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The Rapid Detection of Antioxidants from

Safflower Seeds (Carthamus tinctorius L.)
Using Hyphenated-HPLC Tech....

Article in Korean Journal of Food Science and Technology · January 2010

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4 authors, including:

Albert Byung-Hun Um
Korea Institute of Science and Technology
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KOREAN J. FOOD SCI. TECHNOL. Vol. 42, No. 4, pp. 414~419 (2010)

©The Korean Society of Food Science and Technology

Hyphenated-HPLC 기술을 활용한 홍화씨의 항산화 성분 분석

김수진1,2·김상민1·강석우1·엄병헌1*
1
한국과학기술연구원 강릉분원, 천연물소재센터, 2강릉원주대학교 화학신소재학과

The Rapid Detection of Antioxidants from Safflower Seeds

(Carthamus tinctorius L.) Using Hyphenated-HPLC Techniques
Su Jin Kim , Sang Min Kim , Suk Woo Kang , and Byung Hun Um *
1,2 1 1 1

1
Korea Institute of Science and Technology (KIST) Gangneung Institute
2
Department of Chemistry, College of Natural Sciences, Kangneung-Wonju National University

Abstract Hyphenated-HPLC techniques combine the separation power of HPLC with the structural and bioactivity
information provided by NMR, ESI/MS, and an on-line antioxidant screening system. The major advantages over the
traditional off-line techniques are rapidity and efficiency. In this study, we used hyphenated HPLC techniques including on-
line HPLC-ABTS, LC-NMR, and LC-MS todirectly identify the major antioxidants of safflower (Carthamus tinctorius L.)
seeds. The results demonstrated that the major antioxidant compounds from on-line HPLC-ABTS analysis were identified as
8'-hydroxyarcgenin-4'-O-β-D-glucoside, N-(p-coumaroyl) serotonin, and N-feruloylserotonin. Among them, N-feruloylserotonin
accounted for almost 50% of the ABTS radical scavenging activity of the total extract. The results demonstrate that HPLC
hyphenated techniques can be used to rapidly screen and structurally identify antioxidants from crude plant extracts.
Key words: antioxidants, Carthamus tinctorius L., LC-MS, LC-NMR, on-line HPLC-ABTS system

서 론 분의 분리에 제일 먼저 시도되는 기술은 HPLC(high-performance

liquid chromatography)이고, 미지 물질의 구조 해석에 유용한 기
항산화 물질은 생체내에서 활성산소에 의한 산화적 스트레스 능을 발휘하는 분광학적 기술은 자외선 분석법(ultraviolet spec-
를 감소시켜, 노화를 억제하고, 암, 심장혈관계 질환 등을 예방, troscopy, UV), 질량 분석법(mass spectrometry, MS)과 핵자기공명
지연시키는 물질로서, 자연계에 널리 분포되어 있는데, 페놀성 화 분석법(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)이다. 따라
합물, 플라보노이드, 토코페롤, 비타민 C, 셀레륨 등이 대표적인 서 HPLC와 이들 분광학적 기술의 결합(hyphenation)은 천연물의
항산화 물질로 알려져 있다(1). 그러나 효과와 경제성으로 인하 분리와 구조 해석에 있어 매우 중요한 정보를 제공할 수 있는 기
여 butylated hydroxytoluene, butylated hydroxyanisole, propyl 술이라 할 수 있다. 약용식물 연구 분야에 있어서도, HPLC와 UV,
gallate 등의 합성 항산화제가 상업용 식품에 많이 사용되어 왔으 MS, NMR이 결합된 LC-MS, LC-NMR 등이 단일 성분의 구조
나, 이들이 식품에 첨가되었을 때의 안전성 때문에 그 사용량이 규명을 위한 유용한 기술이 되었고, 이를 활용한 많은 연구들이
법적으로 규제되었다. 한편 토코페롤과 같은 천연 항산화제는 안 보고되고 있는 실정이다(6-8). 그 외에도 HPLC와 결합된 분광학
전성에 있어서는 매우 뛰어나나 항산화 효과가 비교적 낮고, 가 적 기술로는 LC-IR, LC-CD 등이 있다. 최근에는 이들 기술이 한
격이 비싸다는 단점이 있다(2). 따라서 최근에는 안전성에 문제 차원 더 결합된 LC-MS-NMR 등의 기술도 등장하여 천연물의 구
가 없고, 항산화 효과가 뛰어난 천연 항산화제 소재의 발굴을 위 조 해석에 매우 유용한 도구로 사용되고 있다(9,10).
해 각종 생약과 식물 추출물을 대상으로 많은 연구가 이루어지 천연 항산화제의 연구에 있어, 천연물의 구조 해석 뿐만 아니
고 있다(3-5). 라 항산화 활성을 검색하는 데에도 hyphenated-HPLC 기술이 적
각종 추출물에 포함되어 있는 미지의 단일 성분의 분리와 구 용되고 있다. 일반적으로 천연물에서 분리된 단일 물질의 항산화
조 분석 및 규명은 천연물의 연구에 있어 필수적이고, 각종 크로 활성을 측정하는 방법으로 ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazo-
마토그래피 분리 기술과 분광학적 검출 시스템의 결합은 이러한 line-6-sulfonic acid))나 DPPH((1,1)-diphenyl-2-picrylhydrazyl)와 같
연구에 있어 강력한 기능을 발휘하여 왔다. 일반적으로 단일 성 은 물질의 라디칼을 소거하는 방법이 사용되는데(11), 이러한 방
법을 사용하기 위해서는 단일 물질을 분리해야 하는 번거로운 작
업을 수행해야 하고 많은 시간이 소요된다. 이러한 단점을 극복
*Corresponding author: Byung-Hun Um, Korea Institute of Science
and Technology (KIST) Gangneung Institute, Gangneung, Gangwon 하기 위하여 HPLC의 분리기술과 라디칼 소거 반응을 결합시킨
210-340, Korea 온라인 항산화 분석 장치(on-line antioxidant assay system)가 개발
Tel: 82-33-650-3601 되었다(12). 온라인 항산화 분석 장치는 HPLC에 결합된 항산화
Fax: 82-33-650-3629
분석 방법에 따라 크게 세 가지 종류로 나뉠 수 있는데, singlet
E-mail: [email protected]
Received February 22, 2010; revised March 22, 2010; oxygen, hydrogen peroxide 또는 superoxide anion 등의 활성 산소
accepted March 22, 2010 기질과의 반응을 이용하는 방법, DPPH나 ABTS와 같이 상대적

414
 Hyphenated-HPLC 기술을 활용한 홍화씨의 항산화 성분 분석 415

으로 안정한 라디칼을 만들 수 있는 반응 시약을 이용하는 방법, trile과 water을 사용하였고, 이동상의 조건은 0.4 mL/min의 유속에
그리고 colormetric 분석방법이나 amperometic 분석 방법 등의 전 서 24% acetonitrile isocratic 조건으로 60분간 수행하였다. ABTS
기화학적인 분석 방법을 이용하는 방법 등이다(13). 이러한 분석 시약은 0.2 mL/min 유속으로 공급되었고, HPLC에 의해 분리된
기술을 활용하면, HPLC에 의해서 분리된 각각의 단일 성분에 대 성분은 320 nm에서, ABTS 라디칼의 감소는 734 nm에서 검출되
해서 라디칼 소거 활성을 동시에 측정할 수 있어, 항산화 물질을 었다. 분리된 각 성분의 항산화 정량은 734 nm에서 감소된 면적
선별하는데 분석 시간을 크게 단축시킬 수 있다. 또한 정량 분석 을 기준으로 Trolox를 사용하여 10-400 µM 범위에서 정량곡선을
법을 적용하여 각 항산화 물질의 정량적인 라디칼 소거활성을 측 작성한 후 분리된 각 성분의 면적을 사용하여 TE(Trolox Equiv-
정할 수 있어 정량화된 각 화합물의 라디칼 소거활성 값을 얻을 alent)값으로 표현하였다.
수 있다. 최근에는 HPLC와 항산화 분석장치, NMR 등이 하나로
결합된 triple hyphenated-HPLC 분석 시스템을 활용한 항산화 성 LC-NMR 분석
분의 분석 방법도 개발되었다(14). 홍화씨 메탄올 추출물 50 mg을 메탄올 1 mL에 녹인 후 0.45
홍화(Safflower, Carthamus tinctorious L.)는 국화과에 속하는 일 µm membrane 필터를 사용하여 정제한 용액을 LC-NMR 시료로
년생 초목으로서, 홍화꽃은 수용성의 황색색소와 불용성의 적색 사용하였다. Varian HPLC-NMR system(Agilent Technologies)은
색소를 함유하고 있어 예로부터 염료로 사용되어 왔으며, 아울러 ProStar 410 autosampler, ProStar 210 pumps, DAD detector로
한방에서 어혈, 통경 및 고지혈증 치료제로서 홍화탕, 황혈통경 구성된 HPLC 시스템에 proton enhanced cold-probe가 장착된
탕 등의 처방제로 널리 이용되어 왔고(15), 홍화씨는 한국, 중국 Varian 500 MHz NMR spectrophotometer가 연결되어 완성되었다.
및 일본 등지에서 진정 및 보혈 등의 약용으로 사용되어 왔으며 HPLC 분석에는 YMC Hydrosphere C [150×4.6 mm I.d., 5 µm
18

특히 미국 및 인도에서는 식용유 생산용으로 재배되고 있는 유 particle size,(YMC Inc., Wilmington, NC, US)] 컬럼이 사용되었
용한 식물종자이다(16). 본 연구에서는 앞서 언급한 여러 기술 중 고, 검출은 210 nm에서 수행되었다. 이동상 용매는 acetonitrile과
온라인 항산화 분석 장치인 on-line HPLC-ABTS 분석 시스템을 D O가 사용되었고, 0.4 mL/min 유속으로 24% acetonitrile isocratic
2

활용하여 홍화씨로부터 항산화 물질을 검출하였고, LC-ESI/MS 조건에서 60분간 분석되었다. 이동상 용매인 물과 acetonitrile의
및 LC-NMR을 사용하여 항산화 물질의 구조를 빠르게 규명하여, 1
H-NMR 피크를 억제하기 위해 Varian WET1d pulse program을
이들 hyphenated-HPLC 방법이 항산화 물질의 선별 및 구조 규명 사용하였고, Relaxation time(d1)은 1초, Number of transients(nt)은
에 매우 강력한 도구가 될 수 있음을 증명하였다. 4초에서 분석이 수행되었다. H-NMR spectrum은 stop-flow mode
1

에서 측정되었다.
재료 및 방법
LC-MS 분석
실험재료 홍화씨 메탄올 추출물 10 mg을 메탄올 1 mL에 녹인 후 0.45
2006년 강원도 양양에서 채취한 홍화씨의 기름을 짜고 남은 홍 µm membrane 필터를 사용하여 정제한 용액을 LC-MS 시료로 사
화씨 탈지 분말 100 g을 실험재료로 사용하였다. ABTS, potassium 용하였다. Varian HPLC-MS system은 ProStar 410 autosampler, 2
persulfate는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사 개의 ProStar 210 pumps로 구성된 HPLC 시스템에 1200L qua-
용하였다. HPLC에 사용된 methanol, acetonitrile, water 등은 Fisher drupole mass spectrometer 가 장착된 LC-MS를 사용하였다. 시료
Scientific(Pittsburgh, PA, USA)에서, 분석용 용매들은 Daejung 의 이온화는 ESI(electron spray ionization) 방법을 사용하였다.
Chemicals(Siheung, Korea)에서 구입하여 사용하였다. HPLC 분석에는 LC-NMR과 같은 조건에서 수행되었다. Mass
spectrometer는 positive 모드에서 mass range=m/z 150-1000;
추출 및 농축 needle=5000 V; shield=600 V; nebulizing gas pressure(N )=60 psi;
2

홍화씨 탈지 분말 100 g에 메탄올 500 mL를 가한 후 3시간 동 drying gas(N ) flow rate=20 psi; drying temperature=300 C 조건
2
o

안 초음파추출을 3회 반복 수행하였다. 추출 용액을 진공농축기 에서 분석되었다.

를 사용하여 감압 농축하여 메탄올 추출물 18.42 g을 얻었다. 메
탄올 추출물을 온라인 항산화 분석 시스템, LC-NMR과 LC-MS 결과 및 고찰
에 적용하여 홍화씨 성분 연구에 사용하였다.
온라인 항산화 장치를 통한 항산화 물질 탐색 및 항산화 정량
온라인 항산화 분석 홍화씨 메탄올 추출물로부터 온라인 항산화장치를 통하여 항
홍화씨 메탄올 추출물 10 mg을 메탄올 1 mL에 녹인 후 10 L 산화 물질을 탐색하였다(Fig. 1). 온라인 항산화 분석에서 항산화
를 온라인 항산화 분석에 사용하였다. 항산화 분석시스템은 binary 분석을 위하여 사용된 방법은 ABTS 라디칼 소거활성법이다.
pump, diode array detector(DAD)로 구성된 Agilent 1200 HPLC HPLC에 의해 분리된 각각의 단일 성분은 컬럼을 통과하고 난
system(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)에 pump, UV- 후 펌프 시스템에 의해 공급된 ABTS 라디칼 시약과 반응 오븐
Vis detector로 구성된 ABTS 시약을 공급하는 펌프 시스템, 그리 에서 라디칼 소거 반응이 이루어진 후 UV-visible 검출기에 의해
고, passive splitter, reaction loop로 구성된 라디칼 소거 반응이 이 서 라디칼의 감소량이 측정되게 된다(Fig. 1a). 한편, 본 실험에
루어지는 반응 오븐이 결합되어 완성되었다(Fig. 1a). ABTS 시약 사용된 온라인 항산화 분석 장치에는 라디칼 시약으로 ABTS 대
은 2 mM ABTS, 3.5 mM potassium persulfate가 되도록 물에 녹 신 DPPH 라디칼 또한 사용될 수 있다. 하지만 반응 속도가 빠
인 후, 이 용액을 갈색병에 8배 희석한 후 상온에서 12시간 반 른 ABTS 라디칼과는 달리, DPPH 라디칼의 반응 속도는 화합물
응시켜 ABTS 라디칼이 만들어지도록 하였다. 컬럼은 YMC 에 따라서 매우 다르다고 알려져 있는데, 비타민 C의 경우는 EC 50

Hydrosphere C [150×4.6 mm 5 µm i.d.(YMC Inc., Wilming-

18 농도에서 동적평형상태(steady state)로 도달하는 시간이 1.15분인
ton, NC, US)] 컬럼을 사용하였다. HPLC 이동상 용매는 acetoni- 데 반해 rutin의 경우 103분이 걸린다(17). 경우에 따라서는 ABTS
416 한국식품과학회지 제 42 권 제 4 호 (2010)

Table 1. Relative antioxidant activity of each compound in the

defatted safflower seed extract by on-line HPLC-ABTS analysis
1)
Compound Total A B C
2)
TE value 527.4 0.31 131.6 260.6
3)
(%) (100) (0.1) (24.9) (49.4)
1)
Total: Total methanol extract of the defatted safflower seed.
2)
TE value: Trolox Equivalent value in 0.1 mg methanol extract of the
defatted safflower seed injected to on-line HPLC-ABTS analysis.
3)
Relative ABTS radical scavenging activity of each compound in the
study.

A의 경우 항산화도가 전체의 약 0.1% 정도로써, HPLC 크로마토

그램에서 피크의 면적으로 판단했을 경우 화합물 B와 C에 비슷
한 면적을 가지면서 홍화씨 추출물에서 상대적으로 낮은 항산화
도를 나타내는 것으로 판단할 수 있었다. 하지만 본 실험에서 수
행한 항산화 정량값은 총 항산화도에서 각 화합물이 차지하는 상
대적인 비율만을 비교한 것으로, 각 화합물의 절대적인 정확한
항산화도를 얻기 위해서는 각 화합물의 분자량에 따른 정확한 몰
농도를 구한 후에 Trolox 값과 비교하여 TEAC(Trolox equivalent
antioxidant capacity) 값을 구하여야 하므로, 추출물에 존재하는 각
화합물의 정확한 양을 분석해야 가능하다(21). 따라서 화합물 A
Fig. 1. The schematic diagram of on-line HPLC-ABTS system
가 총 항산화도에서 차지하는 비율이 상대적으로 낮더라도, 화합
(a) and its chromatogram from the methanol extract of the
defatted safflower seeds (b). The HPLC chromatogram of the 물 A의 절대적 항산화도가 낮다고 판단하기에는 무리가 있다.
extract was detected at 320 nm for phenolic compounds and the
ABTS radical scavenging activity of each compound was expressed LC-NMR를 통한 각 화합물의 구조 규명
as negative peaks at 734 nm.
온라인 항산화 분석 장치를 통하여 단일 물질로 분리되고, 항
산화 활성을 가지고 있는 화합물 A-C에 대해서, 빠르게 구조를
라디칼과는 잘 반응하는 항산화 물질이 DPPH와는 전혀 반응하 규명하기 위해서 우선 LC-NMR 분석을 수행하여 H-NMR 데이 1

지 않을 수도 있다고 알려져 있다. 따라서 본 실험에서는 다양한 터를 얻었다. Fig. 2에서 볼 수 있는 것처럼 화합물 A-C의 H- 1

페놀성 성분이 포함되어 있는 것으로 알려진 홍화씨 추출물의 분 NMR 데이터에서는 효과적으로 용매 피크가 억제되어 화합물의
석에 라디칼 시약으로 ABTS를 사용하였다. Fig. 1b에는 온라인 수소 피크들이 잘 나타나 있는 것을 알 수 있었다.
항산화 분석 장치에 의한 홍화씨 추출물의 라디칼 소거 활성 결 우선 화합물 A의 H-NMR spectrum을 살펴보면(Fig. 2a), δ
1

과가 나타나 있다. 홍화씨 추출물에는 ABTS 라디칼을 감소시키 2.77, 2.54 ppm과 δ 3.15, 2.98 ppm에서 각각 double doublet과
는 많은 화합물이 있는 것으로 보아 다종의 항산화 물질을 포함 two doublet으로 나타난 수소 피크를 확인하였다. 또한 δ 4.99
하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 실제로 홍화로부터는 많은 항 ppm에서 anomeric proton 피크를 확인하였으며, 이 때 coupling
산화 물질이 분리되어 보고되었다(18-20). 특히 Kim 등(19)은 홍 constant가 J=7.6인 것으로 보아 β형의 당이 결합하고 있음을 추
화씨로부터 분리한 12종의 페놀성 성분에 대해 라디칼 소거 활 정하였다. 또한 δ 3.45와 δ 4.11 ppm 사이에서 당에 결합하고 있
성을 측정하여 보고한 바 있고, Chung 등(20)은 홍화로부터 다종 는 수소 피크들을 확인하였고, 피크들이 분리되는 양상으로 보아
의 플라보노이드 화합물을 분리하여 그들의 항산화 활성을 측정 결합하고 있는 당이 glucose일 것으로 추정하였다. 그 외 3개의
하였다. 본 연구의 HPLC 조건에서는 화합물 A-C가 순수한 단일 methoxyl(-OCH )기의 피크들(δ 3.82, δ 3.80, δ 3.79 ppm)을 확인
3

성분으로 분리가 되었고, 이들 성분은 ABTS 라디칼 소거활성을 하였다. 이상의 결과와 홍화씨로부터 보고된 화합물의 문헌치와
보여 항산화 성분인 것을 확인할 수 있었다. 특히 화합물 B와 C 비교하여 볼 때, 화합물 A는 8'-hydroxyarcgenin-4'-O-β-D-glucoside
의 경우는 매우 강한 라디칼 소거능을 보여 홍화씨 추출물의 항 로 구조 동정되었다(19). 화합물 B의 H-NMR spectrum(Fig. 2b)
1

산화 기능에 있어서 매우 중요한 위치를 차지한다는 것을 확인 에서 AA' BB' type의 aromatic 수소 유래의 피크 [δ 7.31 ppm
할 수 었었다. 따라서 이들 세 성분의 라디칼 소거능이 추출물의 (1H, d, J=8.6 Hz, H-2',6'), δ 6.89 ppm(1H, d, J=8.5 Hz, H-3',5')]
총 라디칼 소거능에서 차지하는 비율을 측정하기 위해 항산화 정 와 ABC type의 수소 피크 [δ 7.04 ppm(1H, d, J=2.3 Hz, H-4),
량 분석을 실시하였다(Table 1). 항산화 정도를 표현하기 위해서 δ 6.76 ppm(1H, dd, J=2.3, 8.6 Hz, H-6), δ 7.49 ppm(1H, d, J=
본 실험에서는 수용성 항산화 화합물인 Trolox를 10-400 µM 농 8.6 Hz, H-7)]로부터 벤젠의 존재를 확인 할 수 있었다. 나머지 피
도 범위에서 온라인 항산화 분석을 실시하여 정량 곡선을 작성 크들과 문헌치와 비교한 결과 유사하였기에 화합물 B는 N-(p-
한 후, 홍화씨 추출물의 각 화합물의 항산화 정도를 TE(Trolox Coumaroyl) serotonin으로 동정하였다(22). 화합물 C의 H-NMR 1

Equivalent)값으로 표현하였다. 우선 홍화씨 추출물의 총 항산화 spectrum(Fig. 2c)에서는 ABC type의 aromatic 수소 유래의 피크
정도는 527.4 TE/0.1 mg였고, 화합물 A-C의 항산화 값은 각각 [δ 7.04 ppm(1H, d, J=2.2 Hz, H-4), δ 6.76 ppm(1H, dd, J=2.3,
0.31, 131.6, 260.6 TE/0.1 mg이었다. 항산화도가 가장 큰 화합물 8.6 Hz, H-6), δ 7.31 ppm(1H, d, J=8.7 Hz, H-7)]과 [δ 7.19 ppm
은 화합물 C로써, 총 항산화도의 약 49.4%에 해당하였다. 화합 (1H, s, H-2'), δ 6.90 ppm(1H, d, J=8.2 Hz, H-5'), δ 7.10 ppm
물 B는 약 25% 정도의 항산화도를 가지고 있어, 화합물 B와 C (1H, d, J=8.2 Hz, H-6')]로부터 벤젠의 존재를 확인할 수 있었으
의 항산화도 합계는 전체의 약 75%에 해당하였다. 한편 화합물 며, δ 7.37 ppm(1H, d, J=15.7 Hz)과 δ 6.42 ppm(1H, d, J=15.7
 Hyphenated-HPLC 기술을 활용한 홍화씨의 항산화 성분 분석 417

Hz)의 수소 피크로부터 trans-olefin 구조를, 그리고 δ 3.87 ppm의

피크로부터 methoxyl(-OCH )기의 수소를 확인하였다. Spectrum의
3

나머지 부분도 이미 보고된 문헌치와 유사하였기에 화합물 C는

N-feruloylserotonin으로 동정하였다(23). 각 화합물의 H-NMR 1

spectrum 데이터를 Table 2에 정리하였고, 각 화합물의 구조를 Fig.

3에 나타내었다. 본 실험에서 규명된 세 가지 물질, 8'-hydroxyarc-
genin-4'-O-β-D-glucoside(A), N-(p-Coumaroyl) serotonin(B), N-fer-
uloylserotonin(C) 화합물은 이미 여러 연구에 의해 탈지 홍화씨로
부터 분리 및 구조 규명이 되었고, 그 생리적 효과도 조사되었다
(24,25). 특히 본 연구에 의해서 밝혀진 것처럼 serotonin 유도체
등은 강한 항산화 능력으로 인해 low-densitiy lipoprotein(LDL) 산
화를 저해하여 동맥경화(Atherosclerosis)를 저해하는 것으로 보고
되었다(26). 또한 탈지 홍화씨에는 본 실험에서 구명된 serotonin
화합물 외에 N-(p-Coumaroyl) serotonin-5-O-β-D-glucoside, N-feru-
loylserotonin-5-O-β-D-glucoside 등의 serotonin 배당체 등도 분리,
보고되었다(19).
LC-NMR은 이상에서 볼 수 있는 것처럼 식물 추출물과 같은
혼합물로부터 HPLC를 사용하여 단일 물질로 분리한 후, 각 단
일 화합물의 구조를 분석할 수 있는 매우 강력한 도구가 될 수
있다. 하지만, 현재까지의 기술로는 극복 되어야 할 몇 가지의 단
점이 존재한다. 그 중 첫 번째는, NMR 신호는 화합물의 농도에
비례하여 증가하기 때문에 혼합물에 포함된 단일 물질의 NMR
1
Fig. 2. H-NMR chromatogram of peak A-C from stop-flow LC- 데이터를 얻을 수 있는 농도가 LC-MS와 같은 다른 분석 기기에
NMR spectroscopy. 비해 훨씬 높다는 것이다. 따라서 분석 가능한 NMR 신호를 얻

1
Table 2. H NMR data from stop-flow LC-NMR of the defatted Safflower seeds
Position A B C
1
H-NMR
2 6.78(d, J =6.69 Hz) 7.16(s) 7.17(s)
4
7.04(d, J =2.36) 7.04(d, J =2.23)
5 6.95(d, J =8.76 Hz)
6 6.78(d, J =6.69 Hz) 6.76(dd, J =2.33, 8.68) 6.76(dd, J =2.34, 8.66)
7 2.54(dd, J =3.89, 13.57 Hz) 7.49(d, J =8.67) 7.31(d, J = 8.70)
2.77(dd, J =4.44, 13.15 Hz)
8 2.51(d, J =12.94 Hz)
9 3.53(m)
10 2.94(t, J =6.66) 2.95(t, J =6.87)
11 3.57(t, J =6.94) 3.58(t, J =6.85)
2' 6.82(d, J =1.8) 7.31(d, J =8.66) 7.19(s)
3' 6.89(d, J =8.51)
5' 7.07(d, J =8.38) 6.89(d, J =8.51) 6.90(d, J =8.25)
6' 6.75(d, J =8.32) 7.31(d, J =8.66) 7.10(d, J =8.26)
7' 2.98(d, J =13.88) 7.39(d, J =15.86) 7.37(d, J =15.74)
3.15(d, J =13.92)
8' 6.40(d, J =15.74) 6.42(d, J =15.79)
OCH 3
3.82, 3.80, 3.79 3.87
Glucose
1' 4.99(d, J =7.61)
2' 3.49(m)
3' 3.69(m)
4' 3.45(m)
5' 3.51(m)
6' 4.09(d, J =5.37)
4.11(d, J =4.80)
418 한국식품과학회지 제 42 권 제 4 호 (2010)

LC-MS를 통한 분자량 확인
앞서 LC-NMR을 통해 규명된 화합물에 대한 추가적인 정보를
얻고자 LC-MS를 통하여 각 화합물의 분자량을 확인하였다(Fig.
4). HPLC 분석에는 LC-NMR과 같은 조건을 사용하였고, 이온화
는 ESI 방법을 사용하여 positive mode에서 측정하였다. 화합물
A의 경우(Fig. 4a) parent ion으로 m/z 568을 보여 주었고, 이는
[M+H O] 에 해당되는 것으로 8'-hydroxyarcgenin-4'-O-β-D-glucoside
2
+

의 분자량인 550과 일치하는 결과를 얻었다. MS spectrum에서

보인 m/z 371의 fragment는 [M+H-H O-162(hexose)] 에 해당하는
2
+

것으로 한 분자의 glucose 그룹이 떨어진 것을 확인할 수 있었다.

화합물 B의 MS spectrum에서는(Fig. 4b) parent ion으로 m/z 323
을 보여주었는데, 이는 [M+H] 에 해당되는 것으로 화합물 B의
+

분자량이 322임을 확인하였고, 이는 보고된 문헌치와 일치하였다

(22). 화합물 C의 경우는(Fig. 4c) 화합물 B의 구조와의 차이가
단지 methoxyl(-OCH )기가 더 있는 것이고, 따라서 화합물 B와
3

의 분자량 차이가 30이 나는데, 화합물 C의 MS spectrum에서 m/z

355의 parent ion 피크를 보여주어 예상했던 결과와 일치하는 결
Fig. 3. Chemical structures of compound A-C from the defatted 과가 얻어져, 화합물 C의 구조를 N-feruloylserotonin으로 확인할
safflower seeds. 수 있었다.

기 위해서 혼합물의 농도를 높여야 하고, 그렇게 되면 HPLC 컬 요 약

럼의 분리능이 떨어져 단일 물질을 많이 분리할 수 없는 결과가
초래된다(24). 본 실험에서는 이러한 단점을 극복하고자, NMR 본 연구에서는 세 종류의 hyphenated-HPLC 기술을 활용하여
프로브(probe)로 proton enhanced cold probe를 사용하였다. 두 번 홍화씨로부터 3종의 항산화 화합물의 구조를 규명하였다. 우선
째 단점으로는 화합물의 구조 해석에 매우 중요한 탄소 NMR을 온라인 항산화 분석 장치를 통하여 홍화씨 추출물로부터 ABTS
측정할 수 없다는 것이다. 현재까지는 LC-NMR을 활용하여 COSY, 라디칼 소거활성을 가지는 성분을 검색 및 항산화 정량을 수행
HMBC와 같은 2D NMR을 측정할 수 있지만, 혼합물에 포함되 한 후, 단일 물질로 분리되고, 항산화 활성을 가지는 세 가지 화
어 있는 탄소 NMR을 측정하기에는 단일 물질의 농도를 높일 수 합물에 대해서 구조 규명을 시도하였다. 우선 LC-NMR을 이용하
있는 한계가 있기 때문에 탄소 NMR을 측정하고 있지 않는 실 여 stop-flow mode에서 이들 세 가지 화합물에 대해 H-NMR 1

정이다(27). 따라서 현재까지의 기술로는 LC-NMR의 단독 사용 spectrum데이터를 얻은 결과 각 화합물은 8'-hydroxyarctigenin-4'-

만으로는 미지 화합물 구조를 완벽하게 규명하기에는 어려움이 O-β-D-glucoside, N-(p-coumaroyl) serotonin, N-feruloylserotonin으
따르고, LC-MS 등의 다른 분석 기기의 도움이 필요한 실정이다. 로 확인되었다. 그리고 LC-ESI-MS를 활용하여 각 화합물에 대
만약 이러한 단점들이 극복될 수 있다면 LC-NMR은 어떠한 분 한 분자량에 대한 정보를 얻어 LC-NMR에서 규명된 화합물이
석 기기보다 천연물의 구조 해석에 있어 유용한 도구가 될 수 있 정확함을 다시 한 번 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 기존의
을 것이다. 탐색방법인 여러 크로마토그래피 방법이나 preparative HPLC 등

Fig. 4. LC-ESI/MS chromatogram of compound A-C at positive mode from the defatted safflower seeds.
 Hyphenated-HPLC 기술을 활용한 홍화씨의 항산화 성분 분석 419

을 이용하여 활성물질을 분리하고 off-line NMR, MS 등을 활용 2,2'-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) methods. J. Agr. Food
Chem. 54: 1151-1157 (2006)
하여 구조를 규명하는 방법에 비하여, hyphenated-HPLC 방법을
12. Dapkevicius A, van Beek TA, Niederlnder HA. Evaluation and
활용하여 혼합물 상태인 추출물을 분리하지 않고 신속하게 단일 comparison of two improved techniques for the on-line detection
성분의 구조를 규명하고, 또한 각각의 성분에 대한 항산화도를 of antioxidants in liquid chromatography eluates. J. Chromatogr.
측정할 수 있다는 장점이 있음을 증명하였다. 이는 천연물 또는 A 912: 73-82 (2001)
13. Niederlnder HA, van Beek TA, Bartasiute A, Koleva II. Antioxi-
식품 분야의 연구에 있어 추출물의 항산화 성분을 분석하고 그 dant activity assays on-line with liquid chromatography. J. Chro-
구조를 신속 간편하게 확인할 수 있으므로 항산화 성분 탐색 및 matogr. A 1210: 121-134 (2008)
변이 연구에 매우 유용하리라 생각된다. 14. Pukalskas A, van BeeK TA, de Waard P. Development of a triple
hyphenated HPLC-radical scavenging detection-DAD-SPE-NMR
system for the rapid identification of antioxidant in complex plant
감사의 글 extracts. J. Chromatogr. A 1074: 81-88 (2005)
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본 연구는 지식경제부 지방기술혁신사업(RT105-01-02)지원으로 16. Palter R, Lundin RE, Haddon WF. A cathartic lignan glycoside
수행되었음. isolated from Carthamus tinctorus. Phytochemistry 11: 2871-2874
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