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Serum Plasma Proteomics Methods and Protocols 3rd

Edition David W. Greening
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Serum Plasma Proteomics Methods and Protocols 1st Edition

Lynn A. Beer
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protocols-1st-edition-lynn-a-beer/
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Clinical Proteomics Methods and Protocols 1st Edition

Young-Ki Paik
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Cancer Genomics and Proteomics Methods and Protocols 1st

Edition Narendra Wajapeyee (Eds.)
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and-protocols-1st-edition-narendra-wajapeyee-eds/
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Introduction to Ground Penetrating Radar Inverse

Scattering and Data Processing 1st Edition Raffaele
Persico
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radar-inverse-scattering-and-data-processing-1st-edition-raffaele-
persico/
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The Politics of Personal Law in South Asia Second Edition.
Edition Partha S. Ghosh
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asia-second-edition-edition-partha-s-ghosh/
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Mechanical Properties of Polymers based on Nanostructure

and Morphology 1st Edition G. H. Michler
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on-nanostructure-and-morphology-1st-edition-g-h-michler/
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The Routledge Companion to Jazz Studies Nicholas Gebhardt
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nicholas-gebhardt/
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Exercise and Chronic Disease An Evidence Based Approach

1st Edition John Saxton
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evidence-based-approach-1st-edition-john-saxton/
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Nietzsche on mind and nature 1st Edition Dries
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edition-dries/
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The Aqua Group Guide to Procurement Tendering and Contract
Administration Second Edition Bowsher
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tendering-and-contract-administration-second-edition-bowsher/
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Methods in
Molecular Biology 2628
David W. Greening
Richard J. Simpson Editors
Serum/Plasma
Proteomics
Methods and Protocols
Third Edition
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY
Series Editor
John M. Walker
School of Life and Medical Sciences
University of Hertfordshire
Hatfield, Hertfordshire, UK
For further volumes:

http://www.springer.com/series/7651
For over 35 years, biological scientists have come to rely on the research protocols and
methodologies in the critically acclaimed Methods in Molecular Biology series. The series was
the first to introduce the step-by-step protocols approach that has become the standard in all
biomedical protocol publishing. Each protocol is provided in readily-reproducible step-by-
step fashion, opening with an introductory overview, a list of the materials and reagents
needed to complete the experiment, and followed by a detailed procedure that is supported
with a helpful notes section offering tips and tricks of the trade as well as troubleshooting
advice. These hallmark features were introduced by series editor Dr. John Walker and
constitute the key ingredient in each and every volume of the Methods in Molecular Biology
series. Tested and trusted, comprehensive and reliable, all protocols from the series are
indexed in PubMed.
Serum/Plasma Proteomics
Methods and Protocols
Third Edition
Edited by
David W. Greening
Molecular Proteomics, Baker Heart and Diabetes Institute, Melbourne, VIC, Australia
Richard J. Simpson
Department of Biochemistry and Chemistry, School of Agriculture, Biomedicine and Environment,
La Trobe Institute for Molecular Science, Melbourne, VIC, Australia
Editors
David W. Greening Richard J. Simpson
Molecular Proteomics Department of Biochemistry
Baker Heart and Diabetes Institute and Chemistry, School of Agriculture
Melbourne, VIC, Australia Biomedicine and Environment
La Trobe Institute for Molecular Science
Melbourne, VIC, Australia
ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)

ISBN 978-1-0716-2977-2 ISBN 978-1-0716-2978-9 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2978-9
© The Editor(s) (if applicable) and The Author(s), under exclusive license to Springer Science+Business Media, LLC, part
of Springer Nature 2011, 2017, 2023
This work is subject to copyright. All rights are solely and exclusively licensed by the Publisher, whether the whole or part
of the material is concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation,
broadcasting, reproduction on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and
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be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty,
expressed or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been
made. The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
This Humana imprint is published by the registered company Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer
Nature.
The registered company address is: 1 New York Plaza, New York, NY 10004, U.S.A.
Preface
Cartography of the plasma proteome remains technically challenging. Despite extensive

efforts to interrogate the plasma proteome for its composition and disease markers, relatively
few new candidate biomarkers have been accepted as clinically useful. This lack of success is
largely due to the complexity and unknown size of the plasma proteome which has a
concentration range exceeding 10 orders of magnitude, including low-abundant tissue-
derived proteins in the pg/mL range. Despite these technical challenges, recent develop-
ments in sensitive sample preparation (enrichment, multiplexing, fractionation) and
enhanced data-processing pipelines for the comprehensive, deep, and unbiased mass
spectrometry-based proteomic analysis of plasma herald a bright future for plasma-based
disease biomarker discovery. Over the past several years, we have witnessed technological
advances in mass spectrometry, developments in anti-protein or anti-peptide immunodeple-
tion, sample preparation workflows, chromatographic fractionation, targeted analyte-
specific monitoring assays, sample multiplexing, and processing and analytical throughput.
Software analysis workflows and informatic interrogation and digitalization pipelines are also
providing rapid and comprehensive insights for discovery and large-scale understanding of
the plasma proteome.
This updated volume describes recent developments in these above-mentioned areas of
plasma proteomics.
This third edition of Serum/Plasma Proteomics provides a detailed insight into topics
and methods covering blood processing and handling strategies (Part I), discovery-based
mass spectrometry (Part II), and targeted-based mass spectrometry (Part VI). We imple-
ment new areas including developments in technologies for plasma proteomics (Part III)
and assay development in biomarker discovery and translational proteomics (Part VII).
Several new areas have been expanded to integrate enrichment and detection strategies to
understand the plasma proteome (Part IV), isolation and use of extracellular vesicles from
blood (Part V), and peptide, lipid, and metabolite targeted assays (Part VIII). Workflows to
aid in discovery and targeted data analysis and interpretation we have included Software and
Bioinformatics for the Plasma Proteome (Part IX).
2023: Serum/Plasma Proteomics is a comprehensive resource of 33 chapters and proto-
cols across the areas of enrichment and fractionation for sensitive sample preparation,
multiplexing, advanced mass spectrometry acquisition strategies, and sophisticated data
processing pipelines. We introduce developments in microsampling, glycoprotein biology,
immunoassay design, high-throughput quantitative analyses, lipidomics, biomarker discov-
ery and validation, and analysis of circulating factors including extracellular vesicles and
platelets.
This updated volume, contributed by leading experts in the field, complements the
initial volumes of Serum/Plasma Proteomics (2011) and An Updated Serum/Plasma Proteo-
mics (2017), and provides a valuable foundation for the development and application of
v
vi Preface
blood-based proteomics. We would like to thank all authors and coauthors for sharing their
experience, knowledge, and time to make this new edition possible. We hope this resource
will catalyze further advances in the deep and scalable quantitative analysis of proteomic
studies in plasma and blood products.
Melbourne, VIC, Australia David W. Greening

Richard J. Simpson
Contents
Preface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Contributors. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi
PART I BLOOD PROCESSING AND HANDLING STRATEGIES

1 Protocols for the Isolation of Platelets for Research and Contrast
to Production of Platelet Concentrates for Transfusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Rosemary L. Sparrow, Richard J. Simpson, and David W. Greening
2 Collection of Plasma Samples in Areas with Limited Healthcare Access . . . . . . . . 19
Alicia Johnson, Camila Braga, Pedro de Magalhães Padilha,
and Jiri Adamec
3 Blood Collection Processing and Handling for Plasma and
Serum Proteomics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
Conor McCafferty, Natasha Letunica, Ella Swaney, Cai Tengyi,
Paul Monagle, Vera Ignjatovic, and Chantal Attard
4 Preparation of Cryoprecipitate and Cryo-depleted Plasma for
Proteomic Research Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
PART II DISCOVERY-BASED MASS SPECTROMETRY
5 High-Throughput Proteome Profiling of Plasma and Native

Plasma Complexes Using Native Chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Aleksandr Gaun, Niclas Olsson, John C. K. Wang, Dan L. Eaton,
and Fiona E. McAllister
6 High-Throughput and In-Depth Proteomic Profiling of 5 μL Plasma
and Serum Using TMTpro 16-Plex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
Yan Zhou, Rui Sun, Sainan Li, Xiao Liang, Liujia Qian,
Liang Yue, and Tiannan Guo
7 An Optimized Data-Independent Acquisition Strategy for
Comprehensive Analysis of Human Plasma Proteome . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
Haoyun Fang and David W. Greening
8 In-Depth Blood Proteome Profiling by Extensive Fractionation
and Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
Xue Zhang, Huan Sun, Zhen Wang, Suiping Zhou, Yingxue Fu,
High A. Anthony, and Junmin Peng
9 Early Cancer Biomarker Discovery Using DIA-MS Proteomic
Analysis of EVs from Peripheral Blood. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
Camila Espejo, Bruce Lyons, Gregory M. Woods, and Richard Wilson
vii
viii Contents
PART III DEVELOPMENTS IN TECHNOLOGIES FOR PLASMA PROTEOMICS
10 Strategies to Enrich, Identify, and Characterize Glycoproteome in

Blood Plasma Using Liquid Chromatography High-Resolution
Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155
Saravanan Kumar
11 Proteome Analysis of Whole Blood Collected by Volumetric
Absorptive Microsampling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
Mark P. Molloy, Cameron Hill, Matthew J. McKay,
and Ben R. Herbert
12 Proteomic Applications and Considerations: From Research
to Patient Care . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
Natasha Letunica, Conor McCafferty, Ella Swaney, Tengyi Cai,
Paul Monagle, Vera Ignjatovic, and Chantal Attard
PART IV ENRICHMENT & DETECTION STRATEGIES

13 Immunoaffinity Mass Spectrometry Diagnostic Tests for
Multi-Biomarker Assays. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
Scott Bringans, Tammy Casey, Jun Ito, Tasha Lumbantobing,
Ronan O’Neill, and Richard Lipscombe
14 Secretome Profile of Leukocyte-Platelet-Rich Fibrin
(L-PRF) Membranes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207
Lidia Hermida-Nogueira, Juan Blanco, and Ángel Garcı́a
15 Quantification of Proteins in Blood by Absorptive Microtiter
Plate-Based Affinity Purification Coupled to Liquid
Chromatography-Mass Spectrometry. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
Frank Klont, Oladapo Olaleye, and Rainer Bischoff
16 Glycomics-Assisted Glycoproteomics Enables Deep and Unbiased
N-Glycoproteome Profiling of Complex Biological Specimens . . . . . . . . . . . . . . . 235
The Huong Chau, Anastasia Chernykh, Julian Ugonotti,
Benjamin L. Parker, Rebeca Kawahara, and Morten Thaysen-Andersen
17 The Small-Protein Enrichment Assay (SPEA) for Analysis of Low
Abundance Peptide Hormones in Plasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265
Dylan James Harney and Mark Larance
PART V ANALYSIS OF EXTRACELLULAR VESICLES FROM BLOOD
18 In-Depth Proteomic Analysis of Blood Circulating Small

Extracellular Vesicles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279
Veronica De Giorgis, Elettra Barberis, Marco Falasca,
and Marcello Manfredi
19 Protocol for Plasma Extracellular Vesicle and Particle Isolation and
Mass Spectrometry-Based Proteomic Identification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291
Amirmohammad Nasiri Kenari, Linda Bojmar, Søren Heissel,
Henrik Molina, David Lyden, and Ayuko Hoshino
Contents ix
20 Analysis of Extracellular Vesicle and Contaminant Markers in

Blood Derivatives Using Multiple Reaction Monitoring . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301
Lauren A. Newman, Zivile Useckaite, Ting Wu, Michael J. Sorich,
and Andrew Rowland
21 Generation of Red Blood Cell Nanovesicles as a Delivery Tool . . . . . . . . . . . . . . . 321
Auriane Drack, Alin Rai, and David W. Greening
PART VI TARGETED-BASED MASS SPECTROMETRY
22 Progress in Targeted Mass Spectrometry (Parallel Accumulation-Serial

Fragmentation) and Its Application in Plasma/Serum Proteomics . . . . . . . . . . . . 339
Anqi Hu, Jiayi Zhang, and Huali Shen
23 Offline Peptide Fractionation and Parallel Reaction Monitoring
MS for the Quantitation of Low-Abundance Plasma Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . 353
Claudia Gaither, Robert Popp, Vincent R. Richard, René P. Zahedi,
and Christoph H. Borchers
24 Profiling Serum Intact N-Glycopeptides Using Data-Independent
Acquisition Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 365
Yi Yang and Liang Qiao
PART VII ASSAY DEVELOPMENT IN BIOMARKER DISCOVERY

AND TRANSLATIONAL PROTEOMICS
25 Semi-Automated Lectin Magnetic Bead Array (LeMBA) for

Translational Serum Glycoprotein Biomarker Discovery and Validation. . . . . . . . 395
Mriga Dutt, Marisa N. Duong, Scott Bringans, Renée S. Richards,
Richard Lipscombe, and Michelle M. Hill
26 Accessing Antibody Reactivities in Serum or Plasma to (Auto-)antigens
Using Multiplexed Bead-Based Protein Immunoassays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 413
Jasmin Huber, Silvia Schönthaler, Manuela Hofner,
Yasmin Gillitschka, Regina Soldo, Lisa Milchram, Klemens Vierlinger,
Christa Nöhammer, and Andreas Weinh€ a usel
27 Absolute Quantitative Targeted Proteomics Assays for Plasma Proteins . . . . . . . . 439
Yassene Mohammed, David Goodlett, and Christoph H. Borchers
PART VIII PLASMA-BASED PEPTIDE, LIPID, AND METABOLITE ASSAYS
28 Rapid and Quantitative Enrichment of Peptides from Plasma

for Mass Spectrometric Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 477
Amy L. George, Rachel E. Foreman, Mariwan H. Sayda,
Frank Reimann, Fiona M. Gribble, and Richard G. Kay
29 Comprehensive Targeted Lipidomic Profiling for Research and
Clinical Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 489
Kevin Huynh, Thy Duong, Natalie A. Mellett, Michelle Cinel,
Corey Giles, and Peter J. Meikle
x Contents
30 Multiplexed Bead-Based Peptide Immunoassays for the

Detection of Antibody Reactivities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 505
Silvia Schönthaler, Jasmin Huber, Manuela Hofner,
Yasmin Gillitschka, Regina Soldo, Lisa Milchram, Klemens Vierlinger,
Christa Nöhammer, and Andreas Weinh€ a usel
31 Array-Based Multiplex and High-Throughput Serology Assays . . . . . . . . . . . . . . . 535
Jennie Olofsson, Ceke Hellström, Eni Andersson, Jamil Yousef,
Lovisa Skoglund, Ronald Sjöberg, Anna Månberg, Peter Nilsson,
and Elisa Pin
PART IX SOFTWARE AND BIOINFORMATICS FOR THE PLASMA PROTEOME

32 Bioinformatics Tools and Knowledgebases to Assist Generating
Targeted Assays for Plasma Proteomics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 557
Yassene Mohammed, David Goodlett, and Christoph H. Borchers
33 Use of Longitudinal Serum Analysis and Machine Learning to
Develop a Classifier for Cancer Early Detection. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 579
Rashmi Madda, Vladislav A. Petyuk, Yi-Ting Wang, Tujin Shi,
Craig D. Shriver, Karin D. Rodland, and Tao Liu
Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 593
Contributors
JIRI ADAMEC • Department of Biochemistry, University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE,

USA; Redox Biology Center, University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE, USA
ENI ANDERSSON • Department of Protein Science, SciLifeLab, KTH Royal Institute of
Technology, Stockholm, Sweden
HIGH A. ANTHONY • Center for Proteomics and Metabolomics, St. Jude Children’s Research
Hospital, Memphis, TN, USA
CHANTAL ATTARD • Haematology Research, Murdoch Children’s Research Institute,
Melbourne, VIC, Australia; Department of Paediatrics, University of Melbourne,
Melbourne, VIC, Australia; The Royal Children’s Hospital, Parkville, VIC, Australia
ELETTRA BARBERIS • Biological Mass Spectrometry Lab, Department of Translational
Medicine, University of Piemonte Orientale, Novara, Italy; Center for Translational
Research on Autoimmune and Allergic Diseases, University of Piemonte Orientale,
Novara, Italy
RAINER BISCHOFF • Department of Analytical Biochemistry, Groningen Research Institute of
Pharmacy, University of Groningen, Groningen, The Netherlands
JUAN BLANCO • Periodontology Unit, Medical-Surgical Dentistry Research Group
(OMEQUI), Faculty of Medicine and Odontology, Instituto de Investigacion Sanitaria de
Santiago de Compostela (IDIS), Universidade de Santiago de Compostela, Santiago de
Compostela, Spain
LINDA BOJMAR • Children’s Cancer and Blood Foundation Laboratories, Departments of
Pediatrics, and Cell and Developmental Biology, Drukier Institute for Children’s Health,
Meyer Cancer Center, Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA
CHRISTOPH H. BORCHERS • Segal Cancer Proteomics Centre, Lady Davis Institute for
Medical Research, Jewish General Hospital, McGill University, Montreal, QC, Canada;
Division of Experimental Medicine, McGill University, Montreal, QC, Canada; Gerald
Bronfman Department of Oncology, McGill University, Montreal, QC, Canada;
Department of Pathology, McGill University, Montreal, QC, Canada; Segal Cancer
Centre, Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, Montreal,
QC, Canada; Gerald Bronfman Department of Oncology, Jewish General Hospital,
Montreal, QC, Canada
CAMILA BRAGA • Department of Biochemistry, University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE,
USA; Redox Biology Center, University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE, USA
SCOTT BRINGANS • Proteomics International, QEII Medical Centre, Nedlands, Perth, WA,
Australia
TENGYI CAI • Haematology Research, Murdoch Children’s Research Institute, Melbourne,
VIC, Australia; Department of Paediatrics, The University of Melbourne, Melbourne, VIC,
Australia
TAMMY CASEY • Proteomics International, QEII Medical Centre, Nedlands, Perth, WA,
Australia
THE HUONG CHAU • School of Natural Sciences, Faculty of Science and Engineering,
Macquarie University, Sydney, NSW, Australia; Biomolecular Discovery Research Centre,
Macquarie University, Sydney, NSW, Australia
xi
xii Contributors
ANASTASIA CHERNYKH • School of Natural Sciences, Faculty of Science and Engineering,

MICHELLE CINEL • Baker Heart and Diabetes Institute, Melbourne, VIC, Australia
VERONICA DE GIORGIS • Biological Mass Spectrometry Lab, Department of Translational
Novara, Italy
PEDRO DE MAGALHÃES PADILHA • Institute of Biosciences, São Paulo State University
(UNESP), Botucatu, São Paulo, Brazil
AURIANE DRACK • Baker Heart and Diabetes Institute, Melbourne, VIC, Australia;
Department of Biochemistry and Chemistry, La Trobe University, Melbourne, VIC,
Australia
MARISA N. DUONG • Proteomics International, QEII Medical Centre, Nedlands, Perth, WA,
Australia
THY DUONG • Baker Heart and Diabetes Institute, Melbourne, VIC, Australia
MRIGA DUTT • Precision and Systems Biomedicine Laboratory, QIMR Berghofer Medical
Research Institute, Herston, QLD, Australia
DAN L. EATON • Calico Life Sciences LLC, South San Francisco, CA, USA
CAMILA ESPEJO • Tasmanian School of Medicine, College of Health and Medicine, University
of Tasmania, Hobart, TAS, Australia
MARCO FALASCA • Metabolic Signalling Group, Curtin Medical School, Curtin Health
Innovation Research Institute, Curtin University, Perth, WA, Australia
HAOYUN FANG • Baker Heart and Diabetes Institute, Melbourne, VIC, Australia; Baker
Department of Cardiometabolic Health, University of Melbourne, Melbourne, VIC,
Australia
RACHEL E. FOREMAN • Wellcome-MRC Institute of Metabolic Science, University of
Cambridge, Addenbrooke’s Hospital, Cambridge, UK
YINGXUE FU • Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude
Children’s Research Hospital, Memphis, TN, USA
CLAUDIA GAITHER • MRM Proteomics Inc, Montreal, QC, Canada
ÁNGEL GARCÍA • Platelet Proteomics Group, Center for Research in Molecular Medicine and
Chronic Diseases (CIMUS), Universidade de Santiago de Compostela, and Instituto de
Investigacion Sanitaria de Santiago de Compostela (IDIS), Santiago de Compostela, Spain
ALEKSANDR GAUN • Calico Life Sciences LLC, South San Francisco, CA, USA
AMY L. GEORGE • Wellcome-MRC Institute of Metabolic Science, University of Cambridge,
Addenbrooke’s Hospital, Cambridge, UK
COREY GILES • Baker Heart and Diabetes Institute, Melbourne, VIC, Australia; Baker
Department of Cardiometabolic Health, University of Melbourne, Parkville, VIC,
Australia; Baker Department of Cardiovascular Research Translation and
Implementation, La Trobe University, Bundoora, VIC, Australia
YASMIN GILLITSCHKA • Austrian Institute of Technology GmbH, Center for Health and
Bioresources, Competence Unit Molecular Diagnostics, Vienna, Austria
DAVID GOODLETT • University of Victoria - Genome BC Proteomics Centre, Victoria, BC,
Canada; Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria, Victoria,
BC, Canada; University of Gdansk, International Centre for Cancer Vaccine Science,
Gdansk, Poland
Contributors xiii
DAVID W. GREENING • Molecular Proteomics, Baker Heart and Diabetes Institute,

Melbourne, VIC, Australia; Baker Department of Cardiovascular Research, Translation
and Implementation, La Trobe University, Melbourne, VIC, Australia; Central Clinical
School, Monash University, Melbourne, VIC, Australia; Baker Department of
Cardiometabolic Health, University of Melbourne, Melbourne, VIC, Australia;
Department of Biochemistry and Chemistry, La Trobe University, Melbourne, VIC,
Australia
FIONA M. GRIBBLE • Wellcome-MRC Institute of Metabolic Science, University of
TIANNAN GUO • iMarker Lab, Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine, Key
Laboratory of Structural Biology of Zhejiang Province, School of Life Sciences, Westlake
University, Hangzhou, Zhejiang, China; Institute of Basic Medical Sciences, Westlake
Institute for Advanced Study, Hangzhou, Zhejiang, China; Research Center for Industries
of the Future, Westlake University, Hangzhou, Zhejiang, China
DYLAN JAMES HARNEY • Charles Perkins Centre, School of Life and Environmental Sciences,
Faculty of Science, University of Sydney, Sydney, NSW, Australia
SØREN HEISSEL • Proteomics Resource Center, The Rockefeller University, New York, NY,
USA
CEKE HELLSTRÖM • Department of Protein Science, SciLifeLab, KTH Royal Institute of
BEN R. HERBERT • Sangui Bio Pty Ltd, St. Leonards, NSW, Australia
LIDIA HERMIDA-NOGUEIRA • Platelet Proteomics Group, Center for Research in Molecular
Medicine and Chronic Diseases (CIMUS), Universidade de Santiago de Compostela, and
Instituto de Investigacion Sanitaria de Santiago de Compostela (IDIS), Santiago de
Compostela, Spain
CAMERON HILL • Sangui Bio Pty Ltd, St. Leonards, NSW, Australia
MICHELLE M. HILL • Precision and Systems Biomedicine Laboratory, QIMR Berghofer
Medical Research Institute, Herston, QLD, Australia; Centre for Clinical Research, The
University of Queensland, Faculty of Medicine, Herston, QLD, Australia
MANUELA HOFNER • Austrian Institute of Technology GmbH, Center for Health and
AYUKO HOSHINO • School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology,
Yokohama, Kanagawa, Japan
ANQI HU • Institutes of Biomedical Sciences and Minhang Hospital, Fudan University,
Shanghai, China
JASMIN HUBER • Austrian Institute of Technology GmbH, Center for Health and
KEVIN HUYNH • Baker Heart and Diabetes Institute, Melbourne, VIC, Australia; Baker
VERA IGNJATOVIC • Haematology Research, Murdoch Children’s Research Institute,
Melbourne, VIC, Australia; Institute for Clinical and Translational Research, Johns
Hopkins All Children’s Hospital, St. Petersburg, FL, USA; Department of Pediatrics, Johns
Hopkins University, Baltimore, MD, USA
JUN ITO • Proteomics International, QEII Medical Centre, Nedlands, Perth, WA, Australia
xiv Contributors
ALICIA JOHNSON • Department of Biochemistry, University of Nebraska-Lincoln, Lincoln,

NE, USA; Redox Biology Center, University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE, USA
REBECA KAWAHARA • School of Natural Sciences, Faculty of Science and Engineering,
RICHARD G. KAY • Wellcome-MRC Institute of Metabolic Science, University of Cambridge,
AMIRMOHAMMAD NASIRI KENARI • School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of
Technology, Yokohama, Kanagawa, Japan
FRANK KLONT • Unit of PharmacoTherapy, -Epidemiology & -Economics, Groningen
Research Institute of Pharmacy, University of Groningen, Groningen, The Netherlands;
Department of Clinical Pharmacy and Pharmacology, University Medical Center
Groningen, University of Groningen, Groningen, The Netherlands
SARAVANAN KUMAR • Proteomics Lab, Thermo Fisher Scientific India, First Technology Place,
Bangalore, Karnataka, India
MARK LARANCE • Charles Perkins Centre, School of Medical Sciences, Faculty of Medicine and
Health, University of Sydney, Sydney, NSW, Australia
NATASHA LETUNICA • Haematology Research, Murdoch Children’s Research Institute,
XIAO LIANG • iMarker Lab, Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine, Key
RICHARD LIPSCOMBE • Proteomics International, QEII Medical Centre, Nedlands, Perth,
WA, Australia
SAINAN LI • iMarker Lab, Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine, Key
TAO LIU • Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, Richland,
WA, USA
TASHA LUMBANTOBING • Proteomics International, QEII Medical Centre, Nedlands, Perth,
WA, Australia
DAVID LYDEN • Children’s Cancer and Blood Foundation Laboratories, Departments of
Pediatrics, and Cell and Developmental Biology, Drukier Institute for Children’s Health,
Meyer Cancer Center, Weill Cornell Medicine, New York, NY, USA
BRUCE LYONS • Tasmanian School of Medicine, College of Health and Medicine, University of
Tasmania, Hobart, TAS, Australia
RASHMI MADDA • Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory,
Richland, WA, USA
ANNA MÅNBERG • Department of Protein Science, SciLifeLab, KTH Royal Institute of
MARCELLO MANFREDI • Biological Mass Spectrometry Lab, Department of Translational
Novara, Italy
Contributors xv
FIONA E. MCALLISTER • Calico Life Sciences LLC, South San Francisco, CA, USA
CONOR MCCAFFERTY • Haematology Research, Murdoch Children’s Research Institute,
MATTHEW J. MCKAY • Bowel Cancer and Biomarker Laboratory, School of Medical Science,
Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, Sydney, NSW, Australia
PETER J. MEIKLE • Baker Heart and Diabetes Institute, Melbourne, VIC, Australia; Baker
NATALIE A. MELLETT • Baker Heart and Diabetes Institute, Melbourne, VIC, Australia
LISA MILCHRAM • Austrian Institute of Technology GmbH, Center for Health and
YASSENE MOHAMMED • Center for Proteomics and Metabolomics, Leiden University Medical
Center, Leiden, The Netherlands; University of Victoria - Genome BC Proteomics Centre,
Victoria, BC, Canada; Department of Biochemistry and Microbiology, University of
Victoria, Victoria, BC, Canada
HENRIK MOLINA • Proteomics Resource Center, The Rockefeller University, New York, NY,
USA
MARK P. MOLLOY • Bowel Cancer and Biomarker Laboratory, School of Medical Science,
Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, Sydney, NSW, Australia
PAUL MONAGLE • Haematology Research, Murdoch Children’s Research Institute,
Melbourne, VIC, Australia; Department of Clinical Haematology, Royal Children’s
Hospital, Melbourne, VIC, Australia; Kids Cancer Centre, Sydney Children’s Hospital,
Randwick, NSW, Australia
LAUREN A. NEWMAN • College of Medicine and Public Health, Flinders University, Adelaide,
SA, Australia
PETER NILSSON • Department of Protein Science, SciLifeLab, KTH Royal Institute of
CHRISTA NÖHAMMER • Austrian Institute of Technology GmbH, Center for Health and
RONAN O’NEILL • Proteomics International, QEII Medical Centre, Nedlands, Perth, WA,
Australia
OLADAPO OLALEYE • Department of Analytical Biochemistry, Groningen Research Institute
of Pharmacy, University of Groningen, Groningen, The Netherlands
JENNIE OLOFSSON • Department of Protein Science, SciLifeLab, KTH Royal Institute of
NICLAS OLSSON • Calico Life Sciences LLC, South San Francisco, CA, USA
BENJAMIN L. PARKER • Department of Anatomy and Physiology, School of Biomedical Sciences,
Faculty of Medicine Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, Melbourne,
VIC, Australia
JUNMIN PENG • Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude
Children’s Research Hospital, Memphis, TN, USA; Center for Proteomics and
Metabolomics, St. Jude Children’s Research Hospital, Memphis, TN, USA
VLADISLAV A. PETYUK • Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory,
Richland, WA, USA
xvi Contributors
ELISA PIN • Department of Protein Science, SciLifeLab, KTH Royal Institute of Technology,
Stockholm, Sweden
ROBERT POPP • MRM Proteomics Inc, Montreal, QC, Canada
LIUJIA QIAN • iMarker Lab, Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine, Key
LIANG QIAO • Department of Chemistry and Shanghai Stomatological Hospital, Fudan
University, Shanghai, China
ALIN RAI • Baker Heart and Diabetes Institute, Melbourne, VIC, Australia; Baker
Department of Cardiovascular Research, Translation and Implementation, La Trobe
University, Melbourne, VIC, Australia
FRANK REIMANN • Wellcome-MRC Institute of Metabolic Science, University of Cambridge,
RENÉE S. RICHARDS • Precision and Systems Biomedicine Laboratory, QIMR Berghofer
Medical Research Institute, Herston, QLD, Australia
VINCENT R. RICHARD • Segal Cancer Proteomics Centre, Lady Davis Institute for Medical
Research, Jewish General Hospital, McGill University, Montreal, QC, Canada
KARIN D. RODLAND • Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory,
Richland, WA, USA; Department of Cell Developmental and Cancer Biology, Oregon
Health and Science University, Portland, OR, USA
ANDREW ROWLAND • College of Medicine and Public Health, Flinders University, Adelaide,
SA, Australia
MARIWAN H. SAYDA • Wellcome-MRC Institute of Metabolic Science, University of
SILVIA SCHÖNTHALER • Austrian Institute of Technology GmbH, Center for Health and
HUALI SHEN • Institutes of Biomedical Sciences and Minhang Hospital, Fudan University,
Shanghai, China
TUJIN SHI • Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, Richland,
WA, USA
CRAIG D. SHRIVER • Murtha Cancer Center Research Program, Department of Surgery,
Uniformed Services University of the Health Sciences, Bethesda, MD, USA; John P. Murtha
Cancer Center, Uniformed Services University of the Health Sciences, Walter Reed
National Military Medical Center, Bethesda, MD, USA
RICHARD J. SIMPSON • Department of Biochemistry and Chemistry, School of Agriculture,
Biomedicine and Environment, La Trobe University, Melbourne, VIC, Australia
RONALD SJÖBERG • Department of Protein Science, SciLifeLab, KTH Royal Institute of
LOVISA SKOGLUND • Department of Protein Science, SciLifeLab, KTH Royal Institute of
REGINA SOLDO • Austrian Institute of Technology GmbH, Center for Health and
MICHAEL J. SORICH • College of Medicine and Public Health, Flinders University, Adelaide,
SA, Australia
ROSEMARY L. SPARROW • Transfusion Science, Melbourne, VIC, Australia; School of Public
Health and Preventive Medicine, Monash University, Melbourne, VIC, Australia
Contributors xvii
HUAN SUN • Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude
RUI SUN • iMarker Lab, Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine, Key
ELLA SWANEY • Haematology Research, Murdoch Children’s Research Institute, Melbourne,
VIC, Australia; Department of Paediatrics, University of Melbourne, Melbourne, VIC,
Australia
CAI TENGYI • Haematology Research, Murdoch Children’s Research Institute, Melbourne,
VIC, Australia; Department of Paediatrics, University of Melbourne, Melbourne, VIC,
Australia
MORTEN THAYSEN-ANDERSEN • School of Natural Sciences, Faculty of Science and
Engineering, Macquarie University, Sydney, NSW, Australia; Biomolecular Discovery
Research Centre, Macquarie University, Sydney, NSW, Australia; Institute for Glyco-core
Research (iGCORE), Nagoya University, Nagoya, Aichi, Japan
JULIAN UGONOTTI • School of Natural Sciences, Faculty of Science and Engineering,
ZIVILE USECKAITE • College of Medicine and Public Health, Flinders University, Adelaide,
SA, Australia
KLEMENS VIERLINGER • Austrian Institute of Technology GmbH, Center for Health and
JOHN C. K. WANG • Calico Life Sciences LLC, South San Francisco, CA, USA
YI-TING WANG • Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory,
Richland, WA, USA
ZHEN WANG • Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude
ANDREAS WEINHA€ USEL • Austrian Institute of Technology GmbH, Center for Health and
RICHARD WILSON • Central Science Laboratory, University of Tasmania, Hobart, TAS,
Australia
GREGORY M. WOODS • Tasmanian School of Medicine, College of Health and Medicine,
University of Tasmania, Hobart, TAS, Australia
TING WU • College of Medicine and Public Health, Flinders University, Adelaide, SA,
Australia
YI YANG • Department of Chemistry and Shanghai Stomatological Hospital, Fudan
University, Shanghai, China; ZJU-Hangzhou Global Scientific and Technological
Innovation Center, Zhejiang University, Hangzhou, China
JAMIL YOUSEF • Department of Protein Science, SciLifeLab, KTH Royal Institute of
LIANG YUE • iMarker Lab, Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine, Key
xviii Contributors
RENÉ P. ZAHEDI • Manitoba Centre for Proteomics and Systems Biology, Winnipeg, MB,
Canada; Department of Internal Medicine, University of Manitoba, Winnipeg, MB,
Canada; Department of Biochemistry and Medical Genetics, University of Manitoba,
Winnipeg, MB, Canada
JIAYI ZHANG • Institutes of Biomedical Sciences and Minhang Hospital, Fudan University,
Shanghai, China
XUE ZHANG • Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude
SUIPING ZHOU • Center for Proteomics and Metabolomics, St. Jude Children’s Research
Hospital, Memphis, TN, USA
YAN ZHOU • iMarker Lab, Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine, Key
Part I
Blood Processing and Handling Strategies

Chapter 1
Protocols for the Isolation of Platelets for Research

and Contrast to Production of Platelet Concentrates
for Transfusion
Abstract
Platelets are specialized cellular elements of blood and play a central role in maintaining normal hemostasis,
wound healing, and host defense but also are implicated in pathologic processes of thrombosis, inflamma-
tion, and tumor progression and dissemination. Transfusion of platelet concentrates is an important
treatment for thrombocytopenia (low platelet count) due to disease or significant blood loss, with the
goal being to prevent bleeding or to arrest active bleeding. In blood circulation, platelets are in a resting
state; however, when triggered by a stimulus, such as blood vessel injury, become activated (also termed
procoagulant). Platelet activation is the basis of their biological function to arrest active bleeding, compris-
ing a complex interplay of morphological phenotype/shape change, adhesion, expression of signaling
molecules, and release of bioactive factors, including extracellular vesicles/microparticles. Advances in
high-throughput mRNA and protein profiling techniques have brought new understanding of platelet
biological functions, including identification of novel platelet proteins and secreted molecules, analysis of
functional changes between normal and pathologic states, and determining the effects of processing and
storage on platelet concentrates for transfusion. However, because platelets are very easily activated, it is
important to understand the different in vitro methods for platelet isolation commonly used and how they
differ from the perspective for use as research samples in clinical chemistry. Two simple methods are
described here for the preparation of research-scale platelet samples from human whole blood, and detailed
notes are provided about the methods used for the preparation of platelet concentrates for transfusion.
Key words Platelet, Blood, Activation, Isolation, Transfusion, Proteomics
1 Introduction
Platelets, the smallest of the human blood cellular elements

(~3.6 0.7 μm), are central players in maintaining normal hemo-
stasis, including surveillance of blood vessel wall integrity, clot
formation at sites of blood vessel injury, blood vessel repair, clot
retraction, and host defense. On the other hand, pathological
platelet activity, referred to as thrombosis, is implicated in blood
vessel constriction, atherosclerosis, inflammation, and promoting
David W. Greening and Richard J. Simpson (eds.), Serum/Plasma Proteomics: Methods and Protocols,
Methods in Molecular Biology, vol. 2628, https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2978-9_1,
© The Author(s), under exclusive license to Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2023
3
4 Rosemary L. Sparrow et al.
tumor growth/metastases [1–3]. Platelets are formed following

maturation of megakaryocytes in the bone marrow and are released
as anucleated fragments into the circulation [4]. Being anuclear,
platelets are not cells in the strict meaning of the word, although
they are often referred to as blood cells. Circulating platelets have a
discoid shape; are the second most numerous cellular element in
blood, normally circulating at concentrations between 150 and
450 109 platelets/L; and have the lowest specific gravity of
formed blood cells [1, 2]. Their shape and small size, combined
with blood flow rheology, allow platelets to access the edge of
blood vessels, thereby enabling them constantly to survey vascular
integrity. Complex, regulated reactions occur between platelets,
von Willebrand factor, collagen, and soluble coagulation factors in
regions of disturbed vasculature. These changes induce platelet
adherence to vessel walls and platelet activation, which leads to
platelet aggregation, procoagulant activity, spreading, microparti-
cle release, and formation of a primary hemostatic plug [1, 2].
Since platelets lack nuclear DNA and their genome consists of a
subset of megakaryocyte-derived mRNA transcripts, they represent
a simplified biological model when investigating cell function
[4]. While valuable information may be gathered from studies of
platelet mRNA [5, 6], the rapid signaling and regulatory events in
platelets are not governed by, or dependent on, alterations in gene
expression. On the other hand, characterization of the platelet
proteome by proteomic techniques provides powerful insight into
the vicissitudes of platelet function [7, 8]. Platelet proteomic stud-
ies reported to date can be grouped into three distinct purposes:
(i) cataloging the spectrum of proteins that comprise the normal,
resting platelet proteome, (ii) characterizing proteins expressed by
or released from activated platelets, and (iii) identifying specific
platelet sub-proteomes. For example, proteomic studies have
detailed the proteins expressed at the platelet membrane [9, 10]
and in granules [11], changes in phosphorylation patterns [12, 13],
and functional endpoints in response to external stimuli (i.e., extra-
cellular vesicles [14, 15] and releasate [16, 17]), as well as effects of
processing and storage on platelet concentrates (PCs) for transfu-
sion [18–20] and in pathological conditions [21–23].
The separation of platelets from whole blood is based on the
differential densities of the various cellular elements when blood is
subjected to defined centrifugation forces. Platelets, being the
smallest and lightest cellular elements of blood, remain suspended
in the liquid plasma when whole blood is centrifuged at a low
centrifugal force. Protocols for the preparation of platelets rely on
this characteristic, including those used by blood processing facil-
ities for the preparation of PCs for clinical use.
Transfusion of PCs is indicated for the treatment of thrombo-
cytopenia caused by hematological disease or the effects of chemo-
therapy or bleeding related to surgery or trauma injury. PCs for
Platelet Isolation for Research and Transfusion 5
transfusion can be prepared by three different methods: (i) platelet-

rich plasma-platelet concentrates (PRP-PC), (ii) buffy coat-platelet
concentrates (BC-PC), and (iii) apheresis-platelet concentrates
(apheresis-PC). All three processing methods are fully closed sterile
systems. For the preparation of PRP-PC, an initial soft centrifuga-
tion produces PRP, which is separated from white cells and red
cells, and the PRP is centrifuged at a higher g force to pellet the
platelets. The PRP method is typically used for preparing research
platelet samples from smaller volumes of whole blood. Disadvan-
tages of this method are that it is difficult to avoid aspirating some
white cells and red cells with the PRP [9] and the platelets are hard-
spun against the surface of the container, which increases the risk of
platelet activation and/or damage. In contrast, platelets prepared
by the BC-PC method are not subjected to being pelleted, and the
levels of other cellular contaminants tend to be lower [24]. For
apheresis-PC, a specialized automated blood cell separator is used
whereby the blood donor is inline directly and whole blood is
drawn, immediately mixed with anticoagulant, and separated into
components; the target component (e.g., platelets) is collected into
a separate bag, while other components (i.e., plasma, red cells,
white cells) are returned to the donor [25].
In developed countries, blood for transfusion is collected, pro-
cessed, and distributed by licensed blood processing facilities that
operate in a highly regulated environment governed by strict codes
of practice similar to those that apply to the manufacturers of
medicinal products (i.e., the code of good manufacturing practice
(cGMP)). These regulations are designed to ensure standardization
of all procedures to maximize quality and safety of blood transfu-
sion components, such as PCs [26].
For this protocol, two research-scale methods for the prepara-
tion of platelets from whole blood are described that yield a mini-
mally manipulated platelet specimen suitable for use in proteomic
analysis and other research applications [27, 28]. Because many
researchers source platelets from a supplier of blood transfusion
products, an overview of the methods used by blood processing
facilities to prepare PCs from whole blood donations and by single-
donor apheresis collection is also provided.
2 Materials
2.1 Blood Collection 1. Acid citrate dextrose (ACD) blood collection tubes (e.g.,
and Platelet Sample Whole Blood Glass Vacutainer® tube with anticoagulant,
Preparation ACD Sol A, 8.5 mL, BD Biosciences #364606) (see Note 1).
2. Sterile hypodermic needles compatible with the blood collec-
tion tubes, e.g., BD Vacutainer® Safety-Lok™ Blood Collec-
tion Set #367281; 21-G butterfly needle with attached sterile
tubing.
6 Rosemary L. Sparrow et al.
3. Tourniquet, alcohol swabs for disinfection of the

venipuncture site.
4. Personnel protective equipment—examination/surgical
gloves, gown, eye safety glasses.
5. Waste container for biological and sharp hazards.
6. Polypropylene tubes for processing and storage (15 mL).
7. Tube rack.
8. Adhesive labels for blood sample tubes and indelible
marker pen.
9. Transfer pipettes, wide aperture.
10. Centrifuge (swing bucket rotor, compatible with 15 mL tubes,
programmable temperature setting; set at 22 C).
11. Platelet wash buffer (see Note 2).
12. Platelet activation inhibitors (see Note 2) (optional).
13. Water bath set at 22–24 C (optional).
3 Methods
3.1 Blood Collection 1. For the preparation of normal, resting platelets, the blood
donor must be healthy, with no signs of infection or inflamma-
tion, and must not have taken medications that have antith-
rombotic (anticlotting) or anti-inflammatory effects, such as
aspirin or ibuprofen.
2. Blood collection must only be performed by personnel trained
in phlebotomy/venipuncture. Safety precautions for the col-
lection and handling of blood must be employed at all times
(see Note 3). Particular care must be taken with insertion of the
hypodermic needle into the center midstream of the vein to
limit the possibility of activation of the hemostasis/coagulation
system, which could compromise the quality of the blood
sample. A hypodermic needle of 21-gauge or wider is recom-
mended to minimize shear stress upon the collected blood
specimen.
3. It is important to collect the volume of blood specified for the
particular blood collection tube to ensure the correct blood/
anticoagulant ratio is achieved (see Note 4).
4. After blood collection, gently invert the tube three to four
times to ensure thorough mixing with the ACD anticoagulant.
5. Blood samples must be maintained at temperate conditions
(i.e., 20–24 C) and platelet preparations prepared within 4 h
of blood collection. To ensure blood samples are held at the
correct temperature, place in a water bath set at 22–24 C if
necessary.
Platelet Isolation for Research and Transfusion 7
6. One 8.5 mL tube of whole blood from a donor with a normal

platelet count (i.e., 150–450 109 platelets/L) should yield
sufficient numbers of platelets to prepare a sample for proteo-
mic analysis and other expression validations as required.
3.2 Platelet-Rich Precaution: Platelets are extremely labile and are very easily acti-
Plasma (PRP) vated during sample preparation. It is important to limit the extent
Preparation Method of manipulation of the blood sample to avoid unintentional activa-
tion of the platelets. All procedures must be performed at 20–24 C
to maintain platelet quality and viability. The temperature of all
equipment (e.g., centrifuge) and wash buffers (if used) must be
between 20 and 24 C prior to use. At temperatures below 20 C,
platelets undergo cold storage-induced activation [29, 30] and
must be avoided in order to isolate normal resting platelets:
1. The PRP is separated from whole blood (typical volume
8.5 mL) by light spin centrifugation at 110 g for 15 min at
22 C, without brake. Under these centrifugation conditions,
the platelets will remain suspended in the plasma (upper frac-
tion, yellow-colored fluid), while the denser white cells and red
cells will softly settle to the lower fraction (Fig. 1a). Using a
Fig. 1 Schematic of methods to isolate platelets for research from whole blood. (a) Platelet-rich plasma (PRP)
method, (b) buffy coat (BC) method. The order of the hard and soft centrifugations is different between the two
methods. Following the second spin, the platelets are pelleted in the PRP method but are in suspension in the
BC method and necessitate a third centrifugation to pellet the platelets. In general, the BC method yields a
purer platelet sample with less carryover of contaminant white cells, red cells, and plasma. PPP platelet-poor
plasma
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terre, ceux-là la tête appuyée sur leur main. Ils dorment, et le comte
aurait pu en tuer un grand nombre ; pourtant il ne tira pas Durandal.
Le généreux Roland a le cœur si grand, qu’il dédaigne de frapper
des gens qui dorment. Il parcourt ces lieux en tous sens, cherchant à
retrouver les traces de sa dame. A chacun de ceux qu’il rencontre
éveillés, il dépeint, en soupirant, ses vêtements et sa tournure, et les
prie de lui apprendre, par courtoisie, de quel côté elle est allée.
Puis, quand vint le jour clair et brillant, il chercha dans toute
l’armée mauresque ; et il pouvait le faire en toute sécurité, vêtu qu’il
était de l’habit arabe. Il était en outre servi en cette occasion par sa
connaissance des langues autres que la langue française ; il parlait
en particulier la langue africaine de façon à faire croire qu’il était né à
Tripoli et qu’il y avait été élevé.
Il chercha par tout le camp, où il demeura trois jours sans plus de
résultat. Puis il parcourut non seulement les cités et les bourgs de
France et de son territoire, mais jusqu’à la moindre bourgade
d’Auvergne et de Gascogne. Il chercha partout, de la Provence à la
Bretagne, et de la Picardie aux frontières d’Espagne.
Ce fut entre la fin d’octobre et le commencement de novembre,
dans la saison où les arbres voient tomber leur robe feuillue jusqu’à
ce que leurs branches restent entièrement nues, et où les oiseaux
vont par bandes nombreuses, que Roland entreprit son amoureuse
recherche. Et de tout l’hiver il ne l’abandonna point, non plus qu’au
retour de la saison nouvelle.
Passant un jour, selon qu’il en avait coutume, d’un pays dans un
autre, il arriva sur les bords d’un fleuve qui sépare les Normands des
Bretons [52] , et va se jeter dans la mer voisine. Ce fleuve était alors
tout débordé et couvert d’écume blanche par la fonte des neiges et
la pluie des montagnes, et l’impétuosité des eaux avait rompu et
emporté le pont, de sorte qu’on ne pouvait plus passer.
Le paladin cherche des yeux d’un côté et d’autre le long des
rives, pour voir, puisqu’il n’est ni poisson ni oiseau, comment il
pourra mettre le pied sur l’autre bord. Et voici qu’il voit venir à lui un
bateau, à la poupe duquel une damoiselle est assise. Il lui fait signe
de venir à lui, mais elle ne laisse point arriver la barque jusqu’à terre.
Elle ne touche point terre de la proue, car elle craint qu’on ne
monte contre son gré dans la barque. Roland la prie de le prendre
avec elle et de le déposer de l’autre côté du fleuve. Et elle à lui : «
— Aucun chevalier ne passe par ici, sans avoir donné sa foi de
livrer, à ma requête, la bataille la plus juste et la plus honorable qui
soit au monde.
« C’est pourquoi, si vous avez le désir, chevalier, de porter vos
pas sur l’autre rive, promettez-moi que vous irez, avant la fin du mois
prochain, vous joindre au roi d’Irlande qui rassemble une grande
armée pour détruire l’île d’Ébude, la plus barbare de toutes celles
que la mer entoure.
« Vous devez savoir que par delà l’Irlande, et parmi beaucoup
d’autres, est située une île nommée Ébude, dont les sauvages
habitants, pour satisfaire à leur loi, pillent les environs, enlevant
toutes les femmes qu’ils peuvent saisir, et qu’ils destinent à servir de
proie à un animal vorace qui vient chaque jour sur leur rivage, où il
trouve toujours une nouvelle dame ou damoiselle dont il se nourrit.
« Les marchands et les corsaires qui croisent dans ces parages,
leur en livrent en quantité, et surtout les plus belles. Vous pouvez
compter, à une par jour, combien ont déjà péri de dames et de
damoiselles. Mais, si la pitié trouve en vous asile, si vous n’êtes pas
entièrement rebelle à l’amour, ayez pour agréable de faire partie de
ceux qui vont combattre pour une si juste cause. — »
Roland attend à peine d’avoir tout entendu, et, en homme qui ne
peut souffrir un acte inique et barbare, ni en entendre parler sans
que cela lui pèse, il jure d’être le premier à cette entreprise. Quelque
chose lui fait penser, lui fait craindre, que ces gens ne se soient
emparés d’Angélique, puisqu’il l’a cherchée par tant d’endroits sans
pouvoir retrouver sa trace.
Cette pensée le trouble et lui fait abandonner son premier projet.
Il se décide à s’embarquer le plus vite possible pour cette île inique.
Avant que le soleil ne se soit plongé dans la mer, il trouve près de
Saint-Malo un navire sur lequel il monte ; puis, ayant fait déployer les
voiles, il dépasse le Mont-Saint-Michel pendant la nuit.
Il laisse Saint-Brieuc et Landriglier [53] à main gauche, et s’en va
côtoyant les grandes falaises bretonnes. Puis, il se dirige droit sur
les côtes blanches d’où l’Angleterre a pris le nom d’Albion. Mais le
vent, qui était d’abord au midi, vient à manquer, et se met à souffler
du ponant et du nord avec une telle force, qu’il faut abaisser toutes
les voiles et tourner la poupe.
Tout le chemin qu’avait fait le navire en quatre jours, on le refait
en arrière en un seul. L’habile pilote tient la haute mer et n’approche
pas de terre, où son bâtiment se briserait comme un verre fragile. Le
vent, après avoir soufflé en fureur pendant quatre jours, s’apaisa le
cinquième et laissa le navire entrer paisiblement dans l’embouchure
du fleuve d’Anvers.
Dès que le pilote, harassé de fatigue, eut fait entrer dans cette
embouchure son vaisseau maltraité par la tempête, il longea une
contrée qui s’étendait à droite du fleuve ; on vit aussitôt descendre
sur la rive un vieillard d’un grand âge, ainsi que semblait l’indiquer sa
chevelure blanche. D’un air tout à fait courtois, après avoir salué tout
le monde, il se retourna vers le comte, qu’il jugea être le chef,
Et le pria, de la part d’une damoiselle, de venir au plus tôt lui
parler, ajoutant qu’elle était belle, et plus douce et plus affable que
toute autre au monde ; et que s’il préférait l’attendre, elle viendrait le
trouver sur son navire, car elle mettait le plus grand empressement à
s’aboucher avec tous les chevaliers errants qui passaient par là ;
Qu’aucun chevalier, venu par terre ou par mer dans
l’embouchure du fleuve, n’avait refusé de s’entretenir avec la
damoiselle et de la conseiller dans sa cruelle position. En entendant
cela, Roland s’élance sans retard sur la rive, et comme il était
humain et rempli de courtoisie, il va où le vieillard le mène.
Une fois à terre, le paladin fut conduit dans un palais, au haut de
l’escalier duquel il trouva une dame en grand deuil, autant que
l’indiquaient son visage et les tentures noires dont toutes les
chambres et les salles étaient tendues. Après un accueil plein de
grâce et de déférence, la dame le fit asseoir et lui dit d’une voix
triste :
« — Je veux que vous sachiez que je suis la fille du comte de
Hollande. Bien que je ne fusse pas son seul enfant, et que j’eusse
deux frères, je lui étais si chère, qu’à tout ce que je lui demandais,
jamais il ne me répondit par un refus. Je vivais heureuse en cet état,
lorsqu’arriva sur nos terres un jeune duc.
« Il était duc de Zélande et s’en allait vers la Biscaye, guerroyer
contre les Maures. La jeunesse et la beauté qui fleurissaient en lui
m’inspirèrent un profond amour, et il eut peu de peine à me captiver.
Je croyais et je crois, et je pense ne point me tromper, qu’il m’aimait
et qu’il m’aime encore d’un cœur sincère.
« Pendant les jours qu’il fut retenu chez nous par les vents
contraires — contraires aux autres, mais à moi propices, car s’ils
furent au nombre de quarante pour tout le monde, ils me parurent à
moi durer un moment, tant à s’enfuir ils eurent les ailes promptes —
nous eûmes ensemble de nombreux entretiens, où nous nous
promîmes de nous unir solennellement en mariage, aussitôt qu’il
serait de retour.
« A peine Birène nous eut-il quittés — c’est le nom de mon fidèle
amant — que le roi de Frise, pays qui est séparé du nôtre par la
largeur du fleuve, désirant me faire épouser son fils unique nommé
Arbant, envoya en Hollande les plus dignes seigneurs de son
royaume, pour me demander à mon père.
« Moi, qui ne pouvais pas manquer à la foi promise à mon amant,
et qui n’aurais pas voulu y manquer, quand même Amour me l’eût
permis, pour déjouer tous ces projets menés si vivement, et pressée
de donner une réponse, je dis à mon père que, plutôt que prendre
un mari en Frise, j’aimerais mieux être mise à mort.
« Mon bon père, dont le seul plaisir était de faire ce qui me
plaisait, ne voulut pas me tourmenter plus longtemps, et pour me
consoler et faire cesser les pleurs que je répandais, il rompit la
négociation. Le superbe roi de Frise en conçut tant d’irritation et de
colère, qu’il entra en Hollande, et commença la guerre qui devait
mettre en terre tous ceux de mon sang.
« Outre qu’il est si fort et si vigoureux que bien peu l’égalent de
nos jours, il est si astucieux dans le mal, que la puissance, le
courage et l’intelligence ne peuvent rien contre lui. Il possède une
arme que les anciens n’ont jamais vue, et que, parmi les modernes,
lui seul connaît. C’est un tube de fer, long de deux brasses, dans
lequel il met de la poudre et une balle.
« Dès qu’avec le feu il touche un petit soupirail qui se trouve à
l’arrière de cette canne et qui se voit à peine — comme le médecin
qui effleure la veine qu’il veut alléger — la balle est chassée avec le
fracas du tonnerre et de l’éclair, et comme fait la foudre à l’endroit où
elle a passé, elle brûle, abat, déchire et fracasse tout ce qu’elle
touche.
« A l’aide de cette arme perfide, il mit deux fois notre armée en
déroute, et occit mes frères. A la première rencontre, il tua le premier
en lui mettant la balle au beau milieu du cœur, après avoir traversé
le haubert ; dans le second combat, l’autre, qui fuyait, reçut la mort
par une balle qui le frappa de loin entre les épaules et qui ressortit
par la poitrine.
« Quelques jours après, mon père qui se défendait dans le
dernier château qui lui restait, car il avait perdu tous les autres, fut
tué d’un coup semblable ; pendant qu’il allait et venait, veillant à ceci
et à cela, il fut frappé entre les deux yeux par le traître qui l’avait visé
de loin.
« Mes frères et mon père morts, je restai l’unique héritière de l’île
de Hollande. Le roi de Frise, qui avait l’intention bien arrêtée de
prendre pied sur cet État, me fit savoir, ainsi qu’à mon peuple, qu’il
m’accorderait la paix, si je voulais encore — ce que j’avais refusé
auparavant — prendre pour mari son fils Arbant.
« Moi, tant à cause de la haine que j’avais conçue pour lui et pour
toute sa race infâme qui avait tué mes deux frères et mon père, et
qui m’avait vaincue et dépouillée, que parce que je ne voulais pas
manquer à la promesse que j’avais faite à Birène de ne pas en
épouser un autre jusqu’à ce qu’il fût revenu d’Espagne,
« Je répondis que j’aimerais mieux souffrir mille maux, être mise
à mort, brûlée vive et que ma cendre fût jetée au vent, avant de
consentir à faire cela. Mes sujets essayèrent de me détourner de
cette résolution ; ils me prièrent ; ils me menacèrent de me livrer, moi
et mes domaines, plutôt que de se laisser opprimer à cause de mon
obstination.
« Aussi, voyant que leurs protestations et leurs prières étaient
vaines, et que je persistais dans mon refus, ils entrèrent en accord
avec le Frison et, comme ils l’avaient dit, ils me livrèrent à lui, moi et
ma ville. Le roi de Frise, sans me faire subir aucun mauvais
traitement, m’assura qu’il me conserverait la vie, si je voulais
consentir à ses anciens projets et devenir la femme de son fils
Arbant.
« Me voyant ainsi forcée, je voulus, pour m’échapper de leurs
mains, perdre la vie ; mais mourir sans me venger m’eût semblé plus
douloureux que tous les maux que j’avais déjà soufferts. Après avoir
beaucoup réfléchi, je compris que la dissimulation pouvait seule
servir ma vengeance. Je feignis de désirer que le roi me pardonnât
et fît de moi sa belle-fille.
« Parmi tous ceux qui avaient été jadis au service de mon père,
je choisis deux frères doués d’une grande intelligence et d’un grand
courage. Ils étaient encore plus fidèles, ayant grandi à la cour et
ayant été élevés avec nous dès leur première jeunesse. Ils m’étaient
si dévoués, que leur vie leur paraissait peu de chose pour me
sauver.
« Je leur fis part de mon dessein, et ils me promirent de m’aider.
L’un d’eux alla en Flandre pour y appareiller un navire ; l’autre resta
en Hollande avec moi. Or, pendant que les étrangers et les habitants
du royaume se préparaient à célébrer mes noces, on apprit que
Birène avait levé une armée en Biscaye, pour venir en Hollande.
« Après la première bataille, où un de mes frères fut tué, j’avais
en effet envoyé un messager en Biscaye, pour en porter la triste
nouvelle à Birène. Pendant que ce dernier était occupé à lever une
armée, le roi de Frise conquit le reste de la Hollande. Birène, qui ne
savait rien de tout cela, avait mis à la voile pour venir à notre
secours.
« Le roi frison, avisé de ce fait, laisse à son fils le soin de
continuer les préparatifs des noces, et prend la mer avec toute son
armée. Il rencontre le duc, le défait, brûle et détruit sa flotte, et —
ainsi le veut la Fortune — le fait prisonnier. Mais la nouvelle de ces
événements ne parvint pas encore jusqu’à nous. Pendant ce temps,
le jeune prince m’épousa et voulut coucher avec moi, dès le soleil
disparu.
« J’avais fait cacher, derrière les rideaux du lit, mon fidèle
serviteur, qui ne bougea pas avant d’avoir vu mon époux venir à moi.
Mais à peine celui-ci fut-il couché, qu’il leva une hache et lui porta un
coup si vigoureux derrière la tête, qu’il lui ôta la parole et la vie. Moi,
je sautai vivement à bas du lit et je lui coupai la gorge.
« Comme tombe le bœuf sous la masse, ainsi tomba le misérable
jeune homme. Et cela fut un juste châtiment pour le roi Cymosque,
plus que tout autre félon — l’impitoyable roi de Frise est ainsi
nommé — qui m’avait tué mes deux frères et mon père ; et qui, pour
mieux se rendre maître de mes États, me voulait pour bru, et
m’aurait peut-être un jour tuée aussi.
« Avant que l’éveil soit donné, je prends ce que j’ai de plus
précieux et de moins lourd ; mon compagnon me descend en toute
hâte, par une corde suspendue à la fenêtre, vers la mer où son frère
attendait sur le navire qu’il avait acheté en Flandre. Nous livrons les
voiles au vent, nous battons l’eau avec les rames, et nous nous
sauvons tous, comme il plaît à Dieu.
« Je ne sais si le roi de Frise fut plus affligé de la mort de son fils,
qu’enflammé de colère contre moi, lorsque, le jour suivant, il apprit à
son retour combien il avait été outragé. Il s’en revenait, lui et son
armée, orgueilleux de sa victoire et de la prise de Birène. Et croyant
accourir à des noces et à une fête, il trouva tout le monde dans un
deuil sombre et funeste.
« La douleur de la mort de son fils, la haine qu’il a contre moi, ne
le laissent en repos ni jour ni nuit. Mais, comme les pleurs ne
ressuscitent pas les morts, et que la vengeance seule assouvit la
haine, il veut employer le temps qu’il devait passer dans les soupirs
et dans les larmes, à chercher comment il pourra me prendre et me
punir.
« Tous ceux qu’il savait, ou qu’on lui avait dit être mes amis ou
m’avoir aidée dans mon entreprise, il les fit mettre à mort, et leurs
domaines furent brûlés et ravagés. Il voulut aussi tuer Birène,
pensant que je ne pourrais pas ressentir de plus grande douleur.
Mais il pensa qu’en le gardant en vie il aurait en main le filet qu’il
fallait pour me prendre.
« Toutefois il lui impose une cruelle et dure condition : il lui
accorde une année, à la fin de laquelle il lui infligera une mort
obscure, si, par la force ou par la ruse, Birène, avec l’aide de ses
amis et de ses parents, par tous les moyens qu’il pourra, ne me livre
à lui prisonnière. Ainsi sa seule voie de salut est ma mort.
« Tout ce qu’on peut faire pour le sauver, hors me perdre moi-
même, je l’ai fait. J’avais six châteaux en Flandre ; je les ai vendus ;
et le prix, petit ou grand, que j’en ai retiré, je l’ai employé partie à
tenter, par l’intermédiaire de personnes adroites, de corrompre ses
gardiens, partie à soulever contre ce barbare, tantôt les Anglais,
tantôt les Allemands.
« Mes émissaires, soit qu’ils n’aient rien pu, soit qu’ils n’aient pas
rempli leur devoir, m’ont fait de belles promesses et ne m’ont point
aidée. Ils me méprisent, maintenant qu’ils m’ont soutiré de l’or. Et le
terme fatal approche, après lequel ni force ni trésor ne pourront
arriver à temps pour arracher mon cher époux à une mort terrible.
« Mon père et mes frères sont morts à cause de lui ; c’est à
cause de lui que mon royaume m’a été enlevé ; pour lui, pour le tirer
de prison, j’ai sacrifié les quelques biens qui me restaient, et qui
étaient ma seule ressource pour vivre. Il ne me reste plus
maintenant qu’à aller me livrer moi-même aux mains d’un si cruel
ennemi, afin de le délivrer.
« Si donc il ne me reste plus autre chose à faire, et si je n’ai plus
d’autre moyen pour le sauver que d’aller offrir ma vie pour lui, offrir
ma vie pour lui me sera cher encore. Mais une seule crainte
m’arrête : sais-je si je pourrai conclure avec le tyran un pacte assez
solide pour qu’une fois qu’il m’aura en son pouvoir, il ne me trompe
pas ?
« Je crains, quand il me tiendra en cage, et qu’il m’aura fait subir
tous les tourments, qu’il ne laisse point pour cela aller Birène, afin de
m’ôter la satisfaction de l’avoir délivré. Je périrai, mais sa rage ne
sera pas satisfaite s’il me fait périr seule, et, quelque vengeance qu’il
ait tirée de moi, il n’en fera pas moins ce qu’il voudra du malheureux
Birène.
« Or, la raison qui me porte à conférer avec vous au sujet de mes
malheurs, et qui fait que je les expose à tous les seigneurs et à tous
les chevaliers qui passent près de nous, est simplement pour que
quelqu’un me donne l’assurance qu’après que je me serai livrée à
mon cruel persécuteur, il ne retiendra pas Birène prisonnier. Je ne
veux pas, moi morte, qu’il soit ensuite mis à mort.
« J’ai prié chaque guerrier que j’ai vu, de m’accompagner quand
j’irai me remettre entre les mains du roi de Frise. Mais auparavant
j’ai exigé qu’il me promît, qu’il me donnât sa foi de faire exécuter
l’échange, de façon que, moi livrée, Birène sera à l’instant mis en
liberté. De la sorte, quand je serai conduite au supplice, je mourrai
contente, certaine que ma mort aura donné la vie à mon époux.
« Jusqu’à ce jour, je n’ai trouvé personne qui veuille m’assurer
sur sa foi qu’une fois que je serai au pouvoir du roi, celui-ci remettra
Birène en échange, et que je ne me serai pas livrée en vain,
tellement chacun redoute cette arme, cette arme contre laquelle il
n’est pas, dit-on, de cuirasse qui puisse résister, si épaisse qu’elle
soit.
« Mais si chez vous le courage répond à la fière prestance et à
l’aspect herculéen, si vous croyez pouvoir m’arracher à Cymosque
dans le cas où il manquerait à sa promesse, consentez à
m’accompagner lorsque j’irai me remettre en ses mains. Si vous
êtes avec moi, je ne craindrai plus qu’une fois que je serai morte,
mon seigneur meure aussi. — »
Ici la damoiselle termina son récit qu’elle avait interrompu
souvent par ses larmes et ses soupirs. Dès qu’elle eut fermé la
bouche, Roland, qui n’hésita jamais à faire le bien, ne se répandit
pas en vaines paroles, car, de sa nature, il n’en abusait pas. Mais il
lui promit et lui donna sa foi qu’il ferait plus qu’elle ne lui avait
demandé.
Son intention n’est pas qu’elle aille se remettre aux mains de son
ennemi pour sauver Birène. Il les sauvera bien tous deux, si son
épée et sa valeur habituelle ne lui font point défaut. Le jour même, ils
se mettent en route, profitant du vent doux et favorable. Le paladin
presse le départ, car il désirait se rendre ensuite le plus tôt possible
à l’île du monstre.
L’habile pilote dirige sa voile d’un côté et d’autre, à travers les
étangs profonds ; il longe successivement toutes les îles de la
Zélande, découvrant l’une à mesure qu’on dépasse l’autre. Le
troisième jour, Roland descend en Hollande ; mais il ne laisse pas
venir avec lui celle qui est en guerre avec le roi de Frise ; Roland
veut qu’elle apprenne la mort de ce tyran avant de descendre.
Couvert de ses armes, le paladin s’avance le long du rivage,
monté sur un coursier au pelage gris et noir, nourri en Flandre et né
en Danemark, et fort et robuste encore plus que rapide. Car, avant
de s’embarquer, il avait laissé en Bretagne son destrier, ce Bride-
d’Or si beau et si vaillant, qui n’avait pas d’égal, si ce n’est Bayard.
Roland arrive à Dordrecht, et là il trouve la porte gardée par une
nombreuse troupe de gens en armes, ainsi qu’on fait toujours pour
maintenir une ville suspecte, et surtout quand elle est nouvellement
conquise. On venait du reste de recevoir la nouvelle qu’un cousin du
prisonnier accourait de Zélande avec une flotte et une armée.
Roland prie un des gardes d’aller dire au roi qu’un chevalier
errant désire se mesurer avec lui à la lance et à l’épée ; mais qu’il
veut qu’entre eux un pacte soit auparavant conclu : si le roi renverse
celui qui l’a défié, on lui livrera la dame qui a tué Arbant, car le
chevalier la tient à sa disposition dans un endroit peu éloigné, de
manière à pouvoir la lui livrer.
En revanche, il veut que le roi promette, s’il est vaincu dans le
combat, de mettre immédiatement Birène en liberté et de le laisser
aller où il voudra. Le soldat remplit en toute hâte son ambassade,
mais le roi, qui ne connut jamais ni courage ni courtoisie, songe
aussitôt à employer la fraude, la tromperie et la trahison.
Il pense qu’en s’emparant du chevalier, il aura par-dessus le
marché la dame qui l’a si fort outragé, si elle est véritablement à sa
disposition et si le soldat a bien entendu. Par divers sentiers
aboutissant à d’autres portes que celle où il était attendu, il fait sortir
trente hommes, qui, après un long détour et en se cachant, vont
s’embusquer derrière le paladin.
En attendant, le traître fait engager des pourparlers, jusqu’à ce
qu’il ait vu les cavaliers et les fantassins arrivés à l’endroit où il veut.
Ensuite, il sort lui-même par la porte à la tête d’un nombre égal de
soldats. Comme le chasseur expérimenté a coutume de cerner les
bois de tous côtés, ou comme, près du Volana [54] , le pêcheur
entoure les poissons d’un long filet,
De même, le roi de Frise prend ses mesures pour que le
chevalier ne puisse fuir par aucun côté. Il veut le prendre vivant et
non d’une autre façon. Et il croit le faire si facilement, qu’il n’apporte
pas avec lui cette foudre terrestre, avec laquelle il fait de si
nombreuses victimes, car ici elle ne lui semble pas nécessaire,
puisqu’il veut faire un prisonnier et non donner la mort.
Comme le rusé oiseleur, qui conserve vivants les premiers
oiseaux pris, afin d’en attirer par leur jeu et par l’appeau une plus
grande quantité, ainsi voulait faire en cette circonstance le roi
Cymosque. Mais Roland n’était pas un de ces oiseaux qui se
laissent prendre du premier coup, et il eut bien vite rompu le cercle
qu’on avait fait autour de lui.
Le chevalier d’Anglante abaisse sa lance et se précipite au plus
épais de la troupe. Il en transperce un, puis un autre, et un autre, et
un autre, tellement qu’ils semblent être de pâte ; à la fin il en enfile
six, et il les tient tous embrochés à sa lance ; et comme elle ne peut
plus en contenir, il laisse retomber le septième, mais si grièvement
blessé qu’il meurt du coup.
Non autrement, on voit, le long des fossés et des canaux, les
grenouilles frappées aux flancs et à l’échine par l’habile archer,
jusqu’à ce que d’un côté et de l’autre sa flèche soit toute pleine et
qu’on ne puisse plus en mettre. La lance de Roland se rompt sous le
poids, et il se jette avec son épée au milieu de la bataille.
Sa lance rompue, il saisit son épée, celle qui jamais ne fut tirée
en vain. Et à chaque coup, de la taille ou de la pointe, il extermine
tantôt un fantassin, tantôt un cavalier. Partout où il touche, il teint en
rouge, l’azur, le vert, le blanc, le noir, le jaune. Cimosque se lamente
de n’avoir pas avec lui la canne et le feu, alors qu’ils lui seraient le
plus utiles.
Et avec de grands cris et de grandes menaces, il ordonne qu’on
les lui apporte ; mais on l’écoute peu, car quiconque a pu se sauver
dans la ville, n’a plus l’audace d’en sortir. Le roi Frison qui voit fuir
tous ses gens, prend le parti de se sauver, lui aussi. Il court à la
porte et veut faire lever le pont, mais le comte le suit de trop près.
Le roi tourne les épaules et laisse Roland maître du pont et des
deux portes. Il fuit et gagne tous les autres en vitesse, grâce à ce
que son coursier court plus vite. Roland ne prend pas garde à la vile
plèbe ; il veut mettre à mort le félon et non les autres. Mais son
destrier ne court pas assez vite pour atteindre celui qui fuit comme
s’il avait des ailes.
Par une voie, ou par une autre, Cimosque se met bien vite hors
de vue du paladin. Mais il ne tarde pas à revenir avec des armes
nouvelles. Il s’est fait apporter le tube de fer creux et le feu, et tapi
dans un coin, il attend son ennemi comme le chasseur à l’affût, avec
son épieu et ses chiens, attend le sanglier féroce qui descend
détruisant tout sur son passage,
Brisant les branches et faisant rouler les rochers. Partout où se
heurte son front terrible, il semble que l’orgueilleuse forêt croule
sous la rumeur, et que la montagne s’entr’ouvre. Cimosque se tient
à son poste, afin que l’audacieux comte ne passe pas sans lui payer
tribut. Aussitôt qu’il l’aperçoit, il touche avec le feu le soupirail du
tube, et soudain celui-ci éclate.
En arrière, il étincelle comme l’éclair ; par devant, il gronde et
lance le tonnerre dans les airs. Les murs tremblent, le terrain frémit
sous les pieds. Le ciel retentit de l’effroyable son. Le trait ardent, qui
abat et tue tout ce qu’il rencontre et n’épargne personne, siffle et
grince. Mais, comme l’aurait voulu ce misérable assassin, il ne va
pas frapper le but.
Soit précipitation, soit que son trop vif désir de tuer le baron lui ait
fait mal viser ; soit que son cœur tremblant comme la feuille ait fait
trembler aussi son bras et sa main ; soit enfin que la bonté divine
n’ait pas voulu que son fidèle champion fût si tôt abattu, le coup vint
frapper le ventre du destrier et l’étendit par terre, d’où il ne se releva
plus jamais.
Le cheval et le cavalier tombent à terre, le premier lourdement, le
second en la touchant à peine, car il se relève si adroitement et si
légèrement, que sa force et son haleine en semblent accrues.
Comme Antée, le Libyen, qui se relevait plus vigoureux après avoir
touché le sol, tel se relève Roland, et sa force paraît avoir doublé en
touchant la terre.
Que celui qui a vu tomber du ciel le feu que Jupiter lance avec un
bruit si horrible, et qui l’a vu pénétrer dans un lieu où sont renfermés
le soufre et le salpêtre, alors que le ciel et la terre semblent en feu,
que les murs éclatent et que les marbres pesants et les rochers
volent jusqu’aux étoiles,
Se représente le paladin après qu’il se fut relevé de terre. Il se
redresse avec un air si terrible, si effrayant et si horrible à la fois,
qu’il aurait fait trembler Mars dans les cieux. Le roi frison, saisi
d’épouvante, tourne bride en arrière pour fuir. Mais Roland l’atteint
plus vite qu’une flèche n’est chassée de l’arc.
Et ce qu’il n’avait pas pu faire auparavant à cheval, il le fera à
pied. Il le suit si rapidement, que celui qui ne l’a pas vu ne voudrait
point le croire. Il le rejoint après un court chemin ; il lève l’épée au-
dessus du casque et lui assène un tel coup, qu’il lui fend la tête
jusqu’au col, et l’envoie rendre à terre le dernier soupir.
Soudain voici que de l’intérieur de la cité s’élève une nouvelle
rumeur, un nouveau bruit d’armes. C’est le cousin de Birène, qui, à
la tête des gens qu’il avait amenés de son pays, voyant la porte
grande ouverte, a pénétré jusqu’au cœur de la ville encore sous le
coup de l’épouvante où l’avait plongée le paladin, et qui la parcourt
sans trouver de résistance.
La population fuit en déroute, sans s’informer de ce que sont ces
nouveaux venus, ni de ce qu’ils veulent. Mais, quand on s’est aperçu
à leurs vêtements et à leur langage que ce sont des Zélandais, on
demande la paix et on arbore le drapeau blanc, et l’on informe celui
qui les commande qu’on veut l’aider contre les Frisons qui retiennent
son duc prisonnier.
Car la population avait toujours été hostile au roi de Frise et à
ses compagnons, non seulement parce qu’il avait fait périr leur
ancien seigneur, mais surtout parce qu’il était injuste, impitoyable et
rapace. Roland s’interpose en ami entre les deux partis, et rétablit la
paix entre eux. Les deux troupes réunies ne laissèrent pas un Frison
sans le tuer ou le faire prisonnier.
On jette à terre les portes des prisons, sans prendre la peine de
chercher les clefs. Birène fait voir au comte, par ses paroles de
gratitude, qu’il connaît quelle obligation il lui a. Puis, ils vont
ensemble, accompagnés d’une foule nombreuse, vers le navire où
attend Olympie. Ainsi s’appelait la dame à qui, comme de droit, la
souveraineté de l’île était rendue.
Celle-ci avait amené Roland sans penser qu’il ferait tant pour
elle ; il lui paraissait suffisant qu’il sauvât son époux, en
l’abandonnant elle seule au péril. Elle le révère et l’honore, et tout le
peuple avec elle. Il serait trop long de raconter les caresses que lui
prodigue Birène, et celles qu’elle lui rend, ainsi que les
remerciements que tous deux adressent au comte.
Le peuple remet la damoiselle en possession du trône paternel,
et lui jure fidélité. Après s’être unie à Birène d’une chaîne qu’Amour
doit rendre éternelle, elle lui donne le gouvernement de l’État et
d’elle-même. Et celui-ci confie le commandement des forteresses et
des domaines de l’île à son cousin.
Car il avait résolu de retourner en Zélande et d’emmener sa
fidèle épouse avec lui, prétendant qu’il voulait tenter la conquête de
la Frise, et qu’il avait un gage de succès qu’il appréciait fort, à savoir
la fille du roi Cymosque, trouvée parmi les nombreux prisonniers
qu’on avait faits.
Il prétendit aussi qu’il voulait la donner pour femme à son frère
encore mineur. Le sénateur romain partit le même jour que Birène
mit à la voile ; et il ne voulut emporter de tant de dépouilles gagnées
par lui rien autre chose que cet instrument qui, comme nous l’avons
dit, produisait tous les effets de la foudre.
Son intention, en le prenant, n’était pas d’en user pour sa
défense, car il avait toujours estimé qu’il n’appartenait qu’à une âme
lâche de se lancer dans une entreprise quelconque avec un
avantage sur son adversaire. Mais il voulait la jeter dans un lieu où
elle ne pourrait plus jamais nuire à personne. C’est pourquoi il
emporta avec lui la poudre, les balles et tout ce qui servait à cette
arme.
Et, dès qu’il fut sorti du port, et qu’il se vit arrivé à l’endroit où la
mer était la plus profonde, de sorte que, sur l’un et l’autre rivage, on
n’apercevait aucun signe lointain, il la prit et dit : « — Afin que plus
jamais chevalier ne se confie à toi, et que le lâche ne se puisse
vanter de valoir plus que le brave, reste engloutie ici.
« O maudite, abominable invention, forgée au plus profond du
Tartare par les mains mêmes du malin Belzébuth, dans l’intention de
couvrir le monde de ruines, je te renvoie à l’enfer d’où tu es sortie. —
» Ainsi disant, il la jette dans l’abîme, pendant que les voiles,
gonflées par le vent, le poussent sur le chemin de l’île cruelle.
Le paladin est pressé d’un tel désir de savoir si sa dame s’y
trouve, sa dame qu’il aime plus que tout l’univers ensemble, et sans
laquelle il ne peut pas vivre une heure joyeux, qu’il ne met pas le
pied en Ibernie, de peur d’être obligé de consacrer son temps à une
œuvre nouvelle et d’être réduit plus tard à dire : Hélas ! pourquoi ne
me suis-je point hâté davantage !
Il ne permet pas non plus d’aborder en Angleterre ni en Irlande,
ni sur les rivages opposés. Mais laissons-le aller où l’envoie l’Archer
qui l’a blessé au cœur. Avant de parler encore de lui, je veux
retourner en Hollande, et je vous invite à y retourner avec moi. Je
sais qu’il vous déplairait autant qu’à moi que les noces s’y fissent
sans nous.
Les noces furent belles et somptueuses, mais elles seront encore
surpassées par celles qui, dit-on se préparent en Zélande.
Cependant, je ne vous propose pas de venir à celles-ci, car elles
doivent être troublées par de nouveaux incidents dont je vous
parlerai dans l’autre chant, si à l’autre chant vous venez m’entendre.
CHANT X.
Argument. — Birène étant devenu amoureux d’une autre

femme, abandonne Olympie. — Roger reçoit l’hippogriffe des mains
de Logistilla qui lui apprend à le conduire. Il descend avec lui en
Angleterre, où il voit le rassemblement des troupes destinées à
porter secours à Charles. En passant en Irlande, il aperçoit dans l’île
d’Ébude Angélique enchaînée à un rocher pour être dévorée par
l’orque. Il abat le monstre, prend la jeune fille en croupe, et descend
avec elle sur le rivage de la Basse-Bretagne.
Parmi les amants les plus fameux qui donnèrent au monde, soit
dans l’infortune, soit dans la prospérité, les meilleures preuves
d’amour et les plus grands exemples de fidélité, je donnerai de
préférence, non pas la seconde, mais la première place à Olympie.
Et si elle ne doit pas être placée avant tous, je tiens à dire que,
parmi les anciens et les modernes, on ne saurait trouver un amour
plus grand que le sien.
Elle avait rendu Birène certain de cet amour, par des
témoignages si nombreux et si évidents, qu’il serait impossible à une
femme de faire plus pour assurer un homme de sa tendresse, même
quand elle lui montrerait sa poitrine et son cœur tout ouverts. Et si
les âmes si fidèles et si dévouées doivent être récompensées d’un
amour réciproque, je dis qu’Olympie était digne d’être aimée par
Birène, non pas autant, mais plus que soi-même ;
Et qu’il ne devait pas l’abandonner jamais pour une autre femme,
fût-ce pour celle qui jeta l’Europe et l’Asie dans tant de malheurs, ou
pour toute autre méritant plus encore le titre de belle ; mais qu’il
aurait dû, plutôt que de la laisser, renoncer à la clarté du jour, à
l’ouïe, au goût, à la parole, à la vie, à la gloire, et à tout ce qu’on
peut dire ou imaginer de plus précieux.
Si Birène l’aima comme elle avait aimé Birène ; s’il lui fut fidèle
comme elle le lui avait été ; si jamais il tourna sa voile pour suivre
une autre voie que la sienne ; ou bien s’il paya tant de services par
son ingratitude, et s’il fut cruel pour celle qui lui avait montré tant de
fidélité, tant d’amour, je vais vous le dire et vous faire, d’étonnement,
serrer les lèvres et froncer les sourcils.
Et quand vous aura été dévoilée l’impitoyable cruauté dont il
paya tant de bontés, ô femmes, aucune de vous ne saura plus si elle
doit ajouter foi aux paroles d’un amant. L’amant, pour avoir ce qu’il
désire, sans songer que Dieu voit et entend tout, entasse les
promesses et les serments, qui tous se dispersent ensuite par les
airs au gré des vents.
Les serments et les promesses s’en vont dans les airs, emportés
et dispersés par les vents, dès que ces amants ont assouvi la soif
qui les embrasait et les brûlait. Soyez, par cet exemple, moins
faciles à croire à leurs prières et à leurs plaintes. Bien avisé et
heureux, ô mes chères dames, celui qui apprend à être prudent aux
dépens d’autrui.
Gardez-vous de ceux qui portent sur leur frais visage la fleur des
belles années ; car, chez eux, tout désir naît et meurt promptement,
semblable à un feu de paille. De même que le chasseur suit le lièvre,
par le froid, par le chaud, sur la montagne, dans la plaine, et n’en fait
plus le moindre cas dès qu’il l’a pris, s’acharnant seulement à
poursuivre ce qui le fuit ;
Ainsi font ces jeunes gens qui, tant que vous vous montrez dures
et hautaines envers eux, vous aiment et vous révèrent avec tout
l’empressement que doit avoir l’esclave fidèle. Mais, aussitôt qu’ils
pourront se vanter de la victoire, de maîtresses il vous faudra
devenir esclaves, et voir s’éloigner de vous leur faux amour qu’ils
porteront à d’autres.
Je ne vous défends pas pour cela — j’aurais tort — de vous
laisser aimer, car, sans amant, vous seriez comme la vigne inculte
au milieu d’un jardin, sans tuteur ou sans arbre auquel elle puisse
s’appuyer. Je vous engage seulement à fuir la jeunesse volage et
inconstante, et à cueillir des fruits qui ne soient pas verts et âcres,
sans les choisir cependant trop mûrs.
Je vous ai dit plus haut qu’on avait trouvé parmi les prisonniers
une fille du roi de Frise, et que Birène parlait, toutes les fois qu’il en
avait l’occasion, de la donner pour femme à son frère. Mais, à dire le
vrai, il en était lui-même affriandé, car c’était un morceau délicat ; et
il eût considéré comme une sottise de se l’enlever de la bouche,
pour le donner à un autre.
La damoiselle n’avait pas encore dépassé quatorze ans ; elle
était belle et fraîche comme une rose qui vient de sortir du bouton et
s’épanouit au soleil levant. Non seulement Birène s’en amouracha,
mais on ne vit jamais un feu pareil consumer les moissons mûres
sur lesquelles des mains envieuses et ennemies ont porté la
flamme,
Aussi vite qu’il en fut embrasé, brûlé jusqu’aux moelles, du jour
où il la vit, pleurant son père mort et son beau visage tout inondé de
pleurs. Et comme l’eau froide tempère celle qui bouillait auparavant
sur le feu, ainsi l’ardeur qu’avait allumée Olympie, vaincue par une
ardeur nouvelle, fut éteinte en lui.
Et il se sentit tellement rassasié, ou pour mieux dire tellement
fatigué d’elle, qu’il pouvait à peine la voir ; tandis que son appétit
pour l’autre était tellement excité, qu’il en serait mort s’il avait trop
tardé à l’assouvir. Pourtant, jusqu’à ce que fût arrivé le jour marqué
par lui pour satisfaire son désir, il le maîtrisa de façon à paraître non
pas aimer, mais adorer Olympie, et à vouloir seulement ce qui
pouvait lui faire plaisir.
Et s’il caressait la jeune fille, — et il ne pouvait se tenir de la
caresser plus qu’il n’aurait dû, — personne ne l’interprétait à mal,
mais bien plutôt comme un témoignage de pitié et de bonté. Car
relever celui que la Fortune a précipité dans l’abîme, et consoler le
malheureux, n’a jamais été blâmé, mais a souvent passé pour un
titre de gloire, surtout quand il s’agit d’une enfant, d’une innocente.
O souverain Dieu, comme les jugements humains sont parfois
obscurcis par un nuage sombre ! Les procédés de Birène, impies et
déshonnêtes, passèrent pour de la pitié et de la bonté. Déjà les
mariniers avaient pris les rames en main, et, quittant le rivage sûr,
emportaient joyeux vers la Zélande, à travers les étangs aux eaux
salées, le duc et ses compagnons.
Déjà ils avaient laissé derrière eux et perdu de vue les rivages de
la Hollande — car, afin de ne pas aborder en Frise, ils s’étaient
tenus sur la gauche, du côté de l’Écosse — lorsqu’ils furent surpris
par un coup de vent qui, pendant trois jours, les fit errer en pleine
mer. Le troisième jour, à l’approche du soir, ils furent poussés sur
une île inculte et déserte.
Dès qu’ils se furent abrités dans une petite anse, Olympie vint à
terre. Contente, heureuse et loin de tout soupçon, elle soupa en
compagnie de l’infidèle Birène ; puis, sous une tente qui leur avait
été dressée dans un lieu agréable, elle se mit au lit avec lui. Tous
leurs autres compagnons retournèrent sur le vaisseau pour s’y
reposer.
La fatigue de la mer, et la peur qui l’avait tenue éveillée pendant
plusieurs jours, le bonheur de se retrouver en sûreté sur le rivage,
loin de toute rumeur, dans une solitude où nulle pensée, nul souci,
puisqu’elle avait son amant avec elle, ne venait la tourmenter,
plongèrent Olympie dans un sommeil si profond, que les ours et les
loirs n’en subissent pas de plus grand.
Son infidèle amant, que la tromperie qu’il médite tient éveillé, la
sent à peine endormie, qu’il sort doucement du lit, fait un paquet de
ses habits et, sans plus se vêtir, abandonne la tente. Comme s’il lui
était poussé des ailes, il vole vers ses gens, les réveille, et sans leur
permettre de pousser un cri, leur fait gagner le large et abandonner
le rivage.

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Methods and Protocols

ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)

Cartography of the plasma proteome remains technically challenging. Despite extensive

Melbourne, VIC, Australia David W. Greening

PART I BLOOD PROCESSING AND HANDLING STRATEGIES

PART II DISCOVERY-BASED MASS SPECTROMETRY

5 High-Throughput Proteome Profiling of Plasma and Native

PART III DEVELOPMENTS IN TECHNOLOGIES FOR PLASMA PROTEOMICS

10 Strategies to Enrich, Identify, and Characterize Glycoproteome in

PART IV ENRICHMENT & DETECTION STRATEGIES

PART V ANALYSIS OF EXTRACELLULAR VESICLES FROM BLOOD

18 In-Depth Proteomic Analysis of Blood Circulating Small

20 Analysis of Extracellular Vesicle and Contaminant Markers in

PART VI TARGETED-BASED MASS SPECTROMETRY

22 Progress in Targeted Mass Spectrometry (Parallel Accumulation-Serial

PART VII ASSAY DEVELOPMENT IN BIOMARKER DISCOVERY

25 Semi-Automated Lectin Magnetic Bead Array (LeMBA) for

PART VIII PLASMA-BASED PEPTIDE, LIPID, AND METABOLITE ASSAYS

28 Rapid and Quantitative Enrichment of Peptides from Plasma

30 Multiplexed Bead-Based Peptide Immunoassays for the

PART IX SOFTWARE AND BIOINFORMATICS FOR THE PLASMA PROTEOME

JIRI ADAMEC • Department of Biochemistry, University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE,

ANASTASIA CHERNYKH • School of Natural Sciences, Faculty of Science and Engineering,

DAVID W. GREENING • Molecular Proteomics, Baker Heart and Diabetes Institute,

ALICIA JOHNSON • Department of Biochemistry, University of Nebraska-Lincoln, Lincoln,

Blood Processing and Handling Strategies

Protocols for the Isolation of Platelets for Research

Key words Platelet, Blood, Activation, Isolation, Transfusion, Proteomics

Platelets, the smallest of the human blood cellular elements

tumor growth/metastases [1–3]. Platelets are formed following

transfusion can be prepared by three different methods: (i) platelet-

3. Tourniquet, alcohol swabs for disinfection of the

6. One 8.5 mL tube of whole blood from a donor with a normal

Argument. — Birène étant devenu amoureux d’une autre

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