Table of Contents
2 Introduction
2 Principle
3 Materials Supplied
3 Storage
3 Materials Needed but Not Supplied
4 Reagent Preparation
5 Sample Handling 
7 Assay Procedure
8 Calculation of Results 
9 Trouble Shooting 
10 References
12 Limited Warranty









Introduction

The Glutathione peroxidase activity kit is a complete kit for measuring the activity of glu‐
tathione‐dependent peroxidases in cells, tissues, erythrocytes and plasma.  
 
Glutathione Peroxidase is a tetramer of four identical subunits, with a molecular weight 
of 84,000 daltons. It requires selenium as a cofactor and contains a selenocysteine amino 
acid residue in the active site of each monomer that participates  in  the  actual mecha‐
nism of the enzyme. Glutathione peroxidase (GP) is found in mammalian cells and helps 
to prevent lipid peroxidation of cell membranes by consuming free peroxide in the cell. 
The enzyme catalyzes the following reaction: 
 
GP
2GSH + H2O2 -------> GSSG + 2H2O
 
 
Glutathione Reductase (GR) then reduces the oxidized glutathione to complete the cycle: 
 
GR
+ +
GSSG + NADPH + H -------> 2GSH + NADP
 
 
Where GSH represents reduced monomeric glutathione, and GSSG represents oxidized  
glutathione.  The  oxidation  of  NADPH  to  NADP+  is  accompanied  by  a decrease in 
absorbance at 340 nm (A340). The rate of decrease in the A340  s directly proportional  
to  the  Glutathione  Peroxidase  activity  in  the  sample.  
 
 

Principle
 
1.  Reaction mix, Glutathione Peroxidase, and samples are added to the appropriate 
wells of a 96‐well plate.   
 
2.  Cumene  Hydroperoxide  is added to the wells to initiate the reaction. 
 
3.  The plate is transferred to a plate reader and absorbance readings are taken at 
340 nm every 30 seconds or 1 minute for 10 to 15 minutes. 
 
 
 
 
 
 

Catalog No. 25‐0615       2     01/29/2015 © 2007 

Materials Supplied
 
1.  Clear Microtiter Plate 
  Five Plates of 96 Wells, Catalog No. 80‐1639 
  Clear uncoated solid plates. 
 
2.  10X Assay Buffer 
  20 mL, Catalog No. 80‐1662 
 
3.  GSH + NADPH 
  10 vials, Catalog No. 80‐1661 
 
4.  Glutathione Reductase 
  1.1 mL, Catalog No. 80‐1665 
 
5.   Glutathione Peroxidase 
   800 µL, Catalog No. 80‐1664 
    Glutathione Peroxidase in a 50% glycerol storage buffer   
 
6.   Cumene Hydroperoxide 
        12 mL, Catalog No. 80‐1663 
 
Storage 
 
All components of this kit are stable at ‐20°C.  All kit components are stable at their 
recommended storage temperatures until the kit expiration date. 
 
Materials Needed but Not Supplied

1.  PBS pH 7.4 
2.  Distilled water 
3.  Protease  inhibitors such  as  phenylmethylsulfonyl  fluoride  (PMSF), Sigma P7626 or 
equivalent 
4.  Peroxide free Triton X‐100 or Nonidet P‐40 for cell extract preparation. 
5.  Microtubes, 0.5 and 1.5 mL 
6.  15 mL conical tubes (adherent and suspension cell preparation) 
7.  50 mL conical tubes (tissue preparation) 
8.  Precision pipettes for volumes between 1‐200 µL and 100 to 1000μL 
9.     Multichannel pipettor for volumes between 1 ‐ 50 µL and 50 µL – 200 µL 
10.    Microplate reader or spectrophotometer capable of reading at 340 nm and taking 
readings every 30 seconds or 1 minute for ten to 15 minutes and exporting data to 
an Excel spreadsheet. 
11.   Microcentrifuge for processing samples 
12.   Sonicator or Homogenizer 

Catalog No. 25‐0615       3     01/29/2015 © 2007 

Reagent Preparation
 
1.    Assay Buffer 
  Dilute the 10X Assay Buffer to 1X (1:10) with distilled water.  The 1X Assay Buffer is 
stable at 4°C for up to 2 weeks. Note that 1X Assay Buffer contains 0.1 mg/mL  BSA 
and this should be taken into account when calculating the protein concentration of 
your samples. 
 
2.   GSH + NADPH 
  Each vial of lyophilized GSH + NADPH contains sufficient reagent for 50 wells.   Bring 
the number of vials required to room temperature and add 110 µL of 1X Assay Buffer 
to  each  vial.  Swirl  contents  gently  to  dissolve  and  store  on  ice.  The  reconstituted 
reagent should be used within 4 hours. Discard any unused portion after use. Do not 
refreeze. 
 
3.   Reaction Mix 
  Make a 10X Reaction Mix (sufficient for 50 wells) as follows: 
 
  Glutathione Reductase    110 µL 
  Reconstituted GSH + NADPH  110 µL 
  1X Assay Buffer      880 µL 
 
          Mix well and store on ice until added to the wells. Reaction Mix should be used 
within 4 hours of preparation. 
 
4.  Cumene Hydroperoxide
Thaw  the  cumene  hydroperoxide  and  bring  to  room  temperature.  Aliquot  into  1.1 
mL portions and freeze at ‐20°C. Each aliquot is sufficient for 50 wells. Note that the 
Cumene Hydroperoxide should be used within 1 hour at room temperature. Store on 
ice if in use for longer periods of time.

 
 

Catalog No. 25‐0615       4     01/29/2015 © 2007 

Sample Handling
 
A. Preparation of Cell Extracts 
 
1. Non-adherent cells:  Centrifuge 2 x 106 to 1 x 107 non‐adherent cells at  
    400 x g for 10 minutes at 4°C. Discard the supernatant. Suspend the cell pellet  
    in1mL of ice‐cold 1X PBS and transfer to a prechilled 1.5 mL microtube.  
    Centrifuge at 10,000 x g for 10 seconds at 4°C. Discard the supernatant.  
    Suspend the cell pellet in 5 pellet volumes of cold 1X Assay Buffer containing  
    0.4 mM PMSF, other protease inhibitors,  and 1% Triton X‐100 (peroxide‐free). 
 
2. Adherent cells:  Wash the adherent cells with 1X PBS. Adherent cells may be  
   harvested by scraping in 5 mL of ice‐cold 1X PBS. Transfer to a pre chilled 15 mL 
    tube. Centrifuge at 400 x g for 10 minutes at 4°C and discard the supernatant.  
    Resuspend the cell pellet in 1 mL ice‐cold 1X PBS and transfer to a pre chilled  
    1.5 mL microtube.  Centrifuge at 10,000 x g for 12 seconds at 4°C. Discard the  
    supernatant. Resuspend  the cell pellet in 5 pellet  volumes  of ice‐cold 1X Assay   
    Buffer containing 0.4 mM PMSF, other protease inhibitors, and 1% Triton X‐100  
    (peroxide‐free). 
 
3. Incubate the cell suspensions on ice, with periodic vortexing, for 30 minutes. 
 
4. Microcentrifuge  the  disrupted  cell  suspension  at  10,000 x g for 10‐20 minutes  
    at 4°C to remove insoluble material. Recover the supernatant to a fresh tube pre 
    chilled on ice. 
 
5. Determine the protein concentration of the cleared cell lysate. Snap‐freeze the  
    cleared cell extract in small aliquots and store at ‐80°C. Avoid repeated freezing   
    and thawing of the extract. The frozen cell extracts will be stable for 1 month. 
 
B. Preparation of Plasma 
 
1. Collect blood using an anticoagulant such as heparin, citrate, or EDTA. 
 
2. Centrifuge at 1,500 x g for 10 minutes at 4°C. Pipet off the upper yellow  
    plasma layer without disturbing the white buffer layer (the white interface  
    between the pelleted red blood cells and the plasma). 
 
3. Store the plasma on ice for up to 4 hours, or freeze in small aliquots at ‐80°C. The  
    frozen samples will be stable for at least 1 month. 
 

Catalog No. 25‐0615       5     01/29/2015 © 2007 

C. Preparation of Red Blood Cell Lysates
 
1. Follow the directions for preparing  plasma, above. Remove the buffy coat  
    and discard. 
 
2. Wash the red blood cells with 1X PBS at 4°C. Centrifuge at 1500 x g for 10  
    minutes at 4°C. Discard the supernatant. Repeat this step once more. 
 
3. Lyse the red blood cells in 4‐10 volumes of 4°C deionized water by repeated  
    gentle  vortexing or mixing over a 10 minute period. 
 
4. Centrifuge at 10,000 x g for 15 minutes at 4°C. Collect the supernatant. 
 
5. Determine the protein concentration of the erythrocyte lysate. Store on ice for up      
    to 4 hours, or freeze in small aliquots at ‐80°C. The frozen samples will be stable  
    for at least one month. 
 
D. Preparation of Tissue Homogenates 
 
1. Prior to dissection, perfuse the tissue with 1X PBS plus 0.16 mg/mL heparin to  
    remove blood components and clots. 
 
2. Homogenize the tissue in 5‐10 mL per gram of tissue of cold 1X Assay Buffer    
    containing 0.4 mM PMSF, other protease  inhibitors, and 1% Triton X‐100    
    (peroxide‐free). 
 
3. Centrifuge at 10,000 x g for 10‐20 minutes at 4°C to remove insoluble  
    material. Recover the supernatant to a fresh tube prechilled on ice. 
 
4. Determine the protein concentration of the cleared tissue lysate. 
 
5. Alternative protocol: Mince the tissue in cold 1X PBS and make a single cell sus 
    pension by forcing the tissue through a stainless steel wire mesh screen  
    using a pestle. Centrifuge the single cell suspension at 1,000 x g for 10 minutes  
    at 4°C. Discard the supernatant. Resuspend the pellet in 5 pellet volumes of  
    ice‐cold 1X Assay Buffer containing 0.4 mM PMSF, other protease inhibitors,  
    and 1% Triton X‐100 (peroxide‐free). 
 
6. Incubate the cell suspensions on ice, with periodic vortexing, for 30 minutes. 
 
7. Microcentrifuge the disrupted tissue single cell suspension at 10,000 x g for  
    10‐20 minutes at 4°C to remove insoluble material. Recover the supernatant to    
    a fresh tube prechilled on ice (If supernatant is cloudy, repeat centrifugation). 
 
8. Determine the protein concentration of the cleared tissue lysate. 
 

Catalog No. 25‐0615       6     01/29/2015 © 2007 

9. Store the clarified  tissue  extracts on ice and assay immediately, or   
    snap‐ freeze the cleared tissue extract in small aliquots and store at ‐80°C. Avoid  
    repeated freezing and thawing of the extract.  The frozen cell extracts will be  
    stable for 1 month. 
  

Assay Procedure

1.  Set up  your  plate  reader  to  measure  absorbance  at  340 nm  every  30 seconds or 
1  minute.  Include  a  10  second  orbital  shake  prior  to  the  initial  read.  Accuracy  and 
consistency of results is dependent on maintaining a constant temperature. Set the 
plate  chamber  of  your  instrument  to  25°C  if  possible.  Blank  your  readings  with 
respect to 200 µL of 1X Assay Buffer in one well. 
 
2.  Plan your experiment to measure each sample in triplicate and at different dilutions 
or amounts of protein.  Some samples, particularly  erythrocyte lysates, may have to 
be diluted significantly with 1X Assay Buffer to achieve a reasonable rate of decrease 
in absorbance at 340 nm.  Note that the final volume of the reaction is 200 µL. 
 
3.  Set up the following reactions in a 96 well plate (per well): 
 
    1X Assay Buffer:             140 µL 
    10X Reaction Mix:                  20 µL 
    Glutathione Peroxidase, sample, or control        20 µL 
   
  Note: The Glutathione Peroxide is provided to serve as a positive control to ensure 
the  assay  is  working.  It  should  not  be  used  to  construct  a  calibration  curve  to 
measure Glutathione Peroxidase concentration in samples.   
 
4.  Initiate the reactions by quickly adding 20 µL of Cumene Hydroperoxide to each well 
using a mutichannel pipettor. 
 
5.  Immediately begin measuring absorbance at 340 nm every 30 seconds or 1 minute 
over a 10‐15 minute period. 
 
6.  Controls: Include  a  background  set  of  wells where 20  µL of 1X  Assay Buffer  is  
added  instead  of  sample  or  Glutathione  Peroxidase.  The  rate  of decrease of 
absorbance at 340 nm in the background is subtracted from that of the samples or 
standard  to  obtain  the  net  rate  of  decrease  of  absorbance  at    340    nm    for    the  
calculation  of  Glutathione  Peroxidase  activity  in  your samples. 
 
 
 
 
 

Catalog No. 25‐0615       7     01/29/2015 © 2007 

Calculation of Results

A. Determination of Glutathione Peroxidase Activity. 

 
1. Calculate the mean absorbance at each time point of the triplicate values for the  
    samples, Glutathione Peroxidase Standard, and background.   
 
2. Plot the mean absorbance versus time. A representative standard curve is shown  
     in Figure 1: 
   
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
     
3. Determine the slope from a linear portion of the curve for the sample,   
    Glutathione Peroxidase standard, and background. Express the results as  
    the change in absorbance per minute (ΔA340/min). 
 
4. Subtract the ΔA340/min for the background from that of the samples. 
 
5. One Unit of Glutathione Peroxidase is defined as the amount of enzyme that will  
    cause the oxidation of 1 nmole of NADPH to NADP+ per minute at 25ºC.  
    The reaction rate can be calculated knowing the extinction coefficient of NADPH  
    which is 0.00622 μM ‐1cm‐1. Since the path length of the samples in the wells is  
    0.61 cm, the extinction coefficient is modified to 0.00379 µM‐1. Calculate the  
    Glutathione Peroxidase activity in your samples from the following equations 
    (where Y is the volume of your samples): 
 
Glutathione Peroxidase Activity =    ΔA340/min     x     0.2 mL    x  Sample Dilution 
                                                   0.00379 µM‐1   Y mL

                                                =  nmole/min/mL  =  Units/mL 
 
 

Catalog No. 25‐0615       8     01/29/2015 © 2007 

Trouble Shooting
 
 

Problem Cause Solution

Erratic  values.    Poor  re‐ Poor pipetting technique Depress  plunger  of  your 

producibility of triplicates pipettor  all  the  way.  Fill 
with  solution.  Depress  to 
first  stop.  Fill  with  solu‐
tion.  Depress  to  first  stop. 
Repeat  as  often  as  neces‐
sary.

Bubbles in well Avoid making bubbles

No decrease in absorbance  Enzyme  activity  in  the  Increase  volume  and/or 

observed  in  sample  wells  samples is too low. concentration  of  your 
or  Glutathione  Peroxidase  samples.
standard.

Failure  to  add  cumene  Add  cumene  hydroperox‐

hydroperoxide ide to wells.

Initial absorbance is below  Glutathione  Peroxidase  Dilute  your  samples  with 

0.5  or  the  absorbance  activity  is  too  high  in  your  1X  Assay  Buffer  and  reas‐
deceases very rapidly samples. say.

Initial  absorbance  is  less  Failure  to  add  GSH  +  Add  GSH  +  NADPH  to  10X 
than  0.1  and  there  is  no  NADPH  to  10X  Reaction  Reaction Mix
decrease in absorbance Mix

Initial  absorbance  in  sam‐ Sample  is  too  concentrat‐ Dilute your sample with 1X 

ple  wells  is  greater  than  ed Assay Buffer and reassay
1.5
       
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Catalog No. 25‐0615       9     01/29/2015 © 2007 

References 
 
1.    Ozdemir   G,   Ozden   M,   Maral   H,   Kuskay   S,   Cetinalp   P,   Tarkun   I.    
       Malondialdehyde,   glutathione,   glutathione   peroxidase   and   homocyste 
       ine levels in type 2 diabetic patients with and without microalbuminuria. Ann  
       Clin Biochem. 2005, 42:99‐104. 
 
2.    Prasad NR, Menon VP, Vasudev V, Pugalendi KV. Radioprotective effect of  
       sesamol  on  gamma‐radiation  induced  DNA  damage,  lipid  peroxidation  and  
       antioxidants   levels   in   cultured   human   lymphocytes.   Toxicology.   2005, 
       209:225‐35. 
 
3.    Sindhu  RK,  Ehdaie  A,  Farmand  F,  Dhaliwal  KK,  Nguyen  T,  Zhan  CD,  
       Roberts CK, Vaziri ND. Expression of catalase and glutathione peroxidase in  
       renal insufficiency. Biochim Biophys Acta. 2005, 1743:86‐92. 
 
4.    Szelestei T, Bahring S, Wagner Z, Aydin A, Molnar GA, Kocsis B, Nagy J,  
       Wittmann   I.   Serum   levels   of   L‐arginine   analogues   and   glutathione  
       peroxidase and catalase gene variants in Type 2 diabetes mellitus patients. 
 
5.    Chu  FF,  Esworthy  JH,  Doroshow  JH.  Role  of  Se‐dependent  glutathione per 
       oxidases in gastrointestinal inflammation and cancer. Free Rad Biol Med. 
       2004. 36:1481‐95. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 

Catalog No. 25‐0615       10     01/29/2015 © 2007 

Notes 

Catalog No. 25‐0615       11     01/29/2015 © 2007 

 

 
 
Use of Product 
This  product  contains  research  chemicals.    As  such,  they  should  be  used  and 
handled only by or under the supervision of technically qualified individuals.  This 
product is not intended for diagnostic or human use. 
 
Warranty 
Enzo Life Sciences International, Inc.  makes no warranty of any kind, expressed 
or implied, which extends beyond the description of the product in this brochure, 
except that the material will meet our specifications at the time of delivery.  Enzo 
Life  Sciences  International,  Inc.  makes  no  guarantee  of  results  and  assumes  no 
liability  for  injuries,  damages  or  penalties  resulting  from  product  use,  since  the 
conditions of handling and use are beyond our control. 
 
 
 
 
  www.enzolifesciences.com
 
 
Enabling Discovery in Life Science®
 
 
 
 
 

 
Global Headquarters 
Enzo Life Sciences Inc.  Enzo Life Sciences (ELS) AG 
10 Executive Blvd  Industriestrasse 17, Postfach 
Farmingdale, NY 11735  CH‐4415 Lause / Switzerland 
(p) 1‐800‐942‐0430  (p) +41/0 61 926 89 89 
(f) 1‐631‐694‐7501  (f) +41/0 61 926 89 79 
(e) info‐[email protected]  (e) info‐[email protected] 
 
 
 
Please visit our website at www.enzolifesciences.com for additional con‐
tact information. 

Catalog No. 25‐0615       12     01/29/2015 © 2007