RESUMEN: RNA-Sequencing Reveals Differentially Expressed Rice Genes

Functionally Associated with Defense against BPH and WBPH in RILs

Derived from a Cross between RP2068 and TN1
Aguilar Alarcón Wendy Briseida 1 , Maldonado Fuenteees Dana Clarissa 1 , Martí nez
Almazan José Natanael 1 , Navarrete Arroyo Citlali 1 , Ortega Aguilar Reyna Guadalupe 1 ,
Pastor Jacobo Isis Gabriela 1 and Villanueva Flores Arizbeth Guadalupe 1 .

ANTECEDENTES Y EL OBJETIVO DEL ESTUDIO

La importancia del arroz a nivel mundial es impresionante, cada año más del 25%
de la producción anual se pierde por factores bióticos como lo son plagas de
insectos. Algunas de las plagas con más impacto en los cultivos de arroz, son
algunas especies de saltamontes las cuales se han controlado con insecticidas
que terminan siendo daniño para el medio ambiente y por este motivo se ha
buscado el mejoramiento de arroz resiste a plagas.
Se ha identificado una variedad de genes que confiere resistencia a algunas
especies de saltamontes y al usar variaciones de estos genes se obtiene arroz
resiste que se puede cultivar libremente y a su vez más de 30 genes se
encuentran divididos en 6 grupos los cuales los podemos ver en 4 cromosomas
diferentes.
Cada grupo de genes actúa de manera diferente, algunos de ellos interactúan
meramente como genes de resistencia y algunos otros como receptores de
leptina.
Finalmente, utilizando un enfoque que emplea análisis de microARN,
transcriptoma y proteómica se encontraron casi 30 mi ARN clave y 20 genes
candidatos con regulación a la resistencia y tampoco no se ha informado sobre
algún estudio que tenga como objetivo comprender la resistencia diferencial.
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Para realizar la parte experimental del presente artículo se trazaron rutas de
métodos para la parte de toma de muestra, extracción del ARN, secuenciación e
inclusive para la parte bioinformatica de los resultados. Primero se realizo la
recolección de las muestras mediante el uso de un protocolo NGS, las muestras
partieron de la vaina parte inferior de la hoja de tres macetas con la finalidad de
contar con triplicados en dos diferentes lapsos de tiempo (6 y a las 12 horas post-
infestación). Posteriormente a la recolecta de las muestras se realizó el
1
Estudiante de la licenciatura en biotecnología en la Universidad Autónoma de
Guerrero.
aislamiento de las 9 muestras y para ello se utilizo el mini kit de plantas Rneasy.
Dicho kit proporciona columnas QIAshredder para la homogeneización y filtración
de lisados viscosos de plantas mediante microcentrifugación en combinación con
columnas giratorias RNeasy Mini para la purificación de ARN. Para su uso se
requiere lisar las muestras y luego se homogeneizan en las columnas
QIAshredder. Se agrega etanol al lisado para proporcionar condiciones de unión
ideales. Luego, el lisado se carga en la membrana de sílice RNeasy. El ARN se
une y todos los contaminantes se eliminan con eficacia.
SECUENCIACIÓN
A partir del ARN obtenido se prepararon las bibliotecas de secuenciación
utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN ultradireccional NEBNext el
cual es compatible con Illumina, posterior a esto se sintetizo cDNA para después
purificarse utilizando perlas magnéticas HighPreo, y este fue secuenciado
mediante Illumina HiSeq 4000.
A su vez se realizó una secuenciación de ARN (RNA-seq) la cual se hizo con RIL
TR3RR que resulto resistente a BPH como a WBPH, después de la infestación la
variabilidad entre las réplicas nos mostro una ligera variabilidad dentro de las
réplicas biológicas para BPH y WBPH
Se observaron números más altos de transcritos/genes expresados diferenciados
(DEG) en tejidos vegetales infectados con BPH en comparación con tejidos
vegetales no infectados en comparación con tejidos vegetales infectados con
WBPH, por lo tanto para poder tener la capacidad de proteger el arroz contra los
dos saltamontes BPH y WBPH, tiene que haber características distintas en
RP2068, de modo que se necesita de una combinación consciente de resistencia
a estas dos plagas, ya que es esencial para un efectivo manejo de campo.
ANÁLISIS DEL ARTÍCULO
Es interesante como durante el artículo se desglosa el paso a paso de la
metodología a través de los métodos estadísticos empleados. Para empezar,
estimaron la presencia de transcritos con cufflinks4, esta herramienta también
permite calcular la abundancia de transcritos; los resultados obtenidos los
normalizaron de acuerdo con el formato FPKM (que se basa en la longitud de los

1
Estudiante de la licenciatura en biotecnología en la Universidad Autónoma de
Guerrero.
transcritos y el número de lecturas para la normalización). Normalizar datos sirve
para poder clasificarlos y compararlos de una forma más simple. Los transcritos se
identificaron y cuantificaron a partir de las lecturas alineadas obtenidas.
Posteriormente hicieron un ensamblaje de los transcritos, es decir, la síntesis de
ARN sin el uso de una secuencia de referencia física. Nuevamente usando el
software cufflinks4. El genoma de interés fue analizado y se estimó la abundancia,
expresión y regulación de diferentes RNA-Seq; este software fue muy importante
en la investigación, ya que evita el tener que hacer ensayos de “prueba y error”
hasta encontrar un genoma con valores lo suficientemente significativos. Una vez
encontraron las secuencias de interés a través del mapeo, estas se utilizaron para
ensamblar el transcriptoma deseado. El resultado fue utilizado para generar
nuevas anotaciones de transcripción como lo son los niveles de expresión.
Los datos “brutos” que obtuvieron de las muestras blanco e infestadas se utilizaron
para buscar small ARN con el software psRNATarget. Buscaron precursores de
miRNA en la miRBase y los utilizaron para encontrar las familias a las cuales
pertenecían. Así mismo, también utilizaron estos datos para utilizar una base de
datos de plegamiento de ARN y así predecir sus estructuras secundarias.
Las secuencias maduras de los miARN las emplearon para hacer un en BLAST,
contraponiéndolos con los miARN del genoma del arroz índico. Los genes
homólogos encontrados se consideraron genes diana y sirvieron para hacer un
perfil de expresión de estos genes.
Finalmente, para encontrar asociaciones de los RNA a las vías de respuestas, se
hizo un análisis de redes con RiceNet v2 y los 27 genes fueron separados en 4
grupos con una priorización basada en hubs, es decir, en la relación que hay entre
su actividad y el contexto de la investigación, para así poder discernir de redes no
correlacionadas. Fueron identificadas vías en las que participaban 2 o más genes
de los 27 consultados.
FIGURA DEL ARTÍCULO MÁS RELEVANTE
En las siguientes figuras se representa la ontología génica realizada para todos los
genes expresados diferencialmente (DEG) en los tejidos de las plantas TR3RR
cuando se desafío contra BPH y WBPH. Se realizó una agrupación de los DEG en

1
Estudiante de la licenciatura en biotecnología en la Universidad Autónoma de
Guerrero.
UPUP,DNDN, UPDN Y DNUP con respecto su expresión ya sea regulada hacia
arriba o hacia abajo, contra la infección de BPH y WBPH. Posterior a ello se
clasificó en tres, el proceso biológico, el componente celular y función molecular.
Proceso biológico

En el proceso biológico se logra observar (figura 4) 16 conglomerados en UPUP y

DNDN , 6 clusters exclusivos de UPUP, 14 exclusivos de DNDN, 12 exclusivos de
UPDN y 3 exclusivos de DNUP. En los cuales de cada grupo hubo una mayor
transcripción comúnmente reguladas negativamente y una baja transcripción de
los positivos.
Componente celular

En el componente celular (figura 5) se lograron observar 14 grupos de transcrito

pertenecientes al grupo UPUP y DNDN, en los cuales 5 de estos transcritos
1
Estudiante de la licenciatura en biotecnología en la Universidad Autónoma de
Guerrero.
exclusivamente de UPUP se observó que eran contra la alza de BPH y WBPH,
mientras los que fueron exclusivamente de DNDN se encontraban regulados a la
baja.
Función molecular

En la función molecular (figura 6) se lograron observar 17 grupos representados

en UPUP y UPDN, 6 conglomerados en UPDN y 3 en DNUP, en UPUP se
observaron 10 que fueron exclusivamente de este y 4 que fueron exclusivamente
de DNDN. Los genes de DNDN se regularon de manera negativa frente a BPH y
WBPH, mientras los genes de UPDN aumentaron frente a BPH pero disminuyeron
frente a WBPH y los genes de DNUP disminuyeron frente a BHP pero aumentaron
frente a WBPH.
REFERENCIAS
 Divya, D., Sahu, N., Reddy, P.S. et al. RNA-Sequencing Reveals
Differentially Expressed Rice Genes Functionally Associated with Defense
against BPH and WBPH in RILs Derived from a Cross between RP2068 and
TN1. Rice 14, 27 (2021). https://doi.org/10.1186/s12284-021-00470-3
 Mini Kit de purificación de ADN de plantas u hongos, DNeasy Plant x 250u.
(n.d.). OneLab. https://www.onelab.com.ar/purificacion-de-dna-de-plantas-u-
hongosdneasy-plant-mini-kit-x-250u
 FPKM - GDC Docs. (s.f.). GDC Docs.
https://docs.gdc.cancer.gov/Encyclopedia/pages/FPKM/#:~:text=Fragments
1
Estudiante de la licenciatura en biotecnología en la Universidad Autónoma de
Guerrero.
 %20Per%20Kilobase%20of%20transcript,total%20number%20of
%20mapped%20reads.

1
Estudiante de la licenciatura en biotecnología en la Universidad Autónoma de
Guerrero.