Mace Kevin

Le contrôle qualité de la synthèse protéique comme cible
pour le développement de nouveaux antibiotiques

Kévin Macé
To cite this version:

Kévin Macé. Le contrôle qualité de la synthèse protéique comme cible pour le développement de
nouveaux antibiotiques. Génétique. Université Rennes 1, 2016. Français. �NNT : 2016REN1B034�.
�tel-01691728�
HAL Id: tel-01691728

https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01691728
Submitted on 24 Jan 2018
HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est

archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents
entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
lished or not. The documents may come from émanant des établissements d’enseignement et de
teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires
abroad, or from public or private research centers. publics ou privés.
ANNÉE 2016
THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1

sous le sceau de l’Université Bretagne Loire
pour le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1
Mention : Biologie
Ecole doctorale Vie-Agro-Santé
présentée par
Kévin Macé
Préparée à l’unité de recherche UMR CNRS 6290
Institut de Génétique & Développement de Rennes, équipe RBS
U.F.R Sciences de la Vie et de l’Environnement
Thèse soutenue à Rennes

Le contrôle qualité le 24 novembre 2016
devant le jury composé de :
de la synthèse protéique Axel Hartke
Professeur à l’Université de Caen Normandie - EA 4655, Caen
comme cible pour / rapporteur
le développement de Emmanuelle Schmitt

Directrice de recherche CNRS UMR7654, Maître de conférences
de l'Ecole polytechnique, Palaiseau
nouveaux antibiotiques / rapporteur
Brice Felden
Professeur à Université de Rennes 1 – INSERM U835, Rennes
/ examinateur
Jean-Christophe Giard
Professeur à l’Université de Caen Normandie - U2RM, Caen
/ examinateur
Axel Innis
Chargé de Recherches INSERM U1212 CNRS UMR 5320, Institut
Européen de Chimie et Biologie (IECB) Pessac
/ examinateur
Reynald Gillet
Professeur à l’Université de Rennes 1 – IGDR UMR6290, Rennes
/ Directeur de thèse
ANNÉE 2016
THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1

sous le sceau de l’Université Bretagne Loire
pour le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1
Mention : Biologie
Ecole doctorale Vie-Agro-Santé
présentée par
Kévin Macé
Préparée à l’unité de recherche UMR CNRS 6290
Institut de Génétique & Développement de Rennes, équipe RBS
U.F.R Sciences de la Vie et de l’Environnement
Thèse soutenue à Rennes

le 24 novembre 2016
Le contrôle qualité devant le jury composé de :
de la synthèse protéique Axel Hartke

Professeur à l’Université de Caen Normandie - EA 4655, Caen
comme cible pour / rapporteur
Emmanuelle Schmitt
le développement de Directrice de recherche CNRS UMR7654, Maître de conférences
de l'Ecole polytechnique, Palaiseau
nouveaux antibiotiques
/ rapporteur
Brice Felden
Professeur à Université de Rennes 1 – INSERM U835, Rennes
/ examinateur
Jean-Christophe Giard
Professeur à l’Université de Caen Normandie - U2RM, Caen
/ examinateur
Axel Innis
Chargé de Recherches INSERM U1212 CNRS UMR 5320, Institut
Européen de Chimie et Biologie (IECB) Pessac
/ examinateur
Reynald Gillet
Professeur à l’Université de Rennes 1 – IGDR UMR6290, Rennes
/ Directeur de thèse
Remerciements
Cette thèse a été réalisée au sein du laboratoire de recherche Traduction et Repliement,
appartenant à l’Institut Génétique et du développement de Rennes (IGDR), Unité Mixte de
Recherche 6β90 du CNRS et de l’Université Rennes 1. J'adresse mes remerciements aux
personnes qui ont rendu la réalisation de cette thèse possible.
En premier lieu, je remercie tout particulièrement mon directeur de thèse, le Pr Reynald

Gillet, pour ses grandes qualités humaines, pour avoir su se rendre disponible tout en me
laissant une grande autonomie. Il est une source de savoir qui m’a été indispensable dans la
réussite de mes projets scientifiques. Il a été pour moi un vrai Mentor, un directeur de thèse
exemplaire, et dont les 3 années passées à ses côtés ont été un privilège dont j’ai profité au
maximum. Concernant son aide au long de ma thèse, je tiens particulièrement à souligner son
indéfectible optimisme et ses relectures scrupuleuses des articles et du manuscrit.
Je remercie ensuite tous mes collègues pour ce super esprit d’équipe qui imprègne le
laboratoire. Ce fut un réel plaisir de collaborer avec tous. En particulier le bon accueil qui m’a
été offert par Aurélie et Claire. Nicolas que je remercie pour l’encadrement à la paillasse à
mes débuts, ainsi que Jean-Paul qui m’a initié à la microscopie électronique avec passion.
Pour leurs esprits de cohésion, je remercie également Christian pour sa bonne humeur et sa
générosité, merci à Cyrille et Eléonore pour les bons moments passés ensemble et pour leurs
aides tout au long de la thèse notamment pour la logistique quotidienne du laboratoire.
Merci à Manu pour sa richesse intellectuelle et culturelle. Un grand merci pour sa

collaboration fructueuse à ce projet.
Merci à Charlotte, Fanny et Sophie pour leurs aides dans ce projet et leurs investissements
pour les autres projets en cours de réalisation. En souvenirs à toutes les soirées labo, V&B, au
bar…
Je n’oublierai pas de remercier Daniel et Maryvonne pour leur grande générosité.
Je remercie aussi la seconde équipe qui travaille en collaboration avec la nôtre, en particulier
Carlos, Annie et Gwennola pour la formation reçue au cours de mes études à l’Université de
Rennes 1, ainsi que Renan, Sylvie, Manon pour l'aide scientifique apportée tout au long de la
thèse.
Merci également à l'équipe TIPs, Denis, Laurence, Claire et Franck ainsi qu’à l’équipe
SPARTE.
Je remercie aussi mes stagiaires durant ces trois dernières années qui ont tous participé à ce
projet (mais aussi pour tous les bons moments en dehors du labo) : Nadia, Martial, Caroline,
Louise et Émilie, les stagiaires de médecine Ondine & Marie, Flore-Anne & Marine et de
pharmacie Lorraine & Maxime. Également à tous les autres stagiaires passés au labo.
Merci à Florence et Didier, mes parents pour leur soutien infaillible. Un énorme merci du
cœur pour ma femme Aurélie, sans qui je ne serais jamais parvenu jusque là. Et évidemment
une grosse pensée à ma source de bonheur quotidienne : Léandre.
Je tiens aussi à remercier spécialement ceux qui ont minutieusement lu et corrigé les articles
présents dans ce manuscrit et cela sans compter leur temps : Reynald, Manu, Juliana, Renan,
Daniel… L’émulation scientifique et leurs suggestions toujours avisées ont permis de réaliser
des articles scientifiques de haute qualité.
Merci aussi à tous ceux qui liront cette thèse.

Organisation du manuscrit
Ce manuscrit de thèse se découpe en trois parties. Il a pour fil conducteur la synthèse
protéique bactérienne et ses systèmes de contrôle-qualité.
La partie I débute par une courte introduction sur l’origine du code génétique. L’article
théorique associé (Macé and Gillet, 2016) émet l’hypothèse argumentée de la naissance de la
synthèse protéique à partir de l’ARN transfert-messager. Vient ensuite, une introduction sur la
synthèse des protéines de nos jours, avec une attention particulière pour le facteur
d’élongation G, objet du second article (Macé et al., soumis). Celui-ci présente des résultats
structuraux originaux du facteur d’élongation G complexé au ribosome dans une
conformation jamais observée auparavant.
La partie II se focalise sur un mécanisme de sauvetage de la synthèse protéique bactérienne :

la trans-tranduction. Un troisième article de revue (Giudice, Macé et al., 2014), ainsi que des
résultats structuraux préliminaires la composent. Cette partie se poursuit par la présentation
des autres fonctions de la trans-traduction, notamment son rôle dans la virulence. Il se termine
par un autre article de revue (Macé et al., 2015) mettant en évidence les applications
thérapeutiques de la trans-traduction.
La partie III traite de la trans-traduction comme cible pour de nouveaux antibiotiques. Après
une courte introduction sur les antibiotiques, et plus spécifiquement ceux ciblant la trans-
traduction, cette partie est complétée par un cinquième article (Macé et al., en préparation).
Cet article traite de la mise au point d’un système rapporteur de la trans-traduction,
permettant de cribler à haut-débit de nouveaux composés inhibiteurs. Cet article est
accompagné du brevet d’application de ce système.
Table des matières
Table des matières 10
Table des matières

_Toc464685020
Table des matières .................................................................................................................... 10
Partie I ...................................................................................................................................... 17
La synthèse protéique ............................................................................................................... 17
I - Origine de la synthèse protéique ...................................................................................... 18
I.1 – Introduction – Origine de la synthèse protéique ....................................................... 18
I.2 - Origine du code génétique ......................................................................................... 19
I.3 - Origine de la vie : L’hypothèse du monde ARN ....................................................... 21
I.3.A - Introduction : Le paradoxe de l'origine de la vie ............................................... 21
I.3.B - Découverte des ARN catalytiques ..................................................................... 21
II - Article #1 | K. Macé and R. Gillet - 2016 - Nucleic Acids Research ............................. 23
II.1 - Introduction de l’article #1 ....................................................................................... 23
II.2 - Article #1 ................................................................................................................. 25
II.3 - Conclusion de l’article #1 ........................................................................................ 37
III - Le ribosome ................................................................................................................... 39
III.1 - Introduction - Le ribosome ..................................................................................... 39
III.2 - Nomenclature du ribosome ..................................................................................... 40
III.2.1 - Nomenclature des ARN ribosomiques............................................................. 40
III.2.2 - Nomenclature des protéines ribosomiques ...................................................... 41
III.2.2.A - Historique ................................................................................................. 42
III.2.2.B - La nouvelle nomenclature ........................................................................ 43
III.3 - Structure du ribosome ............................................................................................. 45
IV - Le cycle traductionnel ................................................................................................... 48
IV.1 - Introduction – Le cycle traductionnel .................................................................... 48

IV.1.1 - Les acides ribonucléiques de transfert, partenaires clés du ribosome au cours

de la synthèse protéique ................................................................................................ 48
IV.1.1.A - Structure des ARNt .................................................................................. 49
IV.1.1.B - Synthèse et modification post-transcriptionnel des ARNt ....................... 50
IV.1.2 - Les aminoacyl-ARNt-synthétases (aaRS) ....................................................... 51
IV.1.2.A - Généralités et structure ............................................................................. 51
IV.1.2.B - Le mécanisme d’aminoacylation .............................................................. 52
IV.2 - Les étapes du cycle traductionnel ........................................................................... 53
IV.2.1 – L’initiation de la traduction ............................................................................. 53
IV.2.1.A - Introduction – L’initiation de la traduction .............................................. 53
IV.2.1.B - Caractéristiques de la région TIR de l’ARNm ......................................... 54
IV.2.1.C - Les étapes conduisant à la formation d’un ribosome fonctionnel ............ 55
IV.2.2 - L’élongation ..................................................................................................... 57
IV.2.2.A - Introduction : L’élongation ...................................................................... 57
IV.2.2.B - Les étapes du cycle d’élongation .............................................................. 57
IV.2.2.B.1 - Liaison du complexe ternaire ............................................................. 57
IV.2.2.B.2 - Le décodage ....................................................................................... 57
IV.2.2.C - Le transfert peptidique.............................................................................. 62
IV.2.2.D - La translocation ........................................................................................ 63
IV.2.2.D.1 – Introduction : La translocation .......................................................... 63
IV.2.2.D.2 - Les états intermédiaires durant la translocation ................................ 63
IV.2.2.D.3 - « Ratcheting » des sous-unités pendant la translocation ................... 63
IV.2.2.D.4 - Mouvement de l’ARNm et des ARNt dans la sous-unité 30S .......... 64
IV.2.2.D.5 - Facteur d’Elongation G ..................................................................... 65
IV.2.2.D.6 - L'État de Post-translocation ............................................................... 65
IV.2.3 - La terminaison ..................................................................................................... 66

IV.2.3.1 - Structure des facteurs de terminaison et interaction avec le ribosome. ........ 66
IV.2.3.2 - Reconnaissance du codon de terminaison .................................................... 67
IV.2.3.3 - Hydrolyse et libération de la protéine ........................................................... 68
IV.2.3.4 - Départ des facteurs de terminaison ............................................................... 69
IV.2.4 - Le recyclage......................................................................................................... 69
V - Gros plan sur EF-G : au cœur du mécanisme de translocation ...................................... 70
V.1 - Introduction – Au cœur du mécanisme de translocation ......................................... 70
V.2 - Le « swiveling » de la tête du 30S ........................................................................... 70
V.3 - Casser l’état PRE ..................................................................................................... 71
V.4 - Le passage de l’ARNt du site P à E ......................................................................... 72
V.5 - Contrôle du mouvement de l’ARNm ....................................................................... 73
V.6 - Rôle et déclenchement du centre GTPasique .......................................................... 74
VI - Article #2 | K. Macé, E. Giudice, S. Chat and R. Gillet................................................ 75
VI.1 - Introduction de l’Article #β .................................................................................... 75
VI.2 - Article #2 ................................................................................................................ 77
VI.3 - Conclusion de l’Article #β.................................................................................... 103
Partie II ................................................................................................................................... 107
La trans-traduction ................................................................................................................. 107
I - Introduction Partie II – La trans-traduction ................................................................... 108
II - Article #3 | E. Giudice, K. Macé and R. Gillet. - 2014 - Frontiers in Microbiology.... 109
II.1 - Introduction de l’Article #γ.................................................................................... 109
II.2 - Article #3 ............................................................................................................... 111
III - Résultats préliminaires de l’étude structurale de la trans-traduction .......................... 123
III.1 - Introduction – Résultats préliminaires de l’étude structurale de la trans-traduction 123
III.2 - Complexe ribosomique en cours de trans-traduction en présence de RNase R ... 124
III.2.1 - Introduction : étude de la trans-traduction en présence de la RNase R ......... 124

III.2.2 - Résultats préliminaires de l’étude de la trans-traduction en présence de la

RNase R....................................................................................................................... 126
III.2.3 - Discussion et conclusion des résultats préliminaires ..................................... 130
IV - Les autres rôles de la trans-traduction ........................................................................ 131
IV.1 - Introduction – Les autres rôles de la trans-traduction .......................................... 131
IV.1.1 - Les autres rôles de la trans-traduction ........................................................... 131
IV.1.2 - Régulation de la pathogénicité....................................................................... 131
IV.1.2.1 - Le stress................................................................................................... 131
IV.1.2.1 - La pathogénicité ...................................................................................... 132
IV.2 - Conclusion – Les autres rôles de la trans-traduction ........................................... 134
V - Article #4 | K. Macé, E. Giudice and R. Gillet. - 2015 - Med Sci................................ 135
V.1 - Introduction de l’Article #4 ................................................................................... 135
V.2 - Article #4 ............................................................................................................... 137
VI - Conclusion – La trans-traduction ............................................................................... 147
Partie III.................................................................................................................................. 149
Recherche d’antibiotiques ciblant la trans-traduction ........................................................... 149
I - Généralités sur les antibiotiques .................................................................................... 150
I.1 - Bref historique sur les antibiotiques ........................................................................ 150
I.3 - Les antibiotiques ciblant le ribosome ...................................................................... 153
II - État de l’art des antibiotiques ciblant la trans-traduction ............................................. 155
II.1 - Introduction – État de l’art des antibiotiques ciblant la trans-traduction .............. 155
II.2 - La pyrazinamide ..................................................................................................... 156
II.2.1 - Introduction : la pyrazinamide ........................................................................ 156
II.2.2 - Effet de l’acide pyrazinoïque sur la trans-traduction ...................................... 158
II.3 - Le KKL-35 ............................................................................................................. 160
III - Le développement d’un outil pour la recherche d’antibiotiques ciblant la trans-

traduction ............................................................................................................................ 162
III.1 - Introduction – Le développement d’un outil pour la recherche d’antibiotiques

ciblant la trans-traduction ............................................................................................... 162
III.2 - Détail et construction du système rapporteur ....................................................... 165
III.3 - Conclusion - Le développement d’un outil pour la recherche d’antibiotiques ciblant

la trans-traduction ........................................................................................................... 168
V - Article #5 | K. Macé et al. ............................................................................................ 169
V.1 - Introduction de l’Article #5 ................................................................................... 169
V.2 - Article #5 ............................................................................................................... 171
V.3 - Conclusion de l’Article #5 ..................................................................................... 199
VI - Conclusion du manuscrit ............................................................................................. 203
Bibliographie .......................................................................................................................... 205
Liste des articles ..................................................................................................................... 223
Liste des figures & tableaux ................................................................................................... 225
Liste des abbréviations ........................................................................................................... 229
Annexes .................................................................................................................................. 233
Annexes de la Partie I ......................................................................................................... 234
Annexes de la Partie II........................................................................................................ 241
Annexes de la Partie III ...................................................................................................... 263

I - Origine de la synthèse protéique 17
Partie I
La synthèse protéique
I - Origine de la synthèse protéique
I.1 – Introduction – Origine de la synthèse protéique
Le code génétique est universel à tout le règne vivant. Son décryptage nécessite deux étapes
bien distinctes représentant le « dogme central » de la biologie moléculaire : la transcription et
la traduction. La transcription correspond au passage de l’information génétique contenue
dans l’acide desoxyribonucléique (ADN) sous la forme d’acide ribonucléique (ARN). La
traduction correspond au passage de l’ARN sous la forme de chaîne protéique, grâce à une
machinerie cellulaire complexe, le ribosome. Le code génétique est un véritable langage écrit
avec des mots de 3 lettres ordonnées (triplet ou codon) à parti d’un alphabet de quatre lettres
(nucléotides) adénine, thymine, cytosine et guanine (A, T, G et C). Lors de la transcription de
l’ADN en ARN, un code à quatre lettres est conservé (A, U, G et C). Par contre lors de la
traduction, le passage à un alphabet à vingt lettres (les acides aminés composant les protéines)
est nécessaire. La traduction est donc plus complexe, nécessitant le passage d’un « langage » à
un autre via l’utilisation d’une clé : l’ARN de transfert (ARNt).
Il existe 64 codons (4 nucléotides possibles à 3 positions différentes soit 43 = 64) pour 20

acides aminés (tableau 1). Le code génétique est dit dégénéré, c’est-à-dire qu’il y a une
redondance d’attribution des codons : il peut
exister plusieurs codons pour un même acide
Box N°1 - Ne pas confondre "code
aminé. Il existe donc des ARNt différents génétique" avec "information génétique".
apportant le même acide aminé à des codons L'information génétique est une notion vague
et théorique qui signifie les données
différents, on parle alors d’ARNt isoaccepteurs. enregistrées dans les acides nucléiques et les
protéines par la cellule.
Quant aux codons correspondant à un même
acide aminé ils sont dits synonymes. Chaque
séquence codante commence par un codon initiateur (le plus souvent AUG codant pour une
formyl-méthionine chez les bactéries) et définit ce que l'on appelle le cadre ouvert de lecture
(« open reading frame » ORF) ou séquence codante. La séquence codante se termine par la
reconnaissance d’un des trois triplets de terminaison ou stop (UGA = opale ; UAG = ambre ;
UAA = ocre).
Tableau 1. Le code génétique. Le code génétique est un tableau (dictionnaire de traduction) des
correspondances entre les 64 triplets de bases azotées de l'ARNm (codons) et les 20 acides aminés.
I.2 - Origine du code génétique
Il existe une infinité de combinaisons possibles permettant d'associer les 64 codons à 21

éléments d'information (20 acides aminés et un signal de terminaison). Malgré cela, le code
génétique est quasiment similaire pour toutes les formes de vies connues, se limitant à de
rares variations mineures. Diverses hypothèses, souvent opposées, ont été émises pour
expliquer l’origine de cette attribution et l’homogénéité observée.
Tout d’abord, l’hypothèse stéréochimique propose que l’origine du code génétique soit basée
sur des affinités chimiques réciproques entre le codon et l'acide aminé. En particulier, des
expériences avec des aptamères ont mis en évidence que certains acides aminés présentent
une affinité chimique spécifique pour les codons qui les encodent (Knight and Landweber,
1998). D'autres expériences ont mis en évidence le fait qu’un certain nombre d’acides aminés
(6 sur 8 testés) peuvent s’associer avec leurs codons (Yarus et al., 2009). La base du premier
code génétique serait donc une conséquence logique de la relation chimique entre codons et
acides aminés.
Ce premier code génétique très simple aurait incorporé progressivement de nouveaux acides
aminés, en lien avec l’évolution du métabolisme cellulaire (Amirnovin, 1997; Ronneberg et
al., 2000). Cette incorporation de nouveaux acides aminés dans le code génétique s’est faite
conjointement avec une optimisation du système de reconnaissance, via trois principes
antagonistes (Tlusty, 2010): (i) le besoin d'un éventail d'acides aminés suffisamment
diversifié ; (ii) la nécessité de limiter l'impact des erreurs ; (iii) l'avantage de réduire le coût du
processus en termes d'utilisation des ressources de la cellule.
Effectivement, les acides aminés codés par des codons proches les uns des autres ont des
propriétés chimiques similaires. De plus, les acides aminés qui partagent une voie
métabolique de biosynthèse commune tendent également à avoir la même première base
nucléique dans leurs codons (Taylor and Coates, 1989). Ceux dont la chaîne latérale présente
des propriétés physicochimiques proches tendent à avoir également des codons semblables
(Wong, 1980). Cette organisation du code génétique a pour effet de limiter les conséquences
des mutations ponctuelles, car les acides aminés modifiés sont remplacés par des acides
aminés pouvant jouer un rôle similaire pour la structure de la protéine et ainsi que sa fonction
soit conservée (Freeland and Hurst, 1998; Freeland et al., 2000).
Intervient la théorie la plus communément connue, celle du "frozen accident" proposée par
Francis Crick (Crick, 1968). Elle considère que le code génétique est général et universel car
une réattribution du code génétique n'est possible que dans les étapes primitives de la vie.
Tout changement du code génétique des organismes modernes entraînerait une modification
de tout le protéome, ce qui serait évidemment délétère pour la cellule.
La sélection naturelle a conduit à retenir un code génétique optimum qui, couplé à une
machinerie de synthèse protéique complexe, permet de traduire une quantité d’information
époustouflante de manière rapide et fidèle. L’origine et l’évolution du code génétique
jusqu’au « frozen accident » ne représente qu’une courte étape dans l’évolution de la vie :
environ β00 millions d’années, à comparer aux γ.6 milliards d’années environ de l’évolution
cellulaire qui a suivi. Cependant l’origine du code génétique soulève un problème conceptuel
puisque l’ADN, support de l’information génétique pour la synthèse des protéines, est
répliqué par des polymérases qui sont des protéines. Il en résulte un paradoxe : qui des
protéines ou de l'ADN est apparu en premier au cours de l'émergence de la vie ?
I.3 - Origine de la vie : L’hypothèse du monde ARN
I.3.A - Introduction - Le paradoxe de l'origine de la vie
Dans les années 1960, Carl Woese, Francis Crick et Leslie Orgel constatent l'omniprésence et
les diverses fonctionnalités de l’ARN dans le
monde d'aujourd'hui, et suggèrent qu’il pourrait
Box N°2 - Har Gobind Khorana, Robert W.
avoir été le principal acteur au début de la vie sur Holley et Marshall Nirenberg ont obtenu le
prix Nobel de physiologie ou médecine en
Terre. Cette hypothèse, appelée « Monde ARN » 1968 pour « leur interprétation du code
(RNA world), permet de résoudre le paradoxe de génétique et de sa fonction dans la synthèse
des protéines ».
l’œuf et de la poule concernant l’ADN, support
de l’information génétique et les protéines, responsables de l’activité enzymatique cellulaire.
Pour fabriquer une protéine il faut un ADN, mais pour fabriquer un ADN, il faut… une
protéine. L’hypothèse du monde ARN est que l’ARN soit à la fois support de l’information et
des activités catalytiques.
I.3.B - Découverte des ARN catalytiques
C’est dans les années 1980 que les premiers ARN ayant une activité catalytique sont
découverts. Ensuite appelés ribozymes, ces ARN peuvent avoir un rôle de catalyseur, comme
les protéines, permettant de rendre l’hypothèse du
monde ARN crédible. Le premier de ces ARN,
Box n°3 – “The protein is thought to aid in découvert en 1981, est un ARN auto-catalytique,
the reaction, but is not required for catalysis.
All enzymes are not proteins”. Cette étant capable d’auto épissage (Cech and Bass,
découverte inattendue a valu à Cech et
1986). Fait intéressant, ces ARN, appelés « self
Altman le prix Nobel de chimie en 1989.
splicing group I RNAs » se retrouvent
fréquemment dans les ARN de transfert et ribosomiques. Le second de ces ARN est la RNase
P (Guerrier-Takada et al., 1983). Il est le premier cas avéré d’une molécule d’ARN qui
catalyse une réaction sans subir elle-même un changement net. De plus, la RNase P intervient
dans la maturation des ARN de transfert et ribosomiques.
Depuis, de nombreuses équipes ont mis au point des méthodes visant à diriger l'évolution
d'ARN, afin de sélectionner ceux présentant une activité catalytique optimale. De nombreux
ribozymes capables de réaliser une multitude de réactions biochimiques, comme lier des
nucléotides entre eux, lier des acides aminés à des ARN, effectuer des réactions d'oxydo-
réductions etc, ont ainsi été développés (Beaudry and Joyce, 1992; Ellington and Szostak,
1990; Tuerk and Gold, 1990). Il est donc possible que l'ARN seul suffise à établir un
métabolisme primitif.
Un dernier ARN catalytique découvert récemment, et non des moindres, est le ribosome.
Confirmé dans les années 2000, la fonction catalytique du ribosome lors de la synthèse
protéique est en effet assurée par son ARN, ce qui fait du ribosome un ribozyme. Le cœur
catalytique du ribosome, composé de deux hélices d’ARN, appelé centre de transfert
peptidique, semble être le fossile moléculaire du premier catalyseur de la synthèse protéique.
II - Article #1 | K. Macé and R. Gillet - 2016 - Nucleic Acids Research 23
II - Article #1 | K. Macé and R. Gillet - 2016 - Nucleic

Acids Research
II.1 - Introduction de l’article #1
Origins of tmRNA: the missing link in the birth of protein synthesis?
K. Macé and R. Gillet Nucleic Acids Res. 2016 Sep 30;44

(17):8041-51.
Si l’évolution du monde ARN jusqu’à aujourd’hui semble bien connue, il reste une zone
d’ombre autour de la naissance d’une étape essentielle au commencement de la vie : la
synthèse protéique. En considérant que le monde ARN prend fin lorsque des proto-cellules
deviennent capables de synthétiser des petits peptides à partir d’un code génétique
élémentaire, ce passage fort symbolique vers un monde ribonucléoprotéique (RNP World)
reste mystérieux.
Nous avons décidé d’effectuer un travail de recherche théorique – et non une revue de
synthèse – afin de développer l’hypothèse d’une synthèse protéique ayant pour origine un
fossile moléculaire ARN, aujourd’hui présent uniquement chez les bactéries : l’ARN
transfert-messager (ARNtm). Il s’agit d’une molécule hybride ayant les caractéristiques à la
fois d’un ARN de transfert et celle d’un ARN messager. L’ARNtm joue le rôle de sauvetage
de la synthèse protéique lorsque celle-ci se bloque. L’article propose un modèle argumenté de
l’origine de la synthèse protéique, basé entre autres sur l’analyse de séquences de l’ARNtm.
Cette hypothèse a également permis de faire le point sur la répartition de l’ARNtm dans les
différents domaines du vivant tout en expliquant l’absence de l’ARNtm chez les archées ou
les cellules eucaryotes.
II.2 - Article #1
Illustration réalisée par Emilie Saucisse, 2016

II.3 - Conclusion de l’article #1
L’analyse de l’ARNtm, fossile moléculaire datant des étapes précoces de l’origine de la vie,
permet d’émettre une hypothèse sur la naissance de la synthèse protéique. Cette étape est un
évènement crucial de l’évolution, puisque le décryptage d’une information contenue dans une
molécule constitue le saut évolutif le plus important dans l’évolution de la vie.
Cette hypothèse permet également de faire le point sur la répartition de l’ARNtm dans les
différents domaines du vivant. Effectivement, l’absence de l’ARNtm chez les archées et
eucaryotes n’avait jamais été explicitée, ni l’exception de sa présence chez quelques
eucaryotes.
La trans-traduction assure aujourd’hui de nombreuses fonctions, en plus du sauvetage de la

synthèse protéique. Son rôle central dans la cellule en fait une cible bactérienne
particulièrement attractive pour le développement de nouveaux antibiotiques. Malgré la
complexification de la synthèse protéique au cours de l’évolution, comme nous allons le voir
lors du chapître suivant, l’ARNtm possède toujours la clé permettant de sauver le ribosome.
III - Le ribosome 39
III - Le ribosome
III.1 - Introduction - Le ribosome
Le ribosome est un complexe ribonucléoprotéique constitué de deux sous-unités. Chez les

bactéries, la petite sous-unité possède un coefficient de sédimentation de 30 Svedberg (30S) et
prend en charge l’ARNm. Elle est constituée de l’ARNr 16S (1 540 nucléotides) et de β1
protéines. La grande sous-unité 50S assure la catalyse des liaisons peptidiques entre les acides
aminés formant la protéine. Elle est composée de l’ARN βγS (β γ00 nucléotides), de l’ARN
5S (120 nucléotides) et de 34 protéines. Les deux sous-unités réunies forment le ribosome
complet 70S, composé de β/γ d’ARN et d’1/γ de protéines, pour une masse de β.7 million
Daltons (MDa) pour Escherichia coli. Éléments essentiels de la cellule, les ribosomes peuvent
représenter plus de 50% de la masse sèche d’une bactérie, cela représente plus de β0 000
ribosomes par cellule. Plusieurs ribosomes peuvent être associés et traduire simultanément un
même ARNm, on parle alors de polysomes.
Le ribosome est le catalyseur de la synthèse protéique, particulièrement au sens biochimique

pour son aide dans la formation de la liaison peptidique. Le ribosome accélère la réaction de
transfert peptidique par un facteur d'environ 105 (Trobro and Aqvist, 2005), ce qui est
beaucoup moins efficace que nombres d'enzymes protéiques qui accélèrent les réactions
jusqu'à 1023 fois (Kraut et al., 2003). Mais si aujourd’hui le ribosome n’a pas été remplacé par
une protéine, c’est qu’il est également un catalyseur dans un sens plus global. Il est
notamment le lieu de décryptage du code génétique qui permet d’obtenir des conditions
physico-chimiques et de proximités optimales pour tous les partenaires. De plus, le ribosome
permet une synchronisation des différentes étapes nécessaires à la traduction. Ces différentes
fonctions se sont optimisées au cours de l’évolution pour atteindre des capacités
impressionnantes de 15-20 codons décodés par seconde et ne commettant qu'une erreur pour
10 000 (Zaher and Green, 2009) acides aminés assemblés. La traduction est un processus très
dynamique et continu, qui a fait l’objet de très nombreuses études structurales à partir des
années 1970 jusqu’à aujourd’hui (β000, première structure du ribosome bactérien à haute
résolution (3 ångström = 3 Å) (pour le 30S : (Schluenzen et al., 2000; Wimberly et al., 2000)
(pour le 50S : (Ban et al., 2000) | 2015, première structure du ribosome humain à haute
résolution (3.6 Å) (Khatter et al., 2015)).
III.2 - Nomenclature du ribosome
III.2.1 - Nomenclature des ARN ribosomiques
Le ribosome procaryote est composé de trois ARNr : 23S, 16S et le 5S. Le 23S est codé par le
gène rrlA, le 5S par rrfH et le 16S par le gène rrsA, et ces gènes sont présents en plusieurs
copies chez tous les organismes. Les ARNr 23S et 16S sont découpés en six et quatre
domaines respectivement (Figure 1, A). Les ARNr forment de nombreuses hélices dans
l’espace : 45 pour l’ARN16S et 101 pour le 23S, numérotés selon leur ordre d’apparition dans
la séquence (Figure 1, B).
A
Figure 1. Structures secondaires et tertiaires de 16S, 23S et 5S ARNr. D’après Yusupov et al.,
2001, Science. (A) Les structures secondaires des ARNr 23S et 5S de T. thermophilus, avec indication
pour l'ARNr 23S des domaines I (bleu), II (cyan), III (vert), IV (jaune), V (rouge) et VI (magenta). Les
ARNr sont numérotés en fonction d’E. coli (69). (B) Structure secondaire de T. thermophilus ARNr
16S, avec les domaines 5 ', C, 3'M et 3'm en bleu-violet, magenta, rouge et jaune respectivement. (C)
Structure en trois dimensions de l'ARNr 16S à gauche et du 23S et 5S à droite, avec les domaines
colorés comme dans (B) et (A) respectivement.
III.2.2 - Nomenclature des protéines ribosomiques
III.2.2.A - Historique
La dénomination des protéines ribosomiques est devenue problématique dès le milieu des
années 1960, lorsque plusieurs groupes ont commencé à les purifier et les caractériser chez
Escherichia coli. Chaque laboratoire a conçu son propre système de nomenclature et ce chaos
a pris fin en 1971 après la mise en place d’un premier système de nomenclature universel.
Cependant le problème revint au milieu des années 1980, avec l’identification des protéines
ribosomiques d’archées et d’eucaryotes. À la fin des années 1980, le nombre de séquences de
protéines ribosomiques disponibles était devenu assez grand pour que les homologies soient
réalisées en toute confiance à travers les trois domaines du vivant. En 1989, un système de
nomenclature pour les archées et eucaryotes fût donc mis au point (Bergmann and Wittmann-
Liebold, 1990).
Cependant les premières structures cristallines de ribosomes eucaryotes en 2011 entraînèrent

une nouvelle confusion dans la dénomination de chaque protéine. Dans une étude publiée en
2012, un nouveau système pour nommer des protéines ribosomiques eucaryotes fut donc
proposé (Jenner et al., 2012). Plusieurs obstacles au changement furent identifiés, notamment
une réticence au changement des bases de données de séquence, par exemple, le fait que les
noms de l’ancien système soient déjà incorporés dans la littérature clinique qui traite des
maladies ribosomiques etc. La proposition fut donc discutée lors du « ribosome meeting » à
Napa, CA, en 2013 avant de donner naissance au nouveau système de nomenclature des
protéines ribosomiques, aujourd’hui universellement applicable (Ban et al., 2014).
III.2.2.B - La nouvelle nomenclature
Le système pour nommer les protéines ribosomiques actuel est décrit dans le tableau 2 (50S)
et le tableau 3 (30S) et, qui présentent les équivalences entre les différents systèmes de
désignation ancien et nouveau. Étant donné que les protéines ribosomiques d’E. coli furent les
premières à être isolées et entièrement séquencées, elles sont abondamment décrites dans la
littérature et servent ici de référence pour le nouveau système.
Tableau 2. Nouvelle nomenclature pour les protéines ribosomiques procaryotes de la grande

sous unité. D’après Ban et al., 2014, Curr Opin Struct Biol. En fond violet les protéines non
retrouvées chez la levure ou l’humain.
Tableau 3. Nouvelle nomenclature pour les protéines ribosomiques procaryotes de la petite sous
unité. D’après Ban et al., 2014, Curr Opin Struct Biol. En fond violet les protéines non retrouvées
chez la levure ou l’humain.
L’ancien système de nomination, c’est-à-dire LX pour une protéine de la grande sous unité et
SX pour la petite (où X est le numéro de la protéine) est conservé. À cela est rajouté un
préfixe. Les protéines trouvées dans les ribosomes de chacun des trois domaines sont
identifiées par le préfixe «u» (pour ubiquitaire). Les protéines bactériennes sans homologues
eucaryotes (ou archées) sont désignées par le préfixe «b», de même pour les eucaryotes par la
lettre « e » et pour les archées par le préfixe «a» (pour Archaea) (Figure 2).
III.3 - Structure du ribosome
Le ribosome est constitué de deux sous-unités, nommées 30S et 50S chez les bactéries La
petite sous-unité ou 30S se décompose en deux parties : la tête, avec une protubérance appelée
bec, et le corps qui possède plusieurs protubérances, l’éperon, l’épaule et la plate-forme. La
grande sous-unité ou 50S possède trois protubérances : la protubérance uL1 formée par
l’hélice H78 du βγS et de la protéine uL1 ; la protubérance centrale (PC) constitué de uL5,
bLγ1, de l’ARN βγS et 5S ; et la protubérance L7/L12 (nouvelle nomenclature bL12) formée
par les hélices H42, H43 et H44 du 23S avec la protéine L10 (Figure 2). Cette dernière
protubérance est de taille variable puisqu’elle vient se fixer au-dessus de la protéine L11,
suivie par plusieurs dimères bL12 (quatre chez E. coli, six chez T. thermophilus). Ce
complexe joue un rôle essentiel dans la fixation des facteurs GTP-dépendant lors de la
traduction (Deroo et al., 2012). Les deux sous-unités sont reliées au niveau de leurs interfaces
planes par une douzaine de ponts faisant intervenir des cations divalents Mg2+. La plupart de
ces ponts sont constitués d’interactions ARN-ARN ou ARN-protéine, et une seule implique
uniquement deux protéines (B1b). Le ribosome entier est une particule relativement
globulaire, sans symétrie et d’environ β5nm de diamètre. Il possède trois sites de liaison aux
ARNt : le site A (pour aminoacyl-ARNt); le site P (pour peptidyl-ARNt) et le site E (pour
exit) (Figure 3).
Figure 2. Structure du ribosome avec une orientation canonique. (A) Structure 3D du ribosome
en représentation volume sans couleur avec indication des zones facilement reconnaissables. (B)
Structure 3D du ribosome en représentation volume avec coloration des protéines ribosomiques qui
sont indiquées avec la double nomenclature. Les 3 ARNr sont de différentes nuances de gris. (C)
Structure du ribosome en représentation « carton » avec le même code couleur.
Figure 3. Structure du ribosome en représentation « carton ». D’après T. Martin Schmeing et V.

Ramakrishnan, 2009, Nature. (A) Orientation du ribosome identique à la figure précédante (N°2) avec
indication des ARNt et de l’ARNm. (B) Vue de la sous-unité 30S seule avec la présence des 3ARNt et de
l’ARNm. (C) Vue de la sous-unité 50S seule avec toujours la présence des 3 ARNt.
IV - Le cycle traductionnel 48
IV - Le cycle traductionnel
IV.1 - Introduction – Le cycle traductionnel
IV.1.1 - Les acides ribonucléiques de transfert, partenaires clés du ribosome au

cours de la synthèse protéique
Les acides ribonucléiques de transfert (ARNt) sont les acteurs clés de la traduction du code
génétique. Ils assurent la correspondance et le lien physique entre l'information génétique des
ARNm, sur lesquels ils déchiffrent les
codons successifs, et amènent les acides Box N°4 - Dès 1955, Francis Crick prédisait
l’existence de molécules adaptatrices faisant le lien
aminés correspondants pour la synthèse de entre le langage des acides nucléiques, porté par les
ARNm, et la chaîne polypeptidique naissante au
la protéine. Cette capacité à déchiffrer le niveau du ribosome. Ils furent découverts trois ans
code génétique provient du fait que l’ARNt plus tard par Mahlon Hoagland.
possède, d’une part, un triplet « anticodon » complémentaire d’un codon spécifique de
l’ARNm, et d’autre part, l’acide aminé correspondant au codon lié de manière covalente à son
extrémité γ’-CCA. Lorsqu'ils sont ainsi porteurs d'un acide aminé, on dit que ce sont des
aminoacyl-ARNt ou aa-ARNt. Il y a vingt acides aminés standards dans le code génétique,
plus deux autres encodés indirectement par des codons-stop qui sont recodés en codons
d'acides aminés dans certaines conditions. Il s’agit de la sélénocystéine (UGA) retrouvé dans
tout le règne vivant et la pyrrolysine (UAG) uniquement présent chez les archées
méthanogènes. Le chargement spécifique d’un acide aminé (aa) sur l’ARNt correspondant est
assuré par les aminoacyl-ARNt-synthétases (aaRS). Ces enzymes sont donc garantes du code
génétique au niveau biochimique.
Figure 4. Structures secondaires et tertiaires d'un ARNt canonique. Le code couleur utilisé n’est
pas conventionnel, mais correspond de l’article Macé & Gillet, β016. (A) Structure secondaire en
forme de trèfle d’un ARNt. (B) Structure secondaire en forme de L d’un ARNt. (C) Structure 3D
atomique d’un ARNt avec indication des bases de l’anticodon. (D) Structure 3D en représentation
volume d’un ARNt.
IV.1.1.A - Structure des ARNt
Les ARNt sont des acides ribonucléiques simple brin, de longueurs variant entre 74 et 98
nucléotides, avec une moyenne de 76. Ils se replient via des appariements canoniques
Watson-Crick de type (G-C) et (A-U) et des interactions tertiaires pour adopter une structure
comportant plusieurs tiges-boucles, en forme de « L » dans l’espace (Figure 4, B). En
structure secondaire, cinq régions sont définies :
- La tige acceptrice est une hélice sur laquelle l'acide aminé correspondant est estérifié. Le
premier appariement de l’hélice entre la guanine 1 (G1) et la cytosine 72 (C72) est
extrêmement conservé dans tous les ARNt, mis à part dans l’ARNtfMet (ARNt N-
formylméthionine) bactérien où l’on retrouve un mésappariement C1 : A72. Cette hélice
possède à son extrémité γ’ une séquence simple brin de quatre nucléotides de type NCCA-γ’.
Le nucléotide N est un discriminant important dans la spécificité des aaRS. La séquence
universellement conservée CCA porte à son extrémité γ’ l’acide aminé, lié de façon covalente
par une liaison ester entre le groupement hydroxyle β’ ou γ’ du ribose et le groupement
carboxyle de l’acide aminé.
- La tige-boucle D possède une hélice de trois ou quatre paires de bases et une boucle de 8 à
11 nucléotides possédant deux bases modifiées dihydrouridines (D), d’où le nom de la tige-
boucle.
- La tige-boucle anticodon possède la séquence anticodon dans sa boucle. L’hélice possède

toujours cinq paires de bases et la boucle est très conservée avec une séquence consensus
Py32-U33-XYZ-Pu37-N38, où Py représente une pyrimidine (C ou U), XYZ peut être
n’importe quel triplet de nucléotide et représente l’anticodon, Pu une purine (A ou G) et N
n’importe quel nucléotide.
- La tige-boucle T possède, comme la précédente, une hélice de cinq paires de bases et une
boucle de sept nucléotides. Cette boucle contient la séquence TΨC (T pour ribose-thymidine
et Ψ pour pseudouridine), donnant le nom de bras T à cette structure.
- En plus de ces structures très conservées, il existe une région variable entre la tige-boucle T
et anticodon, dont la longueur varie entre 4 et 24 nucléotides.
Ces quatre tiges se replient en trois dimensions pour former une structure en forme de "L" par
l'empilement coaxial deux à deux des tiges : le bras T sur bras accepteur d’une part, et le bras
anticodon sur le bras D d’autre part.
IV.1.1.B - Synthèse et modification post-transcriptionnel des ARNt
La synthèse des ARNt s’effectue généralement sous forme d’opérons transcrits donnant un
seul précurseur contenant plusieurs ARNt non matures. Le transcrit primaire est maturé par la
ribonucléase E et P. Chez les trois domaines du vivant, la maturation de certains ARNt fait
intervenir en plus une étape d’épissage d’un intron. Après maturation, les nucléotides des
ARNt subissent de nombreuses modifications. Les ARNt sont les ARN les plus modifiés dans
la cellule (Tableau 4).
Tableau 4. Diversité et proportion de nucléotides modifiés pour les différents types d’ARN.
D’après Rozenski J et al., 1999, NAR.
Type ARNt ARNsn ARNr ARNm

d’ARN 74–98 nt 70–1200 nt 1600–4000 nt 100–3000 nt
Nombre de nt 3–20 nt 0–13 nt 65–200 nt 0–5 nt

modiﬁé par ARN (3–26 %) (0–10 %) (1–3 %) (< 1 %)
Près de 25% des nucléotides des ARNt possèdent des modifications post-transcriptionnelles.
Ces modifications permettent d’élargir la diversité chimique et d'affiner la fonctionnalité des
molécules d'ARNt dans les trois domaines de la vie. Elles ont diverses fonctions comme la
stabilité de la structure tertiaire, la reconnaissance auprès des aaRS et de l’interaction avec le
facteur d’élongation EF-Tu (« facteur d'élongation thermo instable ») et le ribosome. À ce
jour, plus de 100 modifications chimiques différentes ont été identifiées.
IV.1.2 - Les aminoacyl-ARNt-synthétases (aaRS)
IV.1.2.A - Généralités et structure
Les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS) forment une famille de ligases qui catalysent
l'estérification des acides aminés sur l'extrémité
γ' des ARNt (l’aminoacylation). Chaque aaRS
Box N°4 - Chez Escherichia coli il existe 22
aminoacyl-ARNt synthétases, une pour chaque reconnaît spécifiquement un acide aminé et tous
acide aminé standard sauf la lysine qui en ses ARNt isoaccepteurs. Ce sont des protéines
possède deux + la pyrrolysine. essentielles pour la fidélité de la traduction du
code génétique, car elles garantissent que l'acide
aminé estérifié à l'extrémité de l'ARNt correspond au bon anticodon. Ce sont des enzymes très
anciennes, dont l’origine est estimée antérieure à LUCA (Last Universal Common Ancestor).
L'enzyme possède trois sites distincts, l'un pour la liaison de l'adénosine triphosphate (ATP)
afin de l’activer, l’autre pour la liaison de l’acide aminé spécifique et le troisième site pour la
fixation spécifique de l’ARNt. Ce sont les deux dernières caractéristiques qui valent aux aaRS
d’être considérées comme garantes du code génétique, nommé communément le second code
génétique. La reconnaissance spécifique entre l’aaRS et son ARNt correspondant implique
des interactions spécifiques localisées dans la branche acceptrice et de la branche anticodon. Il
existe cependant trois exceptions où il n’y a pas d’interaction au niveau de la branche
anticodon : LeuRS, SerRS et AlaRS.
Leur structure quaternaire est variable, allant du monomère (ArgRS) au tétramère (AlaRS).
Les aaRS sont classées en deux catégories :
- Les aminoacyl-ARNt synthétases de Classe I se fixent sur le petit sillon du bras accepteur,
estérifient l’acide aminé en β' de l'adénosine
terminale de l'ARNt. Leur structure est organisée Box N°5 – Le pli Rossman est une structure
typique commune à de nombreuses enzymes
autour d'un domaine constitué d'une alternance utilisant un cofacteur nucléotidique (ATP,
NAD+). Son nom provient de Michael
d’hélices alpha et feuillets bêta, appelé pli Rossmann, qui fut le premier à souligner la
fréquence de ce type de pli.
Rossmann.
- Les aminoacyl-ARNt synthétases de classe II se lient par le grand sillon de son bras
accepteur, estérifient l'acide aminé sur le 3'-OH de l'adénosine terminale de l'ARNt et
possèdent une structure construite autour d'un feuillet bêta antiparallèle.
IV.1.2.B - Le mécanisme d’aminoacylation
La réaction d’aminoacylation se décompose en deux étapes. Les aaRS activent d'abord l'acide
aminé en formant un aminoacyl-adénylate avec l'ATP. Cette activation induit une
modification conformationelle de l’aaRS rendant les sites de liaisons actifs à l’acide aminé et
à l’ARNt. Ensuite, l’enzyme catalyse la formation de la liaison ester entre l’acide aminé
activé et l’adénosine de l'ARNt.
acide aminé + ATP → aminoacyl-AMP + pyrophosphate
aminoacyl-AMP + ARNt → aminoacyl-ARNt + AMP

IV.2 - Les étapes du cycle traductionnel
La synthèse protéique est un processus complexe, auquel participent les ARN messagers
(ARNm), les ARN de transfert (ARNt) et le ribosome, mais aussi de nombreux facteurs
protéiques. Ce processus peut se diviser en quatre grandes étapes distinctes : le démarrage (ou
initiation), l'élongation, la terminaison et le recyclage (Figure 5).
Figure 5. Le cycle de traduction bactérienne. D’après T. Martin Schmeing & V. Ramakrishnan,

2009, Nature. Les quatre grandes étapes distinctes y sont présentées : le démarrage (Initiation),
l'élongation (Elongation), la terminaison (Release) et le recyclage (Recycling).
IV.2.1 – L’initiation de la traduction
IV.2.1.A - Introduction – L’initiation de la traduction
L’initiation de la traduction est l'étape de régulation post-transcriptionnelle de l'expression

d'un grand nombre de gènes et joue également un rôle important dans la stabilité des ARNm.
La phase d'initiation de la traduction commence par la formation d'un complexe d’initiation
30S (30S-IC), dans lequel une région de l’ARNm dite d’initiation à la traduction (TIR) est
décodée par l'anticodon CAU de l’ARNt-fMet. Le 30S-IC est alors rejoint par la grande sous-
unité ribosomique pour donner un complexe d'initiation 70S (70S-IC). Trois protéines, les
facteurs d'initiation (IF) IF1, IF2 et IF3, déterminent la cinétique et la fidélité de l'ensemble du
processus d'initiation. Les trois IFs se lient au complexe 30S-IC, et sont dissociées du
ribosome pendant la transition 30S-IC  70S-IC. IF2 est le dernier facteur à se dissocier,
laissant le ribosome prêt pour la formation de la première liaison peptidique et le début de la
phase d’élongation de la synthèse protéique. Il existe deux autres types d’initiations non
canoniques, via les ARNm « leaderless » (dépourvus de séquence de Shine Dalgarno) et le
« 70S-scanning ». Ce dernier mécanisme, récemment découvert, intervient lors de la
traduction d’un ARNm codant pour plusieurs gènes. Après la traduction de la première
séquence codante le ribosome ne se dissocie pas, et balaye la séquence en aval à la recherche
d’un nouveau site d'initiation (Yamamoto et al., 2016).
IV.2.1.B - Caractéristiques de la région TIR de l’ARNm
Bien que le triplet AUG soit de loin le codon d'initiation le plus fréquent, d'autres triplets
d'initiation sont possibles, notamment GUG, UUG, AUU, AUC et AUA, ayant pour point
commun la base U centrale. Parmi ces triplets, seuls ceux ayant un 3’-G (AUG, GUG et
UUG) sont reconnus comme '' canoniques''. De plus, le codon d’initiation AUG est utilisé
comme signal fort pour permettre la traduction d’ARNm « leaderless ». Aucun autre codon
potentiel (GUG, UUG ou CUG) ne peut remplacer AUG dans cette fonction.
Une autre caractéristique de la région TIR de l’ARNm est la présence de la séquence de

Shine-Dalgarno (SD) et de la séquence complémentaire à d'extrémité 3' de l'ARNr 16S (anti-
SD ou aSD). Le SD est constitué de 3 à 9 nucléotides consécutifs situés idéalement à une
distance de 4 à 9 nucléotides chez Escherichia coli en amont du codon d'initiation. La
séquence Shine-Dalgarno canonique complète est la suivante : AGGAGGUAA. Elle est
rarement retrouvée sous la forme complète, et comporte généralement 4 à 6 nucléotides
(exemples : AGGA ou GGAGG).
Lors de la formation du complexe d’initiation, cette séquence forme un appariement ARN-

ARN avec l’anti-SD à l'extrémité 3' de l'ARN ribosomique 16S, ce qui permet de pré-
positionner le ribosome. En fonction de la séquence, un SD peut avoir des interactions plus ou
moins fortes avec son anti-SD. C’est lors de la formation de la première liaison peptidique
que les interactions SD:anti-SD sont déstabilisées, ce qui est indispensable pour le
mouvement de l'ARNm le long du ribosome au cours de la première étape de translocation
(Uemura et al., 2007). Les données disponibles suggèrent que le duplex SD:anti-SD formé en
amont du triplet d'initiation confère à un ARNm donné un excellent moyen de renforcer

l'affinité thermodynamique du complexe productif 30S-ARNm et donc d'augmenter le nombre
global de traductions.
IV.2.1.C - Les étapes conduisant à la formation d’un ribosome fonctionnel
La transition du complexe 30S de pré-initiation (30S pre-IC) vers le 30S-IC implique un

mécanisme de verrouillage qui repose sur le changement conformationnel du fMet-ARNt
induit par IF2 et l'ARNm, qui stabilise les interactions entre les différents ligands. Le
verrouillage est l'étape limitant la vitesse de formation du complexe 30S-IC. L'étape
d'association des deux sous-unités représente le deuxième point de contrôle de l’initiation de
la traduction (Figure 6).
Figure 6. Schéma simplifié de l'initiation bactérienne. D’après Hiroshi Yamamoto et al., 2016,
PNAS. Enchainement du recrutement des facteurs d’initiation IF1 (bleu), IFβ (violet) accompagné de
l’fMETARNtfMet (rouge) et IFγ (vert) à la sous unité γ0S (jaune). L’arrivée de la sous-unité 50S (bleu)
au complexe 30S-IC provoque l’hydrolyse du GTP d’IFβ et le départ des facteurs.
Le facteur IF3 est le premier facteur à se lier à la sous-unité 30S, formant un complexe
instable. La liaison ultérieure d’IF1 stabilise les facteurs au 30S. Ce complexe sur lequel
l’ARNm est recruté, ainsi qu’IF2 lié à la branche acceptrice du fMet-ARNtfMet, forme le
complexe de transition 30S pré-IC. Le passage du complexe pré-IC au 30S-IC est
accompagné d'une stabilisation de l'interaction 30S-ARNm entièrement attribuable à la mise
en place de l’ARNm dans le canal messager ainsi qu’à l’appariement codon-anticodon dans le
site P. Cette étape réduit l’affinité d’IF3 au 30S-IC, ce qui facilite l’accostage de la sous-unité
50S.
Le 30S-IC, contenant ses ligands canoniques (fMet-ARNtfMet, l'ARNm avec un codon

d'initiation et les trois facteurs d’initiation), est très rapidement accosté par la sous-unité
ribosomique 50S, donnant naissance à un complexe 70S-IC initialement instable. IF3 se
dissocie en même temps que la mise en place des ponts 30S-50S lors de la fixation du 50S au
complexe 30S-IC (Fabbretti et al., 2007). Le complexe 70S-IC présente une rotation des deux
sous-unités (voir chap. élongation). Le contact entre IF2 et le GAC (GTPase Activating
Center) et la SRL (α- Sarcin Ricin Loop) de la sous-unité 50S déclenche l’hydrolyse du GTP
d’IFβ. Le phosphate inorganique (Pi) produit n’est pas libéré instantanément, et reste lié avec
IF2 sur le ribosome sous forme GDP-Pi. Pendant ce temps, le complexe subit les
modifications structurales nécessaires pour devenir productif ; essentiellement le départ d’IF1,
le déplacement d’IF2 et le retour du ribosome dans un état classique. La dissociation du Pi de
IF2 promeut son changement de conformation, perdant ainsi son contact avec le fMet-
ARNtfMet, dont l'extrémité acceptrice peut maintenant se loger dans le site de P. Suite au
départ d’IF2, le ribosome fonctionnel peut débuter le cycle d’élongation (Gualerzi and Pon,
2015).
IV.2.2 - L’élongation
IV.2.2.A - Introduction – L’élongation
Le cycle d'élongation est un processus en plusieurs sous-étapes aboutissant à l'addition

séquentielle d'acides aminés à la chaîne polypeptidique en croissance. Chaque cycle
d’élongation permet d’apporter un nouvel acide
aminé, ce qui implique une sélection précise de
chaque ARNt dicté par le codon de l'ARNm, la Box N°6 - EF-Tu es la protéine la plus
abondante dans la cellule bactérienne,
catalyse de la formation d'une liaison peptidique, représentant jusqu'à 5% des protéines totales.
et le mouvement des ARNt et de l'ARNm. Le

processus nécessite deux facteurs GTPasiques : le facteur d'élongation thermo instable (EF-
Tu) et le facteur d'élongation G (EF-G). À chaque sous-étape de grands changements
conformationnels se produisent au sein du ribosome.
IV.2.2.B - Les étapes du cycle d’élongation
IV.2.2.B.1 - Liaison du complexe ternaire
La liaison du complexe ternaire est rapide et indépendante de l'ARNm via des interactions
avec la protéine bL12. Une fois le complexe lié au site A du ribosome, l'ARNt est positionné
pour interagir avec le codon de l’ARNm. La reconnaissance correcte codon-anticodon induit
un changement conformationnel. Dans l'ARNr 16S des résidus très conservés, A1492, A1493
de l’hélice h44 et G530 de l’hélice h18, interagissent avec la première et la deuxième base de
l’anticodon. De plus, la sérine 46 (nomenclature Escherichia coli) de la protéine ribosomique
uS12 est impliquée dans la reconnaissance de la seconde paire de bases. Tous ces éléments
constituent le centre de décodage.
IV.2.2.B.2 - Le décodage
IV.2.2.B.2.1 -Introduction – Reconnaissance codon-anticodon
L'appariement codon-anticodon se fait dans le ribosome, par complémentarité de bases. De

manière évidente, ce sont les positions γ4, γ5 et γ6 de l’ARNt, correspondant à l’anticodon,
qui interviennent dans la reconnaissance. Les modifications post-traductionnelles situées dans
la tige-boucle anticodon sont également importantes lors du processus. D’autre part, en 1966,
F. Crick énonce des règles d'associations codon-anticodon grâce auxquelles un nombre
minimal de 32 ARNt est nécessaire (wobble hypothesis) (Crick, 1966). En effet, il est possible
que des ARNt possèdent un nucléotide non canonique en position 34 de leur anticodon :
l'inosine (renfermant une base inhabituelle : l'hypoxanthine) qui peut s'associer (faiblement)
par liaisons hydrogène avec U, C ou A. Ces appariements non canoniques sont appelés le «
wobble pairing » (littéralement « appariement bancal ») et permettent donc de réduire le
nombre d'ARNt nécessaires à la traduction du code génétique, en autorisant la lecture de
différents codons synonymes par un seul et même ARNt.
Les nucléotides adjacents jouent également un rôle dans la reconnaissance codon-anticodon.

Ainsi la position γγ est toujours un uracile (U) jamais modifié. A l’inverse, la position 37 est
une purine (A ou G) fréquemment modifiée. Le rôle de celle-ci est associé au maintien à la
fois de l'efficacité et de la fidélité de la traduction. Cette modification est fréquente lorsque la
base en position 36 est une adénine ou un uracile. Effectivement, pour les interactions A:U ou
U:A, la modification empêche la formation de paires de bases dans la structure tige-boucle de
l'anticodon et réduit ainsi le risque de déphasage (Vendeix et al., 2008). Étonnamment
d’autres bases situées dans le corps de l’ARNt jouent également un rôle dans cette
reconnaissance en intervenant dans la distorsion de l’ARNt au cours du processus de
décodage.
Il est désormais évident que le ribosome ne fait aucune distinction entre la géométrie des
paires de bases « Watson-Crick » et « wobble pairing ». Le mécanisme actuel établit en outre
que la discrimination entre les ARNt est principalement fondée sur l'ajustement spatial,
notamment grâce à la conformation unique et caractéristique de chaque ARNt, plutôt que sur
le nombre de liaisons hydrogène entre le centre de décodage et le duplex codon-anticodon
(Rozov et al., 2016).
IV.2.2.B.2.2 - Les étapes du décodage
Le processus de décodage se décompose en une série d'étapes comprenant : (a) la liaison

rapide et réversible du complexe ternaire au centre de décodage ; (b) la stabilisation de
l’ARNt ; (c) la communication entre l’ARNt apparié et EF-TuGTP ; (d) le déclenchement de
l’hydrolyse du GTP ; (e) la dissociation d’EF-TuGDP du ribosome et l’accommodation de
l’ARNt dans le centre de transfert peptidique (PTC).
Figure 7. Les différentes étapes de l’arrivée d’un nouveau ARNt par EF-Tu au ribosome.
D’après Voorhees R.M et Ramakrishnan V., 2013, Annu. Rev. Biochem. L’image (a) explique le code
couleur utilisé.
IV.2.2.B.2.2.1 - Distorsions dans le Corps de l’ARNt
En plus de l’appariement des bases codon-anticodon, le corps de l’ARNt joue également un

rôle essentiel dans le décodage. La liaison du complexe ternaire au ribosome entraîne en effet
la formation d’un état A / T de l’ARNt. Cette conformation induit deux zones de déformation
de l’ARNt : une torsion de la tige anticodon et un mouvement de la tige D par rapport à la tige
T. La séquence du corps de l’ARNt qui permet sa déformation pour être dans l’état A/T est
réglée avec précision à l'identité de l'acide aminé, tout comme la force d'interaction codon
anticodon. Ainsi, chaque ARNt possède un équilibre d'énergie unique qui permet un décodage
précis.
IV.2.2.B.2.2.2 - Facteur d’élongation Tu
En même temps que la déformation du corps de l'ARNt, EF-Tu subit un réarrangement

corformationnel. EF-Tu es composé de trois domaines : le domaine 1 ou domaine GTPasique
dont la structure et la séquence sont conservées dans tous les GTPases ; le domaine 2 qui est
localisé au niveau de l’épaule du γ0S lors de sa liaison ; le domaine 3 qui intervient dans les
interactions avec l’ARNt.
IV.2.2.B.2.2.3 - L'activation de la GTPase et l’hydrolyse du GTP
L’hydrolyse du GTP est initialement empêchée par une porte hydrophobe composée des
résidus Val20 et Ile60. Lors de l'activation GTPasique, l’Histidine 84 passe la porte
hydrophobe et coordonne une molécule d'eau qui attaque le -phosphate du GTP. Les
mouvements à l'intérieur de EF-Tu ( -tour), de l'ARNt (extrémité 3') et du ribosome
(fermeture tête/épaule du 30S) sont nécessaires pour l'activation GTPasique.
Figure 8. Hydrolyse du GTP d’EF-Tu lors de l’élongation. D’après Rebecca M. Voorhees et V.

Ramakrishnan, 2013, Annu. Rev. Biochem. Conformation d’EF-Tu avant liaison au ribosome,
l'histidine est dans une conformation catalytique inactive, éloignée du GTP. EF-Tu lié au ribosome en
interaction avec le résidu Aβ66β de la boucle de sarcine ricine (SRL) (cyan) active l’hydrolyse en
positionnant l’His84 (switch II) dans le site actif. Après hydrolyse du GTP et la libération de Pi, la
boucle du switch I (Ile60) est désordonnée (ligne pointillée) et His84 est revenue à une conformation
inactive, en contact avec le résidu G2661 du SRL.
À la suite de l'hydrolyse du GTP et de la libération du Pi, les interactions avec la boucle du

switch I (Figure 8) se désordonnent. EF-Tu subit alors un changement conformationnel, ce qui
implique une rotation du domaine 2 par rapport au domaine 3. Ce mouvement perturbe les
interactions du domaine GTPasique avec la boucle SRL du 21S, ainsi que ceux entre switch II
(Figure 8) et le bras accepteur de l’ARNt. L’ensemble de ces réarrangements affaiblit les
interactions d’EF-Tu-GDP avec le ribosome et provoque sa dissociation.
IV.2.2.B.2.2.4 - Hébergement et Relecture
Après la sortie d’EF-Tu, l'aminoacyl ARNt est essentiellement maintenu sur le ribosome par
ses interactions avec le centre de décodage. Bien que les ARNt non correspondant soient pour
la plupart rejetés lors de l'étape initiale, ils peuvent aussi se dissocier du ribosome après
hydrolyse du GTP, lors d’une sous-étape nommée « proofreading ». Effectivement, un ARNt
mal apparenté possède des interactions plus faibles avec le centre de décodage, et se dissocie
plus facilement. A l’inverse, un ARNt avec de fortes interactions au centre de décodage a
donc une conformation stable, ce qui facilite son logement dans le centre peptidyl transférase.
Le positionnement de l’aminoacyl-ARNt dans le centre de transfert peptidique conduit à la
formation rapide d'une liaison peptidique, ce qui représente la fin d'un cycle de décodage
réussi.
IV.2.2.C - Le transfert peptidique
La liaison peptidique est réalisée dans le centre de transfert peptidique (PTC) qui réside au
cœur de la grande sous-unité ribosomique. Le PTC est un ribozyme qui catalyse les deux
principales réactions chimiques de synthèse protéique : formation d'une liaison peptidique et
libération du peptide. La liaison peptidique est une attaque nucléophile du groupement amine
de l’aa-ARNt sur le carbone du groupement carboxyl de la liaison ester du petidyl-ARNt,
formant ainsi une nouvelle liaison peptidique.
Les données biochimiques suggèrent que le transfert peptidique est catalysé par des effets
entropiques seuls. Le PTC catalyse cette réaction principalement en formant un réseau de
liaisons hydrogène qui positionne précisément les substrats et par l'exclusion d’une molécule
d’eau. (Figure 9) (Hiller et al., 2011; Sharma et al., 2005).
Figure 9. Le transfert peptidique via l’attaque nucléophile. D’après Rebecca M. Voorhees & V.
Ramakrishnan, 2013, Annu. Rev. Biochem. (A) le transfert peptidyl implique l'attaque nucléophile du
groupe α-amino de l'ARN de transfert aminoacyle (ARNt) (magenta) sur la peptidyl-ester de la
peptidyl-ARNt (vert). (B) Schéma du mécanisme de l’attaque nucléophile et du transfert peptidique.
IV.2.2.D - La translocation
IV.2.2.D.1 - Introduction – La translocation
Après formation de la liaison peptidique, le ribosome dispose d’un ARNt déacylé dans le site
P et un peptidyl-ARNt, allongé d’un résidu dans le site A. Dans l'étape suivante, connue sous
le nom de translocation, les ARNt du site A et P (état de pré-translocation ou PRE) passent
dans les sites P et E respectivement (état post-translocation ou POST), et l'ARNm se déplace
précisément d’un codon, ce qui porte le codon suivant dans le site de décodage pour permettre
un nouveau cycle d’élongation. La translocation est une propriété inhérente du ribosome, qui
peut s’effectuer spontanément - quoiqu’extrêmement lent – dans les deux sens, en avant et en
arrière. Dans la cellule, la translocation est favorisée par EF-G. La translocation comprend de
grands mouvements avec de nombreux états intermédiaires et implique des changements
conformationnels à grande échelle.
IV.2.2.D.2 - Les états intermédiaires durant la translocation
La translocation produit des états intermédiaires dans lesquels les ARNt se déplacent dans une
sous-unité mais pas dans l'autre. Plus précisément, l’état hybride A/P et P/E des ARNt
correspond à la position des extrémités CCA-3' des ARNt dans les sites P et E de la sous-unité
50S, tandis que leurs extrémités anticodon et l'ARNm restent ancrés dans la sous-unité 30S
dans les sites A et P. Après la liaison d’EF-G et l'hydrolyse du GTP, l'ARNm et l’extrémité
anticodon de l’ARNt se déplacent dans les sites P et E de la sous-unité 30S pour restaurer
l'état canonique du ribosome, laissant le site A vide et prêt à accepter le prochain aminoacyl-
ARNt. Un aminoacyl-ARNt dans le site A favorise l’état canonique A/A, alors qu'un peptidyl-
ARNt favorise l'état intermédiaire A/P, ce qui démontre que le transfert peptidique entraîne la
formation d'états hybrides, même en l'absence d’EF-G. De plus, seul un ARNt déacylé peut se
lier au site E de la sous-unité 50S, assurant ainsi que l’état hybride P/E ne se forme qu’après
le transfert du peptide. La formation de l'état P/E A/A précède la formation de l'état P/E A/P
dans l’ordre des événements.
IV.2.2.D.3 - « Ratcheting » des sous-unités pendant la translocation
La formation d'états hybrides pendant la translocation est couplée à une rotation inverse des
sous-unités. Ce mouvement, appelé « ratchet », correspond à la rotation de 7° de la sous-unité
30S par rapport à la sous-unité 50S. Cette rotation s’accompagne d’un mouvement de la
protubérance uL1 vers l'intérieur du ribosome, ce qui stabilise l’état intermédiaire P/E de
l'ARNt (Figure 10). Dans l'état canonique, un rétrécissement ou une barrière entre la tête et la
plate-forme de la sous-unité 30S inhibe la translocation de la tige anticodon de l'ARNt du site
P au site E. Pour réaliser la translocation, la tête doit alors pivoter de 18°, un mouvement
appelé « swiveling ». Plus exactement, la translocation se déroule au travers d’une série
d'états intermédiaires de degré de rotation de la sous-unité 30S (« ratchet ») et de pivotement
de la tête (« swiveling »).
Figure 10. Structure du ribosome à l’état canonique et à l’état « ratcheté ». D’après Jie Zhou et
al., 2014, Science. (A) Ribosome à l’état canonique avec les ARNts en position A/A et P/P ; (B) État
intermédiaire de la translocation montrant le ribosome à l’état ratcheté avec un fort « swiveling ». (Les
angles de rotations sont indiqués) avec les ARNts en position hybride pe/E et ap/ap.
IV.2.2.D.4 - Mouvement de l’ARNm et des ARNt dans la sous-unité 30S
La seconde étape de la translocation catalysée par EF-G est le mouvement de l'ARNm et des
ARNt par rapport à la sous-unité 30S. Le déplacement de l'ARNm s’effectue en simultané
avec l’ARNt, et l'appariement des bases entre elles semble être maintenue tout au long de la
translocation. Le domaine IV d’EF-G est en contact direct avec l’interaction codon-anticodon.
Cette interaction est initialement formée dans le site A et persiste tout au long de la
translocation. Cependant, l’action précise d’EF-G dans cette dernière étape de translocation
n’est pas connue. L’affinité de l’ARNt pour le site E est diminuée lorsque le site A est occupé,
et vice versa. Ainsi il ne se dissocie que lorsque l’aminoacyl ARNt suivant s’apparie au
ribosome (Dinos et al., 2005).
IV.2.2.D.5 - Facteur d’Elongation G
EF-G catalyse la translocation des ARNt et de l'ARNm dans le ribosome. La structure d’EF-G
mime structuralement le complexe ternaire ARNt-EF-TuGTP (Figure 11).
A B
Figure 11. Comparaison structurale entre le complexe ternaire ARNt-EF-TuGTP et EF-

GGTP. D’après Pulk A and Cate JH, 2013, Science. Mise en lumière de la ressemblance structurale
entre le complexe ARNt-EF-Tu et EF-G en présence tous deux de GTP. (A) Structure
cristallographique d’EF-GGTP avec les différents domaines indiqués : domaine I ou G (vert),
domaine II (violet), domaine III (vert), le domaine IV (orange) et le domaine V (bleu). (B) Structure
tridimensionnel cristallographique d’EF-TuGTP-ARNt lié au ribosome lors de la reconnaissance
codon/anticodon. EF-TuGTP domaine I (vert), II (violet) et III (vert clair) qui retient l’ARNt (bleu)
par l’extrémité CCAγ’.
EF-GGTP peut se lier au ribosome, que ce dernier soit sous une forme pivotée (« ratchet »)
ou non. EF-G accélère considérablement la translocation, le modèle actuel concluant que la
fixation d’EF-G et l'hydrolyse du GTP conduisent à une étape de déverrouillage, qui est suivie
par une translocation et un re-verrouillage. La question est de savoir si l'énergie libérée par
l'hydrolyse du GTP est utilisée pour conduire la translocation directement, ou si elle est
utilisée pour fournir un gradient d'énergie libre pour un « ratchet brownien ». Cette dernière
hypothèse est actuellement privilégiée (Chen et al., 2016).
IV.2.2.D.6 - L'État de post-translocation
Un mouvement de retour de la sous-unité 30S (rotation inverse du ratchet) remet le ribosome

dans l'état canonique avec des ARNt dans les sites P et E. Lors de ce mouvement, il a été
suggéré que uL1 tire l'ARNt à partir du site hybride P/E au site E, du fait des contacts entre
uL1 et l’ARNt à l’état P/E (Valle et al., 2003). Cependant, le mutant uL1 montre une
performance inchangée de la réaction de translocation, indiquant qu’il est peu probable que
uL1 joue un rôle actif dans la translocation (Sander, 1983). À la fin de la translocation, la
pointe du domaine IV d’EF-G est dans le site P en contact avec le couple codon-anticodon.
Après le départ d’EF-G, le site A est pourvu d’un nouveau codon. Lors de l’arrivée d’un
nouvel ARNt dans le site A, uL1 pivote et s’éloigne de l'ARNt du site E (en conformation
ouverte), qui est ainsi facilement libéré. uL1 pourrait donc avoir comme fonction d’être une
porte pour le site E et de contrôler la libération de l’ARNt (Feng et al., 2013; Rheinberger and
Nierhaus, 1983).
IV.2.3 - La terminaison
Les cycles d’élongation continuent itérativement jusqu’à l’arrivée d’un codon de terminaison
dans le site A. Ces codons ne sont pas reconnus pas des ARNt (sauf cas particulier de la
sélénocysteine et de la pyrrolysine) mais par deux protéines, les facteurs de terminaison RF1
et RF2 (« Realease Factors »). Le codon UAG est reconnu par RF1, UGA par RF2, tandis
qu’UAA est reconnu par les deux facteurs. Les séquences de RF1 et RF2 sont homologues
(Ito et al., 1996; Nakamura et al., 1995) et leurs structures tridimensionnelles sont semblables
(Shin et al., 2004; Vestergaard et al., 2001). Les motifs tripeptidiques PxT (Pro-X-Thr) de
RF1 et SPF (Ser-Pro-Phe) de RF2 leur confèrent une spécificité pour les codons stop UAG et
UGA, respectivement. Les deux facteurs de terminaison libèrent la protéine de manière
universelle en catalysant, via motif de GGQ (Gly-Gly-Gln), l’hydrolyse de la liaison ester
entre le peptide et l’ARNt.
IV.2.3.1 - Structure des facteurs de terminaison et interaction avec le ribosome.
La fixation des facteurs de terminaison au site A du ribosome ne provoque pas de changement

conformationnel à grande échelle du ribosome (Figure 12). Les facteurs de terminaison se
composent de quatre domaines. Le domaine I est lié au centre GTPasique (uL11 ribosomal
protein). Le domaine II possède le motif PxT pour RF1 qui permet la reconnaissance
spécifique des codons stop UAA et UAG, et le motif SPF pour RF2 qui reconnait UAA et
UGA. Le domaine III interagit avec le peptidyl-ARNt et possède le motif GGQ responsable
de l’hydrolyse peptidique. Entre le domaine III et IV il y a une « switch loop » conservé qui
intervient également dans la reconnaissance du codon stop. Enfin le domaine IV qui participe
au réarrangement structural du facteur de terminaison après reconnaissance du codon stop.
Figure 12. Structure du facteur de terminaison RF1 et RF2. Adapté d’après Andrei A. Korostelev,
2011, RNA et Bruno P. Klaholz, 2011, Trends in Biochemical Sciences. (A) Structure du ribosome en
complexe avec RF1 (bleu). (B) Structure de RF2 dans la conformation liée au ribosome. La structure
est colorée en fonction de l’organisation des quatre domaines; GGQ, PVT/SPF motifs ainsi que la
« switch loop » sont indiqués en vert. (C) Comparaison d’un ARNt dans le site A aux domaines β, γ
et 4 de RF2.
IV.2.3.2 - Reconnaissance du codon de terminaison
Les motifs PxT et SPF servent "d’anticodons tripeptidiques" (Wilson et al., 2000). Les acides
aminés situés dans d'autres régions de facteurs de libération, sont également impliqués dans la
reconnaissance du codon stop (Ito et al., 1998). La reconnaissance du codon stop implique des
éléments conservés de RF1 / RF2 et l'ARNr 16S (Figure 13). Trois nucléotides clés de l’ARN
16S, du centre de décodage universellement conservé G530, A1492 et A1493, subissent des
changements conformationnels cruciaux pour la reconnaissance du codon stop. Les
nucléotides du codon stop sont appelés U1, A2 ou G2, et A3 ou G3. La reconnaissance du
nucléotide U1 s’effectue par la formation de liaisons hydrogènes spécifiques avec la pointe
d’une hélice du facteur de terminaison. Ces interactions sont identiques pour RF1 et RF2 et
représentent la caractéristique universelle de la présence d’un uracile en première position des
trois codons d'arrêt. Pour le second nucléotide, les motifs PxT et SPF définissent la spécificité
des facteurs de libération (Korostelev et al., 2010; Laurberg et al., 2008). Intervient également
dans la spécificité tout un réseau d’interaction hors du motif Pxt et SPF (Young et al., 2010).
La reconnaissance du troisième nucléotide du codon stop s’effectue avec le nucléotide G530
du centre de décodage. Pour RF1 c’est la présence d’une glutamine à l'extrémité N-terminale
de la boucle de reconnaissance qui créer une liaison hydrogène avec l’Aγ ou Gγ. Pour RF2,
c’est une valine à cette position, qui ne peut réaliser cette interaction. Cela explique la
capacité de RF1 à reconnaître un A ou G en troisième position (Korostelev et al., 2008).
Figure 13. Reconnaissance spécifique des codons stop par les facteurs RF1 et RF2. D’après
Andrei A. Korostelev, 2011, RNA. (A) Interactions entre les deux premières bases du codon stop UAA
et UAG par RF1 et UAA et UGA par RF2. (B) Interactions entre la troisième base du codon stop UAA
et UAG par RF1 et UAA et UGA par RF2.
IV.2.3.3 - Hydrolyse et libération de la protéine
L’hydrolyse du peptidyl ARNt est assurée par un motif tripeptidique universellement

conservé GGQ (Gly-Gly-Gln). Le motif GGQ se lie au centre de transfert peptidique, aidé par
des interactions spécifiques avec bL27 (Svidritskiy et al., 2016). La petite taille du squelette
des glycines permet un placement optimal du groupe NH2 catalytique de la glutamine (Figure
14). Effectivement, la glutamine joue le rôle de catalyseur en stabilisant une étape
intermédiaire dans la réaction d’hydrolyse, via une liaison hydrogène avec le groupe NH de
son squelette.
Figure 14. Schéma de la réaction d'hydrolyse du peptidyl-ARNt. D’après Andrei A. Korostelev,

2011, RNA. Le facteur de terminaison est en vert et le polypeptide en violet. La molécule d'eau est
positionnée pour une attaque nucléophile du groupement OH du ribose 76 du peptidyl-ARNt. Puis un
état de transition est stabilisé de (« tetrahedral transition-state intermediate »). Enfin le peptide est
libéré après l'hydrolyse, le groupe OH 3’ libre de l’ARNt du site P déacylé effectue une liaison
hydrogène avec le squelette de la glutamine. Cependant, ça ne serait pas une molécule d’eau mais
plutôt un ion hydroxyde qui réalise l’attaque nucléophile (Indrisiunaite et al., 2015).
IV.2.3.4 - Départ des facteurs de terminaison
La libération de RF1/2 du ribosome est facilitée par RF3 d'une manière GTP-dépendante
(Freistroffer et al., 1997). RF3 libre dans le cytoplasme existe principalement dans la forme
GDP. Contrairement à EF-Tu, l’échange du GDP en GTP pour RFγ s’effectue dans le
ribosome via un complexe avec RF1/2 (Zavialov et al., 2001). Après la libération de la
protéine naissante, RF3GDP est recruté sous une forme fermée. Après stabilisation rapide de
RF3 au ribosome, le GDP est libéré et RF3 prend une conformation semi-ouverte. À ce stade,
RF3 est en contact direct avec bL12, RF1/2 et la protéine uS12. Après le recrutement du GTP
par RF3, RF3GTP prend une conformation ouverte et induit un mouvement de rotation
(ratchet) du ribosome qui provoque le départ de RF1/2 et place l’ARNt déacylé dans un état
hybride P/E (Gao et al., 2007). Cette conformation marque le début de l'activité GTPase de
RFγ conduisant à l’hydrolyse du GTP et à la libération de PiRF3GDP. Ce dernier se
dissocie du complexe ribosomique dans sa conformation fermée et le ribosome est alors prêt
pour le recyclage (Zavialov et al., 2002).
IV.2.4 - Le recyclage
Afin de pouvoir recommencer un nouveau cycle de traduction, le ribosome nécessite une

dernière étape afin que les deux sous-unités soient séparées et que l’ARNm et l’ARNt déacylé
soient dissociés. Cette fonction est assurée par le facteur de recyclage du ribosome RRF
(« Ribosome Recycling Factor ») associé à la protéine EF-G (Hirashima and Kaji, 1973). RRF
se fixe au niveau du site A du ribosome « ratcheté », amenant l’extrémité de son domaine I à
proximité de l’ARNt déacylé dans le site P (Pai et al., 2008; Wilson et al., 2005). EF-G vient
alors se fixer au complexe, induisant une rotation des domaines de RRF, qui effectue ensuite
l’ouverture des ponts et divise les deux sous-unités du ribosome. EF-G, via la boucle II de son
domaine IV, est directement impliqué dans la perturbation du principal pont entre hélice 44
(30S) et l'hélice 69 (50S) (B2a). EF-G est impliqué dans le processus de séparation finale en
jouant un rôle actif en plus de faciliter l'orientation RRF. Enfin, lors de l'hydrolyse du GTP,
EF-G change de conformation et sépare ainsi complètement le ribosome en deux sous-unités
(Zhang et al., 2015).
V - Gros plan sur EF-G : au cœur du mécanisme de translocation 70
V - Gros plan sur EF-G : au cœur du mécanisme de

translocation
V.1 - Introduction – Au cœur du mécanisme de translocation

Au cours d'un cycle d'élongation un ribosome oscille entre deux états principaux, à savoir la
pré-translocation (PRE) et la post-translocation (POST), qui sont séparés par des barrières
élevées d'énergie. Dans l'état PRE classique, les ARNt sont dans les sites A/A et P/P, puis
après un mouvement de rotation (« ratchet ») de la petite sous-unité ribosomique, les ARNt se
retrouvent dans des états intermédiaires A/P, P/E (état H1-PRE). Cette rotation est couplée à
un mouvement de 30 ° vers l'intérieur de la protubérance L1.
V.2 - Le « swiveling » de la tête du 30S

Lorsque EF-GGTP se lie à un état PRE ou H1-PRE du ribosome, il induit une forte
modification conformationnelle du 30S : la tête pivote par rapport au corps (« swiveling »)
d’environ 18 ° vers le site E. Dans les états intermédiaires de translocation, le complexe
ribosome/EF-G contenant l'ARNm et deux ARNt dans un état hybride, où les anticodons ont
déjà quitté les sites P et A de la petite sous-unité, mais n’ont pas encore atteint les sites E et P,
respectivement. En conséquence, ces états hybrides observés sur les intermédiaires de
translocation sont des inter-états appelés pe/E et les sites ap/P.
La tête de la petite sous-unité ribosomique est connectée au corps par une région appelée cou.
Le mouvement de « swiveling » n’est pas juste un penchement de la tête au niveau du cou,
mais plutôt une flexion en deux points d'articulation ou charnières (Mohan et al., 2014). La
première charnière se situe dans l’hélice H28, formée par la seule liaison covalente entre la
tête et le corps. La seconde est non covalente, composée de l’hélice H35/36 de la tête, qui
interagit avec l’hélice H2 du corps (Figure 15). Le mouvement des deux points d'articulation
est strictement corrélé, conduisant au mouvement en un seul bloc de la tête, mais nous
ignorons toujours comment EF-G déclenche ce mouvement.
Figure 15. La rotation de la tête résulte de l'articulation concertée des charnières 1 et 2. D’après
John Achenbach et Knud H. Nierhaus, 2014, Biochimie. (A) Structure secondaire et tertiaire des
hélices formant le noyau de la tête 30S (rouge) ainsi que leurs connexions avec les hélices du corps
(bleu). Les lignes en pointillés indiquent les connexions de l'hélice h36 et de h2. En orange, la
structure de la tête et en grise la structure du corps. (B) Les flèches montrent le mouvement autour
charnière 1 et charnière 2 et la rotation de la tête de domaine 30S autour de l'axe E-R. Les cylindres
montrent la position des hélices dans pour l’état classique (bleu sarcelle) et l’état « swiveling » de la
tête (magenta). (C) Lors de la rotation de la tête, le mouvement de la charnière 1 est provoqué par le
redressement de l'hélice H28; le déplacement orthogonal de charnière 2 est le résultat du pivotement
de l'hélice h34 autour de h35 statique. Les lignes pointillées représentent les interactions hydrogènes
entre les deux charnières.
V.3 - Casser l’état PRE
L’ARNt du site A forme un réseau de liaisons hydrogène avec le codon et le centre de

décodage (voir chap. Liaison du complexe tertiaire), stabilisant ainsi l'état PRE. Tous les
résidus du centre de décodage appartiennent au corps du 30S. Pendant la rotation de la tête, le
complexe ARNt/ARNm se déplace donc par rapport au corps. Il en résulte que ce réseau de
liaisons hydrogène est affaibli ou perturbé avant que le duo ARNt/ARNm ne passe au site P.
C’est notamment la pointe du domaine IV d’EF-G contenant deux boucles hautement
conservées (boucles I et II) qui interagissent avec le centre de décodage par des liaisons
hydrogène, en remplaçant le réseau de liaisons hydrogène du duplex codon-anticodon. Cela
permet le déplacement concomitant du duo codon-anticodon du site A à P pendant la rotation
de la tête.
V.4 - Le passage de l’ARNt du site P à E
En plus du mouvement de l’ARNt/ARNm du site A au site P, la sous-unité 30S est impliquée

dans un deuxième mouvement, à savoir le déplacement de la tige-boucle de l'anticodon de
l’ARNt du site P vers le site E. L’ARNt du site P doit passer une porte sur le chemin du site E,
composée du résidu A790 de la plate-forme 30S et des résidus G1338-A1339-N1340-U1341
de la tête du 30S (Figure 16). Appelée porte A790, d’une largeur d'environ 14 Å (porte
fermée), elle est trop étroite pour être traversée par une double-hélice d’ARN d'une largeur de
20 Å. Cette porte est ouverte à une largeur allant jusqu'à 24 Å exclusivement dans les états
intermédiaires de translocation (Ratje et al., 2010). Cette ouverture causée par l'EF-G est
combinée à une forte rotation de la tête d’environ 18° (« swivelling ») (Zhou et al., 2014).
Figure 16. Ouverture et passage de l’ARNt de la porte G1338-A790 pendant la translocation.

D’après Kien Ngyen et Paul C. Whitford, 2016, Nature. La boucle de PE entre les résidus G1338-
U1341 de la tête et les résidus A790 du corps forme un pont séparant le site P et E. Rgate est la
distance entre les atomes U1340 et A790 (perles noires), et sont utilisés comme référence pour
mesurer l'ouverture et la fermeture de la porte.
V.5 - Contrôle du mouvement de l’ARNm
Le mouvement de l'ARNm est également contrôlé pendant la transition du PRE au POST. Les
bases C1397 et A1503 de l’hélice H44 de l’ARNr 16S s’intercalent entre les nucléotides +9 et
+10 et -1 et -2 dans les états intermédiaires de translocation, empêchant ainsi un retour
coulissant de l'ARNm lors du retour de rotation de la tête du 30S. Dans l'état POST les deux
nucléotides d’intercalation ne touchent pas l'ARNm (Figure 17).
Figure 17. Vue des interactions entre l'ARNm et la sous-unité 30S. D’après Jie Zhou et al, 2013,
Science. (A) l'ARNm lié à un état ratcheté du ribosome en complexe avec EF-G/Acide fusidic. (B)
ARNm lié à un état classique du ribosome (POST). Les positions des protéines S3, S11 et S18 sont en
bleues transparentes; également montré la position de EF-G (jaune); les tiges-boucles anticodon des
ARNt P (orange), E et pe/E (rouge); l'hélice de Shine-Dalgarno en verte et grise (S-D). Les éléments
de l'ARNr 16S sont en vert/cyan. L’ARNm en gris avec les codons du site A, P et E sont représentés
en jaune, orange et rouge, respectivement.
V.6 - Rôle et déclenchement du centre GTPasique
Le rôle de l'activité GTPase d’EF-G pour la réaction de translocation a été controversé au

cours des dernières décennies. Cependant des observations indiquent que l'énergie exploitée
pour une réaction de translocation ne dérive pas de l'hydrolyse du GTP, mais plutôt d'une
autre source. Par conséquent, EF-G n’est pas une protéine « moteur », mais plutôt une
protéine G classique : lors de la liaison à sa cible (ici le ribosome PRE), ce dernier subit un
changement conformationnel qui à son tour active le centre GTPase de la protéine G. La
protéine G tombe dans sa conformation du GDP, desserre l'affinité pour la cible et se dissocie
(Figure 18).
Figure 18. Modèle détaillé du mécanisme de translocation. D’après Wasserman MR et al., 2016,
NSMB. EF-GGTP se lie au complexe PRE et induit la rotation du 30S (gris-bleu), stabilisant ainsi la
position hybride p/E et a/P des ARNt (orange clair). L’hydrolyse GTP et libération du phosphate
inorganique (Pi) entraine un déverrouillage du complexe PRE ainsi qu’un état intermédiaire compacté
des ARNt (orange foncé). Cet état (INT1) est converti rapidement dans un état intermédiaire stable
(INT2) affichant un pivotement de la tête (bleu) prononcé (18-21°) accompagné d’une légère rotation
inverse du corps (gris). Les effets inhibiteurs de la viomycine (Vio), hygromycine B (hygB) et
spectinomycine (Spc) sont indiqués. En bas, dans la deuxième étape de la translocation, un
mouvement exagéré de tête (violet) conduit de manière réversible à un troisième intermédiaire
transitoire (INT3). Un ARNt désacylé peut être libéré au cours de ce mouvement. A partir de cet état
(INT3), le domaine de la tête pivote en sens inverse pour atteindre sa position non « ratcheté » de
départ (blanc). Dans cet étape, l'ARNm et peptidyl-ARNt sont dans leurs configurations POST, ce qui
est immédiatement suivi par la libération d’EF-GGDP du ribosome.
VI - Article #2 | K. Macé, E. Giudice, S. Chat and R. Gillet 75
VI - Article #2 | K. Macé, E. Giudice, S. Chat and R. Gillet
VI.1 - Introduction de l’Article #2
The structure of an elongation factor G-ribosome complex captured in the absence of

inhibitors
K. Macé, E. Giudice, S. Chat and R. Gillet
Après traitement de l’hétérogénéité de l’échantillon lors de l’analyse des images, nous avons
obtenu une structure à 3.9Å de résolution d’EF-GGDP lié au ribosome en l’absence
d’inhibiteur. Nous constatons une différence de positionnement du domaine III d’EF-G
comparé aux structures connues. L’hydrolyse du GTP en GDP est confirmée par la
visualisation directe du nucléotide GDP dans notre structure ainsi que par la déformation du
« switch I » dans le domaine I d’EF-G.
L’analyse plus détaillée de cette nouvelle conformation d’EF-G révèle une perte
d’interactions entre le domaine III et la protéine ribosomique S12. Une nouvelle interaction
intra EF-G se forme entre le switch II (boucle du domaine I proche de la poche du GTP) et le
domaine III. Ces résultats permettent de comprendre la réorganisation d’EF-G après
hydrolyse du GTP. Ils permettent également d’expliquer le mécanisme d’action de l’acide
fusidique, antibiotique qui bloque EF-G au ribosome.
VI.2 - Article #2
The structure of an elongation factor G-ribosome complex captured in

the absence of inhibitors
Kevin Macé1*, Emmanuel Giudice1*, Sophie Chat1 and Reynald Gillet1,2
1
: Université de Rennes 1, UMR CNRS 6290 IGDR, « Translation and Folding Team»,
Campus de Beaulieu, 35042 Rennes cedex, France
2
: Institut Universitaire de France.
*
These authors contributed equally to this work.
Correspondence to: [email protected]
Keywords: cryo-electron microscopy, elongation factor G, ribosome, translocation
Illustration réalisée par Viktor Koen: “The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through
structural biology” (Ewen Callaway, 09 September 2015, Nature)
The structure of an elongation factor G-ribosome complex captured in

the absence of inhibitors
Kevin Macé1*, Emmanuel Giudice1*, Sophie Chat1 and Reynald Gillet1,2
1
: Université de Rennes 1, UMR CNRS 6290 IGDR, « Translation and Folding Team»,
Campus de Beaulieu, 35042 Rennes cedex, France

2
: Institut Universitaire de France.
*
These authors contributed equally to this work.
Correspondence to: [email protected]
Keywords: cryo-electron microscopy, elongation factor G, ribosome, translocation
One sentence summary: The structure reported here reveals a hitherto unseen large motion
of the third domain in EF-G, which helps clarify how fusidic acid antibiotics prevent EF-G
release from the ribosome.
Abstract
During translation’s elongation cycle, elongation factor G (EF-G) GTPase promotes
messenger and transfer RNA translocation through the ribosome. Until now, the structures
reported for EF-G-ribosome complexes have been obtained by trapping EF-G in the ribosome.
These results were based on use of non-hydrolyzable guanosine 5’-triphosphate (GTP)
analogs, specific inhibitors, or a mutated EF-G form. Here we present the first cryo-electron
microscopy structure of EF-G bound to ribosome in the absence of an inhibitor. The structure
reveals a natural conformation of EF-GGDP in the ribosome, with a previously unseen
conformation of its third domain. These data show how EF-G must affect translocation, and
suggests the molecular mechanism by which fusidic acid antibiotics prevent the release of EF-
G after GTP hydrolysis.
Main text: The ribosome is a large molecular machine performing protein synthesis,
‘translation,’ in all living cells. During translation’s elongation cycle, amino-acids are
incorporated into a growing polypeptide chain through aminoacylated transfer RNA (tRNA)
thanks to the decoding of mRNA codons. After each amino acid is added to the nascent
peptide chain, the ribosome carries a peptidyl-tRNA at the aminoacyl A-site and a deacylated
tRNA at the peptidyl P-site. In the next step, mRNA moves one codon length and the P- and
A-site tRNA shift to the exit (E) and P-sites, respectively. In bacteria, this universal step of
‘translocation’ is catalyzed by elongation factor G (EF-G) (1). EF-G is a large GTPase protein
made up of five distinct domains. The N-terminus (domains I-II) is separate from the C one
(domains III-V), and a significant hinge-like joint motion probably occurs between the two
(2). EF-G is structurally similar to the ternary complex made by EF-Tu with the incoming
tRNA and guanosine 5’-triphosphate (GTP), with the third EF-G domain mimicking the
acceptor arm and the fourth mimicking the tRNA anticodon stem-loop (ASL) (3).
Translocation is divided into several small intermediate steps that permit a gradual shifting in
tRNA positioning (4). Just after peptidyl transfer, tRNA are in what is called the pre-
translocation (PRE) state, a classic A/A and P/P state. Then a reversible 7° rotation of one
ribosomal subunit relative to the other (ratcheting) allows for movement of the tRNA into the
large subunit from A- to P-, and from P- to E sites, leading to the occupancy of the A/P and
P/E hybrid sites. EF-G binding to a PRE-state ribosome stabilizes the rotated state and
triggers GTP hydrolysis (5). An internal 18° swiveling of the head relative to the small
subunit body then leads to the final post-translocation state (POST), wherein only one tRNA
is bound to the P-site and the E-site tRNA is released (4, 6, 7).
Several structures of ribosomal EF-G complexes were recently determined by X-ray or cryo-
electron microscopy (cryo-EM). These yielded an accurate understanding of EF-G
interactions and how they adjust with the ribosome along the translocation pathway between
the PRE and POST states (3, 5, 8–14). So far, these detailed structures have been based on
trapping EF-G in the ribosome via non-hydrolyzable GTP analogs, specific inhibitors (e.g.,
fusidic acid, thiostrepton, viomycin, and dityromycin), or a mutated form of EF-G. However,
the use of these inhibitory conditions may have prevented the formation of relevant
intermediate states. To explore how unobstructed EF-G acts in the ribosome, we performed
experiments in the presence of natural GTP. To avoid extensive release of EF-G from the
ribosome after GTP hydrolysis, we increased the EF-G/ribosome molecular ratio and used a
non-productive translation complex stalled on a truncated mRNA. To avoid competition with

rescue systems (15), EF-G must leave the vacant decoding site after GTP hydrolysis (16), but
without triggering translocation. We identify here how EF-G interacts with stalled ribosomes.
The structure presented reveals a hitherto unseen large motion of the EF-G’s domain III,
indicating the molecular mechanism by which the antibiotic fusidic acid must prevent
ribosomal release of EF-G after GTP hydrolysis.
Our single-particle cryo-EM reconstruction clearly shows extra densities for P-site tRNA and
EF-G (Fig. 1). Compared to the classic ribosomal state (17), the 30S body is rotated slightly
counterclockwise by ∼5° with respect to the 50S subunit. This ratchet movement is lower
than the 7° usually observed in PRE state ribosomes, but similar to that previously observed
for complexes in intermediate POST states. This suggests a back-ratcheting of the 30S body
after GTP hydrolysis but before complete translocation (6, 10, 18). The 30S head is also
swiveled, but by only about 5°. This rather short swiveling may reflect the start of the partial
back-swiveling movement of the head as tRNA transits from the hybrid P/E state to the
classic E/E one.
As a result of 30S ratcheting, the P-site tRNA moves to an intermediate hybrid state between
the ribosomal P- and E-sites. To better identify the position of the anticodon stem loop (ASL)
with respect to these sites, we first aligned the small subunit’s helix 44 to compare our
structure with tRNA bound in intermediate PRE or POST states (8, 10). This showed that in
our structure the ASL is positioned in a chimeric “pe” state, meaning that it interacts with
parts of the 30S P-site head and E-site platform. More precisely, the ASL is positioned 7.5 Å
downstream from a canonical P-site ASL, and 16 Å upstream from a canonical E-site one (8).
This disposition resembles the structure recently described by Zhou and collaborators (10) in
the presence of fusidic acid or GDPNP non-hydrolyzable analog of GTP (Fig. 1C). On the
other hand, if aligned using the 23S rRNA, comparison of the same structures shows that in
ours the acceptor stem has reached the E-site of the 50S subunit (Fig. 1D), and that the L1
stalk has moved inward into an intermediate conformation to interact with its elbow (Fig. S3).
These interactions allow L1 to chaperone the p/E tRNA as it translocates to the E/E
conformation (11). Overall, our data show the ribosome in an intermediate state, with a small
5° intersubunit rotation and a 5° swiveling of the 30S head. The tRNA is trapped in an
intermediate pe/E translocation state.
In our structure, the EF-G density is well-defined and all five domains were easily attributed.
Domains I, II, and V are stable and well-resolved, allowing for an accurate atomic
reconstruction. On the other hand, domains III and IV are highly flexible and required the use
of masked classification with residual signal subtraction in order to unambiguously attribute
their electron densities.
The overall conformations and positions of domains I and II are very similar to that of
previously-reported structures, in both PRE and POST states. Domain I is the GTPase active
site of EF-G and contains switches I and II, two mobile elements that are essential for EF-G’s
unidirectional cycle during protein synthesis (16, 19). In our map, switch I (amino acids 38-
64) is disordered (Fig. S4), a feature which is characteristic of EF-G after GTP hydrolysis into
guanosine diphosphate (GDP) (3). Accordingly, the distinct density within the EF-G catalytic
center correctly accommodates a GDP nucleotide molecule, but even at a high threshold it is
too small for GTP (Fig. S4). The complex therefore looks like EF-G after GTP hydrolysis,
including an intersubunit rotation and 30S subunit head swiveling, as well as having pe/E
tRNA positioned close to the L1 stalk.
The switch II loop (amino acids 84-107) is one of the most stable EF-G elements in our
complex (Fig. S6). The loop has moved away from the catalytic site to join domain III, and
this conformation differs from all of the known structures of EF-G ribosomal complexes (Fig.
2). Due to a large motion of the third domain (see below), in that domain the Phe90 found in
the tip of switch II interacts with Arg465 in the B3 helix. The switch II shift is similar to that
encountered in crystal-free EF-GGDP, confirming that the factor is frozen in a post-GTP
hydrolysis conformation. However, the Phe90-Arg465 interaction is not seen in the free EF-
GGDP (Fig. S7).
Domain III is critical for EF-G activity, as its deletion impairs GTP hydrolysis and
translocation (5, 20). Among the EF-G domains in our structure, it is the least well-defined,
suggesting its dynamic nature (Fig. S2). In comparison with the PRE state, domain III has
moved toward domain V in a large motion of about 14 Å. This moves domain III away from
s12, the only ribosomal protein located near the decoding site. It also allows new interactions
to occur between domain III and switch II (Fig. 2). These data suggest that domain III is not
part of a rigid body composed of domains III-V, but is instead subjected to large rotations
during translocation (Movie S1). While this motion has never been described in structural
studies, it has been suggested as a result of chemical crosslinking and single-molecule
polarized fluorescence microscopy examinations of normal translocation (i.e. without
blockers that might freeze the EF-G conformation) (21, 22). Our study shows the movement
observed after GTP hydrolysis and before EF-G release, confirming that domain III can cause
the subsequent movement of mRNA and tRNA (5). Unlike domain III, domain V does not
undergo a large motion, although it is slightly pushed toward protein L11 (Fig. 2C)
The fourth domain establishes close contact with the decoding site on the small 30S subunit
thus is critical for translocation catalysis. The decoding site cannot simultaneously bind tRNA
and a translation factor, so obviously EF-G, and particularly domain IV, undergoes structural
rearrangements during translocation (14, 23). Despite the absence of a codon, this domain
fully occupies the decoding center in a similar location as in ribosome with elongation factor
G trapped in the posttranslocational state (8), with loop I at the tip of domain IV extending
toward the P-site to make contact with pe/E tRNA. Within helix 44, there is no deep
remodeling of nucleotides G530, A1492, and A1493, as occurs during ribosomal tRNA
selection (24). Thus this domain cannot directly interact with these nucleotides (Fig. 3) as it
does during canonical translocation (13). This implies that EF-G detects the presence or
absence of codon-anticodon interactions within the A-site by sampling the positions of these
three nucleotides. Our results also confirm that the molecular clamp formed by these bases is
necessary for triggering translocation, but not for EF-G binding and GTP hydrolysis (25),
which are instead found to be due to EF-G flanking restrictions imposed by the III and V
domains in the rotated ribosome (5).
According to various structures bound to fusidic acid (FA), the antibiotic bonds occur
between domains II and III, preventing conformational changes in EF-G that are required for
its release from the ribosome after GTP hydrolysis (8, 10, 12). In our map, obtained without
FA, domains I and III are linked through a hitherto unseen interaction between Phe90 and
Arg465 (Figs 2, 4). We can therefore assume that after GTP hydrolysis, switch I
disorganization causes the release of domain III, which then changes conformation. This
movement allows new interactions to occur between domain III and switch II, triggering EF-
GGDP release from the ribosome (Movie S1). However, after GTP hydrolysis, FA replaces
the switch I position on domain III and prevents binding of R465-F90 amino acids. As a
consequence, EF-G preserves a “GTP-like” conformation and stays within the ribosome. This
is in line with previous work showing that FA overlaps residues in the conserved core of
switch loop I (10), and that the antibiotic interacts with both Phe90 and Arg465 (8).
Consequently, mutation of these residues is known to confer FA resistance (26), and most FA-
resistant EF-G mutations have altered switch II or domain III properties including these two
amino-acids (26, 27).
Together, our data has provided an atomic model of EF-GGDP bound to a rotated ribosomal
state. The tRNA is in a chimeric intermediate pe/E state between the P/E and E/E ones, close
to the L1 stalk of the large ribosomal subunit. The absence of translocation blockers allows
for the first visualization of a large motion of EF-G’s domain III, a shift which leads to a close
interaction between it and switch II. This conformational change occurs before the complete
translocation of the tRNA from the P- to the E-site, and could therefore act as the facilitator
for that final movement. This also explains how the antibiotic fusidic acid stops this
conformational change and thus prevents EF-G release after GTP hydrolysis.
References
1. J. Achenbach, K. H. Nierhaus, The mechanics of ribosomal translocation. Biochimie.

114, 80–89 (2015).
2. S. R. Connell et al., Structural Basis for Interaction of the Ribosome with the Switch
Regions of GTP-Bound Elongation Factors. Mol. Cell. 25, 751–764 (2007).
3. A. Pulk, J. H. D. Cate, Control of ribosomal subunit rotation by elongation factor G.

Science. 340, 1235970 (2013).
4. W. Holtkamp, W. Wintermeyer, M. V. Rodnina, Synchronous tRNA movements

during translocation on the ribosome are orchestrated by elongation factor G and GTP
hydrolysis. BioEssays News Rev. Mol. Cell. Dev. Biol. 36, 908–918 (2014).
5. W. Li et al., Activation of GTP hydrolysis in mRNA-tRNA translocation by

elongation factor G. Sci. Adv. 1 (2015), doi:10.1126/sciadv.1500169.
6. A. H. Ratje et al., Head swivel on the ribosome facilitates translocation by means of

intra-subunit tRNA hybrid sites. Nature. 468, 713–716 (2010).
7. R. M. Voorhees, V. Ramakrishnan, Structural Basis of the Translational Elongation

Cycle. Annu. Rev. Biochem. 82, 203–236 (2013).
8. Y.-G. Gao et al., The structure of the ribosome with elongation factor G trapped in the
posttranslocational state. Science. 326, 694–699 (2009).
9. J. Lin, M. G. Gagnon, D. Bulkley, T. A. Steitz, Conformational changes of elongation

factor G on the ribosome during tRNA translocation. Cell. 160, 219–227 (2015).
10. J. Zhou, L. Lancaster, J. P. Donohue, H. F. Noller, Crystal structures of EF-G-

ribosome complexes trapped in intermediate states of translocation. Science. 340, 1236086
(2013).
11. D. S. Tourigny, I. S. Fernández, A. C. Kelley, V. Ramakrishnan, Elongation factor G

bound to the ribosome in an intermediate state of translocation. Science. 340, 1235490 (2013).
12. D. J. F. Ramrath et al., Visualization of two transfer RNAs trapped in transit during
elongation factor G-mediated translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 20964–20969
(2013).
13. Y. Chen, S. Feng, V. Kumar, R. Ero, Y.-G. Gao, Structure of EF-G-ribosome complex
in a pretranslocation state. Nat. Struct. Mol. Biol. 20, 1077–1084 (2013).
14. A. F. Brilot, A. A. Korostelev, D. N. Ermolenko, N. Grigorieff, Structure of the

ribosome with elongation factor G trapped in the pretranslocation state. Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. 110, 20994–20999 (2013).
15. E. Giudice, K. Macé, R. Gillet, Trans-translation exposed: understanding the structures

and functions of tmRNA-SmpB. Front. Microbiol. 5, 113 (2014).
16. C. Ticu, R. Nechifor, B. Nguyen, M. Desrosiers, K. S. Wilson, Conformational

changes in switch I of EF-G drive its directional cycling on and off the ribosome. EMBO J.
28, 2053–2065 (2009).
17. M. Selmer et al., Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA.
Science. 313, 1935–1942 (2006).
18. H. Yamamoto et al., EF-G and EF4: translocation and back-translocation on the
bacterial ribosome. Nat. Rev. Microbiol. 12, 89–100 (2014).
19. I. R. Vetter, A. Wittinghofer, The guanine nucleotide-binding switch in three

dimensions. Science. 294, 1299–1304 (2001).
20. K. A. Martemyanov, A. T. Gudkov, Domain III of elongation factor G from Thermus

thermophilus is essential for induction of GTP hydrolysis on the ribosome. J. Biol. Chem.
275, 35820–35824 (2000).
21. C. Chen et al., Elongation factor G initiates translocation through a power stroke.
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, 7515–7520 (2016).
22. R. Nechifor, K. S. Wilson, Crosslinking of translation factor EF-G to proteins of the

bacterial ribosome before and after translocation. J. Mol. Biol. 368, 1412–1425 (2007).
23. E. Salsi, E. Farah, J. Dann, D. N. Ermolenko, Following movement of domain IV of

elongation factor G during ribosomal translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111,
15060–15065 (2014).
24. J. M. Ogle et al., Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit.
Science. 292, 897–902 (2001).
25. L. Garcia-Ortega, J. Stephen, S. Joseph, Precise alignment of peptidyl tRNA by the

decoding center is essential for EF-G-dependent translocation. Mol. Cell. 32, 292–299 (2008).
26. M. Laurberg et al., Structure of a mutant EF-G reveals domain III and possibly the
fusidic acid binding site. J. Mol. Biol. 303, 593–603 (2000).
27. Y. Chen, R. K. Koripella, S. Sanyal, M. Selmer, Staphylococcus aureus elongation

factor G--structure and analysis of a target for fusidic acid. FEBS J. 277, 3789–3803 (2010).
Acknowledgments
We acknowledge the use of electron microscopes from the Netherlands Centre for Electron
Nanoscopy (NeCEN) (Leiden University) funded by the Netherlands Organization for
Scientific Research (NOW) and the European Regional Development Fund of the European
Commission. We thank Juliana Berland for insightful comments on the manuscript. This work
was supported by the Agence Nationale pour la Recherche with the Direction Générale de
l’Armement (#ANR-14-ASTR-0001) and by the Institut Universitaire de France. Computer
time was provided by GENCI (IDRIS and CINES, #i2015037391). The maps were deposited
with the EMDB under the accession code XXX. Atomic coordinates were deposited with the
Protein Data Bank under the accession code YYY.
Figures.
Figure 1. Overview of the EF-G-rotated ribosome complex and positioning of tRNA in

the pe/E hybrid state
(a) Overall view of EF-G in the ribosome. The 50S subunit is blue, the 30S subunit is grey,
tRNA is orange, and the five (I-V) domains of EF-G are purple, blue, green, red, and yellow,
respectively. (b) Rotation of the 30S subunit relative to the 50S one in the EF-G complex. As
compared to the non-rotated (PDB accession code 2J00) 30S subunit (cyan), in this structure
30S (red) shows a 5° counter-clockwise rotation of the 30S body and a 5° orthogonal
swiveling of the head toward the L1 stalk. The two structures are aligned on 23S rRNA. (c)
Cartoon representations of EF-G in GDP. The EF-G domain colors are as per (a). (d) Left:
Comparisons of the distances between the current anticodon stem-loops (ASL). The ASLs are
bound in p, pe and e-states and aligned on the 44 helix of each corresponding structure. The
left side E-site ASL is white; the right side P-site ASL is white; the pe* state ASL is orange; a
red star indicates the current ASL. The P- and E-site structures are from 4V5F, while the pe*
state is from 4V9L. Right: Relative positions of the acceptor stems aligned on the 23S rRNA,
presented using the same color code.
Figure 2. Interactions between EF-G switch II and domain III, and movement of this
domain away from ribosomal protein s12.
(a) Overall view of EF-G, with the five domains indicated in various colors. (b) Focus on the
interaction between switch II (orange) and domain III (green). The local mesh volume shows
a clear interaction between phenylalanine 90 (Phe90) and arginine 465 (Arg465) residues. (c)
Superposition of the EF-G-Fus (Gray-4V9L) structure and our EF-G model. Ribosomal
protein s12 is brown. The two EF-G structures are aligned on EF-G domains I and II. (d)
Details of the domain III movement as it relates to ribosomal protein s12. The third domain
undergoes a 14° movement (black arrow) toward domain V, leading to a loss of interaction
with s12 amino acid Lysine 79 and histidine 80 (light blue).
Figure 3. Comparison of the presented structure’s decoding center with the structures of
empty 30S, tRNA-EF-Tu, and PRE state EF-G.
Detailed interactions of EF-G domain IV with the universally conserved A1492 and A1493
16S rRNA (red). When present, mRNA is green. (a) The empty 30S subunit, without mRNA
or tRNA in its A-site (PDB 1J5E). (b) The presented structure showing EF-G Ser578 and
Met580 (blue) at the tip of domain IV (yellow). (c) The canonical tRNA (yellow with the
nucleotides 34, 35 and 36 of ASL in blue) that decodes mRNA in the A-site (PDB 4V87). (d)
The EF-G fus (yellow and Ser578 and Met580 in blue) in a classic intermediate state, with A-
site mRNA (PDB 4V9L).
Figure 4. Overview of the structural mechanism of fusidic acid.

(a) Structure of EF-G GDPNP (dark green) (PDB 4V9K), showing the paths for switch loop I
(yellow) and switch II (orange). Arg465 is green and Phe90 is orange. (b) In the Fus complex
(PDB 4V9L), switch I is replaced by fusidic acid (yellow). (c) Position modifications of
domain III and switch II in the absence of fusidic acid, as the interaction between them
clashes with the antibiotic.
Supplementary Materials
Materials and Methods
Preparation of EF-G bound ribosomes
Ribosomes from Thermus thermophilus were a kind gift of Dr V. Ramakrishnan. His-tagged

EF-G from Thermus thermophilus and His-tagged phenylalanine-tRNA synthetase (PheRS)
from Escherichia coli were overexpressed in E. coli BL21 (DE3) using T7 expression system
and then isolated by Ni2+ precharged HisTrap chelating column, according to the
manufacturer’s procedures (GE Healthcare) (1). All protein concentrations were measured on
a SimpliNano spectrometer (GE Healthcare). E. coli tRNA, phenylalanine specific was
purchased from Sigma. Aminoacylation was performed by incubating 1 µM tRNA at 37°C
for 30 min in 50 mM Hepes-KOH (pH 7,5), 60 mM NH4Cl, 7 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 2
mM ATP, 30 µM phenylalanine and 1 µM PheRS. Stalled ribosomes were obtained by
incubating 70S ribosomes (1 µM) with 2 µM of an mRNA consisting of the
AGGAGGUGAGGUUUU sequence containing a Shine-Dalgarno sequence (bold) and a
phenylalanine (underlined) and E. coli aminoacylated tRNAPhe (2 µM), for 30 min at 37°C in
buffer III (5 mM Hepes-KOH (pH 7.5), 10mM NH4Cl, 10 mM MgOAc, 50 mM KCl, 0.1 mM
EDTA and 6 mM -mercaptoethanol). The final complexes were obtained by mixing 1 µM of
stalled ribosomes with 20 µM of EF-G in the presence of 2 mM GTP for 15 min at 42°C.
Cryo-electron microscopy
EM sample preparation and data acquisition

After dilution ribosomes at 150nM concentration in buffer III, 2 uL of the complexes were
applied to glow-discharged holey carbon grids (Quantifoil R2/2, Germany), and flash-frozen
in liquid ethane using FEI Vitrobot Mark III (FEI, the Netherland). Then, the grids were
transferred to Titan Krios cryo-transmission electron microscope (FEI Company) with CS
correction, operated at 300 kV. Using the FEI EPU software, images were automatically
recorded on a Falcon II direct electron detector, at a nominal magnification of 59 000x,
corresponding to a calibrated pixel size of 1,162 Å/pixel, and with the defocus ranging from -
1,5 to -3 µm. Images were acquired in movie mode using seven movie frame per exposure
(1s).
Image processing
The direct detector device micrographs were aligned and summed using a robust optical flow
approach, Xmipp (2). This procedure was accessed through Scipion, a software framework
toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy (3). Contrast
transfer function (CTF) parameters and defocus values for each micrograph were determined
by using CTFFIND4 (4). EMAN2 e2boxer (5) was used for semi-automatic particle picking
and RELION-1.4 (6) for all subsequent steps.
Single-particle 3D image reconstruction

A total of 96,509 particles were extracted from 949 micrographs. Particles were split into
height classes during the first round of 3D classification, with a map of the mature 60S
ribosomal subunit (low-pass filtered to 60 Å) as the initial model. Bases on the presence of
EF-G, three classes were combined for a total of 61404 particles, reflecting EF-G rather high
occupancy on stalled ribosome. To boost the resolution the particle polishing procedure of
Relion was applied which after subsequent 3D auto-refinement and post processing yielded a
3.7Å (gold-standard Fourier shell correlation (FSC) 0.143 criteria) map with fuzzy densities
for EF-G domains III and IV. To further improve the quality of the map, the theoretical pixel
size was first re-assessed by calculating the cross-correlation between our map and an X-ray.
The structure of the ribosome with elongation factor G trapped in the post-translocational
state as a reference structure (PDB accession number: 4V5F). This lead to a readjustment of
the pixel size of 1.162 to 1.103 Å/pixel. The defocus values for each micrograph were re-
calculated and the 3D auto-refinement and post processing were re-performed on the 61404
particles subset leading to an improved density map with 3.51-Å resolution. To deal with the
structural heterogeneity we then performed a focused classification on EF-G with subtraction
of the signal from the rest of the complex (Supplementary Figure S1) (7). The best class made
of 30,000 particles gave rise to a density map with better definition of EF-G the domain III
and IV. The refined maps were corrected for the modulation transfer function of the detector,
and the high spatial frequencies were boosted using B-factor sharpening (8) resulting in a
3.83-Å density map. The local resolution map was estimated using ResMap (fig. S7) (9).
Model building and refinement

Crystal structure of the thermus thermophilus EF-G-Ribosome complex in a Pretranslocation
State ribosome (PDB accession number: 4V90) was used as the initial template for modelling.
The models of the rRNAs (25S, 5.8S) and ribosomal proteins were docked separately into the
density map manually using UCSF Chimera (2). The atomic model was then refined against
the density map first by real-space refinement in PHENIX (10) with secondary structure and
geometry constraints applied. After refinement, alternating rounds of manual model
adjustment using COOT (11) and model refinement using PHENIX (12) were applied. A
final round of model refinement was done in Fourier space using REFMAC (13) with
secondary structure, base pair and planarity restraints applied, according to previously
established protocols (14). To avoid overfitting, different weights of the density map for
refinement were tested. Cross-validation against overfitting was performed following the
procedures previously described (14, 15). The atom positions of the atomic model were
randomly displaced by 0.5Å before the model was refined against a map reconstructed from
half of the data produced by RELION during the last iteration of high-resolution structural
refinement. The absence of overfitting was verified by comparing the FSC between our model
and the two half maps. Statistics of final model was evaluated using MolProbity (16)
(Extended Data Table 1b).
Supplementary Figures
Figure S1: Visualisation of the mask position

Cryo-EM map obtained from the 61K micrographs (gold). The mask applied around EF-G to
improve the classification is highlighted in red (see Material and Methods).
Figure S2: Final map and global resolution of the EF-G-ribosome complex and
(a) Gold-standard Fourier shell correlation (FSC) curves for the EF-G ribosome complex after
3D refinement and statistical movie processing in RELION (17, 6). (b) Final map obtained at
3.9Å global resolution. (c) Surface view of the unsharpened final map colored according to
local resolution calculated with the ResMap software package (9).
Figure S3: Interactions between tRNA and ribosomal L1 stalk.

In red L1 stalk in an intermediate state, in orange pe*/E-state tRNA and mRNA in green.
Figure S4: View of switch I disorganized

The switch I region (cyan) is completely disordered in the current map (no volume
corresponding). The region of EF-G showing additional density that corresponds to GDP does
not accommodate GTP (white arrow: the third phosphate that does not fit into the map, event
at high threshold).
Figure S5: Lost of interactions between domain III and s12 ribosomal protein, after
GTP hydrolysis.
(a) Global view of EF-G in our current structure (cyan) with (b) focus on interaction between
s12 (16S RNAr). Residue XXX and YYY of s12 are steel blue and EF-G is same color in
figure 1. (c & d) Identical view of (a & b) with EG-F Fus complexe (PDB 0000) in grey. The
data show lost interaction in our structure after GTP hydrolysis compare to EF-G Fus
complex, showing clearly an interaction between MMM and KKK residue of domain III and
s12.
Figure S6: Switch II changes in EF-G after GTP hydrolyze

(a) Unbiased difference Fourier maps obtained after initial refinement with an empty
ribosome as a starting model, showing switch II. (b) Comparison of the switch II of isolated
EF-GGDP free (cyan; PDB 2BM0) (18), EF-GGDP ribosome in this current structure
(orange) and EF-GGDP ribosome with FA (Gray; PDB 4V9L) (19).
Figure S7: Comparison between EF-GGDP free and the current structure
Comparison between the isolated EF-GGDP free (Gray; PDB 2BM0) and EF-GGDP
ribosome in this current structure (multicolor). Except for domain I and II which are totally
identical, the rest of the structure is completely different. It is therefore impossible to use as
reference the crystal structure of EF-GGDP to analyze the interactions between the switch II
and domain III in ribosomal context.
References Supplementary Materials
1. F. Weis et al., tmRNA-SmpB: a journey to the centre of the bacterial ribosome. EMBO
J. 29, 3810–3818 (2010).
2. V. Abrishami et al., Alignment of direct detection device micrographs using a robust

Optical Flow approach. J. Struct. Biol. 189, 163–176 (2015).
3. J. M. de la Rosa-Trevín et al., Scipion: A software framework toward integration,

reproducibility and validation in 3D electron microscopy. J. Struct. Biol. 195, 93–99 (2016).
4. A. Rohou, N. Grigorieff, CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from

electron micrographs. J. Struct. Biol. 192, 216–221 (2015).
5. G. Tang et al., EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy.
J. Struct. Biol. 157, 38–46 (2007).
6. S. H. W. Scheres, RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM

structure determination. J. Struct. Biol. 180, 519–530 (2012).
7. X. Bai, E. Rajendra, G. Yang, Y. Shi, S. H. Scheres, Sampling the conformational

space of the catalytic subunit of human -secretase. eLife. 4, e11182 (2015).
8. S. Chen et al., High-resolution noise substitution to measure overfitting and validate

resolution in 3D structure determination by single particle electron cryomicroscopy.
Ultramicroscopy. 135, 24–35 (2013).
9. A. Kucukelbir, F. J. Sigworth, H. D. Tagare, Quantifying the local resolution of cryo-

EM density maps. Nat. Methods. 11, 63–65 (2014).
10. P. D. Adams et al., PHENIX: a comprehensive Python-based system for

macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 213–221
(2010).
11. P. Emsley, B. Lohkamp, W. G. Scott, K. Cowtan, Features and development of Coot.

Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 486–501 (2010).
12. P. V. Afonine et al., Towards automated crystallographic structure refinement with

phenix.refine. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 68, 352–367 (2012).
13. G. N. Murshudov, A. A. Vagin, E. J. Dodson, Refinement of macromolecular

structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53,
240–255 (1997).
14. A. Amunts et al., Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit.
Science. 343, 1485–1489 (2014).
15. I. S. Fernández, X.-C. Bai, G. Murshudov, S. H. W. Scheres, V. Ramakrishnan,

Initiation of translation by cricket paralysis virus IRES requires its translocation in the
ribosome. Cell. 157, 823–831 (2014).
16. V. B. Chen et al., MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular

crystallography. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 12–21 (2010).
17. X.-C. Bai, I. S. Fernandez, G. McMullan, S. H. W. Scheres, Ribosome structures to

near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2, e00461 (2013).
18. S. Hansson, R. Singh, A. T. Gudkov, A. Liljas, D. T. Logan, Structural Insights into

Fusidic Acid Resistance and Sensitivity in EF-G. J. Mol. Biol. 348, 939–949 (2005).
19. J. Zhou, L. Lancaster, J. P. Donohue, H. F. Noller, Crystal structures of EF-G-

ribosome complexes trapped in intermediate states of translocation. Science. 340, 1236086
(2013).
VI.3 - Conclusion de l’Article #2
La structure obtenue par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) permet de visualiser le

facteur d’élongation EF-G dans une nouvelle conformation, après un mouvement de son
domaine III. Malgré une forte concurrence dans ce domaine scientifique (voir Annexe N°1 –
Partie I) cette conformation d’EF-G n’avait encore jamais été directement observée lors de
précédentes analyses en cristallographie aux rayonx X ou en cryo-microscopie électronique
(AEvarsson et al., 1994; Hansson et al., 2005; Laurberg et al., 2000) Il est à noter que les
récents progrès en cryo-EM permettent aujourd’hui d’observer des complexes à haute
résolution et d’améliorer la classification afin de mieux traiter l’hétérogénéité des échantillons
(voir Annexe N°2 – Partie I). L’utilisation de ces approches a une grande importance dans
notre cas, puisque la visualisation du domaine III, très flexible en l’absence d’antibiotiques, a
été obtenue grâce à utilisation d’un masque. Cette technique permet d’obtenir une
reconstruction 3D en soustrayant le signal du ribosome (bruit) des images 2D afin
d’augmenter le signal d’EF-G seul (voir la méthode en Annexe N°3 – Partie I).
Nos résultats s’intègrent à de précédentes observations obtenues par pontage chimique

suggérant que ce mouvement puisse repositionner uS12 et faciliter ainsi la translocation
(Nechifor and Wilson, 2007). Ce mouvement d’EF-G a également été récemment suggéré par
des études de fluorescence polarisée (polTIRF) (Chen et al., 2016). Le mouvement du
domaine III y est abordé d’un point de vue structural avec une incroyable anticipation: « The
large and variable motions of the EF-G domain III we observe during normal translocation
have not generally been detected among the X-ray and cryo-EM structures obtained using
antibiotics and/or non-hydrolyzable GTP analogs that inhibit normal translocation and
prolong the dwell time of EF-G on the ribosome. These blockers may rigidify the
conformation of ribosome-bound EF-G. It is possible that time-resolved cryo-EM with single-
particle sorting into different classes, by resolving structural heterogeneities in the sample,
could reveal the motions of domain III detected by polTIRF. ». Les auteurs concluent que le
mouvement du domaine III de EF-G sur le ribosome génère une force mécanique qui soit, se
déplace vers l'ARNm et l’ARNt directement, soit facilite un déverrouillage du ribosome, ce
qui permet la réalisation de la translocation.
Il faut noter également qu’une rotation différente du domaine III a déjà été observée dans une
structure cristalline d’EF-G complexé avec l’antibiotique dityromycine (Lin et al., 2015).
Cette structure compacte possède un domaine III tourné d'environ 90 ° par rapport à la
position des domaines I et II d’EF-G. Cependant, le domaine III n’est pas le seul domaine en
rotation et c’est tout l’ensemble III-IV-V qui tourne comme un corps rigide, ce qui est
incompatible avec les données de polTIRF (montrant que seul le domaine III tourne
indépendamment des autres). Cette structure est une étape précoce de l’état de pré-
translocation alors que la rotation du domaine III observée ici à lieu en post hydrolyse du
GTP.
Les données de notre structure permettent d’émettre un nouveau modèle de l’hydrolyse du

GTP par EF-G. Ce modèle, présenté sous forme d’une vidéo dans l’article, montre
l’enchaînement des évènements depuis l’arrivée d’EF-G au ribosome jusqu’à sa conformation
GDP (Figure 19, page suivante).
Les informations obtenues permettent également de mieux comprendre le fonctionnement de

l’antibiotique acide fusidique (Fus) ciblant EF-G.
La comparaison des structures d’EF-GGDP
Box N°10 – L’acide fusidique est utilisé pour
le traitement de l'impétigo et se présente sous cristallisé seul (Hansson et al., 2005) avec EF-
forme de crème pour application cutanée. GGDP en présence de Fus dans le ribosome (Gao
et al., 2009; Zhou et al., 2013) montre que la
position de Fus dans le complexe EF-G-70S chevauche celle du switch I, stabilisant ainsi EF-
G dans sa conformation initiale, ceci malgré l’hydrolyse du GTP en GDP. Cependant, ces
données ne permettent pas de savoir si c’est le switch II qui vient au contact du domaine III et
induit le changement conformationnel (Gao et al., 2009), ou inversement, si c’est
déstructuration du switch I qui induit un changement de conformation du domaine III (Zhou
et al., 2013). D’après nos données, l’acide fusidique empêche le domaine III de venir au
contact du switch II en empêchant la liaison entre l’Arg465 et la Phe90.
Figure 19. Modèle de l’hydrolyse du GTP. Planche de la réalisation du mini film pour l’article EF-
G. EF-GGTP x-ray (2DY1) en bleu, en orange EF-GGTP ribosome (4V9J), EF-GGDP ribosome
en rouge (notre structure). L’ARN16S en vert et S1β en rose/violet.
Partie II
La trans-traduction
I - Introduction Partie II – La trans-traduction 108
I - Introduction Partie II – La trans-traduction

La synthèse protéique est un mécanisme complexe et fascinant. Afin d’assurer son
fonctionnement, les cellules possèdent différents systèmes de contrôle-qualité. Nous nous
intéresserons ici au « sauvetage de la synthèse protéique », lorsqu’un ribosome en cours de
traduction reste bloqué sur un ARNm. Ce blocage intervient dans de nombreuses situations
(Moore and Sauer, 2007). Ici nous aborderons un mécanisme de sauvetage en particulier, la
trans-traduction. Ce mécanisme bactérien ancestral – voir Article #1 – joue aujourd’hui
d’autres rôles que le simple sauvetage de la traduction, ce qui fait de la trans-traduction une
cible particulièrement intéressante pour le développement de nouveaux antibiotiques, thème
qui sera abordé dans la deuxième partie de ce chapitre.
II - Article #3 | E. Giudice, K. Macé and R. Gillet. - 2014 - Frontiers in Microbiology 109
II - Article #3 | E. Giudice, K. Macé and R. Gillet. - 2014 -

Frontiers in Microbiology
II.1 - Introduction de l’Article #3
Trans-translation exposed: understanding the structures and functions of tmRNA-SmpB
E. Giudice, K. Macé & R. Gillet Front Microbiol. 2014 Mar 21;5:113.
Les ribosomes qui se bloquent lors de la traduction doivent être secourus afin de maintenir la
synthèse des protéines. Le blocage se produit lorsque les ribosomes sont emprisonnés sur
l'extrémité 3' d'un ARNm, sans codon disponible dans le site A, ce qui conduit à l'arrêt de
l'élongation. Le principal système de contrôle-qualité bactérien permettant de sauver les
ribosomes est la trans-traduction. Deux autres systèmes alternatifs sont médiés par les
protéines ArfA et ArfB (Alternative ribosome-rescuing factor A and B). Ces systèmes de
sauvetage sont indispensables à la survie bactérienne. Cette revue en guise d’introduction
rassemble les différentes connaissances du mécanisme de la trans-traduction.
II.2 - Article #3
Illustration réalisée d’après Agata L. Starosta et al., 2014, FEMS Microbiol Rev.
III - Résultats préliminaires de l’étude structurale de la trans-traduction 123
III - Résultats préliminaires de l’étude structurale de la

trans-traduction
III.1 - Introduction – Résultats préliminaires de l’étude structurale de la

trans-traduction
Si le mécanisme général de la trans-traduction est bien admis, un certain nombre de points

restent encore obscurs. Par exemple, les mécanismes permettant le passage du complexe
ARNtm-SmpB (Small Protein B), environ six fois plus grand qu’un ARNt classique, au
travers du ribosome (Figure 20). De plus, l’intervention du partenaire RNase R chargé de
détruire l’ARNm défectueux au cours de la trans-traduction n’a jamais était observée.
Figure 20. Les étapes précoces de la trans-traduction en structure 3D et schématique. (a)

Ribosome bloqué lors de la traduction d’un ARNm défectueux. (b) Pré-accomodation : L’ARNtm se
positionne au niveau du site A vide en complexe avec SmpB et EF-Tu. (c) Accomodation : Le peptide
incomplet est transféré sur l’ARNtm. (d) Translocation : La traduction passe de l’ARNm défectueux à
la partie codant de l’ARNtm. L’ARNm tronqué est éjecté puis dégradé. (e) Post-translocation : Le
premier codon de l’ARNtm est traduit et le peptide est transféré sur l’ARNt. Le point d’interrogation
symbolise que la structure de cette étape n’est pas connue.
III.2 - Complexe ribosomique en cours de trans-traduction en présence de

RNase R
III.2.1 - Introduction : étude de la trans-traduction en présence de la RNase R
L’étude bibliographique ainsi que des données préliminaires suggèrent que la RNAse R se lie
au ribosome lors de l’arrivée du complexe ARNtm/SmpB/EF-Tu (Liang and Deutscher, 2012;
Richards et al., 2006; Venkataraman et al., 2014). L’objectif de ce projet est d’obtenir la
structure par cryo-MET des complexes de trans-traduction en présence de la RNAse R. Le
premier complexe en état de pré-accomodation, Ribosome/ARNtm/SmpB/RNase R/EF-Tu en
présence de kirromycine, permettrait d’observer pour la première fois l’interaction de la
RNase R avec le complexe ARNtm/SmpB dans le contexte ribosomique. Un second
complexe, constitué du Ribosome/RNase R avec ARNtm/SmpB en cours de translocation via
le blocage d’EF-G par l’acide fusidique, permettrait d’observer l’éjection de l’ARNm
défectueux du ribosome ainsi que sa prise en charge par la ribonuclése chargée de le détruire.
L’ARNm est alors pris directement en charge par la RNase R, qui est supposée être ancrée à
proximité du canal d’ARNm.
Pour les précédents projets du laboratoire nous avions utilisé des ribosomes, l’ARNtm et
SmpB de Thermus thermophilus. Cependant aucune RNase R n’a été identifiée dans le
génome de cet organisme. Par conséquent pour l’étude structurale de la RNase R tous les
complexes sont réalisés chez E. coli. Cela nécessite donc la mise au point de nouveaux
protocoles de purification pour cet organisme (voir Annexe N°1 – Partie II).
Pour la purification de la RNase R-Hist, nous utilisons une RNase R spécifique D280N mutée
dans son site catalytique (Matos et al., 2009). Effectivement, l’utilisation d’une RNase R
fonctionnelle n’est pas compatible avec l’étude ribosomique in vitro, puisque cette dernière
dégrade les ARN ribosomiques dans ces conditions (résultats non publiés).
Un protocole de purification des ribosomes d’E. coli adapté pour l’étude de cryo microscopie
a été également réalisé. Nous utilisons des ribosomes étiquetés par modification génétique sur
le gène rpsO (uS15) grâce à l’ajout constitutif d’une étiquette Streptavidine (C Blanco, non
publié). L’utilisation de ces ribosomes modifiés permet par la suite de purifier les complexes
70S-ARNtm-SmpB-RNaseR sur colonnes de chromatographie (Figure 21). Tout d’abord le
complexe est passé sur une colonne HiTrap™ Streptavidin. Les ribosomes sont retenus et tous
les éléments non liés au ribosome sont éliminés. Puis après élution, les complexes sont passés
sur une colonne Histidine afin de retenir les complexes via la RNase R. Cela permet
d’éliminer tous les ribosomes ou sous-unité ribosomiques n’ayant pas de complexe RNase
R/ARNtm/SmpB. Cette méthode a pour avantage d’augmenter au maximum l’homogénéité de
l’échantillon pour l’étude par cryo-EM.
Figure 21. Les étapes de la purification des complexes 70S-RNase R. Étape 1 : mélange et
incubation des différents éléments constituant le complexe. Étape 2 : première purification sur
colonne Streptavidine (Ribosome retenu). Étape 3 : seconde purification sur colonne Histidine (RNase
R retenu)
III.2.2 - Résultats préliminaires de l’étude de la trans-traduction en présence de la

RNase R
Tout d’abord des complexes 70S-RNase R sont formés afin de vérifier la possible fixation de
l’enzyme au ribosome, en l’absence de tout facteur de traduction ou de trans-traduction.
Après plusieurs essais, il s’est avéré nécessaire de conserver la RNase R dans une forte
concentration de glycérol (>50 %) afin d’éviter sa précipitation lors du mélange avec les
ribosomes. Les complexes formés sont ensuite purifiés sur les deux colonnes HiTrap™
Streptavidin (Figure 22) et HisTrap™ et concentrés sur Amicon® pour analyse.
Figure 22. Chromatogramme de la purification du complexe sur colonne Streptavidine. En bleu

la DO à 280nm, en vert la concentration en desthiobiotin. (A) Rétention des ribosomes et élimination
des autres molécules non liées aux ribosomes (pic de DO280). (B) Élution des ribosomes complexés
ou non (pic de DO280).
L’échantillon obtenu est analysé sur gel gradient et en coloration négative (Figure 23, B).
Nous observons bien une bande correspondant à la RNase sur le gel (figure 23, A), signifiant
la formation d’un complexe stable RNase R/70S.
Figure 23. Analyse du complexe 70S-RNase R par gel d’acrylamide et coloration négative. (A)
Gel gradient (4-20%) SDS-PAGE après purification du complexe. (B) Coloration négative à l’acétate
d’uranyle du complexe après purification, permettant de contrôler l’association des sous-unités
ribosomales.
Cet échantillon est ensuite vitrifié dans une fine couche de glace amorphe et observé par cryo-
MET sur un microscope TECNAI G2 SPHERA opérant à 200 kV (plateforme MRic, Rennes).
Nous avons procédé à environ β00 acquisitions à faibles doses d’électrons. Les particules
isolées de chaque image sont ensuite sélectionnées et analysées à l’aide du logiciel IMAGIC-
V. Une première reconstruction à faible résolution est obtenue, et comparée à la structure d’un
ribosome vide (Figure 24).
Figure 24. Reconstruction à faible résolution du complexe ribosome/RNase R. En gris, le volume

obtenu après traitement des images. En jaune, le 30S et en bleu le 50S de la structure d’un ribosome
vide. La flèche noire indique l’excès de volume observé au niveau de l’éperon.
Nous observons la présence d’un volume inhabituel au niveau de l’éperon de la sous-unité

30S. Ces résultats préliminaires sont en cohérence avec de précédentes observations.
Effectivement, l’éperon se situe à proximité du canal de l’ARNm et de la protéine uS12 avec
laquelle la RNase R intéragit spécifiquement (Strader et al., 2013). Après cette première étape
prometteuse, nous sommes passés à la réalisation du complexe 70S-RNaseR-ARNtm-SmpB-
EF-Tu-Kirromycine.
Les complexes 70S/ARNtm/SmpB/EF-Tu/RNase R, en phase de pré-accommodation via

l’utilisation de kirromycine bloquant EF-TuGDP aux ribosomes, ont été réalisés et purifiés
de la même manière, sur colonnes HiTrap™ Streptavidin et HisTrap™ (histidine). Une
analyse sur gel d’agarose est également réalisée afin de contrôler la présence d’ARNtm dans
le complexe (Figure 25).
A B
Figure 25. Analyses du complexe 70S/ARNtm/SmpB/EF-Tu/RNase R sur gels. (A) Gel d’Agarose
1,8% (MOPS 40mM ph7, NaOAc 10mM, EDTA 1mM) révélé au BET. Le puit * correspond au
complexe 70S/ARNtm/SmpB/EF-Tu/RNase R (4pmoles) et le puit ARNtm, ARNtm E. coli pur (1µg).
(B) Gel SDS-PAGE 10%, révélé à l’Instant BlueTM. Le puit RNase R : RNase R (275pmoles) ; EF-Tu
: EF-Tu (55pmoles) ; * : Complexe 70S/ARNtm/SmpB/EF-Tu/RNase R (10pmoles) ; 70S : ribosome
pur (10pmoles) ; M : marqueur de taille.
D’après les résultats obtenus sur le gel A, la présence des ARN ribosomiques (5S) est
observée. Cependant, pas ou peu d’ARNtm est présent dans le complexe. En effet, la bande
correspondant aux ARNtm, n’est pas retrouvée sur l’échantillon (Figure 25, gel A, piste
ARNtm). D’après les résultats obtenus pour la piste correspondant au complexe en pré-
accommodation du gel B, une bande de faible intensité est observée à environ 97kDa
correspondant à la présence de la RNase R dans l’échantillon. Une bande faiblement visible,
d’environ 45kDa correspondant à EF-Tu est également observée. Les autres bandes
correspondent aux protéines ribosomiques. L’analyse des gels montre que le ratio ribosomes
complexés/ribosomes seuls est très faible. En conséquence il est impossible de passer à
l’étape d’analyse par cryo-MET. En effet, il est indispensable d’avoir un échantillon
concentré en complexes et le plus homogène possible, afin d’obtenir une structure
tridimensionnelle de haute résolution.
III.2.3 - Discussion et conclusion des résultats préliminaires
Nous avons rencontré de nombreux problèmes tout au long de ce projet. Tout d’abord pour
l’étape de purification des complexes, qui permet de séparer les différents facteurs en excès et
d’analyser le contenu des complexes par SDS-PAGE et gel d’agarose. Effectivement, la
plupart des complexes ribosomiques sont instables et font intervenir des liaisons faibles. Ainsi
la méthode utilisée ici – ribosome retenu par l’étiquette streptavidine – n’est peut-être pas
suffisament rapide et douce. De plus, l’utilisation d’un tampon riche en desbiothine (tampon
d’élution) est peut-être néfaste pour la stabilité des complexes. D’autres méthodes sont à
tester, notamment celle utilisée classiquement pour l’étude du ribosome : l’ultracentrifugation
sur cousin de sucrose. Cette technique de séparation facile et rapide, basée sur la séparation
des molécules selon leur coefficient de sédimentation, est tout à fait compatible pour la
réalisation de l’étape de purification. Une dernière solution possible est de ne pas purifier,
ainsi nous pouvons réaliser les grilles de cryo-MET juste après préparation du complexe.
Mais dans ce cas nous ne pouvons pas valider la présence ou non de complexe par analyse
biochimique.
De plus, le passage chez E. coli des éléments du complexe pour l’étude de la trans-traduction
pose deux problèmes majeurs : (i) la répartition des ribosomes E. coli dans la glace pour
l’étude en cryo-MET n’était pas optimale. Après plusieurs essais, le protocole de purification
des ribosomes en présence d’anti oxydant a permis d’améliorer ce problème. (ii) le second
problème est la présence de SmpB dégradé et d’un mauvais rendement durant la purification
de cette protéine. Pour améliorer le protocole actuel de purification de SmpB, plusieurs
stratégies sont actuellement testées, notamment une induction à basse température, et des
étapes supplémentaires de passage sur colonnes échangeuses d’ions.
IV - Les autres rôles de la trans-traduction 131
IV - Les autres rôles de la trans-traduction
IV.1 - Introduction – Les autres rôles de la trans-traduction
La trans-traduction est un système élégant qui combine le sauvetage des ribosomes,

l’élimination de l’ARNm défectueux et de la protéine incomplète. De plus, des observations
récentes font état de la régulation spécifique de la traduction d'un petit nombre de gènes par
trans-traduction. Ce chapitre met l'accent sur le rôle spécifique de la trans-traduction dans la
régulation physiologique des bactéries, notamment dans la pathogénicité.
IV.1.1 - Les autres rôles de la trans-traduction
La trans-traduction régule l’expression de nombreux gènes, dont notamment celle du facteur

alternatif ArfA, produit uniquement lorsque la trans-traduction est insuffisante. La trans-
traduction intervient également dans le cycle cellulaire, comme chez Caulobacter crescentus
(Russell and Keiler, 2009) ou Bradyrhizobium japonicum (Ebeling et al., 1991) par exemple.
Plusieurs bactériophages nécessitent également la trans-traduction pour leur développement,
comme le phage P22 (Withey and Friedman, 1999) ou le phage Mu (Ranquet et al., 2001). Il a
été également démontré que la trans-traduction régule le quorum-sensing (Kumar et al.,
2016).
IV.1.2 - Régulation de la pathogénicité
D’importants changements du profil d'expression génique sont retrouvés au cours de la

pathogenèse, lorsque les bactéries sont confrontées à différents stress et à l'attaque par les
systèmes de défense de l'hôte. La résistance aux stress et le pouvoir pathogène sont liés, et
aujourd’hui nous commençons à comprendre le rôle de la trans-traduction dans les souches
pathogènes.
IV.1.2.1 - Le stress
La trans-traduction permet aux bactéries de répondre efficacement à une variété de stress. Les
cellules dépourvues d’ARNtm ont une phase de latence retardée après la phase stationnaire
(Oh and Apirion, 1991), sont plus sensibles aux manques d’acides aminés (Li et al., 2008),
aux chocs thermiques (Oh and Apirion, 1991) et aux antibiotiques ciblant le ribosome (Abo et
al., 2002). Les bases moléculaires de ces phénotypes ne sont pas connues, mais certains
phénotypes peuvent être causés par un dérèglement de RpoS (« RNA polymerase sigma S
factor »), un facteur sigma alternatif qui est exprimé lors de la phase stationnaire ou lors de
conditions de stress (Ranquet and Gottesman, 2007). De la même manière, les niveaux
d’ARNtm et SmpB augmentent au cours du stress thermique, et sont indispensables pour y
répondre (Shin and Price, 2007). La sensibilité accrue aux antibiotiques dans les cellules
dépourvues de l'activité de trans-traduction est quant à elle probablement due à un niveau plus
élevé de ribosomes bloqués causée par la lecture erronée ou bloquée de l’ARNm (Li et al.,
2013).
La trans-traduction influe également sur d’autres résistances aux stress qui sont
particulièrement intéressantes dans les
mécanismes de pathogénicité, comme le stress
Box n°11 - Les ulcères de l’estomac sont
maintenant considérés comme des maladies oxydatif qui a lieu lors de phagocytoses. Idem
dues à l’infection par Helicobacter pylori et
se traitent, comme toute maladie infectieuse pour Helicobacter pylori, qui ne vit que dans
bactérienne, avec des antibiotiques. Pour
cette découverte, le Professeur Barry J.
l’estomac de l’Homme, dans un milieu très acide
Marshall et le Dr J. Robin Warren ont reçu (Thibonnier et al., 2008). Le rôle central de la
en 2005 le Prix Nobel de Médecine.
trans-traduction pour la virulence de H. pylori est
essentiel, grâce au sauvetage très fréquent des ribosomes dans les conditions de stress
rencontrées dans l'environnement gastrique.
IV.1.2.1 - La pathogénicité
La trans-traduction est directement nécessaire pour la virulence de certains agents

pathogènes. Par exemple les souches Y. pseudotuberculosis ssrA (pour « small and stable
RNA A » gène codant pour l’ARNtm), sont incapables de proliférer dans des macrophages
chez la souris. Au moins une partie de ce défaut de virulence est due à un retard dans la
production de protéines effectrices sécrétées, connues sous le nom Yops. Après l'invasion des
macrophages, le facteur de transcription virF régule la production et la sécrétion de Yops,
mais en l'absence d'ARNtm, virF est dérégulé et la sécrétion Yop est retardée (Okan et al.,
2006).
Chez Salmonella enterica, l’ARNtm est nécessaire à la fois pour la prolifération dans les
macrophages et pour la virulence chez la souris. L'expression de plusieurs gènes de virulence
est perturbée dans la souche ΔssrA, mais la base moléculaire pour le phénotype de virulence
est inconnu (Julio et al., 2000). Des résultats similaires sont retrouvés chez Salmonella
Typhimurium, où Hfq et SmpB modulent directement ou indirectement un éventail de
protéines qui sont requises pour de nombreux processus biologiques, y compris l'invasion de
la cellule hôte, la motilité, le métabolisme central, la biosynthèse des LPS
(lipopolysaccharides), des systèmes de régulation à deux composants et le métabolisme des
acides gras. Ces résultats suggèrent que les voies de contrôle-qualité de la synthèse protéique
jouent un rôle important dans la régulation de la virulence et l'adaptation de l'environnement
(Ansong et al., 2009).
Chez Staphylococcus aureus ΔssrA, on constate une augmentation du pigment de la bactérie.

Le pigment caroténoïde doré de S. aureus, la staphyloxanthine, est un facteur de virulence
important qui altère les neutrophiles et possède
une activité antioxydante (Lan et al., 2010).
Cette fois ce n’est pas l’intervention de la trans- Box n°12 - Staphylococcus aureus est observé
pour la première fois par Pasteur en 1880,
traduction qui est en jeu, puisque la couleur des tient son nom de staphylē, "grappe de raisin"
et Kokkos, "granule".
bactéries ne change pas lorsque le gène smpb
est inactivé. En fait, l’ARNtm agit comme un ARN antisens en se liant à la région contenant
la séquence de Shine-Dalgarno de l’ARNm codant pour la protéine crtMN, enzyme nécessaire
à la synthèse du pigment. Ainsi, l’ARNtm, et non la trans-traduction, joue un rôle important
dans la pathogenèse de S. aureus (Liu et al., 2010).
Chez Francisella tularensis, les souches mutantes ΔssrA perdent leur virulence. Cette perte
est due à la baisse de synthèse de facteurs de virulence, tel que le locus de croissance
intracellulaire C (IglC) et le facteur de macrophage infectiosité (Mif) (Svetlanov et al., 2012).
IV.2 - Conclusion – Les autres rôles de la trans-traduction
En conclusion, la trans-traduction est essentielle à la survie de nombreuses bactéries

pathogènes (Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Shigella flexneri etc.) et
elle est requise pour la virulence d’autres espèces. Lorsqu’elle n’est pas létale, la délétion de
l’ARNtm ou de SmpB entraîne l’apparition de phénotypes hypersensibles chez de nombreuses
espèces bactériennes, et ces mutants ne sont pas viables en présence de faibles doses
d’inhibiteurs de la synthèse protéique (chloramphénicol, lincomycine, spiramycine, tylosine,
érythromycine, ou spectinomycine). Ces différences de phénotypes en absence de trans-
traduction dépendent essentiellement de la présence de système de sauvetage du ribosome
alternative.
V - Article #4 | K. Macé, E. Giudice and R. Gillet. - 2015 - Med Sci 135
V - Article #4 | K. Macé, E. Giudice and R. Gillet. - 2015 -

Med Sci
V.1 - Introduction de l’Article #4
La synthèse des protéines par le ribosome : Un chemin semé d'embûches
K. Macé, E. Giudice & R. Gillet Med Sci (Paris). 2015 Mar;31(3):282-

90.
La trans-traduction est omniprésente chez toutes les bactéries et, comme nous venons de le
voir, son rôle va bien au-delà du sauvetage des ribosomes bloqués. Après l’âge de la
recherche fondamentale concernant ce processus captivant, arrive celui des applications,
notamment médicales. C’est dans ce sens que nous avons rédigé cette revue, afin d’exposer
les possibilités d’applications thérapeutiques qu’offre le mécanisme de trans-traduction.
V.2 - Article #4
Photographie réalisée par Reynald Gillet

VI - Conclusion – La trans-traduction 147
VI - Conclusion – La trans-traduction
Comme détaillé dans l’article, les intérêts thérapeutiques de la trans-traduction sont

multiples : vaccins, diagnostics ou antibiotiques.
Pour la recherche de nouveaux antibiotiques ciblant la trans-traduction il est nécessaire de

développer un outil rapporteur efficace de cette activité (Alumasa and Keiler, 2015). Les
connaissances du laboratoire sur la trans-traduction, notamment au niveau structural, ainsi
qu’en microbiologie et génétique moléculaire, nous ont offert la possibilité de réaliser un outil
génétique rapporteur de la trans-traduction, original et performant. Avec l’aide de cet outil et
de collaborations multidisciplinaires, nous avons également débuté une recherche active de
nouveaux antibiotiques.
VI - Conclusion – La trans-traduction 149
Partie III
Re he he d’anti ioti ues i lant la

trans-traduction
I - Généralités sur les antibiotiques 150
I - Généralités sur les antibiotiques
I.1 - Bref historique sur les antibiotiques
Un antibiotique est une substance naturelle ou synthétique qui détruit (bactéricide) ou qui
bloque la croissance (bactériostatique) des bactéries. Les antibiotiques agissent de manière
spécifique sur les bactéries, en bloquant une étape
essentielle de leur développement. Les antibiotiques sont
Box n°13 – Antibiotique
provient du grec ancien anti : habituellement classés en fonction de leur mécanisme
“contre” et bios : “la vie”.
d'action, de leur structure chimique, ou de leur spectre
d'activité. Ceux qui ciblent la paroi cellulaire bactérienne (pénicillines et céphalosporines), la
membrane cellulaire (polymyxines) ou interférent avec des enzymes essentielles (rifamycines,
lipiarmycins, quinolones et sulfamides) ont des activités bactéricides. A l’inverse, ceux qui
ciblent la synthèse des protéines (macrolides, lincosamides et tétracyclines) sont généralement
bactériostatiques (à l'exception des aminoglycosides).
Un grand nombre d’antibiotiques est fabriqué par des micro-organismes : champignons,

végétaux supérieurs, lichens ou bactéries elles-mêmes. Ces dernières produisent ces
substances pour éliminer les autres micro-organismes concurrents, pour l’occupation d’un
biotope par exemple. C’est comme cela qu’en 19β8 Sir Alexander Fleming a découvert le
premier antibiotique, par l’observation sur une boite de Preti d’une inhibition de
Staphylococcus aureus par un champignon, le Penicillium notatum. Il émit l'hypothèse que
l’inhibition était dûe à une substance sécrétée par le champignon et lui donna le nom de
pénicilline. Ce phénomène de concurrence entre micro-organismes est aujourd’hui encore
utilisé (Zipperer et al., 2016), mais pour des raisons variées (toxicité, dégradation, diffusion
etc) seul un petit nombre de ces antibiotiques naturels sont utilisables en thérapie humaine.
L'introduction généralisée des antibiotiques

après la Seconde Guerre mondiale a été l'un des
Box n°14 – Alexander Fleming, Ernst Boris
progrès thérapeutiques les plus importants du Chain et Howard Walter Florey ont obtenu le
prix Nobel de médecine en 1945 pour la
XXe siècle. Les traitements antibiotiques ont découverte de la pénicilline et de ses effets
curatifs dans diverses maladies infectieuses.
fait progresser l'espérance de vie de plus de dix
ans. Mais dès 1945, dans un article publié dans le New York Times (Penicillin’s finder Assay
its future) le « père » de la pénicilline avait prévenu des risques liés à un mauvais usage du
médicament en indiquant qu’un usage massif des antibiotiques « aboutirait, non à
l’élimination de l’infection, mais à apprendre aux microbes à résister à la pénicilline,
microbes qui seraient ensuite transmis à un individu […] chez qui ils provoqueraient une
pneumonie ou une septicémie que la pénicilline ne pourrait plus guérir ». Malheureusement
ces déclarations allaient se confirmer rapidement (Figure 26).
Figure 26. Utilisation thérapeutique des antibiotiques et apparition des premières résistances.
Image internet (http://www.vitamindwiki.com/Antibiotics+and+Vitamin+D+are+associated+with+many+of+the+same+diseases)
L’usage généralisé voire abusif des antibiotiques entraîne une adaptation des bactéries par
pression de sélection. Elles peuvent muter et modifier la cible des antibiotiques, devenir
imperméables aux antibiotiques ou acquérir des gènes qui produisent des enzymes qui
détruisent ou expulsent les antibiotiques. Elles deviennent résistantes et se multiplient, tout en
transférant parfois cette résistance à d'autres bactéries. Enfin, certaines bactéries peuvent
devenir résistantes à plusieurs antibiotiques. Elles sont dites multi-résistantes.
Faute de traitement adapté contre certains germes particulièrement résistants, on observe en

milieu hospitalier une baisse générale de l'efficacité thérapeutique et à une augmentation du
risque nosocomial. De plus, l’assèchement des découvertes et en conséquence de la mise sur
le marché de nouveaux antibiotiques n’annonce pas un avenir meilleur. Effectivement, malgré
des sommes considérables investies au cours des vingt dernières années, aucune nouvelle
classe d'antibiotiques pour les bactéries à gram négatif n'a été homologuée au cours des 30
dernières années (Lewis, 2012) (Figure 27). Ces dernières années sont pourtant
particulièrement marquées par la recrudescence de bactéries multi-résistantes (Di Pilato et al.,
2016). Face aux problèmes sanitaires et économiques qu’elles entraînent, la recherche doit
aujourd’hui s’intensifier afin de découvrir de nouvelles cibles antibiotiques.
Figure 27. Frise chronologique des découvertes de nouvelles classes d’antibiotique. Image
internet (http://www.businessinsider.com/massive-risk-of-antibiotic-resistant-bacteria-in-three-charts-2013-1?IR=T)
I.3 - Les antibiotiques ciblant le ribosome
Le ribosome est la cible principale des antibiotiques efficaces cliniquement (Figure 28). La
recherche actuelle s’oriente vers le développement d’antibiotiques semi-synthétiques avec de
meilleures propriétés antimicrobiennes à partir de molécules naturelles connues.
Actuellement, plusieurs nouveaux antibiotiques ciblant le ribosome sont au stade d’essais
cliniques, comme l’aminoglycoside plazomizin (Achaogen), la cethromycin (Advanced Life
Sciences) ou bien l’oxazolidinones PF-02341272 (Pfizer). Même si ces molécules offrent des
avantages comme une meilleure absorption ou sont moins sujettes à efflux, l'inconvénient
majeur est qu’ils ciblent le même site de liaison que les composés parents dont ils sont issus,
et n’offrent donc pas de nouvelles cibles (Butler and Cooper, 2011).
Figure 28. Vue des étapes de la synthèse protéique ciblées par les principaux
antibiotiques. D’après Daniel N. Wilson, 2014, Nature Reviews Microbiology
Des antibiotiques ayant de nouvelles cibles ribosomiques sont également en cours de

développement, mais à des stades plus précoces. La stratégie est de modifier des antibiotiques
produits naturellement et dont la toxicité ou la solubilité empêchent actuellement leur
utilisation thérapeutique (Nicolaou et al., 2009). Cependant, il existe une cible voisine de la
synthèse protéique mais pas encore exploitée : les mécanismes de contrôle qualité de la
synthèse protéique, et plus particulièrement la trans-tranduction.
II - État de l’art des antibiotiques ciblant la trans-traduction 155
II - État de l’art des antibiotiques ciblant la trans-

traduction
II.1 - Introduction – État de l’art des antibiotiques ciblant la trans-

traduction
La trans-traduction peut être ciblée de manière non spécifique par des antibiotiques qui
bloquent la traduction canonique (Vioque and de la Cruz, 2003). Avant 2011, aucun
antibiotique n’était connu pour cibler la trans-traduction ou d’autres voies de sauvetage des
ribosomes (Shi et al., 2011). La découverte de la trans-traduction comme cible principale de
la pyrazinamide, un antituberculeux de première ligne découvert et utilisé depuis 1956, a
enfin apporté la preuve de concept manquante (Kalinda and Aldrich, 2012). Depuis, une
seconde molécule inhibant la trans-traduction - le KKL-35 - a été découverte en 2013 à partir
d’une chimiothèque de plus de 663 000 molécules (Ramadoss et al., 2013).
II.2 - La pyrazinamide
II.2.1 - Introduction : la pyrazinamide
La pyrazinamide (ou PZA) est spécifique du genre Mycobacterium. Cliniquement, elle est
toujours utilisée en association avec d'autres
antibiotiques comme l'isoniazide, la rifampicine et
Box n°15 – Le bacille de Koch est
l'éthambutol contre le bacille de Koch. La l’autre nom de Mycobacterium
tuberculosis, Découvert en 1882 par
pyrazinamide permet de réduire la durée globale du
Robert Koch.
traitement (2 mois environ contre 9 mois sans la PZA).
La pyrazinamide est un pro-médicament, puisqu’il est converti par la pyrazinamidase en
molécule active : l'acide pyrazinoïque (POA) (Figure 29).
Figure 29. Conversion de la pyrazinamide en acide pyrazinoïque.

L'acide pyrazinoïque a plusieurs cibles. D'une part, il inhibe la synthèse des acides gras
nécessaire à la bactérie via inhibition de l’enzyme FAS I (Fatty Acid Synthase) (Boshoff et
al., 2002). Des études in vivo et in vitro ont confirmé cette inhibition par l'acide pyrazinoïque
et de plusieurs analogues (Sayahi et al., 2012). L'augmentation de la concentration de POA
pourrait également perturber le potentiel de membrane et ainsi limiter la production d'énergie.
Autre cible, l'acide pyrazinoïque acidifie le milieu cytoplasmique et, de manière inattendue,
inhibe également la trans-traduction (Zhang et al., 2013) (Figure 30).
Figure 30. Mécanisme d’action de la pyrazinamide. D’après Zhang et al., 2013,

MicrobiolSpectrum.
II.2.2 - Effet de l’acide pyrazinoïque sur la trans-traduction
L'acide pyrazinoïque inhibe la trans-traduction en bloquant l’interaction entre l’ARNtm et la

protéine ribosomique bS1 de M. tuberculosis, mais pas d’E. coli ou M. smegmatis (Shi et al.,
2011).
Chez M. tuberculosis, bS1 codé par le gène rpsA, est composé de six domaines dont les deux
premiers sont impliqués dans la liaison au ribosome. bS1 de M. tuberculosis possède
également une queue d’environ 100 acides aminés à son extrémité C-terminale (Salah et al.,
2009). Des tests d’interactions entre différents domaines de bS1 et l’acide pyrazinoïque ont
démontré que POA se fixe sur le quatrième domaine de bS1 (figure 31). Ainsi POA inhiberait
la trans-traduction de M. tuberculosis en bloquant et / ou modifiant le site de liaison de
l’ARNtm à bS1, empêchant ainsi la formation d'un complexe bS1-ARNtm-SmpB et donc la
trans-traduction (Yang et al., 2015).
Figure 31. Structure aux rayons X de bS1 lié à l’acide pyrazinoïde. D’après Juanjuan Yang et al,
2015, Molecular Microbiology. En volume (rouga à bleu) le quatrième domaine de bS1 de chez M.
tuberculosis complexé avec deux molécules de POA.
La plupart des résistances à la pyrazinamide ont pour origine des mutations sur le gène pncA
codant pour la pyrazinamidase, une enzyme transformant la pro-drogue PZA en POA actif.
Mais il a été également observé des résistances sur des souches présentant des mutations sur
le gène rpsA. L’étude structurale de S1 muté à la position 4γ8 connu pour être résistante à la
PZA a permis de montrer des modifications structurales dans le site de fixation de
l’antibiotique (Figure 32).
Figure 32. Structure aux rayons X de bS1 muté. D’après Juanjuan Yang et al, 2015, Molecular
Microbiology. Focus sur la région de bS1 muté de chez M. tuberculosis résistant à la PZA.
Malheureusement le spectre très étroit de l’activité de la pyrazinamide - dû peut-être à la

structure particulière de bS1 chez M. tuberculosis - ne permet pas d’utiliser cet antibiotique
contre d’autres agents pathogènes.
II.3 - Le KKL-35
Le second antibiotique connu pour cibler spécifiquement la trans-traduction est le KKL-35

ainsi que certains de ses dérivés (Figure 33 ; (Ramadoss et al., 2013)). Certains composés sont
spécifiques de la trans-traduction et d’autres ciblent les protéases impliquées dans la trans-
traduction. Afin de confirmer que le KKL-35 inhibe bien la trans-traduction et non une cible
secondaire, de nombreux tests in vitro et in vivo ont été réalisés (Ramadoss et al., 2013).
Curieusement, KKL-35 a également été identifié lors d’un criblage haut débit de molécules
inhibant la croissance de Mycobacterium tuberculosis (Reynolds et al., 2012). Cependant, la
cible précise du KKL-35 et de ses dérivés n’est pas identifiée.
Figure 33. Structure des composés actifs contre la trans-traduction découverte par l’équipe de
Kenneth Keiler.
L’équipe de Kenneth Keiler à l’origine de cette découverte a poursuivi ces recherches en

testant l’activité du KKL-35 et de ses dérivés sur une souche dépourvue de systèmes
alternatifs à la trans-traduction, Francisella tularensis (sans ArfA ni ArfB) (Figure 34). Après
plusieurs analyses, dont des inhibitions de la prolifération de Francisella tularensis dans des
macrophages, les composés KKL-10 et KKL-40 sont aussi jugés comme étant de bons
composés pour le développement d'antibiotiques (Goralski et al., 2016).
Figure 34. Répartition de la présence d’ArfA et ArfB dans différentes espèces. D’après Kenneth
C. Keiler and Heather A. Feaga, 2014, J Bacteriol. Les noms en gras indiquent les espèces dans
lesquelles l’ARNtm ou SmpB sont vitaux.
III - Le développement d’un outil pour la recherche d’antibiotiques ciblant la trans-traduction 162
III - Le développement d’un outil pour la recherche

d’antibiotiques ciblant la trans-traduction
III.1 - Introduction – Le développement d’un outil pour la recherche

Dans l’objectif de développer un outil fiable pour mesurer in vivo l’activité de composés anti
trans-traduction, nous avons mis au point un système rapporteur bicolore chez E. coli. Pour
cela, nous avons combiné un mécanisme rapporteur de la trans-traduction, le test, (Keiler and
Feaga, 2014) à celui des protéases, le contrôle (Cheng et al., 2007). Ainsi, deux protéines
fluorescentes ont été clonées en opéron : la première protéine est mCherry (rouge) complétée
en N-terminal par une étiquette identique à celle ajoutée par l’ARNtm d’E. Coli :
A*ANDENYALAA (l’alanine avant l’étoile est celle apportée par le domaine ARNt de
l’ARNtm, le TLD). Cette construction protéique que nous nommerons « mCHERRY_tag »
est reconnue par des protéases et dégradée. La seconde protéine est une GFP (verte) (« Green
Fluorescent Protein »). Une séquence correspondant à un terminateur ARN fort est rajoutée à
son gène, avant le codon-stop. Cette séquence codante est transcrite sous la forme d’un
ARNm GFP non-stop qui bloquera les ribosomes lors de sa traduction, provoquant ainsi
l’intervention de la trans-traduction. L’étiquette spécifique de la trans-traduction est rajoutée
à la GFP bloquée qui une fois libérée est reconnue par des protéases et dégradée (Figure 35,
A).
Figure 35. Modèle du système rapporteur. (A) Schéma explicatif du système rapporteur de la trans-
traduction et (B) les différents résultats possibles.
Trois situations sont possibles (Figure 35, B). Si la mutation ou le composé testé n’a pas
d’effet sur la trans-tranduction ou les protéases, les deux protéines fluorescentes sont
dégradées et les cellules ne sont pas fluorescentes. En revanche, si le composé testé inhibe la
trans-traduction, la GFP bloquée dans le ribosome n’est plus étiquetée. La GFP stable
s’accumule donc dans les cellules, conduisant à une fluorescence dans le vert. Enfin, si la
mutation ou le composé testé inhibe les protéases, les protéines mCherry et GFP, qu’elles
soient étiquetées ou non, ne sont pas dégradées et s’accumulent dans les cellules, induisant
une fluorescence rouge et verte.
Notre système présente de nombreux avantages par rapport aux solutions préexistantes.
D’abord, ce système « deux en un » (test et contrôle associés) permet d'éliminer les faux
positifs grâce à la présence d’un témoin interne. La présence de ce témoin n’est pas
négligeable, puisque l’expression conjointe des deux protéines est maîtrisée par une seule
induction. En conséquence une même quantité de protéines est exprimée entre le test et le
témoin, pour chaque bactérie, évitant ainsi des biais. Ce système est donc très spécifique, et sa
sensibilité et reproductibilité sont suffisamment performantes pour juger de l’efficacité d’une
molécule.
De plus, ce système peut être utilisé dans différents conditions de cultures (par exemple :
biofilm vs culture liquide | phase exponentielle vs phase stationnaire | milieu solide (boite de
Petri) vs milieu liquide (plaque de 96 puits)). L’utilisation de protéines fluorescences est une
technique versatile qui permet la visualisation des résultats par différents moyens
(Microscopie de fluorescence, fluorimètre, etc.). Cela permet d'utiliser ce système, non
seulement pour le criblage de molécule, mais également pour la recherche fondamentale.
Enfin, le système est conçu de manière à être facilement transposable dans différentes espèces
bactériennes (Espèces/souches différentes).
III.2 - Détail et construction du système rapporteur
Pour construire la séquence du système rapporteur (voir la séquence Annexe N°1 – Partie III),
nous avons choisi un promoteur constitutif d’E. coli de consensus TTGACA-TATAAT
(Kanaya and Kudo, 1991). Ce promoteur est directement suivi par la séquence lacO :
séquence non codante sur laquelle vient se fixer la forme active du répresseur LacI,
empêchant l'action de l'ARN polymérase. Ce promoteur avec l’opérateur permet d’induire
l’operon de manière maitrisée avec de l’IPTG (isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside). Des
sites de restrictions placés de part et d’autre permettent de modifier ce promoteur (voir
Annexe N°2 – Partie III).
Le premier gène codant pour la protéine mCHERRY débute par un site de fixation au
ribosome (SD ou RBS pour « Ribosome Binding Site ») de consensus AGGAGG (Barrick et
al., 1994). Une séquence de 7 nucléotides sépare le site de fixation au ribosome du codon de
démarrage AUG. Cette séquence, SD + les 7 nucléotides, est identique pour la seconde
protéine GFP.
La séquence mCHERRY est modifiée avant le codon stop par l’insertion d’une séquence
codant pour l’étiquette de l’ARNtm d’E. coli (A*ANDENYALAA). Cette séquence est
également flanquée par des enzymes de restriction afin de pouvoir la modifier facilement.
Effectivement chaque espèce bactérienne possède une étiquette différente. Ainsi si l’on
souhaite transposer le système dans une autre espèce, il est nécessaire de changer l’étiquette
(voir site web des étiquettes de l’ARNtm en fonction des espèces :
http://www.ag.auburn.edu/mirror/tmRDB/peptide/peptidephylolist.html). Après le codon stop,
une séquence intermediaire de 12 nucléotides (TCTAGATTTAAG) est insérée contenant
également des sites de restrictions.
Le second gène codant pour la protéine GFP débute donc par la même séquence que la
mCHERRY (SD + 7 nucléotides). Avant le codon stop est ajouté un terminateur synthétique
fort. Nous nous sommes appuyés sur une publication ayant testé un grand nombre de
terminateurs naturels et synthétiques (Chen et al., 2013b). Nous avons choisi de placer trois
terminateurs à la suite (figure N°36). Le premier nommé L3S2P56 est synthétique, le second
ECK12002960 est naturel. Enfin le troisième est un terminateur naturel de l’opéron rrnC chez
E. coli (Young, 1979).
Figure 36. Prédiction de structure secondaire du terminateur. En haut à droite la séquence codant
les trois terminateurs, au centre la prédiction de la structure secondaire de cette séquence réalisée avec
le logiciel Oligo Analyzer.
Ce « méga » terminateur ne possède pas de codon stop. Lorsque ce terminateur est transcrit
par l’ARN polymérase, trois grandes tige-boucles se forment, bloquant prématurément la
transcription, ce qui génère un ARNm « non-stop ». L’ensemble de cette séquence est
également flanqué par des enzymes de restrictions permettant de le déplacer facilement dans
d’autres plasmides.
La séquence entière a été commandée et vérifiée chez Thermo Fisher Scientific (GeneArt®).
Puis par clonage avec les enzymes de restriction, la construction a été placée dans un vecteur
pBADβ4 (inductible à l’arabinose) et un vecteur pET15b (inductible à l’IPTG). Pour le
premier plasmide pBADβ4 nous n’avons pas obtenu de résultat satisfaisant, nous avons donc
poursuivi la mise au point sur le plasmide pET15b. Aussi, ce plasmide a été modifié en
remplacant l’étiquette de l’ARNtm d’E. coli (A*ANDENYALAA) par celle de
Staphylococcus aureus (A* GKSNNNFAVAA).
La mise au point de l’utilisation de ce système rapporteur a nécessité de nombreux essais. Il

est aujourd’hui opérationnel pour l’utilisation sur plaque 96 puits et lecture au
spectrofluorimètre. Cette technique est particulièrement adaptée à la réalisation de criblages
haut débit. De plus, ce système a également été mis au point afin de pouvoir effectuer des
suivis dans le temps par microscopie à fluorescence (Figure 37). Cette technique, consistant à
observer la croissance bactérienne et la fluorescence au cours du temps, est réalisée en
déposant une faible concentration de bactéries (DO = 0.1) sur un gel d’agar. Ce support
permet de fixer les bactéries tout en les maintenant en vie. Après dépôt des bactéries, le gel
d’agar placé entre lame et lamelle est scellé afin d’éviter l’assèchement. La visualisation par
microscopie est complémentaire de la lecture sur plaques – moyenne de la fluorescence – car
elle permet d’observer directement le système dans la bactérie au cours de son cycle
celullaire.
Figure 37. Time lapse en microscopie à fluorescence de la souche E. coli ΔssrA. Le temps est
indiqué en minutes. La ligne du haut correspond à l’observation en lumière blanche. Les bactéries sont
clairement visibles. La ligne du milieu correspond à une visualisation avec le filtre GFP, et la ligne du
bas avec le filtre mCHERRY. Comme expliqué dans la Figure γ5B, les bactéries ΔssrA fluorescent
dans le vert et non dans le rouge. Les images sont acquises sur un vidéo microscope Olympus IX71
inversé API DeltaVision de la plateforme MRic.
III.3 - Conclusion - Le développement d’un outil pour la recherche

Ce système rapporteur in vivo de la trans-traduction est opérationnel pour le criblage haut

débit et pour l’étude fondamentale de la trans-traduction. L’objectif final est d’adapter ce
système bicolore chez différentes espèces afin de réaliser un « Kit de screening » commercial.
Ses particuliarités, et notamment l’utilisation d’un témoin interne et sa transposabilité à
d’autres espèces qu’E. coli, en font un système particulièrement novateur. C’est la raison pour
laquelle l’ensemble de ce travail a été valorisé par la réalisation d’un brevet. Le dépôt de
brevet est réalisé en partenariat avec la SATT Ouest Valorisation (Sociétés d'Accélération du
Transfert de Technologies), en lien avec le cabinet de propriété industrielle Plasseraud. En
plus de protéger ce système et de pouvoir le vendre à des industriels, ce brevet permettra
également d’avoir des droits sur toutes les molécules ayant une activité anti trans-
traductionnelle, découvertes et/ou validées par cette méthode. Actuellement, ce système est
tilisé au laboratoire et les premiers résultats sont présentés dans l’article suivant. Cet article de
méthode est en cours de rédaction et sera soumis une fois le brevet déposé.
IV - Article #5 | K. Macé et al. 169
IV - Article #5 | K. Macé et al.
IV.1 - Introduction de l’Article #5
A new antibiotic screening assay targeting trans-translation in vivo
K. Macé et al.
Nous avons d’abord validé le système de détection de la trans-traduction chez E. coli (wt,
ΔssrA, ΔclpP). Nous avons observé des résultats intéressants comme la spécificité de
l’étiquette de l’ARNtm pour la reconnaissance et la dégradation des protéines trans-traduites
mais également un changement des voies de dégradations en fonction du cycle cellulaire, ou
encore une complémentation de la dégradation des produits trans-traduits par les protéases
ClpAP et ClpXP. Puis dans un second temps, nous avons testé la seule molécule connue pour
inhiber la trans-traduction chez E. coli, le KKL-35. Étonnamment nous n’avons pas observé
d’effet tangible du KKL-35 sur la trans-traduction, mais un léger effet sur les protéases.
Après approfondissement des recherches, la trans-traduction et les protéases ne sont pas les
cibles principales du KKL-35.
IV.2 - Article #5
Trans-translation is not the main target of the antibiotic KKL-35

Kevin Macé, Fanny Demay, Charlotte Guyomar, Sylvie Georgeault, Emmanuel Giudice,
Renan Goude, Annie Trautwetter, Gwennola Ermel, Carlos Blanco, and Reynald Gillet*
Univ. Rennes, CNRS, UBL, Institut de Génétique et Développement de Rennes (IGDR)

UMR6290 35000 Rennes, France
*Corresponding author. Tel: +33 (0)2 23 23 45 07; E-mail: [email protected]
Running title: KKL-35 and trans-translation inhibition
Keywords: Antibiotics, KKL-35, Ribosome, tmRNA, trans-translation

Trans-translation is not the main target of the antibiotic KKL-35

Kevin Macé, Fanny Demay, Charlotte Guyomar, Sylvie Georgeault, Emmanuel Giudice,
Renan Goude, Annie Trautwetter, Gwennola Ermel, Carlos Blanco, and Reynald Gillet*
Univ. Rennes, CNRS, UBL, Institut de Génétique et Développement de Rennes (IGDR)

UMR6290 35000 Rennes, France
*Corresponding author. Tel: +33 (0)2 23 23 45 07; E-mail: [email protected]
Running title: KKL-35 and trans-translation inhibition

Keywords: Antibiotics, KKL-35, Ribosome, tmRNA, trans-translation
ABSTRACT
The reality and intensity of antibiotic resistance in pathogenic bacteria means that new
reporter systems are needed for the rapid development of new antimicrobial drugs. In bacteria,
trans-translation is the primary quality control mechanism for rescuing ribosomes arrested
during translation. This key process is universally conserved and plays a critical role in the
viability and virulence of many pathogens. In a recent work, several oxadiazole derivatives
were found to inhibit trans-translation, and among these the compound KKL-35 shows strong
bactericidal activity against a large number of bacteria. To explore how KKL-35 works, we
developed a useful double fluorescence reporter system which allows for the simultaneous in
vivo detection of bacterial trans-translation and proteolysis activities. The assay was validated
using various strains that lack tmRNA, SmpB, and the ClpP protease. Surprisingly, it turns
out that KKL-35 does not directly effect on trans-translation, and the antibiotic has only a
minor impact on trans-translation-mediated proteolysis.
INTRODUCTION
The rapid development of novel antimicrobial drugs is needed to address the emergence and
gravity of antibiotic resistance in pathogenic bacteria. One of the main antibiotic targets is the
ribosome, where the fundamental process of protein synthesis (translation) takes place (1).
Despite its very promising potential, quality control of bacterial protein synthesis is a pathway
that has not yet been exploited (2). Ribosomal stalling is a serious issue for cell survival. In
bacteria, the primary rescue system for this is trans-translation, performed by transfer-
messenger RNA (tmRNA) and its partner SmpB, small protein B. Trans-translation has been
identified in all bacterial species but is absent in eukaryotes (3). tmRNA, encoded by the ssrA
gene, is a large RNA molecule with two major domains: the TLD (tRNA-like domain),
always aminoacylated by an alanine; and the MLD (mRNA-like domain), a short internal
open reading frame (ORF) that acts as an mRNA template and carries a stop codon (4). When
the tmRNA-SmpB complex enters the vacant A-site of a stalled ribosome, the nascent
polypeptide is transferred to the alanine on tmRNA (5). The ORF is then inserted into the
mRNA channel, and translation resumes using the ORF as mRNA. This translation event adds
a short degradation tag to the C-terminus of the incomplete polypeptide. The tag sequence
varies between bacterial types, although elements at the beginning and end are both highly
conserved (6). Escherichia coli cytoplasm-tagged proteins are mostly degraded by ClpXP and
ClpAP proteases (7, 8), while the inner membrane or periplasm proteins are respectively
degraded by FtsH and Tsp proteases. Two alternative ribosome rescue factors A and B (ArfA
and ArfB) can take over when trans-translation is absent or overwhelmed. ArfA (formerly
YhdL) binds to stalled ribosomes and recruits the RF2 release factor to the A-site to hydrolyze
the peptidyl-tRNA, while ArfB (formerly YaeJ) directly catalyzes the hydrolysis (9).
Although ArfB seems minor, ArfA is an essential factor in E. coli viability in the absence of
tmRNA (10). Accordingly, when ssrA is deleted, bacteria devoid of arfA (Shigella flexneri,
Helicobacter pylori, Francisella tularensis, Mycobacterium tuberculosis, and Legionella
pneumophila) cannot survive (9, 11, 12). The presence of ArfA, however, does not make
trans-translation superfluous in all bacterial species (11). Interestingly, when pathogenic
bacteria such as Salmonella enterica, Yersinia pestis, and Neisseria gonorrheae survive in the
absence of trans-translation, they generally lose their virulence (13–16). Taken together, these
facts strongly suggest that inhibitors of trans-translation may act as antibiotics and have
minimal side effects on eukaryotic hosts (17, 18). After high-throughput screening, several
compounds active against a wide array of bacteria were recently identified as inhibitors of
trans-translation. One of the most active ones, KKL-35, shows strong bactericidal activity
against various non-related bacteria, making it a promising molecule for future development
(2). Unfortunately, neither the molecular target of KKL-35 nor its mechanism of action have
yet been solved. In order to better understand how it affects trans-translation, we first
confirmed its antibacterial activity in E.coli, using various strains deleted for the efflux pumps
of the TolC system, which are known to transport KKL-35 out of the cell. Surprisingly, the
compound has the same inhibitory activity with or without tmRNA, challenging the theory
that trans-translation is the main target for KKL-35 and other oxadiazole derivatives. We
therefore developed a double-fluorescence reporter system for simultaneous and specific
detection of bacterial trans-translation and proteolysis activity. The system was designed to be
easily adapted to a large range of bacterial species, and should be very useful for the screening
of new trans-translation inhibitors. And in fact, by using this system we were able to show
that KKL-35 has no direct effect on trans-translation, and only minor effects on proteolysis.
MATERIALS AND METHODS

Bacterial strains and plasmids
Table 2 lists the details of the bacterial strains and plasmids used. E. coli DH5α and NM5ββ
strains were used for cloning experiments, and all other experiments were done using
BW25113 and its derivatives. Mutations were transduced using the bacteriophage P1 Cml
(19). Most of the mutations were from the Keio collection (20), and were created by deleting
genes and replacing them with a kanamycin resistance (KanR) cassette flanked by flippase
recognition target (FRT) sites. When necessary, the cassette was removed using pCP20, a
thermoconditional plasmid encoding the FLP recombinase (21). This allowed us to obtain
mutated strains without antibiotic resistance, and facilitated the transduction of new
mutations. Plasmid pCP20 was eliminated by growing the strains at 42°C. Restriction
enzymes, T4 DNA ligase, Phusion High-Fidelity DNA polymerase (New England BioLabs),
and Thermo-Start Master Mix (Thermo Scientific) were used following the manufacturers'
instructions. Ligation products were transformed into DH5α through electroporation with a
Bio-Rad Gene Pulser II (22). They were then isolated using a Nucleobond PC 20 miniprep kit
(Macherey-Nagel), and introduced into the E. coli strain of interest by electroporation.
Routine molecular biology procedures were performed as previously described (23). Bacteria
were grown aerobically at 37°C in Lysogeny broth (LB) (19). When necessary, we added
ampicillin (100 µg/mL), kanamycin (50 µg/mL), gentamicin (5 µg/mL), and increasing
concentrations of KKL-35 to growth medium. All antibiotics were purchased from Sigma-
Aldrich.
Construction of ptCnsG plasmid

The reporter system was created from a two-gene operon. The first gene encodes for the red
fluorescent protein mCHERRY (24), with an AANDENYALAA E. coli tmRNA-tag at its C-
terminus. The second non-stop GFP (nsGFP) gene encodes a GFPmut3 (25) whose stop
codon has been replaced by a strong terminator. We used a chimerical terminator that
combines three terminal sequences already known to be particularly effective:
CTCGGACCAAATTTTCGAAAAAAGACGCTGAAAAGCGTCTTTTTTCGTTTTG
GTCCTTCAGCCAAAAAACTTAAGACCGCCGGTCTTGTCCACTACCTTGCAGTAATGCG
GTGGACAGGATCGGCGGTTTTCTTTTCTCTTCTCAACCAGGCATCAAATAAAACGAA
AGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCT
CTC. These terminators are synthetic L3S2P56 (bold); the natural E. coli operon
ECK12002960 (italics) (26); and another E. coli operon, rrnC (underligned) (27). The two
fluorescent proteins both carry the same AGGAGG Shine-Dalgarno (SD) sequence, and the
same TATACAT sequence between the SD and ATG initiation codons. The whole operon
was synthesized and controlled by Thermo Fisher Scientific’s GeneArt service, and provided
in a kanamycin resistant cloning vector. It was cloned between pET15’s BamHI and EcoRI
restriction sites to yield ptCnsG plasmid (Fig. S1).
Construction of plasmids that encode ssrA/smpB and clpP genes

Using the corresponding primers, ssrA-smpB and clpP genes were amplified from E. coli
genomic DNA (see Table 2 and Supplementary Materials). Amplicons were cloned into
pBBR1-MCS5, yielding pBBss (carrying the ssrA-smpB operon) and pBBclp (carrying the
clpP gene). In order to do complementation assays, ΔssrA, ΔsmpB, and ΔclpP strains carrying
ptCnsG were transformed with pBBss or with pBBclp. The pBBR1-MCS5 vector was used as
a control. The strains were cultured in the presence of 50 µg/mL kanamycin, 100 µg/mL
ampicillin, or 5 µg/mL gentamicin. These plasmids were used for complementation assays.
Fluorescence analysis
LB medium was used to dilute pre-cultures in the stationary phase to an initial cell density of
OD600 = 0.025. Cell suspensions were cultivated by shaking at 190 rpm until the OD600
reached 0.1. IPTG was then added to the culture at a final concentration of 1 mM. After 30
min. of induction at 37°C, 50 µL cell suspension was distributed into 96-well microplates,
pre-incubated (in at least 3 wells) with 50 µL LB, in the presence of either DMSO or KKL-
35. The microplates were incubated at 37°C under constant shaking (190 rpm). The intensities
of GFP (excitation 485 nm / emission 535 nm / exposure: 0.06 sec) and mCherry fluorescence
(excitation 550 nm / emission 610 nm / exposure: 1.5 sec) were regularly measured with a
Berthold Twinkle LB 970 fluorometer. In order to plot the growth of each sample, duplicate
microplates were prepared in exactly the same conditions.
RESULTS AND DISCUSSION
KKL-35 activity in E. coli

Our intention was to look for the molecular targets of KKL-35, an oxadiazole derivative
recently described to be an active inhibitor of the trans-translation tagging reaction (18, 20).
We began by doing disk diffusion assays and by calculating minimum inhibitory
concentrations (MIC), thus confirming the compound’s antibacterial activity in E. coli
BW25113 (Table 1). Initial experiments were conducted using strains deleted for TolC efflux
system, known to transport many small chemical compounds including KKL-35 (2). In fact,
BW25113 is only sensitive to KKL-35 when TolC is deleted: the tolC strain has a 22 mm
inhibition diameter and a 2 µM MIC, while wild-type E. coli BW25113 had no inhibition
zone and the MIC over 32 µM (Table 1). The TolC system pumps are formed by the assembly
of two conveyors: TolC for the external membrane and variable pumps in the inner
membrane. We therefore measured the inhibition diameters of 18 strains mutated for the
internal pumps in order to pinpoint the efflux mechanism (Table S2). The AcrA and AcrB
mutants have 13 mm inhibition diameters, lower than that of tolC, but the other mutants
lacked inhibition altogether. This indicates that KKL-35 is ejected by the AcrAB-TolC
multidrug efflux pump in E. coli.
The same assays were then performed on various strains involved in protein synthesis quality
control that were mutated to delete for tolC to avoid KKL-35 efflux. Assuming that KKL-35
inhibited trans-translation, we expected that it would kill bacteria in conditions requiring
trans-translation (2). We therefore began by testing KKL-35 in the absence of the ArfA and
ArfB alternative rescue systems. Although the double deletion of ssrA and arfA is lethal in E.
coli (10), in the absence of ArfA we did not observe a larger inhibition diameter around a
KKL-35-containing disk than was seen for tolC (Table 1). We thus performed the same
experiment in the absence of the putative targets (ΔssrA and ΔsmpB), and this again yielded
the same inhibition diameters as with the tolC strain.
These results suggested that KKL-γ5’s antibacterial effects in E. coli are not due to the direct
inhibition of trans-translation. In order to confirm that theory, we decided to create a new
double-reporter system which would allow for the simultaneous in vivo monitoring of both
trans-translation and related proteolysis activities. Indeed, KKL-35 was discovered using a
single fluorescent screening assay (2). Double reporter systems permit concurrent
measurements in the same bacteria and under the exact same growth conditions, thus
minimizing false positives caused by background effects.
Assembly of a double reporter

Our goal was to construct a double reporter system that could be used with a large variety of
bacterial species. (Fig. 1, S1). The operon was designed to display similar levels of
translational expression in both the control and the test. It was placed under the control of the
tac1 promoter (28) to ensure moderate and controlled overexpression, as GFP overproduction
is known to be harmful to bacteria. Red fluorescence is used as a control. The mCherry gene
ends with the E. coli ssrA C-terminal tag AANDENYALAA, and the proteases involved in
trans-translation recognize this tag and degrade the protein. The trans-translation activity is
followed using the green fluorescence. The GFP gene is followed by a strong synthetic
terminator, and produces a non-stop mRNA GFP on which the ribosome will stall, triggering
trans-translation. The chimeric terminator is formed by three successive strong terminators
chosen from the large collection described by Chen et al (26). We selected L3S2P56,
ECK12002960, and rrnC, as they could all be associated in-frame with GFP without a stop
codon. In the absence of IPTG, no fluorescence was seen, demonstrating that LacI was
sufficient to repress ptac1.
In such systems, GFP proteins are released after being tagged by tmRNA then recognized and
degraded by the proteases involved in trans-translation (Fig. 1A). When trans-translation
tagging and proteolysis activities are not impaired, the mCherry and GFP fluorescent proteins
are simultaneously degraded, and no significant fluorescence can be detected in the bacteria.
On the other hand, when the activity of the proteases involved in trans-translation is impaired,
the proteins are not degraded, so they accumulate in the cell and cause both red and green
fluorescence. Lastly, if only trans-translation tagging activity and not proteolysis is inhibited,
proteases take charge of the mCherry protein and degrade it, leaving the GFP alone and stuck
on the stalled ribosomes. Stalled GFP proteins can be released by the other rescue systems
(including ArfA and ArfB) (5), but without tmRNA tagging. They therefore accumulate in the
cells without being triggered by specific proteases like mCherry, and the cells display a green
fluorescence. In summary, if the compound inhibits trans-translation, bacteria will glow
green, and if it inhibits proteases, the bacteria show simultaneous green and red fluorescence
(Fig. 1B).
Reporter system activity

The ptCnsG (plasmid carrying tagged mCherry and non-stop GFP) reporter plasmid was
checked in different E. coli genetic backgrounds before being used to detect inhibitor activity.
It was first tested in a wild-type (WT) strain and in mutants deleted for tmRNA (ΔssrA),
SmpB (ΔsmpB), and ClpP (ΔclpP), before and after IPTG-induced fluorescence. In line with
previous studies, the ΔssrA and ΔsmpB strains grew slightly slower than the WT (29).
Conversely, the ΔclpP strain was faster, as ClpP protease affects the protein FtsZ that is
responsible for bacterial septum formation (16) (Fig. 2A). Nevertheless, these small
differences did not affect our conclusions because the differences in fluorescence intensities
considered to be significant are much larger.
With or without IPTG induction, E. coli WT (BW25113) that contained the ptCnsG reporter
system showed no significant fluorescence, suggesting that GFP and mCherry proteins are
properly recognized and degraded by proteases (Fig. 2B-E). The system was then tested in
ΔssrA and ΔsmpB mutants, where trans-translation is inefficient. Without induction, both
mutants displayed a small green fluorescence, suggesting a slight leak in system expression
before induction (Fig. 2B). When the system was induced by the addition of IPTG, a strong
increase in green fluorescence was observed, with no significant red fluorescence. The
fluorescence continued to increase, growing 14 times brighter after 400 minutes of induction
(Fig. 2C) even though the cells had stopped growing. This confirms that the artificial
terminator was highly efficient in prematurely stopping the transcription of non-stop GFP
mRNA.
The system was then introduced into a ΔclpP mutant. In this strain, tmRNA-tagged proteins
should not be degraded because there is no main protease system, and without induction it
also displays a slight red fluorescence (Fig. 2D). However, after 240 minutes of IPTG-
induced induction, both red and green fluorescence strongly increased, with red markedly
prevalent, growing 17 times brighter after 400 minutes of induction (Fig. 2E). At the same
time, the ΔclpP strain produced four times more green fluorescence than the WT, but three
times less than strains lacking trans-translation. This suggests that in the absence of Clp
proteases, other (probably less efficient) proteases can degrade ssrA-tagged proteins (30). The
increase of green fluorescence in this mutant emphasizes the importance of checking Clp
protease efficiency to avoid false positives when reporting trans-translation activity.
Trans-complementation testing of trans-translation in the mutant strains ΔssrA and ΔsmpB

was then conducted by reintroducing tmRNA and SmpB, respectively (see Materials and
Methods). As indicated in Fig. S2, the basal level of green fluorescence was restored by the
complementation assays, indicating that the absence of trans-translational activity is
responsible for the increase in GFP. It also confirms that this is not a side effect of the lack of
SmpB or tmRNA. Similar trans-complementation assays were conducted on the ΔclpP strain,
complemented by the protease ClpP. The mCherry red fluorescence was restored in a similar
way by adding the protease (Fig. S2). These results together confirm that the two fluorescent
proteins are correctly produced and degraded by the trans-translation pathway after IPTG
induction.
Reporter system specificity

We tested the reporter system in several other mutant strains (ΔarfA, ΔarfB, and Δrnr) that
either lack the alternative ribosome rescue factors ArfA and ArfB, or lack RNase R, which is
involved in degradation of the problematic RNA during trans-translation (5). After IPTG
induction, neither type of fluorescence increased in any of the mutants (Fig. 3A-B),
confirming the specificity of the reporter system for tmRNA tagging activity and the
subsequent protease degradation of tagged proteins. The ΔclpP, ΔclpA, ΔclpX, and ΔclpA/X
strains were then tested to explore the degradation pathway, since ClpA and ClpX are
chaperone proteins able to recognize tmRNA-tagged ones then transfer them into the ClpP
proteolytic chamber. Contrary to the green one, the red fluorescence slightly increased for the
ΔclpA or ΔclpX strains. In contrast, for the double mutant ΔclpA/X, we observed a significant
increase in both types, comparable to the levels observed with ΔclpP (Fig. 3 C-D). This
confirmed that the tag is specifically recognized by both ClpA and ClpX proteases, and that
ClpX compensates for the absence of ClpA chaperone, and vice versa.
Therefore, we created a double fluorescence reporter system that can be used for high-
throughput screening of compound libraries to identify new molecules that specifically inhibit
trans-translation. The green fluorescence is used to follow the trans-translation activity, while
the red is used as a reporter of the tmRNA-dependent degradation pathway and serves as an
internal control. Fluorescence intensities can be detected in various ways (such as
fluorescence tracking microscopy or spectroscopy), and under various culture conditions
(liquid medium, agar, or microplates). However, to set-up a high-throughput screening assay,
we optimized our reporter for 96-well microplate fluorescence reading systems. Another big
plus is the system’s modularity, and we are currently adapting it to a wide range of bacteria.
The effects of KKL-35 on the reporter system

After validation, our reporter system was used to check KKL-35 activity. The addition of
KKL-35 to the E. coli WT (BW25113) ptCnsG strain did not trigger an increase in green or
red fluorescence, even after 8 hours of exposure and in the presence of high concentrations (>
100 µM) of the compound (Fig. 4A). This is undoubtedly due to the strong TolC efflux (see
above and Table 1). Therefore, we decided to do our experiments with the ΔtolC strain, which
should display a stronger sensitivity to KKL-35. However, even when used on this strain,
KKL-35 had no impact on fluorescence levels as compared to the positive controls, which
were ΔssrA for green fluorescence and ΔclpP for red (Fig 4B). We continued our experiments
by using specific mutant strains able to amplify the signal resulting from trans-translation
impairment. We constructed a Δ(tolC, arfA, arfB) strain deficient for the TolC pump and for
the other ArfA and ArfB rescue factors. Again, after KKL-35 was added, there was no
increase in basal fluorescence levels (Fig. 4C). The same strategy was then applied to the
protease pathway, using ΔclpA and ΔclpX strains. Indeed, within the classical tagging
sequence AANDENYALAA, ClpX binds the C-terminal ‘‘LAA’’ residues, while ClpA binds
the “ALA” C-terminal residues and makes additional contacts with the N-terminal ones. In
contrast to previous experiments, the ΔclpA strain showed a slight increase in red and green
fluorescence after 8 hours of KKL-35 exposition, with a higher increase in red fluorescence
(Fig. 5). The increase of fluorescence in ΔclpA and not ΔclpX suggests that KKL-35 has a
moderate effect on ClpXP proteases or on their SspB adaptor (31). However, and despite this
slight effect, proteases, tmRNA, and SmpB cannot be considered as KKL-γ5’s main targets.
These results contradict the results of Keiler and colleagues, who recently proposed that
KKL-35 directly targets trans-translation (2). We were able to clearly demonstrate that KKL-
35 displays strong antibiotic activity, but without directly targeting this quality control
system. This disparity could be explained by indirect effects on trans-translation. Since KKL-
35 targets the ribosome (32), one possibility is that it leads to ribosomal stalling via an
unknown mechanism (i.e misreading or peptidyl-transfer impairment). An accumulation of
stalled ribosomes could explain the increased fluorescence observed by Keiler’s group when
using a single reporter system with a constitutive promoter (2). Indeed, the accumulation of
the truncated reporters on stalled ribosomes probably overwhelms the trans-translational
machine, indirectly leading to a multiplication of non-tagged proteins when the antibiotic is
added. In our system, we deliberately chose to work with the inducible pTac1 promoter so we
could control transcription levels and avoid constant basal production of truncated reporter
proteins.
In conclusion, using a new double reporter system we were able to examine the activity of
KKL-35, a molecule described as a promising trans-translation inhibitor, and to show that it
has no effect on trans-translation and only a minor impact on trans-translation-mediated
proteolysis. Same results were obtained with other oxadiazole derivatives (R Gillet,
unpublished). So far, and as previously described by others (2), we have also failed to obtain
mutants resistant to KKL-35, which suggests that the target of KKL-35 is either indispensable
for survival or there are multiple targets. Despite these surprising results, KKL-35 and its
derivatives must still be considered as promising antibiotics to fight a broad spectrum of
resistant bacteria. Our efforts are now underway to better understand their exact mechanisms
of action. We also hope that the new double reporter system presented here will be used not
only for antibiotic screening, but also for basic research in order to better understand trans-
translation and protein degradation pathways in bacterial cells.
ACKNOWLEDGEMENTS
We thank Xavier Charpentier and Juliana Berland for insightful comments on the manuscript.
This work was supported by the Agence Nationale pour la Recherche, the Direction Générale
de l’Armement (#ANR-14-ASTR-0001), and by the Institut Universitaire de France. K.Macé,
F.Demay, E.Giudice, C.Blanco, and R.Gillet are co-inventors on a patent on the double
fluorescence reporter system described here (application #EP 16.200144, November 23,
2016).
REFERENCES
1. Wilson DN (2014) Ribosome-targeting antibiotics and mechanisms of bacterial resistance. Nat

Rev Microbiol 12(1):35–48.
2. Ramadoss NS, et al. (2013) Small molecule inhibitors of trans-translation have broad-
spectrum antibiotic activity. Proc Natl Acad Sci U S A 110(25):10282–10287.
3. Macé K, Gillet R (2016) Origins of tmRNA: the missing link in the birth of protein synthesis?
Nucleic Acids Res 44(17):8041–8051.
4. Neubauer C, Gillet R, Kelley AC, Ramakrishnan V (2012) Decoding in the absence of a codon
by tmRNA and SmpB in the ribosome. Science 335(6074):1366–1369.
5. Giudice E, Gillet R (2013) The task force that rescues stalled ribosomes in bacteria. Trends
Biochem Sci 38(8):403–411.
6. Hudson CM, Lau BY, Williams KP (2014) Ends of the line for tmRNA-SmpB. Front
Microbiol 5:421.
7. Karzai AW, Roche ED, Sauer RT (2000) The SsrA-SmpB system for protein tagging, directed
degradation and ribosome rescue. Nat Struct Biol 7(6):449–455.
8. Gottesman S, Roche E, Zhou Y, Sauer RT (1998) The ClpXP and ClpAP proteases degrade
proteins with carboxy-terminal peptide tails added by the SsrA-tagging system. Genes Dev
12(9):1338–1347.
9. Starosta AL, Lassak J, Jung K, Wilson DN (2014) The bacterial translation stress response.
FEMS Microbiol Rev 38(6):1172–1201.
10. Chadani Y, et al. (2010) Ribosome rescue by Escherichia coli ArfA (YhdL) in the absence of
trans-translation system. Mol Microbiol 78(4):796–808.
11. Keiler KC, Feaga HA (2014) Resolving nonstop translation complexes is a matter of life or
death. J Bacteriol 196(12):2123–2130.
12. Brunel R, Charpentier X (2016) Trans-translation is essential in the human pathogen

Legionella pneumophila. Sci Rep 6:37935.
13. Julio SM, Heithoff DM, Mahan MJ (2000) ssrA (tmRNA) plays a role in Salmonella enterica
serovar Typhimurium pathogenesis. J Bacteriol 182(6):1558–1563.
14. Okan NA, Mena P, Benach JL, Bliska JB, Karzai AW (2010) The smpB-ssrA mutant of
Yersinia pestis functions as a live attenuated vaccine to protect mice against pulmonary plague
infection. Infect Immun 78(3):1284–1293.
15. Svetlanov A, Puri N, Mena P, Koller A, Karzai AW (2012) Francisella tularensis tmRNA
system mutants are vulnerable to stress, avirulent in mice, and provide effective immune protection.
Mol Microbiol 85(1):122–141.
16. Huang C, Wolfgang MC, Withey J, Koomey M, Friedman DI (2000) Charged tmRNA but not
tmRNA-mediated proteolysis is essential for Neisseria gonorrhoeae viability. EMBO J 19(5):1098–
1107.
17. Li J, Ji L, Shi W, Xie J, Zhang Y (2013) Trans-translation mediates tolerance to multiple

antibiotics and stresses in Escherichia coli. J Antimicrob Chemother 68(11):2477–2481.
18. Vioque A, de la Cruz J (2003) Trans-translation and protein synthesis inhibitors. FEMS
Microbiol Lett 218(1):9–14.
19. Miller JH (1972) Experiments in molecular genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
20. Baba T, et al. (2006) Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout
mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol 2:2006.0008.
21. Datsenko KA, Wanner BL (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia
coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A 97(12):6640–6645.
22. Meselson M, Yuan R (1968) DNA restriction enzyme from E. coli. Nature 217(5134):1110–
1114.
23. Molecular cloning : a laboratory manual / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis - Details
Trove. Available at: http://trove.nla.gov.au/work/13615226 [Accessed October 15, 2016].
24. Shaner NC, et al. (2004) Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins
derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol 22(12):1567–1572.
25. Cormack BP, Valdivia RH, Falkow S (1996) FACS-optimized mutants of the green
fluorescent protein (GFP). Gene 173(1 Spec No):33–38.
26. Chen Y-J, et al. (2013) Characterization of 582 natural and synthetic terminators and
quantification of their design constraints. Nat Methods 10(7):659–664.
27. Young RA (1979) Transcription termination in the Escherichia coli ribosomal RNA operon
rrnC. J Biol Chem 254(24):12725–12731.
28. de Boer HA, Comstock LJ, Vasser M (1983) The tac promoter: a functional hybrid derived
from the trp and lac promoters. Proc Natl Acad Sci U S A 80(1):21–25.
29. Oh BK, Apirion D (1991) 10Sa RNA, a small stable RNA of Escherichia coli, is functional.
Mol Gen Genet MGG 229(1):52–56.
30. Farrell CM, Grossman AD, Sauer RT (2005) Cytoplasmic degradation of ssrA-tagged
proteins. Mol Microbiol 57(6):1750–1761.
31. Song HK, Eck MJ (2003) Structural basis of degradation signal recognition by SspB, a
specificity-enhancing factor for the ClpXP proteolytic machine. Mol Cell 12(1):75–86.
32. Keiler K (2016) Trans-Translation As A Target For Novel Antibiotics. FASEB J 30(1
Supplement):242.1–242.1.
Figures
Figure 1. Schematic model of the in vivo trans-translation reporter system.

(A) Illustrative diagram of the system using a control (mCHERRY) and a trans-translation inhibition
reporter (GFP). Transcription is induced by IPTG at pTAC. The polycistronic mRNA encodes an
intrinsically tagged mCHERRY and a non-stop GFP. The nsGFP stalls the ribosome and induces
trans-translation. Both proteins are recognized and degraded by proteases. (B) The possible outcomes
of the system. In the absence of inhibition, both proteins are degraded and bacteria are dark. Without
efficient trans-translation, the GFP protein is not tagged, thus bacteria display green fluorescence.
When proteolysis is inhibited, mCHERRY and GFP are not degraded, and bacteria show both green
and red fluorescence.
Figure 2. Validation of the reporter system in E. coli WT (BW25113), ΔsmpB, ΔssrA, and ΔclpP
strains.
Wild type (WT) is white; ΔsmpB is light gray; ΔssrA is dark gray; and ΔclpP is black. (A) Growth
comparison between WT, ΔsmpB, ΔssrA, and ΔclpP. (B, C) Green fluorescent protein (GFP)
intensities without and with IPTG induction, respectively. (D and E) mCherry red fluorescent protein
intensities without and with IPTG induction, respectively. Measurements are shown of fluorescence
(%) over time (minutes), with standard deviations indicated.
Figure 3. Specificity of the reporter system in E. coli in the absence of alternative rescue systems
and proteases.
(A and B) Measurement of green (GFP) and red (mCherry) fluorescence over time after IPTG
induction in strains deleted for alternative rescue systems or RNase R. WT is in white; ΔssrA (positive
control) in white with black stripes; ΔarfA in light gray; ΔarfB in dark gray; and Δrnr in black. (C and
D) Measurement of GFP and mCherry fluorescence over time after IPTG induction in strains deleted
for various proteases. WT is in white; ΔclpP (positive control) in white with black stripes, ΔclpA in
light grey, ΔclpX in dark grey and double mutant ΔclpA/X in black. Measurements are shown of
fluorescence (%) over time (minutes), with standard deviations indicated.
Figure 4. Green and red fluorescence levels of E. coli WT, ΔtolC, and Δ(tolC, arfA, arfB)
strains in the presence of increasing concentrations of KKL-35.
(A) GFP green fluorescence and mCHERRY red fluorescence were measured in wild-type (WT)
Escherichia coli in the presence of serial dilutions of the antibiotic KKL-35. Only two times are
indicated here, 0 and 480 min; for complete fluorescence information, see Fig. S3. The maximum
concentration (100µM) is black; the minimum concentration (0 µM) is white; and the positive control
is striped. The control for GFP green fluorescence was ΔssrA, for mCHERRY red fluorescence it was
ΔclpP. (B and C) Same as (A), but for E. coli ΔtolC and Δ(tolC, arfA, arfB) and with different KKL-
35 serial dilutions going from 1 µM (black) and lightening to 0 µM (white). Standard deviations are
indicated for each value.
Figure 4. Measurements of green and red fluorescence for E. coli ΔclpA and ΔclpX
mutants in the presence of increasing concentrations of the antibiotic KKL-35.
GFP green and mCHERRY red fluorescence in E. coli ΔclpA (A) and ΔclpX (B) were measured in the
presence of serial dilutions of KKL-35. The maximum concentration (100 µM) is black, and the
minimum (0 µM) is white. The positive control is striped: ΔssrA for GFP green fluorescence, and
ΔclpP for mCHERRY red fluorescence. The standard deviation is indicated for each value.
Table 1. Antibacterial activity of KKL35
Strains Inhibition diameter (mm) Strains MIC (µM)
E. coli WT (BW25113) 0 E. coli WT (BW25113) >32

ΔtolC 22.3 (0.6) E. coli UPEC >32
Δ(tolC, ssrA) 22.7 (1.5) E. coli NM522 >32
Δ(tolC, arfA) 21.7 (1.5) E. coli BL21 >32
Δ(tolC, arfB) 22.0 (1.7) E. coli K10 >32
Δ(tolC, arfA, arfB) 21.7 (1.5) E. oli BW 5 ΔtolC 2
ΔacrA 13.3 (0.5) Bacillus subtilis 1
ΔacrB 12.3 (0.5) Staphylococcus epidermidis 2
WT, wild-type; UPEC, uropathogenic E. coli; MIC, minimum inhibitory concentrations. Standard
deviations are shown in parentheses after the inhibition diameters.
Supporting Information
Figure S1. Plasmid map of the ptCnsG double reporter system

A. The pTAC promoter (thin black circular line) is a strong hybrid promoter composed of the -35
region of the trp promoter and the -10 region of the lacUV5 promoter/operator. Two Shine-Dalgarno
(SD) sequences are indicated by fine black lines (SD1 and SD2). The mCherry fluorescent protein
ORF is fused to the ANDENYALAA ssrA-tag of E. coli. The non-stop GFP fluorescent protein ORF
(nsGFP) is a green arrow. The strong terminator is symbolized by a dark green box. The gene AmpR
which codes for ampicillin resistance is indicated by a white arrow, and the replication origin (ColE1)
by a black rectangle. B. Details of the movable cassette, with various elements indicated, including
restriction sites.
Figure S2. SsrA, SmpB, and ClpP complementation assays.

Complementation assays in the presence of the ptCnsG were performed on ΔssrA, ΔsmpB, and ΔclpP
strains. (A and B) In the presence of the pBBR1-MCS5 empty vector, ΔsmpB and ΔssrA strains
display green (GFP) but no red (mCherry) fluorescence, as described here. When complementation
with the pBBss vector is performed, SmpB proteins and tmRNA are restored in bacteria, and the green
fluorescence vanishes in both strains, as occurs in the WT strain (C) In the same circumstances as
above, ΔClpP strain displays red and some green fluorescence. When complementation is done, the
ClpP proteases are restored and both types of fluorescence vanish, as happens with the WT. The
standard deviation is indicated for each value. For each graph grey is without IPTG and black with 1mM
IPTG.
Figure S3. Monitoring of green and red fluorescence in E. coli WT, ΔtolC, and Δ(tolC,
arfA, arfB) strains in the presence of increasing concentrations of KKL-35.
(A) E. coli WT GFP (green) and mCHERRY (red) fluorescence levels were measured over time in the
presence of serial dilutions of KKL-35. The spectrum starts with the maximum concentration (100
µM) in black and shades through to the minimum (0 µM) in white. The positive controls (ΔssrA for
GFP green fluorescence and ΔclpP for mCHERRY red fluorescence) are striped. (B and C) Same as
previous, but showing E. coli ΔtolC (B) and Δ(tolC, arfA, arfB) (C). Here the serial dilution of KKL-
35 is different, going from 1 µM (black) to 0 µM (white). The standard deviation is indicated for each
value.
Table S1. List of plasmids used in this study.
NAME SPECIFICITY REFERENCE
pET-15b ori ColE1,ampR, lacI+, T7 promoter Obtained from Novagen
pET-15b derivative carrying tagged

ptCnsG mCHERRY and non-stop GFP
This study
E8895 pGEM-T carrying srrA and smpB This study
pBBR1-MCS5 cloning vector (1)
pBBss pBBR1-MCS5 carrying smpb/ssrA This study
pBBclp pBBR1-MCS5 carrying clpP This study
Table S2. List of bacterial strains used in this study.
NAME GENOTYPE Target/relevant characteristics Reference
F-,Δ(araD-araB)567,
CSGC 7636
E. coli BW25113 ΔlacZ4787(::rrnB-3), λ-, rph-1, Used as Wild Type (WT)
(2)
Δ(rhaD-rhaB)568, hsdR514
CGSC 8590
E. coli JW0427-1 BW25113 ΔclpP723::kan Clp AAA+ proteolysis pathway
(3)
CGSC 10058
E. coli JW2601-1 BW25113 ΔsmpB776::kan SmpB ; inactive trans-translation
(3)
E. coli WT ΔssrA E. coli strain W3110 ssrA tmRNA ; inactive trans-translation (4)
CGSC 10454
E. coli JW3253-1 BW25113 ΔyhdL728::kan alternative rescue system A (ArfA)
(3)
CGSC: 8433
E. coli JW0187-1 BW25113 ΔyaeJ788::kan alternative rescue system B (ArfB)
(3)
CGSC: 8898
E. coli JW0866-1 BW25113 ΔclpA783::kan ClpAP protease activity
(3)
CGSC: 8591
E. coli JW0428-1 BW25113 ΔclpX724::kan ClpXP protease activity
(3)
BW25113 ΔclpX724,
E. coli 6414 ClpXP or ClpAP protease activities This study
ΔclpA783::kan
CGSC: 11550
E. coli JW5741-1 BW25113 Δrnr-729::kan Ribonuclease R
(3)
CGSC 11430
E. coli JW5301-1 BW25113 ΔtolC732::kan TolC multidrug efflux pump
(3)
E. coli 6338 BW25113 ΔtolC732 TolC multidrug efflux pump or KanR This study
E. coli 6330 ΔtolC732, ΔclpP723::kan combination of both tolC and clpP deletions This study
BW25113 ΔtolC732::kan and

E. coli 6334 combination of both tolC and ssrA deletions This study
Δssra
BW25113 ΔtolC732,
E. coli 6338 combination of tolC, arfA, and arfB deletions This study
ΔyhdL728::kan, and ΔyaeJ788
CGSC: 11843
E. coli JW0451-3 BW25113 ΔacrA748::kan AcrAB multidrug efflux pump
(3)
CGSC: 8609
E. coli JW0452-2 BW25113 ΔacrB747::kan AcrAB multidrug efflux pump
(3)
CGSC: 11758
E. coli JW3233-2 BW25113 ΔacrE783::kan AcrEF multidrug efflux pump
(3)
CGSC: 10446
E. coli W3234-1 BW25113 ΔacrF784::kan AcrEF multidrug efflux pump
(3)
CGSC: 11548
E. coli JW5738-1 BW25113 ΔsugE775::kan SugE small multidrug resistance (SMR) family
(3)
CGSC: 8894
E. coli JW0862-1 BW25113 ΔmacA779::kan MacAB macrolide extrusion system
(3)
CGSC: 8895
E. coli JW0863-1 BW25113 ΔmacB780::kan MacAB macrolide extrusion system
(3)
CGSC: 11343
E. coli JW5363-1 BW25113 Δbcr-739::kan Bcr multidrug efflux pump
(3)
CGSC: 8620
E. coli JW0468-1 BW25113 Δfsr-761::kan Fsr fosmidomycin efflux pump
(3)
CGSC: 9005
E. coli JW1043-1 BW25113 ΔyceI726::kan Yce1 periplasmic protein
(3)
CGSC: 10099
E. coli JW2661-1 BW25113 ΔemrB767::kan EmrAB drug efflux system
(3)
CSGC : 11492
E. coli JW5634-1 BW25113 ΔemrD779::kan EmrD multidrug efflux pump
(3)
EmrE multidrug / betaine / choline efflux CSGC : 8665

E. coli JW0531-2 BW25113 ΔemrE750::kan
pump (3)
CGSC: 9408
E. coli JW1655-1 BW25113 ΔmdtK740::kan MdtABC drug efflux system
(3)
CGSC: 8370
E. coli JW0069-1 BW25113 ΔsetA777::kan SetA sugar / lactose exporter
(3)
CGSC: 8865
E. coli JW0826-2 BW25113 Δcmr-742::kan Cmr multidrug efflux pump
(3)
fhuA2 [lon] ompT gal (λ DE3)
[dcm] ∆hsdS
E. coli BL21 λ DE3 = λ sBamHIo ∆EcoRI-B E. coli B – BL21 DE3 (5)
int::(lacI::PlacUV5::T7 gene1) i21
∆nin5
F' proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15/
E. coli NM522 Δ(lac-proAB) glnV thi-1 Δ(hsdS- E. coli K12 – NM522 (6)
mcrB)5
Hfr(PO2A) bio+, relA1, spoT1,
cre-510, fhuA22, garB10, CGSC:4234
E. coli K10 E. coli K10
ompF627, fadL701, cre-510, (7)
mcrB1, pit-10
E. coli UPEC - Uropathogenic E. coli strains This study
Bacillus subtilis JH642 (trpC2 pheA1) Gram-positive WT (8)
Staphylococcus
CIP 68.21 Gram-positive WT (10)
epidermidis
REFERENCES
1. Kovach ME, et al. (1995) Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector
pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene 166(1):175–176.
2. Datsenko KA, Wanner BL (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in

Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A 97(12):6640–6645.
3. Baba T, et al. (2006) Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene

knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol 2:2006.0008.
4. Nameki N, et al. (1999) Functional and structural analysis of a pseudoknot upstream of

the tag-encoded sequence in E. coli tmRNA. J Mol Biol 286(3):733–744.
5. Studier FW, Moffatt BA (1986). Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct

selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol 189, 113–120.
6. Gough JA, Murray NE (1983). Sequence diversity among related genes for recognition of
specific targets in DNA molecules. J Mol Biol 166(1):1-19.
7. Skaar PD, Garen A (1956) The orientation and extent of gene transfer in Escherichia coli.
Proc Natl Acad Sci U S A 42(9):619–624.
8. Kappes RM, Kempf B, Bremer E (1996) Three transport systems for the osmoprotectant
glycine betaine operate in Bacillus subtilis: characterization of OpuD. J Bacteriol
178(17):5071–5079.
9. Yagi Y, Clewell DB (1980) Recombination-deficient mutant of Streptococcus faecalis. J

Bacteriol 143(2):966–970.
10. André E, et al. (2006) Novel synthetic molecules targeting the bacterial RNA polymerase
assembly. J Antimicrob Chemother 57(2):245–251.
IV.3 - Conclusion de l’Article #5
Nous avons voulu pour cet article présenter et valider un système rapporteur de la trans-
traduction. Excepté la pyrazinamide, qui est un antibiotique spécifique de Mycobacterium
tuberculosis, la principale molécule connue comme inhibitrice de la trans-traduction est le
KKL-35. Nous avons donc été surpris par les premiers résultats obtenus avec le KKL-35, ne
donnant aucun signal d’inhibition de la trans-traduction ou des protéases liées à la trans-
traduction. En conséquence, nous avons dans un premier temps remis en question notre
système et vérifié de nombreux points, à commencer par la souche bactérienne utilisée, qui est
bien la même souche utilisée par l’équipe de Kenneth Keiler (BW β5113) lors de la
découverte du KKL-γ5. Nous avons également testé notre système avec d’autres souches d’E.
coli (BWΔtolC, DH5α, BLβ1, XL10). D’autre part, nous avons testé trois molécules de KKL-
35 provenant de sources différentes (un KKL-35 synthétisé par l’équipe de Pierre van de
Weghe (UMR6226, Institut des Sciences Chimiques de Rennes) et deux commerciaux (Sigma
et MolPort)). Enfin, différents protocoles ont été expérimentés (ajout du KKL-35 avant
l’induction à l’IPTG, pendant la phase exponentielle ou la phase stationnaire). Après de
nombreux échecs d’obtention d’effet du KKL-35 sur le système rapporteur, nous avons
conclu que si le KKL-35 inhibe la trans-tranduction, il ne s’agit pas de sa cible principale.
Pour confirmer cette hypothèse, nous avons réalisé des antibiogrammes avec le KKL-35 sur
des souches délétées des gènes ssrA, smpB, arfA et arfB, confirmant que la cible principale du
KKL-γ5 n’est pas la trans-traduction.
Nous avons ensuite recherché d’autres molécules potentiellement inhibitrices de la trans-

traduction afin de valider le système. Bien que la pyrazinamide ne fonctionne que chez
Mycobacterium tuberculosis, nous l’avons tout de même testée, sans succès. Après plusieurs
recherches bibliographiques, nous avons décidé de tester la puromycine, un antibiotique
mimant l'extrémité 3' d'un aminoacyl-ARNt. Cet antibiotique n'inhibe pas la trans-traduction
ou les protéases, mais permet une libération aléatoire du polypeptide lors de la traduction. De
plus, à faible dose, la puromycine a la capacité de libérer les ribosomes bloqués en l’absence
de trans-tranduction. Il est donc probable que la puromycine puisse libérer les ribosomes
bloqués avant leur prise en charge par la trans-traduction. Nous avons bien obtenu une
augmentation de la fluorescence (Figure 38) corrélée avec une inhibition de la croissance.
Ainsi, une légère augmentation de la fluorescence rouge et verte est visible à 25 µg / ml de

puromycine, puis bien plus forte à 50 µg / ml contre aucune à 100 µg / ml. L’augmentation
simultanée des signaux vert et rouge suggère que la puromycine ne rentre pas en compétition
avec la trans-traduction, mais libère prématurément les peptides avant la fin de leur synthèse.
L’ensemble de la synthèse des protéines semble affecté, ce qui explique la corrélation entre
l’augmentation de la fluorescence et l'effet toxique de la molécule.
Figure 38. Effet de la puromycine sur le système rapporteur de la trans-traduction.
(A) Fluorescence verte avec une gamme de puromycine allant de 0 à 100µg/mL. (B) Identique à (A)
pour la fluorescence rouge.
Bien que la puromycine ne soit pas le témoin positif idéal tant recherché, elle témoigne
néanmoins de la nécessité d’un contrôle interne au système rapporteur. Effectivement, sans le
contrôle mCHERRY, l’augmentation du vert aurait pu être interprétée comme une inhibition
de la trans-traduction.
L’absence de molécules inhibitrices est un avantage et un inconvénient à la fois. Un avantage

car cela démontre l’utilité de notre système pour la recherche de molécules inhibitrices de la
trans-traduction. Mais l’absence de molécules inhibitrices ne permet pas d’affiner la mise au
point du protocole dans des conditions de criblage semi-haut débit, criblage que nous
souhaitons réaliser prochainement. En revanche, nous pouvons d’ores et déjà exploiter
l’avantage de la transposabilité de notre système pour tester la pyrazinamide chez M.
tuberculosis.
Enfin, le système peut être utilisé pour des études fondamentales de la trans-traduction in
vivo. Effectivement, comme observé au cours de ces expériences, l’activité de trans-
traduction et la prise en charge des protéines étiquetées varient en fonction des conditions de
croissance de la bactérie.
L’ensemble de ce travail laisse entrevoir des retombées très intéressantes pour la lutte contre
les maladies infectieuses d'origine bactérienne. En effet, cet outil servira de base
fondamentale pour la conception rationnelle de molécules spécifiques inhibant la trans-
traduction. Connaissant l'urgence en matière de découverte de nouveaux antibiotiques, la mise
au point de molécules bloquant la trans-traduction représenterait une avancée majeure vers la
découverte de nouvelles molécules à activité anti-bactérienne. Enfin, c’est un exemple de
valorisation d'une recherche fondamentale sur la trans-traduction.
V - Conclusion générale 203
V - Conclusion générale
Les travaux réalisés durant cette thèse ont contribué à l’amélioration des connaissances, aussi
bien fondamentales qu’appliquées, du mécanisme de la synthèse protéique. Tout d’abord
l’exploitation, l’analyse et l’interprétation de l’ensemble des connaissances sur l’ARNtm et de
son lien avec le monde ARN ont permis de proposer un article, singulier dans sa forme, sur
l’origine de synthèse protéique à partir de petites hélices d’ARN. L’obtention d’une structure
à haute résolution du facteur d’élongation EF-G en complexe avec le ribosome, nous a plongé
au cœur de la translocation et apporte des informations concrètes pour la compréhension de
son mécanisme. Notamment dans l’élucidation du fonctionnement de l’acide fusique, un
antibiotique ciblant la synthèse protéique. Effectivement de nombreux antibiotiques ciblent ce
mécanisme, mais l’augmentation du nombre de bactéries multi-résistantes nous contraint à
trouver de nouvelles cibles.
Une voie très prometteuse est le principal mécanisme de contrôle qualité de la synthèse
protéique bactérienne : la trans-traduction. Ainsi nous avons mis au point un système in vivo
rapporteur de son activité afin de tester de nouvelles molécules pour le développement de
futurs antibiotiques. Ce système rapporteur de la trans-traduction, validé par l’utilisation de
bactéries génétiquement modifiées, à mis en lumière que le KKL-35 ne cible pas la trans-
traduction comme précédemment annoncé.
L’ensemble de ces travaux intervient à la croisée de diverses disciplines scientifiques, telles

que la génétique, la biologie structurale, la bio-informatique, la biochimie et la microbiologie,
offrant une vision transdiciplinaire de la recherche.
Bibliographie 205
Bibliographie
Bibliographie 206
Abo, T., Ueda, K., Sunohara, T., Ogawa, K., and Aiba, H. (2002). SsrA-mediated protein
A tagging in the presence of miscoding drugs and its physiological role in Escherichia coli.
Genes Cells Devoted Mol. Cell. Mech. 7, 629–638.
Achenbach, J., and Nierhaus, K.H. (2015). The mechanics of ribosomal translocation.
Biochimie 114, 80–89.
AEvarsson, A., Brazhnikov, E., Garber, M., Zheltonosova, J., Chirgadze, Y., al-Karadaghi, S.,
Svensson, L.A., and Liljas, A. (1994). Three-dimensional structure of the ribosomal
translocase: elongation factor G from Thermus thermophilus. EMBO J. 13, 3669–3677.
Alumasa, J.N., and Keiler, K.C. (2015). Clicking on trans-translation drug targets. Front.
Microbiol. 6, 498.
Amirnovin, R. (1997). An analysis of the metabolic theory of the origin of the genetic code. J.
Mol. Evol. 44, 473–476.
Ansong, C., Yoon, H., Porwollik, S., Mottaz-Brewer, H., Petritis, B.O., Jaitly, N., Adkins,
J.N., McClelland, M., Heffron, F., and Smith, R.D. (2009). Global systems-level analysis of
Hfq and SmpB deletion mutants in Salmonella: implications for virulence and global protein
translation. PloS One 4, e4809.
Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2000). The complete atomic
B structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science 289, 905–920.
Ban, N., Beckmann, R., Cate, J.H.D., Dinman, J.D., Dragon, F., Ellis, S.R., Lafontaine,
D.L.J., Lindahl, L., Liljas, A., Lipton, J.M., et al. (2014). A new system for naming ribosomal
proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 24, 165–169.
Barrick, D., Villanueba, K., Childs, J., Kalil, R., Schneider, T.D., Lawrence, C.E., Gold, L.,
and Stormo, G.D. (1994). Quantitative analysis of ribosome binding sites in E.coli. Nucleic
Acids Res. 22, 1287–1295.
Beaudry, A.A., and Joyce, G.F. (1992). Directed evolution of an RNA enzyme. Science 257,
635–641.
Bibliographie 207
Bergmann, U., and Wittmann-Liebold, B. (1990). Use of a hapten specific anti-dansyl

antibody for the localization of ribosomal proteins by immuno electron microscopy. Biochem.
Int. 21, 741–751.
Blanchard, S.C., Cooperman, B.S., and Wilson, D.N. (2010). Probing translation using small
molecule inhibitors. Chem. Biol. 17, 633–645.
Boshoff, H.I., Mizrahi, V., and Barry, C.E. (2002). Effects of pyrazinamide on fatty acid
synthesis by whole mycobacterial cells and purified fatty acid synthase I. J. Bacteriol. 184,
2167–2172.
Brilot, A.F., Korostelev, A.A., Ermolenko, D.N., and Grigorieff, N. (2013). Structure of the
ribosome with elongation factor G trapped in the pretranslocation state. Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. 110, 20994–20999.
Butler, M.S., and Cooper, M.A. (2011). Antibiotics in the clinical pipeline in 2011. J.
Antibiot. (Tokyo) 64, 413–425.
Camberg, J.L., Hoskins, J.R., and Wickner, S. (2011). The interplay of ClpXP with the cell
C
division machinery in Escherichia coli. J. Bacteriol. 193, 1911–1918.
Cech, T.R., and Bass, B.L. (1986). Biological catalysis by RNA. Annu. Rev. Biochem. 55,
599–629.
Cerletti, M., Martínez, M.J., Giménez, M.I., Sastre, D.E., Paggi, R.A., and De Castro, R.E.
(2014). The LonB protease controls membrane lipids composition and is essential for viability
in the extremophilic haloarchaeon Haloferax volcanii. Environ. Microbiol. 16, 1779–1792.
Chadani, Y., Ono, K., Ozawa, S.-I., Takahashi, Y., Takai, K., Nanamiya, H., Tozawa, Y.,
Kutsukake, K., and Abo, T. (2010). Ribosome rescue by Escherichia coli ArfA (YhdL) in the
absence of trans-translation system. Mol. Microbiol. 78, 796–808.
Chen, C., Cui, X., Beausang, J.F., Zhang, H., Farrell, I., Cooperman, B.S., and Goldman, Y.E.
(2016). Elongation factor G initiates translocation through a power stroke. Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A. 113, 7515–7520.
Bibliographie 208
Chen, Y., Koripella, R.K., Sanyal, S., and Selmer, M. (2010). Staphylococcus aureus
elongation factor G--structure and analysis of a target for fusidic acid. FEBS J. 277, 3789–
3803.
Chen, Y., Feng, S., Kumar, V., Ero, R., and Gao, Y.-G. (2013a). Structure of EF-G-ribosome
complex in a pretranslocation state. Nat. Struct. Mol. Biol. 20, 1077–1084.
Chen, Y.-J., Liu, P., Nielsen, A.A.K., Brophy, J.A.N., Clancy, K., Peterson, T., and Voigt,
C.A. (2013b). Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of
their design constraints. Nat. Methods 10, 659–664.
Cheng, L., Naumann, T.A., Horswill, A.R., Hong, S.-J., Venters, B.J., Tomsho, J.W.,
Benkovic, S.J., and Keiler, K.C. (2007). Discovery of antibacterial cyclic peptides that inhibit
the ClpXP protease. Protein Sci. Publ. Protein Soc. 16, 1535–1542.
Connell, S.R., Takemoto, C., Wilson, D.N., Wang, H., Murayama, K., Terada, T., Shirouzu,
M., Rost, M., Schüler, M., Giesebrecht, J., et al. (2007). Structural Basis for Interaction of the
Ribosome with the Switch Regions of GTP-Bound Elongation Factors. Mol. Cell 25, 751–
764.
Crick, F.H. (1966). Codon--anticodon pairing: the wobble hypothesis. J. Mol. Biol. 19, 548–
555.
Crick, F.H. (1968). The origin of the genetic code. J. Mol. Biol. 38, 367–379.
Deroo, S., Hyung, S.-J., Marcoux, J., Gordiyenko, Y., Koripella, R.K., Sanyal, S., and
D
Robinson, C.V. (2012). Mechanism and rates of exchange of L7/L12 between ribosomes and
the effects of binding EF-G. ACS Chem. Biol. 7, 1120–1127.
Dinos, G., Kalpaxis, D.L., Wilson, D.N., and Nierhaus, K.H. (2005). Deacylated tRNA is
released from the E site upon A site occupation but before GTP is hydrolyzed by EF-Tu.
Nucleic Acids Res. 33, 5291–5296.
Di Pilato, V., Arena, F., Tascini, C., Cannatelli, A., Henrici De Angelis, L., Fortunato, S.,
Giani, T., Menichetti, F., and Rossolini, G.M. (2016). mcr-1.2, a New mcr Variant Carried on
Bibliographie 209
a Transferable Plasmid from a Colistin-Resistant KPC Carbapenemase-Producing Klebsiella

pneumoniae Strain of Sequence Type 512. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 5612–5615.
Drainas, D. (2016). Antibiotics and RNase P. Antibiot. Basel Switz. 5.
Ebeling, S., Kündig, C., and Hennecke, H. (1991). Discovery of a rhizobial RNA that is
E
essential for symbiotic root nodule development. J. Bacteriol. 173, 6373–6382.
Ellington, A.D., and Szostak, J.W. (1990). In vitro selection of RNA molecules that bind
specific ligands. Nature 346, 818–822.
Fabbretti, A., Pon, C.L., Hennelly, S.P., Hill, W.E., Lodmell, J.S., and Gualerzi, C.O. (2007).
F
The real-time path of translation factor IF3 onto and off the ribosome. Mol. Cell 25, 285–296.
Feng, S., Chen, Y., and Gao, Y.-G. (2013). Crystal structure of 70S ribosome with both
cognate tRNAs in the E and P sites representing an authentic elongation complex. PloS One 8,
e58829.
Flynn, J.M., Levchenko, I., Seidel, M., Wickner, S.H., Sauer, R.T., and Baker, T.A. (2001).
Overlapping recognition determinants within the ssrA degradation tag allow modulation of
proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 10584–10589.
Freeland, S.J., and Hurst, L.D. (1998). The genetic code is one in a million. J. Mol. Evol. 47,
238–248.
Freeland, S.J., Knight, R.D., Landweber, L.F., and Hurst, L.D. (2000). Early fixation of an
optimal genetic code. Mol. Biol. Evol. 17, 511–518.
Freistroffer, D.V., Pavlov, M.Y., MacDougall, J., Buckingham, R.H., and Ehrenberg, M.
(1997). Release factor RF3 in E.coli accelerates the dissociation of release factors RF1 and
RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner. EMBO J. 16, 4126–4133.
Gao, H., Zhou, Z., Rawat, U., Huang, C., Bouakaz, L., Wang, C., Cheng, Z., Liu, Y.,
G
Zavialov, A., Gursky, R., et al. (2007). RF3 induces ribosomal conformational changes
responsible for dissociation of class I release factors. Cell 129, 929–941.
Bibliographie 210
Gao, Y.-G., Selmer, M., Dunham, C.M., Weixlbaumer, A., Kelley, A.C., and Ramakrishnan,
V. (2009). The structure of the ribosome with elongation factor G trapped in the
posttranslocational state. Science 326, 694–699.
Garcia-Ortega, L., Stephen, J., and Joseph, S. (2008). Precise alignment of peptidyl tRNA by
the decoding center is essential for EF-G-dependent translocation. Mol. Cell 32, 292–299.
Giudice, E., and Gillet, R. (2013). The task force that rescues stalled ribosomes in bacteria.
Trends Biochem. Sci. 38, 403–411.
Giudice, E., Macé, K., and Gillet, R. (2014). Trans-translation exposed: understanding the
structures and functions of tmRNA-SmpB. Front. Microbiol. 5, 113.
Goralski, T.D.P., Dewan, K.K., Alumasa, J.N., Avanzato, V., Place, D.E., Markley, R.L.,
Katkere, B., Rabadi, S.M., Bakshi, C.S., Keiler, K.C., et al. (2016). Inhibitors of Ribosome
Rescue Arrest Growth of Francisella tularensis at All Stages of Intracellular Replication.
Antimicrob. Agents Chemother. 60, 3276–3282.
Gottesman, S., Roche, E., Zhou, Y., and Sauer, R.T. (1998). The ClpXP and ClpAP proteases
degrade proteins with carboxy-terminal peptide tails added by the SsrA-tagging system.
Genes Dev. 12, 1338–1347.
Gualerzi, C.O., and Pon, C.L. (2015). Initiation of mRNA translation in bacteria: structural
and dynamic aspects. Cell. Mol. Life Sci. CMLS 72, 4341–4367.
Guerrier-Takada, C., Gardiner, K., Marsh, T., Pace, N., and Altman, S. (1983). The RNA
moiety of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme. Cell 35, 849–857.
Hansson, S., Singh, R., Gudkov, A.T., Liljas, A., and Logan, D.T. (2005). Structural Insights
H
into Fusidic Acid Resistance and Sensitivity in EF-G. J. Mol. Biol. 348, 939–949.
Hiller, D.A., Singh, V., Zhong, M., and Strobel, S.A. (2011). A two-step chemical mechanism
for ribosome-catalysed peptide bond formation. Nature 476, 236–239.
Hirashima, A., and Kaji, A. (1973). Role of elongation factor G and a protein factor on the
release of ribosomes from messenger ribonucleic acid. J. Biol. Chem. 248, 7580–7587.
Bibliographie 211
Holtkamp, W., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (2014). Synchronous tRNA movements
during translocation on the ribosome are orchestrated by elongation factor G and GTP
hydrolysis. BioEssays News Rev. Mol. Cell. Dev. Biol. 36, 908–918.
Indrisiunaite, G., Pavlov, M.Y., Heurgué-Hamard, V., and Ehrenberg, M. (2015). On the pH
I dependence of class-1 RF-dependent termination of mRNA translation. J. Mol. Biol. 427,

1848–1860.
Ito, K., Ebihara, K., Uno, M., and Nakamura, Y. (1996). Conserved motifs in prokaryotic and
eukaryotic polypeptide release factors: tRNA-protein mimicry hypothesis. Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A. 93, 5443–5448.
Ito, K., Ebihara, K., and Nakamura, Y. (1998). The stretch of C-terminal acidic amino acids
of translational release factor eRF1 is a primary binding site for eRF3 of fission yeast. RNA
N. Y. N 4, 958–972.
J
Jenner, L., Melnikov, S., Garreau de Loubresse, N., Ben-Shem, A., Iskakova, M.,
Urzhumtsev, A., Meskauskas, A., Dinman, J., Yusupova, G., and Yusupov, M. (2012).
Crystal structure of the 80S yeast ribosome. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 759–767.
Julio, S.M., Heithoff, D.M., and Mahan, M.J. (2000). ssrA (tmRNA) plays a role in
Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. J. Bacteriol. 182, 1558–1563.
Kalinda, A.S., and Aldrich, C.C. (2012). Pyrazinamide: a frontline drug used for tuberculosis.
K Molecular mechanism of action resolved after 50 years? ChemMedChem 7, 558–560.
Kanaya, S., and Kudo, Y. (1991). Specificity of promoter consensus sequences in Escherichia
coli chromosome. Nucleic Acids Symp. Ser. 41–42.
Karzai, A.W., Roche, E.D., and Sauer, R.T. (2000). The SsrA-SmpB system for protein
tagging, directed degradation and ribosome rescue. Nat. Struct. Biol. 7, 449–455.
Keiler, K.C., and Feaga, H.A. (2014). Resolving nonstop translation complexes is a matter of
life or death. J. Bacteriol. 196, 2123–2130.
Bibliographie 212
Khatter, H., Myasnikov, A.G., Natchiar, S.K., and Klaholz, B.P. (2015). Structure of the
human 80S ribosome. Nature 520, 640–645.
Knight, R.D., and Landweber, L.F. (1998). Rhyme or reason: RNA-arginine interactions and
the genetic code. Chem. Biol. 5, R215–R220.
Korostelev, A., Asahara, H., Lancaster, L., Laurberg, M., Hirschi, A., Zhu, J., Trakhanov, S.,
Scott, W.G., and Noller, H.F. (2008). Crystal structure of a translation termination complex
formed with release factor RF2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 19684–19689.
Korostelev, A., Zhu, J., Asahara, H., and Noller, H.F. (2010). Recognition of the amber UAG
stop codon by release factor RF1. EMBO J. 29, 2577–2585.
Kraut, D.A., Carroll, K.S., and Herschlag, D. (2003). Challenges in enzyme mechanism and
energetics. Annu. Rev. Biochem. 72, 517–571.
Kumar, S., Kolodkin-Gal, I., Vesper, O., Alam, N., Schueler-Furman, O., Moll, I., and
Engelberg-Kulka, H. (2016). Escherichia coli Quorum-Sensing EDF, A Peptide Generated by
Novel Multiple Distinct Mechanisms and Regulated by trans-Translation. mBio 7, e02034–
02015.
Lan, L., Cheng, A., Dunman, P.M., Missiakas, D., and He, C. (2010). Golden pigment
L production and virulence gene expression are affected by metabolisms in Staphylococcus

aureus. J. Bacteriol. 192, 3068–3077.
Laurberg, M., Kristensen, O., Martemyanov, K., Gudkov, A.T., Nagaev, I., Hughes, D., and
Liljas, A. (2000). Structure of a mutant EF-G reveals domain III and possibly the fusidic acid
binding site. J. Mol. Biol. 303, 593–603.
Laurberg, M., Asahara, H., Korostelev, A., Zhu, J., Trakhanov, S., and Noller, H.F. (2008).
Structural basis for translation termination on the 70S ribosome. Nature 454, 852–857.
Lewis, K. (2012). Antibiotics: Recover the lost art of drug discovery. Nature 485, 439–440.
Bibliographie 213
Li, J., Ji, L., Shi, W., Xie, J., and Zhang, Y. (2013). Trans-translation mediates tolerance to
multiple antibiotics and stresses in Escherichia coli. J. Antimicrob. Chemother. 68, 2477–
2481.
Li, W., Liu, Z., Koripella, R.K., Langlois, R., Sanyal, S., and Frank, J. (2015). Activation of
GTP hydrolysis in mRNA-tRNA translocation by elongation factor G. Sci. Adv. 1.
Li, X., Yagi, M., Morita, T., and Aiba, H. (2008). Cleavage of mRNAs and role of tmRNA
system under amino acid starvation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 68, 462–473.
Liang, W., and Deutscher, M.P. (2012). Transfer-messenger RNA-SmpB protein regulates
ribonuclease R turnover by promoting binding of HslUV and Lon proteases. J. Biol. Chem.
287, 33472–33479.
Lin, J., Gagnon, M.G., Bulkley, D., and Steitz, T.A. (2015). Conformational changes of
elongation factor G on the ribosome during tRNA translocation. Cell 160, 219–227.
Liu, Y., Wu, N., Dong, J., Gao, Y., Zhang, X., Shao, N., and Yang, G. (2010). SsrA (tmRNA)
acts as an antisense RNA to regulate Staphylococcus aureus pigment synthesis by base pairing
with crtMN mRNA. FEBS Lett. 584, 4325–4329.
Macé, K., and Gillet, R. (2016). Origins of tmRNA: the missing link in the birth of protein
M
synthesis? Nucleic Acids Res. 44, 8041–8051.
Macé, K., Giudice, E., and Gillet, R. (2015). [Protein synthesis by the ribosome: a pathway
full of pitfalls]. Med. Sci. MS 31, 282–290.
Martemyanov, K.A., and Gudkov, A.T. (2000). Domain III of elongation factor G from
Thermus thermophilus is essential for induction of GTP hydrolysis on the ribosome. J. Biol.
Chem. 275, 35820–35824.
Matos, R.G., Barbas, A., and Arraiano, C.M. (2009). RNase R mutants elucidate the catalysis
of structured RNA: RNA-binding domains select the RNAs targeted for degradation.
Biochem. J. 423, 291–301.
Bibliographie 214
Mohan, S., Donohue, J.P., and Noller, H.F. (2014). Molecular mechanics of 30S subunit head
rotation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 13325–13330.
Moore, S.D., and Sauer, R.T. (2007). The tmRNA system for translational surveillance and
ribosome rescue. Annu. Rev. Biochem. 76, 101–124.
Nakamura, Y., Ito, K., Matsumura, K., Kawazu, Y., and Ebihara, K. (1995). Regulation of
N
translation termination: conserved structural motifs in bacterial and eukaryotic polypeptide
release factors. Biochem. Cell Biol. Biochim. Biol. Cell. 73, 1113–1122.
Nechifor, R., and Wilson, K.S. (2007). Crosslinking of translation factor EF-G to proteins of
the bacterial ribosome before and after translocation. J. Mol. Biol. 368, 1412–1425.
Neubauer, C., Gillet, R., Kelley, A.C., and Ramakrishnan, V. (2012). Decoding in the absence
of a codon by tmRNA and SmpB in the ribosome. Science 335, 1366–1369.
Nicolaou, K.C., Nold, A.L., and Li, H. (2009). Synthesis of the monomeric unit of the
lomaiviticin aglycon. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 48, 5860–5863.
Ogle, J.M., Brodersen, D.E., Clemons, W.M., Tarry, M.J., Carter, A.P., and Ramakrishnan, V.
O
(2001). Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit. Science 292,
897–902.
Oh, B.K., and Apirion, D. (1991). 10Sa RNA, a small stable RNA of Escherichia coli, is
functional. Mol. Gen. Genet. MGG 229, 52–56.
Okan, N.A., Bliska, J.B., and Karzai, A.W. (2006). A Role for the SmpB-SsrA system in
Yersinia pseudotuberculosis pathogenesis. PLoS Pathog. 2, e6.
Okan, N.A., Mena, P., Benach, J.L., Bliska, J.B., and Karzai, A.W. (2010). The smpB-ssrA
mutant of Yersinia pestis functions as a live attenuated vaccine to protect mice against
pulmonary plague infection. Infect. Immun. 78, 1284–1293.
Bibliographie 215
Pai, R.D., Zhang, W., Schuwirth, B.S., Hirokawa, G., Kaji, H., Kaji, A., and Cate, J.H.D.
P (2008). Structural Insights into ribosome recycling factor interactions with the 70S ribosome.
J. Mol. Biol. 376, 1334–1347.
Pulk, A., and Cate, J.H.D. (2013). Control of ribosomal subunit rotation by elongation factor
G. Science 340, 1235970.
Ramadoss, N.S., Alumasa, J.N., Cheng, L., Wang, Y., Li, S., Chambers, B.S., Chang, H.,
R Chatterjee, A.K., Brinker, A., Engels, I.H., et al. (2013). Small molecule inhibitors of trans-
translation have broad-spectrum antibiotic activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110,
10282–10287.
Ramrath, D.J.F., Lancaster, L., Sprink, T., Mielke, T., Loerke, J., Noller, H.F., and Spahn,
C.M.T. (2013). Visualization of two transfer RNAs trapped in transit during elongation factor
G-mediated translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 20964–20969.
Ranquet, C., and Gottesman, S. (2007). Translational regulation of the Escherichia coli stress
factor RpoS: a role for SsrA and Lon. J. Bacteriol. 189, 4872–4879.
Ranquet, C., Geiselmann, J., and Toussaint, A. (2001). The tRNA function of SsrA
contributes to controlling repression of bacteriophage Mu prophage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S. A. 98, 10220–10225.
Ratje, A.H., Loerke, J., Mikolajka, A., Brünner, M., Hildebrand, P.W., Starosta, A.L.,
Dönhöfer, A., Connell, S.R., Fucini, P., Mielke, T., et al. (2010). Head swivel on the
ribosome facilitates translocation by means of intra-subunit tRNA hybrid sites. Nature 468,
713–716.
Reynolds, R.C., Ananthan, S., Faaleolea, E., Hobrath, J.V., Kwong, C.D., Maddox, C.,
Rasmussen, L., Sosa, M.I., Thammasuvimol, E., White, E.L., et al. (2012). High throughput
screening of a library based on kinase inhibitor scaffolds against Mycobacterium tuberculosis
H37Rv. Tuberc. Edinb. Scotl. 92, 72–83.
Rheinberger, H.J., and Nierhaus, K.H. (1983). Testing an alternative model for the ribosomal
peptide elongation cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 4213–4217.
Bibliographie 216
Richards, J., Mehta, P., and Karzai, A.W. (2006). RNase R degrades non-stop mRNAs
selectively in an SmpB-tmRNA-dependent manner. Mol. Microbiol. 62, 1700–1712.
Ronneberg, T.A., Landweber, L.F., and Freeland, S.J. (2000). Testing a biosynthetic theory of
the genetic code: fact or artifact? Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 13690–13695.
Rozov, A., Westhof, E., Yusupov, M., and Yusupova, G. (2016). The ribosome prohibits the
G•U wobble geometry at the first position of the codon-anticodon helix. Nucleic Acids Res.
44, 6434–6441.
Russell, J.H., and Keiler, K.C. (2009). Subcellular localization of a bacterial regulatory RNA.
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16405–16409.
Salah, P., Bisaglia, M., Aliprandi, P., Uzan, M., Sizun, C., and Bontems, F. (2009). Probing
S
the relationship between Gram-negative and Gram-positive S1 proteins by sequence analysis.
Salsi, E., Farah, E., Dann, J., and Ermolenko, D.N. (2014). Following movement of domain
IV of elongation factor G during ribosomal translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111,
15060–15065.
Sander, G. (1983). Ribosomal protein L1 from Escherichia coli. Its role in the binding of
tRNA to the ribosome and in elongation factor g-dependent gtp hydrolysis. J. Biol. Chem.
258, 10098–10103.
Sayahi, H., Pugliese, K.M., Zimhony, O., Jacobs, W.R., Shekhtman, A., and Welch, J.T.
(2012). Analogs of the antituberculous agent pyrazinamide are competitive inhibitors of
NADPH binding to M. tuberculosis fatty acid synthase I. Chem. Biodivers. 9, 2582–2596.
Schluenzen, F., Tocilj, A., Zarivach, R., Harms, J., Gluehmann, M., Janell, D., Bashan, A.,
Bartels, H., Agmon, I., Franceschi, F., et al. (2000). Structure of functionally activated small
ribosomal subunit at 3.3 angstroms resolution. Cell 102, 615–623.
Sharma, P.K., Xiang, Y., Kato, M., and Warshel, A. (2005). What are the roles of substrate-
assisted catalysis and proximity effects in peptide bond formation by the ribosome?
Biochemistry (Mosc.) 44, 11307–11314.
Bibliographie 217
Shi, W., Zhang, X., Jiang, X., Yuan, H., Lee, J.S., Barry, C.E., Wang, H., Zhang, W., and
Zhang, Y. (2011). Pyrazinamide inhibits trans-translation in Mycobacterium tuberculosis.
Science 333, 1630–1632.
Shin, J.-H., and Price, C.W. (2007). The SsrA-SmpB ribosome rescue system is important for
growth of Bacillus subtilis at low and high temperatures. J. Bacteriol. 189, 3729–3737.
Shin, D.H., Brandsen, J., Jancarik, J., Yokota, H., Kim, R., and Kim, S.-H. (2004). Structural
analyses of peptide release factor 1 from Thermotoga maritima reveal domain flexibility
required for its interaction with the ribosome. J. Mol. Biol. 341, 227–239.
Song, H.K., and Eck, M.J. (2003). Structural basis of degradation signal recognition by SspB,
a specificity-enhancing factor for the ClpXP proteolytic machine. Mol. Cell 12, 75–86.
Strader, M.B., Hervey, W.J., Costantino, N., Fujigaki, S., Chen, C.Y., Akal-Strader, A.,
Ihunnah, C.A., Makusky, A.J., Court, D.L., Markey, S.P., et al. (2013). A coordinated
proteomic approach for identifying proteins that interact with the E. coli ribosomal protein
S12. J. Proteome Res. 12, 1289–1299.
Svetlanov, A., Puri, N., Mena, P., Koller, A., and Karzai, A.W. (2012). Francisella tularensis
tmRNA system mutants are vulnerable to stress, avirulent in mice, and provide effective
immune protection. Mol. Microbiol. 85, 122–141.
Svidritskiy, E., Madireddy, R., and Korostelev, A.A. (2016). Structural Basis for Translation
Termination on a Pseudouridylated Stop Codon. J. Mol. Biol. 428, 2228–2236.
Taylor, F.J., and Coates, D. (1989). The code within the codons. Biosystems 22, 177–187.
T Thibonnier, M., Thiberge, J.-M., and De Reuse, H. (2008). Trans-translation in Helicobacter

pylori: essentiality of ribosome rescue and requirement of protein tagging for stress resistance
and competence. PloS One 3, e3810.
Ticu, C., Nechifor, R., Nguyen, B., Desrosiers, M., and Wilson, K.S. (2009). Conformational
changes in switch I of EF-G drive its directional cycling on and off the ribosome. EMBO J.
28, 2053–2065.
Bibliographie 218
Tlusty, T. (2010). A colorful origin for the genetic code: information theory, statistical
mechanics and the emergence of molecular codes. Phys. Life Rev. 7, 362–376.
Tourigny, D.S., Fernández, I.S., Kelley, A.C., and Ramakrishnan, V. (2013). Elongation
factor G bound to the ribosome in an intermediate state of translocation. Science 340,
1235490.
Trobro, S., and Aqvist, J. (2005). Mechanism of peptide bond synthesis on the ribosome.
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 12395–12400.
Tuerk, C., and Gold, L. (1990). Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:
RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 249, 505–510.
Tworowski, D., Klipcan, L., Peretz, M., Moor, N., and Safro, M.G. (2015). Universal pathway
for posttransfer editing reactions: insights from the crystal structure of TtPheRS with
puromycin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 3967–3972.
Uemura, S., Dorywalska, M., Lee, T.-H., Kim, H.D., Puglisi, J.D., and Chu, S. (2007).
U
Peptide bond formation destabilizes Shine-Dalgarno interaction on the ribosome. Nature 446,
454–457.
Valle, M., Zavialov, A., Sengupta, J., Rawat, U., Ehrenberg, M., and Frank, J. (2003).
V
Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell 114, 123–134.
Vendeix, F.A.P., Dziergowska, A., Gustilo, E.M., Graham, W.D., Sproat, B., Malkiewicz, A.,
and Agris, P.F. (2008). Anticodon domain modifications contribute order to tRNA for
ribosome-mediated codon binding. Biochemistry (Mosc.) 47, 6117–6129.
Venkataraman, K., Zafar, H., and Karzai, A.W. (2014). Distinct tmRNA sequence elements
facilitate RNase R engagement on rescued ribosomes for selective nonstop mRNA decay.
Vestergaard, B., Van, L.B., Andersen, G.R., Nyborg, J., Buckingham, R.H., and Kjeldgaard,
M. (2001). Bacterial polypeptide release factor RF2 is structurally distinct from eukaryotic
eRF1. Mol. Cell 8, 1375–1382.
Bibliographie 219
Vetter, I.R., and Wittinghofer, A. (2001). The guanine nucleotide-binding switch in three
dimensions. Science 294, 1299–1304.
Vioque, A., and de la Cruz, J. (2003). Trans-translation and protein synthesis inhibitors.
FEMS Microbiol. Lett. 218, 9–14.
Voorhees, R.M., and Ramakrishnan, V. (2013). Structural Basis of the Translational

Elongation Cycle. Annu. Rev. Biochem. 82, 203–236.
Wilson, D.N., Schluenzen, F., Harms, J.M., Yoshida, T., Ohkubo, T., Albrecht, R., Buerger,
W J., Kobayashi, Y., and Fucini, P. (2005). X-ray crystallography study on ribosome recycling:
the mechanism of binding and action of RRF on the 50S ribosomal subunit. EMBO J. 24,
251–260.
Wilson, K.S., Ito, K., Noller, H.F., and Nakamura, Y. (2000). Functional sites of interaction
between release factor RF1 and the ribosome. Nat. Struct. Biol. 7, 866–870.
Wimberly, B.T., Brodersen, D.E., Clemons, W.M., Morgan-Warren, R.J., Carter, A.P.,
Vonrhein, C., Hartsch, T., and Ramakrishnan, V. (2000). Structure of the 30S ribosomal
subunit. Nature 407, 327–339.
Withey, J., and Friedman, D. (1999). Analysis of the role of trans-translation in the
requirement of tmRNA for lambdaimmP22 growth in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181,
2148–2157.
Wong, J.T. (1980). Role of minimization of chemical distances between amino acids in the
evolution of the genetic code. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 1083–1086.
Yamamoto, H., Qin, Y., Achenbach, J., Li, C., Kijek, J., Spahn, C.M.T., and Nierhaus, K.H.
Y (2014). EF-G and EF4: translocation and back-translocation on the bacterial ribosome. Nat.
Rev. Microbiol. 12, 89–100.
Yamamoto, H., Wittek, D., Gupta, R., Qin, B., Ueda, T., Krause, R., Yamamoto, K., Albrecht,
R., Pech, M., and Nierhaus, K.H. (2016). 70S-scanning initiation is a novel and frequent
initiation mode of ribosomal translation in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113,
E1180–E1189.
Bibliographie 220
Yang, J., Liu, Y., Bi, J., Cai, Q., Liao, X., Li, W., Guo, C., Zhang, Q., Lin, T., Zhao, Y., et al.
(2015). Structural basis for targeting the ribosomal protein S1 of Mycobacterium tuberculosis
by pyrazinamide. Mol. Microbiol. 95, 791–803.
Yarus, M., Widmann, J.J., and Knight, R. (2009). RNA-amino acid binding: a stereochemical
era for the genetic code. J. Mol. Evol. 69, 406–429.
Young, R.A. (1979). Transcription termination in the Escherichia coli ribosomal RNA operon
rrnC. J. Biol. Chem. 254, 12725–12731.
Young, D.J., Edgar, C.D., Murphy, J., Fredebohm, J., Poole, E.S., and Tate, W.P. (2010).
Bioinformatic, structural, and functional analyses support release factor-like MTRF1 as a
protein able to decode nonstandard stop codons beginning with adenine in vertebrate
mitochondria. RNA N. Y. N 16, 1146–1155.
Zaher, H.S., and Green, R. (2009). Fidelity at the molecular level: lessons from protein
Z
synthesis. Cell 136, 746–762.
Zavialov, A.V., Buckingham, R.H., and Ehrenberg, M. (2001). A posttermination ribosomal

complex is the guanine nucleotide exchange factor for peptide release factor RF3. Cell 107,
115–124.
Zavialov, A.V., Mora, L., Buckingham, R.H., and Ehrenberg, M. (2002). Release of peptide
promoted by the GGQ motif of class 1 release factors regulates the GTPase activity of RF3.
Mol. Cell 10, 789–798.
Zhang, D., Yan, K., Zhang, Y., Liu, G., Cao, X., Song, G., Xie, Q., Gao, N., and Qin, Y.
(2015). New insights into the enzymatic role of EF-G in ribosome recycling. Nucleic Acids
Res. 43, 10525–10533.
Zhang, Y., Shi, W., Zhang, W., and Mitchison, D. (2013). Mechanisms of Pyrazinamide
Action and Resistance. Microbiol. Spectr. 2, 1–12.
Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J.P., and Noller, H.F. (2013). Crystal structures of EF-G-
ribosome complexes trapped in intermediate states of translocation. Science 340, 1236086.
Bibliographie 221
Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J.P., and Noller, H.F. (2014). How the ribosome hands the
A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science 345, 1188–1191.
Zipperer, A., Konnerth, M.C., Laux, C., Berscheid, A., Janek, D., Weidenmaier, C., Burian,
M., Schilling, N.A., Slavetinsky, C., Marschal, M., E. (2016). Human commensals producing
a novel antibiotic impair pathogen colonization. Nature 535, 511–516.
Liste des articles 223
Liste des articles

Liste des articles 224
Partie I - II.2 - Article #1 | K. Macé and R. Gillet - 2016 - Nucleic

Acids Research --------------------------------------------------------------- 25
Partie I - VI.2 - Article #2 | K. Macé, E. Giudice, S. Chat and Gillet R

– Non soumis ----------------------------------------------------------------- 77
Partie II - II.2 - Article #3 | E. Giudice, K. Macé and R. Gillet. - 2014

– Frontiers in Microbiology ---------------------------------------------- 111
Partie II - V.2 - Article #4 | K. Macé, E. Giudice and R. Gillet. - 2015

– Med Sci-------------------------------------------------------------------- 137
Partie III - V.2 - Article #5 | K. Macé et al. - Non soumis ---------- 171
Liste des figures & tableaux 225
Liste des figures & tableaux

Tableau 1. Le code génétique. . ............................................................................................................ 19
Tableau 2. Nouvelle nomenclature pour les protéines ribosomiques procaryotes de la grande sous unité.
............................................................................................................................................................... 43
Tableau 3. Nouvelle nomenclature pour les protéines ribosomiques procaryotes de la petite sous
unité.. ..................................................................................................................................................... 44
Tableau 4. Diversité et proportion de nucléotides modifiés pour les différents types d’ARN.. ............ 51
Figure 1. Structures secondaires et tertiaires de 16S, 23S et 5S ARNr.----------------------------------- 41
Figure 2. Structure du ribosome avec une orientation canonique. ---------------------------------------- 46
Figure 3. Structure du ribosome en représentation « carton ». -------------------------------------------- 47
Figure 4. Structures secondaires et tertiaires d'un ARNt canonique. ------------------------------------- 49
Figure 5. Le cycle de traduction bactérienne. ---------------------------------------------------------------- 53
Figure 6. Schéma simplifié de l'initiation bactérienne. ----------------------------------------------------- 55
Figure 7. Les différentes étapes de l’arrivée d’un nouveau ARNt par EF-Tu au ribosome.------------ 59
Figure 8. Hydrolyse du GTP d’EF-Tu lors de l’élongation. ----------------------------------------------- 61
Figure 9. Le transfert peptidique via l’attaque nucléophile. ----------------------------------------------- 62
Figure 10. Structure du ribosome à l’état canonique et à l’état « ratcheté ».---------------------------- 64
Figure 11. Comparaison structural entre le complexe ternaire ARNt-EF-TuGTP et EF-GGTP. --- 65
Figure 12. Structure du facteur de terminaison RF1 et RF2.. ---------------------------------------------- 67
Figure 13. Reconnaissance spécifique des codons stop par les facteurs RF1 et RF2. ------------------ 68
Figure 14. Schéma de la réaction d'hydrolyse du peptidyl-ARNt. ----------------------------------------- 68
Figure 15. La rotation de la tête résulte de l'articulation concertée des charnières 1 et 2. ------------ 71
Figure 16. Ouverture et passage de l’ARNt de la porte G1338-A790 pendant la translocation. ------ 72
Figure 17. Vue des interactions entre l'ARNm et la sous-unité 30S..-------------------------------------- 73
Figure 18. Modèle détaillé du mécanisme de translocation. ----------------------------------------------- 74
Figure 19. Modèle de l’hydrolyse du GTP. ------------------------------------------------------------------ 105
Figure 20. Les étapes précoces de la trans-traduction en structure 3D et schématique. -------------- 123
Figure 21. Les étapes de la purification des complexes 70S-RNase R. ---------------------------------- 125
Figure 22. Chromatogramme de la purification du complexe sur colonne Streptavidine. ------------ 126
Figure 23. Analyse du complexe 70S-RNase R par gel d’acrylamide et coloration négative. -------- 127
Figure 24. Reconstruction à faible résolution du complexe ribosome/RNase R. ----------------------- 128
Figure 25. Analyses du complexe 70S/ARNtm/SmpB/EF-Tu/RNase R sur gels. ------------------------ 129
Figure 26. Utilisation thérapeutique des antibiotiques et apparition des premières résistances. ---- 151
Figure 27. Frise chronologique des découvertes de nouvelles classes d’antibiotique. ---------------- 152
Figure 28. Vue des étapes de la synthèse protéique ciblées par les principaux antibiotiques -------- 153
Figure 29. Conversion de la pyrazinamide en acide pyrazinoïque. -------------------------------------- 156
Figure 30. Mécanisme d’action de la pyrazinamide. ------------------------------------------------------- 157
Figure 31. Structure au rayon X de bS1 lié à l’acide pyrazinoïde. --------------------------------------- 158
Figure 32. Structure au rayon X de bS1muté. --------------------------------------------------------------- 159
Figure 33. Structure des composés actifs contre la trans-traduction découverte par l’équipe de Keiler. - 160
Figure 34. Répartition de la présence d’ArfA et ArfB dans différentes espèces.------------------------ 161
Figure 35. Modèle du système rapporteur. ------------------------------------------------------------------ 163
Figure 36. Prédiction de structure secondaire du terminateur. ------------------------------------------- 166
Figure 37. Time lapse de la souche ΔssrA. ------------------------------------------------------------------ 167
Figure 38. Effet de la puromycin sur le système rapporteur de la trans-traduction. ------------------- 200
Liste des abréviations 229
Liste des abréviations

30S-IC « 30S initiation complex »

3D tridimentionnel
Å ångström
aa acide aminé
aa-ARNt aminoacyl-ARNt
aaRS aminoacyl-ARNt-synthétases
ADN acide desoxyribonucléique
Arf « Alternative ribosome-rescuing factor »
ARN acide ribonucléique
ARNm ARN messager
ARNr ARN ribosomique
ARNt ARN de transfert
ARNtm ARN transfert-messager
ASL «anticodon stem-loop»
ATP adénosine triphosphate
cryo-EM Cryomicroscopie électronique à transmission
Da Daltons
EF-G « Elongation Factor G »
EF-Tu « Elongation Factor Thermo-unsensible »
FA « fusidic acid »
fMet formyl-méthionine
GAC GTPase Activating Center
GFP « Green Fluorescent Protein »
GTP guanosine triphosphate
IF « initiation factor »
IPTG isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside
LPS lipopolysaccharide
MLD « mRNA-like domain » (domaine ARNm de l’ARNtm)
nt nucleotide
NTC «non-productive translation complex»
ORF « open reading frame »
PC protubérance centrale
Pi phosphate inorganique
POA acide pyrazinoïque
POST post-translocation
PRE pré-translocation
pre-IC « pre-initiation complex »
PTC centre de transfert peptidique
PZA pyrazinamide
RBS « Ribosome Binding Site »
RF « Realease Factors »
RFF « Ribosome Recycling Factor »
RpoS « RNA polymerase sigma S factor »
S Svedberg
SD Shine-Dalgarno
SDS-PAGE « Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis »
SmpB « Small Protein B »
SPF motif Serine-Proline-Phenylalanine
SRL α- Sarcin Ricin Loop
ssrA « small and stable RNA A »
TIR « translation initiation region »
TLD « tRNA-like domain » (domaine ARNt de l’ARNtm)
Annexes 233
Annexes
Annexes 234
Annexes de la Partie I
Annexes 235
Annexe Partie I - N°1
Tableau 1. Comparaison des structures récentes d’EF-G complexé au ribosome.

Annexes 236
Vers la résolution atomique, récentes avancées en Microscopie électronique.
La microscopie électronique à transmission (MET) sur des objets biologiques a parcouru un

long chemin depuis le développement du premier microscope électronique et les premières
images de bactériophages, par Ruska et ses collaborateurs, dans la première moitié du 20ème
siècle.
Le principal problème rencontré par les biologistes en MET est la dégradation de

l’échantillon. En effet, le vide poussé de la colonne du microscope est incompatible avec une
bonne conservation d’un échantillon hydraté, et l’énergie du faisceau, en rompant les liaisons
chimiques, détériore rapidement l’échantillon. Il en résulte que la plupart des études de
biologie en MET a été réalisée sur des échantillons biologiques fixés, déshydratés et
contrastés. Ces préparations, sources d’artéfacts, limitent la résolution. Préserver l’échantillon
dans un état aussi proche que son état natif devenait donc primordial afin d’accéder à une
meilleur compréhension de ses fonctions biologiques.
C’est en 1984 que l’équipe de Jacques Dubochet a montré qu’il était possible d’observer des
objets hydratés après les avoir congelés dans un film de glace non cristallisé, appelée aussi
glace amorphe ou vitreuse. En prenant la précaution de maintenir l’échantillon à la
température de l’azote liquide, il devenait possible d’obtenir des images d’MET d’objets
biologiques à l’état quasi-natif. Cette technique, maintenant connue sous l’appellation de
Cryo-MET, ouvrait une nouvelle ère pour la microscopie électronique en biologie.
Bien auparavant, en 1968, DeRosier et Klug avaient démontré qu’à partir d’images de
différentes projections βD d’un même objet, en MET, il était possible de calculer sa structure
γD. Dès lors, l’utilisation combinée de la Cryo-MET et de la reconstruction 3D sur des
cristaux protéiques 2D ou des structures hélicoïdales, montrèrent le potentiel de la technique
pour identifier la position d’atomes individualisés (Kühlbrandt, 1994 ; Nogales, 1998).
Si l’existence d’une symétrie facilite la reconstruction γD, ce n’est pas le cas pour une grande
majorité des échantillons, notamment en ce qui nous concerne, le ribosome. Dans ce cas, des
Annexes 237
complexes moléculaires purifiés et en solution peuvent être imagés et des reconstructions 3D

peuvent être obtenues en utilisant les images des diverses projections des complexes ou
particules. Cette méthode, dite « Single Particle Analysis », présente certaines limitations dont
l’absence d’orientation connue des objets dans la glace, ceci combiné au faible niveau du
rapport signal/bruit notamment dans les hautes fréquences (haute résolution), compliquant
l’attribution précise des angles d’Euler à chaque projection. Dans ces conditions, les
meilleures résolutions obtenues furent de l’ordre de 10 Å (Gabashvili, 2000). Si le potentiel
de cette technique d’atteindre la résolution atomique avait été prédit, même pour des
complexes de 100 kDa ; pendant très longtemps, cette prédiction fut considérée comme très
optimiste.
C’est à partir de β01γ que les avancées réalisées en Cryo-MET furent si rapides que le terme
de « Révolution » fut employé. Quelles sont donc les avancées à l’origine de cette
révolution ?
1. Les Caméras à Détection Directe d’électrons.
Etant donné que les dégâts d’irradiations limitent la quantité d’électrons utilisables, les images
en Cryo-MET sont intrinsèquement bruitées. Il est donc important d’enregistrer le maximum
d’électrons disponibles. La capacité d’un détecteur, ou DQE (Detective Quantum Efficiency),
exprime le taux de dégradation du signal dans le processus de détection. Un détecteur idéal
enregistrerait tous les électrons sans ajouter de bruit et aurait un DQE de 1. Jusqu’à
récemment le film photographique fut le détecteur de choix utilisé pour la haute résolution
grâce à ses grands champs d’acquisition et une bonne DQE (0,γ). Le fait de ne plus avoir à
révéler les films puis de les scanner a favorisé l’utilisation des caméras CCD (Charge Coupled
Device) bien qu’ayant une faible DQE (0,1). Cependant, c’est avec la mise sur le marché des
caméras à détection directe d’électrons que les avancées spectaculaires ont pu être réalisées.
Les trois types de caméra actuellement sur le marché présentent toutes une DQE supérieure au
film photographique (de 0.9 dans les basses fréquences à 0.2 à très haute fréquence). Enfin,
pour éviter que même à faible dose le détecteur soit saturé par les électrons, leur acquisition
est étalée dans le temps sous forme de séquences d’images (films).
Annexes 238
2. Le traitement des images.
Deux développements dans le traitement des images, en synergie avec l’arrivée des nouveaux
détecteurs ont permis une avancée spectaculaire.
Le premier est directement lié aux propriétés des nouveaux détecteurs. Dès que les premiers
électrons du faisceau rencontrent le film de glace, au niveau de l’échantillon des liaisons
chimiques se brisent et des charges nouvelles se forment, entrainant des mouvements dans
l’échantillon qui conduisent à l’acquisition d’images floues. En β01β, Grigorieff et son équipe
ont été les premiers à exploiter les séquences d’images (movie mode) des nouveaux détecteurs
pour caractériser ces déplacements induits par le faisceau électronique. Ils démontrèrent que
le réalignement entre elles de ces séquences d’images pouvait corriger ces déplacements, et
permettre ainsi une amélioration significative du rapport signal sur bruit.
Le deuxième développement est lié à la capacité d’analyser et traiter l’hétérogénéité des

échantillons. La plupart des échantillons contiennent différentes structures 3D, résultant à la
fois de l’hétérogénéité dans sa composition et dans la conformation des macromolécules
présentes. Si ces différentes structures ne sont pas classées en des sous-ensembles
structuralement homogènes, leur association en une unique reconstruction 3D résultera au
mieux en une reconstruction floue. De plus, le problème de classification se complique par le
fait qu’il est souvent difficile de faire la différence entre projections sous différents angles
d’un même objet et projections provenant de différentes structures 3D. Une première
approche de classification a été fréquemment utilisée. Celle-ci, dite « supervisée », est basée
sur une connaissance a priori de la variabilité structurale de l’échantillon, connaissance
difficilement réalisable, et entrainant inévitablement un biais dans la reconstruction.
L’avènement des méthodes de classification γD non-supervisées vient du développement
d’algorithmes statistiques basés sur les procédures du maximum de vraisemblance
(maximum-likelihood). Avec l’introduction d’une approche Bayésienne à l’analyse des
particules isolées, les paramètres optimums pour réduire le bruit des reconstructions sont
déterminés directement à partir des données, sans intervention de l’utilisateur.
L’implémentation de cette méthode dans le programme RELION a démontré rapidement la
puissance de cet outil dans la classification 3D ainsi que dans les reconstructions à haute
résolution.
Annexes 239
Ces trois dernières années, les premières améliorations de cartes de reconstruction furent
obtenues. Cette synergie entre l’apparition de nouveaux détecteurs et l’amélioration des
programmes d’analyse d’image fut inattendue et surprenante. D’une part, les images avec un
meilleur signal mènent directement à des cartes à haute résolution. D’autre part, ces images
moins bruitées permettent à ces nouveaux algorithmes d’être plus performants. Il en résulte
des données plus homogènes, dépourvues du flou lié à la dérive, il devient alors possible de
déterminer l’orientation de chaque particule avec précision. Le résultat de cet effet combiné à
la résolution finale des reconstructions a certainement été plus prépondérant que ce que nous
pouvions espérer. Des résolutions proches de la résolution atomique sont actuellement
obtenues pour des complexes de tailles inférieures à 200 kDa, démontrant le potentiel de la
Cryo-MET pour l’étude de structure dynamique ou encore d’interactions drogue/cible.
Merci à Daniel Thomas et Sophie Chat.

Annexes 240
Le domaine III d’EF-G a pu être visualisé en utilisant un masque au cours de la reconstruction

3D. Le principe de cette méthode est de soustraire l’information du reste du complexe (ici le
ribosome) qui agit ici comme une source supplémentaire de bruit lors de la reconstruction
(Figure ci-dessus).
Principe de la soustraction du bruit induit par le reste d’un complexe. Adapté de X Bai & al,
2015, Elife. (A) Un modèle 3D d'un complexe d'intérêt dont on voudrait ignorer la partie jaune du
complexe et la partie du complexe d’intérêt est en rouge. (B) Une image expérimentale βD d’une
particule entière, auquel on retire le signal qu’on souhaite ignorer. (C) Après soustraction du signal et
reconstruction, on obtient une structure mieux résolu pour le domaine d’intérêt.
Annexes 241
Annexes de la Partie II
Annexes 242
Annexe Partie II - N°1
Les protocoles de purification des ribosomes, de la RNase R et de l’ARNtm de chez E. coli.
Annexes du chapître :
IV.2 - Complexe ribosomique en cours de trans-traduction en présence de RNase R

Annexes 243
Purification of prokaryotic ribosomes
MATERIALS:
▲TIP: We recommend using ultrapure MiliQ water or RNase-free water and to

sterilize it through a 0.22µm filter, to avoid the degradation of the ribosomes and the
contamination of the sample.
Buffers:
FP Buffer: French Press Buffer for prokaryotic 70S ribosomes ■Recommended

volume: 25mL
Tris-HCl pH7.5  20mM
MgOAc  50mM
NH4Cl  100mM
EDTA  0.5mM
ß-Mercaptoethanol  6mM
H2O added up to 25 mL
ribo_A Buffer: Tight Couples Buffer ■Recommended volume: 1L

MgCl2  10mM
NH4Cl  60mM
EDTA  0.5mM
H2O added up to 1L
ribo_B Buffer: Washing Buffer ■Recommended volume: 50mL

MgCl2  10mM
NH4Cl  800mM
▲TIP: This high concentration of salt allows washing the ribosomes
EDTA  0.5mM
Sucrose  1.1M (certified Rnase free)
Annexes 244
ribo_B_dis Buffer: Dissociating Buffer ■Recommended volume: 50mL

MgCl2  0.5mM
NH4Cl  800mM
▲TIP: This high concentration of salt allows washing the ribosomes
EDTA  0.5mM
Sucrose  1.1M (certified Rnase free)
STOCK Buffer: Storing Buffer ■Recommended volume: 10mL

Glycerol  10%
ribo_A buffer  90%
Sucrose gradients solutions: ■For 6 tubes (rotor SW28)
▲TIP: We recommend heating the solutions at 50°C for a faster dissolution of

sucrose in the buffer. We also recommend the use of certified RNase free sucrose to
avoid the degradation of the ribosomes.
10% sucrose_Solution 1: ■Recommended volume: 150mL

Sucrose  15g (certified RNAse free)
ribo_A buffer added up to 150mL
45% sucrose_Solution 2: ■Recommended volume: 150mL

Sucrose  67.5g (certified RNAse free)
ribo_A buffer added up to 150mL
Growth Medium:
LB Medium: ■Recommended volume: 2L

LB Broth  40g
H2O added up to 2L
Equipment:
▲TIP: We recommend following the manufacturer’s instructions and safety

information for safe and proper operation for each equipment.
- Linear maker gradient system ■Gradient Master 108 Biocomp

- Centrifuge for large volumes ■BECKMAN J2-MC, rotor JA14
- Ultracentrifuge ■BECKMAN L-90, rotor TI70 and rotor SW28
Annexes 245
- Centrifuge for falcon tubes ■Eppendorf 5804R

- French pressure cell ■SLM Aminco Thermo, model FA-073
- Incubator ■INFORS AG, model CH-4103
PROCEDURE:
I – Growth of bacteria ●TIMING 2 days
1| Pre cultivate E. coli streptag (Rpst – Kan) in 100mL of LB medium overnight with
Neomycin at a finale concentration of 50µg/mL.
2| Incubate at 37°C under an agitation of 190rpm. ■INFORS AG, model CH-4103
3| Inoculate 2X1L in LB medium supplemented with Neomycin at 0.1g/L by 2X50mL

of preculture.
▲TIP: We recommend cultivating the bacteria in large recipients for a better
oxygenation.
II – Bacterial cells Retrieval / Elimination of the medium ●TIMING 1 hour
5| Once the cultures reach an OD600nm of 0.8, divide the culture in 250mL BECKMAN
flacons.
6| Centrifuge at 6,000rpm for 15 minutes at 4°C. ■Rotor JA14, for the BECKMAN
J2-MC centrifuge
7| Discard the supernatant and resuspend the pellets in 10 to 20mL of saline at a

concentration of 9g/L of NaCl and pool them in 50mL falcon tubes.
8| Centrifuge at 8,000rpm for 20 minutes at 4°C. ■ Rotor for Falcon tubes, for the
centrifuge Eppendorf 5804R Rotor JA14 for the BECKMAN J2-MC centrifuge
9| Discard the supernatant.
10| Froze the bacterial pellet at -80°C for ulterior use.
III – Lysis of bacterial cells / Elimination of waste ●TIMING 2 hours
11| Thaw the pellet, weigh the sample and resuspend it in FP buffer with a ratio of
1.5mL for 1g of cells.
12| Lyse the cells with the French Pressure Cell Press. ■Pounds per inch:
16,000psi, by the French Pressure Cell SLM Aminco Thermo, model FA-073
13| Centrifuge at 11,000rpm for 1h at 4°C. ■Rotor for Falcon tubes, for the
centrifuge Eppendorf 5804R
▲TIP: We recommend storing in ice if not use immediately.
Annexes 246
IV – Ribosomes retrieval / Elimination of nonribosomal debris ●TIMING 1 day
14| Put carefully the supernatant above the high-salt sucrose cushion: 1 volume of
ribo_B buffer for 1 volume of supernatant in plastic tubes. ■Maximum volume of
16mL
15| Centrifuge at 30,000rpm for 20h at 4°C, or 40,000rpm for 10h. ■Rotor TI70, for
the BECKMAN L-90 ultracentrifuge
V – Ribosomes separation ●TIMING 3 hours
16| After the centrifuge, pellets will appear translucent with a yellow layer. The yellow
layer corresponds to the membranes and must be eliminated. The translucent pellet
is ribosomes and it's strongly fixed to tube. Discard the supernatant and wash several
times with 1mL of ribo_A buffer.
▲TIP: Let the tube upright on the ice to let the membranes come off by themselves
before washing the pellet.
17| Resuspend the pellet in 1mL of ribo_A buffer in ice.

▲TIP: We recommend tipping up the tube in ice to let the buffer onto the pellet and
to let the ribosomes resuspend themselves for at least 2 hours. Mix it regularly by
reflux to facilitate resuspension.
18| Once the pellet is correctly resuspended, ■Measure at OD260nm a hundredth

dilution.
VI – 70S ribosomes isolation by sucrose gradients ●TIMING 1 day
19| Prepare the sucrose gradients 10%-45%:
20| The gradient is realized into thin polycarbonate tubes. ■By the Gradient Master
108 machine (Biocomp)
21| Heat up the sample for 5 minutes at 42°C
22| Once the gradients are ready, put the ribosomes sample at an equivalent of
200OD, drop by drop over each sucrose gradient. ■Maximum volume of 500µL
▲TIP: We recommend loading a small volume of ribosome for optimal resolution and
a better isolation of the 70S ribosomes.
23| Centrifuge at 23,000rpm, for 18h at 4°C. ■Rotor SW28, for the BECKMAN L-90
ultracentrifuge
24| Prepare the 1,5mL micro tubes to aliquot the gradients. ■About 80 tubes for
one gradient
25| After the centrifugation, aliquot the gradients 0,5mL by 0,5mL on the surface of
the tube.
Annexes 247
26| Measure the OD260nm and locate the absorbance peak.
Figure 39: Measure of OD260nm of different fractions of E. coli 70S ribosomes purification
by a sucrose gradient
■For example, in this case, the 70S peak is obtained around the fifty-fourth
fraction. A weak plateau seems to show around the forty-sixth fraction.
▲TIP: We recommend avoiding taking the fractions too close to the 50S (first
fractions) because of the contaminations of the sample. Here, for each tube, we
chose to keep the fractions after this plateau, up to the twenty third fraction, before
the end of the absorbance peak.
27| Pool the corresponding tubes from the absorbance peak.
VII – Sucrose elimination ●TIMING 1 day
28| Dilute into centrifuge tubes to 1 volume of ribosomes sample for 1 volume of
ribo_A buffer. ■Maximum volume of 16mL
▲TIP: We recommend gently mix the tubes up before the centrifuge for better
sucrose elimination efficiency.
29| Centrifuge at 30,000rpm for 20h at 4°C or 40,000rpm for 10h. ■Rotor TI70, for
the BECKMAN L-90 ultracentrifuge
VIII – Storage of the Ribosomes ●TIMING 2 hours
30| After the centrifugation, discard the supernatant and wash 2-3 times with 500µL
of ribo_A buffer to eliminated a maximum of sucrose.
31| Resuspend one pellet in 100µL of STOCK buffer in ice.

▲TIP: We recommend tipping up the tube in ice to let the buffer onto the pellet and
to let the ribosomes resuspend themselves for at least 1 hour. Mix it regularly by
reflux to facilitate resuspension.
32| Pools, titrate and aliquots the sample into 20µL and store the sample at -80°C for
ulterior use
Annexes 249
Purification of E. coli RNase R

MATERIALS:
▲TIP: We recommend using ultrapure MiliQ water or RNase free water and to
sterilize it through a 0.22µm filter, to avoid the contamination of the sample.
Buffers:
Lyse Buffer pH7.5: ■Recommended volume: 40mL

NaH2PO4  50mM
NaCl  300mM
Imidazole  10mM
H2O added up to 40mL
Pro-Buffer pH8: ■Recommended volume: 300mL

NaH2PO4  50mM
NaCl  300mM
Washing Buffer: ■Recommended volume: 100mL

Imidazole  20mM
NaCl  1M
Pro-Buffer pH8 added up to 100mL
Column Buffer: ■Recommended volume: 100mL

Imidazole  20mM
Elution Buffer: ■Recommended volume: 100mL

Imidazole  250mM
Concentration Buffer pH7: ■Recommended volume: 25mL

HEPES-KOH  10mM
KCl  500mM
EDTA  0.5mM
Glycerol  50%
Annexes 250
Growth Medium:
LB Medium: ■Recommended volume: 2x2L

LB Broth  40g
H2O added up to 2L
Equipment:

- Centrifuge for large volume ■BECKMAN J2-MC, rotor JA14

- Ultracentrifuge ■BECKMAN L-90, rotor TI50.2
- French press ■SLM Aminco Thermo, model FA-073
- Centrifuge for micro tubes ■Eppendorf 5804R
- His-trap column ■ GE life sciences
- Cations exchange column ■ GE life sciences
PROCEDURE:
1| Pre cultivate E. coli in 100mL of LB medium overnight with Ampicillin.
2| Inoculate 2X1L in LB medium supplemented with Ampicillin by 2X50mL of

preculture.
oxygenation.
3| Incubate at 37°C under an agitation of 190rpm ■INFORS AG, model CH-4103
4| Once the culture reach an OD600nm of 0.5, add 1mM of IPTG. ■To induce the
production of tmRNA
II – Bacterial cells Retrieval / Elimination of the medium ●TIMING 1 hour
6| After the induction with IPTG for 4 hours, centrifuge at 6,000rpm for 15 minutes at
4°C. ■Rotor JA14, for the BECKMAN J2-MC centrifuge
7| Discard the supernatant and pool and resuspend the pellets into 20mL of Saline at
a concentration of 9g/L of NaCl in one 50mL falcon tube.
Annexes 251
8| Centrifuge at 6,000rpm for 15 minutes at 4°C. ■Rotor for Falcon tubes, for the
10| Store the pellet at -20°C for ulterior use.
III – Lysis of bacterial cells / Elimination of waste ●TIMING 2 hours
11| Thaw the pellet, weigh the sample and resuspend it in Lyse buffer with a ratio of
1.5mL for 1g of cells.
13| Centrifuge at 25,000rpm for 30h at 4°C. ■Rotor TI50.2, for the Ultracentrifuge
BECKMAN L-90
14| Keep the supernatant on ice for ulterior use.
IV – RNaseR retrieval ●TIMING 1 day
His-trap column
15| Load the sample on the equilibrated His-trap column.
16| Wash the column with the Washing Buffer.
17| Elute the HIST sample ■About 60 tubes
Cations exchange column
18| Equilibrate the cations exchange column with Washing Buffer.
19| Load the sample on the equilibrated cations exchange column
20| Wash the column with five volumes of Washing Buffer.
21| Elute the RNaseR ■Recommended speed of 0.2mL/min and fraction size of
1mL
IV – RNaseR concentration
22| Centrifuge the filtering device ■Amicon Ultra, 15mL of capacity and 50kDa of
Millipore with of the Concentration Buffer at 8,000rpm for 15min at 4°C ■Rotor for
Falcon tubes, for the centrifuge Eppendorf 5804R
▲TIP: We recommend keeping the filter of drying.
23| Eliminate the supernatant

Annexes 252
24| Load the sample with the appropriate fractions depending on the desired
concentration.
25| At the end of each centrifugation, eliminate the supernatant.

▲TIP: We recommend loading a volume of the supernatant on the filtering device at
the end of each centrifugation to equilibrate the tubes before loading other fractions.
26| Once all of the fractions are loaded and centrifuged, load of the Concentration
Buffer and centrifuge at to eliminate the imidazole.
▲TIP: We recommend centrifuging several times with the Concentration Buffer so
that the concentration of the imidazole is diluted about 0.001mM of concentration.
Annexes 253
In vivo purification of E. coli tmRNA

MATERIALS:
▲TIP: We recommend using ultrapure MiliQ water or RNase free water and to
sterilize it through a 0.22µm filter, to avoid the degradation of the tmRNA and the
contamination of the sample. It is also advisable to sterilize some water, cones, micro
pipettes and micro tubes.
Buffers:
TMN Solution: ■Recommended volume: 100mL

NaCl  100mM
MgCl2  50mM
Tween 20  0.05% ■Can’t be autoclaved
Sterilized
3M pH5.2 Sodium acetate Solution: ■Recommended volume: 10mL

Sodium acetate  3M
pH adjustment to 5.2
Sterilized
Elution Buffer: ■Recommended volume: 20mL

Tris-HCl pH7,5  20mM
Sodium acetate  0.25M
EDTA  1mM
SDS 2%  0.25%
Sterilized
Annexes 254
5% acrylamide gel: ■Recommended volume: 150mL

Urea  8M
TBE  1X
Acrylamide  5%
▲TIP: We recommend dividing the solution into 3 falcon tubes of 50mL and to
incubate the falcon tubes at 37°C for a better dissolution of the urea and to increase
the polymerization speed in order to avoid leaks.
APS 0.33%
TEMED 50 µL
Formamide Gel-loading Buffer: ■Recommended volume: 10mL

Deionizaed formamide  95%
Bromophenol blue  0.025%
Xylene cyanol FF  0.025%
EDTA ph8  5mM
10% polyacrylamide gel: ■Recommended volume: 20mL

Urea  7M
TBE  1X
Acrylamide  10%
▲TIP: We recommend incubating the tube at 37°C for a better dissolution of the urea
and to increase the polymerization in order to avoid leaks.
APS  1%
TEMED  10 µL
Growth Medium:
LB Medium: ■Recommended volume: 2x2L
LB Broth  40g
H2O added up to 2L
Equipment:

- Centrifuge for large volume ■BECKMAN J2-MC, rotor JA14

- French press ■SLM Aminco Thermo, model FA-073
Annexes 255
- Centrifuge for micro tubes ■Eppendorf 5804R

- UV shadows ■Thomas Scientific, E-Series Corded Hand-Held UV Lamps
PROCEDURE:
1| Pre cultivate E. coli ΔssrA ■Containing the transformed T7 with the pGEMEX-
tmRNA plasmid-E+1 and the pGEMEX-tmRNA-GFP11 helix in 100mL of LB
medium overnight with Kan30 ■Cassette of chromosomic resistance integrated in
the gene ssrA and with Amp50. ■Resistance of pGEMEX
2| Inoculate 2X1L in LB medium supplemented with Kanamycin and Ampicillin by

2X50mL of preculture.
oxygenation.
3| Incubate at 37°C under an agitation of 190rpm ■INFORS AG, model CH-4103
4| Once the culture reach an OD600nm of 0.5, add 1mM of IPTG. ■To induce the
production of tmRNA
II – Bacterial cells Retrieval / Elimination of the medium ●TIMING 30 minutes
6| After the induction with IPTG for 2 hours, centrifuge at 8,000rpm for 10 minutes at
4°C. ■Rotor JA14, for the BECKMAN J2-MC centrifuge
7| Discard the supernatant and resuspend the pellets into 10mL of TMN Solution.
and pool them in 50mL falcon tubes.
8| Centrifuge at 8,000rpm for 20 minutes at 4°C. ■ Rotor for Falcon tubes, for the
9| Store the pellet at -80°C for ulterior use.
III – Lysis of bacterial cells / DNA, RNA and proteins retrieval ●TIMING 2 hours
10| Thaw the pellet, weigh the sample and resuspend it in TMN solution with a ratio
of 1.5mL for 1g of cells.
12| Add up to 20mL of TMN solution in the Falcon tube.
13| Add 20mL of phenol (especially for RNA use, pH 4.3) and 2mL of SDS 10% ■The
phenol allow extracting the proteins and the pH at 4.3 destabilize the DNA
▲TIP: We recommend dividing in two falcon tubes to facilitate the agitation.
Annexes 256
14| Shake the tubes up vigorously for 30 minutes.
15| Centrifuge at 12,000rpm for 10 minutes at 20°C ■Rotor for Falcon tubes, for
the centrifuge Eppendorf 5804R
16| Gently transfer with a micro pipette the aqueous phase (superior phase) of the
two tubes in two new 50mL falcon tubes.
▲TIP: We recommend letting some aqueous phase to be sure not to have some
organic phase in your sample and to recentrifuge at 12,000rpm for 10 minutes at
20°C ■Rotor for Falcon tubes, for the centrifuge Eppendorf 5804R if some
organic phase is drawn.
IV – Elimination of the DNA ●TIMING 1 hours
17| Add absolute ethanol in each tube: 2.5 volume of absolute ethanol for 1 volume
of supernatant.
18| Take the ball off DNA off with a Pasteur pipette bend at the extremity
▲TIP: We recommend bending the Pasteur pipette so that the bend extremity is big
enough to move around the bottom of the Falcon tube in order to retrieve a maximum
of DNA.
19| After taking off the ball of DNA there is still small filament of DNA in the falcon
tubes. Shake the tubes up and let them rest for 15 minutes. Transfer the liquid phase
into another tube without drawing the DNA into it.
▲TIP: We recommend letting some liquid to be sure to not transferring the DNA into
the new Falcon tube.
20| Centrifuge the rest of the liquid with the DNA at 6,000rpm for 10 seconds at 20°C
and pool the supernatant with the previous one. ■Rotor for Falcon tubes, for the
V – RNA retrieval ●TIMING 3 hours
21| Add 0.1 volume of sodium acetate 3M for one volume of sample in each tube.
22| Incubate at -80°C for 30 minutes.
25| Wash the pellets with 75% ethanol.
26| Let the pellets completely dry off by opening the tubes to eliminate a maximum of
ethanol.
▲TIP: We recommend drying the pellets off under a fume hood to speed up the
evaporation.
Annexes 257
27| Pool and resuspend the two pellets in 4mL of TMN Solution.
28| Add 4mL of phenol (especially for RNA use, pH 4.3) and vortex the sample for 1
minute.
29| Centrifuge at 12,000rpm for 10 minutes at 20°C. ■Rotor for Falcon tubes, for
30| Transfer the aqueous phase (superior phase) in a smaller falcon tube of 15mL of
capacity.
31| Add 2.5 volume of absolute ethanol and 0.1 volume of 3M pH5.2 Sodium acetate
Solution for 1 volume of sample.
32| Shake by inversion.
33| Incubate at -80°C for 30 minutes.
35| Discard the supernatant and wash the pellet by 75% ethanol.
ethanol.
evaporation.
37| Store the pellets at -80°C for ulterior use.
VI – Elimination of the mRNA ●TIMING 30 minutes

38| Resuspend the pellet in 4.5mL of sterile H20.
39| Add 500µL of 3M pH5.2 Sodium acetate Solution.
40| Aliquot the sample in 5x1mL in 2mL micro tubes.
41| Add 500µL of isopropanol in each tube.
43| Centrifuge at 12,000rpm for 5 minutes at 20°C. ■Rotor for micro tubes, for the
44| Transfer the supernatant into new 2mL micro tubes.
VI – tmRNA retrieval ●TIMING 2 days
45| Add 340µL of isopropanol in each tube.

Annexes 258
47| Centrifuge at 12,000rpm for 5 minutes at 20°C. ■Rotor for micro tubes, for the
48| Discard the supernatant and wash the pellet by 75% ethanol.
ethanol.
evaporation.
50| Premigrate the 5% polyacrylamide gel at 5W, in TBE 1X.
51| Resuspend each pellet by 100µL of TMN Solution.
52| Pool the samples into 1 tube. ■Finale volume of 500µL
53| Add 55µL of DNase buffer 10X and 3µL of DNase I. ■Rnase free; NEB
54| Incubate at 37°C for 45 minutes.
55| Add 130µL of Formamide Gel-loading Buffer.
56| Load the sample in the 5% polyacrylamide gel at 400V, 10W in TBE 1X until the
bromophenol blue exit the gel. ■About 3 hours
57| Reveal the gel by an UV shadow. ■Thomas Scientific, E-Series Corded Hand-
Held UV Lamps
58| Cut the stripe corresponding to the tmRNA into small pieces. ■tmRNA ~ 363nt
59| Put the pieces into a 15mL falcon tube with 5mL of elution buffer.
60| Incubate in -20°C for 1 hour.
61| Thaw the sample et incubate overnight at ambient temperature.
62| Centrifuge at 11,000rpm for 10 minutes at 20°C. ■Rotor for Falcon tubes, for
63| Transfer the supernatant in a 15mL falcon tube.
64| Centrifuge at 11,000rpmfor 10 minutes at 20°C. ■Rotor for Falcon tubes, for
65| Aliquot the supernatant by 400µL
66| Add 1mL of 100% ethanol and 44µL of 3M pH5.2 Sodium acetate Solution.
Annexes 259
68| Incubate at -80°C for 1 hour.
69| Centrifuge at 11,000rpm for 15m minutes at 0°C. ■Rotor for Falcon tubes, for
70| Discard the supernatant and let the pellets completely dry off by opening the
tubes to eliminate a maximum of ethanol and incubate at 37°C.
evaporation.
71| Froze the completely dried pellets at -20°C.

▲TIP: We recommend resuspending the pellets in sterile H2O only at the use.
VII – Verification on a polyacrylamide gel ●TIMING 1 hour
72| Premigrate the 10% polyacrylamide gel for 30 minutes at 200V in TBE 1X.
73| Add 5µL of Formamide Gel-loading Buffer.
74| Load the sample in the 10% polyacrylamide gel at V/W in TBE 1X until the blue
band exit the gel ■About 1 hour
77| Reveal the 10% polyacrylamide gel with a BET dye (3µL + 50mL of TBE 1X) by
an UV table
Annexes 260
PICTURES:
I – Lysis of bacterial cells
Step 10| Step 11|
Figure 40: Before the bacterial lysis Figure 41: After the bacterial lysis
II – DNA, RNA and proteins retrieval
Step 15| Step 16|
Figure 3: Phenol after centrifugation Figure 4: Pellet and Supernatant

Annexes 261
III – Elimination of the DNA
Step 18| Step18|
Figure 5: Bend pipette Pasteur Figure 6: DNA elimination
IV – RNA retrieval VI – tmRNA retrieval
Step 23| Step 47|
Figure 7: RNA precipitation Figure 8: tmRNA precipitation

Annexes 262
VI – 5% acrylamide gel assembly
Step 56|
Figure 9: 5% acrylamide gel assembly
VI – 5% acrylamide gel revelation
Step 58
Figure 10: 5% acrylamide gel reveals the gel by an UV shadow

Annexes 263
Annexes de la Partie III

Annexes 264
Annexe Partie III - N°1
II.1) Séquence du système rapporteur de la trans-traduction avec la position des

principaux sites de restrictions
AseI at|taat 60
MseI t|taa 60
SwaI attt|aaat 46
BamHI g|gatcc 37
XhoI c|tcgag 31
NsiI atgca|t 29
BfrBI atg|cat 27
HpaI gtt|aac 19
1 GTAAAACGACGGCCAGTtaacttatgcatctcgagggatccatttaaattgTTGACAatt
1 10 20 30 40 50
KpnI ggtac|c 119

NheI g|ctagc 109
61 aatcatcggctcgTATAATgtgtggaattgtgagcggataacaatttgctagcggtaccg
61 70 80 90 100 110
NdeI ca|tatg 134

41 G D I H M V S K G E E D N M A I I K E F
121 AAGGAGATATACATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGT
121 130 140 150 160 170
61 M R F K V H M E G S V N G H E F E I E G
181 TCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGG
181 190 200 210 220 230
81 E G E G R P Y E G T Q T A K L K V T K G
241 GCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGG
241 250 260 270 280 290
101 G P L P F A W D I L S P Q F M Y G S K A
301 GTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGG
301 310 320 330 340 350
121 Y V K H P A D I P D Y L K L S F P E G F
361 CCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCT
361 370 380 390 400 410
141 K W E R V M N F E D G G V V T V T Q D S
Annexes 265
421 TCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACT
421 430 440 450 460 470
PstI ctgca|g 491

161 S L Q D G E F I Y K V K L R G T N F P S
481 CCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCT
481 490 500 510 520 530
NcoI c|catgg 569

181 D G P V M Q K K T M G W E A S S E R M Y
541 CCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGT
541 550 560 570 580 590
201 P E D G A L K G E I K Q R L K L K D G G
601 ACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCG
601 610 620 630 640 650
221 H Y D A E V K T T Y K A K K P V Q L P G
661 GCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCG
661 670 680 690 700 710
241 A Y N V N I K L D I T S H N E D Y T I V
721 GCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCG
721 730 740 750 760 770
261 E Q Y E R A E G R H S T G G M D E L Y K
781 TGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACA
781 790 800 810 820 830
XbaI t|ctaga 886

ApaI gggcc|c 848
281 G P G K S N N N F A V A A *
841 AGGGGCCCGCAGCAAACGACGAAAACTACGCTCTCGCGGCTTAAtctagatttaagAAGG
841 850 860 870 880 890
NdeI ca|tatg 910

301 M S K G E E L F T G V V P I L V E
901 AGATATACATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGA
901 910 920 930 940 950
321 L D G D V N G H K F S V S G E G E G D A
961 ATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGC
961 970 980 990 1000 1010
NcoI c|catgg 1077

341 T Y G K L T L K F I C T T G K L P V P W
Annexes 266
1021 AACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATG
1021 1030 1040 1050 1060 1070
361 P T L V T T F G Y G V Q C F A R Y P D H
1081 GCCAACACTTGTCACTACTTTCGGGTATGGTGTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCA
1081 1090 1100 1110 1120 1130
381 M K Q H D F F K S A M P E G Y V Q E R T
1141 TATGAAACAGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGAAC
1141 1150 1160 1170 1180 1190
PmlI cac|gtg 1236

401 I F F K D D G N Y K T R A E V K F E G D
1201 TATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGA
1201 1210 1220 1230 1240 1250
421 T L V N R I E L K G I D F K E D G N I L
1261 TACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCT
1261 1270 1280 1290 1300 1310
441 G H K L E Y N Y N S H N V Y I M A D K Q
1321 TGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACA
1321 1330 1340 1350 1360 1370
461 K N G I K V N F K I R H N I E D G S V Q
1381 AAAGAATGGAATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCA
1381 1390 1400 1410 1420 1430
MfeI c|aattg 1471

481 L A D H Y Q Q N T P I G D G P V L L P D
1441 ACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGA
1441 1450 1460 1470 1480 1490
501 N H Y L S T Q S A L S K D P N E K R D H
1501 CAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCA
1501 1510 1520 1530 1540 1550
521 M V L L E F V T A A G I T H G M D E L Y
1561 CATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATA
1561 1570 1580 1590 1600 1610
BglII a|gatct 1623

541 R S L G P N F R K K T L K S V F F R F G
1621 CagatctCTCGGACCAAATTTTCGAAAAAAGACGCTGAAAAGCGTCTTTTTTCGTTTTGG
1621 1630 1640 1650 1660 1670
Annexes 267
BfrI c|ttaag 1698

561 P S A K K L K T A G L V H Y L A V M R W
1681 TCCTTCAGCCAAAAAACTTAAGACCGCCGGTCTTGTCCACTACCTTGCAGTAATGCGGTG
1681 1690 1700 1710 1720 1730
581 T G S A V F F S L L N Q A S N K T K G S
1741 GACAGGATCGGCGGTTTTCTTTTCTCTTCTCAACCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTC
1741 1750 1760 1770 1780 1790
SpeI a|ctagt 1856

SalI g|tcgac 1852
601 V E R L G L S F Y L L F V G E R C R L V
1801 AGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTGTCgactagt
1801 1810 1820 1830 1840 1850
EcoRI g|aattc 1874

HindIII a|agctt 1868
SstI gagct|c 1866
621 S S S L N S G V V T G K
1861 gagctcaagcttgaattccggaGTCGTGACTGGGAAAAC
1861 1870 1880 1890
Annexes 268
Annexe Partie III - N°2
II.2) Tableau répertoriant les positions des sites de restrictions du système rapporteur de la trans-
traduction.
Enzyme Site Positions

AatI agg | cct 361, 583
AatII gacgt | c none
Acc16I tgc | gca none
AccII cg | cg 434, 524, 797
AccIII t | ccgga 1878
AclI aa | cgtt none
AcvI cac | gtg 1236
AfaI gt | ac 117, 349, 601, 790, 838, 1189
AfeI agc | gct none
AflII c | ttaag 1698
AgeI a | ccggt none
AhlI a | ctagt 1856
Alw441 g | tgcac 196
AluI ag | ct 285, 402, 519, 648, 714, 834, 1587, 1864, 1870
Aor51HI agc | gct none
ApaI gggcc | c 848
ApaLI g | tgcac 196
AscI gg | cgcgcc none
AseI at | taat 60
Asp718I g | gtacc 115
AsuII tt | cgaa 1533, 1643
AvaI c | ycgrg 31, 412, 604
AviII tgc | gca none
AvrII c | ctagg none
BalI tgg | cca 166, 1082
BamHI g | gatcc 37
BanIII at | cgat none
BbeI ggcgc | c 617, 725
BbrPI cac | gtg 1236
BbuI gcatg | c none
BcuI a | ctagt 1856
BclI t | gatca none
BfaI c | tag 110, 887, 1443, 1857
BfrI c | ttaag 1698
BfrBI atg | cat 27
BglII a | gatct 1623
BlnI c | ctagg none
BseCI at | cgat none
BsePI g | cgcgc none
BseX3I c | ggccg none
BshTI a | ccggt none
Bsp1407I t | gtaca 836, 1187
Bsp19I c | catgg 569, 1077
Annexes 269
BspDI at | cgat none

BspEI t | ccgga 1878
BsrGI t | gtaca 836, 1187
BssHII g | cgcgc none
BstUI cg | cg 434, 524, 797
ClaI at | cgat none
DpnII | gatc 37, 233, 629, 1136, 1538, 1623, 1746
DraI ttt | aaa 46, 1301
EagI c | ggccg none
EcoRI g | aattc 1874
EcoRV gat | atc none
EgeI ggc | gcc 615, 723
FseI ggccgg | cc none
FspI tgc | gca none
HaeIII gg | cc 13, 166, 221, 254, 305, 361, 548, 583, 662, 697, 806, 846, 1082, 1483, 1816
HincII gty | rac 19, 54, 735, 1400, 1854
HindIII a | agctt 1868
HinfI g | antc 478, 1276, 1390, 1882
HpaI gtt | aac 19, 1400
HpaII c | cgg 719, 818, 848, 1708, 1879
KasI g | gcgcc 613, 721
KpnI ggtac | c 119
MboI | gatc 37, 233, 629, 1136, 1538, 1623, 1746
MfeI c | aattg 1471
MluI a | cgcgt none
MscI tgg | cca 166, 1082
MseI t | taa 18, 45, 60, 893, 976, 1042, 1270, 1284, 1300, 1399, 1699
MspI c | cgg 719, 818, 848, 1708, 1879
NaeI gcc | ggc none
NarI gg | cgcc 614, 722
NcoI c | catgg 569, 1077
NdeI ca | tatg 134, 910, 1141
NdeII | gatc 37, 233, 629, 1136, 1538, 1623, 1746
NgoMIV g | ccggc none
NheI g | ctagc 109
NlaIII catg | 165, 186, 204, 348, 573, 828, 1081, 1155, 1175, 1370, 1565, 1605, 1610
NotI gc | ggccgc none
NruI tcg | cga none
NsiI atgca | t 29
PacI ttaat | taa none
PciI a | catgt none
PhoI gg | cc 13, 166, 221, 254, 305, 361, 548, 583, 662, 697, 806, 846, 1082, 1483, 1816
PmeI gttt | aaac none
PmlI cac | gtg 1236
PsiI tta | taa none
PstI ctgca | g 491
PvuI cgat | cg none
PvuII cag | ctg 714, 1587
RsaI gt | ac 117, 349, 601, 790, 838, 1189
SacI gagct | c 1866
SacII ccgc | gg none
Annexes 270
SalI g | tcgac 1852

SbfI cctgca | gg 491
ScaI agt | act none
SfoI ggc | gcc 615, 723
SmaI ccc | ggg none
SnaBI tac | gta none
SpeI a | ctagt 1856
SphI gcatg | c none
SspI aat | att none
SstI gagct | c 1866
SstII ccgc | gg none
StuI agg | cct 361, 583
SwaI attt | aaat 46
TaqI t | cga 32, 230, 236, 446, 1279, 1533, 1643, 1804, 1853
TliI c | tcgag 31
VspI at | taat 60
XbaI t | ctaga 886
XhoI c | tcgag 31
XmaI c | ccggg none
VU : VU :
Le Directeur de Thèse Le Responsable de l'École Doctorale
(Nom et Prénom)
VU pour autorisation de soutenance
Rennes, le
Le Président de l'Université de Rennes 1
David ALIS
VU après soutenance pour autorisation de publication :
Le Président de Jury,
(Nom et Prénom)
Résumé
Le travail retranscrit dans cette thèse regroupe l’étude de différents processus biologiques impliqués
dans la synthèse protéique bactérienne. Dans un premier chapitre, les origines de la synthèse protéique
au temps du monde ARN sont traitées en guise d’introduction. Ce travail théorique se poursuit par la
présentation d’une structure à haute résolution du facteur d’élongation G (EF-G) en complexe avec le
ribosome par cryo-microscopie électronique à transmission (cryo-MET). Grâce aux avancées
techniques de la cryo-MET, nous avons observé pour la première fois EF-G lié au ribosome en
l’absence de tout inhibiteur. Cet état particulièr d’EF-G permet de visualiser une flexibilité de son
doamine III. Cette étude permet aussi de rationaliser le fonctionnement de l’antibiotique acide
fusidique. Nous nous sommes ensuite intéressés aux voies de sauvetage de la synthèse protéique et
plus particulièrement de la trans-traduction. Ce mécanisme fascinant permet le recyclage des
ribosomes bloqués sur un ARN messager défectueux. Cette voie de sauvetage est généralement vitale
ou alors indispensable pour la virulence bactérienne. Nous avons réalisé une étude structurale
préliminaire de la dégradation de l’ARNm défectueux durant ce processus. Après une revue traitant du
sujet, nous présentons une étude de la trans-traduction comme cible pour le développement de
nouveaux antibiotiques. Pour cela, nous avons mis au point un système rapporteur avec contrôle
interne de l’activité trans-traductionnelle bactérienne. Après avoir mis au point ce système et validé
son utilisation, nous l’avons exploité en testant des molécules ciblant la trans-traduction.
Mots clés
Acide fusidique - Antibiotiques - ARNtm - Cryo-MET - EF-G - Ribosome - SmpB - Structure - Synthèse
protéique – trans-traduction - 70S
Abstract
The current PhD work brings together various studies linked to bacterial protein synthesis. The first
chapter is about the origins of protein synthesis at the time of the RNA world. This theoretical work
continues with the presentation of a high-resolution structure of the elongation factor G (EF-G) in
complex with the ribosome by cryo-electron transmission microscopy (cryo-TEM). We describe for
the first time EF-G bound to the ribosome in the absence of any inhibitor. This particular structure of
EF-G displays a yet unseen positioning of its third domain, which becomes very flexible. This study
helps to understand the way the antibiotic fusidic acid blocks translation. The work then switches to a
study of trans-translation, the main rescuing system of stalled ribosomes in bacteria. Trans-translation
is generally vital or at least necessary for bacterial virulence. We conducted a preliminary structural
study on the way faulty mRNAs are degraded during this process. This is why we present a study of
trans-translation as a target for the development of new antibiotics. For this we developed and
validated a reporter system for trans-translation, which is used to screen molecules targeting trans-
translation.
Key words
Antibiotics - Cryo-EM - EF-G - Fusidic acid - Protein synthesis - Ribosome - SmpB - Structure - tmRNA -
trans-translation - 70S

Mace Kevin

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Mace Kevin

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Mace Kevin

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Le contrôle qualité de la synthèse protéique comme cible

pour le développement de nouveaux antibiotiques

To cite this version:

HAL Id: tel-01691728

HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est

THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1

Thèse soutenue à Rennes

le développement de Emmanuelle Schmitt

THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1

Thèse soutenue à Rennes

de la synthèse protéique Axel Hartke

comme cible pour / rapporteur

En premier lieu, je remercie tout particulièrement mon directeur de thèse, le Pr Reynald

Merci à Manu pour sa richesse intellectuelle et culturelle. Un grand merci pour sa

Je n’oublierai pas de remercier Daniel et Maryvonne pour leur grande générosité.

Merci aussi à tous ceux qui liront cette thèse.

La partie II se focalise sur un mécanisme de sauvetage de la synthèse protéique bactérienne :

Table des matières

Table des matières .................................................................................................................... 10

La synthèse protéique ............................................................................................................... 17

I - Origine de la synthèse protéique ...................................................................................... 18

I.1 – Introduction – Origine de la synthèse protéique ....................................................... 18

I.2 - Origine du code génétique ......................................................................................... 19

I.3 - Origine de la vie : L’hypothèse du monde ARN ....................................................... 21

I.3.A - Introduction : Le paradoxe de l'origine de la vie ............................................... 21

I.3.B - Découverte des ARN catalytiques ..................................................................... 21

II - Article #1 | K. Macé and R. Gillet - 2016 - Nucleic Acids Research ............................. 23

II.1 - Introduction de l’article #1 ....................................................................................... 23

II.2 - Article #1 ................................................................................................................. 25

II.3 - Conclusion de l’article #1 ........................................................................................ 37

III - Le ribosome ................................................................................................................... 39

III.1 - Introduction - Le ribosome ..................................................................................... 39

III.2 - Nomenclature du ribosome ..................................................................................... 40

III.2.1 - Nomenclature des ARN ribosomiques............................................................. 40

III.2.2 - Nomenclature des protéines ribosomiques ...................................................... 41

III.2.2.A - Historique ................................................................................................. 42

III.2.2.B - La nouvelle nomenclature ........................................................................ 43

III.3 - Structure du ribosome ............................................................................................. 45

IV - Le cycle traductionnel ................................................................................................... 48

IV.1 - Introduction – Le cycle traductionnel .................................................................... 48

IV.1.1 - Les acides ribonucléiques de transfert, partenaires clés du ribosome au cours

IV.1.1.A - Structure des ARNt .................................................................................. 49

IV.1.1.B - Synthèse et modification post-transcriptionnel des ARNt ....................... 50

IV.1.2 - Les aminoacyl-ARNt-synthétases (aaRS) ....................................................... 51

IV.1.2.A - Généralités et structure ............................................................................. 51

IV.1.2.B - Le mécanisme d’aminoacylation .............................................................. 52

IV.2 - Les étapes du cycle traductionnel ........................................................................... 53

IV.2.1 – L’initiation de la traduction ............................................................................. 53

IV.2.1.A - Introduction – L’initiation de la traduction .............................................. 53

IV.2.1.B - Caractéristiques de la région TIR de l’ARNm ......................................... 54

IV.2.1.C - Les étapes conduisant à la formation d’un ribosome fonctionnel ............ 55

IV.2.2 - L’élongation ..................................................................................................... 57

IV.2.2.A - Introduction : L’élongation ...................................................................... 57

IV.2.2.B - Les étapes du cycle d’élongation .............................................................. 57

IV.2.2.B.1 - Liaison du complexe ternaire ............................................................. 57

IV.2.2.B.2 - Le décodage ....................................................................................... 57

IV.2.2.C - Le transfert peptidique.............................................................................. 62

IV.2.2.D - La translocation ........................................................................................ 63

IV.2.2.D.1 – Introduction : La translocation .......................................................... 63

IV.2.2.D.2 - Les états intermédiaires durant la translocation ................................ 63