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0 대한민국

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工學碩士學位 論文

西紀 2008學年度

효소가수분해를 이용한 음식물쓰레기의

바이오에탄올 생산

Bio-ethanol production of enzymatic hydrolyzed food

wastes

指導敎授 朴 大 遠

서울産業大學校 에너지環境大學院

에너지環境工學科

金 宰 亨
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 工學碩士學位 論文

효소가수분해를 이용한 음식물쓰레기의

바이오에탄올 생산

Bio-ethanol production of enzymatic hydrolyzed food

wastes

指導敎授 朴 大 遠

2009 年 2 月

서울産業大學校 에너지環境大學院

에너지環境工學科

金 宰 亨
효소가수분해를 이용한 음식물쓰레기의
바이오에탄올 생산

Bio-ethanol production of enzymatic hydrolyzed food

wastes

指導敎授 朴 大 遠

이 論文을 工學碩士 學位論文으로 提出함

2009 年 1 月

서울産業大學校 에너지環境大學院
에너지環境工學科
金 宰 亨

金宰亨의 工學碩士 學位論文을 認准함

2009 年 1 月

審査委員長 (印)

審 査 委 員 (印)

審 査 委 員 (印)

서울産業大學校 에너지環境大學院
 목 차

요 약 ·································································································· ⅰ

표 목 차 ·································································································· ⅱ

그림목차 ·································································································· ⅳ

Ⅰ. 서 론 ·································································································· 1

1. 연구의 배경 및 필요성 ··········································································· 1

2. 연구 내용 및 특징 ················································································· 3

Ⅱ. 이론적 배경 ······················································································ 5

1. 유기성폐기물 ······························································································ 5
1.1 축산분뇨 ······························································································· 5
1.2 하수슬러지 ··························································································· 7
1.3 음식물쓰레기 ···················································································· 10
2. 유기성폐기물 처리 및 에너지화 기술 ················································ 13
2.1 열화학적 전환기술 ·········································································· 13
2.2 혐기성소화 ························································································ 15
2.3 수소발효 ···························································································· 19
2.4 알코올발효(바이오에탄올) ····························································· 21
3. 생물학적 바이오에탄올 생산 ································································ 24
3.1 Feedstock ······················································································· 24
3.2 에탄올생산 균주 ·············································································· 28
 3.3 당화공정(Saccharification) ··························································· 33
3.4 에탄올발효(Ethanol fermentation) ············································· 38

Ⅲ. 실험방법 ·························································································· 41

1. 실험재료 및 분석방법 ············································································ 41

1.1 음식물쓰레기 ···················································································· 41
1.2 가수분해효소 ···················································································· 41
1.3 에탄올 생산 균주 ············································································ 44
1.4 분석방법 ···························································································· 45
2. 실험방법 ···································································································· 46
2.1 음식물쓰레기의 가수분해효소를 이용한 당화 ·························· 46
2.2 에탄올생산 균주선별 ······································································ 47
2.3 염분농도에 의한 Saccharomyces cerevisiae의 inhibition · 48
2.4 효소를 이용한 음식물쓰레기의 당화 후 에탄올 생산 ············ 49
2.5 음식물쓰레기를 이용한 동시당화공정에서의 효소주입량과
에탄올생산 ························································································· 52
2.6 동시당화공정을 이용한 음식물쓰레기의 에탄올 생산 ············ 53

Ⅳ. 결과 및 고찰 ·················································································· 54

1. 음식물쓰레기의 가수분해효소를 이용한 당화 ·································· 54

2. 에탄올생산 균주선별 ·············································································· 64
3. 염분농도에 의한 Saccharomyces cerevisiae의 inhibition ········· 70
4. 효소를 이용한 음식물쓰레기의 당화 후 에탄올 생산 ···················· 72
5. 음식물쓰레기를 이용한 동시당화공정에서의 효소주입량과
에탄올생산 ································································································ 74
 6. 동시당화공정을 이용한 음식물쓰레기의 에탄올 생산 ···················· 76

Ⅴ. 결론 ·································································································· 78

Ⅵ. 참고문헌 ·························································································· 80

Abstract ······························································································ 87
 요 약

제 목 : 효소가수분해를 이용한 음식물쓰레기의

바이오에탄올 생산

본 연구는 국내의 실정을 고려하여 바이오매스인 음식물쓰레기를 발효기질로

이용하여 바이오에탄올을 생산하고자 하였다. 바이오에탄올의 생산효율을 높

이기 위해 다양한 효소의 당화효율 비교, 에탄올생산 균주특성, 또한, 국내 음

식물쓰레기의 특징인 염분농도에 대한 균주의 내성 확인과 분리당화공정, 동

시당화발효공정을 적용하여 에탄올 생산량을 확인하였다. 개별효소를 이용하

여 글루코즈 생산량을 확인한 결과, 음식물쓰레기의 복합적인 성상으로 인해

glucoamylase와 complex-carbohydrase에서 각각 0.52, 0.48 g glucose/g

dry food waste을 생산하였으며, 또한, 혼합효소를 이용하여 음식물쓰레기를

당화한 결과에서는 protease와 위의 두 효소를 혼합한 결과가 약 0.7 g

glucose/g dry food waste로 높은 글루코즈 생산량을 나타내었다. S.

cerevisiae와 Thermoanaerobacter. ethanolicus 두 종을 이용하여 에탄올을
생산한 결과, 6탄당인 글루코즈를 사용하는데 있어서는 S. cerevisiae가 더

높은 에탄올 생산량을 나타내었다. 염분농도에 의한 S. cerevisiae의 특성을

확인한 실험에서는 NaCl의 농도가 높아질수록 에탄올 생산은 거의 이루어지

지 않았으며, 특히, 3%(V/V) 이상의 농도에서는 낮은 에탄올 생산을 나타내

었다. 분리당화공정을 이용하여 에탄올을 생산한 결과는 0.51g ethanol/g

dry food waste이였으며, 동시당화공정 적용시에는 0.41g ethanol/g hexose

를 생산하는 것을 확인하였다. 이를 통하여 국내의 음식물쓰레기를 자원으로

이용하여 바이오에탄올의 안정적인 생산 가능성을 확인하였다.

- i -
 LIST OF TABLES

Table 2.1. Ingredients of nutrients as manure in the livestock

wastewater ····························································································· 5
Table 2.2. Status of livestock wastewater in sewage and waste water

····················································································································· 6

Table 2.3. Generation and treatment status of sewage sludge ··············· 8

Table 2.4. Conditions of pyrolysis and gasification process ················· 14

Table 2.5. Volatile fatty acids during the anaerobic digestion ············· 17

Table 2.6. Bio-hydrogen production processes ·········································· 20

Table 2.7. Comparison between the characteristics of gasoline and

bio-ethanol ·························································································· 21

Table 2.8. Advantages and disadvantages of bio-ethanol as liquid fuel

················································································································· 24

Table 2.9. Biofuel production methods using various biomass

feedstocks ···························································································· 24
Table 2.10. Chemical composition of different lignocellulosic feedstock

··················································································································· 26

Table 2.11. Bacteria species as candidate ethanol fuel producers ······· 29

Table 2.12. Ethanol production by yeasts on different carbon sources

················································································································· 30

Table 3.1. Characteristic of food wastes used in the present study · 42

Table 3.2. Characteristics of various enzymes used in the present

study ······································································································ 44

Table 3.3. Pre-culture medium(S. cerevisiae) ············································· 45

Table 3.4. Pre-culture medium(T. ethanolicus) ·········································· 45

- ii -
Table 3.5. Gas chromatographic condition for ethanol analysis ··········· 46

Table 3.6. Composition of fermentation medium(S. cerevisiae) ············ 48

- iii -
 LIST OF FIGURES

Fig. 2.1. Status of food wastes generation and treatment in Korea ·· 10

Fig. 2.2. Composition of Biofuels production from renewable energy in
Korea ········································································································· 12

Fig. 2.3. Schematic of anaerobic methane fermentation process ········· 16

Fig. 2.4. A general process scheme for ethanol production from

different raw materials ········································································ 25

Fig. 2.5. Simplified flowsheet for ethanol production from

lignocellulose ··························································································· 27

Fig. 2.6. Embden-Meyerhof pathway ······························································ 32

Fig. 2.7. Schematic representation of enzymatic hydrolysis steps

based on carbohydrates ······································································ 34

Fig. 2.8. Steps involved in the enzymatic hydrolysis of cellulose ······ 36

Fig. 2.9. Schematics of separate hydrolysis and fermentation (SHF)

process and simultaneous saccharification and fermentation
(SSF) processes ····················································································· 39

Fig. 3.1. Schematic of enzymatic hydrolysis from food wastes

experiment (batch type) ····································································· 47

Fig. 3.2. Schematic of ethanol fermentation reactor ································· 51

Fig. 4.1. Glucose production from food wastes using various enzymes

······················································································································· 56

Fig. 4.2. Glucose production from food wastes using mixed enzymes58

Fig. 4.3. Glucose production from food wastes of various

carbohydrase(Viscozyme L) dosages ··········································· 60

Fig. 4.4 Total glucose production from food wastes of various

carbohydrase(Viscozyme L) dosages ··········································· 61

- iv -
Fig. 4.5 Total glucose production from food wastes of various
glucoamylase(Spirizyme plus) dosages ········································ 63

Fig. 4.6 Ethanol production using S. cerevisiae in medium batch

cultivations ······························································································· 65

Fig. 4.7 Effect of OD and pH changes during the ethanol fermentation

using S. cerevisiae ················································································· 67

Fig. 4.8 Ethanol production using T. ethanolicus in medium batch

cultivations ································································································· 68

Fig. 4.9 Effect of ethanol production using S. cerevisiae on various

salt concentrations ················································································ 71

Fig. 4.10 Effect of OD and pH changes during ethanol fermentation on

various salt concentrations using S. cerevisiae ························ 72

Fig. 4.11 Ethanol production from enzymatic hydrolyzed food wastes 73

Fig. 4.12 Effect of ethanol production on various carbohydrases

(Viscozyme L) dosages using SSF process ································ 75

Fig. 4.13 Ethanol production from food wastes using SSF process ····· 77

- v -
 Ⅰ. 서 론

1. 연구의 배경 및 필요성

석유자원의 고갈과 함께 대체에너지로써 태양, 풍력, 조력 등을 이

용한 신⋅재생에너지 등에 관심이 집중되고 있으며, 이들 중 Biomass

를 이용한 에너지생산은 폐자원을 재활용한다는 의미에서 국제적 이슈

로 떠오르고 있다. 이러한 Biomass를 이용하여 생산되는 에너지 중

바이오에탄올은 수송용 에너지로써 각광을 받고 있다.

바이오에탄올은 대부분 미국과 브라질 같은 대규모 경작지를 소유

하고 있는 국가를 위주로 옥수수, 사탕수수 등과 같은 원료에서 생산

되어 왔다. 하지만, 이러한 원료는 애그플레이션(agflation)과 같은 문

제점으로 사용에 제한적이며, 이로 인해 최근에는 목질계 바이오매스

(lignocellulosic biomass)를 비롯한 다양한 바이오매스를 이용하여 바

이오에탄올을 생산하는 방법들이 주목을 받고 있다. 우리나라의 경우

경작지가 부족하거나, 목질계 바이오매스를 제한적으로 사용가능하기

에 현재까지 바이오에탄올생산 연구가 미비한 실정에 있다. 하지만,

최근에는 우리나라 실정에 맞는 바이오매스(음식물쓰레기, 해초 및 조

류 등)을 이용하여 바이오에탄올을 생산하는 연구가 활발히 진행 중에

있다.

이러한 바이오매스 중 특히 음식물쓰레기는 고농도의 유기화합물

(sugar, starch, lipid, protein, cellulose, hemicellulose 등)을 함유

하고 있어 생물화학적 공정의 기질로써 높은 활용가능성을 가지고 있

다. 이에 음식물쓰레기의 에너지화를 위한 많은 연구가 진행되고 있으

며, 특히 바이오리파이너리(Biorefinery)기술을 응용한 수소생산 및 메

- 1 -
탄생산 등의 연구가 활발히 진행중이다.

음식물쓰레기가 함유하고 있는 고농도의 유기화합물을 발효기질로

써 이용하여 생물학적인 방법으로 에너지를 생산하기 위해서는 셀룰로

우즈(cellulose), 헤미셀룰로우즈(hemicellulose), 전분(starch)과 같은

고분자화합물들을 모노머(monomer)로 전환하기 위한 가수분해과정이

필수적이다. 가수분해공정은 물리적, 화학적인 방법을 이용한 처리기

술 등이 있으나 이는 부가적인 생성물들로 인해 2차 오염을 야기하고,

에너지 소모 및 고가의 기계장치들로 인해 비용이 증가한다는 단점들

이 있다. 이로 인해 최근에는 생물학적인 방법인 효소가수분해가 주로

사용되어지고 있다. 효소를 이용한 방법은 특정한 반응에 대하여만 촉

매반응을 한다는 점과 화학적 처리방법에 비해 분해생성물, 부산물 등

의 생성이 적고, 상온⋅상압 반응이므로 시설비가 적게 들며 반응되지

않는 성분은 변환없이 배출되므로 다른 용도로 쓸 수 있다는 점 그리

고 기술개발이 지속적으로 이루어지고 있으므로 공정개선 및 경제성

제고가 용이한 장점이 있다.

따라서, 본 연구에서는 Biomass인 음식물쓰레기를 효율적으로 이

용하여 친환경적인 바이오연료, 특히 운송연료로 사용되어질 수 있는

바이오에탄올 생산 기술을 개발하여, 환경과 에너지 문제를 동시에 해

결하고, 우리나라의 음식물쓰레기 처리에도 방향을 제시할 수 있을 것

으로 기대된다.

- 2 -
2. 연구 내용 및 특징

세계적으로 바이오에탄올 생산에 대한 연구는 전분계, 셀룰로우즈

계 및 최근 각광받고 있는 목질계 바이오매스를 발효원료 기질로 이용

한 연구에 국한되어 왔다. 하지만, 이는 경작지가 부족한 우리나라의

실정에는 적합하지 않으며, 이로 인해 국내의 바이오에탄올 생산연구

는 현재까지 미비한 실정에 있다.

이에 본 연구에서는 바이오에탄올 발효공정의 제한요소인 값비싼

기질공급의 문제점을 국내 실정에 적합한 재생가능한 유기성자원인 음

식물쓰레기를 이용함으로써 기질공급으로 인한 경제적 해결점을 모색

하고 수송용 연료인 바이오에탄올을 생산하고자 하였다.

생물학적인 방법을 적용하는 바이오에탄올 생산은 당화공정

(saccharification)과 발효공정(fermentation)으로 크게 2가지로 나누

어진다. 첫 번재 당화공정은 바이오매스가 포함하고 있는 탄소원

(carbon source)중 전분(starch), 셀룰로우즈(cellulose) 및 헤미셀룰

로우즈(hemicellulose)와 같은 다당류(polysaccharide)를 단당류

(monosaccharide)로 전환하는 공정으로 최근에는 효소를 이용한 방법

이 대두되고 있다. 두 번째 발효공정은 앞선 당화공정에서 생산된 단

당류를 에탄올발효 미생물을 이용하여 최종적으로 에탄올을 생산하는

공정으로 기존에는 효모(yeast)를 이용하였으나, 최근에는 목질계 바

이오매스를 원료로 이용함으로써 목질계 바이오매스의 당화산물인 5

탄당, 6탄당을 기질로써 이용가능한 박테리아(bacteria)에 대한 연구가

진행되고 있다.

이에 본 연구에서는 재생가능한 유기성 자원인 음식물쓰레기에 함

유된 탄소 화합물을 효소 반응에 의한 값싼 기질로 이용함으로써 환경

친화적인 효소 당화공정 개발, 에탄올 생산균주인 Saccharomyces

- 3 -
cerevisiae를 이용하여 음식물쓰레기 당화액으로부터 회분식 발효에
의한 바이오에탄올생산, 우리나라의 음식물쓰레기가 포함하고 있는 높

은 염분 함량에 의한 바이오에탄올 생산효율에 미치는 영향 그리고,

동시당화공정을 적용한 바이오에탄올생산 등을 연구하여, 음식물쓰레

기를 원료로 이용한 바이오에탄올 생산을 위한 공정의 기초 자료를 제

시하고자 한다.

- 4 -
 Ⅱ. 이론적 배경

1. 유기성 폐기물

국내에서 발생되는 유기성폐기물은 생활쓰레기를 비롯하여 농⋅축산폐

기물, 임업폐기물, 수산가공폐기물, 동⋅식물성잔재물 및 하⋅폐수슬러

지 등으로 크게 나눌 수 있다. 최근 이러한 유기성폐기물은 Biomass

로써 재이용되어 화석연료의 대체에너지(Bio-energy) 및 재자원화(퇴

비화 및 사료화 등)로써 관심이 집중되고 있으며, 이로 인해 부존자원

의 소비를 줄이고 경제성 확보와 환경문제를 동시에 해결하는 유기성

폐기물 처리기술들이 크게 부각되고 있다.

1.1. 축산분뇨

가축사육으로부터 발생하는 축산분뇨는 Table 2.1과 같이 질소(N)

를 비롯한 인산(P2O5), 칼리(K2O) 등 3대 비료성분과 유기물, 기타 작

1)
물생육에 필요한 각종 미량물질이 다량 함유되어 있으며 , 토양개량제
로 사용가능하여 기존에는 퇴비화를 사용하였다.

Table 2.1. Ingredients of nutrients as manure in the livestock

wastewater
(단위 : %)

구분 수분 유기물 질소 C/N 인산 칼리 CaO

우분 80.0 75.3 2.09 21.5 2.80 0.46 2.05
돈분 75.2 80.7 3.68 14.8 5.99 0.77 3.16
계분 66.7 77.0 5.10 11.4 4.84 1.47 4.27

- 5 -
 하지만, 이러한 축산분뇨는 적정하게 관리되지 않을 경우 점오염원

또는 비점오염원으로 작용하여 수질에 큰 영향을 미치게 되며, 우리나

라의 경우 Tabel 2.2의 결과에서 알 수 있듯이 축산분뇨 발생량은 전

체 오․폐수 발생량의 0.6%에 불과하나, 발생오염 부하량은 25.8%로

1)
높은 값을 나타낸 것으로 확인되었다 .

Table 2.2. Status of livestock wastewater in sewage and waste

water

구분 계 생활하수 산업폐수 축산폐수

발생량
23,670 15,023(66.0%) 7,907(33.4%) 131(0.6%)
(천 톤/일)
부하량(톤/일) 7,417 3,126(42.2%) 2,374(32.0%) 1,917(25.8%)

이러한 축산분뇨는 다른 폐수보다도 높은 농도의 유기물질과 영양

염류를 함유하여, 최근에 와서는 정부의 지원금을 받아 이러한 기존시

설의 재검토와 함께 오니 발생이 적게 발생하는 바이오가스를 생산하

여 이를 전기에너지로 이용하는 선진국형 축산분뇨 처리 시설인 바이

오 가스화 발전 시설을 설치하여 사용하고 있거나 시설설치를 검토하

는 농가가 많아졌다.

바이오가스화 시설은 독일, 덴마크, 네덜란드 등의 EU 국가에서

축산폐수의 공동 집하 및 적정처리, 바이오가스의 발전 등 대체에너지

로의 유효이용, 소량의 경종 농가용 퇴비생산 등의 장점으로 미래 선

진국형 축산의 필수 시설로 인식되고 있다.

- 6 -
1.2. 하수슬러지

슬러지는 하수처리 과정에서 발생하는 액상 부유물질의 총칭으로

서, 하수 슬러지를 좁은 의미로 1차 슬러지, 잉여 슬러지, 반송 슬러

지, 농축 슬러지 및 소화 슬러지 등이라고 하고, 넓은 의미로는 침사,

스크린 협잡물 및 스컴도 포함된다. 하수처리 및 정수과정에서 생긴

침전물로 오니라고도 한다. 특히 도시 생활하수로 인해 발생되는 슬러

지를 Sewage Sludge라고 하며 처리에 관심을 요한다.

하수슬러지의 최종 처분방법으로는 Table 2.3과 같이 매립, 해양

배출, 소각, 재활용 등을 고려할 수 있다. 2005년도 국내의 하수슬러

지 발생량은 전국 294개 하수처리장에서 2561천 톤/년이 발생하였으

며, 최종적으로 해양배출이 77.9%, 소각이 11.2%, 재활용이 4.8%, 육

상매립이 1.7%의 순으로 처리되고 있는 것으로 나타났다2). 하수슬러

지의 최종처분에 있어서 해양배출 비율이 높은 것은 ´03. 7월부터 시

설용량 1만 톤 이상의 하수종말처리시설에서 발생하는 하수슬러지는

육상매립이 금지됨에 따라 일선 지방자치단체에서는 하수슬러지 처리

를 초기시설 투자가 필요 없고 처리단가가 저렴한 해양배출 중심으로

전환해 왔기 때문이다.

- 7 -
Table 2.3. Generation and treatment status of sewage sludge

발생량 처분량 (천톤/년)

년도 (천 해양배
계 재활용 매립 소각 기타 미처분
톤/년) 출
26 766 - 169 - -
1994 962 962
2.7% 79.7% - 17.6% - -
24 932 - 206 - -
1995 1,162 1,162
2.1% 80.2% - 17.7% - -
30 1,009 5 243 11 -
1996 1,298 1,298
2.3% 77.7% 0.4% 18.7 0.9% -
43 989 9 279 9 130
1997 1,478 1,348
2.9% 66.9% 0.6% 20.1% 0.7% 8.8%
34 792 27 552 8 282
1998 1,695 1,413
2.0% 46.8% 1.5% 32.6% 0.5% 16.6%
80 641 33 820 - 19
1999 1,593 1,574
5.1% 40.7% 2.1% 52.1% - 1.2%
88 439 93 1,118 0.92 1.6
2000 1,741 1,739
5.1% 25.2% 5.3% 64.2% 0.1% 0.1%
118 229 138.2 1,391 20.4 5.4
2001 1,902 1,897
6.2% 12.0% 7.3% 73.3% 1.1% 0.1%
239 197 222 1,418 - -
2002 2,076 2,076
11.5% 9.5% 10.7% 68.3% - -
2,266. 152 113 280 1626 96 0.2
2003 2,266.8
6 6.7% 5% 12.4% 71.7% 4.2 0.009%
239 35 283 1869 - -
2004 2,426 2,426
9.2% 1.6% 12.5% 76.7% - -
122 44 286 1,994 114 763
2005 2,561 2,560
4.8% 1.7% 11.2% 77.9% 4.5% 0.03%

- 8 -
 하수슬러지의 육상매립은 직․매립 금지조치에 따라 매년 그 처분

양은 큰 폭으로 감소하여 ´05년 현재 전체 하수슬러지 발생량의 1.7%

만이 매립되고 있으며, '03. 7월 이후에는 1만톤 미만의 하수종말처리

시설에서 발생하는 슬러지만이 매립되고 있기 때문에 매립처리 금지

대상이 되는 1만톤 이상의 하수종말처리시설에서는 대부분이 해양배

출로 전환되고 있다.

하수슬러지의 소각처리 유형은 크게 전용 소각로와 일반폐기물 소

각로에서 연계처리 등의 두 가지로 구분되고 현재 우리나라에는 9개

의 하수슬러지 전용소각시설이 가동 중에 있다. 2000년 소각으로 처

리되는 하수슬러지 양이 전체의 5.3%에서 ‘05년 11.2%로 증가하였

고, 계속 증가할 것으로 예상된다.

- 9 -
 1.3. 음식물쓰레기

음식물쓰레기는 인간과 주위 환경에 좋지 않은 영향과, 사람의 시

각과 후각 등의 쾌적감과 생활 위생에 영향을 미친다. 또한, 바이러스,

및 병원성 미생물이 존재하여 적절한 처리없이 이를 직접 이용할 경

우, 병원균의 전파 및 감염 등이 조성될 수 있다. 또한, 유기물의 함량

이 높아, 온도가 비교적 높을 경우, 빠르게 부식하여 악취가 발생하여

새로운 오염을 유발시킨다. 이러한 음식물 쓰레기는 가정, 음식영업점,

식당, 식품 가공에서 발생하는 폐재료, 부식품 시장 및 슈퍼마켓 등의

유통기한 초과 상품 등 그 출처가 광범위하고 대량으로 배출되고 있는

실정이다. 이에 정부에서는 생활쓰레기의 감축을 위해 ‘95년 쓰레기

종량제 실시하여 생활폐기물 배출량이 47,774톤/일로 ’94년에 비해

17.8% 감소하였고, ‘98년까지 지속적으로 감소하는 추세를 보였으나,

국민들의 생활수준의 향상 등으로 인해 1999년과 2000년에는 다시

각각 2.3%와 1.8%의 증가를 보였다. 이중에서 음식물 쓰레기 발생량

은 2000년의 경우 11,434톤/일로 생활쓰레기 발생량의 약 24.6%로써
3)
높은 비율을 차지하고 있다 .

Figure 2.1. Status of food wastes generation and treatment in

Korea

- 10 -
 하지만, 2005년부터 음식물쓰레기의 매립지 반입에 따른 악취 및

침출수 문제 등으로 인해 정부에서는 시단위 이상에서 젖은 쓰레기의

직접 매립을 전면 금지하고 소각, 퇴비화, 사료화 또는 소멸화 등의

전처리 후에 발생되는 잔류물만을 매립할 수 있도록 규정하여, 음식물

쓰레기의 주 처리 방법이 기존의 소각 및 매립으로부터 자원화 및 재

활용화로 움직이고 있는 추세이다. 이러한 움직임은 자원순환형 사회

형성이라는 새로운 사회적 트렌드와 맞물려 기존의 음식물쓰레기 처리

방법이 자원화로 전환되었으며, 이러한 자원화 방법으로서는 사료화와

퇴비화가 90%이상을 차지하고 있지만, 음식물쓰레기가 포함하고 있는

과다한 염분으로 인해 퇴비화에 큰 저해요인으로 작용하고 있으며, 사

료화 역시 안정성에 대한 불안과 소비자의 구매 기피현상에 따른 수요

감소로 인해 제대로 되지 않고 있는 실정에 있다.

이러한 음식물쓰레기는 유기물질과 영양성분을 많이 함유하고 있어

서 Biomass로써 높은 이용 가치가 있으며, 이러한 Biomass를 기질로

이용하여 미생물 발효에 의해 생산되는 에너지는 화석연료를 대체 하

는 에너지원으로써 사용가능하다. 기존의 화석연료의 사용은 자원 고

갈, 환경오염 및 지구온난화 등의 문제점을 나타내어 선진국중심으로

국가적인 규제강화 및 신⋅재생에너지의 보급을 확산하는 정책들이 입

안되고 있는 실정이다.

- 11 -
Figure 2.2. Composition of Biofuels production from renewable

energy in Korea

음식물쓰레기의 구성 성분은 크게 단백질, 지방, 탄수화물, 수분으

로 구성되어 있다. 이를 적절한 전처리 방법을 적용 할 경우 단백질은

아미노산, 지방은 지방산 그리고 탄수화물은 분자량이 큰 헤미셀루로

우즈(hemicellulose) 및 셀룰로우즈(cellulose) 등으로 가용화된다. 이

러한 가용화산물들을 기질로써 혐기성미생물을 이용하여 메탄, 수소

등의 신⋅재생에너지의 생산의 연구들이 진행되어 지고 있다. 현재 우

리나라 정부에서도 국제 환경변화에 대응하고 에너지 안보를 확보하기

위하여 현재 1.4%의 신⋅재생에너지 비중을 2011년까지 5%로 대폭

확대할 예정이며, 현재 바이오에너지는 Fig 2.2와 같이 신⋅재생에너

지 중 낮은 비중을 차지하고 있으므로 기술개발이 이루어져야 한다.

- 12 -
2. 유기성폐기물 처리 및 에너지화 기술

2.1. 열화학적 전환 기술

열화학 반응을 이용하여 유기성폐기물을 화학적으로 변환시켜, 에

너지원으로서의 사용하기 쉬운 2차 에너지로 변환하는 것으로, 유기성

폐기물의 다양한 조건하에서 열을 가하여 이를 통해 생성물을 얻는 기

술을 열화학적 전환 기술이라 한다.

2.1.1. 연 소

유기성폐기물 이용의 가장 간단한 방법의 하나로서 유기성페기물을

공기중에서 태워 열, 수증기 등을 얻을 수 있으며, 또한 전기 생산도

가능하다. 현재 연소는 스토커형, 선회류형, 유동상식 연소 등 다양한

방법이 있으며, 열병합발전에 의한 지역난방, 석탄발전소 또는 도시쓰

레기 소각로에서 혼합연소 발전 등에 다양하게 활용되고 있다.

2.1.2. 열분해

열분해는 상압 혹은 고압에서 산소가 결핍된 상태에서 가열하여 탄

화(carbonization)를 유도하는 것이다. 생성물의 성상은 반응기내의 체

류시간과 가열속도에 크게 좌우된다. 반응기 종류로는 버블유동층, 순

환유동층 등이 있다.

- 13 -
 2.1.3. 가스화
가스화 반응은 연소반응의 이론적 산소량보다 적은 양의 산소를

공급하여 이루어지는 부분 산화공정이다. 1,000 K 이상의 고온에서

부분산화반응을 거쳐 가스와 charcoal이 생성되며, charcoal은 추가반

응을 거쳐 H2, CO, CO2, CH4로 전환된다. 가스화로의 형식에 따라 고

정층, 유동층, 분류층 등의 형태로 나눌 수 있다.

Table 2.4. Conditions of pyrolysis and gasification process

공정 압력 온도(℃) 건조 생성물
액체
열분해 상압 500 - 600 필요
(중질상오일 및 char)

고압 350 - 450 불필요 기체(수소, 메탄 등)

가스화
상압 800 - 1200 필요 기체 (CO, H2 등)

하지만 이와 같은 열화학적 전환 기술은 질소 산화물 발생, 염소

화합물에 의한 고온영역에서의 반응기 부식 등의 단점을 가지고 있으

며, 또한 음식물쓰레기, 하수슬러지, 가축분뇨와 같은 수분함량이 많은

유기성폐기물에 적용하기에는 전처리 비용이 많이 들고, 에너지 회수

율이 낮다는 단점이 있다.

- 14 -
2.2. 혐기성 소화

유기성폐기물을 혐기성조건에서 미생물반응에 의해 메탄과 이산화

탄소를 주성분으로 하는 가연성 가스를 얻는 과정으로, 첫 번째 단계

인 산생성 과정을 통해 단당류, 아미노산, 지방산 등의 분자량이 작은

중간생성물을 거처 아세트산, 프로피온산, 부틸산 등의 저급지방산, 젖

산, 에탄올 등으로 분해되고, 아세트산을 제외한 저급지방산 등이 수

소생성 미생물에 의하여 수소와 아세트산으로 변환되고, 마지막 단계

에서는 기질 특이성이 강한 메탄생성 미생물에 의해 메탄과 이산화탄

소로 분해되는 것이다4).

유기성폐기물을 이용한 혐기성 소화 공정은 1930년대부터 현재까

지 중국, 인도 등지의 농가에서부터 덴마크의 낙농단지, 우리나라의

식품공장 등에서 다양하게 적용되어 에너지를 공급하고 있으며 1974

년 석유파동 이후에는 대부분의 나라에서 고농도 유기물 처리의 표준

공정으로 자리잡고 있다. 혐기성 소화 공정을 통한 메탄은 시설난방에

이용되거나 소화조의 가온이나 전력생산에 이용되고 있으며, 또는 포

집하여 가스엔진, 보일러, 소각로의 보조열원 등으로 사용이 가능하다

2.2.1 혐기성소화의 Mechanism

혐기성소화는 다양한유기물을 분해하여 안정화시키는 다단계의 생

화학 반응으로 가수분해단계, 산 형성단계, 메탄형성단계로 이루어진

다.

- 15 -
Fig 2.3. Schematic of anaerobic methane fermentation process

1) 가수분해단계

가수분해단계는 유기화합물이 가수분해균과 발효균의 가수분해효

소에 의해 분해되는 과정이 며, 다당류, 탄수화물, 단백질, 지방, 리그

닌, 셀룰로오스 등이 용해성의 당, 알코올, 지방산, 아미노산, 폴리펩타

이드 등의 단위체(monomer)나 올리고머(oligomer)로 분해된다.

2) 산 형성단계

산 형성단계는 산 생성균에 의해 가수분해산물을 초산(acetate),

프로피온산(propionate), 뷰티르산(butyrate), 저분자의 유기산, 수소,

- 16 -
이산화탄소 등으로 전환시키는 단계를 말한다. 가수분해단계에서 생성

된 용존성 저분자의 유기물을 프로피온산(propionate), 뷰티르산

(butyrate)으로 분해시키는 미생물은 acid forming bacteria이고, 이

들 미생물에 의해 생성된 유기산을 아세트산으로 분해하는 미생물은

acidogenic bacteria이다. 산형성균은 메탄형성균에 비해 증식률과 기

질 이용 속도가 빠르고 환경변화에 더욱 안정적인 반응을 보인다. 산

형성단계는 가수분해되어 생성된 단당체들이 propionate나 butyrate

까지 분해되는 단계와 프로피온산등을 이용하여 최종적으로 아세트산

으로 분해되는 acetogenic 단계로 나누기도 한다. 이 과정에서는 산

형성 과정에서 발생한 lactic, propionic, butyric, valeric acid, 에탄

올 등의 기질이 분해되어 메탄형성의 기질인 acetate, 수소, 이산화탄

소가 만들어진다. Acetogenic reaction은 수소분압이 10-4 ~ 10-5 기

압과 같이 매우 낮은 조건에서만 일어나고 이처럼 낮은 수소분압은

hydrogenophilic methanogen bacteria 균이 수소를 소비하기 때문에

가능하다. 혐기성소화에서 일반적으로 생성되는 휘발성 유기산은

formic, acetic, propionic, butyric, valeric, isovaleric, caproic acid

등이다.

Table 2.5. Volatile fatty acids during the anaerobic digestion

휘발성지방산 화학식
Formic acid HCOOH
Acetic acid CH3COOH
Propionic acid CH3CH2COOH
Butyric acid CH3CH2CH2COOH
Valeric acid CH3CH2CH2CH2COOH
Iso-valeric acid (CH3)2CHCH2COOH
Caproic acid CH3CH2CH2CH2CH2COOH

- 17 -
 3) 메탄형성단계

혐기성소화의 마지막 단계로 수소를 기질로 이용하여 메탄을 생성

하는 hydrogenotrophic methanogens와 acetate를 기질로 이용하는

acetogenic methanogens에 의해 수행된다. 총 메탄은 acetogenic

methanogenesis에 의해 약 70% 그리고 30% hydrogenotrophic

methanogensis에 의해 생산된다. 두 종류의 미생물 군은 절대 혐기성

균이며 이들은 메탄형성균으로 통칭하고, 기질의 이용과 동력학적 특

성에 있어 서로 상이한 특성을 지닌다. 메탄생산균은 산생산균에 비해

pH, 온도, 독성물질 등 환경변화에 매우 민감하고 증식속도나 기질 이

용률이 낮기 때문에 전체 혐기성 분해의 율속 단계가 된다.

혐기성 소화조를 설계할 때는 메탄형성균의 필요조건을 충족시킬

수 있도록 설계인자가 고려되어야 한다.

- 18 -
 2.3. 수소 발효

생물학적 수소 생산 기술은 다양하며, 기질로 사용되는 원료 물질

에 따라 물, 바이오매스, 가스로 크게 구분될 수 있고 유기성폐기물을

이용한 수소 발효는, 이 중에서 혐기 발효에 의한 수소 생산이라고 할

수 있다. 즉 통상의 혐기성 소화 공정에서 운전조건을 달리하여 수소

를 생산하는 것이다.

수소 생산 균주들은 자체 내 존재하는 생화학반응을 통해 수소, 이

산화탄소, butyrate를 생성하며 동시에 lactate, acetate, butanol, 에

탄올도 생성할 수 있는 발효 경로를 갖는다. 포도당으로부터 수소와

같이 acetate 및 butyrate가 생성될 경우, 수소 생산은 2몰 Acetate

5)
와 동시에 4몰의 수소를, Butyrate의 경우 2몰의 수소를 생산한다 .

수소를 생산하는 미생물은 크게 광합성 세균(photosyntheric

bacteria), 혐기성세균(non-photosytheric anaerobic bacteria), 조류

(algae)등으로 구분된다. 광합성 세균은 Rhodospirillaceae,

Chromatiaceae 및 Chlorobiaceae로 구분되며, 이는 각각 홍색 비유
황세균(purple non-sulfur bacteria), 홍색 유황세균(puple sulfur

bacteria), 녹색 유황세균(green sulfur bacteria)으로 통칭된다. 혐기

성 세균은 절대 혐기(strict anaerobes)와 통성 혐기(facultative

anarobes)세균으로 구분된다. 조류는 녹조류(green algae)와 남조류

(blue-green algae)로 구분되며 남조류는 통칭 cyanobacteria라고 불

리고, 대표적 수소생산균주로는 Anabaena 속이 있다6), 생물학적으로

수소를 생산 기술의 분류를 Table 2.6에 나타내었다

- 19 -
Table 2.6. Bio-hydrogen production processes

방법 원료 Chemistry

광합성 작용에
의한 직접 물 물
분해

조류 및 광합성 세균

간접 물 분해 물

빛,광합성 세균

유기물 + 물 → 유기산 + 수소 +
광합성 발효 바이오매스 이산화탄소

예) 2CH3COOH + 4H2O → 4CO2 + 8H2

혐기성 세균
유기물 + 물 → 유기산 + 수소 +이산화탄소
예) C6H12O6 + 2H2O → 2CH3COOH +
혐기 발효 바이오매스
2CO2 + 4H2
C6H12O6 → CH3CH2CH2COOH +
2CO2 + 2H2
물 → photosystem Ⅱ, Ⅰ → e- →
물 또는 hydrogenase → 수소
균체외 반응 -
바이오매스 유기물 + 물 → enzyme → e →
hydrogenase → 수소

- 20 -
 2.4. 알코올발효(바이오에탄올)

현재 바이오매스로부터 얻어지는 신⋅재생에너지(바이오에탄올, 부

탄올, 수소, 메탄 등)의 연구가 활발히 진행되고 있으며, 선진국을 중

심으로 연료용으로 사용될 수 있는 바이오에탄올의 연구가 진행되고

있다. 현재 개발된 바이오에탄올은 수송용 대체연료로서 휘발유와 혼

합연료(Gasohol)의 형태, 산화물(ETBE, Ethyl Tertiary Buthyl

Ether)의 혼합연료 혹은 수화에탄올(95%(v/v)에탄올 + 5%(v/v)물)로

7)
기존의 내연기관에 거의 완벽하게 사용될 수 있다 .
Table 2.7에서 보는 바와 같이 에탄올은 공연비(Air/Fuel ratio)를

낮게 유지할 수 있으며, 증발잠열과 옥탄가가 높고, 화염온도는 낮으

8)
므로 연료용으로써의 특성이 입증되고 있다 .

Table 2.7. Comparison between the characteristics of gasoline

and bio-ethanol

연료특성 에탄올(바이오) 가솔린

38.1℃ 129 414-776

증기압
46.4℃ 165 640
(mmHg)
4.8℃ 21 160
열량 ( kcal/ℓ ) 5,060 7,589
옥탄가 RON 111 91-98
증발열 (kcal/ℓ) 158 62
비 중 0.789 0.70-0.76
비등점 (℃) 78.7 27-205
분자량 46.1 100-105
탄소함유량 (g/ℓ) 412 640
공연비 9.0 14.5
발화 한계농도 (Vol%) 3.3-19 1.4-7.6
인화점 (℃) 13.1 -42.4
자동 착화점 (℃) 218 125

- 21 -
Table 2.8. Advantages and disadvantages of bio-ethanol as

liquid fuel

장점 단점
독성이 적다 가격이 비싸다
유기배출물의 반응성이 낮다 원료 공급원의 제한이 있다
유독 공해물질 배출량이 적다 부피당 열량이 가솔린 대비 1/3
엔진 효율이 높다 저온 시동성에 문제점이 있다
CO2 배출이 적다
황, 질소 성분 미포함
바이오매스로부터 생산가능

위의 Table 2.8에 내연기관 연료로서 에탄올 장단점을 종합하였다.

화석연료와 바이오에탄올을 비교할 경우 다양한 장점을 가지고 있다.

바이오에탄올은 연소시 formaldehyde, benzene, 1,3-butadiene같은

유독성 물질의 배출량을 저감할 수 있으며, 또한 Non-methane

organic gas도 소량 방출되어 오존(Ozone)형성에 대해 낮은 광화학적

반응성을 가지고 있어서, 지속적으로 도시의 대기환경 문제를 감소할

수 있다. 또한 에탄올을 연료로써 사용할 경우 가솔린 대비 이산화탄

소의 배출량이 약 12% 감소되며, 바이오매스의 이산화탄소 사이클을

고려할 때 이산화탄소의 배출량을 90∼100% 까지 감소시킬 수 있다.

또한, 바이오에탄올은 자동차 연료인 가솔린에 연료 첨가제로 사용될

수 있으며, 10%의 에탄올을 혼합하였을 경우, 엔진 동력을 5% 향상

시킬 수 있고, 5 units의 옥탄가를 증가시키며, 또한 배출가스의 일산

화탄소량을 30%가량 감소시킬 수 있다. 이러한 에탄올은 액체 수송연

료로서 취급이 용이하고 연소 후 대기오염의 적으며, 옥탄가가 높아서

고체 바이오매스로부터 얻어질 수 있는 에너지 중 가장 높을 효율을

나타낸다고 할 수 있어서, 경제적⋅환경적인 측면에서 매우 우수한 에

- 22 -
 9-12)
너지원으로 평가 된다 .

에탄올은 다양한 원료로부터 생산되어진다. 바이오에탄올의 경우

곡물류, 당밀, 사탕수수, 과일과 같은 당류와 polysaccharide 등을 통

해서 생산되어지며, 화학공정을 이용한 합성에탄올은 아래의 식과 같

이 ethylene의 수화반응(hydration)을 통해서 생산된다.

합성에탄올은 Sasol, SADAF, British Petroleum 등의 회사에서

년간 100∼400 kiloton의 양을 생산하고 있다. 하지만, 이는 1990년

대 전세계 총 에탄올생산량의 7%에서 2006년도에는 4%에도 못 미치

는 수준이며, 바이오에탄올의 생산가격 하락과 원료인 ethylene의 가

격상승 등의 요인으로 경제적인 차원에서 바이오에탄올의 생산에 주목

하고 있다.

- 23 -
3. 생물학적 바이오에탄올 생산

3.1. Feedstock

바이오에탄올은 다양한 원료(feedstock)에서 생물학적인 방법에 의

해 전환되며, feedstock은 일반적으로 슈크로우즈(sucrose)를 다량 포

함하고 있는 사탕수수, 옥수수, 밀, 감자, 보리 고구마 등의 녹말작물

을 이용하며, 또한 카사바, 볏짚 등의 다양한 식물에서도 다당류

(polysaccharide)를 이용하여 적절한 가수분해방법을 적용하여 단당류

13,14)
로 전환 후 에탄올을 생산 할 수도 있다 .

Table 2.9. Biofuel production methods using various biomass

feedstocks

공정 바이오매스 바이오연료
Soy beans,
Testerification rapeseed, canola, Biodiesel
algae, etc.
Sugar cane, corn,
Sugar
sugar beets, Bioethanol
Fermentation
grains, etc.
Energy crops,
Cellulosic-
woody biomass, ag Cellulosic Ethanol
Biochemical
waste, etc
Blended biomass,
Cellulosic- Cellulosic Ethanol,
MSW, green waste,
Thermochemical Alcohols
etc

- 24 -
 바이오에탄올의 원료 중 가장 많이 사용되는 원료는 사탕수수이다.

사탕수수가 많이 생산되는 브라질에서는 차량의 약 70%가 바이오에

탄올을 연료첨가제로 사용한다. 하지만 다른 국가들에서는 사탕수수의

생산원가가 높기 때문에 섬유소가 풍부한 바이오매스에서 바이오에탄

15,16)
올을 생산하는 기술을 개발하고 있다 .

Figure 2.4. A general process scheme for ethanol production

from different raw materials

Fig 2.4에 각각의 원료에 따른 에탄올 생산공정을 나타내었다. 이

러한 feedstock은 크게 슈크로우즈(sucrose)를 포함하고 있는 당질계

바이오매스, 전분계 바이오매스 그리고 목질계 바이오매스로 구분할

수 있다. 하지만, 전분계 및 당질계 기질의 경우 식용자원으로의 이용

으로 인해 수급 측면에서 현실성이 떨어지므로, 최근에는 비가식 식용

- 25 -
자원인 목질계 바이오매스를 이용하여 에탄올을 생산하는 기술개발의

연구가 급속한 속도로 발전 중에 있다.

Table 2.10. Chemical composition of different lignocellulosic

feedstock

Lignocellulosic
Cellulose(%) Hemicellulose(%) Lignin(%)
materials
Hardwoods
40-50 24-40 18-25
stems

Softwood stems 45-50 25-35 25-35

Nut shells 25-30 25-30 30-40

Corn cobs 45 35 15
Grasses 25-40 35-50 10-30
Paper 85-99 0 0-15
Wheat straw 30 50 15
Sorted refuse 60 20 20
Leaves 15-20 80-85 0
Cotton seed
80-95 5-20 0
hairs
Newspaper 40-55 25-40 18-30
Waste papers
from chemical 60-70 10-20 5-10
pulps
Primary
wastewater 8-15 - 24-29
solids
Swine waste 6.0 28 -
Solid cattle
1.6-4.7 1.4-3.3 2.7-5.7
manure
Coastal Bermuda
25 35.7 6.4
grass
Switch grass 45 31.4 12.0

- 26 -
 목질계 바이오매스는 많은 양을 수급할 수 있지만, Table 2.10에서
보듯이 안정한 화합물인 리그닌의 포함으로 인해 가용화를 통해 기질

로 이용되는 hemicellulose 및 cellulose와의 분리기술개발이 필요하

다. 또한 목질계 바이오매스의 가수분해 잔류물에는 육탄당(hexoses)

과 오탄당(pentoses)이 혼합되어 있기 때문에 기존의 기술개발이 이

루어져있는 전분계 및 당질계 기질의 가수분해 시 얻어지는 육탄당을

에탄올로 전환하는 발효 균주들을 도입할 수가 없다는 단점이 있으며,

이로 인해 Fig 2.4의 목질계 바이오매스를 이용한 에탄올 생산공정과

같이 육탄당 뿐만 아니라 오탄당을 고수율, 고생산성으로 에탄올로 전

17-19)
환하는 균주의 연구개발이 진행중에 있다 .

Figure 2.5. Simplified flowsheet for ethanol production from

lignocellulose

- 27 -
 3.2. 에탄올발효 미생물

미생물이 생산하는 알코올류로서는 ethanol, 1-butanol,

2-propanol, 2,3-butandiol 그리고 glycerol 등이 있다. 현재 에탄올

생산에 쓰이고 있는 미생물은 효모가 주를 이루고 있다. 효모는 선택

적으로 에탄올을 생산하므로, 부산물이 적어 발효 후의 에탄올 회수가

편리하고, 세포의 사이즈가 박테리아보다 커서 취급이 용이하다.

Clostridium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacter

ethanolicus, Pachysolen tannophilus 등의 박테리아의 경우에는 일
반적인 효모가 발효를 하지 못하는 5탄당(pentose)의 이용이 가능하

여 많은 연구가 진행되고 있다. 박테리아는 5탄당과 6탄당(hexose)을

동시에 이용하고, 발효온도가 높아 생산된 에탄올이 계속 증발되므로,

최종산물인 에탄올에 의해 발효가 억제되는 것을 막을 수 있어, 앞으

로의 에탄올발효에서 효모에 대체될 가능성이 크다, 그러나 현재까지

연구된 미생물들은 불필요한 부산물의 생산이 너무 많고, 생산되는 에

탄올의 농도 또한 낮다.

박테리아 중 에탄올 발효균주로써 대표적인 종으로는 Zymomonas

mobilis를 들수 있다. Zymomonas는 Gram-음성균으로써 열대지방에

서는 술의 제조에 사용된 적도 있으며, EM 또는 glycolytic경로가 아

닌 Enter- Doudoroff(ED) 경로를 통해 글루코즈 1분자로부터 2분자

의 에탄올을 생산하여, 같은 양의 글루코즈에서 에탄올을 효모보다 약

5∼10% 더 높은 수율로 생산한다. 차후 바이오에탄올의 대량생산에

있어서 생산속도가 빠른 미생물의 형질개량에 있어서도 효모보다 유전

적으로 변화시키기가 수월하여, Zymomonas의 에탄올 내성을 증가시

키는 연구가 진행 중에 있으며, 에탄올생산이 가능한 박테리아 종에

대해 Table 2.11에 나타내었다.

- 28 -
Table 2.11. Bacteria species as candidate ethanol fuel
20-25)
producers .

Ethanol
Carbon productivity
Species Strain type
source (g/g sugar
used)
Erwinia PDC
Xylose 0.45
chrysanthemi transconjugant
Erwinia PDC
Arabinose 0.33
chrysanthemi transconjugant
Klebsiella PDC
Xylose 0.40
planticola transconjugant
Amylalse-
Zymomonas Patented
digested 0.46
mobilis loboratory strain
starch
Z. mobilis pdc
Klebsiella oxytoca Xylose 0.42
and adhB genes
Z. mobilis pdc
Klebsiella oxytoca Arabinose 0.34
and adhB genes
Z. mobilis pdc
Klebsiella oxytoca Glucose 0.37
and adhB genes
Lactate
Bacillus
dehydrogenase Sucrose 0.30
stearothermophilus
mutant
Corn fiber
Z. mobilis pdc
Escherichia coli acid 0.41
and adhB genes
hydrolysate

- 29 -
Table 2.12. Ethanol production by yeasts on different carbon
26-29)
sources .

Carbon Temp. Ferment. Maximum

Yeast
source (℃) time (hr) ethanol(g/L)
Saccharomyces Glucose,
30 94 91.8
cerevisiae 200 g/L
Saccharomyces Sucrose,
28 96 96.7
cerevisiae 220 g/L
Saccharomyces Galactose,
30 60 40.0
cerevisiae 20-150 g/L
Saccharomyces Molasses,
30 24 18.4
cerevisiae 1.6-5.0 g/L
Saccharomyces Glucose,
30 30 21.7
pastorianus 50 g/L
Saccharomyces Glucose,
30 60 23.0
bayanus 50 g/L
Kluyveromyces Glucose,
30 192 49.0
fragilis 120 g/L
Kluyveromyces Glucose,
30 40 24.2
marxianus 50g/L
Glucose,
Candida utilis 30 80 22.7
50 g/L

효모들 중에서는 Saccharomyces cerevisiae, S. ellypsoideus,

S.uvarum, S. fragilis, Schizosaccharomyces pombe 등이 에탄올 생

산에 선택되어 지고 있으며, Table 2.12에 에탄올생산이 가능한 효모

들에 대해 나타내었다. 효모는 에탄올에 대해 매우 민감하고, 에탄올

의 농도가 1-2%(w/v) 정도로도 생장을 감퇴시킬 수 있으며,

10%(w/v)에서는 효모의 생장이 거의 없어지게 된다. 발효시간이 길어

지게 되면 에탄올은 미생물의 생장에 대한 비경쟁적인 Michaelis-

- 30 -
Menten억제를 일으키고, 이런 억제의 직접적인 영향은 더 복잡하다고

알려져 있다. 효모배양의 대수생장기에 에탄올을 첨가하면 미생물의

생장률이 급격히 저하되며, 효소의 비가역적 파괴로 인해 미생물의 생

존율이 저하되어. 이로 인해 에탄올 자체의 생산율의 저하를 초래하게

된다.

기질의 선택사항에 따라서는 Torula cremoris나 Candida

pseudotropicalis가 사용되어지기도 한다. Saccharomyces속의 효모
는 세포의 모양이 보통 원형 또는 난원형인데, 때로는 길어지거나 드
물게는 실 모양을 띄기도 한다. 보통때는 출아(budding)를 통해 무성

적으로 번식해 나가지만, 유성생식을 할때는 세포상호간에 동태 또는

이태 접합을 한 후, 1-4개의 포자를 만든다. Schizosaccharomyces

속의 효모도 유포자성(sporogenous)으로써, Saccharomyces속 과 더

불어 Endomycetaseae과에 분류되고 있다. 세포는 실모양을 나타내지

않고, 형단분열로 증식한다. 포자는 동태접합 후 생기고, 자낭 속에 둥

근 포자를 4-8개 만든다. 에탄올발효에 쓰이는 S. pombe는 세포의

크기가 약 3∼4⨯6∼15 ㎛ 정도이다. Torula와 Candida는 같은 속인

데, 현재는 Candida로 통일되었다. Candida는 무포자성

(asporogeneous) 효모이고, 세포는 원형이나 난원형 때로는 길어지기

도 한다. 세포표면의 여러 곳에서 출아하여 번식한다.

S. cerevisiae는 glucose 및 sucrose와 같은 단당류 및 다당류를

기질로 이용하여 Fig 2.6과 같은 Embden-Meyerhof(EM)경로를 통해

에탄올을 생산하고, 안정적인 식품첨가물로써 알코올 음료 및 제빵분

야에 널리 사용되어지며 종에 대한 연구도 지속적으로 이루어지고 있

다.

- 31 -
Figure 2.6. Embden-Meyerhof pathway

앞서 언급했듯이 박테리아, 효모의 다양한 종들에 의해서 에탄올

생산은 가능하며, 특히 에탄올발효에 이용되기 위한 균주의 특성으로

는 (1) 바이오매스당 에탄올의 전환율이 높고, (2) 효소가수분해의 고

온에 따라서, 높은 온도의 저항성을 가지고 있어야 하며, (3) 에탄올에

대한 내성이 강하고, (4) 낮은 pH에 대한 내성을 가지고 있어야 한다.

- 32 -
 3.3. 당화공정(Saccharification)

당화공정은 바이오매스가 포함하고 있는 고분자 탄수화물

(polysaccharide)을 저분자 당류(mono-saccharide)로 전환하는 과정

으로 Fig 2.6에 이를 간략하게 나타내었다.

Figure 2.7. Schematic representation of enzymatic hydrolysis

steps based on carbohydrates

이러한 공정을 통해 바이오매스는 에탄올발효 미생물들이 기질로써

이용할 수 있는 단당류로 전환되며, 일반적으로 효소를 이용하여 처리

하게 된다. 효소를 사용하는 이점 중 하나는 대개 특정한 반응에 대하

여만 촉매작용을 하므로 분해 생성물, 부산물 등의 생성이 적다는 것

이다. 둘째로는 생물공정은 상온, 상압 반응이므로 시설비가 적게 들

며 반응되지 않는 성분(바이오매스의 경우 리그린 등)은 변환없이 배

출되므로 다른 용도로 쓸 수 있다는 점이며, 마지막으로, 생물공정은

- 33 -
새로운 공정 및 기술 개발이 계속되고 있으므로 공정 개선 및 경제성

제고가 용이하다는 것이다.

효소의 종류는 가수분해 대상 물질 또는 분자의 결합구조에 따라

달라지게 된다. 대상물질의 결합구조에 따른 효소의 종류들 중 에스테

르결합(ester bond)에 작용하는 효소들은 lipase, cholinesterase,

DNase(deoxyribonuclease) 등으로 이들은 카르복시산, 인산, 황산 등

의 에스테르를 가수분해하는데 사용된다. 그리고, glycosyl화합물에

작용하는 효소로는 α- 및 β-amylase, glycosidase, nucleosidase 등

이 있으며 당의 환원성 수산기와의 사이에서 생성된 글리코시드 결합

(glycosidic bond)을 가수분해 하는 역할을 한다. 또한, 펩티드결합

(peptide bond)에 작용하는 효소로는 leucine aminopeptidase,

pepsin, trypsin, chymotrypsin 등의 효소들이 있으며, 단백질의 구조

를 형성하는 아미노산의 펩티드 결합을 가수분해한다. 펩티드 이외의

탄소-질소 결합에 작용하는 효소 또한 존재 하는데 이들의 종류는

urease, asperginase, penicillinase, arginase, nucleoside 또는

nucleotide의 deaminase 등이 있다. 산무수물에 작용하는 효소는

ATPase 등이 있다.
이러한 효소들을 탄수화물, 단백질, 지방 분해효소로 분리하면, 지

방(lipid)의 경우 구성성분인 트리글리세리드(triglyceride)를 글리세롤

(glycerol)과 지방산(fatty acid)으로 가수분해하는 리파아제(lipase)

효소, 단백질은 아미노산(amino acid)이 펩티드결합에 의하여 중합된

펩티드사슬로써, 이러한 펩티드결합의 C-N결합을 가수분해 하는 것이

단백질 분해효소이다. 이러한 단백질 분해효소를 기능에 따라 분류하

면 endopeptidase와 exopeptidase로 나눌 수 있으며, 엔도펩티다아

제의 경우는 펩티드사슬 내부에 펩티드결합을 가수분해하여 작은 펩티

드를 생성하게 되며, 펩신과 트립신, 키모트립신 등이 있다. 엑소펩티

- 34 -
다아제는 펩티드사슬 말단의 펩티드결합만을 가수분해하여 말단의 아

미노산을 유리시키는 것으로써, carboxypeptidase와 aminopeptidase,

dipeptidase 등이 있다. 고분자 탄수화물(polysaccharide)은 단당류

(monosaccharide)가 글리코시드결합에 의하여 연결된 다당류로써, 이

러한 다당류의 글리코시드결합을 가수분해하여 단당류로 만드는 것이

탄수화물 분해효소이다. 종류로는 amylase, lactase, sucrase 등이 있

으며, 아밀라아제의 경우는 starch를 maltose과 dextrin으로 분해하고

엿당(맥아당)은 maltase에 의해 glucose로 분해된다. 이당류

(disaccharide)분해효소는 lactose를 분해하는 lactase, sucrose를 분

해하는 sucrase 등이 있다.

셀룰로우즈를 분해하는 효소는 셀룰라아제(cellulase)이다. 이는 박

테리아(Bacteria)나 효모(fungi) 모두 생산이 가능한 효소이며, 중온

또는 고온, 호기성, 혐기성에 국한되지 않고 생산하며, 박테리아에서는

Clostridium, Cellulomonas, Bacillus, Thermomonospora,

Ruminococcus, Bacteriodes, Erwinia, Acetovibrio, Microbispora
그리고 Streptomyces 종에서 셀룰라아제를 생산한다. 혐기성 박테리

아에서 셀룰라아제를 생산하는 경우에는 효율이 좋지 않기 때문에 혐

기성 조건에서는 대부분 효모를 사용하고 있으며, 효모 중 셀룰라아제

를 생산하는 종들은 Sclerotium rolfsii, P. chrysosporium,

Trichoderma 종, Aspergillus, Schizophyllum 그리고 penicillium이
다.

- 35 -
Figure 2.8. Steps involved in the enzymatic hydrolysis of
cellulose

셀룰라아제는 복합효소이며, endoglucanase(EC 3.2.1.4),

exoglucanase (EC 3.2.1.91) 및 β-glucosidase(EC3.2.1.21) 등의 3

가지 효소로 구성되어 있으며, 이들 효소는 기질의 활동도 특성에 따

라 각각 CMCase, Avicelase 및 PNPGase로 구분되기도 한다.

이러한 셀룰라아제의 가수분해 단계는 Fig 2.8에 나타내었다. 반응

단계는 먼저 1) endoglucanase(EG, endo 1,4-D-glucano-

hydrolase 또는 EC 3.2.1.4 효소가 셀루로우즈 섬유의 연결고리들을

분해한 후 2) exoglucanase 또는 cellobiohydrolase(CBH, 1,4-β

-D-glucan cellobiohydrolase, 또는 EC 3.2.1.91.) 가 연결고리가 포

함하고 있는 셀로비오제(cellobiose) 결합들을 제거하고, 3) β

-glucosidase(EC 3.2.1.21)가 cellobiose에서 glucose로 전환시키는

과정을 거치게 된다. 셀룰라아제 중 헤미셀룰로우즈를 분해하는 효소

들은 glucuronidase, acetylesterase, xylanase, β-xylosidase,

galactomannanase 그리고 glucomannanase 들이 있다.

효소가수분해시 효소의 주입량을 높게 할 경우, 높은 분해효율 및

반응시간이 단축되지만, 이에 따라서 공정의 비용이 증가하게 된다.

효소를 사용하는데 있어서 단일효소를 사용하기도 하지만, 때에 따라

30-32)
서는 이러한 개별효소들을 혼합하여 사용하기도 한다 . T. reesei

- 36 -
의 셀룰라아제 반응에 β-glucosidases를 주입하여 당화시키는 경우

β-glucosidases를 주입하지 않은 것에 비해 전환효율이 높게 나왔으

며, 이는 β-glucosidase가 셀룰라아제의 활성도를 저해하는
31,32)
cellobiose를 가용화 시키기 때문이라고 보고되었다 . 그리고 또한

셀룰라아제와 헤미셀룰라아제 또는 펙티나아제(pectinases)로써 A.

ustus와 T. viride를 혼합하여 사용하는 경우에는 바이오매스에서 셀

33)
룰로우즈로의 전환효율이 약 90%정도를 보고된 바 있다 .

이러한 효소가수분해를 사용하는 경우에는 효소의 사용량에 따른

공정의 비용이 높아지므로 반응기의 고형잔재물에 포함되어 있는 효소

를 재사용하기 위해 회수를 해야 하며, 기존 문헌에 따르면 상업용 효

소인 Celluclast와 Novozym을 사용하여, 5단계의 회수공정을 이용하

여 recycling에 성공한 바 있다34).

셀룰라아제의 활성도는 cellobiose에 의해 저해되며, 이러한

inhibition을 막기 위해서 효소의 농도를 높게 사용한다거나, β

-glucosidase를 첨가하거나, 반응기에 분리막을 연결하여 당을 제거하

는 방법들을 사용하였으나, 최근에는 simultaneous saccharification

and fermentation(SSF) 공정을 사용하여 이러한 문제점을 해결하고

있다.

- 37 -
 3.4. 에탄올발효(Ethanol Fermentation)

에탄올 발효는 분리당화발효공정(separate hydrolysis and

fermentation, SHF)과 동시당화발효공정(simultaneous sacchari-

fication and fermentation, SSF)로 나누어지게 된다.

Figure 2.9. Schematics of separate hydrolysis and fermentation

(SHF) process and simultaneous saccharification and

fermentation (SSF) processes

분리당화발효공정은 당화공정(saccharification)과 에탄올발효

(ethanol fermentation)공정을 각각 다른 반응기에서 수행하는 것으로

당화과정과 발효과정 각각에 반응하는 효소와 에탄올발효미생물에 최

- 38 -
적의 조건에서 반응시킬 수 있다는 장점이 있다. 하지만 분리당화발효

공정은 당화공정과 발효공정을 따로 하여 당화공정에서의 셀룰라아제

의 중간생성물과 최종생성물인 cellobiose와 glucose가 반응기내에 축

적됨에 따라 효소의 활성도에 inhibition에 따른 문제로 인해 반응이

종결된다는 단점이 있다. 이를 위해서는 cellobiose를 분해하는 β

-glucosidase를 추가적으로 주입하는 방법과 효소의 농도를 높게 하

는 방법, 그리고 반응기에 분리막을 설치하여 glucose를 제거하는 방

법들을 사용하였으나, 이는 공정의 비용이 비싸기 때문에 경제적이지

않다. 하지만, 동시당화공정은 당화공정과 발효공정을 동시에 함으로

써 효소가 바이오매스를 당화시켜 단당류가 생성되면, 에탄올 발효미

생물이 생성된 당을 사용하여 에탄올을 생산하게 되어 반응기에 글루

코우즈의 축적을 최소화 할 수 있다. 동시당화발효공정의 이상발효공

정과 비교시 이점들은 (1) 셀룰라아제의 활성도가 저해되지 않으므로

효율이 증가하며, (2) 효소사용량이 낮고 (3) 최종산물로의 전환 효율

이 높으며, (4) 생산된 글루코우즈를 바로 에탄올로 전환되기 때문에

이에 따른 멸균의 필요도가 적고, (5) 반응시간이 짧으며 그리고(6) 한

개의 반응기를 사용하기 때문에 반응기의 사이즈가 작아진다는 것들이

있다.

그러나, 동시당화발효공정의 경우 몇 가지 문제점들을 수반하게

된다. 첫 번째로는 온도에 따른 문제점으로써, 당화효소와 에탄올생산

미생물의 최적온도가 다르다는 점이다. 당화효소의 경우 45∼50℃의

온도에서 최적의 활성도를 나타내며, 에탄올생산미생물의 경우 30℃에

서 최적의 활성도를 나타내므로, 온도제어에 따른 공정의 문제점을 수

반하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 동시당화발효공정의 온

도를 약 38℃로 하여 당화와 발효의 반응에 관여하는 효소 및 미생물

에 저해가 없도록 하여 T. reesei와 S. cerevisiae를 이용하여 연구가

- 39 -
진행되었으며, Kluyveromyces marxianus와 K. fragilis를 이용하여

약 42℃에서 실험하여 0.5g ethanol/g cellulose를 생산한 결과도 보

고되어 지고 있다35). 이러한 온도에 대한 문제점의 해결책중 하나로써

에탄올생산미생물의 형질을 개량하여 고온내성 에탄올생산미생물을 만

36)
드는 연구가 진행되어왔다 .

두 번째 문제점으로는 생산되는 에탄올로 인해 에탄올생산미생물

과 당화효소의 활성도에 저해를 준다는 점이다. 이러한 문제는 생산되

는 반응기에서 바로 분리(separation) 및 추출(extraction)하는 방법으

로 처리 가능하다. 에탄올 추출공정은 vacuum, gas-stripping,

membrane 그리고 liquid extraction 등의 방법들이 공정에서 사용되

어 지고 있으며, 그 중 gas-stripping은 공정에 지속적으로 가스를 주

입하여, 휘발성이 높은 에탄올을 반응기 밖으로 추출 후 콘덴서를 연

결하여 이를 포집하는 방법으로 이를 이용하여 에탄올을 반응기에서

분리하여, 미생물 및 효소의 활성도에 저해를 없애도록 한다. 또한 효

소 및 에탄올생산 미생물에 에탄올 내성 형질을 개량시키는 연구와 고

가의 효소 사용량 절감과 고농도의 에탄올 생산을 위해 당화 및 발효

를 동시에 수행할 수 있는 재조합미생물 등을 획득하기 위해 선진국에

서는 지속적인 연구가 수행되어 지고 있다.

- 40 -
Ⅲ. 실험방법

1. 실험 재료 및 분석방법

1.1 음식물쓰레기

바이오에탄올 생산의 기질로 사용된 음식물쓰레기는 서울산업대학교

내에 있는 테크노파크 구내식당으로부터 채취하여 가정용 믹서기로 파

쇄하여 사용하였다. 음식물 쓰레기 성상은 Table 3. 1과 같다.

Table 3.1. Characteristic of food wastes used in the present

study

Alkalinity SCODcr TCODcr

pH VS (mg/L) TS (mg/L)
(mg/L) (mg/L) (mg/L)
4.5 0.1 130,000 163,000 62,000 150,000
~4.8 ~0.3 ~138,000 ~190,000 ~98,000 ~180,000

1.2 가수분해 효소

음식물 쓰레기의 가수분해 효소는 Viscozyme L, Spirizyme Plus

FG, Novozym 342, Alcalase 2.5L과 Carezyme 900T를 사용하였으

며, 모두 한국 Novozyme사로부터 구입하였다.

Viscozyme L는 Aspergillus aculeatus 유래 다중복합효소로서

arabanase, cellulase, β-glucanase, hemicellulase, xylanase 등을

포함하는 광범위 carbohydrases의 한 종류이며, 최적 활성 조건은

- 41 -
pH 3.3 - 5.5, 25 - 55 ℃이다. Spirizyme Plus FG는 Aspergillus

niger 유래 1,4-alpha-D-glucan-glucohydrolase이다. 이 효소는 액

화된 starch 함유하고 있으며 그중 1,4- 및 1,6-alpha 결합을 가수분

해하며, 발효를 위해 분쇄된 곡류의 당화에 사용되는 효소의 일종이

다. 최적 활성 조건은 pH 4.2 - 4.6, 60 - 63 ℃ 이다. Alcalase

2.5L은 Bacillus 유래 protease이며, Novozym 342과 Carezyme

900T는 각각 Humicola insolens와 Aspergillus에서 유래된 cellulase

로써 효소들의 세부적인 특성은 Table 3.2에 나타내었다.

- 42 -
Table 3.2. Characteristics of various enzymes used in the

present study

product type of application and

activity origin
name enzyme remark
Brewing industry
Fruit water
viscozyme 80 Aspergillus treatment
carbohydrase 1
L FBG /g group Cell-wall
degrading
enzymes
Hydrolysis of
starch
Spirizyme 400 Aspergillus Liquefaction of
glucoamylase 2
Plus FG AG /g niger starch
Saccharification of
grains
Novozym 90 Humicola
cellulase 3
342 EGU /g insolens
detergent
2.5 formulations to
Alcalase
protease AU_A5/ Bacillus remove
2.5L
g protein-based
strains

1, 2, 3, 4 and 5 indication the unit of glucoamylase, cellulase, protease and

complex carboohydrases activity that the amount of enzyme liberates 1㎕ mol of

product(glucose etc.) for 1 min from maltose, β-glucan and another compounds
, respectively

- 43 -
1.3 에탄올 생산 균주

본 연구에서 사용된 에탄올 생산 균주는 mesophilic organism으로

Saccharomyces cerevisiae (ATCC NO.13007), Thermophilic

organism으로 Thermoanaerobacter ethanolicus (ATCC NO.31550)

를 사용하였으며, 한국종균협회로부터 분양 받았다. S. cerevisiae는

YM broth에서 배양하였으며, 배지 성분은 표 3.3과 같고, shaking

incubator에서 30℃, 150 rpm으로 배양하였으며, T. ethanolicus는

표 3.4와 같은 배지에서 60℃, 150 rpm으로 배양하였다.

Table 3.3. Pre-culture medium (S. cerevisiae)

Yeast extract 3.0 g

Malt extract 3.0 g
Peptone 5.0 g
Dextrose 10.0 g
Distilled water 1.0 L

Table 3.4. Pre-culture medium (T. ethanolicus)

Tryptone 10.0 g
Sucrose 10.0 g
Yeast extract 2.0 g
FeSO4·7H2O 0.2 g
NaS2O3 0.2 g
NaS2O3·5H2O 0.08 g
Resazurin 0.001 g
Distilled watere 1.0 L

- 44 -
1.4 분석 방법

글루코즈와 에탄올 분석을 위한 모든 샘플은 4,000 rpm에서 15분

간 원심분리 후 0.45 ㎕ syringe filter로 필터링하여 분석하였다. 글

루코즈는 ELSD가 장착된 High Performance Liquid

Chromatography(HPLC Acme 9000, Younglin, KOREA)를 이용하

여, 이동상 75% acetronitrile 용액을 1.5 ml/min , 시료 주입량은 20

㎕를 주입하였다. 검출기의 evaporator와 nebulizer는 Nirogen으로

분사해주었으며, 오븐 온도는 35 ℃ 조건에서 분석하였다. 에탄올 분

석은 FID가 장착된 Gas Chromatograph(GC 6000series, 영린기기,

Korea)을 이용하여 측정하였고, 분석조건은 Table 3.5에 나타내었다.

그리고 미생물생장을 간접적인 지표로 나타내는 OD(optical density)

분석은 660 nm에서 UV/VIS spectophotomer(Optizen 2120,

Mecasys, KOREA)를 이용하였다.

Table 3.5. Gas chromatographic condition for ethanol analysis

Detector FID (Flame Ionization Detector)

Innowax
Column
(Agilent, 30m×0.25㎜, ID, 0.25㎛)
Carrier gas Helium (1.0㎖/min)

Oven temp. 45℃

Detector temp. 240℃

Injector temp. 220℃

Injection volume 1㎕

- 45 -
2. 실험방법

2.1. 음식물쓰레기의 가수분해효소를 이용한 당화

효소 Viscozyme L를 이용한 음식물쓰레기 가수 분해 실험은 음식

물쓰레기 200 g, buffer 용액 (pH 4.5) 100 ml, 온도 30 ℃에서 실

험하였으며, 이때 Viscozyme L의 농도는 0.1%, 0.5%, 1.0%, 5.0%,

10.0% (0.8, 4.0, 8.0, 31.8, 79.6 FBG/g-dry food waste)가 되도록

주입하였다. 실험은 그림 3. 1과 같이 batch형태로 12시간 동안 진행

하였다.

Figure 3.1. Schematic of enzymatic hydrolysis from food wastes

experiment (batch type)

- 46 -
 2.2. 에탄올 생산 균주 선별

효소를 이용하여 당화된 음식물쓰레기를 기질로 이용하는 실험에

앞서 에탄올생산 균주 2종을 선별하여 각 균주에 맞는 최적 배지를

이용, 에탄올생산량을 확인하고자 하였다. 에탄올 생산균주는 yeast로

써 Mesophilic organism인 Saccharomyces cerevisiae(ATCC

No.13007)과 bacteria로써 Thermophilic organism인
Thermoanaerobacter ethanolicus(ATCC No.31550) 2종을 한국종균
협회로부터 분양받아 사용하였다. S. cerevisiae는 표 3. 3과 같은

YM broth배지를 이용하여 30 ℃, 150 rpm 조건의 shaking

incubator에서 이틀간 배양 후 표 3. 6과 같은 fermentation medium

에 접종하여 배양과 같은 조건으로 실험을 진행하였으며, T.

ethanolicus는 배양용 배지와 에탄올생산용 발효배지 모두 표 3. 5와
같은 배지를 사용하여, 60℃, 150 rpm에서 실험을 진행하였다. 2종

모두 실험 전 serum병에 접종하여 nitrogen으로 serum병을 충분히

치환 후 혐기상태에서 24시간 batch 형태로 실험하였다.

Table 3.6. Composition of fermentation medium(S. cerevisiae)

Glucose 10.0 g
Yeast extract 0.5 g
Peptone 0.5 g
KH2PO4 0.1 g
MgSO4·7H2O 0.1 g
Distilled water 0.1 L

- 47 -
 2.3. 염분농도에 의한 Saccharomyces cerevisiae의
inhibition

본 연구에서 최종적인 기질로 이용하는 음식물쓰레기는 우리나라의

음식문화 특성상 염분농도가 높다는 특징(1.9∼2.2%)을 가지고 있다.

이로 인해 음식물쓰레기를 기질로 이용하여 에탄올을 생산하는 경우

염분농도에 의해 에탄올생산균주의 에탄올생산량에 미치는 영향 평가

는 필수적이며, 이를 확인하고자 하였다.

에탄올생산균주는 S. cerevisiae(ATCC No.13007)을 이용하였으

며, 앞선 에탄올생산균주 선별실험과 동일한 fermentation medium을

이용하여 같은 조건에서 실험을 진행하였다. 염분농도를 달리하기 위

해 각각의 샘플에 NaCl의 농도를 각각 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 10.0, 15.0

%(V/V)로 주입하였고, NaCl을 미주입한 대조군과 함께 비교실험을

진행하였다.

- 48 -
 2.4. 효소를 이용한 음식물쓰레기의 당화

(Saccharification) 후 에탄올생산

음식물쓰레기를 이용하여 효소와 에탄올생산균주를 동시에 접종하

는 동시당화공정(Simultaneous Saccharification and Fermentation)

을 사용하기 이전에 음식물쓰레기에 효소를 이용하여 당화

(Saccharification) 후 에탄올생산균주를 반응기에 접종(innoculation)

하여 에탄올생산을 확인하고자 하였다.

음식물쓰레기의 당화과정에 사용된 효소는 앞선 음식물쓰레기를 이

용한 당화방법에서 효율이 높았던 Viscozyme L을 이용하였고, 에탄

올 생산균주는 에탄올생산균주 선별 실험에서 에탄올생산 효율이 높았

던 Saccharomyces cerevisiae(ATCC No.13007)를 이용하였다. 실험

에 사용된 반응기는 그림 3.2와 같으며 본 장치는 유리재질 원형실린

더 형태의 발효조로 제작하였다, 총 용량은 5 L이며, 발효조 내부에는

음식물쓰레기와 효소 및 에탄올생산균주가 잘 혼합될 수 있도록 교반

기를 설치하였고, pH를 유지시켜주기 위한 pH controller를 설치하였

다. 에탄올 생산 시 발생하는 이산화탄소를 바로 배출 할 수 있도록

콘덴서를 연결하였고 콘덴서 말단에는 wet gas meter를 설치하여 반

응기내에 이산화탄소가 생산되는 즉시 배출되고, 반응기 안쪽으로는

어떠한 가스상 형태의 물질들이 유입될 수 없도록 하였다. 최적의 pH

를 유지하기 위하여 3N KOH와 3N HCl을 사용하였으며, 반응기 내

의 온도를 일정하게 유지시켜 주기 위하여 반응기 외부에 이중쟈켓을

설치한 후 항온조를 이용하였다. 실험 시작 전에는 N2로 pursing하여

반응기 내부에 산소를 제거하여 혐기성 상태에서 실험을 진행하였다.

- 49 -
Figure 3.2. Schematic of ethanol fermentation reactor

교내식당에서 채취한 음식물쓰레기는 가정용 믹서기를 이용하여 파

쇄 후 autoclave를 이용하여 120℃에서 20분간 멸균하여 사용하였다.

이는 당화공정 시 음식물쓰레기 당화 후 생산된 최종산물인 glucose

는 실험실 및 음식물쓰레기에 존재하는 발효균주 들에 의해 쉽게 사용

되어 지기 때문에, 음식물쓰레기에 존재하는 탄수화물의 glucose 전환

량을 정확히 확인하기 위하여 음식물쓰레기를 멸균 후 사용하였다. 이

후 멸균된 음식물쓰레기 1,500 g 과 pH 5.0 phosphate buffer

solution 1,170ml 그리고 당화효소로써 viscozyme L 30 ml을 혼합

하여 working volume 2,700 ml로 하였으며, pH는 pH controller를

이용하여 4.5 - 5.0을 유지시켰고, 온도는 36℃의 중온으로 하여 S.

- 50 -
cerevisiae에 온도에 따른 inhibition이 없도록 하였다. 그리고 교반속
도는 160 rpm으로 혼합된 시료가 적절하게 섞이도록 하여 N2

pursing 이후에 실험을 진행하였다. 이후 glucose를 분석하여, 분석된

glucose가 더 이상 증가하지 않는 시점을 음식물쓰레기의 glucose 최

고전환량이라 판단하고 이때, 에탄올생산균주로써 2틀간 배양된 S.

cerevisiae를 working volume에 10%가 되도록 주입하여 ethanol생

산량을 확인하였다.

- 51 -
 2.5. 음식물쓰레기를 이용한 동시당화공정에서의 효소주

입량과 에탄올생산

동시당화는 음식물쓰레기를 글루코즈로 당화시키는 효소와 글루코

즈를 이용하여 에탄올을 생산하는 에탄올 생산균주를 동시에 접종하

여, 효소에 의해 전환되는 글루코즈가 반응기 내에 축적되지 않고 에

탄올생산균주가 즉시 사용함으로써 효소에 최종생성물인 글루코즈로

인한 inhibition을 줄이면서 에탄올의 생산량을 높이는 방법이다. 결국

이 방법은 가수분해효소와 에탄올생산균이 반응기 내에 공존하게 되므

로, 본 실험에서는 효소의 주입양에 따라서 에탄올생산균주에 어떠한

영향을 미치며, 이로 인한 에탄올의 생산량을 확인하기 위한 실험이

다.

음식물쓰레기의 당화과정에 사용된 효소는 Viscozyme L을 이용하

였고, 에탄올 생산균주는 S. cerevisiae를 이용하였다. 실험에 사용된

반응기는 Fig 3.1과 같은 500ml 갈색시약병을 사용하였으며, 음식물

쓰레기는 가정용 믹서기를 이용하여 파쇄 후 autoclave를 이용하여

120℃에서 20분간 멸균하여 사용하였다. 이 후 멸균된 음식물쓰레기

200 g과 에탄올 생산균주로써 S. cerevisiae를 working volume의

10%, pH 5.0 phosphate buffer solution 그리고 가용화효소로써

viscozyme L을 각각 0.1%, 0.5%, 1.0%, 5.0%, 10.0%로 주입하여

total volume을 300 ml로 하였다. 각 샘플들은 36℃, 150 rpm의

shaking incubator에서 실험을 진행하였으며, 실험 시작 전에는 N2로

pursing하여 반응기 내부에 산소를 제거하여 혐기상태를 유지하도록

하였고, 이와 비교하기 위하여 viscozyme L이 주입되지 않은 샘플을

대조군으로 하였다.

- 52 -
2.6. 동시당화공정을 이용한 음식물쓰레기의 에탄올생산

음식물쓰레기에 효소와 에탄올생산균주를 동시에 주입하여 당화와

에탄올 발효가 한 개의 반응기에서 이루어지도록 하였다. 반응기는 그

림 3.2에 모사된 발효기를 이용하였으며, 멸균된 음식물쓰레기 1,500

g 과 pH 5.0 phosphate buffer solution 1,170 ml, 가용화효소로써

viscozyme L 30 ml (1%(V/V)) 그리고 에탄올생산균주로써 배양된

S. cerevisiae 300 ml 을 혼합하여 working volume 3 L로 하였고,

pH는 pH controller를 이용하여 4.2∼4.5를 유지, 온도는 36℃의 중
온으로 하여 S. cerevisiae에 온도에 따른 inhibition이 없도록 하였

다. 그리고 교반속도는 160 rpm으로 혼합된 시료가 적절하게 섞이도

록 하여 N2 pursing 이후에 실험을 진행하였다.

- 53 -
Ⅳ. 결과 및 고찰

1. 음식물쓰레기의 가수분해효소를 이용한 당화

일반적으로 음식물쓰레기는 다양한 종류의 고분자 당류 (poly

-saccharide), 이당류(di-saccharide) 등을 포함하고 있다. 이는 곡류,

야채 및 과일 등으로부터 기인한 것이며, 이로 인해 기질로 사용되는

음식물쓰레기를 에탄올 생산균주가 이용하는 단당류(mono-

saccharide)로 전환하는 과정인 당화(saccharification)가 필수적이다.

당화과정은 바이오에탄올생산 공정중 rate limiting step으로 가장 중

요한 부분이다. 본 실험에서는 음식물쓰레기의 당화를 위해, 전분질계

를 단당류로 전환하는 glucoamylase(Spirizyme plus FG)와 섬유질계

를 단당류로 전환하는 cellulase(Novozym 342) 그리고 전분질계와

섬유질계를 포함하는 탄수화물을 단당류로 전환하는

carbohydrase(Viscozyme L)와 단백질을 분해하는 protease

(Alcalase 2.5L)를 사용하였으며, 이에 대한 결과를 Fig 4.1에 나타내

었다.

- 54 -
Figure 4.1. Glucose production from food wastes using various

enzymes

carbohydrase와 glucoamylase의 경우 cellulase와 protease에 비

해 높은 글루코즈 전환율을 나타내었으며, 각각 0.52, 0.48 g

glucose/g dry food waste의 생산량을 확인하였다. 이에 비해

cellulase와 protease의 경우 낮은 글루코즈 전환량을 나타내었다. 이

는 음식물쓰레기의 성상에 기인한 것으로 사료된다. 본 실험에 사용된

음식물쓰레기는 성상분석 결과 단백질(5.9%), 조섬유(1.2%), 조지방

(4.2%), 총당(3.5%), 탄수화물(9.1%) 그리고 나머지는 물을 함유하고

있었으며, 전분질계는 총탄수화물에서 조섬유와 총당의 성분을 제외한

- 55 -
4.4%로 구성되어 있었다. 이로 인해 성분 중 상대적으로 많은 양을

차지하고 있는 당, 전분질, 탄수화물로 인해 이를 주 촉매반응의

target으로 하는 carbohydrase와 glucoamylase를 사용한 경우 높은

생산량을 나타낸 것으로 사료된다. cellulase의 경우 섬유소에 촉매반

응을 하여 glucose로 전환되게 되는데, 앞선 carbohydrase와

glucoamylase가 주 촉매반응을 일으키는 당, 전분질, 탄수화물에 비

해 낮은 양을 포함하고 있으며, 이로 인해 cellulase를 사용한 경우 낮

은 glucose전환양을 나타내었다. carbohydrase의 경우 소량의

cellulase와 glucoamylase를 포함하고 있어, 가장 높은 생산량을 나타

낸 것으로 사료된다. 또한, 단백질은 가수분해 될 경우 최종산물은 대

37,38)
부분 amino acid과 peptide이며 , 지방의 경우는 fatty acid로 분

해되게 된다. 결국, 에탄올생산균주는 mono-saccharide(glucose 등)

를 이용하여 에탄올을 생산하게 됨으로 단백질과 지방의 최종 가수분

해산물은 본 연구에는 사용되어지지 않는다. 또한, lipid는 다른

biorefinery공정을 통해 vanilin과 같은 aromatic compound로 전환하

여 인간에게 유용한 chemical product로써 사용 가능할 것으로 판단

39)
된다 .

- 56 -
Table 4.2. Glucose production from food wastes using mixed
enzymes

개별효소실험에 이어 각각의 효소들을 혼합하여 사용함으로써 음식

물쓰레기의 글루코즈 생산량을 확인한 결과를 Table 4.2에 나타내었

다. 앞선 개별효소실험결과 carbohydrase와 glucoamylase를 독립적

으로 사용하여 약 0.5 g glucose/g dry food waste를 생산한데 반해

혼합된 효소를 사용한 경우 더 높은 글루코즈 생산량을 확인할 수 있

었다. 이는 음식물쓰레기의 성상과 효소가 특정 물질에만 반응하는 특

성에 기인한 것으로 사료된다. 음식물쓰레기가 포함하고 있는 총탄수

화물 중 각각의 효소들이 반응할 수 있는 물질들은 제한적이다. 앞서

언급했듯이 starch를 분해하는 glucoamylase, cellulose를 분해하는

- 57 -
cellulase 그리고, carbohydrase는 starch와 cellulose도 소량 분해가

능하며 이외의 기타 carbohydrate를 분해가능하기 때문에 개별적으로

사용하는데 있어서는 음식물쓰레기의 다양한 구성성분 중 일부분에 촉

매반응을 하게 되어 제한적인 글루코즈 생산량을 나타낸다. 이에 반해

효소를 혼합한 경우 개별효소에서 반응하지 않았던 carbohydrate를

같이 접종되어진 다른 효소가 분해하게 되어 개별효소의 글루코즈 생

산량에 추가적으로 글루코즈가 생산되어 결과적으로 글루코즈 생산량

이 높아진 것으로 사료된다. 또한, protease와 glucoamylase,

carbohydrase를 혼합한 경우 가장 높은 glucose생산량을 나타내었는

데, 이는 음식물쓰레기에 포함되어 있는 탄수화물은 탄수화물 독립적

인 상태로 존재하기도 하지만, 단백질과 결합되어 존재하는 경우도 다

수 존재하기 때문에40), 글루코즈 생산량을 높이기 위해서는

poly-saccharide만을 가수분해하는 효소를 사용하는 것 이외에

protease를 추가하여 단백질과 탄수화물이 결합되어 있는 구성성분을

분해하여야 하며, 결국, 본 실험 결과에서는 기존 개별효소에서 글루

코즈 생산량이 가장 높았던 glucoamylase와 carbohydrase를 사용한

경우가 protease 추가주입으로 인해 다른 혼합효소들에 비해 높은 글

루코즈의 생산량을 나타낸 것으로 사료된다.

- 58 -
Figure 4.3. Glucose production from food wastes of various

carbohydrase(Viscozyme L) dosages

Fig 4.3은 앞선 효소를 이용한 당화실험 중 개별효소 실험에서 글

루코즈 전환율이 가장 높았던 Viscozyme L의 주입농도에 따른 글루

코즈 생산량을 나타낸 결과이다. 실험진행 초기에 글루코즈는

Viscozyme L의 농도가 5, 10%일때 가장 빠르게 생산되었지만, 12시

간 후의 글루코즈 생산량은 1% Viscozyme L이 18.316g, 5%

Viscozyme L이 18.054g, 10% Viscozyme L이 21.312g으로 1%와

5%의 효소 주입은 큰 차이를 보이지 않았다. 이때 음식물쓰레기의 수

분함량이 약 81.9%로 건조 음식물쓰레기 기준 글루코즈 생산량은,

Fig 4.4와 같이 Viscozyme L 주입 농도 10%에서 0.56 g glucose /

- 59 -
g dry food waste, 5%에서 0.48 g glucose/g dry food waste, 1%

에서 0.48 g glucose/g dry food waste를 생산하였다.

Figure 4.4 Total glucose production from food wastes of various

carbohydrase(Viscozyme L) dosages

결국 효소의 주입량은 효소의 역가와 관련이 있으며, 주입량이 많

을수록 초기에는 높은 yield로 최종산물로 전환시키지만, 이후 효소의

반응물이 부족하게 되어 더 이상 반응이 되지 않게 된다. 효소주입량

이 낮은 경우에는 효소주입량이 높은 경우에 비하여 초기 글루코즈 전

환량이 낮으나, 이후에도 지속적인 반응을 통해 최종적으로는 효소주

입량이 높은 샘플들과 비슷한 글루코즈 생산량을 나타내게 된다. 결국

효소주입량은 반응물의 양과 효소의 역가와의 관계이며, 이는 최종산

- 60 -
물을 생산하는 시간과 관계된다. 에탄올생산공정에서의 효소주입량이

높을 경우 glucose생산량이 높아지게 되어 반응기내에 다량의 글루코

즈가 축적되게 되며, 이는 효소의 최종생산물에 의한 inhibition과 이

후에 에탄올생산균주가 이용하는데 있어서 substrate inhibition으로

41-46)
작용을 초래할 수도 있다 .

또한, 효소의 높은 가격으로 인해 효소의 주입량이 높을 경우 에탄

올 생산공정 전반에 높은 가격상승을 초래하게 되므로, 본 연구에서의

효소주입량은 약 1%가 적당할 것이며, control에서는 글루코즈 생산

이 거의 없는 것으로 보아, 본 실험에서 효소의 주입은 필수적인 것

으로 사료된다.

- 61 -
 Glucoamylase(Spirizyme Plus)는 고온(60-63 ℃)에서 최적 활성

조건을 갖고 있다. 따라서 Carbohydrase(Viscozyme L)와 비교 시,

글루코즈 생산량과 반응속도가 우수할 것으로 사료되었으나, 결과는

Fig 4.5와 같이 예상과 다르게 나타났다.

Figure 4.5 Total glucose production from food wastes of various

glucoamylase(Spirizyme plus) dosages

Spirizyme Plus 효소량을 30 ml (10%) 주입하여, 약

0.43g-glucose/g-dry food waste를 생산하였으나, 이는 Viscozyme

L에 비하여 당화율이 떨어지는 것으로 나타났다. 이는 음식물쓰레기

성상이 기인한 것으로 사료된다. 즉, Viscozyme L은 복합

carbohydrase로 음식물쓰레기의 중의 대부분 탄수화물을 글루코즈로

당화시킨 것으로 사료되고, Spirizyme Plus의 경우 탄수화물 중의 다

- 62 -
당류 및 전분질계가 많이 부족하여 glucoamylase가 높은 당화율을 보

이지 못한 것으로 판단된다.

- 63 -
2. 에탄올 생산 균주 선별

본 연구는 효소를 이용하여 당화가 진행된 음식물쓰레기에서 에탄

올을 생산하여야 하지만, 먼저 미생물의 에탄올 생산 수율을 알아보

고자 발효 배지를 만들어 Saccharomyces cerevisiae를 접종하여 실

험하였다. S. cerevisaie를 이용하여 에탄올 생산 시 미생물의 물질대

사 과정을 살펴보면, 1 g 글루코즈로부터 에탄올이 0.511 g, CO2가

29)
0.489 g 생산이 가능하다고 보고되어 지고 있다 .

Figure 4.6 Ethanol production using S. cerevisiae in medium

batch cultivations

본 실험결과에서는 Fig 4.6과 같이 S. cerevisiae의 에탄올 수율

- 64 -
은 0.47 g ethanol/g glucose/day로 글루코즈로부터 생산할 수 있는

에탄올 이론값에 상당히 근접함을 알 수 있었다. 글루코즈로부터 에탄

올 생산시, 글루코즈는 일정한 경향으로 서서히 감소하였으며 에탄올

의 경우 실험시작 6시간동안은 조금씩 증가하다가 12시간을 기점으로

급격히 생산량이 증가하는 것으로 나타났다. 이와 같은 실험은 글루코

즈를 바탕으로 얻은 결과로, S cerevisiae의 기질로 사용 될 음식물쓰

레기의 경우, 효소에 의한 당화가 먼저 선행되고 그 다음 발효과정을

통하여 에탄올이 생산될 것으로 판단되므로 유도기(lag phase)는 더

길어질 것으로 사료된다.

- 65 -
Figure 4.7 Effect of OD and pH changes during the ethanol
fermentation using S. cerevisiae

Fig 4.7은 S. cerevisiae를 이용하여 글루코즈로부터 에탄올 생산

시 미생물생장을 간접적으로 나타내는 지표인 OD값 및 pH변화를 나

타낸 것이다. OD값은 약 4시간을 전⋅후해서 대수성장기(expotential

phase)를 거쳐, 실험시작 후 8시간동안 급격히 증가하였으며, 약 8시

간을 전⋅후해서 정체기(stationary phase)를 나타내었다. pH는 실험

이 경과 되면서 다소 떨어지는 경향이 있었으나, 실험시작 5시간이 경

과하면서 pH 4.5에서 거의 일정함을 유지하였다.

- 66 -
Figure 4.8 Ethanol production using T. ethanolicus in medium

batch cultivations

앞선 mesophiic condition인 S. cerevisiae의 연구와 비교하기 위

해, thermophillic organism으로써 T. ethanolicus를 이용하여

ethanol생산량에 대한 실험을 진행하였으며, 이를 Fig 4.8에 나타내었

다. 문헌에 따르면 에탄올을 생산하는 고온미생물들 중 T.

ethanolicus가 에탄올 생산이 높으며 또한 바이오매스에 따른 에탄올
전환율이 높기 때문에 이 종을 선택하였다47,48). 기질로써는 앞선 연구

에서 사용한 glucose 대신 sucrose를 이용하였다. sucrose는

disaccharide이며 6탄당의 중합체로써 glucose와 fructose로 가수분

해된다. 일반적으로 T. ethanolicus의 배양시 사용하는 배지에서의 탄

- 67 -
소원을 그대로 유지하여, 실험 시 T. ethanolicus의 기질이용에

inhibition을 주지 않으면서 ethanol의 생산량을 확인하기 위하여

sucrose를 사용하였다. 실험시작 후 초기에 sucrose는 일정한 속도로

감소하는 경향을 보였으며, 에탄올은 약 6시간 이후부터 생산량이 증

가하였다. 이후 약 38시간이 경과한 후 부터는 sucrose의 감소가 서

서히 이루어졌고 에탄올의 생산량 또한 서서히 감소하는 모습을 나타

내었으며, sucrose당 ethanol전환율은 약 0.38g ethanol/g sucrose로

써 앞선 연구인 S. cerevisiae의 기질로써 이용된 glucose와 같은 양

의 6탄당 복합체인 sucrose를 사용하였음에도 불구하고 낮은 ethanol

생산량을 나타내었다.

T. ethanolicus의 ethanol생산에 걸리는 반응시간은 S.

cerevisiae에 비해 더 오랜 시간이 필요하였다. 실험 전 T.
ethanolicus의 생장온도가 50∼60℃인 고온으로써 중온성미생물의 생
장온도에 비해 높은 온도이며 이로 인해 미생물의 생장 및 대사가 촉
진되어 반응시간이 짧을 것으로 예상하고 진행하였으나, 이와는 반대

로 오히려 S. cerevisiae의 경우에서 짧은 반응시간에 ethanol을 생산

할 수 있었다. 또한, 실험시작 약 38시간 경과 후에는 기질인

sucrose의 소비량이 줄어드는 양상을 보였는데, 이는 T. ethanolicus

가 기질로써 6탄당을 사용하는데 있어서, 기질이용성에 제한적인 모습

으로 사료된다. 기질로써 medium에 추가해준 sucrose는

disaccharide로써 이는 6탄당인 D-glucose와 D-fructose가 결합된

형태이며, 가수분해 시에는 6탄당의 최종산물이 생성된다. T.

ethanolicus는 일반적으로 5탄당과 6탄당을 모두 소비하는 종으로 알
려져 있다. 하지만, 최근 연구보고에 따르면 xylose를 기질로써 사용

하는 경우에 최적의 생장을 나타내며, 이에 비해 6탄당인 글루코즈를

49)
사용하는데는 5탄당에 비해 제한적이라고 보고되어지고 있으며 , 이

- 68 -
로 인해 S. cerevisiae의 실험에 경우 주입된 글루코즈를 모두 소비하

는데 반해, T. ethanolicus의 경우는 sucrose를 기질로써 이용하는데

있어서 제한적인 사용으로, 에탄올생산 이 종료된 것으로 사료된다.

본 연구에서 사용되는 우리나라의 음식물쓰레기는 전분질계와 당질

계 바이오매스가 대부분이다. 전분질계와 당질계 바이오매스가 함유하

고 있는 탄수화물 중 polysaccharide는 대부분 6탄당으로 당화되며,

목질계 바이오매스의 경우는 가수분해 최종산물로써 5탄당과 6탄당이

혼합되어 있다. 결국 T. ethanolicus는 음식물쓰레기와 같은 6탄당이

혼합되어져 있는 polysaccharide를 기질로써 이용하여 에탄올을 생산

하기에는 부적합하며, 목질계 바이오매스의 에탄올 생산에는 높은 효

율을 나타낼 것으로 사료된다. 또한 T. ethanolicus의 최적 pH는 약

7.5로써 음식물쓰레기의 낮은 pH로 인해 T. ethanolicus를 실제 공정

에 적용시에는 pH조정을 위해 다량의 염을 추가 주입하여야함으로 공

정 비용이 상승할 것으로 예상된다.

기존 연구에 따르면 T. ethanolicus는 S. cerevisiae에 비해서 높

은 기질농도에 민감하여, 높은 부하량의 기질을 이용할 경우에 에탄올

생산이 저조하다고 보고되고 있으며, 실제 플랜트에 이용하기 어렵고

48)
, 고온성 균주로써 낮은 ORP(-300mV이하)의 조건을 충족시키기

위해 혐기성공정을 제어해야 하므로 공정상의 컨트롤이 어렵다. 이에

반해 S. cerevisiae의 경우는 mild한 조건으로 인해 공정상의 문제점

이 없으며, 오래전부터 Saccharomyces종에 대한 연구가 진행되어졌

고, 실제 공정에서의 적용이 많다는 이점이 있다. 결론적으로 음식물

쓰레기를 이용한 에탄올생산공정에서의 에탄올생산균주는, 음식물쓰레

기의 낮은 pH와 높은 부하량에 적응이 가능하며, 공정의 컨트롤이 용

이한 S. cerevisiae의 사용이 타당하다고 사료된다.

- 69 -
 3. 염분농도에 의한 Saccharomyces cerevisiae의
inhibition

다음으로 상기실험과 동일한 조건하에 S. cerevisiae 발효 배지에

NaCl를 주입하여 염분농도에 따른 S. cerevisiae의 에탄올 생산 영향

평가 실험을 진행하였다. 우리나라의 경우 음식물쓰레기의 염분함량이

약 1.9-2.2%로, 염분농도가 S. cerevisiae의 에탄올 생산에 미치는

영향 평가는 필수적이라 할 수 있다.

Figure 4.9 Effect of ethanol production using S. cerevisiae on

various salt concentrations

Fig 4.9와 같이 NaCl의 농도를 각각 1%, 2%, 3%, 5% ,10%,

15%가 되도록 배지에 주입하고, 대조군과 함께 비교 실험한 결과,

- 70 -
NaCl의 농도가 높아질수록 S. cerevisiae의 에탄올 생산은 거의 이루

어지지 않았으며, 대조군과 1%, 2%에서 각각 에탄올 생산율이 0.502,

0.494, 0.481 g/g glucose로 거의 유사한 결과를 나타냈다. 이는 우

리나라 평균 음식물쓰레기의 염분농도(1.9-2.2%)에서는 S.

cerevisiae가 에탄올 생산시 거의 영향을 받지 않음을 의미하는 결과
라 할 수 있겠다. 즉, 음식물쓰레기를 기질로 사용할 경우 수세와 같

은 별도의 전처리 공정이 불필요함을 의미한다. NaCl 농도에 따른 S.

cerevisiae의 에탄올 생산 영향 실험시 pH변화와 OD 값을 Fig 4.10

에 나타내었는데, pH의 변화(점선)는 거의 없었고, OD값(실선)은 대조

군과 1%, 2%에서 주로 증가하는 경향이 있었으며, 또한 실험 전후의

NaCl 농도는 일정하였다.

Figure 4.10 Effect of OD and pH changes during ethanol

fermentation on various salt concentrations using S. cerevisiae

- 71 -
 4. 효소를 이용한 음식물쓰레기의 당화 후 에탄올생산

Figure 4.11 Ethanol production from enzymatic hydrolyzed food

wastes

Fig 4.11은 음식물쓰레기를 이용한 이상발효에서의 에탄올생산 실

험에 대한 결과이다. 먼저 음식물쓰레기에 효소를 이용하여

Saccharification 한 결과 실험시작 후약 17시간 이후에 glucose 전환

량이 최고치에 달했으며, 이때 글루코즈량은 0.83g glucose/g dry

food waste로, 이 시점이 반응기에 더 이상의 glucose로 전환될

carbohydrate가 존재하지 않거나 또는 효소의 가수분해로 인한 최종

산물생산에 따른 end product inhibition 이라고 사료되어 에탄올생산

균주인 S. cerevisiae를 접종하였다.

이후 glucose가 소모되기 시작하였고 접종시간으로부터 약 16시간

- 72 -
이후부터 에탄올의 생산이 이루어졌으며, 접종이후 약 31시간(총 실험

진행시간 48시간경과)부터는 ethanol의 증가가 보이지 않았으며, 또한

반응기에도 glucose가 남아있지 않았다. 이로 인해 S. cerevisiae가

음식물쓰레기로부터 당화된 모든 glucose를 이용하여 에탄올을 생산

한 것으로 판단되며, 최종 에탄올생산량은 0.51g ethanol/g dry food

waste을 나타내었다. S.cerevisiae 접종 후 에탄올 생산 시까지의 lag

phase가 이전실험인 glucose를 이용하여 에탄올을 생산한 실험한 6

시간의 lag phase에 비해서 길어짐을 알 수 있었는데, 이는 음식물쓰

레기가 포함하고 있는 염분농도와 당화된 glucose를 포함한

monosaccharide의 높은 부하량 등에 의한 것으로 사료된다. 본 실험

방법(Batch type)으로는 glucose생산에 의한 enzyme의 end product

inhibition과 생산된 ethanol의 반응기내 축적으로 인한 S.cerevisiae

의 inhibition을 확인 할 수 없었으며, 이를 위해서는 fed-batch 또는

CSTR형태로 feedstock을 추가 주입하여 ethanol의 생산량을 더 늘리

는 방법을 선택하여 이를 확인할 수 있을 것으로 생각된다.

- 73 -
 5. 음식물쓰레기를 이용한 동시당화공정에서의 효소주입

량과 에탄올생산

Figure 4.12 Effect of ethanol production on various carbo-

hydrases (Viscozyme L) dosages using SSF process

가수분해효소의 주입량에 따른 에탄올 생산량을 확인하기 위해 효

소의 주입량을 각각 다르게 하여 실험을 진행하였으며, 이를 Fig 4.12

에 나타내었다. 가수분해효소의 주입량이 높을수록 glucose 생산량 또

한 높았으며, 이는 앞선 가수분해실험과 비슷한 경향을 나타내었다.

에탄올 생산 역시 기존의 glucose를 이용한 실험과 비슷한 경향으로

초기에는 에탄올 생산속도가 낮았으나, 약 4시간 이후부터는 에탄올의

생산이 급격히 늘었으며, 약 12시간 이후부터는 다시 에탄올의 생산을

- 74 -
멈추는 것으로 확인되었다. 효소의 주입량에 낮은 0.1, 0.5, 1.0%의

샘플에서는 효소의 주입량이 높을수록 에탄올의 생산량이 증가하는 경

향을 나타내었으나, 효소의 주입량 5%, 10%의 샘플에서는 오히려 감

소하는 경향을 나타내었다. 이는 효소의 주입량이 많아짐으로 인해 짧

은 시간에 glucose생산량은 높아지나, 효소의 과다주입으로 인해 에탄

올생산균주에 저해를 준 것으로 사료된다. 하지만, 적절한 효소의 주

입량에서는 상호간의 어떠한 inhibition없이 ethaol을 생산함을 확인

할 수 있었다.
효소의 주입량이 늘어날수록 효소 비용 증가로 공정의 운영비용에

막대한 지출로 인한 문제점이 발생하게 된다. 이러한 문제점을 막기

위해서는 최소량의 효소주입량으로 가수분해효율 높이는 최적의 가수

분해효소주입량을 확인하는 것이 중요하며, 본 실험결과에 따르면 최

적의 가수분해 효소 주입 조건은 1%인 것으로 나타났다.

- 75 -
6. 동시당화공정을 이용한 음식물쓰레기의 에탄올생산

Figure 4.13 Ethanol production from food wastes using SSF

process

동시당화공정을 이용한 음식물쓰레기의 에탄올생산량에 대한 결과

를 Fig 4.13에 나타내었다. 본 실험에서의 에탄올은 실험시작 후 약 2

시간의 lag phase를 갖으며 생산되기 시작하였고, 에탄올 생산과 동시

에 효소가수분해로 인한 글루코즈의 생산도 이루어졌다. 실험 초기 글

루코즈의 생산이 늘어난 것은 Viscozyme L이 음식물쓰레기를 이용하

여 glucose를 생산하는 속도에 비해 S. cerevisiae가 글루코즈를 이용

하여 에탄올을 생산하는 속도가 더 느리기 때문으로 사료된다. 이후

- 76 -
글루코즈의 생산이 줄어드는 것은 S. cerevisiae가 lag phase 이후에

최적의 조건에서 ethanol을 생산하기 시작하여 glucose를 소모하는

양이 많아지고, 효소가 glucose를 생산하는데 사용할 음식물쓰레기의

탄수화물이 저조하게 남아있기 때문이라고 사료된다. 반응시작 후 약

18시간 후에 더 이상의 에탄올은 생산되지 않았으며, 같은 시간에

glucose의 생산도 더 이상 증가하지 않았다.

결론적으로 음식물쓰레기를 이용한 바이오에탄올 생산시 glucose

가 0.49/g dry food waste, ethano이 41g/100g hexose를 생산하는

것을 확인하였으며, 이로 인해 유기성폐기물인 음식물쓰레기를 이용하

여 수송용 에너지인 에탄올을 생물학적인 방법을 적용하여 생산가능함

을 확인하였다.

- 77 -
Ⅴ. 결 론

1. Carbohydrase 효소를 이용하여 음식물쓰레기를 당화한 결과, 초기

hexose는 효소의 주입농도가 높을수록 빠르게 생산되었으나, 이후

효소의 주입농도가 작은 샘플에서의 최종 hexose 생산량과 비슷한

값을 나타내었다. 결국 효소의 주입량이 다를 경우 경과시간만 달라

지며 hexose의 최종생산량에는 큰 차이를 보이지 않았다.

2. Glucoamylase 효소는 Carbohydrase에 비하여 낮은 당화율을 나

타냈다. 이는 음식물쓰레기 성상이 기인한 것으로 사료되며, 음식물

쓰레기의 성상에 따라서 효소를 혼합하여 사용하는 것이 타당할 것

으로 사료된다.

3. 글루코즈를 이용하여 S. cerevisiae의 에탄올 생산결과, 글루코즈

는 일정한 경향으로 서서히 감소하였으며 에탄올의 경우 실험시작
후 6시간 동안은 조금씩 증가하다가 12시간을 기점으로 급격히 생

산량이 증가하는 경향을 나타내었다.

4. NaCl의 농도의 따른 S. cerevisiae의 영향을 실험한 결과, NaCl의

농도가 높아질수록 S. cerevisiae의 에탄올 생산은 거의 이루어지지

않았으며, 대조군과 1%, 2%에서 각각 에탄올 생산율이 0.502,

0.494, 0.481 g/g-glucose로 거의 유사한 결과를 나타냈다. 이는

우리나라 평균 음식물쓰레기의 염분농도(1.9∼2.2%)에서는 S.

cerevisiae가 에탄올 생산 시 거의 영향을 받지 않을 것으로 사료된
다.

- 78 -
5. 음식물쓰레기의 효소가용화 이후 S. cerevisiae를 이용한 에탄올

생산 실험 결과, 효소 주입 후 약 17시간에 0.83g glucose/g dry

food waste로 glucose 전환량이 최고치에 달했으며, 이때 S.

cerevisiae를 접종 후 약 16시간 이후부터 에탄올의 생산이 이루어

졌으며, 접종이후 약 31시간부터는 ethanol의 증가가 보이지 않았으

며, 최종 에탄올생산량은 0.51g ethanol/g dry food waste였다.

6. 음식물쓰레기를 이용한 동시당화공정에서의 효소주입량과 에탄올생

산 실험 결과 효소의 주입량이 높을수록 glucose 생산량이 높았으

나, 5%, 10%의 샘플에서는 오히려 감소하는 경향을 나타내었다. 이

는 효소의 과다주입으로 인해 에탄올생산균주에 저해를 준 것으로

사료되며, 최적의 가수분해 효소 주입 조건은 1%인 것으로 나타났

다.

7. 음식물쓰레기를 동시당화공정을 이용하여 에탄올을 생산한 결과,

0.41g ethanol/g hexose를 생산하는 것을 확인하였다.

이를 통하여 향후 유기성 폐기물인 음식물쓰레기의 자원화와 처리

시스템으로의 활용이 가능할 뿐만 아니라, 수송용 에너지인 에탄올을

환경친화적인 생물학적 방법으로 생산할 수 있으며, 미국과 브라질을

위주로 생산하는 바이오에탄올을 경작지가 부족한 우리나라에서도 생

산이 가능함을 확인할 수 있는 성과를 거두었다.

- 79 -
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 Abstract

Bio-ethanol production of enzymatic hydrolyzed

food wastes

Kim, Jaehyung

(Supervisor Pak, Dae Won)

Dept. of Energy and Environment Engineering
Graduate School of Energy & Environment
Seoul National University of Technology

This research intended to produce bio-ethanol by using food

waste, which is biomass, as a fermentation substrate in

consideration of situations in Korea. In order to enhance the

production efficiency of bio-ethanol, the study compared the

saccharification efficiency of various enzymes, confirmed the

characteristics of ethanol-producing microbes, as well as the

tolerance of microbes to the salt concentration, which comprises

the feature of domestic food waste, and also confirmed the

ethanol production by applying separate hydrolysis and

fermentation(SHF) process and Simultaneous saccharification and

fermentation (SSF) process.

As a result of confirming the production of glucose by using

- 87 -
an various enzyme, glucoamlyase and complex-carbohydrase

produced 0.52g glucose/g and 0.48g dry food waste,

respectively, due to complicated properties and conditions of

food waste. Also, as a result of saccharification from food

waste by using an enzyme mixture, protease and the mixture of

the above two enzymes(glucoamylase and carbohydrase)

produced high glucose with about 0.7g glucose/g dry food

waste.

As a result of producing ethanol by using two types of S.

cerevisiae and Thermoanaerobacter Ethanolicus, S. cerevisiae

showed a higher production of ethanol in using glucose with

hexose. In the test of confirming the characteristics of S.

cerevisiae by salt concentration, the higher the concentration of

NaCl, the fewer the ethanol production. In particular, when the

concentration was over 3%(V/V), the ethanol production was

low. As a result of producing ethanol by using SHF, there

appeared 0.51g ethanol/g dry food waste; and when applying

SSF, 0.41g ethanol/g hexose was confirmed to be produced.

Through the process, the possibility of the stable production of

bio-ethanol using domestic food waste as a resource could be

confirmed.

- 88 -