Troubleshooting 

Problems with the Prothrombin Time (Protime/INR), the activated Partial Thromboplastin 
Time (aPTT) and the Fibrinogen Assay 

Problems with an analytic method may be discovered through unacceptable performance on an external quality 
assessment (EQA)/proficiency testing (PT) challenge, through the regularly scheduled quality control (QC) or, occasionally, 
through changes in patient testing. Regardless of the way that a problem is identified, the troubleshooting begins with a 
detailed evaluation of the QC program. When unacceptable results are reported on a PT challenge, the QC must be 
evaluated when the unacceptable results are reported and for the earlier time when the testing on the PT specimen was 
performed. Following are principles that will be useful in such an evaluation. 
 
There are two general types of analytical errors, systematic and random.  Systematic errors are ones that affect the test 
system and results in a consistent way such that all results show a bias from the accurate result.  An example of this would 
be a failing reagent that is used in all reactions for this analyte.  In this case, all or more than one QC value is expected to be 
out of acceptable limits.  Random errors affect some, but not all results, and are more indicative of a failure in precision of 
the test system.  An example of a random error is bubbles in liquid delivery tubing so that occasionally the wrong volume is 
delivered. 
 
As soon as an out of limits QC result is obtained all patient testing must be suspended pending identification and correction 
of the problem. When an individual QC test result falls outside limits then either there is a problem with the individual vial 
of QC material, the entire batch of QC has deteriorated or there is a problem with the analytical system. It is important to 
differentiate among these possibilities by sequential investigations so that appropriate action can be taken. Stating the 
obvious, all reagents and controls need to be examined to be certain that they have not passed their expiration dates and 
that they have been continuously stored under the conditions recommended by the manufacturer.  
 
In most laboratories Protime/INR, aPTT and fibrinogen methods are in operation on the same analyzer at the same time. In 
this case scrutiny of the whole pattern of QC results for all methods may be informative. Table 1 illustrates how different 
patterns of QC results can help identify the nature of the analytical problem. It is common practice, when a QC value is out 
of limits, to repeat the test with the same control, then with a new vial of control. It is much better to first evaluate all of 
the QC data, and pursue the problem that is indicated by all control results. 
 
The most common cause of an out of control test system in hemostasis laboratories is reagent deterioration or 
contamination. As mentioned above, all QC results will be out of limits and in this case reagents should be discarded. 
Patient testing should only be safely resumed after the problem has been identified and rectified. 
 
When dealing with control problems involving a single method, many laboratories use the Westgard multirule system for 
determining acceptance of quality control values.  Use of these rules can be a useful tool for guiding a troubleshooting 
journey. Rules most commonly used include: 
 1‐3S – one control value outside of 3 SD is a cause for rejection.  This rule detects large imprecision in a test 
system. 
 2‐2S – two controls outside of 2 SD in the same direction, either within a run or 2 consecutive runs.  This indicates 
a bias in results and accuracy failure. If a laboratory is using a mean +/‐ 2SD acceptable limit for QC ranges, it is 
important to realize that based on statistics alone, 1 in 20 or 5% of results will be outside of this range when there 
is nothing wrong with the test system. Failing the Westgard 2‐2S rule indicates a high likelihood of error in the 
reagent or instrument used. If indicated, analysis of a second vial of the same batch of QC with the same 
reagents/method should be the first action. If this is within limits, it means that the out of range result was most 
likely random error, and the test system is under control but the QC sample analyzed earlier had deteriorated or 
been contaminated and should be discarded. This should be confirmed by performing a third QC test. If this is 
within limits then patient testing can be safely resumed. If, on the other hand, a second out of limits result is 
 obtained on the replacement QC vial of the same batch, this indicates systematic error and the most likely 
explanation is that the test system is out of control.  In this case analysis of a second lot or batch of QC material 
would also give out of limits results. If further vials of the first batch give out of limits results but the second batch 
of material gives within limits results, then the entire batch of the first QC material may have deteriorated. This is 
normally a rare occurrence. Thus having more than 1 lot of QC available is very useful when investigating the cause 
of out of limits QC results. 
 
In some instances there are compelling reasons to investigate a method with subsequent intervention even though recent 
QC results are within the target range. For a QC sample with appropriate target limits, analyzed with a well controlled 
method, the results obtained should fluctuate around the mean (Fig 1). However, a series of 7 to 10 results on the same 
material showing a progressive trend in one direction (i.e. gradually increasing or decreasing over time ; (Fig 1) may be an 
indication of drift in the analytical process. A gradual deterioration of a particular reagent over time, or gradual change in 
an analyser could be associated with such a pattern of QC results.  On other occasions there may be a series of individual 
QC results all within limits but consistently lying above or consistently below the mean (Fig 1). This may indicate that there 
has been a change in the method since the target range was established. In this case a new target range should be 
established and investigation of recent changes in the method as well as an assessment of the accuracy of the test is 
warranted (for example through external quality assessment or analysis of reference samples/materials). Where a batch or 
lot number of QC is used for more than 3‐4 months a recalculation of mean and SD is useful to confirm that the original 
range remains appropriate. 
 
Figure 2 depicts similar information that can be derived from a proficiency testing evaluation reports. In this case, the 
relationship of the reported data to the method mean is reported along with the same data for the past 15 reported values. 
Data labeled CG1‐C 2006 is close to the mean and scattered on both sides of the mean. In contrast, those data labeled CG1‐
A and CG1‐B 2006 all are lower than the mean for the method and appear to be slightly more negative with time. Even 
though all of these specimens were graded acceptable, this information is a very strong indication of a problem with the 
method. 
 
When the cause of out of limits QC results has been identified it is necessary to assess which patient results need to be 
repeated. If the problem relates to the deterioration of QC material no retesting is required. If the problem relates to 
reagents then all patient results obtained since the last within limits QC result should be reviewed. One practical approach 
is to retest every 10th sample in reverse order to establish at which point the problem might have developed. Any patient 
samples from that point onward require retesting.  
 
Some consideration of the instrument problems is also useful. In most cases, the laboratory pursues the QC problem as 
described above and, if there is no resolution; the manufacturer would be contacted for assistance with troubleshooting 
possible instrument problem. Potential instrument problems that may contribute to problems are numerous, some of 
which a trained technologist will be able to test. Such items may include but are not limited to:  
 temperature of the chamber storing reagents and specimens;  
 delivery volume and cleaning of the pipettes; contaminated our outdated diluent for QC material (e.g. water);  
 temperature of the reaction; timing of any required incubations;  
 for optical endpoints, wavelength of the nephelometer light source; cleanliness and output of the detector of the 
nephelometer;  
 for mechanical endpoint measurement, the detection of the impedance of motion of the mobile; accuracy of any 
instrument calculations;  
 instrument/computer interface and others.  
Some instrument failures will affect all testing being performed while other may selectively affect only some methods. 
 
Protime/INR 
In addition to the information above, there are a couple of specific issues to consider regarding the Protime/INR.  Table 2 
presents the data from a PT challenge. It demonstrates that the data for this method has little variation. CLIA grading 
criteria for the PT challenge states that in order to pass, the value must be within 15% of the mean for the group. In this 
case, 15% variation actually represents 6.4SD from the mean. In Figure 2, many of the values for CG1‐A and B for 2006 were 

Page 2
beyond 3SD of the mean, however none received a failing score. Despite passing this PT challenge, the method is clearly out 
of control and corrective action by the laboratory is needed.   
 
The INR presents a number of its own problems. In order for the INR to be accurate, the Protime in seconds must be 
accurate.  The Protime in seconds is then converted to the INR by the following calculation: 
INR = (Patient Protime / Mean Normal Protime) ISI 
 
 Several issues are critical in the management of this calculation including:  
 Has an appropriate reference range for your current reagent/instrument been identified? 
 Is the geometric mean of this reference range being used in the calculation? Some common software packages 
(such as Excel) have the capability of calculating a geometric mean. 
 Is the correct ISI being used in the calculation? The ISI varies not only with the lot of reagent but also with the 
instrument being used. If in doubt, contact the reagent manufacturer. 
 When performing the calculation, the values for the patient Protime and the Protime reference range mean 
include one decimal place (e.g. 12.0) and ISI should be included using two decimal places (e.g. 1.05). In each case, 
three significant digits. The INR should be then rounded and reported to one decimal place (e.g. 2.5; two 
significant digits). 
 How is the calculation being performed? Manually? By the instrument? By the LIS? The calculation should only be 
performed by one (not more than one) of these methods. Having more than one method in place increases the 
maintenance efforts and increases the risk of a miscalculation. 
 If a manual method of calculation is used, how do you minimize errors? 
 Is the calculation tested periodically to assure that the correct INR is being produced? In particular, this calculation 
must be validated prior to reporting results if any of the components of the formula (ISI or the geometric mean of 
the reference range) have changed. Actual patient reports should be periodically reviewed to assure that the 
clinician caring for the patient is receiving the correct result.  
 Are specimens collected into 3.2% citrate ‐ not 3.8%? Published reports have documented that INR results differ 
between the two‐citrate concentrations. Some laboratories continue to use 3.8% citrate despite international 
efforts to standardize on 3.2%. 
 
Activated Partial Thromboplastin Time (aPTT) 
aPTT reagents have become more sensitive in recent years, leading to some difficulty with PT and patient specimens that 
are prolonged. Table 3 depicts the situation in which the laboratory’s value has an SDI of 1.4, but still received an 
unacceptable score because the CLIA threshold of 15% was less than 2SD. The 15% level SDI was 1.2. In this case, wide 
variability of the high aPTT data would cause a frustrating unacceptable outcome. 
 
The aPTT is a two‐stage reaction, requiring the addition of a measured reagent, the phospholipid and the activator, 
followed by incubation of 2 ‐ 5 minutes, followed by the addition of calcium to initiate the reaction. The timing of these 
additions is specified by the manufacturer of the reagent and needs to be controlled very closely. If the timing is not 
correct, the error may not be detected by QC, but when compared to a peer group in an PT mailing, may be the cause of 
unacceptable results. 
 
Fibrinogen Assay 
Unlike the Protime and aPTT that are measured as a clotting time in seconds, the fibrinogen activity is reported as mg/dL or 
g/L and is a calibrated assay.  The exception to this is when determined as a derived fibrinogen based on the PT result.  The 
same actions taken to troubleshoot the PT as described above apply to troubleshooting derived fibrinogen activities. 
 
Fibrinogen activity is most commonly measured using the Clauss method – thrombin is added to diluted citrated plasma 
and the time to clot formation is measured.  A standard calibration curve is determined by testing several dilutions of 
plasma and the clotting times vs. concentrations in g/L or mg/dL are plotted on a graph.  Unknown samples’ fibrinogen 
activity is interpolated from the standard curve.  If the Clauss fibrinogen assay is run at the same time as the Protime/aPTT 
assays on an analyzer, it is important to test for reagent carryover and ensure adequate washing of the reagent delivery 

Page 3
probe.  The thrombin concentration in the fibrinogen activity assay reagent is high, and incomplete washing or the failure of 
a wash component on the analyzer can lead to shortening of the PT and PTT. 
 
When a QC or proficiency failure occurs with fibrinogen activity, it is important to first determine if the error is random 
(occurring with one level of QC), or systematic and affecting accuracy across the range of the assay.  If one level of QC is 
unacceptable, and repeats as acceptable, the incorrect result could be a random error (passes Westgard’s 2‐2s rule) and the 
test system accurate.  If one level of QC repeats as unacceptable, it could be due to a systematic error, effecting one end of 
the calibration curve and not over the entire linear range.  Potential sources of error to investigate and a logical 
troubleshooting scheme are listed in Table 4. 
 
Some analyzer models use a bar‐coded calibration curve specific to each lot of reagent.  These systems cannot be 
calibrated, and that troubleshooting step is skipped, leading directly to investigating changes in the instrument liquid 
delivery system, reaction temperature, or detection system.   
   
If more than one level of QC is unacceptable in the same direction, this indicates a bias in the test system and inaccurate 
results.  The first action is usually to re‐assay QC with freshly prepared reagent.  Reagents may show substandard 
performance if left exposed to air for a prolonged period due to a pH change or due to contamination.  If this does not 
correct the problem, recalibrate the assay since drift in reagent responsiveness or with the instrument over time can shift 
the results away from the mean.  Ensure that the correct calibrator value is entered into the system for the lot of calibrator 
material in use.  If the bias is not corrected with these actions, further investigation of the analyzer systems is warranted.  
Comparing the new calibration curve with the old can be useful tool (Fig 3).  If the calibration curves have not changed, a 
problem with the control material is indicated.  If the curves are parallel to each other across the measurable range, 
showing a parallel bias, an instrument or calibrator material shift is indicated.  If the curves intersect or demonstrate an 
inconsistent bias over the linear range, this may be due to a deteriorating reagent. 

Reference:

Krishnan J. Coagulation testing. In: An Algorithmic Approach to Hemostasis Testing. Kottke‐Marchant K. CAP Press, 
Northfield, IL: 2008, pp 63‐92. 
 
Kitchen S, Preston FE, Olson JD. Internal Quality Control in the Hemostasis Laboratory. In: Quality in Laboratory Hemostasis 
and Thrombosis. Kitchen S, Olson JD, Preston FE, ed. Wiley‐Blackwell, West Sussex, England: 2009, pp 43‐50.  
 
Chandler WL. Initial Evaluation of Hemostasis: Reagent and Method Selection. In: Quality in Laboratory Hemostasis and 
Thrombosis. Kitchen S, Olson JD, Preston FE, ed. Wiley‐Blackwell, West Sussex, England: 2009, pp 63‐71.  
 
Olson JD, Brandt JT, Chandler WL, et al. Laboratory Reporting of the International Normalized Ratio Progress and Problems. 
Arch Path Lab Med, 2007;131(11):1641‐1647.  
 
Mackie IJ, Kitchen S, Machin SJ, Lowe GDO.  Guidelines on Fibrinogen Assays, on behalf of the Haemostasis and Thrombosis 
Task Force of the British Committee for Standards in Haemotology. Brit J Haematology, 2003; 121:396‐404. 
 
Westgard JO, Klee GG. Quality Management, Chapter 16 in Fundamentals of Clinical Chemistry, 4th edition.  Burtis C, ed., 
WB Saunders Company, Philadelphia: 1996; pp.211‐223. 
 
 
 
 
 
 
 

Page 4
Appendix 
 
Table 1. Troubleshooting IQC problems: How different patterns of IQC error for 2 levels of IQC material tested for 
Protime/INR and aPTT can direct the sequence of investigations required to correct the problem 

IQC Troubleshooting

Protime   Protime    aPTT  aPTT  Conclusion/Check

Level 1 IQC  Level 2 IQC  Level 1 IQC  Level 2 IQC 
Out  In  In In Protime   
Level 1  IQC material 
Out  Out  In In PT reagent 

In  In  Out In aPTT  

Level 1 IQC material 
In  In  Out Out aPTT reagent 

Out  Out  Out Out Instrument 

Diluent for QC material 
Pipette volume for QC 
material 

Table 2. Results of CG2‐C 2004 Dade Behring BCS Protime PT Data 

CG2‐C 2004 Dade Behring BCS Protime

Specimen CG2 15p

Lab Result 19.1

Mean 19.24

SD 0.45

n 72

SDI ‐0.31

Lower Limit 18.1

Upper Limit 20.2

15% = 2.89 seconds or 6.42 SD

Page 5
Table3. Results of CG2‐C 2004 Trinity Biotech AMAX aPTT PT Data 

CG1‐A 2006 Trinity Biotech AMAX aPTT

Specimen CG1 13

Lab Result 106

Mean 90.1

SD 11.2

n 16

SDI 1.4

Lower Limit 76

Upper Limit 106

Graded Unacceptable ‐ 15% limit: 104

Table 4.  Troubleshooting guide for fibrinogen activity assays 

Source of error  Corrective Action 
Pipette used to reconstitute QC  Check pipette calibration for accuracy and precision

Contaminated diluent  Use fresh diluent

Deteriorated reagent  Prepare fresh reagent

Shift in calibration curve due to instrument wear or 
drift  Recalibrate ‐ Troubleshoot the analyzer’s liquid delivery 
system, temperatures and detection system 

Page 6
Figure 1.   

An example of Levey‐Jennings charts recording control values. 

This shows the expected distribution and examples where problems have occurred indicating that a method is moving out 
of control.  In each case the dotted lines show the 2 standard deviation limits of acceptable results.

Expected Distribution of Control Values Control Events Demonstrating a Trend

3 3
2
Standard Deviation

Standard Deviation
1
1
Mean
Mean -1
-1 -2
-2 -3
-3 -4
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Control Events Control Events

Control Events Demonstrating an

Control Events Demonstrating a Shift Increased Random Error
4 3
Standard Deviation

3 2
Standard Deviation

2 1
1 Mean
Mean
-1
-1
-2 -2
-3 -3
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Control Events
Control Events  

Page 7
Figure 2. 
Longitudinal report of the deviation of results from the mean for the method from the College of American Pathologists PT 
Report. 

 
Figure 3.  

Example of fibrinogen activity calibration curve comparison.  The calibration curve in blue (diamonds) is the accurate curve.  
The pink curve (squares) shows a shift in instrument performance with a parallel bias over the measurable range as could 
be seen with an instrument change.  The green curve (triangles) demonstrates a non‐parallel curve that may indicate 
deterioration of reagent. 

Fibrinogen Activity Calibration Curves

60

50
clotting time (secs)

40

30

20

10

0
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Fibrinogen (mg/dL)

Page 8
 Protime/INR, aPTT and Fibrinogen Assay Toolbox

Issue/failure event  Condition  Troubleshooting action Corrective action

suspected 
   
Protime/INR single  Problem with the   Check out‐date of the control    Assure that all controls are within date 
control out of control  control specimen     prior to use 
range   Check the time the control was opened   
   Assure that all controls are stored and 
 Check Levy‐Jennings to for evidence of a trend  used according to SOP and package insert 
or shift   
   Evaluate the Control Rules (Westgard 
 Repeat control, if within range, repeat again  Rules) used to manage the test 
If out of range, use a new vial of control  

   
Protime/INR more than  Problem with the   Check out‐date of the reagent    Assure that all reagents are within date 
one control out of  reagent used     prior to use 
control range   Check the time the reagent was opened   
   Assure that all reagents are stored and 
 Check Levy‐Jennings to for evidence of a trend  used according to SOP and package insert 
or shift   
   Evaluate the Control Rules (Westgard 
 Repeat reagent, if within range, repeat again  Rules) used to manage the test 
 
 If out of range, use a new vial of reagent  
 
 Protime/INR, aPTT and Fibrinogen Assay Toolbox

Issue/failure event  Condition  Troubleshooting action Corrective action

suspected 
   
aPTT single control out  Problem with the   Check out‐date of the control    Assure that all controls are within date 
of control range  control specimen     prior to use 
 Check the time the control was opened   
   Assure that all controls are stored and 
 Check Levy‐Jennings to for evidence of a trend  used according to SOP and package insert 
or shift   
   Evaluate the Control Rules (Westgard 
 Repeat control, if within range, repeat again  Rules) used to manage the test 
 
 If out of range, use a new vial of control  

   
aPTT more than one  Problem with the   Check out‐date of the reagent    Assure that all reagents are within date 
control out of control  reagent used     prior to use 
range   Check the time the reagent was opened   
   Assure that all reagents are stored and 
 Check Levy‐Jennings to for evidence of a trend  used according to SOP and package insert 
or shift   
   Evaluate the Control Rules (Westgard 
 Repeat reagent, if within range, repeat again  Rules) used to manage the test 
 
 If out of range, use a new vial of reagent  

Page 2
 Protime/INR, aPTT and Fibrinogen Assay Toolbox

Issue/failure event  Condition  Troubleshooting action Corrective action

suspected 
   
Fibrinogen Assay single  Problem with the   Check out‐date of the control    Assure that all controls are within date 
control out of control  control specimen     prior to use 
range   Check the time the control was opened   
   Assure that all controls are stored and 
 Check Levy‐Jennings to for evidence of a trend  used according to SOP and package insert 
or shift   
   Evaluate the Control Rules (Westgard 
 Repeat control, if within range, repeat again  Rules) used to manage the test 
 
 If out of range, use a new vial of control  

   
Fibrinogen Assay more  Problem with the   Check out‐date of the reagent    Assure that all reagents are within date 
than one control out of  reagent used     prior to use 
control range   Check the time the reagent was opened   
   Assure that all reagents are stored and 
 Check Levy‐Jennings to for evidence of a trend  used according to SOP and package insert 
or shift   
   Evaluate the Control Rules (Westgard 
 Repeat reagent, if within range, repeat again  Rules) used to manage the test 
 
 If out of range, use a new vial of reagent  

Page 3
 Protime/INR, aPTT and Fibrinogen Assay Toolbox

Issue/failure event  Condition  Troubleshooting action Corrective action

suspected 
   
Controls out of range for  Problem with the   Check instrument settings   Assure that the prescribed preventive 
more than one analyte  instrument    maintenance for the instrument is 
(e.g. both Protime/INR   Assure that all preventive maintenance has  performed 
and aPTT out of range)  been done   
   Evaluate the Control Rules (Westgard 
 Carry out troubleshooting functions called for  Rules) used to manage the test 
in the SOP 
 
 Call for equipment support 

   
One control out of range  Problem with the   Check out‐date of the control    Assure that all controls are within date 
for more than one  control    prior to use 
analyte (e.g. both   Check the time the control was opened   
Protime/INR and aPTT     Assure that all controls are stored and 
out of range)   Check Levy‐Jennings to for evidence of a trend  used according to SOP and package insert 
or shift   
   Evaluate the Control Rules (Westgard 
 Repeat control, if within range, repeat again  Rules) used to manage the test 
 
 If out of range, use a new vial of control 

Page 4
 Protime/INR, aPTT and Fibrinogen Assay Toolbox

Issue/failure event  Condition  Troubleshooting action Corrective action

suspected 
   
Protime failure on INR  Calculation error   Check that the appropriate ISI is being used in   Assure that the calculation is regularly 
calculation  the calculation  validated 
 
 Check that the correct geometric mean of the 
reference interval is being used in the 
calculation 
 
 Check to see that the calculation is being 
performed correctly 
 
 Assure that the correct result of the calculation 
is being reported in the patient’s record 
 
   
Multiple Proficiency  Clerical error,   Check original printouts for transcription errors   Review PT reporting process, add checks 
Testing failures on one  specimen mix‐up     for data integrity 
or more analytes   Check for PT results that could have been   
switched on result form   Review sample analysis process to insure 
  no future mix‐ups occur 
 Check that method code is appropriate for 
analyzer 
 
 Check barometric pressure data entered 
correctly 
 
 Check that results evaluated against correct 
peer group 
 

Page 5