UJI STERILITAS

Iin Susanti
Jakarta, 10 November 2015

1
 Uji Sterilitas
Uji Sterilitas
• Tidak
Tidak digunakan untuk menjamin bahwa produk 
digunakan untuk menjamin bahwa produk
steril

MUTU HARUSLAH DIBENTUK KE DALAM PRODUK
TIDAK CUKUP HANYA SEKEDAR LULUS UJI
UJI MERUPAKAN BAGIAN DARI RANGKAIAN 
UJI MERUPAKAN BAGIAN DARI RANGKAIAN
TINDAKAN PENGENDALIAN

3
 Uji Sterilitas
Uji Sterilitas
• USP
USP <71>
<71>
• The test is applied to substances, preparations, 
or articles which according to the
or articles which, according to the 
Pharmacopoeia, are required to be sterile
• However, a satisfactory results only indicates 
H if l l i di
that no contaminating micoorganism has been 
f
found in the sample examined under the 
di h l i d d h
conditions of the test

4
 FASILITAS untuk UJI STERILITAS
• Kondisi aseptis
• Kelas A unidirectional airflow protected zone 
K l A idi ti l i fl t t d
atau biosafety cabinet, dengan backgroud 
kelas B
kelas B
• Alternatif: menggunakan isolator
• Working conditions should be monitored 
regularly (Environment Monitoring Program):
– Air sampler, settling plates, contact agar 
– EM should be performed under operational 
p p
(dynamic) conditions  
5
 Isolator di Industri Farmasi
Isolator di Industri Farmasi
• Tujuan:
– Sebagai containment untuk penanganan 
dangerous materials
– Proses aseptis dalam lingkungan yang terkontrol 
(microbiologically controlled environment)
• Negative pressure or positive pressure

6
• Kelebihan isolator:
– Tidak memerlukan background kelas B
Tidak memerlukan background kelas B
– Bisa ditempatkan di non‐class environment
– Environment monitoring “lebih ringan”
g g
• Kekurangan:
– Harga (? ‐
g appraisal cost)
pp
– Perlu penanganan khusus (cleaning, desinfeksi, tata cara 
bekerja menggunakan isolator)

7
 Personnel
• Trained
Trained & qualified to perform sterility testing
& qualified to perform sterility testing
• Supervisors should ensure that all personnel 
follow the SOP.
follow the SOP.
• Personnel should undergo periodic re‐
qualification, particularly when problems are
qualification, particularly when problems are 
detected during the course of routine EM or 
when operators perform the test infrequently
• Training should include gowning procedure to 
enter facility
 SAMPLE
Number of items in the  Minimum no. of items to be 
batch tested for each medium
Parenteral Preparation
10% or 4 containers, whichever is the 
Not more than 100 containers
greater

More than 100 but not more than 500 
10 containers
10 containers
containers

More than 500 containers 2% or 20 containers, whichever is less

For large volume parenteral 2% or 10 containers, whichever is less

etc

USP 38; <71> Sterility Tests; page 129, Table 3

 Minimum Quantity to be Used 
for each Medium
• If the contents of each article are of sufficient 
q
quantity, they maybe divided so that equal 
y, y y q
appropriate portions are added to each of the 
p
specified media.
• If each articles does not contain sufficient 
quantities for each medium use twice the
quantities for each medium, use twice the 
number of articles indicated in Table 3
 Minimum  Quantity to be 
Quantity per container
Used
Liquid

Less than 1 mL The whole contents of each container

Half the contents of each container, 
1‐40 mL
but not less than 1 mL

Greater than 40 mL, and not greater 
20 mL
than 100 mL
Greater than 100 mL 10% of the contents  of container

etc

USP 38; <71> Sterility Tests; page 128, Table 2

Perlukah Antibiotik dan produk yang 
mengandung pengawet  diuji sterilitasnya???
 Uji Sterilitas: 
Sterilitas: antibiotik & pengawet
& pengawet

Antibiotik dan pengawet perlu dinetralkan
Antibiotik dan pengawet perlu dinetralkan
HOW ??
• Dilution 
Dil ti
• Chemical neutralization, e.g: Tween 80
• Filtration 
• Enzyme activity, e.g: β‐lactamase
• Combination of the above four methods
 SAMPLING
• Sample  awal, tengah, akhir dari proses filling
Sample awal tengah akhir dari proses filling
• Atau diambil setiap interval waktu tertentu
• After significant intervention
 Sterility Test: Methods
Sterility Test: Methods
DIRECT INOCULATION
DIRECT INOCULATION
MEMBRANE FILTRATION
Open system
O t
Closed system

Sebisa mungkin metoda yang dipilih adalah 
membran filtrasi. Apabila tidak 
memungkinkan, barulah digunakan metoda 
direct inoculation.
Membrane Filtration: Closed system
Membrane Filtration:  Closed system
Membrane Filtration: Open System
 Membrane Filtration
• Filtration should be followed by minimum 
number of washes of the membrane
b f h f h b
• The membrane should not be permitted to 
dry out between filtration step
• Pore size of the membrane ≤ 0.45µm:
µ
– cellulose nitrate: aqueous, oily & weakly alcoholic 
solution
– cellulose acetate: strongly alcoholic solution
• When
When small volumes is tested, filter should be 
small volumes is tested, filter should be
pre‐wetted 
Sterility Test Direct Inoculation
Sterility Test – Direct Inoculation
 Direct Inoculation: General Procedure
Direct Inoculation:  General Procedure
• Aseptically transfer the sample directly into 
the culture media
• Sample volume less than 10% of the volume 
p
of the medium
• If product with antimicrobial activity :
If product with antimicrobial activity :
– Carry out the test after neutralizing the B&F effect
– Neutralizing substance / dilution
g
• Incubate
• Examine for turbidity
Examine for turbidity
 Direct Inoculation
Direct Inoculation
• When it is necessary to use a large volume of 
y g
the product, it may be preferable to use a 
p p
concentrated culture medium prepared in 
such a way that it takes into account the 
q
subsequent dilution.
• Where appropriate, the concentrated medium 
maybe added directly to the product in its
maybe added directly to the product in its 
container

21
 Culture Media
Soybean‐Casein Digest Medium (SCDM, TSB)
• Suitable for both aerobic bacteria and fungi
• Incubated at 20‐25°C (EP) and 22.5°C +/‐ 2.5°C (USP)

 Fluid Thioglycollate
gy Medium (FTM)
( )
• Primarily intended for the culture of anaerobic 
bacteria. It will also detect aerobic bacteria
• Resazurin sodium solution as an indicative of oxygen
• Ratio surface to depth : Not more than 1/3 pink colour
during the storage and 1/2 at the end of the
during the storage and 1/2 at the end of the 
incubation period 
• Incubated at 30‐35°C (EP) and 32.5°C +/‐ 2.5°C (USP)
• Expiry date shall be defined & validated
 Testing of Media
Testing of Media
• pH
p
– FTM : 7.1 ± 0.2
– SCDM : 7.3 ± 0.2
• Sterility: 
St ilit
– All media should pre‐incubated for 14 days at appropriate 
test temperature to demonstrate sterility prior to use.
– Alternatively, this control test may be conducted 
concurrently with the sterility test.
– No growth occurs
• Growth Promotion Test
 Growth Promotion Test
• Challenge organism strain used:
– Aerobic: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas 
p y , ,
aeruginosa
– Anaerobic: Clostridium sporogenes
– Fungi: Candida albicans, Aspegillus niger
• Inoculation: 10‐100 CFU:
– FTM: S.aureus, P.aeruginosa & C.sporogenes
– SCDM: B.SUbtilis, C.albicans & A.niger
• Growth of organism should be clearly visible in the test media 
within 3 days for bacteria and 5 days for fungi
• It may be performed concurrently with the sterility test
It may be performed concurrently with the sterility test
• Cultures maintained by seed lot culture techniques should ≤ 5 
passages from the original type culture strain which was 
obtained from a recognized reference culture supplier  
bt i d f i d f lt li
 Observation
• Observation
Observation at interval during the incubation 
at interval during the incubation
period
• Media is examine for macroscopic evidence of 
Media is examine for macroscopic evidence of
microbial growth
• Evidence of growth: media become turbid
E id f h di b bid
 Stasis Test
Stasis Test
• Not
Not mandatory
mandatory
• The test is performed by inoculation of 10‐100 
CFU of challenge organisms directly to
CFU of challenge organisms directly to 
representative test containers of media 
containing product which do not display any
containing product, which do not display any 
signs of contamination at the end of 
incubation period
incubation period
 Interpretation of Results
p
• If no evidence of microbial growth is found 
( t bidit b
(no turbidity observed)
d)
comply / pass

• If evidence of microbial growth is found 
(turbidity is observed)
(turbidity is observed)
Not comply / not pass = HULS
 Penanganan HULS ‐ Sterilitas
• Investigasi
• A test may be repeated only when it can be demonstrated 
y p y
that the test was invalid
• Invalid conditions:
– EM
EM data not pass
data not pass
– A review of the testing procedure used during the test in question 
reveals a fault
– Microbial growth is found in the negative controls
Mi bi l hi f di h i l
– After determination of the identity of the micro‐organisms 
isolated from the test, the growth of this species may be ascribed 
unequivocally to faults with respect to the material and/or the 
i ll t f lt ith t t th t i l d/ th
technique used in conducting the sterility test procedure 
– Failure of challenge microorganisms to grow in the stasis test
 Repeat Test
Repeat Test
• If
If the test is declared to be invalid, it is 
the test is declared to be invalid it is
repeated with the same number of units as in 
the original test
the original test
• If no evidence of microbial growth is found in 
the repeat test the product pass
the repeat test, the product pass
• If microbial growth is found in the repeat test, 
the product is failed and should be rejected
h d i f il d d h ld b j d
 VALIDASI
VALIDASI 
UJI STERILITAS
UJI STERILITAS 
 Validasi Uji Sterilitas
Validasi Uji Sterilitas
• Objective:
Certain products may contain 
b
bacteriostatic or fungistatic agents which, 
i i f i i hi h
if not neutralized, will inhibit the growth 
of viable microorganisms present in the 
p
product, producing false negative results.
,p g g
 Validasi Uji Sterilitas
Validasi Uji Sterilitas
Also referred to as a bacteriostasis and 
Also referred to as a bacteriostasis and
fungistasis test
performed in the presence of the product to
performed in the presence of the product to 
determine whether inhibitory properties in 
the product have been neutralized at the
the product have been neutralized at the 
beginning of the sterility test incubation 
period.
period
 Validasi Uji Sterilitas:
j
• Method Suitability Test
• Membrane Filtration:
After transferring the content of the container(s) to be 
tested  to the membrane, add an inoculum of a small 
number of viable microorganisms (not more than 100 CFU) 
to the final portion of sterile diluent used to rinse the filter
to the final portion of sterile diluent used to rinse the filter
• Direct inoculation:
After transferring the content of the container(s) to be 
After transferring the content of the container(s) to be
tested  to the culture medium, add an inoculum of a small 
number of viable microorganisms (not more than 100 CFU) 
to the medium
 Culture Media: Suitability Test
Culture Media: Suitability Test
• The suitability test have to be carried out before, or in parallel 
y , p
with the validation 
• Media Sterilityy
Avoid 
sterility testing should be performed to confirm the 
False  sterility of the microbiological medium.
Positive

• Media Growth promotion Test
To confirm the ability of the test medium to support
To confirm the ability of the test medium to support 
Avoid 
False  the growth and reproduction of selected 
Negative
microorganisms.
 Growth Promotion Test
Growth Promotion Test
 FTM incubated at 30‐35°C (EP), 32,5 + 2.5°C (USP) with :
( ), , ( )
• Clostridium sporogenes anaerobic
• Pseudomonas aeruginosa aerobic 
• Staphylococcus aureus aerobic
 SCDM incubated at 20‐25°C (EP), 22,5 + 2,5°C (USP) with
• Aspergillus niger fungi
• Bacillus subtilis aerobic
• Candida albicans
C did lbi f
fungii
 Tambahan in‐house microflora
 Validasi Uji Sterilitas: Challenge organism
Validasi Uji Sterilitas: Challenge organism
Same microorganism used in Growth 
promotion test
i
• Clostridium sporogenes 
• Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa 
• Staphylococcus aureus
• Aspergillus niger 
• Bacillus subtilis 
ill b ili
• Candida albicans
• In‐house culture (obtain from EM)

10‐100 CFU
The challenge inoculum should be verified by
The challenge inoculum should be verified by 
concurrent viable plate counts.
V lid i Uji St ilit I t
Validasi Uji Sterilitas: Interpretation Result
t ti R lt
 If clearly visible growth of microorganisms obtain 
y g g
after the incubation, visually comparable to that in 
the control vessel without product, either the 
product possesses no anti‐microbial activity under 
the condition of the test or such activity has been 
satisfactorily eliminated
satisfactorily eliminated
 If no visible growth, modify the condition in order to 
eliminate the antimicrobial activity and repeat
eliminate the antimicrobial activity, and repeat 
validation
 Validasi Uji Sterilitas: Acceptance Criteria

bacteria grows within 3 days
grows within 3 days
fungi
g ggrows within 5 days
y
 Validasi Uji Sterilitas: WHEN ?

New Product
There is a change in the condition of 
th t t
the test
40