(FREE PDF Sample) Plant Mitochondria Methods and Protocols 1st Edition James Whelan Ebooks

Full download ebook at ebookgate.
com
Plant Mitochondria Methods and Protocols 1st

Edition James Whelan
https://ebookgate.com/product/plant-mitochondria-
methods-and-protocols-1st-edition-james-whelan/
Download more ebook from https://ebookgate.com

More products digital (pdf, epub, mobi) instant
download maybe you interests ...
Plant Organogenesis Methods and Protocols 1st Edition

Yogev Burko
https://ebookgate.com/product/plant-organogenesis-methods-and-
protocols-1st-edition-yogev-burko/
Plant Hormones Methods and Protocols 2nd Edition Julian

Northey
https://ebookgate.com/product/plant-hormones-methods-and-
protocols-2nd-edition-julian-northey/
Plant Meiosis Methods and Protocols 1st Edition Susan

Armstrong (Auth.)
https://ebookgate.com/product/plant-meiosis-methods-and-
protocols-1st-edition-susan-armstrong-auth-2/
Plant Cell Morphogenesis Methods and Protocols 1st

Edition Aleš Soukup
https://ebookgate.com/product/plant-cell-morphogenesis-methods-
and-protocols-1st-edition-ales-soukup/
Plant Meiosis Methods and Protocols 1st Edition Susan
Armstrong (Auth.)
https://ebookgate.com/product/plant-meiosis-methods-and-
protocols-1st-edition-susan-armstrong-auth/
Plant Transcription Factors Methods and Protocols 1st

Edition Rainer Melzer
https://ebookgate.com/product/plant-transcription-factors-
methods-and-protocols-1st-edition-rainer-melzer/
Plant Gravitropism Methods and Protocols 1st Edition

Elison B Blancaflor
https://ebookgate.com/product/plant-gravitropism-methods-and-
protocols-1st-edition-elison-b-blancaflor/
Plant Endosomes Methods and Protocols 1st Edition

Marisa S. Otegui (Eds.)
https://ebookgate.com/product/plant-endosomes-methods-and-
protocols-1st-edition-marisa-s-otegui-eds/
Plant Gene Silencing Methods and Protocols 1st Edition

Kirankumar S. Mysore
https://ebookgate.com/product/plant-gene-silencing-methods-and-
protocols-1st-edition-kirankumar-s-mysore/
Methods in
Molecular Biology 1305
James Whelan
Monika W. Murcha Editors
Plant
Mitochondria
Methods and Protocols
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY
Series Editor
John M.Walker
School of Life and Medical Sciences
University of Hertfordshire
Hatfield, Hertfordshire, AL10 9AB, UK
For further volumes:

http://www.springer.com/series/7651
Plant Mitochondria
Methods and Protocols
Edited by
James Whelan
La Trobe University, Bundoora, VIC, Australia
Monika W. Murcha
The University of Western Australia, Crawley, WA, Australia
Editors
James Whelan Monika W. Murcha
La Trobe University The University of Western Australia
Bundoora, VIC, Australia Crawley, WA, Australia
Additional material to this book can be downloaded from http://extras.springer.com.
ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)

Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-4939-2638-1 ISBN 978-1-4939-2639-8 (eBook)
DOI 10.1007/978-1-4939-2639-8
Library of Congress Control Number: 2015937422
Springer New York Heidelberg Dordrecht London

© Springer Science+Business Media New York 2015
This work is subject to copyright. All rights are reserved by the Publisher, whether the whole or part of the material is
concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction
on microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation,
computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not
imply, even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and
regulations and therefore free for general use.
The publisher, the authors and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to
be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty,
express or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been made.
Printed on acid-free paper
Humana Press is a brand of Springer

Springer Science+Business Media LLC New York is part of Springer Science+Business Media (www.springer.com)
Foreword
Highlights in Plant Mitochondrial Research
As someone who started their mitochondrial research in the 1970s, it is interesting to see
how far the field has progressed in terms of methodologies and experimental approach and
how our knowledge of the way mitochondrial function affects the entire cell’s metabolism
and gene networks has advanced. Table 1 illustrates the major milestones in this journey.
The late 1950s and 1960s were preoccupied with determining the seat of oxidative
phosphorylation and associated metabolism within cells, and once that was more or less
accepted, the next two decades were devoted to investigating the mitochondrial genome
structure, the composition of the electron transport chain, the basic carbon and nitrogen
metabolism associated with mitochondria, and, mainly in mammalian cells, the mechanism
of ATP synthesis. This was an intensely competitive period in mitochondrial research, and
conferences were often fiery and controversial (and fun, if you liked that sort of thing). The
methods we used were quite indirect, mainly based around oxygen electrodes and spectro-
photometric and fluorimetric assays. Experiments were imaginative and their interpretation
often more so. Without direct proof of concept that is now available with gene knockout
and editing technologies, we peered through the glass darkly and speculated widely. While
the techniques available were indirect, they yielded results very quickly and if experiments
were designed carefully and results analyzed rapidly, enough data for a paper could be gen-
erated in a few weeks of intense activity, spurred on by the knowledge that your competitors
were doing the same. Try doing that today!
The world-wide cohort of plant mitochondrial researchers in this period was quite
small, and the field lived very much in the shadow of photosynthesis—after all, mitochon-
dria are found in all eukaryotes, and it was assumed that their function was much the same,
while chloroplasts are unique to plants. A lot of the research into mitochondria in plants
focused on their interaction with photosynthesis. The elucidation of the role of mitochon-
dria in cellular oxidative stress and programmed cell death resulted in an explosion of mito-
chondrial research in mammals and a renewed interest in plant mitochondria. It also became
apparent that the electron transport chain of plant mitochondria was quite different—and
much more interesting—than their mammalian counterparts, and the scope of mitochon-
drial metabolism far greater in plants. The role of mitochondria in cytoplasmic male sterility
highlighted how much their function could affect the plant, and the application of advanced
transcriptomic and proteomic techniques illustrated the complexity of mitochondrial
metabolism and its integration with other cellular pathways. It is now obvious that mito-
chondria are much more than ATP-synthesizing machines and are central to plant growth
and development in many different ways. They also lie at the heart of the plant cell’s oxida-
tive stress networks, and manipulation of mitochondrial function may lead to enhanced
tolerance to both biotic and abiotic stresses.
This is a timely book. It is, as far as I know, the only book devoted to mitochondrial
methodology in plants and will be an important reference work for people in this field,
v
vi Foreword
particularly those entering the field. The methodologies described here range from the
biochemical, through molecular biology to bioinformatics. These are the techniques that
have brought us to where we now stand in our understanding of mitochondria in plants
and will be critical in continuing to take the field forward.
Adelaide, SA, Australia David A. Day
Table 1
Highlights in discoveries in plant mitochondrial research
Year Discovery Species References

1904 First recorded observation of mitochondria Nymphaea alba [1]
in plants
1925 Presence of cytochromes in plant Various vegetables [2]
mitochondria (eschalots, potato,
beans, leeks)
1929 Cyanide-resistant respiration observed Sweet pea (Lathyrus [3]
odoratus)
1954 Synthesis of ascorbic acid by plant Pisum Sativum [4]
mitochondria
1955 Cyanide insensitive respiration located to Arum maculatum [5]
mitochondria
1970 Demonstration of malic enzyme in plant Brassica oleracea [6]
mitochondria
1978–1989 Isolation of alternative oxidase and Arum maculatum [7–10]
production of antibodies
1975–1981 Presence of pores in outer membrane Solanum tuberosum, [11, 12]
Vigna radiata
1951–1962 Isolation of intact mitochondria Pisum sativum Spinacia [13, 14]
oleracea
Solanum tuberosum
1972–1982 Gradient purification of plant mitochondria Solanum tuberosum, [15–17]
Pisum sativum
Vigna radiata
1970–1974 Oxidation of External NAD(P)H Helianthus tuberosus; [18–21]
Brassica oleracea
1972 Outer membrane NADH dehydrogenase Brassica oleracea [21–23]
1972–1976 Characterization of mitochondrial ribosomes Various [24, 25]
1977 Glycine oxidation located to mitochondria Spinacia oleracea [26, 27]
in plants
(continued)
Foreword vii
Table 1
(continued)

1976–1980 Association of mitochondria with Zea mays [28–30]
cytoplasmic male sterility
1981–1982 Detection of circular DNA molecules from Nicotiana, Datura, [28, 31–33]
mitochondria Solanum, Phaseolus,
Zea, Oenothera
1982 Discovery of chloroplast genome sequences Zea mays [34]
in mitochondrial genome
1985 Cloning of first nuclear-located Nicotiana [35]
mitochondrial gene plumbaginifolia
1985 Expression of “plastid”-type tRNAs in Phaseolus vulgaris [36]
mitochondria
1986 Identification of first nonchromosomal stripe Zea mays [37]
mutants
1987 Discovery of subgenomic DNA molecules Zea mays [38]
1987–1990 In vitro and in vivo protein import into Vicia faba, Nicotiana [39–42]
mitochondria tabacum, Nicotiana
plumbaginifolia,
Spinacia oleracea
1989 RNA editing Arabidopsis thaliana [43–45]
1990–1992 Cloning of Glycine decarboxylase subunits Pisum sativum [46–50]
1992 In vivo import of tRNA Solanum tuberosum [51]
1992–1995 Membrane location and bifunctionality of a Solanum tuberosum, [52–55]
respiratory chain complex in plants Spinacia oleracea
1992–2011 Purification of complex I Solanum tuberosum, Beta [56–59]
vulgaris, Arabidopsis
thaliana, Vicia faba
1992 and Sequencing of mitochondrial genome Marchantia [60, 61]
1997 Arabidopsis thaliana
1993 Elucidation of biochemical activation of Glycine max, Vigna [62, 63]
alternative oxidase radiata, Sauromatum
guttatum
1993–1995 Presence of genes encoding bacterial type Triticum aestivum [64, 65]
cytochrome c maturation pathway Brassica napus
1993–2000 Ongoing gene transfer to the Nucleus Various [66–68]
1994 Genetic manipulation of alternative oxidase Nicotiana tabacum [69]
levels
1995 Discovery of dual targeting of mitochondria Pisum sativum [70]
and plastid proteins
(continued)
viii Foreword
Table 1
(continued)

1996 First receptor for protein import into plant Solanum tuberosum [71]
mitochondria
1997 Fluorescent protein labeling of plant Arabidopsis thaliana [72]
mitochondria
1997–2003 Autonomous antioxidant machinery in the Arabidopsis thaliana, [73, 74]
mitochondrial matrix Pisum sativum
1997, 2000, Bacteriophage-type RNA polymerases in Arabidopsis thaliana [75–77]
2009 plant organelles
1998 Horizontal gene transfer Peperomia polybotyra; [78, 79]
Various angiosperms
1999 Translocation of Cytochrome c in Cucumis sativus [80]
programmed cell death
1999–2003 Cloning of Alternative NAD(P)H Solanum tuberosum [81, 82]
dehydrogenase genes Arabidopsis thaliana
2000 Identification of the PPR family of protein Arabidopsis thaliana [83]
2000–2014 Mitochondrial dynamics, morphology, and Arabidopsis thaliana [84–91]
controlling factors
2001–2014 Proteome characterization Arabidopsis thaliana, [92–97]
Solanum tuberosum,
Oryza sativa,
Triticum aestivum,
Medicago truncatula
2001–2008 Functional characterization of mitochondrial Arabidopsis thaliana [98–100]
antioxidant defense systems
2002 Evidence for permeability transition Solanum tuberosum [101]
2002–2003 PPR involved in CMS restoration Petunia [102, 103]
Raphanus sativus
2002–2006 Identification, characterization and Solanum tuberosum, [104, 105]
crystallization of presequence peptidase Arabidopsis thaliana
for degrading mitochondrial presequences
and other unstructured peptides
2003 Identification of nuclear factors that control Arabidopsis thaliana [106]
levels of subgenomic molecules
2003–2007 Identification of Biochemical properties of Nicotiana sylvestris, [107–109]
Type II NAD(P)H dehydrogenases Arabidopsis thaliana
2003 Characterization of Supercomplexes of Arabidopsis thaliana [110]
respiratory chain
2003 Association of enzymes of glycolysis with Arabidopsis thaliana [111]
mitochondria
(continued)
Foreword ix
Table 1
(continued)

2003–2004 Respiratory complexes contain plant-specific Arabidopsis thaliana [112, 113]
subunits Oryza sativa
2005 Oligomerization of ATP synthase induces Polytomella [114,115]
curvature of the inner mitochondrial
membrane
2005–2008 Identification of phenotype lesion resulting Arabidopsis thaliana [116, 117,118]
from absence of alternative oxidase
2005 Carbonic anhydrase domain of complex I Arabidopsis thaliana [114, 115,
119, 120]
2006 In vitro import of tRNA into mitochondria Arabidopsis thaliana [121]
2006 Mitochondrial transformation Chlamydomonas [122]
reinhardtii
2006–2012 Measurement of matrix physiology with Arabidopsis thaliana [123–125]
genetically targeted fluorescent sensors
2006–2012 Plant-specific DNA-binding proteins Arabidopsis thaliana [126–128]
involved in mitochondrial genome stability
2007 Demonstration that PPR protein required for Arabidopsis thaliana [129]
splicing in mitochondria
2007 Isolation of highly pure mitochondria using Arabidopsis thaliana [130]
free-flow electrophoresis
2008–2013 Identification of regulators of mitochondrial Arabidopsis thaliana [131–134]
retrograde signaling
2009 Noncyclic mode of TCA cycle in the light Xanthium strumarium [135]
2009–2014 Characterization of posttranslational Arabidopsis thaliana [136–140]
modifications of the mitochondrial
proteome
2009 Demonstration that PPR protein required for Arabidopsis thaliana [141]
editing in mitochondria
2010 Identification and characterization of a Arabidopsis thaliana [142]
protein-only RNase P activity
2012 Mitochondrial pulsing Arabidopsis thaliana [143]
2012 Identification of first assembly factor for Arabidopsis thaliana [144]
Complex I
2012 Identification of dual located protein in Arabidopsis thaliana [145]
biogenesis and respiratory chain
complexes
2012 Code for PPR protein recognition of Zea mays [146]
RNA-binding sites Arabidopsis thaliana
(continued)
x Foreword
Table 1
(continued)

2013 Link between mitochondria and plant Arabidopsis thaliana [147]
immunity
2013 Identification, characterization, and Arabidopsis thaliana [148]
crystallization of organellar oligopeptidase
for degrading mitochondrial peptides
a
2013 Crystal structure of the alternative oxidase Trypanosoma brucei [149]
brucei
2013 Micro-respiratory measurements of tissues Arabidopsis thaliana [150]
a
While clearly not a plant, as one of the distinguishing features of plant mitochondria is cyanide-insensitive respiration
catalyzed by the alternative oxidase, the elucidation of the structure of the alternative oxidase provides an important
platform to understand the activity and activation of the plant enzyme by a variety of organic acids.
References
1. Ernster L, Schatz G (1981) Mitochondria: a alternative oxidase of Sauromatum guttatum

historical view. J Cell Biol 91:227–255 mitochondria. Plant Physiol 82:1–6
2. Keilin D (1925) On cytochrome, a respira- 10. Elthon TE, McIntosh L (1989) Monoclonal
tory pigment, common to animals, yeast, and antibodies to the alternative oxidase of higher
higher plants. Proc R Soc Lond B Biol Sci plant mitochondria. Plant Physiol 89:
98:312–339 1311–1317
3. Genevois ML (1929) Sur la fermentation et 11. Mannella CA, Bonner WDJ (1975) X-ray dif-
sur la respiration chez les végétaux chloro- fraction from oriented outer mitochondrial
phylliens. Revue Génétique Botanique membranes. Detection of in-plane subunit
41:252–271 structure. Biochim Biphys Acta
4. Mapson LW, Isherwood FA, Chen YT (1954) 413:226–233
Biological synthesis of L-ascorbic acid: the 12. Mannella CA (1981) Structure of the outer
conversion of L-galactono-gamma-lactone mitochondrial membrane. Analysis of x-ray
into L-ascorbic acid by plant mitochondria. diffraction from the plant membrane. Biochim
Biochem J 56:21–28 Biphys Acta 645:33–40
5. James WO, Elliott DC (1955) Cyanide- 13. Miller A, Bonner J, Axelrod B, Bandurski RS
resistant Mitochondria from the Spadix of an (1951) Oxidative and phosphorylative activ-
Arum. Nature 175:89. ity of plant mitochondria. Proc Natl Acad Sci
doi:10.1038/175089a175080 U S A 37:855–862
6. Macrae AR, Moorehouse R (1970) The oxi- 14. Wiskich JT, Bonner WD (1963) Preparation
dation of malate by cauliflower bud mito- and properties of sweet potato mitochondria.
chondria. Eur J Biochem 16:96–102 Plant Physiol 38:594–604
7. Huq S, Palmer JM (1978) Isolation of a cya- 15. Douce R, Christensen EL, Bonner WDJ
nide-resistant duroquinol oxidase from Arum (1972) Preperation on intact plant mito-
maculatum mitochondria. FEBS Lett chondria. Biochim Biophys Acta 275:
95:217–220 148–160
8. Rich PR (1978) Quinol oxidation in Arum 16. Neuburger M, Journet E-P, Bligny R, Carde
maculatum mitochondria and its application J-P, Douce R (1982) Purification of plant
to the assay, solubilisation and partial purifica- mitochondria by isopycnic centrifugationin
tion of the alternative oxidase. FEBS Lett density gradient of Percoll. Arch Biochem
96:252–256 Biophys 217:312–323
9. Elthon TE, McIntosh L (1986) 17. Day DA, Neuburger M, Douce R (1985)
Characterization and solubilization of the Biochemical characterisation of chlorophyll-
Foreword xi
free mitochondria from pea leaves. Aust J mitochondrial DNA from tobacco suspen-
Plant Physiol 12:219–228 sion cultured cells. Mol Gen Genet 180:
18. Cunningham WB (1964) Oxidation of exter- 351–355
nally added NADH by isolated corn root 33. Brennicke A (1980) Mitochondrial DNA
mitochondria. Plant Physiol 39:699–703 from Oenothera berteriana. Plant Physiol
19. Coleman JO, Palmer JM (1971) Role of 65:1207–1210
Ca(2+) in the oxidation of exogenous NADH 34. Stern DB, Lonsdale DM (1982)
by plant mitochondria. FEBS Lett 17: Mitochondrial and chloroplast genomes of
203–208 maize have a 12-kilobase DNA sequence in
20. Palmer JM, Passam HC (1971) The oxida- common. Nature 299:698–702
tion of exogenous reduced nicotinamide- 35. Boutry M, Chua NH (1985) A nuclear gene
adenine dinucleotide by plant mitochondria. encoding the beta subunit of the mitochon-
Biochem J 122:16P–17P drial ATP synthase in Nicotiana plumbagini-
21. Day DA, Wiskich JT (1975) Isolation and prop- folia. EMBO J 4:2159–2165
erties of the outer membrane of plant mitochon- 36. Marechal L, Guillemaut P, Grienenberger
dria. Arch Biochem Biophys 171:117–123 JM, Jeannin G, Weil JH (1985) Sequence and
22. Moreau F, Lance C (1972) Isolement et pro- codon recognition of bean mitochondria and
priétés des membranes externes et internes de chloroplast tRNAsTrp: evidence for a high
mitochondries végétales. Biochimie 54: degree of homology. Nucleic Acids Res
1335–1348 13:4411–4416
23. Douce R, Manella CA, Bonner WD Jr (1973) 37. Newton KJ, Coe EH (1986) Mitochondrial
The external NADH dehydrogenases of intact DNA changes in abnormal growth (nonchro-
plant mitochondria. Biochim Biphys Acta mosomal stripe) mutants of maize. Proc Natl
292:105 Acad Sci U S A 83:7363–7366
24. Leaver CJ, Harmey MA (1972) Isolation and 38. Small I, Suffolk R, Leaver CJ (1989)
characterization of mitochondrial ribosomes Evolution of plant mitochondrial genomes via
from higher plants. Biochem J 129:37P–38P substoichiometric intermediates. Cell
25. Leaver CJ, Harmey MA (1976) Higher-plant 58:69–76
mitochondrial ribosomes contain a 5S ribo- 39. Boutry M, Nagy F, Poulsen C, Aoyagi K,
somal ribonucleic acid component. Biochem Chua NH (1987) Targeting of bacterial
J 157:275–277 chloramphenicol acetyltransferase to mito-
26. Woo KC, Osmond CB (1976) Glycine decar- chondria in transgenic plants. Nature 328:
boxylation in mitochondria isolated from 340–342
spinach leaves. Aust J Plant Physiol 3: 40. Whelan J, Dolan L, Harmey MA (1988)
771–785 Import of precursor proteins into Vicia faba
27. Moore AL, Jackson C, Halliwell B, Dench JE, mitochondria. FEBS Lett 236:217–220
Hall DO (1977) Intramitochondrial 41. Schmitz UK, Lonsdale DM (1989) A yeast
localization of glycine decarboxylase in spin- mitochondrial presequence functions as a sig-
ach leaves. Biochem Biophys Res Commun nal for targeting to plant mitochondria
78:483–491 in vivo. Plant Cell 1:783–791
28. Levings CS 3rd, Pring DR (1976) Restriction 42. Whelan J, Knorpp C, Glaser E (1990) Sorting
endonuclease analysis of mitochondrial DNA of precursor proteins between isolated spin-
from normal and Texas cytoplasmic male- ach leaf mitochondria and chloroplasts. Plant
sterile maize. Science 193:158–160 Mol Biol 14:977–982
29. Warmke HE, Lee SL (1977) Mitochondrial 43. Covello PS, Gray MW (1989) RNA editing in
degeneration in Texas cytoplasmic male-ster- plant mitochondria. Nature 341:662–666
ile corn anthers. J Hered 68:213–222 44. Gualberto JM, Lamattina L, Bonnard G, Weil
30. Forde BG, Leaver CJ (1980) Nuclear and JH, Grienenberger JM (1989) RNA editing
cytoplasmic genes controlling synthesis of vari- in wheat mitochondria results in the conser-
ent mitochondrial peptides in male sterile vation of protein sequences. Nature 341:
maize. Proc Natl Acad Sci U S A 77:418–422 660–662
31. Kolodner R, Tewari KK (1972) 45. Hiesel R, Wissinger B, Schuster W, Brennicke
Pyysicochemical characterisation of mito- A (1989) RNA editing in plant mitochondria.
chondrial DNA from pea leaves. Proc Natl Science 246:1632–1634
Acad Sci U S A 69:1830–1834 46. Kim Y, Oliver DJ (1990) Molecular cloning,
32. Sparks RBJ, Dale RMK (1980) transcriptional characterization, and sequenc-
Characterisation of 3H-labelled supercolied ing of cDNA encoding the H-protein of the
xii Foreword
mitochondrial glycine decarboxylase complex 57. Soole KL, Dry IB, Wiskich JT (1992) Partial
in peas. J Biol Chem 265:848–853 purification and characterization of complex
47. Macherel D, Lebrun M, Gagnon J, Neuburger I, NADH:ubiquinone reductase, from the
M, Douce R (1990) cDNA cloning, primary inner membrane of beetroot mitochondria.
structure and gene expression for H-protein, Plant Physiol 98:588–594
a component of the glycine-cleavage system 58. Klodmann J, Braun HP (2011) Proteomic
(glycine decarboxylase) of pea (Pisum sati- approach to characterize mitochondrial com-
vum) leaf mitochondria. Biochem J 268: plex I from plants. Phytochemistry 72:
783–789 1071–1080
48. Bourguignon J, Macherel D, Neuburger M, 59. Herz U, Schroder W, Liddell A, Leaver CJ,
Douce R (1992) Isolation, characterization, Brennicke A, Grohmann L (1994) Purification
and sequence analysis of a cDNA clone encod- of the NADH:ubiquinone oxidoreductase
ing L-protein, the dihydrolipoamide dehy- (complex I) of the respiratory chain from the
drogenase component of the glycine cleavage inner mitochondrial membrane of Solanum
system from pea-leaf mitochondria. Eur J tuberosum. J Biol Chem 269:2263–2269
Biochem 204:865–873 60. Oda K, Yamato K, Ohta E, Nakamura Y,
49. Turner SR, Ireland R, Morgan C, Rawsthorne Takemura M, Nozato N, Akashi K, Kanegae
S (1992) Identification and localization of T, Ogura Y, Kohchi T et al (1992) Gene
multiple forms of serine hydroxymethyltrans- organization deduced from the complete
ferase in pea (Pisum sativum) and character- sequence of liverwort Marchantia polymor-
ization of a cDNA encoding a mitochondrial pha mitochondrial DNA. A primitive form of
isoform. J Biol Chem 267:13528–13534 plant mitochondrial genome. J Mol Biol
50. Turner SR, Ireland R, Rawsthorne S (1992) 223:1–7
Cloning and characterization of the P subunit 61. Unseld M, Marienfeld JR, Brandt P, Brennicke
of glycine decarboxylase from pea (Pisum sati- A (1997) The mitochondrial genome of
vum). J Biol Chem 267:5355–5360 Arabidopsis thaliana contains 57 genes in
51. Small I, Marechal-Drouard L, Masson J, 366,924 nucleotides. Nat Genet 15:57–61
Pelletier G, Cosset A, Weil JH, Dietrich A 62. Millar AH, Wiskich JT, Whelan J, Day DA
(1992) In vivo import of a normal or muta- (1993) Organic acid activation of the alterna-
genized heterologous transfer RNA into the tive oxidase of plant mitochondria. FEBS Lett
mitochondria of transgenic plants: towards 329:259–262
novel ways of influencing mitochondrial gene 63. Umbach AL, Siedow JN (1993) Covalent and
expression? EMBO J 11:1291–1296 noncovalent dimers of the cyanide-resistant
52. Eriksson AC, Glaser E (1992) Mitochondrial alternative oxidase protein in higher plant
processing peptidase: a general processing mitochondria and their relationship to
proteinase of spinach leaf mitochondria in a enzyme activity. Plant Physiol 103:845–854
membrane-bound enzyme. Biochim Biophys 64. Gonzalez DH, Bonnard G, Grienenberger
Acta 1140:208–214 JM (1993) A gene involved in the biogene-
53. Eriksson AC, Sjoling S, Glaser E (1994) The sis of c-type cytochromes is co-transcribed
ubiquinol cytochrome c oxidoreductase com- with a ribosomal protein gene in wheat
plex of spinach leaf mitochondria is involeved mitochondria [corrected]. Curr Genet
in both respiration and protein processing. 24:248–255
Biochim Biophys Acta 1186:221–231 65. Bonnard G, Grienenberger JM (1995) A
54. Braun HP, Emmermann M, Kruft V, Schmitz gene proposed to encode a transmembrane
UK (1992) The general mitochondrial pro- domain of an ABC transporter is expressed in
cessing peptidase from potato is an integral wheat mitochondria. Mol Gen Genet
part of cytochrome c reductase of the respira- 246:91–99
tory chain. EMBO J 11:3219–3227 66. Brennicke A, Grohmann L, Hiesel R, Knoop
55. Braun HP, Schmitz UK (1995) Are the ‘core’ V, Schuster W (1993) The mitochondrial
proteins of the mitochondrial bc1 complex genome on its way to the nucleus: different
evolutionary relics of a processing protease? stages of gene transfer in higher plants. FEBS
Trends Biochem Sci 20:171–175 Lett 325:140–145
56. Leterme S, Boutry M (1993) Purification and 67. Kadowaki K, Kubo N, Ozawa K, Hirai A
preliminary characterization of mitochondrial (1996) Targeting presequence acquisition
complex I (NADH: ubiquinone reductase) after mitochondrial gene transfer to the
from broad bean (Vicia faba L.). Plant Physiol nucleus occurs by duplication of existing tar-
102:435–443 geting signals. EMBO J 15:6652–6661
Foreword xiii
68. Adams KL, Daley DO, Qiu YL, Whelan J, chondria to the cytosol occurs during heat-
Palmer JD (2000) Repeated, recent and diverse induced programmed cell death in cucumber
transfers of a mitochondrial gene to the nucleus plants. FEBS Lett 463:151–154
in flowering plants. Nature 408:354–357 81. Rasmusson AG, Svensson AS, Knoop V,
69. Vanlerberghe GC, Vanlerberghe AE, Grohmann L, Brennicke A (1999)
McIntosh L (1994) Molecular genetic altera- Homologues of yeast and bacterial rotenone-
tion of plant respiration (silencing and over- insensitive NADH dehydrogenases in higher
expression of alternative oxidase in transgenic eukaryotes: two enzymes are present in potato
tobacco). Plant Physiol 106:1503–1510 mitochondria. Plant J 20:79–87
70. Creissen G, Reynolds H, Xue Y, Mullineaux P 82. Michalecka AM, Svensson AS, Johansson FI,
(1995) Simultaneous targeting of pea gluta- Agius SC, Johanson U, Brennicke A, Binder
thione reductase and of a bacterial fusion pro- S, Rasmusson AG (2003) Arabidopsis genes
tein to chloroplasts and mitochondria in encoding mitochondrial type II NAD(P)H
transgenic tobacco. Plant J 8:167–175 dehydrogenases have different evolutionary
71. Heins L, Schmitz UK (1996) A receptor for origin and show distinct responses to light.
protein import into potato mitochondria. Plant Physiol 133:642–652
Plant J 9:829–839 83. Small ID, Peeters N (2000) The PPR motif -
72. Kohler RH, Zipfel WR, Webb WW, Hanson a TPR-related motif prevalent in plant organ-
MR (1997) The green fluorescent protein as ellar proteins. Trends Biochem Sci 25:46–47
a marker to visualize plant mitochondria 84. Logan DC, Leaver CJ (2000) Mitochondria-
in vivo. Plant J 11:613–621 targeted GFP highlights the heterogeneity of
73. Chew O, Whelan J, Millar AH (2003) mitochondrial shape, size and movement
Molecular definition of the ascorbate- within living plant cells. J Exp Bot 51:
glutathione cycle in Arabidopsis mitochon- 865–871
dria reveals dual targeting of antioxidant 85. Arimura S, Tsutsumi N (2002) A dynamin-
defenses in plants. J Biol Chem 278: like protein (ADL2b), rather than FtsZ, is
46869–46877 involved in Arabidopsis mitochondrial divi-
74. Jimenez A, Hernandez JA, Del Rio LA, sion. Proc Natl Acad Sci U S A 99:
Sevilla F (1997) Evidence for the presence of 5727–5731
the ascorbate-glutathione cycle in mitochon- 86. Logan DC, Scott I, Tobin AK (2003) The
dria and peroxisomes of pea leaves. Plant genetic control of plant mitochondrial mor-
Physiol 114:275–284 phology and dynamics. Plant J 36:500–509
75. Hedtke B, Borner T, Weihe A (1997) 87. Arimura S, Aida GP, Fujimoto M, Nakazono
Mitochondrial and chloroplast phage-type M, Tsutsumi N (2004) Arabidopsis dynamin-
RNA polymerases in Arabidopsis. Science like protein 2a (ADL2a), like ADL2b, is
277:809–811 involved in plant mitochondrial division.
76. Hedtke B, Borner T, Weihe A (2000) One Plant Cell Physiol 45:236–242
RNA polymerase serving two genomes. 88. Logan DC, Scott I, Tobin AK (2004) ADL2a,
EMBO Rep 1:435–440 like ADL2b, is involved in the control of
77. Kuhn K, Richter U, Meyer EH, Delannoy E, higher plant mitochondrial morphology. J Exp
de Longevialle AF, O'Toole N, Borner T, Bot 55:783–785
Millar AH, Small ID, Whelan J (2009) 89. Scott I, Tobin AK, Logan DC (2006)
Phage-type RNA polymerase RPOTmp per- BIGYIN, an orthologue of human and yeast
forms gene-specific transcription in mito- FIS1 genes functions in the control of mito-
chondria of Arabidopsis thaliana. Plant Cell chondrial size and number in Arabidopsis
21:2762–2779 thaliana. J Exp Bot 57:1275–1280
78. Adams KL, Clements MJ, Vaughn JC (1998) 90. Taylor NL, Howell KA, Heazlewood JL, Tan
The Peperomia mitochondrial coxI group I TY, Narsai R, Huang S, Whelan J, Millar AH
intron: timing of horizontal transfer and sub- (2010) Analysis of the rice mitochondrial car-
sequent evolution of the intron. J Mol Evol rier family reveals anaerobic accumulation of a
46:689–696 basic amino acid carrier involved in arginine
79. Cho Y, Qiu YL, Kuhlman P, Palmer JD metabolism during seed germination. Plant
(1998) Explosive invasion of plant mitochon- Physiol 154:691–704
dria by a group I intron. Proc Natl Acad Sci U 91. Pan R, Jones AD, Hu J (2014) Cardiolipin-
S A 95:14244–14249 mediated mitochondrial dynamics and stress
80. Balk J, Leaver CJ, McCabe PF (1999) response in Arabidopsis. Plant Cell
Translocation of cytochrome c from the mito- 26:391–409
xiv Foreword
92. Kruft V, Eubel H, Jansch L, Werhahn W, Kawasaki S, Imamura J (2003) Genetic char-
Braun HP (2001) Proteomic approach to acterization of a pentatricopeptide repeat pro-
identify novel mitochondrial proteins in tein gene, orf687, that restores fertility in the
Arabidopsis. Plant Physiol 127:1694–1710 cytoplasmic male-sterile Kosena radish. Plant
93. Millar AH, Sweetlove LJ, Giege P, Leaver CJ J 34:407–415
(2001) Analysis of the Arabidopsis mitochon- 104. Stahl A, Moberg P, Ytterberg J, Panfilov O,
drial proteome. Plant Physiol 127: Brockenhuus Von Lowenhielm H, Nilsson F,
1711–1727 Glaser E (2002) Isolation and identification
94. Dubinin J, Braun HP, Schmitz U, Colditz F of a novel mitochondrial metalloprotease
(2011) The mitochondrial proteome of the (PreP) that degrades targeting presequences
model legume Medicago truncatula. Biochim in plants. J Biol Chem 277:41931–41939
Biophys Acta 1814:1658–1668 105. Johnson KA, Bhushan S, Stahl A, Hallberg
95. Huang S, Taylor NL, Narsai R, Eubel H, BM, Frohn A, Glaser E, Eneqvist T (2006)
Whelan J, Millar AH (2009) Experimental The closed structure of presequence protease
analysis of the rice mitochondrial proteome, PreP forms a unique 10,000 Angstroms3
its biogenesis, and heterogeneity. Plant chamber for proteolysis. EMBO J 25:
Physiol 149:719–734 1977–1986
96. Jacoby RP, Millar AH, Taylor NL (2010) 106. Abdelnoor RV, Yule R, Elo A, Christensen
Wheat mitochondrial proteomes provide new AC, Meyer-Gauen G, Mackenzie SA (2003)
links between antioxidant defense and plant Substoichiometric shifting in the plant mito-
salinity tolerance. J Proteome Res 9: chondrial genome is influenced by a gene
6595–6604 homologous to MutS. Proc Natl Acad Sci U S
97. Salvato F, Havelund JF, Chen M, Rao RS, A 100:5968–5973
Rogowska-Wrzesinska A, Jensen ON, Gang 107. Moore CS, Cook-Johnson RJ, Rudhe C,
DR, Thelen JJ, Moller IM (2014) The potato Whelan J, Day DA, Wiskich JT, Soole KL
tuber mitochondrial proteome. Plant Physiol (2003) Identification of AtNDI1, an internal
164:637–653 non-phosphorylating NAD(P)H dehydroge-
98. Laloi C, Rayapuram N, Chartier Y, nase in Arabidopsis mitochondria. Plant
Grienenberger JM, Bonnard G, Meyer Y Physiol 133:1968–1978
(2001) Identification and characterization of 108. Michalecka AM, Agius SC, Moller IM,
a mitochondrial thioredoxin system in plants. Rasmusson AG (2004) Identification of a
Proc Natl Acad Sci U S A 98:14144–14149 mitochondrial external NADPH dehydroge-
99. Finkemeier I, Goodman M, Lamkemeyer P, nase by overexpression in transgenic Nicotiana
Kandlbinder A, Sweetlove LJ, Dietz KJ sylvestris. Plant J 37:415–425
(2005) The mitochondrial type II peroxire- 109. Geisler DA, Broselid C, Hederstedt L,
doxin F is essential for redox homeostasis and Rasmusson AG (2007) Ca2+-binding and
root growth of Arabidopsis thaliana under Ca2+-independent respiratory NADH and
stress. J Biol Chem 280:12168–12180 NADPH dehydrogenases of Arabidopsis
100. Morgan MJ, Lehmann M, Schwarzlander M, thaliana. J Biol Chem 282:28455–28464
Baxter CJ, Sienkiewicz-Porzucek A, Williams 110. Eubel H, Jansch L, Braun HP (2003) New
TC, Schauer N, Fernie AR, Fricker MD, insights into the respiratory chain of plant
Ratcliffe RG, Sweetlove LJ, Finkemeier I mitochondria. Supercomplexes and a unique
(2008) Decrease in manganese superoxide composition of complex II. Plant Physiol
dismutase leads to reduced root growth and 133:274–286
affects tricarboxylic acid cycle flux and mito- 111. Giege P, Heazlewood JL, Roessner-Tunali U,
chondrial redox homeostasis. Plant Physiol Millar AH, Fernie AR, Leaver CJ, Sweetlove
147:101–114 LJ (2003) Enzymes of glycolysis are function-
101. Arpagaus S, Rawyler A, Braendle R (2002) ally associated with the mitochondrion in
Occurrence and characteristics of the mito- Arabidopsis cells. Plant Cell 15:2140–2151
chondrial permeability transition in plants. 112. Heazlewood JL, Howell KA, Millar AH
J Biol Chem 277:1780–1787 (2003) Mitochondrial complex I from
102. Bentolila S, Alfonso AA, Hanson MR (2002) Arabidopsis and rice: orthologs of mamma-
A pentatricopeptide repeat-containing gene lian and fungal components coupled with
restores fertility to cytoplasmic male-sterile plant-specific subunits. Biochim Biophys Acta
plants. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 1604:159–169
10887–10892 113. Millar AH, Eubel H, Jansch L, Kruft V,
103. Koizuka N, Imai R, Fujimoto H, Hayakawa Heazlewood JL, Braun HP (2004)
T, Kimura Y, Kohno-Murase J, Sakai T, Mitochondrial cytochrome c oxidase and
Foreword xv
succinate dehydrogenase complexes contain Expression and characterization of a redox-sens-

plant specific subunits. Plant Mol Biol 56: ing green fluorescent protein (reduction-
77–90 oxidation-sensitive green fluorescent protein) in
114. Dudkina NV, Eubel H, Keegstra W, Boekema Arabidopsis. Plant Physiol 141:397–403
EJ, Braun HP (2005) Structure of a mito- 124. Schwarzlander M, Fricker MD, Muller C,
chondrial supercomplex formed by Marty L, Brach T, Novak J, Sweetlove LJ,
respiratory-chain complexes I and III. Proc Hell R, Meyer AJ (2008) Confocal imaging
Natl Acad Sci U S A 102:3225–3229 of glutathione redox potential in living plant
115. Dudkina NV, Heinemeyer J, Keegstra W, cells. J Microsc 231:299–316
Boekema EJ, Braun HP (2005) Structure of 125. Loro G, Drago I, Pozzan T, Schiavo FL,
dimeric ATP synthase from mitochondria: an Zottini M, Costa A (2012) Targeting of
angular association of monomers induces the Cameleons to various subcellular compart-
strong curvature of the inner membrane. ments reveals a strict cytoplasmic/mitochon-
FEBS Lett 579:5769–5772 drial Ca(2)(+) handling relationship in plant
116. Giraud E, Ho LH, Clifton R, Carroll A, cells. Plant J 71:1–13
Estavillo G, Tan YF, Howell KA, Ivanova A, 126. Zaegel V, Guermann B, Le Ret M, Andres C,
Pogson BJ, Millar AH, Whelan J (2008) Meyer D, Erhardt M, Canaday J, Gualberto
The absence of ALTERNATIVE OXIDASE1a JM, Imbault P (2006) The plant-specific
in Arabidopsis results in acute sensitivity to ssDNA binding protein OSB1 is involved in
combined light and drought stress. Plant the stoichiometric transmission of mitochon-
Physiol 147:595–610 drial DNA in Arabidopsis. Plant Cell 18:
117. Fiorani F, Umbach AL, Siedow JN (2005) 3548–3563
The alternative oxidase of plant mitochondria 127. Cappadocia L, Marechal A, Parent JS, Lepage
is involved in the acclimation of shoot growth E, Sygusch J, Brisson N (2010) Crystal struc-
at low temperature. A study of Arabidopsis tures of DNA-Whirly complexes and their
AOX1a transgenic plants. Plant Physiol role in Arabidopsis organelle genome repair.
139:1795–1805 Plant Cell 22:1849–1867
118. Umbach AL, Fiorani F, Siedow JN (2005) 128. Janicka S, Kuhn K, Le Ret M, Bonnard G,
Characterization of transformed Arabidopsis Imbault P, Augustyniak H, Gualberto JM
with altered alternative oxidase levels and (2012) A RAD52-like single-stranded DNA
analysis of effects on reactive oxygen species binding protein affects mitochondrial DNA
in tissue. Plant Physiol 139:1806–1820 repair by recombination. Plant J 72:423–435
119. Sunderhaus S, Dudkina NV, Jansch L, 129. de Longevialle AF, Meyer EH, Andres C,
Klodmann J, Heinemeyer J, Perales M, Taylor NL, Lurin C, Millar AH, Small ID
Zabaleta E, Boekema EJ, Braun HP (2006) (2007) The pentatricopeptide repeat gene
Carbonic anhydrase subunits form a matrix- OTP43 is required for trans-splicing of the
exposed domain attached to the membrane arm mitochondrial nad1 Intron 1 in Arabidopsis
of mitochondrial complex I in plants. J Biol thaliana. Plant Cell 19:3256–3265
Chem 281:6482–6488 130. Eubel H, Lee CP, Kuo J, Meyer EH, Taylor
120. Klodmann J, Sunderhaus S, Nimtz M, Jansch NL, Millar AH (2007) Free-flow electropho-
L, Braun HP (2010) Internal architecture of resis for purification of plant mitochondria by
mitochondrial complex I from Arabidopsis surface charge. Plant J 52:583–594
thaliana. Plant Cell 22:797–810 131. Giraud E, Van Aken O, Ho LH, Whelan J
121. Salinas T, Duchene AM, Delage L, Nilsson S, (2009) The transcription factor ABI4 is a
Glaser E, Zaepfel M, Marechal-Drouard L regulator of mitochondrial retrograde expres-
(2006) The voltage-dependent anion chan- sion of ALTERNATIVE OXIDASE1a. Plant
nel, a major component of the tRNA import Physiol 150:1286–1296
machinery in plant mitochondria. Proc Natl 132. Ng S, Giraud E, Duncan O, Law SR, Wang Y,
Acad Sci U S A 103:18362–18367 Xu L, Narsai R, Carrie C, Walker H, Day DA,
122. Remacle C, Cardol P, Coosemans N, Gaisne Blanco NE, Strand A, Whelan J, Ivanova A
M, Bonnefoy N (2006) High-efficiency (2013) Cyclin-dependent kinase E1 (CDKE1)
biolistic transformation of Chlamydomonas provides a cellular switch in plants between
mitochondria can be used to insert mutations growth and stress responses. J Biol Chem
in complex I genes. Proc Natl Acad Sci U S A 288:3449–3459
103:4771–4776 133. Ng S, Ivanova A, Duncan O, Law SR, Van
123. Jiang K, Schwarzer C, Lally E, Zhang S, Ruzin Aken O, De Clercq I, Wang Y, Carrie C, Xu
S, Machen T, Remington SJ, Feldman L (2006) L, Kmiec B, Walker H, Van Breusegem F,
xvi Foreword
Whelan J, Giraud E (2013) A membrane- (2012) Pulsing of membrane potential in indi-

bound NAC transcription factor, ANAC017, vidual mitochondria: a stress-induced mecha-
mediates mitochondrial retrograde signaling nism to regulate respiratory bioenergetics in
in Arabidopsis. Plant Cell 25:3450–3471 Arabidopsis. Plant Cell 24:1188–1201
134. Ng S, De Clercq I, Van Aken O, Law SR, 144. Schertl P, Sunderhaus S, Klodmann J, Grozeff
Ivanova A, Willems P, Giraud E, Van Breusegem GE, Bartoli CG, Braun HP (2012)
F, Whelan J (2014) Anterograde and retro- L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase
grade regulation of nuclear genes encoding (GLDH) forms part of three subcomplexes
mitochondrial proteins during growth, devel- of mitochondrial complex I in Arabidopsis
opment, and stress. Mol Plant 7:1075–1093 thaliana. J Biol Chem 287:14412–14419
135. Tcherkez G, Mahe A, Gauthier P, Mauve C, 145. Wang Y, Carrie C, Giraud E, Elhafez D,
Gout E, Bligny R, Cornic G, Hodges M Narsai R, Duncan O, Whelan J, Murcha MW
(2009) In folio respiratory fluxomics revealed (2012) Dual location of the mitochondrial
by 13C isotopic labeling and H/D isotope preprotein transporters B14.7 and Tim23-2 in
effects highlight the noncyclic nature of the complex I and the TIM17:23 complex in
tricarboxylic acid “cycle” in illuminated Arabidopsis links mitochondrial activity and
leaves. Plant Physiol 151:620–630 biogenesis. Plant Cell 24:2675–2695
136. Ito J, Taylor NL, Castleden I, Weckwerth W, 146. Barkan A, Rojas M, Fujii S, Yap A, Chong YS,
Millar AH, Heazlewood JL (2009) A survey Bond CS, Small I (2012) A combinatorial
of the Arabidopsis thaliana mitochondrial amino acid code for RNA recognition by
phosphoproteome. Proteomics 9:4229–4240 pentatricopeptide repeat proteins. PLoS Genet
137. Tan YF, O’Toole N, Taylor NL, Millar AH 8:e1002910
(2010) Divalent metal ions in plant mitochon- 147. Huang Y, Chen X, Liu Y, Roth C, Copeland
dria and their role in interactions with proteins C, McFarlane HE, Huang S, Lipka V,
and oxidative stress-induced damage to respi- Wiermer M, Li X (2013) Mitochondrial
ratory function. Plant Physiol 152:747–761 AtPAM16 is required for plant survival and
138. Havelund JF, Thelen JJ, Moller IM (2013) the negative regulation of plant immunity.
Biochemistry, proteomics, and phosphopro- Nat Commun 4:2558
teomics of plant mitochondria from non- 148. Kmiec B, Teixeira PF, Berntsson RP, Murcha
photosynthetic cells. Front Plant Sci 4:51 MW, Branca RM, Radomiljac JD, Regberg J,
139. Konig AC, Hartl M, Boersema PJ, Mann M, Svensson LM, Bakali A, Langel U, Lehtio J,
Finkemeier I (2014) The mitochondrial lysine Whelan J, Stenmark P, Glaser E (2013)
acetylome of Arabidopsis. Mitochondrion Organellar oligopeptidase (OOP) provides a
140. Smith-Hammond CL, Hoyos E, Miernyk JA complementary pathway for targeting peptide
(2014) The pea seedling mitochondrial degradation in mitochondria and chloro-
N-lysine acetylome. Mitochondrion plasts. Proc Natl Acad Sci U S A 110:
E3761–E3769
141. Zehrmann A, Verbitskiy D, van der Merwe
JA, Brennicke A, Takenaka M (2009) A DYW 149. Shiba T, Kido Y, Sakamoto K, Inaoka DK,
domain-containing pentatricopeptide repeat Tsuge C, Tatsumi R, Takahashi G, Balogun
protein is required for RNA editing at multi- EO, Nara T, Aoki T, Honma T, Tanaka A,
ple sites in mitochondria of Arabidopsis thali- Inoue M, Matsuoka S, Saimoto H, Moore
ana. Plant Cell 21:558–567 AL, Harada S, Kita K (2013) Structure of the
trypanosome cyanide-insensitive alternative
142. Gobert A, Gutmann B, Taschner A, oxidase. Proc Natl Acad Sci U S A 110:
Gossringer M, Holzmann J, Hartmann RK, 4580–4585
Rossmanith W, Giege P (2010) A single
Arabidopsis organellar protein has RNase P 150. Sew YS, Stroher E, Holzmann C, Huang S,
activity. Nat Struct Mol Biol 17:740–744 Taylor NL, Jordana X, Millar AH (2013)
Multiplex micro-respiratory measurements of
143. Schwarzlander M, Logan DC, Johnston IG, Arabidopsis tissues. New Phytol 200:
Jones NS, Meyer AJ, Fricker MD, Sweetlove LJ 922–932
Preface
The chapters to follow detail research and observations into plant mitochondria spanning
over a century in time. However, this research intensified in the 1970s and has been con-
tinuing to the present day. The findings of mitochondrial research continually surprises the
scientific community, whether it be the presence of cyanide-insensitive respiration to large
genomes whose transcripts undergo specific editing, requiring at least hundreds of nuclear-
encoded gene products to produce just 50 proteins. The ability to uncover these unique
features is underpinned by the methodology that is used to investigate plant mitochondria,
from morphology to detailed molecular mechanisms. With plant mitochondria represent-
ing a small proportion of the cell in terms of volume or protein content, the question of
contamination is at the forefront of many studies into mitochondria. There are still many
questions remaining which are made even more challenging due to the large variety of
plants and tissues/organs that are used in studying plant mitochondria. However, this
diversity is useful for plant mitochondrial research, and whilst plants display many similari-
ties, it should not be forgotten that up to hundreds of millions of years of evolution sepa-
rates plant lineages, and even species that are closely related may display substantial
differences.
The chapters compiled in this collection outline a number of methods that are used to
study mitochondria today, starting from the isolation of mitochondria to detailed analyses
of RNA, protein, and enzymatic activities. The ability to visualize mitochondria in vivo with
fluorescent protein tagging puts these activities in a spacial context, and the development
of fluorescent probes to measure metabolites provides subcellular resolution that cannot be
achieved by other means. The application of various omic techniques provides resolution of
proteins and nucleic acids at orders of magnitude higher, unimaginable one or two decades
ago. But despite the abundance of such data, there is still much to understand about how
the mitochondrial machine works.
This collection of techniques does not cover all techniques; some are absent simply
because they have been well documented elsewhere in recent times. What we have tried to
achieve in these chapters is to have techniques written by researchers who have been actively
involved in the development and continued use of these techniques. This is to ensure that
they are relevant to researchers today and are accessible in that the authors can be contacted
directly. In the philosophy of this series, we have tried to ensure a blow-by-blow account of
these techniques so that they are accessible to beginners in the field as well as being useful
to expert researchers who find themselves being pulled into the field of mitochondrial
research as it links to so many important aspects of plant cell biology.
Most importantly this collection of methods could only be achieved due to the fact that
these authors have taken the time and effort to prepare them. This is much appreciated, and
hopefully writing 1 chapter and getting 19 in return is of some small benefit. Secondly, the
editors would like to thank their colleagues and mentors, who have supported them
xvii
xviii Preface
throughout their careers, allowing them to be in the position to be carrying out research
into plant mitochondria with exceptional colleagues from all over the world. Finally, both
editors would like to acknowledge the Australian Research Council (FT130100112,
DP130102384, CE140100008) for their continual support to carry out plant mitochon-
drial research in their laboratories.
Bundoora, VIC, Australia James Whelan

Crawley, WA, Australia Monika W. Murcha
Contents
Foreword. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Preface. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvii
Contributors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxi
1 Isolation of Intact Mitochondria from the Model Plant Species

Arabidopsis thaliana and Oryza sativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Monika W. Murcha and James Whelan
2 Determining Mitochondrial Transcript Termini for the Study
of Transcription Start Sites and Transcript 5′ End Maturation . . . . . . . . . . . . . 13
Stefan Binder and Kristina Kühn
3 Mitochondrial Run-On Transcription Assay Using Biotin Labeling . . . . . . . . . 31
Kristina Kühn
4 In Vitro RNA Uptake Studies in Plant Mitochondria. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Szymon Kubiszewski-Jakubiak, Cyrille Megel, Elodie Ubrig,
Thalia Salinas, Anne-Marie Duchêne, and Laurence Maréchal-Drouard
5 In Vitro and In Vivo Protein Uptake Studies in Plant Mitochondria . . . . . . . . 61
Owen Duncan, Chris Carrie, Yan Wang, and Monika W. Murcha
6 Plant Mitochondrial Proteomics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
Nicolas L. Taylor and A. Harvey Millar
7 Identification of Lysine-Acetylated Mitochondrial Proteins
and Their Acetylation Sites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
Markus Hartl, Ann-Christine König, and Iris Finkemeier
8 A Flowchart to Analyze Protease Activity in Plant Mitochondria . . . . . . . . . . . 123
Pedro F. Teixeira, Rui M. Branca, Beata Kmiec, and Elzbieta Glaser
9 Activity Measurements of Mitochondrial Enzymes in Native Gels . . . . . . . . . . 131
Peter Schertl and Hans-Peter Braun
10 Activity Assay for Plant Mitochondrial Enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
Shaobai Huang, Chun Pong Lee, and A. Harvey Millar
11 Analysis of Type II NAD(P)H Dehydrogenases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
Kathleen L. Soole and Chevaun A. Smith
12 Assessment of Respiration in Isolated Plant Mitochondria
Using Clark-Type Electrodes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165
Richard P. Jacoby, A. Harvey Millar, and Nicolas L. Taylor
13 Micro-Respiratory Measurements in Plants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187
Yun Shin Sew, A. Harvey Millar, and Elke Stroeher
14 Improvements to Define Mitochondrial Metabolomics
Using Nonaqueous Fractionation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
Richard Fly, James Lloyd, Stephan Krueger, Alisdair Fernie,
and Margaretha J. van der Merwe
xix
xx Contents
15 Mitochondrial Markers of Programmed Cell Death in Arabidopsis thaliana . . . 211

Theresa J. Reape, Joanna Kacprzyk, Niall Brogan, Lee Sweetlove,
and Paul F. McCabe
16 Imaging and Analysis of Mitochondrial Dynamics in Living Cells . . . . . . . . . . 223
Sanjaya B. Ekanayake, Amr M. El Zawily, Gaël Paszkiewicz,
Aurélia Rolland, and David C. Logan
17 Analysis of Plant Mitochondrial Function Using Fluorescent
Protein Sensors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241
Stephan Wagner, Thomas Nietzel, Isabel Aller, Alex Costa,
Mark D. Fricker, Andreas J. Meyer, and Markus Schwarzländer
18 In Planta Analysis of Leaf Mitochondrial Superoxide and Nitric Oxide. . . . . . . 253
Marina Cvetkovska and Greg C. Vanlerberghe
19 Databases and Informatics Resources for Analysis of Plant Mitochondria . . . . . 263
Reena Narsai
20 Expression and Crystallization of the Plant Alternative Oxidase . . . . . . . . . . . . 281
Benjamin May, Catherine Elliott, Momi Iwata, Luke Young,
Julia Shearman, Mary S. Albury, and Anthony L. Moore
Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301
Contributors
MARY S. ALBURY • Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Life

Sciences, University of Sussex, Brighton, UK
ISABEL ALLER • INRES – Chemical Signalling, University of Bonn, Bonn, Germany
STEFAN BINDER • Molekulare Botanik, Universität Ulm, Ulm, Germany
RUI M. BRANCA • Clinical Proteomics Mass Spectrometry, Department of Oncology-Pathology,
Science for Life Laboratory, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden
HANS-PETER BRAUN • Institute of Plant Genetics, Plant Proteomics, Leibniz Universität
Hannover, Hannover, Germany
NIALL BROGAN • School of Biology and Environmental Science, University College Dublin,
Dublin, Ireland
CHRIS CARRIE • Department of Biology I, Botany, Ludwig-Maximilians-Universität
München, Planegg-Martinsried, Germany
ALEX COSTA • Department of Biosciences, University of Milan, Milan, Italy
MARINA CVETKOVSKA • Department of Biological Sciences, University of Toronto
Scarborough, Toronto, ON, Canada; Department of Cell and Systems Biology,
University of Toronto Scarborough, Toronto, ON, Canada
DAVID A. DAY • School of Biological Sciences, Flinders University, Adelaide, SA, Australia
ANNE-MARIE DUCHÊNE • Institut de Biologie Moléculaire des Plantes, Université
de Strasbourg, Strasbourg, France
OWEN DUNCAN • Plant Energy Biology, Australian Research Council Centre of Excellence,
University of Western Australia, Crawley, WA, Australia
SANJAYA B. EKANAYAKE • Department of Biology, University of Saskatchewan, Saskatoon,
SK, Canada
CATHERINE ELLIOTT • Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Life
ALISDAIR FERNIE • Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, Potsdam,
Germany
IRIS FINKEMEIER • Plant Proteomics and Mass Spectrometry Group, Max-Planck-Institute
for Plant Breeding Research, Cologne, Germany
RICHARD FLY • Institute for Plant Biotechnology, Stellenbosch University, Matieland, South Africa
MARK D. FRICKER • Department of Plant Sciences, University of Oxford, Oxford, UK
ELZBIETA GLASER • Department of Biochemistry and Biophysics, Arrhenius Laboratories
for Natural Sciences, Stockholm University, Stockholm, Sweden
MARKUS HARTL • Plant Proteomics and Mass Spectrometry Group, Max-Planck-Institute
for Plant Breeding Research, Cologne, Germany
SHAOBAI HUANG • Plant Energy Biology, Australian Research Council Centre of Excellence,
MOMI IWATA • Diamond-Membrane Protein Laboratory, Department of Life Sciences,
Imperial College, London, UK
RICHARD P. JACOBY • Plant Energy Biology, Australian Research Council Centre
of Excellence, Centre for Comparative Analysis of Biomolecular Networks (CABiN),
xxi
xxii Contributors
JOANNA KACPRZYK • School of Biology and Environmental Science, University College

Dublin, Dublin, Ireland
BEATA KMIEC • Department of Biochemistry and Biophysics, Arrhenius Laboratories
ANN-CHRISTINE KÖNIG • Plant Proteomics and Mass Spectrometry Group,
Max-Planck-Institute for Plant Breeding Research, Cologne, Germany
STEPHAN KRUEGER • Botanical Institute II, University of Cologne, Cologne, Germany
SZYMON KUBISZEWSKI-JAKUBIAK • Plant Energy Biology, Australian Research Council
Centre of Excellence, University of Western Australia, Crawley, WA, Australia
KRISTINA KÜHN • Molekulare Zellbiologie der Pflanzen, Institut für Biologie, Humboldt
Universität zu Berlin, Berlin, Germany
CHUN PONG LEE • Department of Plant Sciences, University of Oxford, Oxford, UK
JAMES LLOYD • Institute for Plant Biotechnology, Stellenbosch University, Matieland,
South Africa
DAVID C. LOGAN • UMR 1345 Institut de Recherche en Horticulture et Semences, Université
d’Angers, Angers, France
LAURENCE MARÉCHAL-DROUARD • Institut de Biologie Moléculaire des Plantes, Université
de Strasbourg, Strasbourg, France
BENJAMIN MAY • Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Life Sciences,
University of Sussex, Brighton, UK
PAUL F. MCCABE • School of Biology and Environmental Science, University College Dublin,
Dublin, Ireland
CYRILLE MEGEL • Institut de Biologie Moléculaire des Plantes, Université de Strasbourg,
Strasbourg, France
MARGARETHA J. VAN DER MERWE • Plant Energy Biology, Australian Research Council
Centre of Excellence, University of Western Australia, Crawley, WA, Australia
ANDREAS J. MEYER • INRES – Chemical Signalling, University of Bonn, Bonn, Germany
A. HARVEY MILLAR • Plant Energy Biology, Australian Research Council Centre
ANTHONY L. MOORE • Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Life
MONIKA W. MURCHA • Plant Energy Biology, Australian Research Council Centre
of Excellence, University of Western Australia, Crawley, WA, Australia
REENA NARSAI • Plant Energy Biology, Australian Research Council Centre of Excellence,
Department of Botany, School of Life Science, La Trobe University, Bundoora, VIC,
Australia
THOMAS NIETZEL • Plant Energy Biology Lab, INRES – Chemical Signalling, University
of Bonn, Bonn, Germany
GAËL PASZKIEWICZ • UMR 1345 Institut de Recherche en Horticulture et Semences,
Université d’Angers, Angers, France
THERESA J. REAPE • School of Biology and Environmental Science, University College
Dublin, Dublin, Ireland
AURÉLIA ROLLAND • UMR 1345 Institut de Recherche en Horticulture et Semences,
Université d’Angers, Angers, France
THALIA SALINAS • Institut de Biologie Moléculaire des Plantes, Université de Strasbourg,
Strasbourg, France
Contributors xxiii
PETER SCHERTL • Institute of Plant Genetics, Plant Proteomics, Leibniz Universität Hannover,
Hannover, Germany
MARKUS SCHWARZLÄNDER • Plant Energy Biology Lab, INRES – Chemical Signalling,
University of Bonn, Bonn, Germany
YUN SHIN SEW • Australian Research Council Centre of Excellence Plant Energy Biology,
JULIA SHEARMAN • Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Life
CHEVAUN A. SMITH • School of Biological Sciences, Flinders University, Adelaide, SA, Australia
KATHLEEN L. SOOLE • School of Biological Sciences, Flinders University, Adelaide, SA, Australia
ELKE STROEHER • Plant Energy Biology, Australian Research Council Centre of Excellence,
LEE SWEETLOVE • Department of Plant Sciences, University of Oxford, Oxford, UK
NICOLAS L. TAYLOR • Plant Energy Biology, Australian Research Council Centre
PEDRO F. TEIXEIRA • Department of Biochemistry and Biophysics, Arrhenius Laboratories
ELODIE UBRIG • Institut de Biologie Moléculaire des Plantes, Université de Strasbourg,
Strasbourg, France
GREG C. VANLERBERGHE • Department of Biological Sciences, University of Toronto
Scarborough, Toronto, ON, Canada; Department of Cell and Systems Biology,
University of Toronto Scarborough, Toronto, ON, Canada
STEPHAN WAGNER • Plant Energy Biology Lab, INRES – Chemical Signalling, University
of Bonn, Bonn, Germany
YAN WANG • Plant Energy Biology, Australian Research Council Centre of Excellence,
School of Life Science, La Trobe University, Bundoora, VIC, Australia
JAMES WHELAN • Plant Energy Biology, Australian Research Council Centre of Excellence,
School of Life Science, La Trobe University, Bundoora, VIC, Australia
LUKE YOUNG • Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Life Sciences,
University of Sussex, Brighton, UK
AMR M. EL ZAWILY • Department of Biology, University of Saskatchewan, Saskatoon, SK,
Canada; Faculty of Science, Damanhour University, Damanhour, Egypt
Chapter 1
Isolation of Intact Mitochondria from the Model Plant

Species Arabidopsis thaliana and Oryza sativa
Monika W. Murcha and James Whelan
Abstract
The study of mitochondrial composition, biogenesis, and metabolism requires the isolation of intact
functional mitochondria, often in relatively large quantities sufficient for downstream biochemical and
proteomic analysis. Here we describe techniques optimized for the isolation of functional mitochondria
from a variety of tissues from the model monocot and dicot species Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) and
rice (Oryza sativa).
Key words Mitochondria, Organelle isolation, Density gradients, Arabidopsis, Rice
1 Introduction
Mitochondria are indispensible organelles essential for plant

growth, development, and resistance to stress. Characterization of
these processes requires the isolation of intact, respiratory active,
and functional mitochondria for a multitude of biochemical assays,
many of which are described in detail within this edition.
Traditionally, mitochondrial isolation procedures often focused
on large heterotrophic organs such as potato tubers or cauliflower
or photosynthetic tissues such as pea leaf and soybean cotyledons
with several extensive reviews and specific methodology papers
available [1–5]. With the complete sequencing of plant genomes,
the model dicot, Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), and monocot
rice (Oryza sativa) are more widely used for biochemical studies in
addition to the genetic studies that established these plants as
models. The availability of mutant lines, antibodies, and tools for
the generation of mutant germplasms, such as knockdown and
over-expressing lines, offers many advantages to basic research.
With modifications to plant growth and isolation procedures, suf-
ficient quantities of pure, intact, and functional mitochondria can
James Whelan and Monika W. Murcha (eds.), Plant Mitochondria: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology,
vol. 1305, DOI 10.1007/978-1-4939-2639-8_1, © Springer Science+Business Media New York 2015
1
2 Monika W. Murcha and James Whelan
be isolated from relatively small quantities from specific tissues

from both Arabidopsis and rice. Here we present step-by-step
methods for plant growth and mitochondrial isolation from
Arabidopsis seedlings, rosettes and cell suspensions, and rice
embryo, hypocotyl, and seedlings.
2 Materials
2.1 Arabidopsis 1. 6 × 6 × 6 cm pots.

Tissue Preparation 2. Soil mix consisting of vermiculture:peat moss:perlite mixed at
2.1.1 Soil-Grown a 1:3:1 ratio.
Arabidopsis
2.1.2 Plate-Grown Growing Arabidopsis on plates is useful for propagating enough

Arabidopsis tissue with minimal growth space. Additionally, plates can be easily
treated prior to the isolation of mitochondria with a variety of
stresses/compounds to induce/inhibit specific pathways and/or
responses.
1. Murashige and Skoog (MS) media plates: 3 % (w/v) sucrose,
4.3 g/L MS powder, 0.5 g/L MES, 1 mL/L Gamborg B5
vitamins 1,000×, pH 5.7 (KOH), 7.5 g/L agar.
2. 3 % (v/v) Hydrochloride in sodium hypochlorite.
3. Glass non-vacuum desiccator.
4. 10 × 10 cm square petri dishes (see Note 1).
5. Surgical breathable tape (e.g., 2.5-cm width Leukopor).
2.1.3 Liquid-Grown Growing Arabidopsis in liquid is preferential when large amounts

Arabidopsis of mitochondria are required (3–5 mg). Additionally, seedlings
can be treated continuously with a variety of compounds in
solution.
1. Half-strength MS media: 1.5 % (w/v) sucrose, 2.15 g/L MS
powder, 0.25 g/L MES, 0.5 mL/L Gamborg B5 vitamins
(1,000×), pH 5.7 (KOH).
2. Orbital shaker.
3. 500-mL polycarbonate pots with polypropylene lid (e.g.,
Sarstedt cat. # 75.9922.811).
4. 3 % (v/v) concentrated HCl in sodium hypochlorite.
5. Glass non-vacuum desiccator.
6. Surgical breathable tape (e.g., 2.5-cm width Leukopor).
Isolation of Plant Mitochondria 3
2.1.4 Arabidopsis Cell 1. 250-mL Glass conical flasks.

Suspensions
2. 70 % (v/v) Ethanol.
3. Sterile 25-mL pipettes.
4. MS media: 3 % (w/v) sucrose, 4.3 g/L MS powder, 0.5 mg
1-naphthaleneacetic acid (NAA), 0.05 mg kinetin pH 5.7
(KOH).
2.1.5 Rice Coleoptiles 1. Rice dehusker (see Note 2).

and Seedlings 2. Vermiculite.
3. Large 30 × 40 × 10-cm plastic trays with drainage holes.
2.1.6 Rice Embryos 1. Rice dehusker (see Note 2).

2. Rice growth media: 0.5 mM MES, 0.5 mM CaCl2 pH 6.5,
carbenicillin (6 mg/L) (see Note 3).
3. Sterile 250-mL conical flasks and air spargers (see Note 4).
4. Oxygen/nitrogen tank.
2.1.7 Mitochondrial 1. Large mortar and pestle.

Isolation Using Continuous 2. Miracloth (e.g., Calbiochem Corp. Cat. # 475855) (see Note 5).
Density Gradients
3. Beckman Coulter Avanti® J-E centrifuge with Beckman rotor
JA25.5 or equivalent.
4. 50-mL centrifuge tubes (e.g., Nalgene polycarbonate Cat. #
3117-9500).
5. Fine-hair paintbrush.
6. 300-mL conical flask and funnel.
7. Gradient pourer with standard peristaltic pump.
8. Grinding buffer: 0.3 M sucrose, 25 mM tetrasodium pyro-
phosphate, 2 mM EDTA (disodium salt), 10 mM KH2PO4,
1 % (w/v) PVP-40, 1 % (w/v) bovine serum albumin (BSA),
pH 7.5 (HCl). For 300 mL grinding media, 1.06 g sodium
ascorbate and 0.74 g cysteine are added just prior to use.
9. 2× Wash buffer: 0.6 M sucrose, 20 mM TES, 0.2 % (w/v)
BSA, pH 7.5 (NaOH) (see Note 6).
10. Light gradient solution.
2 Gradients 4 Gradients
Wash buffer (2×) 17.5 mL 35 mL
Percoll 9.8 mL 19.6 mL
Double-deionized water 7.7 mL 15.4 mL
11. Heavy gradient solution.
2 Gradients 4 Gradients
Wash buffer (2×) 17.5 mL 35 mL
Percoll 9.8 mL 19.6 mL
PVP-40 20 % (w/v) 7.7 mL 15.4 mL
2.1.8 Mitochondrial 1. Blender.

Isolation Using 2. Miracloth (e.g., Calbiochem Corp. Cat. # 475855) (see Note 5).
Discontinuous Density
3. Beckman Coulter Avanti® J-E centrifuge with Beckman rotor
Gradients
JA25.5 or equivalent.
4. 50-mL centrifuge tubes (e.g., Nalgene polycarbonate Cat. #
3117-9500).
5. Fine-hair paintbrush.
6. 300-mL conical flask and funnel.
7. Needle (21 gauge), 50-mL syringe, and retort stand.
8. Grinding buffer: 0.3 M mannitol, 50 mM tetrasodium pyro-
phosphate, 2 mM EDTA (disodium salt), 0.5 % (w/v) PVP-
40, 0.5 % (w/v) BSA pH 8.0 (HCl). For 300 mL grinding
media, add 0.74 g cysteine prior to use.
9. 2× Wash buffer: 0.6 M mannitol, 20 mM TES, 0.2 % (w/v)
BSA, pH 7.5 (NaOH) (see Note 6).
10. Percoll gradients [2].
Percoll Water Wash buffer (2×)

Percoll 21 % (v/v) 8.4 mL 11.6 mL 20 mL
Percoll 40 % (v/v) 4 mL 1 mL 5 mL
Percoll 16 % (v/v) 3.2 mL 6.8 mL 10 mL
2.1.9 Mitochondrial 1. Scalpel.

Isolation Using Continuous 2. Small mortar and pestle.
Density Gradients for Rice
3. Grinding buffer: 0.4 M mannitol, 50 mM tetrasodium pyro-
Embryos
phosphate, 2 mM EGTA, 0.5 % (w/v) PVP-40, 0.5 % (w/v)
BSA, 20 mM cysteine, pH 8.0 (HCl).
4. Wash buffer: 0.3 M mannitol, 10 mM TES, pH 7.5 (NaOH).
5. 10-mL ultracentrifuge tubes.
6. Percoll step gradient (see Note 7).
40 % (v/v) 25 % (v/v) 15 % (v/v)

Wash buffer 1.2 mL 1.5 mL 1.7 mL
Percoll 800 μL 500 μL 300 μL
3 Methods
3.1 Tissue Growth 1. Water culture pots are prepared with 80 mL liquid MS media
Conditions and Tissue and sterilized by autoclaving.
Preparation 2. Arabidopsis seeds are sterilized using the chlorine gas method:
3.1.1 Arabidopsis Place 100 mg of seed into a 1.5-mL microcentrifuge tube, and
Seedlings Grown in Water place open tube into a desiccator containing 50 mL sodium
Culture Pots hypochlorite in a 100-mL beaker. Quickly add 3 mL of con-
centrated HCl to the bleach and close the lid; leave to sterilize
for 6 h (see Note 8).
3. In a sterile laminar flow hood using sterile techniques, pour
100 mg of seed to each pot. Screw shut the lid and tape over
the junction with medical tape.
4. Place the pots into standard plant growth conditions, shaking
gently at 100 rpm to ensure that seed does not settle. For a
standard mitochondrial isolation yielding 4–5 mg of mito-
chondria, ten pots will be required when mitochondria are iso-
lated from 2-week-old plants.
3.1.2 Arabidopsis 1. Arabidopsis seed can be sterilized as described above in

Seedlings Grown in Square Subheading 3.1.1.
Petri Dishes 2. 300 mg of sterile seed can be sown evenly onto five large
square MS agar plates and the lid taped up using medical tape
(see Note 9).
3. Seeds are stratified for 48 h at 4 °C upon which they are placed
under standard growth conditions for 2 weeks (see Note 10).
4. Tissue is collected by gently removing the whole seedlings from
agar or washing the agar and plants through a sieve ensuring
that all agar is removed. Excess water is gently squeezed out.
3.1.3 Arabidopsis 1. Arabidopsis seeds (non-sterile) are sprinkled onto pots con-
Rosettes Grown in Soil taining soil within larger trays. Trays are stratified for 48 h at
4 °C prior to placing under optimal growth conditions. About
10 days after sowing, excess seedlings are removed from each
pot and grown for a further 2 weeks. 100–200 pots are
required for isolating 3–5 mg of mitochondria.
2. Tissue is removed by cutting the rosette from the stalk and
gently rinsing excess soil.
3.1.4 Arabidopsis Cell 1. Subculture cell suspensions every 7 days using sterile tech-
Suspensions niques in a laminar flow hood.
2. Subculture the cells by transferring 20–25 mL of the culture
(depending on density) to an autoclaved flask containing
100 mL media. Minimize disturbance by pipetting gently into
the liquid.
3. Shake the flasks in an orbital shaker at 100 rpm at 24 °C.
3.1.5 Rice Hypocotyl 1. Dehusk 50 mL of rice grain, and rinse to remove the husks.
and Seedlings 2. Sow seeds onto a tray containing vermiculite (5 cm deep) and
cover with 2 cm of vermiculite.
3. Soak tray in a larger tray filled with water to ensure that all
vermiculite is wet.
4. Place into 26 °C growth chambers (with or without lights).
3.1.6 Rice Embryos 1. Dehusk 50 mL of rice grain, and rinse to remove the husks.
2. Sterilize rice grain with 5 % (v/v) sodium hypochloride for
5 min and rinse well with sterile water.
3. Submerge grains in rice growth media in sterile 250-mL flasks
or sterile 500-mL polycarbonate pots and incubate at 30 °C
for up to 48 h.
4. Bubble air or nitrogen continuously with spargers just below
the growth media level.
5. Dissect embryos from the seed using sterile scalpels from 12 h
post-imbibition.
3.2 Mitochondrial This protocol is used for the isolation of intact mitochondria from
Isolation Using Arabidopsis tissues grown in water cultures/pots, agar plates, and
Continuous Gradients soil and for rice shoots and hypocotyls (Fig. 1). This protocol is
adapted from [6]. All procedures following the grinding of the
material are to be carried out at 4 °C.
1. Prepare the heavy and light gradient solutions in two 50-mL
beakers.
2. Rinse the chambers and tubing of gradient pourer with water
and check that all tubes are flowing at an even rate.
3. Place two 50-mL tubes on ice at a slight angle and tape tubing
outlets to the inside of the tubes, so the gradient solution runs
down the side of the tubes (see Note 11).
4. Ensure that the gradient pourer, tubing, and 50-mL tubes are
free from water and that the connection between inner and
outer chambers is closed.
5. Pour the light solution into outer chamber (chamber without
tubing outlet).
6. Pour the heavy gradient solution into inner chamber (chamber
with tubing outlet), place a small stirrer bar in the chamber,
place gradient chambers on stirring block, and stir gently.
7. Set the peristaltic pump at a rate of 300 mL/h and allow the
heavy solution to run until half is dispensed.
8. Slowly open the connection between the chambers (push
black lever up halfway) and allow solution to mix.
9. Continue to run until all of the gradient mix has been dis-
pensed from the chambers.
a i ii iii iv
dis-continuous
continuous density gradient density gradient
section 3.2 section 3.3
b i ii iii iv
continuous density gradient dis-continuous density gradient

section 3.2 section 3.4
Fig. 1 Density gradient purification strategies for the isolation of plant mitochondria from (a) Arabidopsis seed-
lings grown by water culture (i), agar plates (ii), Arabidopsis rosettes grown in soil (iii), and Arabidopsis cell
suspensions. (b) Rice hypocotyl (i), seedlings (ii), 1–2-day-old embryo (iii), and 2-week-old coleoptile (iv)
10. Keep the gradients on ice until ready to use in step 11

(see Note 12).
11. Pour 75 mL of grinding medium onto a third of the plant
material in a mortar and pestle, and grind well for several
minutes (see Note 13).
12. Pour homogenate through four layers of Miracloth (pre-wet
with grinding medium) into a 500-mL conical flask.
13. Repeat step 11 twice using the remaining tissue.
14. Squeeze through the excess homogenate through the
Miracloth, grind all of the pooled tissue again with the remain-
ing grinding media, and filter again.
15. Transfer the filtered homogenate into 8 × 50-mL plastic centri-
fuge tubes on ice.
16. Centrifuge for 5 min at 2,450 × g at 4 °C.

17. Transfer the supernatant into new tubes and centrifuge for
20 min at 17,400 × g at 4 °C.
18. Remove the supernatant by aspiration (or gently pour off) and
gently resuspend the pellets in residual buffer using a small
paintbrush.
19. Add 10 mL of 1× wash buffer to each tube and combine four
tubes into one (i.e., two tubes in total).
20. Repeat centrifugation steps 16 and 17.
21. Pool crude mitochondrial pellets and overlay two continuous
PVP-40/Percoll gradients.
22. Balance tubes and centrifuge for 40 min at 40,000 × g at 4 °C
with no brake.
23. Mitochondria should form a light yellow/grey band low in
the tube (Fig. 2a).
24. Aspirate all solution 2 cm above the mitochondrial band and
divide the remaining solution containing mitochondria into
four tubes, filling each with 1× wash buffer. Centrifuge for
15 min at 31,000 × g at 4 °C with light brake (see Note 14).
25. Aspirate the supernatant off, pool all four mitochondrial pel-
lets into two tubes, and add 1× wash buffer. Centrifuge at
18,000 × g for 15 min with soft brakes.
26. Aspirate supernatant off and remove the mitochondrial pellets
in a minimum volume using a Pasteur pipette. Place the mito-
chondria into a 1.5-mL tube and keep on ice or store at −80 °C.
3.3 Mitochondrial This protocol is used for the isolation of intact mitochondria from
Isolation: Arabidopsis cell cultures and adapted from [7]. All procedures are
Discontinuous Density to be carried out at 4 °C.
Gradients 1. Filter 1 L of 7-day-old cell culture through four layers of
Miracloth. This should yield about 100 g of cells.
2. Add 300 mL of grinding solution to the blender, add cells,
and blend five times with 4-s bursts with 10-s intervals.
3. Filter the solution through four layers of Miracloth into a 500-
mL conical flask.
4. Decant the cell extract into 50-mL tubes and centrifuge at
3,500 × g for 5 min.
5. Decant supernatant into new tubes and centrifuge at 18,000 × g
for 15 min.
6. Prepare two Percoll gradients by layering 20 mL of 21 % (v/v)
Percoll gradient solution over 5 mL of 40 % (v/v) Percoll gradi-
ent solution, and layering 10 mL of 16 % (v/v) Percoll gradient
solution on the top; keep the gradients on ice (see Note 15).
a Continuous density gradient
b Dis-continuous density gradient
16%
21%
40%
c Dis-continuous density gradient
16%
21%
40%
Fig. 2 Example of Percoll density gradients for the purification of mitochondria.

(a) Continuous density gradient for Arabidopsis seedling and rice hypocotyl and
seedling tissues. (b) Discontinuous density gradient for Arabidopsis cell suspen-
sion. (c) Discontinuous density gradient for rice embryo and coleoptiles. A model
and photo of the banding patterns obtained following centrifugation. The posi-
tions of the mitochondrial bands are indicated with an arrow
7. Discard the supernatant and gently resuspend pellet with a

fine-hair paintbrush. Pool the pellets into two tubes, fill with
1× wash buffer, and centrifuge at 1,000 × g for 5 min.
8. Decant the supernatant into two new tubes and centrifuge at
15,000 × g for 15 min.
9. Aspirate or gently pour off the supernatant and resuspend

pellets in 2–3 mL of 1× wash buffer. Ensure that pellet is
resuspended thoroughly.
10. Layer the two pellets using a Pasteur pipette over two Percoll
gradients and centrifuge at 40,000 × g for 45 min without brake.
11. The mitochondrial band is located at the interface of the 21 %
(v/v) and 40 % (v/v) Percoll layers (Fig. 2b). Aspirate the
solution leaving 2 cm above the mitochondrial band and place
into a new 50-mL tube.
12. Add 1× wash buffer, divide evenly between four 50-mL tubes,
add 1× wash buffer, and centrifuge at 18,000 × g for 15 min
with light brakes (see Note 14).
13. Aspirate the supernatant off, pool all four mitochondrial pel-
lets into two tubes, and fill with 1× wash buffer. Centrifuge at
18,000 × g for 15 min with light brake.
14. Aspirate supernatant off and remove the mitochondrial pellets
in a minimum volume using a Pasteur pipette. Place the mito-
chondria into a 1.5-mL tube and keep on ice or store at −80 °C.
3.4 Mitochondrial The protocol is adapted from [8]. Embryos can be dissected from
Isolation: Rice imbibed rice grains following 12-h imbibition (Fig. 1). Rice grains
Embryos can be grown under anoxic or aerobic conditions. All procedures
are carried out at 4 °C.
1. Dissect embryos from at least 200 rice grains using scalpel at
room temperature.
2. Grind the embryos in a small precooled mortar and pestle
using 3 mL of grinding buffer and transfer to a chilled micro-
centrifuge tube.
3. Centrifuge at 200 × g for 1 min at 4 °C. Remove the superna-
tant and gently layer onto the layered Percoll step gradients
(1.5 mL per gradient).
4. Centrifuge the gradients at 34,000 × g for 30 min at 4 °C with
the brakes off (see Note 16).
5. Mitochondria are visible as opaque bands at the 25–40 % (v/v)
interface (Fig. 2c). The mitochondrial layer is removed using
a flat-bottomed needle and transferred to a new 10-mL ultra-
centrifuge tube.
6. Add 1× wash buffer and centrifuge at 22,000 × g for 15 min
at 4 °C.
7. Aspirate the wash buffer and transfer the mitochondrial pellet
to a 1.5-mL microcentrifuge tube.
8. Add 1 mL 1× wash buffer, centrifuge at 200 × g for 1 min at
4 °C, transfer the supernatant (mitochondria) to a 1.5-mL
microcentrifuge tube, and centrifuge at maximum speed for
15 min at 4 °C.
9. Remove the supernatant and determine total protein concen-

tration of the mitochondrial pellet. Approximately 100–300 μg
of rice embryo mitochondrial protein should be obtained
using this protocol.
4 Notes
1. Larger and deeper plates are optimal to prevent MS media

drying out and to provide sufficient growth space for plants.
2. Manual removal of the rice grain husk is required to ensure
uniform germination.
3. Rice growth media can be made in large quantities with car-
benicillin added prior to use.
4. Air is bubbled beneath the growth media surface.
5. Alternative materials such as disposable polypropylene
stretcher sheets may be used (Medirite, Australia).
6. Certain downstream applications require the omission of BSA
from the wash buffer in the final wash step.
7. Gradients are prepared by overlaying 2 mL each of 40 % (v/v),
25 % (v/v), and 15 % (v/v) Percoll solutions slowly in a 10-mL
ultracentrifuge tube, being careful not to disturb the inter-
faces and layers.
8. If sterilizing overnight prepare 1.5 % (v/v) concentrated HCl
in sodium hypochlorite.
9. For even distribution of seed, which is required for optimal
growth, sprinkle seed by piercing several holes into the lid of
the microcentrifuge tube and shake over the agar plate.
10. Condensation can easily occur if plates are overheated or
inadequate ventilation is provided.
11. Test that solution is not dripping from the tube outlets with water.
12. The gradients can be prepared during the first 20-min
centrifugation.
13. A small amount of fine sand can be used for fibrous material
such as rice shoots.
14. It is essential to use at least four tubes for this wash step or else
the Percoll concentration is too high and the mitochondria
will fail to pellet.
15. Use a syringe and needle held up by a retort stand to prepare
the gradients with each Percoll mix being poured into the
syringe individually and allowed to run down the side of the
tube. Alternatively the gradients can be prepared by pipetting
though this needs to be done slowly and gently to ensure min-
imal disruption to the Percoll interfaces.
16. Light break may be applied.
References
1. Douce R, Moore AL, Neuburger M (1977) 5. Taylor NL, Stroher E, Millar AH (2014)
Isolation and oxidative properties of intact mito- Arabidopsis organelle isolation and characteriza-
chondria isolated from spinach leaves. Plant tion. Methods Mol Biol 1062:551–572
Physiol 60:625–628 6. Day DA, Neuburger M, Douce R (1985)
2. Eubel H, Heazlewood JL, Millar AH (2007) Biochemical-characterization of chlorophyll-free
Isolation and subfractionation of plant mito- mitochondria from pea leaves. Aust J Plant
chondria for proteomic analysis. Methods Mol Physiol 12:219–228
Biol 355:49–62 7. Millar AH, Sweetlove LJ, Giege P, Leaver
3. Millar AH, Liddell A, Leaver CJ (2007) Isolation CJ (2001) Analysis of the Arabidopsis mito-
and subfractionation of mitochondria from chondrial proteome. Plant Physiol 127:
plants. Methods Cell Biol 80:65–90 1711–1727
4. Neuburger M, Journet EP, Bligny R, Carde JP, 8. Howell KA, Millar AH, Whelan J (2006)
Douce R (1982) Purification of plant mitochon- Ordered assembly of mitochondria during rice
dria by isopycnic centrifugation in density gradi- germination begins with pro-mitochondrial
ents of Percoll. Arch Biochem Biophys 217: structures rich in components of the protein
312–323 import apparatus. Plant Mol Biol 60:201–223
Chapter 2
Determining Mitochondrial Transcript Termini for the Study

of Transcription Start Sites and Transcript 5′ End
Maturation
Stefan Binder and Kristina Kühn
Abstract
Mitochondrial gene expression in plants is considerably more complex than in animals or fungi. In plants,
mitochondrial transcripts are generated from transcription initiation at numerous, poorly conserved pro-
moters located throughout the mitochondrial genome. Most genes have more than one transcription start
site. Posttranscriptional RNA 5′ end maturation contributes to the diversity of transcripts produced from
each mitochondrial gene. Understanding transcriptional mechanisms and transcript maturation requires
knowledge on transcription start sites and processing sites. This chapter describes two different, comple-
mentary experimental approaches for determining these sites in mitochondrial genomes through mapping
of transcript 5′ ends. In order to distinguish 5′ ends deriving from transcription initiation, both strategies
exploit the presence of triphosphates at these specific 5′ termini.
Key words Mitochondrial RNA, Transcription initiation, Transcript 5′ end maturation, Primary
RNA, Processed RNA, Differential transcript 5′ end analysis, 5′-RACE, Primer extension
1 Introduction
Mitochondrial DNA in seed plants generally encodes up to 60

genes [1]. The expression of this genetic information is extraordi-
narily complex; it includes transcription and posttranscriptional
processes like RNA editing, group II intron splicing, and matura-
tion of 5′ and 3′ ends, as well as translation and most likely post-
translational steps [2]. While all of these processes potentially
influence gene expression, it is presently unknown how gene
expression is controlled or even regulated in plant mitochondria.
Further efforts are necessary to unravel the molecular mechanisms
of plant mitochondrial gene expression.
The steady-state level of a transcript is a major quantitative
determinant for the expression of the corresponding gene.
Principally, the abundance of an RNA molecule is adjusted by
two counterbalancing forces: the rate of RNA synthesis, i.e.,
James Whelan and Monika W. Murcha (eds.), Plant Mitochondria: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology,
vol. 1305, DOI 10.1007/978-1-4939-2639-8_2, © Springer Science+Business Media New York 2015
13
14 Stefan Binder and Kristina Kühn
transcription, and the rate of RNA degradation. In plant mito-

chondria, posttranscriptional modifications that can influence the
stability of an RNA molecule are prevailing processes.
One or two bacteriophage-type RNA polymerases accomplish
transcription in plant mitochondria [3]. These enzymes start RNA
synthesis from loosely conserved promoters, and at least in vitro
additional factors are not required for promoter recognition [2,
4–7]. Nevertheless, it is likely that in vivo one or several additional
factors are involved in transcription initiation. To further charac-
terize the initiation mechanism and proteins involved in this pro-
cess, transcription initiation sites have to be identified. These sites
coincide with the 5′ termini of primary RNAs and can thus be
identified by mapping primary transcript 5′ ends, which are charac-
terized by the presence of 5′ triphosphates (Fig. 1). This feature
discriminates primary 5′ termini from 5′ ends that are posttran-
scriptionally generated and carry 5′ monophosphates. To date, the
contributions of individual posttranscriptional processes to the sta-
bility of an RNA species are unknown. It appears though that for-
mation of mature 3′ ends is tightly linked to transcript stability. For
instance, the pentatricopeptide repeat (PPR) protein MTFS1 binds
to the 3′-terminal part of the nad4 mRNA [8]. It is assumed that
this prevents progression of one or two 3′–5′ exoribonucleases,
thereby determining the mature 3′ extremity [9, 10]. In addition,
3′ poly(A) tracts have a profound influence on transcript stability.
It has recently been found that oligo(A) tails, added by the poly(A)
polymerase AGS1, target mitochondrial RNA for degradation by
the a poly(A)-specific ribonuclease AHG2 [11].
A completely different mechanism generates the mature 5′ ter-
mini of plant mitochondrial RNAs. Unlike 3′ termini, 5′ ends are gen-
erated by endonucleolytic cleavage. Several RNA PROCESSING
FACTORS, all of them PPR proteins, have been identified and
were found to be required for the processing of one or several tran-
scripts. Furthermore, proteins involved in 5′ processing are still
unknown, and the importance of this maturation step for transcript
stability and translation awaits clarification [12].
In this chapter we describe principal methods for RNA isola-
tion and the identification of transcript 5′ termini, which have been
optimized for the model organism Arabidopsis (Arabidopsis thali-
ana) but can be applied to other plant species. Special emphasis is
laid on methods to distinguish between primary 5′ ends that origi-
nate from transcription initiation and secondary 5′ termini that are
posttranscriptionally generated. The experimental discrimination
between these ends depends on the presence of triphosphate
groups at the primary 5′ ends. Two different approaches can be
used for the identification of primary 5′ termini. One of these strat-
egies involves the enzyme tobacco acid pyrophosphatase (TAP)
and a differential 5′-RACE protocol (Subheading 3.2) [13]. An
Mapping Transcriptional Start Sites in Plant Mitochondria 15
Fig. 1 Transcription initiation from mitochondrial promoters (top, promoter as

bent arrow) generates primary transcript with 5′ triphosphates, whereas pro-
cessing of these transcripts (5′ processing site as black triangle, 3′ processing
site as white triangle) produces 5′ monophosphorylated transcripts. Differential
5′-RACE uses the enzyme TAP to discriminate between primary and processed
5′ ends. Transcripts are exposed to TAP to convert 5′ triphosphates to mono-
phosphates (left), or not treated with TAP in a control experiment (right). An oli-
goribonucleotide adapter (grey box) is then ligated to the 5′ monophosphate
ends, and cDNA (grey dashed lines) is synthesized using a primer complemen-
tary to the gene of interest (small grey arrows). Reverse-transcribed ligation
products are amplified using a forward primer annealing to the linker sequence
and a gene-specific reverse primer (small black arrows). RT-PCR products are
analyzed by agarose gel electrophoresis, and products derived from primary
transcripts (band indicated by an asterisk) are preferentially or exclusively ampli-
fied from TAP-treated samples
alternative strategy uses Terminator™ 5′-Phosphate-Dependent

Exonuclease (TEX) (Subheading 3.3) combined with methods for
5′ end quantitation, such as primer extension (Subheading 3.4).
Recent genome-scale transcriptomic studies on bacteria or chloro-
plasts combined TEX application with RNA sequencing for the
genome-wide identification of transcription start sites [14–16].
The 5′-RACE strategy described under Subheading 3.2 for the

mapping of mitochondrial primary transcript 5′ ends involves an
initial treatment of total RNA with TAP (Fig. 1). This treatment
will remove a pyrophosphate moiety from primary transcript 5′
ends, thus converting them to 5′ monophosphorylated molecules.
This step is a prerequisite for the subsequent 5′ adapter ligation
(see Note 1) to primary transcripts and amplification of 5′ ends by
reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) with
adapter- and gene-specific primers (Fig. 1). Adapter ligation to
processed 5′ ends does not require TAP treatment. Accordingly,
5′-RACE preceded by TAP treatment will amplify both primary
and processed 5′ ends whereas 5′-RACE performed on untreated
RNA will only capture processed 5′ ends. The comparison of
5′-RACE products obtained from TAP-treated or untreated RNA
will thus identify primary transcripts, which are exclusively or pref-
erentially amplified following TAP treatment (Fig. 1, see Note 2).
Subsequent cloning of 5′-RACE products and sequencing across
adapter ligation sites will determine transcript 5′ ends.
TEX used by the alternative strategy described under
Subheadings 3.3 and 3.4 is a 5′–3′ exonuclease that digests RNA
molecules with 5′ monophosphate ends. The enzyme does not
degrade RNAs that have 5′ triphosphates, 5′ caps, or 5′ hydroxyl
groups. Thus, TEX can be used to specifically enrich mitochondrial
transcripts carrying 5′ triphosphates, which derive directly from
transcription initiation.
For the identification of enriched (primary) or reduced (pro-
cessed) 5′ termini it will be necessary to combine TEX treatment
with a downstream procedure that allows the quantitative compari-
son of transcript termini between TEX-treated and untreated RNA
preparations. The primer extension analysis protocol described
under Subheading 3.4 has successfully been applied in previous
studies for the identification of transcript 5′ ends enriched by TEX
treatment [17, 18]. In contrast, we found that RT-PCR-based
methods [e.g., 5′-RACE or circularized RNA-reverse transcription-
polymerase chain reaction (CR-RT-PCR), Subheading 3.2] were
not suitable.
The RNA preparation method described under Subheading 3.1
is based on acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform
extraction [19]. Unlike procedures using RNA binding to and sub-
sequent elution from silica-based membranes, this method does not
exclude the recovery of small RNAs. Earlier experimental studies of
mitochondrial transcripts were done with RNA extracted from iso-
lated mitochondria [20, 21]. However, the downstream procedures
described under Subheadings 3.2 and 3.4 can be performed on
total cellular RNA. While chromosome 2 of the Arabidopsis nuclear
genome contains a large mitochondrial DNA insertion [22], it is
generally assumed that this part of the nuclear genome does not
contribute to transcripts measured for mitochondrial genes.
2 Materials
To avoid RNA degradation, ensure to use ribonuclease-free mate-

rials and solutions. Reaction tubes should be nuclease-free and
nucleic acid-free. All described procedures require the use of ultra-
pure water (double-distilled and autoclaved, or Milli-Q quality,
i.e., deionized, resin-filtered, and passed through a 0.22-μm mem-
brane filter) for setting up enzymatic reactions or preparing solu-
tions. Clean gloves should be worn at all times.
2.1 RNA Isolation 1. Refrigerated microcentrifuge.

and DNase Treatment 2. Bead mill (e.g., TissueLyser II from QIAGEN), including
2.1.1 Equipment adapters for 1.5–2.0-mL reaction tubes and stainless steel
beads (5 mm diameter, available from QIAGEN).
3. Ultraviolet-visible spectrophotometer (e.g., Nanodrop).
4. Electrophoresis chamber for horizontal agarose gel electro-
phoresis with gel tray, comb, and power supply.
5. Ultraviolet transilluminator.
6. Dewar flask for liquid nitrogen.
2.1.2 Materials, 1. Liquid nitrogen.

Reagents, and Solutions 2. Reaction tubes (1.5 and 2.0 mL).
3. Reagent for acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform
extraction (e.g., TRIsure™ from Bioline, or TRIzol® from Life
Technologies).
4. Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1), pH 5.0.
5. Chloroform.
6. Isopropanol.
7. Ethanol/3 M sodium acetate, pH 4.8 (30:1).
8. 70 % (v/v) ethanol.
9. RQ1 RNase-free DNase (Promega).
10. Materials and buffers for horizontal agarose gel
electrophoresis.
2.2 Tobacco Acid 1. Refrigerated microcentrifuge.

Pyrophosphatase 2. 37 °C incubator.
Treatment of RNA
3. PCR cycler.
and Differential
5′-RACE 4. Electrophoresis chamber for horizontal agarose gel electro-
phoresis with gel tray, comb, and power supply.
2.2.1 Equipment
5. Ultraviolet transilluminator.
2.2.2 Materials, 1. Reaction tubes (1.5 mL).

Reagents, and Solutions 2. PCR tubes (0.2 mL).
5. Ethanol/3 M sodium acetate, pH 4.8 (30:1).
7. TAP (Epicentre Biotechnologies).
8. T4 RNA ligase (Epicentre Biotechnologies).
9. SuperScript® III reverse transcriptase (Life Technologies).
10. RiboLock™ RNase inhibitor (Thermo Scientific).
11. Taq DNA polymerase (e.g., DreamTaq from Bioline).
12. Oligoribonucleotide adapter (5′-GAU AUG CGC GAA UUC
CUG UAG AAC GAA CAC UAG AAG AAA-3′, 10 pmol/μL).
13. RT oligonucleotide mix (Subheading 3.2), containing up to
12 different gene-specific primers (2 μM each).
14. Adapter-specific forward primer (5′-CGA ATT CCT GTA
GAA CGA ACA CTA GAA G-3′).
15. Gene-specific reverse primers (Subheading 3.2).
16. dNTP mix (10 mM each dATP, dGTP, dCTP, and dTTP).
17. PCR product gel extraction kit (e.g., NucleoSpin® Gel and
PCR Clean-up from Macherey-Nagel).
18. PCR cloning kit including vector and DNA ligase (e.g.,
pGEM®-T Vector System I from Promega).
19. Vector-specific primers for PCR amplification of cloned
5′-RACE products (e.g., 5′-ACG ACG TTG TAA AAC GAC
GG-3′ and 5′-TTC ACA CAG GAA ACA GCT ATG AC-3′
when using pGEM®-T as cloning vector).
20. Chemically competent Escherichia coli cells (e.g., DH5α).
21. LB-agar plates with the antibiotic specified by the PCR clon-
ing vector.
22. Materials and buffers for horizontal agarose gel
electrophoresis.
2.3 Terminator™ 1. Reaction tubes (1.5 mL).

5′-Phosphate- 2. TEX, Epicentre Biotechnologies.
Dependent
Exonuclease
Treatment 4. Phenol-chloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, pH 5.0.
(TEX) of RNA 5. Chloroform-isoamyl alcohol 24:1.
6. 3 M Sodium acetate, pH 4.8.
7. 100 % Ethanol.
9. 60 °C Incubator.
10. Refrigerated microcentrifuge.
2.4 Primer Extension 1. Reaction tubes (1.5 mL).

Analysis 2. T4 polynucleotide kinase (PNK) and 10× T4 PNK buffer A
2.4.1 Oligonucleotide 5′ (Thermo Scientific).
End Labeling 3. Oligonucleotide (20 μM).
4. [γ-32P] ATP (10 μCi/μL) (Hartmann Analytic).
5. NAP-5 columns (GE Healthcare).
6. 37 °C Incubator.
7. Liquid scintillation counter (e.g., Tri-Carb 2800TR from
Perkin Elmer).
2.4.2 Primer Extension 1. Reaction tubes (1.5 mL).

Reaction 2. Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT)
RNase (H-) point mutant and 5× reaction buffer (Promega).
4. dNTP mix (10 mM each dATP, dGTP, dCTP, and dTTP).
5. 1 M NaOH.
6. 1 M HCl.
7. Gen Elute™ PCR Clean-Up Kit (Sigma).
8. SpeedVac vacuum concentrator.
9. 72 °C/45 °C incubator or heating block.
10. Microcentrifuge.
2.4.3 Polyacrylamide Gel 1. Glass plates, 0.2-mm spacer, and comb.

Electrophoresis 2. Vertical electrophoresis chamber for polyacrylamide gel elec-
trophoresis (PAGE).
3. 40 % (w/v) Acrylamide stock solution (acrylamide/bisacryl-
amide 19:1).
4. Urea.
5. 10× TBE buffer (890 mM Tris-borate, 890 mM boric acid,
20 mM EDTA).
6. N,N,N′,N′-Tetramethylenediamine (TEMED).
7. 10 % (w/v) Ammonium persulfate (APS).
8. 3× PAGE sample solution [98 % (w/v) deionized formamide,
10 mM EDTA, a pinch of bromophenol blue, and a pinch of
xylene cyanol].
9. pGEM® DNA Marker (Promega).
10. Whatman® 3MM paper.
3 Methods
3.1 RNA Isolation It is important that all steps from tissue harvesting to TRIsure addi-
and DNase Treatment tion are performed rapidly, to avoid RNA degradation by ribonucle-
ases present in the plant tissue. The tissue must remain deep-frozen
between harvesting and TRIsure addition. All centrifugation steps
are to be performed at 4 °C. Handle phenol-containing reagents
and samples under a fume hood, and avoid contaminating gloves and
equipment with traces of phenol (see Note 3). Steps 1–5 will pro-
duce RNA that is sufficiently pure for many applications; however,
for downstream applications described under Subheadings 3.2 and
3.4, we recommend further purification of the RNA as described in
steps 6–15.
1. Harvest and transfer 100 mg of the tissue of interest into a
2-mL microcentrifuge tube containing one stainless steel
bead. Close the tube tightly and rapidly snap-freeze the sam-
ple by transferring the tube into liquid nitrogen (see Note 4).
2. For tissue grinding using the bead mill, place the tube into a
suitable precooled (−80 °C) tube holder and grind at 20 Hz
for 1 min. Verify that the tissue has been thoroughly ground
and a fine powder has been obtained; put the tube back into
liquid nitrogen. If regrinding is required, ensure that the tis-
sue, tube, and tube holder remain deep-frozen.
3. Remove the sample tube from liquid nitrogen and briefly
shake the tube to collect all tissue powder at the bottom of the
tube. Add 1 mL TRIsure reagent to the frozen tissue powder
and mix the contents thoroughly during 30 s, using a vortex
mixer at high speed. Leave the sample at room temperature
for 5 min; then add 200 μL of chloroform. Following chloro-
form addition, keep the tube at room temperature for 2 min.
Centrifuge the sample at 12 000 × g for 15 min.
4. Transfer the upper, RNA-containing aqueous phase into a new
1.5-mL microcentrifuge tube. Add 0.5 volume of isopropa-
nol, mix, and incubate the sample on ice for 15 min in order
to precipitate the RNA. Centrifuge the sample at 12 000 × g
for 15 min to collect the precipitated RNA.
5. Wash the RNA pellet with 70 % (v/v) ethanol, recentrifuge
the sample at 12 000 × g for 5 min, carefully remove all etha-
nol, and air-dry the pellet at room temperature (see Note 5).
Dissolve the RNA in 200 μL of ultrapure water (see Note 6).
6. Add 200 μL of phenol-chloroform-isoamyl alcohol, pH 5.0,
mix the contents of the tube using a vortex mixer at medium
speed three times for 3 s, and centrifuge the sample at
12,000 × g for 8 min.
7. Transfer the upper, RNA-containing aqueous phase into a new

1.5-mL microcentrifuge tube, and repeat the phenol-
chloroform-isoamyl alcohol extraction and centrifugation.
8. Transfer the upper phase into a new 1.5-mL microcentrifuge
tube, add 200 μL of chloroform, and mix the contents of the
tube in order to remove traces of phenol from the sample.
Centrifuge the sample at 12,000 × g for 8 min.
tube. To precipitate the RNA, add 3 volumes of ethanol/3 M
sodium acetate, pH 4.8 (30:1) and leave the sample at −20 °C
for at least 1 h (preferably overnight). Collect the RNA by
centrifugation (20,000 × g for ≥30 min).
10. Wash the pellet with 70 % (v/v) ethanol, recentrifuge the sam-
ple at 12,000 × g for 5 min, carefully remove all ethanol, and
air-dry the pellet at room temperature (see Note 5). Once all
ethanol has evaporated, resuspend the pellet in 30–60 μL of
ultrapure water to obtain an RNA solution at a concentration
of 0.5–2 μg/μL.
11. Use an ultraviolet-visible spectrophotometer to determine the
concentration and purity of the RNA (see Note 7).
12. Treat an aliquot of the RNA with DNase I to remove residual
genomic DNA (see Note 8). In a 1.5-mL reaction tube, mix
15 μg RNA, 10 μL RQ1 DNase (10 U), 10 μL 10× RQ1 reac-
tion buffer (supplied with the enzyme), and ultrapure water to
obtain a final volume of 100 μL. Incubate the reaction at
37 °C for 45 min, then add another 5 μL RQ1 DNase (5 U),
and keep the reaction at 37 °C for another 45 min. Stop the
reaction by adding 100 μL of phenol-chloroform-isoamyl
alcohol, pH 5.0, mix the contents of the tube using a vortex
mixer at medium speed three times for 3 s, and centrifuge the
sample at 12,000 × g for 8 min.
tube, add 100 μL of chloroform, and mix the contents of the
tube in order to remove traces of phenol from the sample.
Centrifuge the sample at 12,000 × g for 8 min.
for at least 1 h (preferably overnight). Collect the RNA by
centrifugation (20,000 × g for ≥30 min).
15. Wash the pellet with 70 % (v/v) ethanol, recentrifuge the sam-
ple at 12,000 × g for 5 min, carefully remove all ethanol, and
air-dry the pellet at room temperature (see Note 5). Once all
ethanol has evaporated, resuspend the pellet in 20 μL of ultra-
pure water to obtain an RNA solution at a concentration of
0.5–0.7 μg/μL.
16. Use an ultraviolet-visible spectrophotometer to determine the

concentration and purity of the RNA. Inspect the RNA qual-
ity by horizontal non-denaturing agarose gel electrophoresis,
using a 1.2 % (w/v) agarose gel and 1× TAE as running buffer.
The RNA can be used immediately for downstream proce-
dures or stored at −80 °C.
3.2 TAP Treatment 1. In a 1.5-mL reaction tube, mix 5 μg RNA, 10 μL 10× TAP
of RNA and Differential reaction buffer (supplied with the TAP enzyme), 2 μL TAP
5′-RACE (10 U), 1 μL RiboLock RNase inhibitor (40 U), and ultrapure
water to obtain a final volume of 100 μL. In a second tube, set
up a control reaction with the same components but omitting
the TAP enzyme. All subsequent steps will be performed simul-
taneously for both the +TAP and the −TAP sample. Incubate
the reaction at 37 °C for 1 h, and then stop the reaction by
adding 100 μL of phenol-chloroform-isoamyl alcohol, pH 5.0.
Mix and centrifuge the samples at 12,000 × g for 8 min.
overnight. Collect the RNA by centrifugation (20,000 × g for
≥30 min). Wash the pellet with 70 % (v/v) ethanol, recentri-
fuge the sample at 12,000 × g for 5 min, carefully remove
all ethanol, and air-dry the pellet at room temperature
(see Note 5). If highly pure RNA was used, the RNA pellet
may not be visible at this step.
3. Resuspend the pellet in 67 μL of ultrapure water. Add to the
RNA 10 μL 10× T4 RNA ligase reaction buffer (supplied with
the T4 RNA ligase enzyme), 10 μL T4 RNA ligase (50 U),
10 μL ATP (10 mM, supplied with the enzyme), 2 μL
RiboLock RNase inhibitor (80 U), and 1 μL oligoribonucleo-
tide adapter (10 pmol/μL) to obtain a final volume of
100 μL. Incubate the reaction at 37 °C for 1 h, and then stop
the reaction by adding 100 μL of phenol-chloroform-isoamyl
alcohol, pH 5.0. Mix and centrifuge the samples at 12,000 × g
for 8 min.
4. Repeat step 2.
5. Resuspend the pellet in 29.5 μL ultrapure water. Transfer the
RNA into a PCR tube and add 1 μL of preprepared RT oligo-
nucleotide mix (see Note 9), containing up to 12 different
gene-specific primers (2 μM each). Denature the RNA and
primers at 65 °C for 5 min, and then immediately place the
tubes on ice for 2 min. Add 2.5 μL of SuperScript® III reverse
transcriptase (600 U), 10 μL 5× reaction buffer (supplied with
the enzyme), 2.5 μL 0.1 M dithiothreitol (DTT, supplied with
the enzyme), 2.5 μL dNTP mix (10 mM each dATP, dGTP,
dCTP, and dTTP), and 2 μL RiboLock RNase inhibitor

(80 U) to obtain a final volume of 50 μL. In a PCR cycler,
allow reverse transcription to proceed at 53 °C for 1 h; then
inactivate the reaction through incubation at 70 °C for 15 min.
6. Add 50 μL of ultrapure water to the reaction and extract the
cDNA with 100 μL of phenol-chloroform-isoamyl alcohol,
pH 8. Mix and centrifuge the samples at 12 000 × g for 8 min.
7. Repeat step 2.
8. Dissolve the cDNA in 20 μL ultrapure water.
9. The products of reverse transcription are amplified in a first
PCR step, using 1 μL of the cDNA as template, the adapter-
specific forward together with a gene-specific reverse primer
(Fig. 1 and see Note 10), and a standard Taq DNA polymerase
(use according to the supplier’s instructions).
10. Products amplified in the first PCR can be used as template for
subsequent nested PCRs, using the adapter-specific forward
primer and reverse primers annealing upstream of the first
PCR reverse primer (see Note 10). Use a standard Taq DNA
polymerase (according to the supplier’s instructions) and
0.05–1 μL of the first PCR reaction as template.
11. RT-PCR products are analyzed by electrophoresis on 3 %
(w/v) agarose gels (see Note 11), using 1× TAE as running
buffer. Bands seen for +TAP and −TAP samples are excised
from the gel and purified using a commercially available PCR
product gel extraction kit (follow the supplier’s instructions).
12. Ligate the purified products into a PCR cloning vector (set up
the ligation reaction according to the supplier’s instructions).
Use the ligation reactions to transform chemically competent
Escherichia coli cells, and grow transformants on LB-agar
plates containing the antibiotic specified by the PCR cloning
vector. One bacterial colony will correspond to one mitochon-
drial transcript molecule.
13. Amplify the cloned RT-PCR fragments by colony PCR, using
a standard Taq DNA polymerase (following the supplier’s
instructions) and vector-specific primers flanking the insert.
Use 1/10 of a colony PCR reaction for agarose gel electro-
phoresis, in order to confirm the insert size.
14. Transcript 5′ ends are identified by sequencing across adapter-
transcript ligation sites (refer to a company providing standard
DNA sequencing services). Per RT-PCR fragment, analyze
the sequence of at least eight clones (equal to eight different
colony PCR products). For heterogeneous or ambiguous
transcript 5′ ends (see Note 2), sequencing of up to 40 clones
for each +TAP and −TAP samples may be necessary to identify
primary transcript 5′ ends.
3.3 Terminator™ 1. Prepare total cellular RNA from appropriate plant tissues as
5′-Phosphate- described under Subheading 3.1 or with the Spectrum Plant
Dependent Total RNA Kit (Sigma). Generally, any RNA isolation proce-
Exonuclease dure can be used; however, special care should be taken to mini-
Treatment mize degradation of the RNA by contaminating ribonucleases.
(TEX) of RNA 2. For exonucleolytic digestion, add the following components
to a total volume of 20 μL: 10 μg RNA in 16.5 μL ultrapure
water, 2 μL 10× TEX reaction buffer A (supplied with the
enzyme), 0.5 μL RiboLock RNase inhibitor (20 U), and 1 μL
TEX (1 U) (see Note 12).
3. Mix gently and incubate for 30 min at 60 °C.
4. Add 180 μL of ultrapure water to adjust the total volume to
200 μL.
5. Add 200 μL of phenol-chloroform-isoamyl alcohol, pH 5.0,
and mix on a vortex mixer.
6. Centrifuge the sample at 16,700 × g for 5 min at room
temperature.
7. Carefully remove the upper aqueous layer (about 190 μL) and
transfer into a new 1.5-mL reaction tube. Add 200 μL of
chloroform-isoamyl alcohol (24:1) and mix the contents of
the tube in order to remove traces of phenol from the sample.
Centrifuge the sample at 16,700 × g for 5 min at room
temperature.
8. Repeat step 7.
9. Finally remove the upper aqueous layer (about 190 μL) and
transfer into a new 1.5-mL reaction tube. To precipitate the
RNA, add 0.1 volume of 3 M sodium acetate, pH 4.8, and 2.5
volumes of 100 % ethanol.
10. Mix gently and incubate for 30 min at −80 °C (or overnight at
−20 °C).
11. Centrifuge the sample at ≥16,700 × g for 30 min at 4 °C.
12. Discard the supernatant and wash the pellet twice with 400 μL
70 % (v/v) ethanol.
13. Dry the pellet at room temperature and resuspend in 16 μL
ultrapure water.
14. The RNA can now be used for the primer extension reaction
(Subheading 3.4).
3.4 Primer Extension 1. For the radioactive labeling of the primer, combine the follow-
Analysis ing components to a total volume of 20 μL: 1 μL 20 μM oli-
gonucleotide, 13 μL ultrapure water, 3 μL [γ-32P] ATP
3.4.1 Oligonucleotide 5′
(10 μCi/μL), 2 μL 10× T4 PNK buffer A (supplied with the
End Labeling
PNK enzyme), and 1 μL PNK (10 U) (see Note 3).
2. Mix gently and incubate for 60 min at 37 °C.
3. Meanwhile prepare a NAP-5 column by adding twice 500 μL

of ultrapure water. Discard the eluate.
4. Add 480 μL of ultrapure water to the PNK reaction and load
the complete mixture onto the NAP-5 column.
5. Discard the flow-through, which contains non-incorporated
[γ-32P] ATP.
6. Add another 500 μL of ultrapure water onto the column and
collect the eluate, which contains the labeled primer.
7. Use a scintillation counter to measure the incorporation of
[γ-32P] ATP. Approximately 200,000–300,000 cpm in 10 μL
of the eluate is appropriate. The labeled oligonucleotide is
now ready to be used in the primer extension reaction.
3.4.2 Primer Extension 1. Primer extension analysis of distinct mitochondrial transcripts

Reaction can be carried out with total cellular RNA or with mitochon-
drial RNA preparations. Depending on the levels of individual
transcripts, 25–50 μg of total RNA or 4–8 μg of mitochondrial
RNA is used per reaction.
2. The extension reaction (i.e., single-strand DNA synthesis) is
performed in a final volume of 25 μL. Mix 16.25 μL RNA in
ultrapure water with 2 μL of labeled primer (300,000–
450,000 cpm, see Note 13).
3. Incubate for at least 5 min at 72 °C and subsequently keep the
sample on ice.
4. Add 5 μL 5× M-MLV RT reaction buffer (supplied with the
enzyme), 0.75 μL RiboLock™ RNase inhibitor (30 U), and
1 μL M-MLV RT (H-) (200 U).
5. Mix gently with a pipette and incubate for at least 60 min at
45 °C. Meanwhile prepare a column of the Gen Elute™ PCR
Clean-Up Kit (see step 8).
6. Stop the cDNA synthesis by adding 5 μL 1 M NaOH. Keep
the reaction for 10 min at room temperature.
7. Add 5 μL 1 M HCl.
8. For purification of the extension products with the Gen
Elute™ PCR Clean-Up Kit, insert the spin column into the
provided collection tube. Add 500 μL column preparation
solution (supplied with the kit) and spin for 30 s at 12,000 × g.
Discard the eluate.
9. Add 5 volumes of the binding solution (supplied with the kit)
to 1 volume of the extension reaction, mix with the pipette,
and load onto the column.
10. Spin for 1 min at 12,000 × g and discard the eluate, but retain
the collection tube.
Another random document with
no related content on Scribd:
VIII.
Seuraavana aamuna kreivitär oli hyvin sairas, ja Roma meni heti

hänen luokseen. Huone oli täynnä hyvää tuoksua, ja sairas vaimo
vääntelehti tuskissaan puristaen kädellään kylkeään ja valitellen
kärsimättömästi.
»Minun täytyy saada tohtori», sanoi hän. »On sydämetöntä, ettei

ennen ole haettu tohtoria.»
»Täti Betsy», sanoi Roma, »tiedäthän hyvin, että aikoja sitten olisi
tuotu tohtori tänne, ellet aivan jyrkästi olisi sitä kieltänyt.»
»Älä herran tähden nyt taas toru, vaan lähetä heti hakemaan
tohtoria.
Minä tahdon tohtori Fedin, sillä kaikki käyttävät nykyjään häntä.»
Fedi oli paavin henkilääkäri ja siitä syystä kallein muotilääkäri koko

Roomassa.
Tohtori Fedi tuli apulaisen kanssa, joka kantoi pientä

instrumenttilaatikkoa. Hän tutki kreivittään rintaa, kylkeä, kainalon
alla olevia rauhasia, työnsi alahuulensa pitkälle, pisti kaksi sormea
kauluksensa väliin, käänsi päätään oikealle ja vasemmalle sekä
ilmoitti, että kreivittärelle oli heti hankittava erityinen sairaanhoitaja.
»Etkö kuule, Roma? Tohtori sanoo, että minulle pitää heti hankkia
sairaanhoitaja. Minä tahdon englantilaisen sisaren. Jokaisella on niitä
tätä nykyä. He ovat muukalaisia eivätkä voi puheillaan aikaansaada
hämmennystä.»
Sisar haettiin. Hän oli lempeä ja vieno olento ja hänellä oli yllään
sinivalkoinen puku, mutta hän puhui yhtämittaa »johtajatar-äidistä»,
joka hymyili koko päivän, vaikka oli ollut vuoteen omana viisitoista
vuotta. Tuo kiusasi kreivitärtä. Kun tohtori palasi, oli sairas
huonompi.
»Sairaalle tulee hankkia herkkuruokia, jotka kiihoittavat hänen

ruokahaluaan ja antavat hänelle voimia.»
»Kuuletko, Roma?»
»Koetan hankkia kaiken mitä tahdot, täti-kulta.»
»Hyvä. Minä tahdon mansikoita. Jokainen syö niitä sairastaessaan

tähän vuoden aikaan.»
Roomassa ei ollut muita mansikoita kuin kasvihuoneissa

kasvatettuja ja ne olivat siitä syystä kalliita.
»Sitä ei voi kestää kauan», sanoi tohtori syrjässä. »Tädillänne on

sisällinen syöpä. Jos se olisi ajoissa tutkittu, olisi leikkaus ollut
mahdollinen, nyt ei lääkäritaito enää voi auttaa.»
Mansikat ostettiin, mutta kreivitär tuskin koskikaan niihin, ja

lopulta ne syötiin keittiössä.
Kun tohtori saapui kolmannen kerran, oli kreivitär hyvin nääntynyt,
ja hänen ihonsa oli kuopalla ja harmaa.
»En menettelisi oikein, jos salaisin teiltä tilanne vaarallisuuden,

kreivitär», sanoi tohtori. »Semmoisissa tapauksissa on mielestäni
aina parasta, että sairas sovittaa asiansa Jumalan kanssa.»
»Oh, älkää puhuko noin, tohtori», valitteli kurja, kuihtunut olento

vuoteellaan.
»Mutta tiedättehän, että niin kauan kuin on henkeä, on toivoa, ja

nyt lähetän teille hiukan oopiumia tuskan lievitykseksi.»
Kun tohtori oli mennyt, lähetti kreivitär hakemaan Romaa.
»Tuo Fedi on hullu», sanoi hän. »En ymmärrä miksi ihmiset häntä
kehuvat. Tahtoisin koettaa Ara Cœlin ihmeitätekevää pyhää lasta. Se
tuotiin erään kardinaalinkin luo. Miksei siis minun luokseni?
Sanotaan, että se on tehnyt ihmeitä. Se on ehkä kallis, mutta jos
kuolen, kadut aina ellet tuottaisi sitä. Ellei sinulla ole rahaa, voit
kirjoittaa kuuden kuukauden vekselin, ja sitä ennen tuo mielipuoli-
raukka on kuollut ja sinä olet paronin vaimo ja…»
»Jos todellakin luulet, että pyhä lapsi voi…»
»Se voi auttaa! Tiedän sen varmaan.»
»Hyvä! Lähetän hakemaan sitä.»
Roma kirjoitti kirjeen fransiskaanien johtajalle Ara Cœlin luostariin

pyytäen, että pieni Kristuksen kuva, jonka sanottiin parantavan
sairaita, lähetettäisiin hänen kuolemaisillaan olevan tätinsä luo.
Samalla hän kirjoitti Via due Macellin varrella asuvalle
huutokaupantoimittajalle pyytäen häntä luokseen. Mies tuli heti.
Hänellä oli pienet kiiluvat silmät, jotka vilkuilivat ympäri huonetta ja
näyttivät katselevan kaikkea paitsi Romaa.
»Tahtoisin myydä huonekaluni», sanoi Roma.
»Kaikkiko?»
»Kaikki, paitsi mitä on tätini ja hänen hoitajansa huoneessa ja

paitsi sellaisia keittiössä ja palvelijain huoneissa sekä omassa
makuusuojassani olevia esineitä, jotka ovat aivan välttämättömiä
nykyisessä asemassani.»
»Hyvä on. — Koska?»
»Viikon kuluessa, jos se on mahdollista.»
Pyhä lapsi tuotiin kahden hevosen vetämissä vaunuissa, ja kansa

kadulla lankesi polvilleen sen kulkiessa ohi. Yksi munkeista puettuna
messupukuun kantoi sitä laatikossa, jonka kansi oli auki, ja kaksi
ruskeapukuista munkkia kulki edellä kynttilät kädessä.
Mutta kun tuo muumiota muistuttava purppuraan ja jalokiviin

puettu lapsen kuva tuotiin synkkine seurueineen kreivittären
huoneeseen sekä asetettiin hänen vuoteensa ääreen, kauhistui hän
ja huusi.
»Viekää pois se!» kirkui hän. »Tahdotteko peloittaa minut

kuoliaaksi?
Viekää pois se!»
Synkkä, aavemainen kulkue meni pois. Koko käynti oli kestänyt
noin kolmekymmentä sekuntia ja se maksoi sata frangia.
Kun tohtori tuli seuraavan kerran, oli ryppyisen peitteen alla

makaava kreivitär muuttunut melkein luurangon näköiseksi.
»Te ette tarvitse pyhää lasta — vaan pappia», sanoi tohtori, ja

kurja kuolevainen, joka yhä vielä pelkäsi kuolemaa, alkoi valittaa.
»Hyvä sisar», sanoi tohtori hoitajalle, »koska kreivittärellä on niin

kovat tuskat, voitte antaa hänelle kaksi kertaa enemmän oopiumia
kuin tähän asti.»
Samana iltana sisar meni kotiinsa pariksi tunniksi, ja Roma istui

siksi aikaa vuoteen ääreen. Sairas oli itsekkäämpi ja vaativampi kuin
koskaan, mutta Roma oli ruvennut tuntemaan sääliä tuota kärsivää
raukkaa kohtaan ja koetti tehdä kaiken voitavansa.
Oli hämärä, ja kreivitär, joka juuri oli saanut kaksinkertaisen

määrän oopiumia, ei tuntenut tuskia, vaan tahtoi pukeutua. Roma toi
hänelle yöpöydän ja peilin, punamaalia, puuteritöyhdöt, pensselit ja
kaikki muut esineet, jotka kuuluivat kreivittären toalettilaatikkoon. Ja
kun tuo heikko olento, jonka multa kohta oli peittävä, oli asetettu
istumaan tyynyjen nojaan, alkoi hän maalata ryppyisiä kasvojaan
aivan kuin hän olisi aikonut mennä tanssimaan menuettia kuoleman
kanssa. Ensin mustat renkaat silmien ympärillä valaistiin, sitten
harmaat posket punattiin ja vihdoin lyijynväriset huulet ja sieraimet
saivat terveyden ja nuoruuden ruusunvärin.
Roma oli sytyttänyt sähkövalon, mutta valo rasitti sairasta, joten

Roman täytyi vääntää se sammuksiin taas. Yö oli alkanut, ja ainoa
valo huoneessa tuli pienestä lampusta, joka paloi pyhimysarkun
edessä.
Oopiumi alkoi vaikuttaa ja ensimmäiseksi se hellitti vanhan naisen

kielen. Hän alkoi puhua papeista ylenkatseellisella ja ilkkuvalla
äänellä:
»Minä vihaan pappeja», sanoi hän, »enkä siedä heitä lähelläni. He

ovat aina tekemisissä kuoleman kanssa. Heidän mustat kauhtanansa
saavat minut ajattelemaan hautajaisia. Minä voisin pyörtyä
nähdessäni hautausmaan. Paitsi sitä papit ja tunnustukset kuuluvat
aina yhteen, ja miksi minun pitäisi tunnustaa, jos voin sitä välttää?
Kun ihmiset tunnustavat, täytyy heidän luopua siitä asiasta, jonka he
tunnustavat, muutoin he eivät saa anteeksiantoa. Fedi on hullu.
Luopua siitä! Yhtä hyvin voisin luopua tästä vuoteestani.»
Roma istui vuoteen ääressä kuunnellen tarkasti, vaikka hän

samalla tunsi, ettei hänellä ollut oikeutta kuunnella. Oopiumi juovutti
nopeasti kreivittären, joka jatkoi puhettaan aivan kuin joku toinen
olisi ollut huoneessa.
»Pappi kysyisi heti kaikenlaista tytöstä. Minun täytyisi kertoa

hänelle, miksi paroni asetti minut tänne vartioimaan häntä, ja sitten
pappi lavertelisi sakramenteista ja käskisi minua luopumaan
kaikesta.»
Kreivitär nauroi kovaa, pahaa naurua, ja Roma tunsi kuin jäisen

väristyksen.
»'Minä olen sidottu', sanoi paroni, 'mutta teidän pitää katsoa, että
hän odottaa minun. Kaikki riippuu teistä ja jos asia loppuu hyvin…'»
Vanhan vaimon kieli kävi paksuksi ja hänen silmänsä muuttuivat
elottomiksi ja lasimaisiksi.
Roma istui liikkumatta ja ääneti katsellen suurilla silmillään tuota

irvistelevää syntistä, joka kertoi liitosta Roman vangitsemiseksi ja
turmelemiseksi. Sillä hetkellä hän vihasi tätiään, tuota saastaista,
ilkeätä, säälitöntä olentoa, joka oli myrkyttänyt hänen sydämensä
hänen omaa isäänsä vastaan ja koettanut tukahduttaa kaikki
paremmat tunteet hänen sielussaan.
Pirullinen, käheä nauru kuului taas, ja sitten paholainen, joka oli

irroittanut kuolevan naisen kielen oopiumihumalalla, saattoi hänet
tunnustamaan sielunsa pahimman salaisuuden.
»Miksi minä annoin hänen kiusata itseäni? Sillä hän tiesi jotain. Se
koski lasta. Etkö tiedä, että minulla oli lapsi? Se syntyi mieheni
poissa ollessa. Hänen piti palata kotiin ja minä olin hädässä.»
Valo sattui kuihtuneille kasvoille. Roma istui varjossa, ja hänen

korvansa kumisivat.
»Se kuoli ja minä menin tunnustamaan… Luulin, ettei kukaan

tiennyt… Mutta paroni tietää kaikki… Sen jälkeen tottelin kaikkia
hänen käskyjään.»
Paksu ääni lakkasi. Ei kuulunut muuta kuin pienen kellon naputus.

Kreivitär oli nukkunut. Koko hänen turhamielisyytensä, vehkeilynsä,
halunsa, syntinsä ja kärsimyksensä peittyivät unen viattomuuteen.
Roma katsoi noita viheliäisiä, ryppyisiä, punatulta kasvoja, joihin

hiki ja musta väri silmäkulmista oli vetänyt viivoja, ja sitten hän
nousi hiljaa mennäkseen pois. Hän tunsi itse syyllisyytensä, joka
alensi hänet kuin syvään kuiluun.
Kreivitär heräsi. Hänellä oli taas tuskia ja hänen äänensä oli

muuttunut.
»Roma! Sinäkö siinä olet?»
»Minä, täti.»
»Miksi sinä istut pimeässä? Minä tunnen kauhua pimeässä.

Senhän tiedät vallan hyvin.»
Roma väänsi sähkönappulaa.
»Olenko puhunut mitään? Mitä olen sanonut?»
Roma koetti vastata kierrellen.
»Sinä et puhu totta. Sen tiedät itsekin. Sinä annoit minulle

oopiumia saadaksesi minut kertomaan salaisuuteni. Mutta se ei ollut
totta, mitä kerroin. Sinun ei tarvitse luulla, että vaikka olet
kuunnellut… Se oli valetta, kuuletko…»
Sisar tuli samassa kotiin, ja Roma meni huoneeseensa. Hän ei

tapansa mukaan kirjoittanut Davido Rossille sinä iltana. Sen sijaan
hän polvistui Elenan pienen Madonnan eteen, joka oli pöydällä
hänen vuoteensa vieressä.
Hänen oma salaisuutensa kiusasi häntä. Hän olisi tahtonut ilmaista

sen jollekin naiselle, joka lohduttaisi häntä. Mutta hänellä ei ollut
äitiä, ja hänen kyynelensä vuotivat viljalti.
Silloin hän rupesi ajattelemaan koko maailman äitiä ja muisti
rukouksen, jonka hän oli kuullut tuhat kertaa, mutta jota hän ei
koskaan itse ollut rukoillut.
»Pyhä Maria, Jumalan äiti, rukoile meidän syntisten puolesta nyt ja

kuoleman hetkellä — amen!»
Kun hän nousi taas, oli hän kuin lapsi, joka on itkenyt ja saanut
lohdutusta.
IX.
Muutamia päiviä tämän jälkeen talo oli vallan nurin. Joukko miehiä,
päässä punaiset lakit, joissa seisoi »Casa di Vendita», puuhaili
irroittaen mattoja ja kantaen pois huonekaluja sekä pannen merkit
niihin. Luettelo laadittiin ja ulkopuolelle katu-ovea kiinnitettiin
ilmoituksia, joissa yleisölle annettiin tieto, että myydään »vanhoja ja
uusia taide-esineitä Appartamento Volonnassa». Sitten seurasi
»Grand Esposizione» eräänä sunnuntaina, ja seuraa vana päivänä oli
huutokauppa.
Roma laittoi kammionsa pakopaikakseen. Sen hän muutti samalla

makuu- ja työhuoneeksi. Sinne hän saattoi kuulla kokoontuneen
joukon askeleet viereisestä salista. Hän istui kirjoituspöytänsä
ääressä, kun joku koputti ovea. Se oli commendatore Angelelli
vaaleassa puvussa ja silkkihatussa. Nöyryyden ilme hänen kalpeilla
kasvoillaan peitti sillä hetkellä ylpeyden ilmeen.
»Hyvää huomenta, Donna Roma. Sallitteko että…»
»Astukaa sisään.»
Pitkä ja laiha herrasmies heittäytyi mukavasti tuolille ja alkoi

ilmaista salaperäistä asiaansa.
»Paroni oli kovin pahoillaan pulastanne ja on lähettänyt minut
sanomaan, että teidän vain tarvitsee pyytää, niin tämä sopimaton
näytelmä lopetetaan. Minulla on totta puhuen valta toimia hänen
nimessään — tuntemattomana ystävänä, ymmärrättehän — ja
lopettaa nämä puuhat yhdennellätoista hetkellä. Sanokaa sananen
vain — yksi ainoa sana — niin kaikki järjestetään mielenne mukaan.»
Roma oli hetken vaiti, ja commendatore päätti, että hän oli

myöntynyt.
Joku koputti taas ovea.
»Sisään», huusi commendatore komeasti.
Huutokaupantoimittaja astui sisään. »Nyt on aika aloittaa,

signorina. Onko mitään muita käskyjä?» Hän katsoi Romaan ja sitten
Angelelliin ymmärtävin ilmein.
»Minä luulen, että armollinen neiti tahtoo sanoa jotain», sanoi

Angelelli.
»En ollenkaan mitään. Jatkakaa toimitustanne», vastasi Roma.
Huutokaupantoimittaja hävisi, ja Angelelli pani hatun päähänsä.
»Teillä ei ole siis mitään vastattavaa hänen ylhäisyydelleen?»
»Ei mitään.»
»Bene», sanoi commendatore ja poistui viheltäen hiljaa.
Huutokauppa alkoi. Pöydän ääressä lavalla, jossa ennen oli ollut

piano, istui huutokaupan toimittaja rautavasara kädessä.
Samanlaisen pöydän ääressä istui hänen apulaisensa. Kun
punalakkiset miehet toivat esiin tavaroita, kertasivat molemmat
toimimiehet toistensa tarjoussanat, aivan kuin näyttelijät ja
kuiskaajat italialaisissa teattereissa.
Englantilainen sisar tuli sanomaan, että kreivitär pyysi tavata

Romaa nyt heti. Sairas, joka oli hyvin heikkona, ei enää jaksanut
istua, vaan makasi pitseillä koristetuilla tyynyillään. Hän hypisteli
luisilla sormillaan kukallista peitettään ja Roman astuessa sisään hän
koetti huutaa hänelle raivoisan vihaisesti. Mutta hänen äänensä oli
kuin huuto tuulisella kentällä ja kuului tuskin selvemmin kuin
huutokaupantoimittajien ääni seinien takaa.
Roma istui tuolille vuoteen ääreen ja silitti kissaa, jonka kaulasta

oli otettu kultaristi pois, ja kuunteli sekä huoneesta että sen
ulkopuolelta kuuluvia sanoja, kun ne vuoroin sattuivat hänen
korviinsa.
»Roma, sinä kohtelet minua häpeällisesti. Minä makaan täällä

avuttomana, ja sinä panet toimeen huutokaupan — oikean
huutokaupan — aivan huoneeni ovella.»
»Camera da letto della Signorina! Sänky, jossa on on runsaasti

hedelmä- ja kukka-aiheisia koristeita.» »Viisikymmentä!» »Kiitos,
viisikymmentä.» »Viisikymmentä.» »Viisikymmentä viisi.»
»Viisikymmentä viisi.» »Eikö kukaan tarjoa enempää?» »Hyvät
herrat, mitä te ajattelette? Kauniin tytön kaunis sänky, ja siitä
tarjotaan ainoastaan viisikymmentä viisi!…»
»Jos tarvitset rahaa, olisit pyytänyt paronilta, tai ellet tahdo tehdä
sitä, olisit kirjoittanut kuuden kuukauden vekselin, kuten sanoin.
Mutta ei! Sinä tahdoit nöyryyttää ja alentaa minua. Siinä kaikki. Se
on onnistunut, ja minä kuolen häpeästä….»
»Pähkinäpuinen kirjoituspöytä! Ajatelkaapa, arvoisat naiset, mitä
salaisuuksia tämä pöytä osaisi kertoa, jos sillä olisi kieli! Kuinka
paljon tarjotaan?» »Kuusikymmentä liiraa.» »Kuusikymmentä.»
»Kuusikymmentä viisi.» »Kuusikymmentä viisi.» »Pähkinäpuinen
kirjoituspöytä, jonka ääressä juuri on kirjoitettu lemmenkirjeitä, ja
ainoastaan kuusikymmentä viisi tarjotaan!…»
»Semmoista se on, kun nuori tyttö tahtoo kulkea omia teitään.

Hienosto ei vaadi paljoa, mutta se kostaa kovasti, jos sen sääntöjä
rikotaan. Ja tekee oikein! Sääli, ettei rikkoja ole ainoa, joka saa
kärsiä! Hänen ystävänsä ja sukulaisensa ne vasta oikein saavatkin
kärsiä, kuten minä nyt…»
Kreivittären ääni vaipui heikoksi kuiskaukseksi. Roma nousi

mennäkseen. Silloin hän tapasi Nattalinan, joka toi huoneeseen
tavallisen mansikkalautasen. Marjat olivat maksaneet neljä frangia
naula.
Hetken perästä Roma istuessaan kirjoituspöydän ääressä

kammiossaan kuuli askelten siirtyvän alas kiertoportaita. Väki meni
alas ateljeehen. Nyt kuului huutokaupantoimittajan ääni kuin
haudasta.
»Paljonko tarjotaan tästä suuresta ja etevästä nykyaikaisesta

taideteoksesta?»
Nyt seurasi pilkallista naurua.
»Suihkukaivo, joka valmiina tulee kilpailemaan vanhan Rooman

mestariteosten kanssa.»
Yhä kovempaa pilkallista naurua.

»Nyt on papiston vastustajien vuoro. Hyvät herrat, älkää kaikki
puhuko yht'aikaa. Joka päivä ei ole juhlapäivä. Kuinka paljon? Eikö
mitään? Ei penniäkään? Sepä hullua. Taide itse on oma palkkansa.»
Yhä uutta naurua, ja sitten askeleet siirtyivät taas ylös portaita.

Sitten kuului tuttu ääni portailta — se oli prinsessa Bellinin —
»Madonna mia! Kuinka huono se on!»
Sitten kuului toinen ääni — se oli rouva Sellan — »sitä minä

ajattelin jo silloin, kun sitä yksityisesti näytettiin ja kun hän
käyttäytyi niin solvaisevasti rakasta paronia kohtaan.»
Sitten kuului sanomalehdentoimittaja Olgan ääni: »Sanoinhan

minä, että kyllä paroni vielä kostaa, ja niinpäs on käynytkin.
Ennenkuin tämä päivä on lopussa, on hän rahaton ja katoton.»
Roman pää vaipui pöytää vastaan. Vaikka hän kuinka koetti

säilyttää mielenmalttinsa, olivat nöyryytyksen aallot nyt vallan
tukahduttaa hänet.
Joku kosketti hänen olkapäätään. Se oli Nattalina, joka toi

sähkösanoman: »Kirjeesi saapunut, huoneistoni maksettu kesäkuun
loppuun, mikset käyttäisi sitä?»
Siitä hetkestä lähtien hän ei välittänyt mistään. Äänet salissa

hävisivät hänen kuuluvistaan eikä kuulunut muuta kuin
huutokaupantoimittajan ja hänen apulaisensa huudot, jotka
kajahtelivat kuin rummun lyönnit autiossa huoneessa.
Kello oli neljä. Avattuaan ikkunan Roma kuuli soittokunnan

soittavan. Silloin vastustushalu syttyi hänessä, ja hän puki yllensä
hatun ja päällystakin. Kun hän kulki tyhjän salin läpi, sanoi
huutokaupantoimittaja, joka juuri laski seteleitään, kuivalla,
konemaisella äänellään:
»Tulos on varsin hyvä, neitiseni — parempi kuin uskalsin toivoa.»
Saavuttuaan piazzalle Roma huusi ajurin. »Pinciolle!» käski hän ja

istui vaunuun. Palattuaan tunnin perästä hän istui kirjoittamaan
tavanmukaista kirjettään Davido Rossille.
»Suuri päivä tänään! Olen toiminut omin päin ja saanut loistavat

tulokset! Kaikki tavarani myyty, paitsi mitä tarvitsen omiin
tarpeisiini. Kuinka moni liikemies voi kehua tällä lailla, ja minä olen
kumminkin aivan vasta-alkaja!
Vakavasti puhuen, olen myynyt kaikki. Koska aion jättää tämän

huoneiston, en tarvinnut noita turhia huonekaluja ja arvelin siis,
että on paras erota niistä hyvissä ajoin. Paitsi sitä, mikä oikeus
minulla oli pehmeään vuoteeseen ja hienoihin liinavaatteisiin, kun
sinä olet maanpakolaisena ja nukut taivas ties missä? Ja sen lisäksi
tätini joka on hyvin sairas, tulee sangen kalliiksi. Siitä syystä on
saliparkani ollut viime viikon niin meluisa kuin sammakkolammikko
auringonlaskun aikaan, ja sunnuntaiaamuna ihmiset takoivat minun
pianoraukkaani aivan kuin se olisi ollut jonkin pikku kapakan
posetiivi.
Mutta oh, kuinka typerä tämä maailma on! Ihmiset luulivat, että
koska myin sellaiset tavarat, joita en tarvitse, olin kokonaan
mennyttä kalua. Sinä olisit nauranut, jos olisit kuullut heidän
huomautuksiaan. Puhuakseni totta olin niin typerä, että melkein
itkin, mutta juuri pahimmalla hetkellä tuli sinun sähkösanomasi kuin
enkeli taivaasta — ja mitä arvelet minun tehneeni? Vanha Aatami,
tai sanokaamme uusi Eeva, valtasi minut, ja heti kun ihmiset olivat
menneet, vuokrasin ajurin — tavalliset roomalaismalliset
ajurinvaunut, joita repaleisen ajajan hoputtama koni vetää
viimeisillä jalkaraukoillaan — ja sitten läksin ajelemaan Pinciolle!
Tahdoin näyttää tuolle hienolle maailmalle, etten ole ollenkaan
lopussa, ja minä näytinkin! He olivat kaikki siellä, joka-ikinen, kaikki
rakkaat ystäväni ja entiset imartelijani, jotka vuosikausia ovat
ahdistaneet taloani rukoillen sitä tai tätä suosiota ja palkiten ne
mitä imelimmillä hymyillään. Näytti vallan siltä kuin kohtalo olisi
koonnut heidät kaikki sinne minun nähtäväkseni, enkä minä
päästänyt ainoatakaan sielua pakoon.
Näkivätkö he minut? Ei ainoakaan! Minä ajoin heidän keskellään

ja heidän seassaan ja he kumartelivat kaikkiin ilmansuuntiin, ja
minä olin näkymätön kuin Asmodeus, heidän kasvojensa ilmeestä
päättäen. Olinko nöyryytetty? Vai hämillänikö? Vai murtunut? Oh,
taivas, en vähääkään! Olin ylpeä! Tiesin sen päivän tulevan vahan
kohta, jolloin heidän täytyy koettaa unohtaa tämä ja uskotella
itselleen, ettei tällaista päivää ole ollutkaan, ja jolloin he minun
itseni tähden, niin, minunkin tähteni, mutta ennen kaikkea sinun
tähtesi tulevat takaisin nöyrinä, äärettömän nöyrinä ja peloissaan.
Annoin heille nyt hyvän tilaisuuden. Olin ylpeä enkä säästänyt

ainoatakaan. Ja kun aurinko alkoi laskea Pietarin kirkon taakse ja
soittokunta lakkasi soittamasta ja me käännyimme pois, tiesin kuka
meni kotiin onnellisimpana ja ilman häpeän tunnetta. Oh, Davido
Rossi! Jospa olisit ollut siellä!
Minun täytyy nyt kertoa muitakin asioita. Kerron pienen uutisen.

Asianajaja Napoleon käy yhä vielä Regina Cœlissa tapaamassa
hämmästyttävää Brunoa ja hän näki Charles Minghellin siellä
vangin vaatteissa! Jos Jumala, joka sukupuolet määrää, olisi
arvannut tehdä sinun vaimostasi kenraaliprokuraattorin, niin
ajattelepa, kuinka toisenlaiselta maailman historia näyttäisi! Pahinta
on, ettei hän ehkä samalla olisi luonut sinua naiseksi, ja koska nyt
asiat ovat näinkin hyvin järjestetyt, luulen etten tahtoisi ollakaan
mies. Tuulen mukana lähetän sinulle lämpimän suudelman!
Roma.
P. S. — Ystävä-raukkani on yhä vielä huolissaan. Vaikka hän ei

ole uskonnollinen, on hän ruvennut joka ilta lukemaan »pyhää
Mariaa» mennessään levolle, ja ellen pelkäisi, että hän lopettaa
päivänsä (niin kamalasti häntä vaivaavat mielikuvat, että hän
joskus ajattelee itsemurhaa), en sanoisi mitään. Olen sanonut
hänelle, kuinka väärin olisi itse lopettaa elämänsä jo hänen
miehensäkin tähden, joka on poissa. Enkö kertonut sinulle, että
hän on matkustanut pois äskettäin? Koskisihan sinuun kovasti, jos
minä kuolisin ennen takaisintuloasi, eikö niin? Olen niin kovin
utelias tietämään mitä sanot hänestä. Kirjoita! Kirjoita! Kirjoita!»
X.
Kun kauhujen kuningasta ei enää voinut estää tulemasta, lähetti

kreivitär hakemaan pappia. Ennen hänen tuloaan kreivitär tahtoi
välttämättömästi pukeutua aamutakkiin, jota hän oli käyttänyt ilon ja
voiman päivinään vastaanottaessaan tuttaviaan.
Mustakauhtanainen pappi tuli, ja kreivitär näkyi ilmeisesti

säikähtävän nähdessään hänet. Mutta hän oli yksinkertainen mies,
joka uskoi, mitä opetti, koettamatta kovin syvästi ymmärtää sitä, ja
parilla hellällä sanalla hän tyynnytti kreivittären. Kreivitär oli aivan
kuin leikattavana ollut henkilö, eikä hän aluksi voinut suostua
olemaan kahdenkesken papin kanssa. Kun hän vihdoin oli voittanut
tuon kammonsa, pelkäsi hän, että huoneen ovet eivät ole aivan
lukossa ja että ihmiset kuuntelevat avaimen rei’istä. Pappi tyynnytti
häntä siinäkin suhteessa ja lankesi toiselle polvelleen, jotta kreivitär
voisi kuiskata hänen korvaansa.
Kreivittären tunnustuksen aikana Roma istui omassa huoneessaan,

sydämessä pelko, jommoista hän ei koskaan ennen ollut tuntenut.
Jotain persoonallista ja hyvin tuttua liikkui hänen sielussaan. Hän
kuuli silloin tällöin papin äänen epäselvän hyminän, jota seurasi
kuiskaukset ja nyyhkytykset.
Tunnustusta kesti neljännestunnin, ja sitten pappi tuli pois
huoneesta. »Nyt on sukulaisenne sopinut Jumalan kanssa», sanoi
hän, »ja nyt hänen tulee saada pyhä sakramentti, viimeinen voitelu
ja apostolinen siunaus.»
Hän meni valmistamaan näitä toimituksia, ja englantilainen sisar

tuli tapaamaan Romaa. »Kreivitär on kuin toinen ihminen nyt jo»,
sanoi hän, mutta Roma ei mennyt sairaan huoneeseen.
Pappi palasi puolen tunnin kuluttua. Hänellä oli mukanaan kaksi

apulaista, joista toinen kantoi ristiä ja lippua, toinen vihkivesimaljaa
ja roomalaisen kirkon käsikirjaa. Sisar ja Felice vastaanottivat heidät
ovella, sytytetyt kynttilät kädessä.
»Rauha olkoon tälle talolle!» sanoi pappi.
Ja apulainen sanoi: »Ja kaikille sen asukkaille.»
Sitten pappi riisui päällystakkinsa ja astui valkoisessa

messupaidassa ja sinipunervassa viitassa kreivittären huoneeseen,
kynttilät edellään. Pieni korttipöytä oli peitetty valkoisella liinalla ja
muutettu alttariksi. Kaikki kuolevan naisen toalettipöydän esineet,
hajuvesipullot, punamaalipurkit, puuteritöyhdöt y.m. oli työnnetty
sikin sokin lääkepullojen kanssa piirongin laatikkoon. Kello oli kaksi
päivällä, ja aurinko paistoi niin että piti sulkea ikkunaluukut. Huone
kävi pimeäksi, ja kynttilät heloittivat kuin tähdet.
Pappi otti pienen rasian povestaan ja asetti sen alttarille. Sitten

hän ruiskutti vihkivettä peitteelle ristin muotoon. Kreivitär rukoili
kiihkeästi matalalla, epäselvällä äänellä ja tarttui kiinni
vuodevaatteisiin.
Avaten pyhän hostia-rasian ja ottaen ehtoollisleivän pappi kohotti
sitä ja lähestyi pitsireunaista tyynyä ja laihoja, punavärille hohtavia
kasvoja sekä asetti ehtoollisleivän suusta kurottautuvalle kielelle.
Kun pyhä sakramentti oli saatu, toimitti pappi viimeisen voitelun.

Taas peite ruiskutettiin vihkivedellä, ja kaikki läsnäolijat lauloivat:
»Sinä Herra ruiskutat päälleni isoppia ja minä tulen puhtaaksi. Sinä
peset minut ja teet minut luntakin valkoisemmaksi.»
Valkoliinainen pöytä nostettiin lähemmäksi vuodetta ja sille

asetettiin kolme maljaa. Yhdessä oli vettä, toisessa oli valkoista
kuoretonta leipää ja kolmanteen apulaiset asettivat seitsemän
pumpulitukkoa. Kynttilä asetettiin kuolevan naisen voimattomiin
käsiin ja ristinmerkkejä tehtiin huoneen kaikkiin suuntiin sanoen:
»Anna perkeleitten paeta tästä paikasta ikipäiviksi.»
Sitten pappi kastoi oikean peukalonsa pieneen astiaan, jossa oli

pyhää öljyä ja joka riippui hänen kaulassaan, sekä teki ristinmerkin
kuolevan vaimon mustaksi maalattuja kulmakarvoja kohti sanoen:
»Tämän pyhän voitelemisen kautta ( † ) ja Hänen suuren armonsa
tähden antakoon Herra sinulle kaikki anteeksi, mitä näköaistisi kautta
olet rikkonut.»
Kastaen taas peukalonsa öljyyn pappi teki ristinmerkin korvia,

nenää, suuta, käsiä ja jalkoja kohti kerraten saman rukouksen
kuulon, haistin, makuaistin ja puheen, kosketuksen ja kävelyn
synneille. Sitten nuo seitsemän pumpulitukkoa otettiin yksitellen
maljasta ja niillä pyyhittiin öljy pois samalla kuin luettiin isämeidän-
rukous näihin sanoihin asti: »Älä johdata meitä kiusaukseen, vaan
päästä meidät pahasta, amen.»
Koko ajan apulaiset ja sisar lauloivat yksitoikkoisella äänellä
katumusvirsiä. Vihdoin lausui pappi apostolisen siunauksen.
»Ja nyt minä paavin pyhän istuimen antamalla vallalla vakuutan

sinulle, Elisabeth, täydellisen anteeksiannon ja vapahduksen kaikista
sinun synneistäsi Isän (†) ja Pojan (†) ja Pyhän Hengen (†) nimessä,
amen.»
Tuo aavemainen ehtoollistoimitus oli nyt ohi, ja pappi apulaisineen

läksi pois talosta. Mutta kuoleman kalpea, uhkaava varjo jäi
seisomaan hajuvesille tuoksuvan vuoteen ääreen.
Rcma ei ollut läsnä noissa toimituksissa, mutta nyt englantilainen

sisar tuli sanomaan, että kreivitär tahtoi tavata häntä.
»On suorastaan ihme», sanoi sisar, »hän on aivan kuin toinen

ihminen.»
»Onko hän saanut oopiumia nykyään?» kysyi Roma, ja sisar sanoi,

että hän oli saanut.
Roma tapasi tätinsä jonkinmoisessa salaperäisessä hurmiotilassa.

Suuri ilo, melkein ylpeys, loisti hänen kasvoissaan.
»Kaikki vaivani ovat menneet», sanoi hän. »Kaikki suruni ja

koetukseni ovat kadonneet. Olen heittänyt kaikki Kristuksen
kannettavaksi, ja kohta minä astun Hänen kanssaan Jumalan luo.»
Hän ei nähtävästi tuntenut mitään syyllisyyttä Romaa kohtaan.

Päinvastoin. Hän rupesi puhumaan hänelle itsetietoisesti kuin
pyhimys syntiselle.
»Sinun täytyy voittaa maalliset himosi, Roma. Sinä olet tehnyt
syntiä, mutta sinä et saa kuolla syntisenä. Sinä olet esimerkiksi
itsekäs. Olen pahoillani, että minun täytyy se sanoa, mutta sinä olet
itsekäs. Sinun täytyy tunnustaa ja uhrata elämäsi taisteluun syntiä
vastaan syntisessä sydämessäsi ja jättää sielusi Hänen armolleen,
joka on pessyt minut puhtaaksi kaikesta synnistä.»
Mutta kreivittären henkinen innostus ei kokonaan voinut

tukahduttaa hänen maallista turhamielisyyttään, kun hän rupesi
puhumaan hautajaisistaan.
»Tilaa requiem-messu, Roma. Jokaiselle toimitetaan sellainen. Se

maksaa kyllä hiukan, mutta eihän tämmöisessä tapauksessa saa
ajatella rahoja. Ja anna Raveggi-yhtiön toimittaa hautausmenot ja
katso etteivät he aseta minua paareille. Minä olen aatelisnainen, ja
minulla on oikeus tulla asetetuksi kirkon permannolle. Ja pidä huolta,
että minut haudataan hienoon osaan. Ylhäisimmät haudataan
pienelle Pinciolle herttua Massimon haudan yläpuolelle.»
Roma vastasi yhtämittaa »niin», »kyllä», »kyllä», vaikka hänen

sydäntään pakotti.
Kahden tunnin perästä alkoi kreivittären kuolinkamppailu. Kärsivä

ruumis oli voittanut riemuitsevan sielun, ja hän huusi yhä lisää ja
lisää oopiumia. Jokainen oli hänelle vastenmielinen, ja hänen terävät
kasvonsa kääntyivät puolelta toiselle.
Pappi tuli rukoilemaan kuolevan puolesta. Aurinko oli

laskemaisillaan, mutta ikkunaluukut olivat vielä suljetut ja huone oli
synkän juhlallinen. Soittokunta soitti Pinciolla, ja erään oopperan
sävelet sekaantuivat rukouksiin.
Kaikki olivat polvillaan, paitsi Roma. Hän seisoi, mutta hänen
sydämensä oli polvillaan, ja koko hänen sielunsa oli masentunut.
Pappi asetti ristin kreivittären käsiin, ja hän suuteli sitä kiihkeästi,

yhtämittaa lausuen nimen »Gesu, Gesu, Gesu!»
Kirkon kello kajahti hitaasti, ja pappi rukoili lujalla äänellä:
»Kristus, joka sinua kutsuu, ottakoon sinut vastaan ja antakoon

enkeliensä johtaa sinut Abrahamin helmaan.»
Samassa risti putosi kuolevan naisen käsistä ja hänen

timanttisormuksensa, jotka olivat käyneet liian väljiksi, vierähtivät
peitteelle. Vähän ajan perästä hänen valetukkansa luisti pois ja
hänen päänsä oli aivan kalju. Hänen otsansa hikoili ja henki korisi
hänen rinnassaan. Vihdoin hän rupesi hourailemaan.
»Se on valhe!» huusi hän. »Kaikki, mitä sanoin, on valhetta! Minä

en tappanut sitä!» Sitten hän heittäytyi sivulle ja risti putosi lattialle.
Pappi, joka hetki hetkellä oli rukoillut yhä kovemmalla äänellä,

nousi seisomaan ja sanoi muuttuneella äänellä: »Me suljemme
huomaasi, oi Herra, tämän palvelijasi Elisabethin sielun, että hän
eläisi Sinussa ja että Sinä sanomattomassa armossasi pyyhkäisisit
pois ne synnit, jotka hän täällä ihmiselämän kurjuudessa on tehnyt,
Kristuksen, meidän Herramme kautta, amen.»
Papin ääni muuttui epäselväksi hyminäksi ja lakkasi sitten

kokonaan. Hetken perästä ikkunaluukut avattiin ja samoin ikkunat.
Laskevan auringon säteet virtasivat huoneeseen. Kynttilät paloivat
himmeästi ja sammuivat sitten kokonaan. Salaperäinen toimitus oli
lopussa.
Englantilainen sisar asetti ristin takaisin kylmiin käsiin ja sulki
sammuneet silmät. Kissa naukui ja raapi vuodetta, ja joku sanoi
asiamies-äänellä:
»Luultavasti vainaja oli järjestänyt maalliset asiansa?»
Roma kiirehti takaisin omaan huoneeseensa. Hänen myrskyjen

murtama sielunsa alkoi tuntea väsymystä.
Soittokunta soitti yhä vielä Pinciolla, aurinko laski Pietarin-kirkon

taakse, ja Roma tarttui kynään kirjoittaakseen. »Hän on kuollut!
Elämä, josta hän niin epätoivoisesti riippui kiinni, on jättänyt hänet
vihdoinkin. Kuinka kiihkeästi hän koetti pitää kiinni siitä! Ja nyt hän
on mennyt tekemään tiliä töistään. Mutta kuka minä olen, kun puhun
näin? Hänen kurja, onneton syntitoverinsa.
»Tunnustuksen jälkeen hän luuli saaneensa anteeksi. Hän uskoi

olevansa puhdas ja synnitön. Ehkä hän olikin, ja ainoastaan kuolon
tuskat näyttivät saavan hänet lankeamaan takaisin. Mutta mikä
voima tunnustuksessa on! Voi hänen kasvoistaan loistavaa iloa, kun
hän oli avannut syntitaakkansa ja sielunsa salaisuudet! Anteeksianto!
Kuinka suloista mahtaa olla, kun tuntee saaneensa anteeksi!…
»En voi kirjoittaa enempää tänään, oma armaani, mutta ensi

kerralla saat kuulla uutisia, vakavia uutisia.»
XI.
Roma täytti kreivittärelle antamansa lupauksen. Hautausmenot, jos

kreivitär olisi ne nähnyt, olisivat tyydyttäneet hänen
turhamielisyyttään. Surusaatto täytti koko Via Gregorianan matkalla
seurakunnan kirkkoon. Ensin kannettiin lippua, jossa oli pääkallo,
kaksi luuta ristissä ja tuntilasi, sitten tuli eräs maallikkoveljeskunta,
sitten kaksikymmentä tilattua surupukuista murehtijaa, sitten
viisikymmentä kapusiinilaismunkkia, joille oli maksettu kaksi frangia
hengelle ja jotka kukin kantoivat kolmen frangin maksavaa kynttilää,
sitten kulki pappeja kaksittain, sitten seurasi seurakunnan pappi
messupaidassa ja mustassa viitassa palvelijoineen ja apulaisineen,
sitten tulivat komeat neljän hevosen vetämät ruumisvaunut ja
vihdoin neljät vaunut komeihin univormuihin pukeutuneine
lakeijoineen. Kirstu oli peitetty kukkasilla, ja koko tämä komeus
maksoi noin tuhat frangia.
Kello soi, kulkue lauloi ja siten saavuttiin kirkkoon. Kirkon ovella

pappi luki sanat: »Levätkööt hänen luunsa Herrassa», ja sitten
komealla vaakunalla koristettu kirstu laskettiin keskelle kirkon lattiaa.
Kynttilöitä asetettiin ympärille, ja seppeleet sijoitettiin kirstulle.
Munkit seisoivat sytytetyt kynttilät kädessä kirstun ympärillä, ja
pappi avustajineen astui alttarille. Alttari oli päällystetty mustalla
vaatteella, ja sen yläpuolella kohosi suuri kultainen risti.
Kun murehtijat olivat asettuneet paikoilleen, rupesi pappi

apulaisineen lukemaan hautauslukuja. Niitä kesti hyvin kauan, ja
papit toimittivat tehtävänsä hitaasti. Ensin tuli antifoni, sitten
vespervirsi ja De profundis, sitten aamulaulu ja kiitoslaulu, sitten
Miserere ja lopuksi riemuvirsi. Kun papit olivat ennättäneet sanoihin:
»Minä olen ylösnousemus ja elämä», oli kirkko täynnä väkeä.
Tulijat olivat kreivittären entisiä ystäviä, jotka vielä elivät sitä

elämää, jota hän oli elänyt terveenä ollessaan. Hänen sairaana
ollessaan he olivat pysähtyneet hänen ovelleen ajaessaan Pinciolle ja
lähettäneet palvelijansa kirjoittamaan heidän nimensä kirjaan, jota
pidettiin eteisessä. Tänä aamuna he olivat pukeutuneet mustiin ja
lähteneet ulos hiukan tavallista aikaisemmin.
Kun hautausluvut olivat lopussa, alkoi requiem-messu.

Viisikymmentä koulutettua ääntä kajahti kuin lintujen laulu kullatussa
häkissä. Laulettiin »Kyrie eleison» sillä aikaa kuin toimituksessa oleva
pappi apulaisineen, jotka kantoivat kynttilöitä, astui alas alttarilta ja
suitsutti pyhää savua. Sitten valittava soitto kajahti kirkossa kuin
mahtava myrsky kohoten ja laskien ja joskus huutaen ilmojen halki
ja sitten vaimentuen kuin meren hyminä. Hetken tuntui kaikki
sammuvan äänettömäksi, mutta sitten kuului taas surullinen valitus,
sopraano lauloi surusävelen, joka kaikui korkeassa holvikatossa.
Vihdoin musiikki lakkasi ja messua jatkui. Lopuksi pappi puki

päähineen yllensä ja antoi synninpäästön. Kulkien kirstun ympäri hän
ruiskutti vihkivettä siihen ja vielä kerran kiertäen sen hän suitsutti
pyhää savua sen päälle. Requiem loppui rukouksella ja kiitoksella:
»Pelasta meidät, oi Herra, ikuisesta kuolemasta sinä hirmuisena
päivänä.» Sitten laulajat läksivät pois lopetettuaan työnsä.
Tuo komea toimitus oli maksanut viisisataa frangia.
Nyt alkoivat kaikki ylhäiset henkilöt poistua. Roma oli tuskin

huomannut heidän läsnäoloaan. Polvistuen penkkiin lähellä alttaria
hän oli istunut pää kumarassa ja koettanut rukoilla. Mutta rukous
kävi väkinäisesti. Alituiseen hän näki yhden ainoan kuvan edessään,
nimittäin itsensä ja Davido Rossin polvistumassa parin askelen
päässä tältä paikalta. Kun hän pää kumarassa astui pois kirkosta,
puhutteli joku häntä. Se oli paroni; hän piti kädessään hattuaan,
jossa oli leveä suruharso. Hänen pitkä, laiha vartalonsa, korkea
otsansa, suora tukkansa ja jäiset kasvonpiirteensä vaikuttivat
kiusallisesti.
»Ikävä, etten voi mennä Campo Santoon», sanoi hän lisäten jotain
murtuneesta elämänlangasta, mitä Roma ei kuullut.
»Toivottavasti ei ole totta, mitä minulle on kerrottu, että sinä

muutat nykyisestä asunnostasi asettuaksesi asumaan erään henkilön
huoneistoon, erään henkilön, jonka nimeä minun ei tarvitse mainita.
Se olisi, sen vakuutan, hyvin paha erehdys, ja minä neuvon sinua
vakavasti välttämään sitä.»
Roma ei vastannut mitään, vaan astui vaunujensa ovelle. Paroni

auttoi häntä vaunuihin ja sanoi: »Muista, että mieleni on sama kuin
ennen. Älä kiellä minulta sitä iloa, että saan auttaa sinua, kun
tarvitset apua.»
Kun Roma tointui täysin requiem-messun jälkeen, oli saattokulku

matkalla hautausmaalle. Siinä oli koko rivi vaunuja. Useimmat olivat
tyhjiä aivan kuin surukin, jota ne edustivat. Pappi istui apulaistensa
kanssa, joista yksi koko ajan piti ristiä hänen edessään, etteivät
hänen ajatuksensa pääsisi harhailemaan. Hän otti nuuskaa ja luki
aamurukouksensa huomisen varalle.
Rooman hautausmaa on Porta San Lorenzon ulkopuolella

samannimisen kirkon ympärillä. Ruumisvaunut ajoivat
ruumiskappelin ovelle. Kun vaunut tyhjenivät, huomasi Roma, että
maksettuja palvelijoita lukuunottamatta hän oli ainoa murehtija.
Kreivittären ystävät eivät enempää kuin hän itsekään tahtoneet
nähdä hautausmaata.
Ruumiskappeli, matalakattoinen huone, oli täynnä paareja jos

jonkinlaatuisille vainajille. Eräässä paikassa oli kirjoitus: »Varattu
huomattavien henkilöiden ruumiille.» Kreivittären kirstu asetettiin
sinne, kunnes hautaajat seuraavana aamuna ennättivät tulla
hautaamaan sen. Kukat ja seppeleet asetettiin sen päälle, ja pappi
ruiskutti taas vihkivettä sille, ja sitten hautajaiset olivat lopussa.
»Minä en vielä palata kotiin», sanoi Roma, ja sitten pappi

apulaisineen nousi vaunuihin. Ajurit sytyttivät sikarinsa ja läksivät
ajamaan täyttä juoksua.
Hautajaiset olivat olleet komeat, kreivittären sielu saattoi olla

tyydytetty. Mutta kauhun kamala kuningas oli seissyt vieressä koko
ajan kuiskaten: »Turhuuksien turhuus, kaikki on turhuutta!»
Roma osti metsäkukista tehdyn seppeleen ja löysi virastosta

saamansa paperin avulla pikku Giuseppen haudan. Se on
hautaryhmässä, missä jokainen hauta oli kuin uuni, jossa on
marmoriovi ja siinä valokuva. Kaikki olivat lasten valokuvia, suloisia,
hymyileviä kasvoja, pieni enkelien kuoro, joka nyt lauloi taivaan
valtaistuimen ympärillä. Aurinko paistoi niihin, ja korkeat
sypressipuut humisivat hiljaa vienossa tuulessa. Siellä täällä joku äiti
asetteli öljylamppua, joka paloi hänen lapsensa kuvan edessä, ja
kuunteli suloista ääntä, joka ei ollut kuollut, vaan puhui hänen
sielunsa syvyydessä.
Roma asetti seppeleensä Giuseppen haudalle ja läksi pois.

Astuessaan ulos portista kohtasi hän suuren parven ihmisiä.
Etunenässä kulki kapusiinilais-munkki kantaen mustaa puuristiä,
johon oli kiinnitetty sieni, keihäs, vasara ja nauloja. Kaksi sinisiin ja
valkoisiin puettua poikaa kantoi kynttilöitä hänen vieressään.
Ihmisjoukko oli aivan köyhää kansaa, etupäässä vaimoja ja tyttöjä
liinat päässä. Nyt oli perjantai, ja he olivat menossa San Lorenzon
kirkkoon. Tuskin tietäen mitä teki Roma seurasi heitä.
Kansa täytti kirkon. Sen hartaus oli syvä ja liikuttava. Seuratessaan

munkkia väki lauloi yksitoikkoisella äänellä Stabat Mater'ia.
»Oi äiti, rakkauden lähde, anna meidän tuntea surun voimaa, että
surisimme sinun kanssasi.»
Tämä rukous tuntui tuskin tarpeelliselta. Rukoilijat olivat

vangittujen tai sairaina makaavien miesten ja reservisotilaiden
nälkään nääntyviä vaimoja ja tyttäriä. He olivat elämän meren kurjia
haaksirikkoisia, joita hyökyaallot olivat ajaneet rannalle, he hakivat
nyt lohdutusta uskonnosta ja kohottivat huutonsa Jumalan luo.
Kun he olivat lopettaneet kulkunsa ja surulaulunsa, kokoontuivat

he saarnastuolin ympärille, ja kapusiinilaismunkki nousi
saarnaamaan. Hän oli partasuu mies, jonka kasvot loistivat melkein
kiihkoa, ja hänen vyötäisillään riippui risti ja helminauha. Hän puhui
heidän köyhyydestään, heidän kadotetuista omaisistaan, heidän
kärsimyksistään, tästä synkästä ajasta, jota he saivat kokea, ja
kuinka oli rukoiltava valtiollisissa vaikeuksissa. Äänettömyys oli
täydellinen kuulijakunnassa, mutta kun pappi sanoi, että Jumala on
lähettänyt heille nämä kärsimykset heidän syntiensä tähden ja että
heidän täytyy tunnustaa syntinsä, joista pyhä äiti, kirkko, voi
pelastaa heidät, silloin syntyi hiljainen hyminä kuulijain kesken.
Rivi rippituoleja oli kirkon kummassakin sivu-osassa, ja kun

saarnaaja kertoi Vapahtajan kärsimyksistä, Hänen tuskastaan, Hänen
verestään, nousivat vaimot ja tytöt ääneen itkien ja menivät toinen
toisensa perästä tunnustamaan syntinsä. Heti kun joku oli noussut
pois, astui toinen sijaan, ja kukin näytti ripin jälkeen tyyneltä ja
rauhalliselta.
Hetken liikutus valtasi Roman kokonaan. Jospa hänkin voisi

tyhjentää sydämensä noin! Jos hän saattaisi päästä päiviensä
tuskista, öiden kärsimyksistä! Kulkiessaan erään rippituolin ohi oli
hän nähnyt papin siellä. Hänellä oli hellät, inhimilliset kasvot. Roma
oli nähnyt ne jossakin ennen, ehkä paavin riemukulussa.
Sillä hetkellä eräs köyhä, huivipää tyttö, joka oli itkien polvistunut
rippituoliin, nousi siitä ylös loistavin silmin. Roma vapisi liikutuksesta.
Vastustamaton halu tunnustaa oli vallannut hänet. Hänen täytyi
tarttua kiinni istuimeen, sillä muuten hän olisi kaatunut. Sitten hän
äkillisen tunnelman valtaamana, jonkinmoisessa huumaustilassa ja
tuskin tietäen mitä teki, heittäytyi samalle paikalle, josta tyttö oli
noussut, ja sanoi sykkivin sydämin ja vapisevalla äänellä pienen
metalliristikon läpi:
»Isä, minä olen suuri syntinen — kuule minua, kuule minua!»

(FREE PDF Sample) Plant Mitochondria Methods and Protocols 1st Edition James Whelan Ebooks

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

(FREE PDF Sample) Plant Mitochondria Methods and Protocols 1st Edition James Whelan Ebooks

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

(FREE PDF Sample) Plant Mitochondria Methods and Protocols 1st Edition James Whelan Ebooks

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Full download ebook at ebookgate.

Plant Mitochondria Methods and Protocols 1st

Download more ebook from https://ebookgate.com

Plant Organogenesis Methods and Protocols 1st Edition

Plant Hormones Methods and Protocols 2nd Edition Julian

Plant Meiosis Methods and Protocols 1st Edition Susan

Plant Cell Morphogenesis Methods and Protocols 1st

Plant Transcription Factors Methods and Protocols 1st

Plant Gravitropism Methods and Protocols 1st Edition

Plant Endosomes Methods and Protocols 1st Edition

Plant Gene Silencing Methods and Protocols 1st Edition

For further volumes:

Additional material to this book can be downloaded from http://extras.springer.com.

ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)

Library of Congress Control Number: 2015937422

Springer New York Heidelberg Dordrecht London

Printed on acid-free paper

Humana Press is a brand of Springer

Highlights in Plant Mitochondrial Research

Adelaide, SA, Australia David A. Day

Year Discovery Species References

Year Discovery Species References

Year Discovery Species References

Year Discovery Species References

Year Discovery Species References

1. Ernster L, Schatz G (1981) Mitochondria: a alternative oxidase of Sauromatum guttatum

succinate dehydrogenase complexes contain Expression and characterization of a redox-sens-

Whelan J, Giraud E (2013) A membrane- (2012) Pulsing of membrane potential in indi-

Bundoora, VIC, Australia James Whelan

1 Isolation of Intact Mitochondria from the Model Plant Species

15 Mitochondrial Markers of Programmed Cell Death in Arabidopsis thaliana . . . 211

MARY S. ALBURY • Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Life

JOANNA KACPRZYK • School of Biology and Environmental Science, University College

Isolation of Intact Mitochondria from the Model Plant

Key words Mitochondria, Organelle isolation, Density gradients, Arabidopsis, Rice

Mitochondria are indispensible organelles essential for plant

be isolated from relatively small quantities from specific tissues

2.1 Arabidopsis 1. 6 × 6 × 6 cm pots.

2.1.2 Plate-Grown Growing Arabidopsis on plates is useful for propagating enough

2.1.3 Liquid-Grown Growing Arabidopsis in liquid is preferential when large amounts

2.1.4 Arabidopsis Cell 1. 250-mL Glass conical flasks.

2.1.5 Rice Coleoptiles 1. Rice dehusker (see Note 2).

2.1.6 Rice Embryos 1. Rice dehusker (see Note 2).

2.1.7 Mitochondrial 1. Large mortar and pestle.

11. Heavy gradient solution.

2.1.8 Mitochondrial 1. Blender.

Percoll Water Wash buffer (2×)

2.1.9 Mitochondrial 1. Scalpel.

40 % (v/v) 25 % (v/v) 15 % (v/v)

3.1.2 Arabidopsis 1. Arabidopsis seed can be sterilized as described above in

continuous density gradient dis-continuous density gradient

10. Keep the gradients on ice until ready to use in step 11

16. Centrifuge for 5 min at 2,450 × g at 4 °C.

a Continuous density gradient

b Dis-continuous density gradient

c Dis-continuous density gradient

Fig. 2 Example of Percoll density gradients for the purification of mitochondria.

7. Discard the supernatant and gently resuspend pellet with a

9. Aspirate or gently pour off the supernatant and resuspend