevilly — elle fut emportée,
balayée comme au souffle d’une rafale brûlante. La fièvre littéraire
se ralluma dans mes veines. Mille sujets de livres me tourbillonnaient
dans la cervelle. Selon cette infatuation juvénile qui gonfle les
débutants, je me voyais entassant volume sur volume, à l’exemple
du Maître, acclamé par une multitude de lecteurs, couronné d’un
laurier d’or par la Gloire !…
Ah ! comme la vie et les dures expériences qu’elle implique se
chargent d’émonder ces rêves exubérants. « La gloire est le soleil
des morts », a dit magnifiquement Balzac lui-même. Mais je n’étais
pas encore apte à retenir cette maxime si profonde en sa concision.
Le sens philosophique du livre amer d’où je l’extrais et qui s’intitule
la Recherche de l’Absolu m’échappait. Et mon esprit devait bien des
fois se fracasser les ailes avant d’en réaliser la vérité…
Toutefois, durant mes six derniers mois au régiment, je ne
négligeai pas trop mon service. Mais le feu sacré n’y était plus. Il
flambait ailleurs — à Paris, où je me voyais déjà installé, en train de
polir les livres dont je ne cessais plus de rêver.
Cette hantise, je l’emportais dans mes promenades solitaires, à la
Roche-d’Érigné, sur le chemin du Lion d’Angers, aux ardoisières de
Trélazé, comme sur cette rive de la Maine où de sveltes peupliers
frémissants reflètent leur feuillage délicat dans les moires et les
remous de l’eau qui fuit sans trêve.
Plus de galops bien rassemblés, plus de trots rythmiques. J’allais
au pas, les rênes flottantes, laissant mon cheval faire ce qu’il voulait.
Je vivais dans le monde féerique des images et des formes, et je les
entendais bourdonner en moi comme une grappe d’abeilles
impatientes d’essaimer.
Ainsi absorbé, j’atteignis le jour de ma libération. Ce fut le 1er
septembre 1886…
En quittant le quartier, je n’éprouvai pas du tout cette sensation
de délivrance qui m’avait rendu si joyeux lors de mon départ du
collège. Au contraire, prenant congé de mes chefs qui me
témoignèrent leurs regrets que je n’eusse pas rengagé, je me
sentais le cœur passablement serré. C’est que l’armée m’avait
inculqué le goût d’une vie régulière, pleine d’occupations bien
déterminées. Là, sous une discipline bienfaisante, j’avais appris à
réfréner ma nature impétueuse. Enfin j’avais trouvé une sorte de
famille remplaçant celle qui m’avait fait défaut. Bref, je tiens à le
souligner, au régiment, j’avais été heureux parce que j’avais appris à
obéir.
Maintenant qu’il me fallait affronter, seul, sans foyer, sans
fortune, sans relations ni indices d’une réussite, les hasards de la
carrière des lettres, je me reprochais presque d’avoir pris ce parti.
Mais la vocation me sollicitait d’une façon trop impérieuse pour que
je revinsse sur ma décision. Si je l’avais fait, je crois qu’au bout de
très peu de temps j’en aurais été au désespoir.
Les écrivains, qu’un appel irrésistible força de suivre la Muse,
malgré tous les obstacles, me comprendront.
Du moins, j’emportais avec moi la notion que, comme l’a si bien
démontré Alfred de Vigny, la servitude militaire a sa grandeur.
Gardienne de la civilisation française, l’armée suscita en moi le
sentiment de la solidarité nationale et y enracina l’idée de patrie. Par
la suite, sous l’action de circonstances déplorables, l’illusion
humanitaire m’égara pendant quelques années. Mais, par la grâce
de Dieu, je retournai assez vite au bon sens. C’est pourquoi, en ces
jours de réflexion mûrie par l’épreuve, où je récapitule les
vicissitudes de ma jeunesse, je me félicite, j’aime à le redire, d’avoir
été — un bon soldat.
CHAPITRE VI
LE SYMBOLISME
Dès les premiers jours de janvier 1887, je me suis fixé à Paris.

J’habite une mansarde au septième étage d’une maison du
boulevard Saint-Marcel et j’y grimpe par l’escalier de service.
Mon mobilier est plutôt rudimentaire : en guise de lit, un
sommier posé à même le carreau et sur lequel ne pèsent pas bien
lourd une galette de varech, deux couvertures de coton, un traversin
rembourré de paille. D’édredon, aucun. S’il gèle, je le remplace par
mes vêtements étalés sur mes pieds. Un tout petit poële dont le long
tuyau zigzaguant contribue à me donner quelque chaleur. Deux
chaises et une table de bois blanc, peintes en noyer. Une malle qui
me sert d’armoire à linge et dont le couvercle supporte mes
ustensiles de toilette. Des rayons de sapin où s’alignent trois
douzaines de livres. Sans cadre et fixés à la muraille par des clous,
un portrait de Baudelaire et une mauvaise gravure d’après la Ronde
de nuit de Rembrandt.
C’est qu’il n’y a pas lieu de faire du luxe. Mon revenu fixe se
monte à soixante-six francs par mois que me verse fort exactement
une tante cossue mais qui entend trop ne pas favoriser ce qu’elle
nomme « ma folie de littérature » pour y ajouter le moindre subside.
Elle espère que je ne tarderai pas à me décourager et que
j’accepterai l’emploi qu’elle me réserve chez un notaire de ses amis.
Or je n’ai jamais rien voulu savoir. Je me suis donné ma parole d’être
un homme de lettres et pas autre chose. Je n’en démordrai pas.
A cette époque, le coût de la vie n’est pas excessif. Pourvu que
l’on possède bon estomac, il est facile de se nourrir à peu de frais.
Ayant réduit mon entretien au strict nécessaire, portant avec
sérénité des frusques achetées chez le revendeur et des chaussures
souvent percées je m’offre donc des festins de charcuterie et de pain
rassis arrosé d’eau fraîche. Des fruits, selon la saison, de loin en loin
un œuf, complètent mes menus. Il y a aussi le café que je prends
très fort, car je passe la plupart des nuits à travailler. Quoique j’aie
supprimé le sucre, c’est ma dépense la plus onéreuse avec le pétrole
dont je m’éclaire.
J’accepte cette gêne avec la plus parfaite insouciance. Je vis
d’une existence si exclusivement cérébrale que je ne donne aucune
attention à ce que je tiens pour de vaines contingences.
Mais j’ai beau pratiquer l’ascétisme pour l’amour du Beau,
soixante-six francs mensuels, ce n’est tout de même pas suffisant.
Afin de grossir mon budget, je me mets en quête de besognes
alimentaires. J’en trouve parfois de bien cocasses. Par exemple, un
commis d’architecte, mon voisin de palier, m’abouche avec le
propriétaire de plusieurs maisons situées dans le quartier des
Gobelins. Cet homme cultive une marotte assez bizarre : il voudrait
obtenir l’entreprise de construction du Métropolitain dont on
commence à parler. Des projets grandioses l’obsèdent, mais comme
le style lui manque aussi bien que l’orthographe, ce bourgeois
babylonesque me propose de lui écrire une brochure qu’il signera,
fera imprimer et distribuera aux conseillers municipaux, à tous les
sénateurs, à tous les députés. Il y aura un tirage de luxe destiné aux
« grosses légumes » tels que le préfet de la Seine, les ministres et le
Président de la République.
Mon Mécène me demande surtout du lyrisme et des phrases
pompeuses. Qu’à cela ne tienne, je lui servirai autant d’emphase
qu’il lui plaira. En huit jours, j’expédie la chose suivant les notes
informes qu’il m’a confiées. J’y ai fourré à foison toutes les couleurs
de l’arc-en-ciel et de l’érudition pillée dans les dictionnaires
techniques — voire des citations cueillies dans les Fleurs du Mal,
entre autres, cette apostrophe à la grand’ville :
Fourmillante cité, cité pleine de rêves

Où le spectre, en plein jour, raccroche le passant…
et ce distique :
Et le sombre Paris, en se frottant les yeux,

Empoignait ses outils, vieillard laborieux.
L’impression produite fut extraordinaire. Lorsque, comme

possédé d’une fureur pindarique, j’eus déclamé cet étrange
dithyrambe au bonhomme, il se prit d’un tel enthousiasme qu’il me
compta mille francs, séance tenante. Or, nous n’étions convenus que
de cinq cents à payer en deux fois. Quel succès — et quelle
aubaine !…
On découvre ainsi quelquefois de ces bourgeois chez qui un
« poète mort jeune » ressuscite soudain, après qu’ils ont fait fortune,
pour s’extravaguer en conceptions délirantes. Ce n’est pas fréquent,
mais cela se rencontre. Et ma bonne étoile m’avait amené l’un d’eux.
Je déniche d’autres tâches moins lucratives mais encore
appréciables. Je rédige des fragments étendus de monographies sur
les métiers parisiens pour un compilateur qui, mal doué quant aux
facultés inventives, ne déteste pas de publier, sous son nom, le
travail d’autrui. Ce parasitisme lui rapporte, paraît-il, beaucoup et il
paie assez bien.
De passage à Paris, il m’arrive, flânant sur les quais de la rive
gauche, d’apercevoir dans les boîtes des bouquinistes quelqu’un des
volumes en question. Alors je ris dans ma barbe et je me remémore,
avec un certain attendrissement, cette période de ma jeunesse où
j’avais le droit de m’appliquer le Sic vos non vobis de Virgile…
Je fais aussi des recherches à la Nationale pour un historien
amateur qui s’est imaginé de refondre, en les rectifiant, les Récits
mérovingiens, d’Augustin Thierry.
Je place, çà et là, sans trop de peine, des articles de reportage
pris dans des milieux picaresques et je les signe de divers
pseudonymes.
Pour mon labeur personnel, je n’en veux rien livrer à la publicité
tant que je ne serai pas sûr de mon instrument.
Je me romps au métier avec patience, avec persévérance.
Empruntant des livres à des amis, en achetant d’occasion,
fréquentant les bibliothèques, je me tiens au courant de l’actualité
littéraire. J’étudie les philosophies et l’histoire, surtout celle de notre
pays. J’aborde l’anglais — toutefois d’une façon superficielle. Je
m’imprègne de Dante, de Shakespeare, de Goethe, des Maîtres de la
littérature française au XVIe et au XVIIe siècle. Je fais du latin ; et je
constate que, malgré une interruption de cinq années, je n’ai nulle
peine à m’y remettre, ce qui est à l’éloge des méthodes
d’enseignement en usage dans l’Université, au temps de mes
études.
Je traduis, pour mon plaisir, le De rerum natura, de Lucrèce, et le
Satiricon, de Pétrone. — Tous ces travaux me forment un fond solide
de culture générale. Pour me récompenser moi-même de mon
activité intellectuelle, je versifie, je prosifie à outrance. Que de
poèmes j’ébauche qui ne réussissent pas à me satisfaire. Que de
romans rêvés à loisir, esquissés dans la fièvre, jamais amenés à
réalisation totale ! N’importe, je ne gaspille pas les heures ;
j’apprends à bien manier la langue et les rythmes. Tout cela servira
plus tard…
Cette formation solitaire a duré deux ans au cours desquels je
vécus entièrement détaché du monde. Ce n’est pas à moi de dire si
ce travail d’assimilation et de préparation m’a profité.
Au commencement de 1889, je publiai mon premier livre. C’était

un recueil de vers qui me fit classer parmi les poètes de l’école
symboliste. A la même époque, je descendis de ma mansarde pour
m’installer en un autre logis, en plein quartier du boulevard Saint-
Michel et pour nouer des relations avec quelques-uns des initiateurs
de ce mouvement littéraire : Moréas, Paul Adam, Gustave Kahn,
Henri de Régnier, Stuart Merrill, etc. Je collaborai au Mercure de
France, qui est devenu, sous la direction judicieuse d’Alfred Vallette,
le meilleur périodique de notre temps avec la Revue universelle ; à la
Plume, disparue, où je fis la critique des livres pendant six ans ; à
l’Ermitage, disparu, dont j’assumai, un peu plus tard, le
gouvernement avec René Boylesve et Henri Mazel.
Ces trois revues étaient, au même degré, idéalistes et
combatives. On y guerroyait surtout pour la liberté du vers et contre
le naturalisme. On y martelait d’immuables têtes-de-Turc : Zola pour
toute son œuvre ; Sully-Prud’homme pour son didactisme visqueux ;
Doumic qui, incarnant le Rien-en-Soi, prétendait nous morigéner ;
Brunetière, à cause de son pédantisme pseudo-classique et de ses
diatribes ineptes contre Baudelaire… d’autres encore, tout à fait
oubliés depuis les cinq premières minutes qui suivirent leur décès.
Je ne parlerai pas longuement du symbolisme. Je l’ai fait dans de
nombreux articles et dans deux ou trois volumes où, si je ne me
leurre, ceux qui entreprendront son histoire complète trouveront des
renseignements exacts. Je n’en rédigerai donc qu’un résumé assez
bref où je m’efforcerai de noter impartialement le bien et le mal qu’il
produisit dans les lettres françaises à la fin du XIXe siècle et au
commencement du XXe.
D’abord le mal.
Un accueil trop complaisant aux influences étrangères. Au
détriment de la tradition nationale, on exaltait, sans mesure, Ibsen,
Tolstoï, Schopenhauer, Nietzsche. L’apologie de ces Barbares allait
souvent jusqu’à l’extravagance. Encore, chez nous, Français,
l’engouement pour ces deux derniers s’expliquait jusqu’à un certain
point : ils réprouvaient le germanisme et se manifestaient tout
pénétrés de culture latine. Mais le Norvégien et le Russe, quels
génies fumeux remâchant les thèses les plus éculées du romantisme,
quels dissolvants dans une brume corrosive, leurs doctrines !
C’étaient, les dieux de la Revue blanche, périodique inspiré,
subventionné, enkahalé par des Juifs polonais qui menaient de front
les opérations de Bourse et les menées anarchistes. Diverses tribus
hébraïques opéraient en cet endroit : les Bernard Lazare, les Cohen,
les Léon Blum, les Ular, sous une trinité de Natanson.
Henri de Bruchard a, naguère, fort bien décrit ce milieu. Il a
croqué sur le vif « ces juifs boursiers, assoiffés de boulevard, portant
dans les lettres, avec de fausses apparences de mécénat, ce goût
malsain de parodier et de parader qui est le propre de leur nation
haïssable. Ils traînaient derrière eux toute une équipe de ghetto dont
ils infligeaient le style, les images, les dégénérescences à une
jeunesse, sans guides, sans appuis, que l’anarchie littéraire attirait
en réaction contre les bassesses et les médiocrités de la salonnaille
opportuniste ou radicale. Telle était cette officine où les esthètes
coudoyaient les usuriers et les lanceurs de bombe où se tutoyaient
et s’associaient bookmakers et auteurs dramatiques ».
De Bruchard donne ensuite un aperçu fort véridique du salon des
Natanson : « Chaque jour, ils s’attachaient à couvrir d’un mauvais
vernis boulevardier la crasse importée du Ghetto de Varsovie. Ne
s’avisaient-ils pas de protéger les peintres ! On devine quelle
peinture était prônée par ces affolés de modernisme. Ils se lançaient
aussi dans leur monde et donnèrent des soirées. Ce fut même assez
comique. Évidemment, on ne pouvait avoir d’emblée l’élite
parisienne. Aussi se contentait-on de la famille Mirbeau et de Marcel
Prévost. Puis, pour faire nombre, quelques gens de lettres naïfs et,
obligatoirement, les collaborateurs de la revue…
« Paris s’amusa fort des glorioles que les Natanson affichaient.
Dès leur second bal, la Pologne délégua tous ses Juifs, traducteurs
de romans étrangers, rédacteurs d’agences de presse allemandes,
correspondants des gazettes sémitiques. Puis apparut l’armée des
traducteurs. Un vol d’Anglais, d’Américains, de Suédois, de Danois,
de Teutons s’abattit sur nos libraires. Dans la presse, c’était l’âpre
concurrence des petits juifs, si humbles la veille, la monopolisation
du théâtre, le boycottage pour tout ce qui portait un nom
français [8] . »
[8] Henri de Bruchard : Petits Mémoires du temps de
la Ligue, 1 vol. à la Nouvelle librairie nationale. — Henri
de Bruchard aurait pu ajouter que parmi les gloires de la
firme Natanson, il y avait Nordau, juif-boche qui venait de
traîner dans la boue la littérature française, et Brandès,
juif-danois qui, pendant la guerre, exalta le
pangermanisme et insulta notre pays.
Voilà qui est fort bien dit. Toutefois, il faut émettre la restriction
que nous, symbolistes d’origine française, nous nous cantonnions sur
notre chère Rive Gauche et que nous ne nous laissions pas
contaminer jusqu’aux moelles par les miasmes d’outre-Rhin et du
Ghetto. Pour ma part, je n’ai jamais mis les pieds dans les salons
Natanson, et c’est tout au plus si j’ai donné deux fois de la copie à
leur revue.
Mais il est vrai que nous faisions beaucoup trop facilement un
sort aux produits de l’étranger. Plusieurs métèques abusaient de
notre courtoisie pour prendre des airs arrogants vis-à-vis de nous.
L’un d’entre eux, venu du Wisconsin ou du Connecticut, en trois
bateaux, pour réformer la prosodie française, se distingua par son
outrecuidance. Ce n’est pas la peine de le nommer ; ses
élucubrations, sans rythme, ni rimes ni raison, n’ont jamais réuni
qu’une douzaine de prosélytes obscurs. Et nul ne se souvient de son
passage dans nos revues.
Un autre défaut des symbolistes, c’était un individualisme si
accusé, si ombrageux qu’il en résultait que chacun suivait sa voie
sans adhérer à une doctrine commune. Nous savions ce que nous ne
voulions pas ; nous ne savions pas trop ce que nous voulions.
Au point de vue de la technique, tous s’appliquaient à libérer le
vers des chaînes excessives dont les Parnassiens l’avaient surchargé.
Mais où l’on n’était plus d’accord, c’était sur les limites entre
lesquelles il était sage de se tenir. Les uns conservaient l’alexandrin,
d’autres le rejetaient. On émettait force théories ; on se gardait,
comme d’un crime, de poser des lois. C’était le règne de l’inspiration
déréglée.
Au point de vue de l’art, en général, on entendait substituer aux
inventaires de sensations basses où se confinait le naturalisme une
littérature plus subtile, moins terre-à-terre que celle dont nous
critiquions les tendances. On visait à remplacer le roman par la
légende. De belles réalisations furent obtenues mais, comme chacun
se forgeait à soi-même des convictions toutes personnelles, l’apport
collectif restait indéterminé. C’était une sorte de symphonie où les
dissonances tenaient plus de place que l’unisson. En somme, le
symbolisme fut un groupement anarchiste toujours sur le point de se
dissoudre. Cela se comprend, puisque on n’y trouvait point d’entente
sur un programme accepté de tous.
C’est contre ce manque de cohésion que tenta de réagir Jean
Moréas, quand il fonda l’école romane avec Charles Maurras, du
Plessys, La Tailhède et Raynaud. Si, dans ses premières œuvres, il fit
la part trop grande à l’archaïsme, il donna bientôt des poèmes où le
soin de se conformer à la tradition classique ne contrariait en rien
l’essor de sa personnalité. Ce furent les Stances où, sous une forme
très pure, il exprimait ce que la sagesse païenne contient de plus
élevé. Moréas fut un stoïcien attardé. Mais comme, de propos
délibéré, il ignora le christianisme, c’est-à-dire le principe unique qui
permette de vivifier les âmes, comme, en outre, il s’isolait dans un
rêve de beauté antique, hors du temps où il vécut, sa tentative
échoua. Ainsi que ses émules, il bâtit une chapelle littéraire, loin de
la foule, et rien de plus.
D’ailleurs, tout en l’admirant, les symbolistes se montraient bien
trop hostiles à toute idée de soumission à un chef d’école pour le
reconnaître comme tel. Leur proposer une discipline était donc
chimérique.
Le symbolisme individualiste eut probablement son expression la
plus complète en Remy de Gourmont, esprit très fin, érudit très
informé, intelligence aux multiples ressources, féconde en aperçus
ingénieux, beau styliste. Mais un vice gâtait ces grandes qualités. Par
instinct de destruction, il s’attachait tellement à dissocier les idées
qu’il aboutissait par excès d’esprit critique au scepticisme total et à
des négations hâtives. Parce qu’elle affirme, l’Église lui était en
haine. Lorsqu’il la rencontrait, sa distinction native, son souci
d’élégance dans la diction l’abandonnaient. Il rivalisait en propos
indécents avec le pire Voltaire. Plus encore, il tombait dans
l’anticléricalisme balourd d’un Homais.
Celui-là non plus ne fut pas le Maître que beaucoup attendaient.
Il ne méritait pas davantage de le devenir ce Mallarmé à qui un
grand nombre de symbolistes vouaient une admiration désordonnée.
Platonicien trouble, dont le mépris pour le Réel passait toutes les
bornes, Mallarmé se confinait si étroitement dans la contemplation
des fantaisies de son Subconscient que ses sectateurs les plus
intransigeants devaient avouer leur impuissance à comprendre les
écrits de sa seconde manière, tant qu’il ne les leur avait pas
commentés.
Mais cette glose, elle-même, manquait souvent de clarté, de
sorte que les mallarmistes en donnaient chacun une interprétation
différente. Et pourtant — détail qui révèle un état d’esprit vraiment
singulier — plus leur idole se rendait hermétique, plus ils la
déclaraient sublime.
Il me semble utile de reproduire le fragment suivant d’un article
que je publiai jadis dans la Revue de Jean Finot ; il prouve que,
touchant le cas Mallarmé, je me séparais nettement du symbolisme,
objet de mes prédilections partout ailleurs. — Voici :
« Mallarmé devint célèbre pour n’avoir pas écrit l’œuvre annoncée
pendant dix ans comme devant résumer, sous une forme définitive,
l’âme humaine et l’âme universelle. Il employa son existence à
rééditer une traduction partielle d’Edgar Poe, dix sonnets, six
poèmes en vers un peu plus étendus, quinze poèmes en prose, une
scène de tragédie, quelques fragments théoriques. De son propre
aveu, et quoique deux ou trois de ces morceaux — les plus clairs ou
les moins obscurs — ne manquassent pas de valeur, ce n’étaient que
des essais, les pierres d’attente d’un édifice toujours futur dont il
expliquait, à l’occasion, le plan et la portée, mais qu’il ne voulut ou
plutôt qu’il ne put bâtir.
« La raison de cette impuissance réside en ceci que Mallarmé se
déclarait incompétent en autre chose que l’absolu. Or, on ne réalise
pas l’absolu. On peut y rêver, mais le faire tomber sous nos sens,
c’est là chose impossible. S’y entêter, c’est se vouer à la stérilité…
« Mallarmé essaya d’ailleurs de distribuer quelques tranches
d’Absolu aux initiés préparés, croyait-il, par ses entretiens, à
s’assimiler cette vague nourriture. Dans cette intention, il soumit la
langue française à une série de déformations qui n’en laissèrent
subsister que des membres épars. Puis, partant de ce principe
bizarre que : « Nommer un objet, c’est supprimer les trois quarts de
la jouissance du poème qui est faite du bonheur de deviner peu à
peu », il s’interdit de traiter autrement que par allusion les vers et les
proses qu’il offrait à la sagacité de ses lecteurs. Frapper directement
leur esprit lui semblait puéril. Il prétendait ne leur suggérer que de la
façon la plus détournée ses intentions. Ce qui ramène sa doctrine à
ceci : quand on veut faire entendre quelque chose à quelqu’un, le fin
du fin consiste à s’exprimer par énigmes. Voilà, du coup, la charade
réhabilitée et même exaltée comme un genre littéraire de premier
ordre.
« Et les mots, ces pauvres mots que tant de poètes, embourbés
dans le Relatif pour n’avoir pas connu la région où vivre, avaient cru
propres à rendre leurs sensations, leurs sentiments et leurs idées,
Mallarmé les accuse de ne pas représenter suffisamment ses
concepts. D’une part, il les méprise si fort qu’il préfère à tout texte
« même sublime » des pages blanches portant « un dessin espacé de
virgules et de points ». Mais, d’autre part, il leur confère une fonction
nouvelle à quoi personne n’avait pensé jusqu’à lui : « Il faut, dit-il,
que, de plusieurs vocables, on refasse un mot total, neuf, étranger à
la langue et comme incantatoire… qui nous cause cette surprise de
n’avoir jamais ouï tel fragment ordinaire d’élocution, en même temps
que la réminiscence de l’objet nommé baigne dans une neuve
atmosphère… »
« Mallarmé eut donc pour objectif de créer un langage spécial,
n’ayant guère de rapport avec le français et destiné à formuler des
pensées tellement inaccessibles qu’il fallait se transporter, par
l’imagination, dans un monde différent du nôtre, si l’on voulait
parvenir à en soupçonner la signification à jamais symbolique.
« Il se donna tout entier à cette tâche impossible. Il y usa toutes
les ressources de son intelligence sans avoir réussi même une
esquisse de son rêve et surtout sans avoir déterminé une de ces
révolutions qui changent la face de la littérature. »
Il ne détermina, en effet, que des apologies sans grande portée,
puisque tout en proclamant la transcendance de son art, aucun de
ses admirateurs ne crut devoir le suivre dans la voie qu’il indiquait.
C’est, disent-ils, que Mallarmé ayant réalisé l’individualiste par
excellence, on ne saurait l’imiter.
Non, grâce à Dieu, on ne l’a pas imité, parce qu’il n’a pas su
« créer un poncif » comme le demandait Baudelaire à l’écrivain digne
de maîtrise. Et puisque je cite Baudelaire, je lui emprunterai encore
les termes qui définissent le mieux Mallarmé. Ce ne fut pas un génie
créateur ; ce fut « une curiosité esthétique ».
Maintenant que j’ai dit le mal qu’on a le droit de penser du
symbolisme, je vais dire le bien.
Les symbolistes ont assoupli la prosodie. Sans entrer dans le
détail et tout en concédant que certains d’entre eux ont porté la
réforme trop loin jusqu’à produire des choses vagues, qui n’étaient
ni prose ni vers, on doit retenir à leur actif que, par eux, le vers
devient plus musical, s’enrichit de rythmes nouveaux et réussit à
exprimer, avec charme, des nuances de sentiment inaperçues avant
eux.
Ils ont fait connaître Verlaine dont l’œuvre avait été
sournoisement étouffée par ses frères du Parnasse et que la
postérité tiendra probablement pour l’un des plus grands poètes du
XIXe siècle.
Ils ont détruit, avec une rudesse pleine d’équité, plusieurs
réputations usurpées.
Leur lutte contre le naturalisme n’a pas été vaine. Ils ont porté le
coup de mort aux sottises matérialistes mises en vogue par Zola.
Enfin, ils ont rendu à l’Art un culte désintéressé et ils ont montré
un mépris de la basse réclame qui condamne les commerçants de
lettres dont nous constatons le règne aujourd’hui.
Voilà qui est pour excuser leurs erreurs d’autant, qu’ils ont été les
victimes et non les guides de leur époque. Or, ce fut une période
d’anarchie dans les idées et dans les mœurs — tout comme le milieu
qui se décompose autour de nous tandis que j’écris ces lignes. Une
société sans Dieu, sans autorité fixe, ne peut guère en produire
d’autres.
J’échappai, en partie, aux tares du symbolisme parce qu’en 1894,

après huit ans d’un séjour continu à Paris, je m’installai à la
campagne. Je m’étais marié, dans l’intervalle, avec la femme,
profondément chrétienne, intelligente et dévouée que j’ai perdue en
1901. C’est, sans doute, à ses prières Là-Haut que je dois la grâce
de ma conversion.
Ce « retour à la Terre » me fit le plus grand bien non seulement
au physique, mais au moral et au point de vue intellectuel.
L’existence parisienne est si pleine de fièvres artificielles qu’on y perd
presque le sens de la nature. Je le reconquis largement à
Guermantes, où nous avions loué une maison paysanne avec jardin.
C’était un petit village de cent trente-quatre habitants. La gare la
plus proche étant à quatre kilomètres, j’y trouvai la solitude
bienfaisante. Il était situé au cœur même de ma chère Ile-de-France,
pays de coteaux modérés, de vergers plantureux, d’eaux courantes
parmi les aubépines et les saules, de prairies tachées d’un bétail
blanc et roux. De grands noyers, des ormes chenus, des sycomores
tout bourdonnants d’abeilles, des cytises aux grappes dorées y
entremêlent leurs feuillages. Des vents salubres le vivifient. Et nulle
part les jeux de la lumière et de l’ombre n’ont plus de douceur.
En cette sereine ambiance, je poursuivis mes travaux littéraires.
La besogne ne faisait pas défaut : une collaboration régulière à deux
grands journaux de Belgique dont j’étais l’un des correspondants,
mes articles bi-mensuels de critique à la Plume, des vers et des
proses dans d’autres revues, surtout au Mercure de France, enfin la
fabrication d’un livre annuel.
Pour atténuer la tension cérébrale résultant de ces multiples
écritures, je faisais de grandes courses par les champs et aussi dans
les bois de mon peu enviable voisin : Alphonse de Rothschild. En
effet, le terroir de Guermantes borde en partie son vaste domaine de
Ferrière.
D’autres jours, lâchant la plume et l’encrier pour la bêche et
l’arrosoir, je cultivais mon jardin d’après les conseils de mon ami
Butelot, cordonnier du village et en même temps horticulteur expert
— ce qui ne l’empêchait pas de braconner astucieusement les
remises grouillantes de gibier du Juif tout-en-or, comme dit Léon
Daudet.
C’est à Guermantes que j’ouvris les hostilités contre les abus du
symbolisme et particulièrement contre Mallarmé que je considérais
— et que je considère toujours — comme sa plus grande erreur.
Cet irrespect louable à l’égard de l’idole m’aliéna une portion de
mes anciens frères d’armes. Ils se sentirent si outrés de mon soi-
disant sacrilège qu’ils me couvrirent d’injures au lieu de rétorquer les
arguments très raisonnés que je développais à l’appui de ma thèse.
Ils me traitèrent de « renégat », de « grossier personnage » et même
de « frénétique ».
Pourtant, si l’on veut bien se reporter au fragment d’article cité
plus haut, je crois qu’il faut convenir que le ton de mes critiques
n’avait rien d’excessif et que je m’y maintenais dans les bornes de la
courtoisie nécessaire. Eh bien, toute ma polémique à propos de
Mallarmé, si incisive qu’elle fût par moments, n’alla jamais jusqu’à
l’invective contre un homme dont j’appréciais le beau caractère tout
en réprouvant ses attentats à la langue et sa méconnaissance des
qualités essentielles de notre génie national, à savoir la précision et
la clarté.
Mais, je le répète, mes détracteurs ne me rendirent pas la
pareille. Je n’établirai pas la liste des procédés malveillants dont
certains me poursuivirent. Ce serait aujourd’hui dénué d’intérêt. Et,
d’ailleurs, je me suis réconcilié avec pas mal de ces adversaires
aveuglés par le parti pris mais qui reconnaissent, au bout de vingt-
cinq ans, que je pourrais bien ne pas m’être trompé.
Mais ce que je vérifiai alors et ce que me confirma, depuis, une
longue expérience, c’est le manque d’esprit de justice qui règne dans
la littérature. Si la bonne foi était exilée du reste de l’univers, ce
n’est pas chez les écrivains qu’elle trouverait un refuge.
Fort heureusement, il y a des exceptions. Mais, en général,
l’aphorisme de Plaute repris par Hobbes : Homo homini lupus
rencontre, dans la gent-de-lettres, son application la plus constante.
Ajoutez une rage de médisance qui va souvent jusqu’à la
calomnie. Voilà qui explique ma décision de me tenir le plus possible
à l’écart de mes « chers confrères ». Je m’en félicite tous les jours.
Une autre « trahison » me fut imputée. Sous le pseudonyme
d’Harold Swann, je décrivis, en divers périodiques, les petits travers
extérieurs et les ridicules inoffensifs des symbolistes. Ces satires
sans méchanceté, et où je ne m’épargnais nullement moi-même,
eurent du succès auprès du public de nos revues. Lorsque, assez
tardivement, le secret fut divulgué, M. Le Goffic, dans un article fort
aimable, m’appela « l’enfant terrible du symbolisme ». C’était le mot
juste. Mais quelques-uns des caricaturés — exactement ceux à qui je
n’avais donné qu’un léger coup de crayon, en passant — prirent fort
mal la plaisanterie. D’où un redoublement de malédictions [9] .
[9] Coïncidence piquante : ces noms de Guermantes
et de Swann, Marcel Proust me les a empruntés pour
deux de ses romans. Comme je ne l’ai jamais rencontré,
je voudrais bien savoir le motif qui détermina son choix. A
moins que le hasard ait tout fait ?
Troisième grief : je désirais, donnant l’exemple dans mes poésies,

qu’on ne fît pas du vers libre un vers amorphe. J’estimais qu’il y
avait exagération à éliminer la rime pour la remplacer par de vagues
assonances ou par — rien du tout. J’avançais que des superpositions
de petites phrases fictivement accentuées ne valaient ni les césures
anciennes ni les rythmes consacrés. Je soutenais que la réforme
était suffisante qui abolissait l’alternance obligatoire des rimes
féminines et masculines, qui permettait de faire rimer un singulier
avec un pluriel et qui tolérait l’hiatus, pourvu qu’il ne produisît pas
de cacophonie. Pour le surplus, je recommandais l’imitation de la
technique du vers libre tel que la Fontaine, dans ses fables, et
Molière, dans Amphitryon, l’ont magistralement pratiqué.
Là encore, on me vilipenda. Le métèque du Connecticut, dont les
vers jargonnants n’évoquaient, en fait de rythme, que les bonds
saccadés d’une sauterelle expirante, me décréta d’ostracisme. Dans
le même temps, M. André Gide prenait l’initiative d’un manifeste où
mes crimes antimallarméens étaient flétris en termes véhéments.
Ces excommunications burlesques me procurèrent une vive
hilarité. Je ne répondis pas. Et je persévérai sans l’ombre d’un
trouble de conscience.
Les curieux de controverses littéraires qui se donneront la peine
de parcourir les volumes où j’ai réuni mes articles et, d’autre part,
les ripostes de mes adversaires, jugeront de quel côté résidait le bon
sens et la mesure.
Pour l’écrivain, c’est une nécessité, à laquelle il cède d’une façon

presque machinale, que de se faire une conception du monde et de
chercher le sens de la vie. Or, j’étais encore très loin de la vérité
catholique. J’avais passé par une phase de pessimisme bouddhique
sous l’influence de Schopenhauer. Puis, après avoir étudié Darwin et
ses émules et compulsé Taine, je m’étais laissé prendre un temps
aux propositions décevantes du déterminisme évolutionniste qui
n’est, en somme, qu’un matérialisme fataliste. Étouffant dans ce
caveau sans soupirail vers le soleil, je m’en étais bientôt évadé.
Alors, au contact de la campagne régénératrice et, ensuite, par la
forêt de Fontainebleau — merveille de grave beauté — je devins
panthéiste. C’est dire que les Apparences furent les divinités
auxquelles je rendis un culte. Je n’épiloguerai pas à ce sujet, me
bornant à rappeler que la plupart de mes écrits, durant cette
période, portent la marque formelle du Grand Pan.
D’ailleurs, et comme pièce probante, voici une prose que le
Mercure de France publia et où je tâchais d’exposer ma communion
avec ce que je nommais « l’âme universelle ». On m’excusera de la
reproduire ; je la crois des plus significatives. Monologuant, je
disais :
« … Toi qu’un destin — peut-être ironique — marqua pour
enfanter des poèmes, toi que les Formes, les Sons, les Essences
tiennent attentif, rappelle-toi comment naît, au fond de ton être le
plus essentiel, le désir d’interpréter, en des strophes cadencées, les
songes que la terre, l’océan, le ciel nuageux, ensoleillé ou plein
d’étoiles ne cessent de te prodiguer.
« Tu marchais, perdu dans une vague rêverie, n’accordant qu’une
attention distraite aux incidents de la route. Soudain, un rayon fait
papilloter les vagules d’un ruisseau. Soudain, l’ombre bleuâtre d’une
vieille muraille, dont maintes giroflées pavoisent la crête moussue,
se découpe bizarrement sur le sol. Soudain, le vent taquine, en riant
tout bas, les feuilles inquiètes d’un bouleau. Tu t’arrêtes, étonné et
ravi. Ces choses, qui te sont pourtant coutumières, te frappent
comme si tu ne les avais jamais vues. Tu les considères ; tes
prunelles s’en imprègnent et, lorsque tu reprends ton chemin, leur
image agrandie, nimbée d’or, éblouissante t’emplit le cerveau. Alors,
tu établis instinctivement un rapport entre cette image et la
disposition de ton âme au moment où elle te séduisit. Si tu es triste,
elle reflète ta tristesse ; si tu es gai, elle reflète ta gaieté. Un rythme
naît en toi et t’obsède. Sans t’en apercevoir, tu y conformes ton pas.
Le rythme se précise ; des mots se précipitent en foule qui
s’efforcent d’y entrer. Puis cent images accessoires s’élancent,
comme des fusées, de ton Subconscient et tentent de s’associer à
l’image primitive. »
J’expliquais ensuite comment le poème, issu de cette première
incubation, aboutissait peu à peu, à force d’y penser, à la réalisation
et j’ajoutais :
« Si tu fus sincère, si tes vers, largement humains, frappent par
leur simplicité, il arrivera que le lecteur y découvrira des mérites
dont tu ne te doutais pas. Alors vous vous réjouirez ensemble. Et
vous serez semblable à des enfants qui, grimpés dans un cerisier et
croyant l’avoir dépouillé, aperçoivent tout à coup une branche
encore chargée de fruits. L’épaisseur du feuillage la leur dissimulait ;
mais un coup de vent opportun leur révèle l’aubaine. Ils se la
montrent ; ils poussent des cris de joie ; puis ils se partagent
fraternellement les cerises juteuses… »
Puis, après quelques développements sur ce thème, je
concluais :
« Non seulement les souffles des vents capricieux et les clapotis
des rivières sinueuses contribuent à former les rythmes du poète,
mais encore les collines aux lignes tremblées, les rochers pareils à
des Titans méditatifs, les vagues de la mer, soit qu’elles se cabrent
comme des poulains indomptés, soit qu’elles viennent mollement se
pâmer sur le sable fin d’une grève étincelante.
« La forêt, la mer et aussi la plaine où les jeunes avoines se
moirent d’argent bleuâtre, où les fleurs roses du sainfoin, où les
fleurs veloutées du trèfle incarnat offrent leur pollen aux abeilles, il
faut les aimer d’un même amour, afin qu’elles nous révèlent les
secrets de leur magnificence.
« Nous entrerons dans la forêt pour apprendre des vieux chênes
rugueux, des hêtres à l’écorce lisse, des pins aux rameaux
gracieusement alternés, des bouleaux sveltes, l’art des proportions
harmonieuses. Nous nous enfoncerons, sans nous inquiéter du
retour, sous les futaies séculaires, pleines d’une brume sacrée où
résident nos dieux. Le murmure éolien des hauts feuillages bercera
notre extase. Et parfois, au détour d’un sentier, nous verrons le
Grand Pan mener, au son de sa flûte, les danses des dryades. Il nous
saluera d’un trille amical, puis, brusque, se fondra dans les taillis.
Nous, cependant, nous demeurerons délicieusement perplexes, nous
demandant si nous ne fûmes pas les dupes des magies du soleil et
du brouillard ou si vraiment le dieu, sachant notre dévotion pour lui,
a daigné nous apparaître.
« La mer, nous en longerons, à pas lents, le rivage. Ses flots
miroitants, son balancement infini, sa face changeante, selon
l’heure, nous seront des modèles pour varier nos cadences. Le
sillage des navires, les traînées d’ombre violette que dessinent les
courants, nous les transposerons dans nos vers. Et, de même qu’aux
profondeurs dorment des richesses englouties, des nacres et des
perles, de même, nos strophes recéleront, sous le prestige
mélodieux des rythmes, des trésors de douleur, de joie et de rêve.
« Mais la forêt et la mer sont d’une beauté redoutable. A les
fréquenter d’une façon exclusive, nous finirions par perdre la
conscience de nous-mêmes ; nous ne saurions plus nous en détacher
et nous aspirerions à la vie végétative, sans désirs et sans pensée.
C’est pourquoi, lorsque nous nous serons saturés de leurs aspects,
nous viendrons nous retremper au spectacle du travail humain dans
la plaine. Là, nous admirerons l’art parfait selon lequel le laboureur
trace ses sillons et nous nous efforcerons de l’imiter pour
l’ordonnance de nos strophes. Ou bien nous suivrons le semeur ;
nous le regarderons épandre le grain doré. Puis, à son exemple,
nous ensemencerons nos poèmes avec des mots de lumière.
« La journée finie, contents d’avoir travaillé de notre mieux, nous
irons nous asseoir parmi les gramens du verger prochain. Nous
coûterons le calme du soir. Nous recueillerons le clair sourire des
étoiles. Et, en récompense de notre bonne volonté, nous entendrons
cette musique des sphères où s’adore l’Ame Universelle. »
La vie aux champs et dans la forêt eut donc cet effet bienfaisant
de me pénétrer du sentiment de la nature. Mais elle ne m’ancra pas
dans une doctrine immuable d’où je pusse déduire des certitudes.
L’illusion panthéiste était beaucoup trop ondoyante pour me les
fournir et même, si elle me les avait procurées, elle aurait été
impuissante à les corroborer d’une morale stable, répondant à tous
les besoins de mon âme inquiète. Au fond je cherchais une religion.
J’aspirais à un idéal qui élevât davantage les sommets de mon être,
qui me purifiât suffisamment pour que, contemplant sa lumière,
j’apprisse à réfréner mes passions mauvaises et qui me consolât aux
heures de doute et de découragement.
Cet Absolu divin je crus un moment l’avoir trouvé dans la
philosophie de Lucrèce. Avec lui, je disais : « La religion, ce n’est pas
de se tourner sans cesse vers la pierre voilée, ni de s’approcher des
autels, ni de se jeter prosterné à terre, ni de lever les mains devant
les demeures des dieux, ni d’arroser les temples du sang de
beaucoup d’animaux, ni d’entasser les vœux sur les vœux, mais de
tout regarder avec une âme tranquille [10] . »
[10]
Nec pietas ulla est, velatum saepe videri

Vertier ad lapidem atque omnes accedere ad aras
Nec procumbere humi prostratum et pandere palmas
Ante deum delubra, neque aras sanguine multo
Spargere quadrupedum, nec votis vectere vota ;
Sed mage placata posse omnia mente tueri.
(De rerum natura.)
Cependant cette sagesse orgueilleuse et solitaire, c’est

précisément le contraire d’une religion, puisque celle-ci implique une
foi commune à un grand nombre d’hommes. Et du reste Lucrèce, lui-
même, considérait-il toutes choses d’une âme paisible, lui qui
s’empoisonna pour une femme dont il désespérait de se faire aimer ?
Son empirisme philosophique ne l’avait donc pas prémuni contre
ses propres faiblesses. Ainsi que tant d’autres, il formula de creuses
sentences, propres à être citées dans un traité de rhétorique mais
inefficaces pour guérir ou atténuer les souffrances et les déboires
dont foisonne l’existence quotidienne.
Après quelques essais fort infructueux pour me créer une âme
impassible selon ses préceptes, je me détournai donc de ce sophiste
inconséquent.
C’est alors que, faute d’une croyance à un principe surnaturel, je
me rejetai vers cette « religion de l’humanité » qui a fait divaguer
tant d’intelligences depuis qu’il existe des aveugles volontaires pour
refuser de voir Dieu. Comme mon tempérament me portait alors aux
extrêmes, j’allai, du premier coup, jusqu’à l’Anarchie.
CHAPITRE VII
L’ANARCHIE
Durant les premiers mois qui suivirent ma sortie du régiment, je

ne m’occupai pas du tout de politique. Absorbé par mon labeur
littéraire, je ne lisais, dans les journaux, que les articles traitant de
littérature. J’ignorais jusqu’au nom des ministres qui se succédaient
au pouvoir comme des ombres chinoises sur une lame d’étoffe, mal
tendue, mal éclairée et secouée de trépidations chroniques.
D’instinct, et comme tout Français capable d’observer et de
construire un raisonnement, je sentais la malfaisance et l’absurdité
du régime ; je n’éprouvais aucune espèce de vénération pour la
République. Ainsi que la plupart de mes contemporains, je haïssais
l’Allemagne et je nourrissais l’espoir que l’heure où nous prendrions
notre revanche de la défaite de 70 ne tarderait pas à sonner. Et il est
certain que j’aurais endossé de nouveau et très volontiers la cuirasse
pour foncer sur l’ennemi héréditaire.
Mais ces sentiments me demeuraient à l’état latent. Ravi par le
culte de la Muse, je ne prêtai, tout d’abord, guère d’attention aux
intrigues et aux papotages stériles de nos maîtres.
Cependant, Paris s’enfiévrait si fort autour de mon rêve qu’il me
fallut bientôt, bon gré mal gré, m’enquérir des causes de ce tumulte
énorme.
En effet, c’était le temps où Boulanger syndiqua tous les
mécontents pour balayer la clique de fantoches malhonnêtes qui
détenaient le pouvoir. Aux cris : Dissolution ! Révision ! la grand’ville,
en haine des parlementaires, tombait amoureuse du soldat qui
surexcitait son patriotisme et, à la fois, ses penchants frondeurs.
On ne parlait plus que de Boulanger. On ne chantait plus que des
refrains boulangistes. Je m’en aperçus au détriment de mon repos.
Dans la maison où j’habitais, il y avait une petite cour, une sorte de
puits étroit entre les quatre corps du bâtiment. Là, un garçon
charcutier, tout en confectionnant ses hachis, n’arrêtait pas de hurler
les couplets en vogue. Il répétait surtout En revenant de la Revue,
chanson cocardière qui enthousiasmait alors les révisionnistes —
c’est-à-dire le plus grand nombre des Français. J’avais beau faire le
possible pour ne pas entendre, à chaque instant une voix aussi
fausse que perçante lançait jusqu’à ma mansarde ces deux vers :
Et moi, je n’cessais d’acclamer

Notr’ brav’ général Boulanger !…
Dehors, pareille ferveur : Paris employait ses jours et même ses

nuits à « revenir de la Revue » Et la province — les campagnes
comme les villes — faisait chorus. Si bien que je finis par
m’échauffer et par entrer dans la danse.
Il y a quelques années, villégiaturant dans une auberge de

campagne, j’avisai au mur de la chambre qui m’avait été désignée,
un portrait du général Boulanger.
— Hé, dis-je à mon hôte, vous aussi, vous avez été boulangiste ?
— Mon Dieu, oui, comme tout le monde, me répondit-il.
Avec un haussement d’épaule énergique, il ajouta
— Cet animal, s’il avait voulu !…
— Nous ne serions peut-être pas où nous en sommes, dis-je en
achevant la phrase.
— C’est cela même !
C’est vrai, pensai-je, une fois seul, il y eut une époque où à peu
près tout le monde était boulangiste, sauf, bien entendu, les francs-
maçons, les quelques socialistes et les clans de politiciens
opportunistes et radicaux qui se disputaient les faveurs de la
Marianne enjuivée.
Mais le général ne sut pas vouloir. Il n’eut ni l’audace réfléchie de
Bonaparte, ni le sang-froid de Monk. Ce fut un romantique
sentimental qui, alors que la France l’exhortait à la délivrer de sa
vermine, choisit de roucouler aux pieds d’une Marguerite
tuberculeuse. Voilà ce qui arrive quand on préfère à la gratitude du
pays les baisers à la créosote d’une Dame aux Camélias mondaine.
Très brave en tant que soldat ! — il l’a prouvé en Indo-Chine, en
Italie et contre la Commune — Boulanger manqua de courage civil.
De tous les côtés, on lui criait : — Fais le coup de force, renverse le
régime ; nous te suivrons…
Il recula, ayant pris trop au sérieux les absurdes déclamations de
Victor Hugo dans les Châtiments et dans l’Histoire d’un Crime. Peut-
être aussi, son idée fixe de rester dans la légalité se doublait-elle du
sentiment de son insuffisance à remplir le rôle magnifique et
redoutable qui lui était offert.
Et puis quels pitoyables lieutenants pour le seconder ! Déroulède,
Thiébaud, Pierre Denis, Barrès, deux ou trois autres mis à part, quel
ramassis d’aventuriers et de pamphlétaires besogneux autour de lui !
Un Laguerre, à vendre comme une fille des rues, un Mermeix, un
Vergoin et surtout, traître probable, le juif Naquet !
Lui-même cultiva par trop l’équivoque ; flattant les républicains,
marivaudant avec les bonapartistes, caressant les royalistes pour en
tirer des subsides, distribuant des poignées de main aux disciples de
Blanqui, allant en cachette à Prangins sonder le prince Jérôme,
dînant chez la duchesse d’Uzès, il usa son prestige à louvoyer entre
les partis avec l’arrière-pensée de les duper tous au profit de son
ambition. Il y eut du sous-officier fricoteur chez Boulanger. A mon
avis, dans l’Appel au Soldat — livre remarquable d’ailleurs et dont
certains chapitres resteront comme de grandes pages d’histoire —
Maurice Barrès l’a peint un peu trop en beau.
Sans génie, mais doué d’un charme incontestable, Boulanger
n’eut pas besoin de se donner beaucoup de peine pour séduire les
masses. Les circonstances le portèrent. Le jour où elles ont cessé de
le favoriser, il prit la fuite d’une façon piteuse, puis s’effondra. Sa
mort ne fut pas celle d’un Caton, ni même d’un Marc-Antoine, mais
celle d’un Roméo suranné.
Emporté par le courant révisionniste, stimulé par quelques-uns
de mes camarades de lettres qui ne juraient que par Boulanger, je
me mêlai à plusieurs manifestations.
J’ai raconté, dans un autre livre, comment je rendis visite au
général. Mais il entrait dans mes actes plus d’impatience de voir ce
qui allait arriver que de conviction profonde.
Le soir de la fameuse élection du 27 janvier, nous nous tenions,
quelques amis et moi, près de l’entrée du restaurant Durand, situé
place de la Madeleine et où Boulanger, entouré de ses principaux
partisans, attendait le résultat du vote. Ne doutant pas qu’il ne fût
favorable à notre chef, frémissant du désir d’achever la déroute des
parlementaires, nous ne quittions pas des yeux le balcon du premier,
où un transparent communiquait le chiffre des voix obtenues dans
les vingt arrondissements. La foule les saluait de clameurs
triomphales car, en tout lieu, Boulanger l’emportait sur son
adversaire.
La police était en désarroi ; la garde acquise au général ; on
savait que la garnison l’idolâtrait. Enfin le bruit courait que les
ministres, pris de panique, faisaient leurs malles pour décamper en
tapinois et se blottir dans les cachettes, préparées d’avance, où ils
espéraient se dérober au premier feu des représailles. Toutes les
chances étaient donc pour le général.
Il allait manquer à sa fortune.
Vers onze heures, on connut le résultat définitif. Paris avait élu
Boulanger à plus de quatre-vingt mille voix de majorité. Tout de
suite s’éleva, depuis la Madeleine jusqu’aux extrémités des
boulevards, le cri qui dictait son devoir à Boulanger : — A l’Élysée ! A
l’Élysée !
Dans les salons de Durand, les amis de Boulanger le pressaient
d’obéir à la volonté populaire. Déroulède se montrait le plus éloquent
Mais l’élu tergiversait, se dérobait, multipliait les arguties pour ne
rien faire. Puis il déclara qu’il lui fallait se recueillir, seul, dans un
cabinet adjacent. Or, dans cette pièce, il y avait Marguerite de
Bonnemain. Que lui dit-elle ? Sans doute quelque chose dans ce
genre : Ah ! mon Georges, si tu descends dans la rue, tu cours le
risque d’attraper un mauvais coup. Reste donc dans mes bras ;
n’écoute pas tous ces exaltés qui te trompent !…
— Tu as raison, ma chérie, dut-il répondre.
Défaillance d’une âme amollie par des excès sensuels, et
devenue incapable de se hausser le cœur ! Est-ce que Bonaparte a
consulté Joséphine au 18 Brumaire ? Ou plutôt, est-ce que
Joséphine, au lieu de l’énerver, ne le seconda pas en dupant le naïf
directeur Gohier ?…
Boulanger rentra dans le salon et déclara, d’un ton qui ne
souffrait pas de réplique, que, satisfait de sa victoire électorale, il
refusait absolument de tenter une action violente contre le régime.
Alors Thiébaud, plein d’amertume et de prévisions sinistres, tira
sa montre :
Il est minuit cinq, dit-il, depuis cinq minutes le boulangisme est
en baisse… [11]
[11] Pauvre Thiébaud, si convaincu et si chimérique !
Il avait coutume de psalmodier cette sentence : — La
France n’est pas rouge, la France n’est pas blanche, elle
est bleue…
Léon Daudet, dans Salons et Journaux, a dessiné,
d’un crayon alerte, une amusante silhouette de Thiébaud
après le boulangisme.
C’était exact. De ce jour le déclin de Boulanger commença ; il alla

en se précipitant jusqu’au coup de revolver final.
Il ne faut rien regretter de cette déconfiture. Boulanger dictateur,
c’était probablement la guerre avec l’Allemagne. L’armée du service
de cinq ans était magnifique et d’une solidité à toute épreuve. La
nation, vibrante de patriotisme, fût entrée en campagne avec
allégresse. Mais quel chef d’État ou quel généralissime pour une
pareille crise !…
Au surplus, sous la forme césarienne et plébiscitaire ou livrée aux
factions de Parlement, la démocratie constitue l’organisme politique
le plus défectueux qui se puisse concevoir. Aristophane l’a bien
jugée : Démos, berné et flagorné par Cléon ou s’éprenant de la
guerre et du cheval noir de Lamachos, est incapable de
discernement. Il lui faut un guide immuable et qui ne dépende pas
de son vote : le Roi.
La déroute du boulangisme coïncidait avec le scandale du

Panama. On se rappelle cette immense coquinerie financière où l’on
entendit un ministre, Rouvier, un président de la Chambre, Floquet,
avouer leurs concussions en invoquant, pour excuse, des nécessités
politiques. Cent quinze parlementaires de gauche furent convaincus
d’avoir vendu leur vote ou leur influence aux Lesseps, tripoteurs de
vaste envergure, qui, contre l’avis des spécialistes s’entêtaient à
creuser, sur des plans insensés, le canal qui devait joindre les eaux
de l’Atlantique à celles du Pacifique.
Malgré mille manœuvres louches et un large emploi de la
corruption, l’entreprise échoua. Quantité de petites gens qui leur
avaient confié de chétives économies furent ruinées. Mais, grâce à la
défaillance d’une Justice à l’image du régime, les chéquards du
Parlement furent acquittés ou obtinrent des non-lieu, sauf un seul,
Baihaut, qui, tardivement tourmenté de scrupules, reconnut son
crime et devint le bouc émissaire des Chambres.
Je ne veux pas remuer cet amas de pourriture démocratique ni
rouvrir les ulcères purulents qui rongeaient les parties honteuses de
Marianne. Maurice Barrès a raconté le Panama dans un livre
magistral, Leurs Figures, où la vigueur vengeresse du style n’a
d’égale que la force de la pensée. Cette œuvre reste et restera.
Ce que je retiendrai de l’épisode, c’est ceci : nombre de
boulangistes, enragés de n’avoir pas réussi à détruire des institutions
qu’ils haïssaient sans trop savoir quoi mettre à la place ; beaucoup
d’actionnaires du Panama, constatant que les principaux coupables
se tiraient du cloaque à peu près indemnes et conservaient les
sommes qu’ils avaient détournées, devinrent des anarchistes.
Lorsque Ravachol dynamita des magistrats, lorsque Vaillant jeta
sa bombe inoffensive parmi les députés, lorsque Émile Henry tua les
premiers venus, lorsque Caserio poignarda le président Carnot, ces
humiliés et ces offensés, s’ils n’osèrent applaudir en public, ne
laissèrent pas de ressentir une trouble gratitude à l’égard des fous et
des assassins que, par une aberration du sens moral fréquente à
cette époque, ils tenaient pour des justiciers.
D’ailleurs, l’état de la société mondaine favorisait le
développement de la doctrine anarchiste. Un matérialisme jouisseur,
des mœurs débraillées, l’incohérence gouvernementale, les querelles
des factions, la survenue de tribus juives apportant, avec une odeur
de ghetto, les rêveries meurtrières des nihilistes — tout contribuait à
pervertir les esprits dévoyés par plus d’un siècle d’intoxication
révolutionnaire.
En maints salons, où les cosmopolites coudoyaient les snobs, on
écoutait avec considération les esthètes qui préconisaient, comme
panacée sociale, un horrible mélange de Nietzsche, d’Ibsen et de
Tolstoï.
Des cercleux, plus stupides que des pingouins, des caillettes
hystériques admirèrent Laurent Tailhade lorsqu’à propos des
meurtres anarchistes, il déclara : « Qu’importent les vagues
humanités, pourvu que le geste soit beau ! »
On ne saurait croire la vogue qu’obtint cette cruelle ineptie
analogue à celle d’Oscar Wilde qui, dans le même temps, demandait
qu’on supprimât les vieillards, « parce qu’ils sont laids », disait-il.
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Apoptosis and Cancer Methods and Protocols 1st Edition Gil

Avi Priel Editor

For further volumes:

Methods and Protocols

ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)

© Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2020

Jerusalem, Israel Avi Priel

PART II TOXINS PURIFICATION AND PRODUCTION

3 Venom Collection from Spiders and Snakes: Voluntary

PART III TOXINS CHARACTERIZATION

5 RNA-Sequencing of Snake Venom Glands . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

PART IV CHARACTERIZATION OF TOXINS FUNCTION

10 Methods for Evaluation of a Snake Venom-Derived Disintegrin

11 Cell-Based Adhesion Assays for Isolation of Snake Venom’s Integrin

Snake- and Spider-Venom-Derived Toxins as Lead

studies of Bristol-Myers Squibb Co. in developing the angiotensin-

2 What Is a Classical Synthetic Lead Compound in Drug Discovery?

Drug discovery encompasses processes ranging from target selec-

activity for the specific molecular target investigated based on

3 Can Peptides Be Used as Lead Compounds for Drug Development?

the first approved peptide therapeutic to be manufactured by

4 What Do the “Most Desired” Peptide Drugs Look Like?

Although there are exceptions, such as human parathyroid hor-

to a polymer or a lipid, need to be considered to obtain a therapeu-

5 Why Snake- and Spider-Venom-Derived Toxins Represent Good Lead

The pharmaceutical industry is currently facing unparalleled chal-

venoms and toxins are being harnessed in order to exploit the

5.1 Which Many snakes specifically evolved to immobilize vertebrate prey

Development Pharmacological Therapeutic Administration

iv intravenous, aa amino acid

Members of the snake-venom-derived “disintegrin” peptide

from the activated binding site. Through a series of small clinical

reliable commercial sources). In the second step, the venom was

integrin, with platelet aggregation-inhibiting activity, named Vipe-

of venom enzymes. The main components of spider venoms are

Name Spider name Pharmacological definition Target Reference

thought to play important roles in pain signaling. The 1.7 subtype

for NaV1.4, and NaV1.5) peptide drug inhibitors of NaV1.7

CaV2.1 in pain relief. Continued methodologies and technical

6 What Is a Common Preclinical Pipeline for Drug Development Based

As a consequence of their high potency and selectivity, snake- and

Fig. 1 (continued) isolation and purification approaches are based on pharma-

sequence can be straightforwardly assigned by BLAST analysis to a

Philip Lazarovici holds the Jacob Gitlin Chair in Physiology and is

Analytics for Bioactivity Profiling of Complex Mixtures

1 Bioactivity/Bioaffinity Profiling of Mixtures for Toxin Identification, Drug

Bioactivity describes the property of a compound or a set of com-

possibly present bioactives. Bioactivity profiling is generally

starting material (for example a venom or plant extract) and

approaches include gel chromatography followed by LC [6] or