Review 

Pulsed Electromagnetic Fields in Bone Healing: Molecular 
Pathways and Clinical Applications 
Laura Caliogna 1, Marta Medetti 1, Valentina Bina 2,*, Alice Maria Brancato 1, Alberto Castelli 1, Eugenio Jannelli 1, 
Alessandro Ivone 1, Giulia Gastaldi 2,3, Salvatore Annunziata 1, Mario Mosconi 1 and Gianluigi Pasta 1 

1  Orthopedics and Traumatology Clinic, IRCCS Policlinico San Matteo Foundation, 27100 Pavia, Italy; 
[email protected] (L.C.); [email protected] (M.M.);   
[email protected] (A.M.B.); [email protected] (A.C.);   
[email protected] (E.J.); [email protected] (A.I.);   
[email protected] (S.A.); [email protected] (M.M.); [email protected] (G.P.) 
2  Department of Molecular Medicine, University of Pavia, 27100 Pavia, Italy; [email protected] 

3  Centre for Health Technologies, University of Pavia, 27100 Pavia, Italy 

*  Correspondence: [email protected] 

Abstract:    In this article, we provide an extensive review of the recent literature of the signaling 
pathways modulated by Pulsed Electromagnetic Fields (PEMFs) and PEMFs clinical application. A 
review of the literature was performed on two medical electronic databases (PubMed and Embase) 
from  3  to  5  March  2021.  Three  authors  performed  the  evaluation  of  the  studies  and  the  data 
extraction. All studies for this review were selected following these inclusion criteria: studies written 
in English, studies available in full text and studies published in peer‐reviewed journal. Molecular 
Citation: Caliogna, L.; Medetti, M.; 
biology, identifying cell membrane receptors and pathways involved in bone healing, and studying 
Bina, V.; Brancato, A.M.; Castelli, A.; 
PEMFs target of action are giving a solid basis for clinical applications of PEMFs. However, further 
Jannelli, E.; Ivone, A.; Gastaldi, G.; 
Annunziata, S.; Mosconi, M.; et al. 
biology  studies  and  clinical  trials  with  clear  and  standardized  parameters  (intensity,  frequency, 
Pulsed Electromagnetic Fields in  dose, duration, type of coil) are required to clarify the precise dose–response relationship and to 
Bone Healing: Molecular Pathways  understand the real applications in clinical practice of PEMFs. 
and Clinical Applications. Int. J. Mol. 
Sci. 2021, 22, 7403. https://doi.org/  Keywords:  pulsed  electromagnetic  fields  (PEMFs);  biophysical  stimulation;  osteogenic 
10.3390/ijms22147403  differentiation; fracture repair; fracture healing; bone regeneration 
 
Academic Editor: Emerito Carlos   
Rodriguez‐Merchan 

1. Introduction 
Received: 30 May 2021 
Accepted: 6 July 2021 
Pulsed  Electromagnetic  Fields  (PEMFs)  are  widely  used  in  orthopedic  clinical 
Published: 9 July 2021 
practices  to  promote  bone  healing  processes  [1].  In  the  1950s,  a  group  of  Japanese 
researchers  discovered  the  piezoelectric  properties  of  the  bone;  Fukada  and  Yasuda 
Publisher’s  Note:  MDPI  stays  demonstrated that in the compression areas the bone is electronegative and causes bone 
neutral  with  regard  to  jurisdictional  resorption, whereas areas under tension are electropositive and produce bone [2]. 
claims  in  published  maps  and  Nowadays,  bone  responses  to  PEMFs  have  been  widely  studied.  In  the  literature, 
institutional affiliations.  skeletal cells responses to PEMFs have been therapeutically evaluated with devices that 
expose  bone  cells  to  electromagnetic  fields  in  order  to  stimulate  extracellular  matrix 
synthesis  for  bone  and  cartilage  repair.  Understanding  the  molecular  pathways  after 
 
PEMFs exposure provides important details for their clinical application. 
Copyright:  ©  2021  by  the  authors.  The aim of the review is to highlight the molecular cell responses to PEMFs and their 
Licensee  MDPI,  Basel,  Switzerland.  clinical uses in promoting bone repair, tissue engineering and regeneration. 
This  article  is  an  open  access  article 
distributed  under  the  terms  and 
2. Materials and Methods 
conditions of the Creative Commons 
Attribution  (CC  BY)  license 
A  review  of  the  literature  was  performed  on  two  medical  electronic  databases 
(http://creativecommons.org/licenses (PubMed  https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov  (accessed  on  3–5  March  2021)  and  Embase 
/by/4.0/).  https://www.embase.com (accessed on 3–5 March 2021)) from 3 to 5 March 2021. Three 

 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403. https://doi.org/10.3390/ijms22147403  www.mdpi.com/journal/ijms 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403  2  of  18 
 

authors performed the evaluation of the studies and the data extraction. All studies for 
this review were selected by following these inclusion criteria: 
 All studies were written in the English language 
 All studies were an available full text 
 All studies were published in peer‐reviewed journals 
The study selection and the data extraction were performed independently by three 
authors.  All  discrepancies  (disagreement)  were  discussed  between  the  authors  and  the 
senior investigators revised the work. 
Eligible  studies  for  the  review  were  selected  by  screening  the  titles  and  abstracts 
using the following three strings, both in PubMed and in Embase: 
 bone physiology AND fracture healing. 
 electromagnetic field AND fracture healing. 
 electromagnetic field AND bone pathway. 
In the first string, we selected only the reviews from 2018 to 2020, in the second all 
the works in the same period and in the third, all works in the last 10 years. 
The research using “bone physiology AND fracture healing” produced 155 articles 
in PubMed and 55 articles in Embase. The two databases share 30 articles. At the end of 
the reading and screening process a total of 6 articles were identified and selected also by 
checking the bibliography of all the articles examined. 
Using the second strings in PubMed we found 26 articles and in Embase 61 articles. 
The two databases have in common 23 articles and for this review after reading the texts 
were selected 2 articles and 1 article were selected checking the bibliography in all articles 
examined. 
The research using the third string produced in PubMed 66 articles and in Embase 
65 and the two databases have in common 38 articles. After reading the texts were selected 
6  articles  and  more  10  articles  were  selected  checking  the  bibliography  in  all  articles 
examined. 
 To evaluate the clinical application of PEMFs the following strings in PubMed and in 
Embase were used. Fracture healing and magnetic field 
 Magnetic field AND delayed union 
 Electromagnetic field AND bone healing 
All the selected articles of the first two strings were full text, published in the last 10 
years  (the  first  two  strings),  whereas  the  selected  articles  from  the  third  string  were 
published in 2019–2020. 
The  research  in  PubMed  using  fracture  healing  AND  magnetic  field  produced  79 
articles and in Embase 91 articles. The two databases have in common 11 articles and for 
this  review  after  reading  the  texts,  were  selected  13  articles  and  1  article  meeting  the 
inclusion criteria were identified, by checking the bibliography in all articles examined. 
The  research  in  PubMed  using  magnetic  field  AND  delayed  union  produced  5 
articles and in Embase 24 articles. The two databases have in common only one article and 
for  this  review  after  reading  the  texts  was  selected  only  one  article  identified  in  the 
bibliography in the examined articles. 
Using the “electromagnetic field AND bone healing” string, we found 32 articles in 
PubMed and 56 in Embase. 
The two databases had 25 articles in common, and for this review two articles were 
selected. 

3. Physical Stimulations in Bone Healing 
In  the  last  decades,  many  efforts  have  been  done  to  understand  musculoskeletal 
tissue regeneration. Biological, chemical, and physiological factors, which play key roles 
in musculoskeletal tissue development, have been extensively explored. However, the use 
of  physical  stimulation  is  increasing,  showing  extreme  importance  in  the  processes  of 

 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403  3  of  18 
 

osteogenic  and  chondrogenic  differentiation,  proliferation,  and  maturation  through 

defined dose parameters including mode, frequency, magnitude, and duration of stimuli. 
There are six main categories of physical stimuli involved in bone healing [3]: 
1. Mechanical  Forces,  which  direct  cellular  activities  influencing  the  tissue‐level 
processes of growth, modeling, remodeling, and repair. 
2. Ultrasound, that usually refers to a longitudinal wave propagation, a special type of 
sonic wave with a frequency greater than 20 kHz (this is the upper limit of human 
audibility),  that  causes  local  oscillation  of  particles.  Ultrasound  with  a  frequency 
around 3–10 MHz is widely used in clinical settings for bone healing. 
3. Shock wave, that is a kind of short‐duration and acoustic pressure wave consisting 
of two phases, the positive phase evoking compressive stress (peak pressure: 30–100 
MPa) and the negative phase arousing tensile and shear stress (negative pressure). 
After  propagating  into  tissue,  shock  waves  may  lead  to  microbubble  formation  of 
liquid  molecules  on  the  focal  area,  as  to  increase  cell  membrane  permeability  and 
facilitate the delivery of macromolecules into cells. 
4. Scaffold stimulation, which should provide a good environment to guarantee secure 
attachment, survival, and differentiation of stem cells grown into scaffolds, due to 
their good osteoconductive and osteogenic ability in bone tissue engineering. 
5. Electrical  stimulation  (EF),  which  can  control  and  regulate  physiologically  the 
cellular and tissue homeostasis. The human body generates a biological EF ranging 
between  10  and  60  mV  at  various  locations.  Furthermore,  bioelectricity  is  very 
important in the wound healing process. When tissue gets damaged, an EF is created. 
This endogenous EF causes cell migration to the wound. Indeed, wound healing is 
compromised when the EF is inhibited. However, the exact mechanism underlying 
the  intracellular  signal  transduction  of  Electrical  Stimulation  in  bone  repair  is  still 
unclear. 
6. Electromagnetic  stimulation  with  Pulsed  Electromagnetic  Fields (PEMFs),  focus  of 
this review. 

4. Pulsed Electromagnetic Fields (PEMFs) 
PEMFs are generated from an alternate current being passed through a coil. They are 
low‐frequency magnetic fields with a specific waveform and amplitude, characterized by 
a  constant  variation  of  the  magnetic  field  amplitude  over  time.  PEMFs  have  been 
approved by the FDA to treat bone fractures since 1979 as a safe and effective treatment 
for nonunion of bone, congenital pseudoarthrosis, and failed fusions. Despite its clinical 
use,  cell  responses  activated  by  electromagnetic  fields  in  bone  tissue  are  not  yet 
completely known. 
Several studies both in vitro and in vivo had been conducted to explore PEMFs effects 
on  osteoprogenitor  cells  and  the  skeletal  system.  The  most  common  cells  lines  used  in 
vitro  are  BM‐MSCs  (Bone  Marrow  Mesenchymal  Stem  Cells)  and  ADSCs  (Adipose 
Derived Stem Cells), while in vivo, the most used models are femoral or tibial osteotomy 
in rats and rabbits. 
Despite numerous studies about the effect of PEMFs stimulations on cells responses, 
there is no consensus on the optimal parameters (frequency, intensity, and duration) that 
will promote bone growth and bone healing. 
Evidence in literature shows that the most common parameters used both in vitro 
and in vivo are the following [3]: 
 intensity: ranging from 0.1 mT to 2 mT; 
 frequency: ranging from 15 Hz to 75 Hz; 
 duration: in vitro, the treatment duration ranges from 8 min to 24 h for many days 
(from 1 to 28 days). In vivo, the treatment duration ranges from 1 h to 8 h for many 
weeks (from 1 to 12 weeks). 

 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403  4  of  18 
 

Most in vitro experiments highlighted a gene expression increase of main bone mark‐
ers  alkaline  phosphatase  (alp),  runt‐related‐transcription  factor  2  (runx‐2),  osteocalcin 
(ocn), and osteopontin (opn); then, the enhancement of alkaline phosphatase (ALP)enzy‐
matic activity and other typical bone matrix proteins was also detected. 
Moreover, in vivo studies  demonstrated that PEMFs  have  positive  effects on bone 
fractures: a decrease in healing time was observed in different animal models who have 
had osteotomy. 
Due to the central role of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) in physiological bone re‐
pair, in the last years several studies have been oriented towards the discovering of PEMFs 
effects on MSCs osteogenic differentiation as well as the signaling pathways involved. 
As  described  below,  PEMFs  can  control  the  inflammatory  microenvironment  and 
promote the MSCs differentiation, playing a pro‐osteogenic role. 

5. PEMFs Molecular Pathways on Bone Healing 
The usual bone healing process after bone fracture consists of four distinct phases. 
However, these stages have considerable overlaps [4]: 
1. Fracture and inflammatory phase. 
2. Angio‐mesenchymal phase. 
3. Bone formation. 
4. Bone remodeling. 
It  has  been  observed  that  PEMF‐activated  pathways  take  a  role  in  bone  healing 
phases 2, 3, and 4, while inhibit the 1 inflammatory phase [5]. 

5.1. Inflammatory Phase and Wnt/β‐Catenin Signaling 
This stage begins immediately following the fracture (Days 1 to 5). Blood vessels and 
bone are broken, originating a hematoma around the fracture site. In literature it has been 
demonstrated  an  important  role  and  implication  of  Wnt  signaling  in  the  inflammatory 
phase preceding tissue repair; however, even though the precise molecular network in‐
volved is not elucidated yet, in this review we considered Wnt signaling as a key player 
in the modulation of this early phase. It has been demonstrated that PEMFs were able to 
activate cell surface adenosine receptor (A2A), resulting in the activation of both canonical 
(Wnt/β‐catenin) and non‐canonical (Wnt/Ca2+) Wnt pathways [6], as documented by the 
increased expression of Wnt ligands such as WNT1, WNT3a, and WNT10b in association 
with increases in both bone mass and strength [7]. 
Generally,  the  Wnt  ligands  activate  a  series  of  downstream  intracellular  signaling 
pathways: the Wnt/β‐catenin, Wnt/Ca2+, Wnt/planar cell polarity (Wnt/PCP) or Wnt/pro‐
tein kinase A (Wnt/PKA) pathways. However, as the canonical Wnt/β‐catenin pathway is 
the most well characterized, for a better comprehension of the molecular mechanisms in‐
volved, in this review we will summarize its intracellular cascade [7]. 
A distinctive feature of the canonical Wnt/β‐catenin pathway is the translocation of 
the β‐catenin into the nucleus upon signaling activation. When no Wnt ligands are pre‐
sent, β‐catenin is degraded by a β‐catenin destruction complex, which includes axin, ade‐
nomatosis polyposis coli (APC), protein phosphatase 2A (PP2A), glycogen synthase ki‐
nase 3 (GSK3), and casein kinase 1 α (CK1α), whereas the binding of WNTs to the receptor 
complex, composed by Fz and LRP5/6 co‐receptors, triggers a series of events responsible 
for  the  degradation  of the  destruction  complex  described  above.  The  Wnt  binding  also 
cause a diminished axin’ stability in the cytoplasm, and its translocation close to the cell 
membrane where it interacts with the cytoplasmic tail of LPR5/6 receptor. This event in‐
duced  the  activation  of  DSH  protein  which  plays  a  key  role  in  the  inhibition  of  GSK3, 
protecting β‐catenin from its degradation and allowing the protein to accumulate in the 
cell’s  cytoplasm.  Then,  the  stabilized  β‐catenin  enters  the  nucleus  whereby  interacting 
with partner DNA‐binding proteins, such as LEF and TFCs, modulate the transcriptional 
activity of target genes [8]. 

 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403  5  of  18 
 

To conclude, the activation by PEMFs of adenosine receptors, especially A2A and A3, 
is particularly relevant in this phase as well, since their activation inhibits the NF‐kB path‐
way, a molecular cascade involved in inflammatory processes [1]. 

5.2. Angio‐Mesenchymal Phase and VEGF Pathways 
In  the  angio‐mesenchymal  phase  (Days  5  to  11),  VEGF  regulates  the  angiogenesis 
process,  which  is  closely  connected to osteogenesis Type  H  vessels,  so  named  for  their 
high  expression  of  endomucin  and  CD31,  that  have  recently  been  identified  as  able  to 
induce bone formation [9]. The VEGF pathway is the key regulator of vascular regenera‐
tion. It has been shown that both osteoblasts and hypertrophic chondrocytes express high 
levels  of  VEGF,  thereby  promoting  the  invasion  of  blood  vessels  and  transforming  the 
avascular  cartilaginous  matrix  into  a  vascularized  osseous  tissue  [10].  VEGF  promotes 
both vasculogenesis, helping aggregation and proliferation of endothelial mesenchymal 
stem cells into a vascular plexus, and angiogenesis, stimulating the growth of new vessels 
from the already existing ones. Therefore, VEGF plays a crucial role in the neo‐angiogen‐
esis and revascularization at the fracture site. It has been observed that the presence of 
VEGF promotes  fracture  healing,  while blocking  of VEGF‐receptors leads  to a delay  or 
interruption of the regenerative processes. 
Many studies suggested that PEMFs play a promotion effect not only in osteogenesis 
but also in angiogenesis, in different cellular model both in physiologic and pathologic 
conditions [11,12]. Therefore, PEMFs may facilitate bone repair by inducing the activation 
of  diverse  signaling  pathways  enhancing  both  osteogenesis and angiogenesis.  Both the 
FGF and VEGF signaling pathways have been demonstrated to be involved in the regula‐
tion  of  proliferation  and  differentiation  of  osteoblasts  and  in  angiogenesis  required  for 
bone formation [10]. A study indicated that, in human umbilical vein, after the exposure 
of endothelial cells (HUVECs) to PEMFs there was a 150% increase of FGF‐2 mRNA and 
a 5‐fold rise of the protein, a molecular shift responsible for the augmented endothelial 
cell proliferation and tubulization, key steps for new vessels formation [13]. The same re‐
sult has been documented by Delle Monache and colleagues, which revealed that in the 
same  cell  type,  the  PEMFs  treatment  induced  an  increase  of  the  protein  expression  of 
phosphorylated  VEGF  receptor  2  (KDR/Flk‐1),  promoting  cell  proliferation,  migration 
and tube formation of HUVECs [12]. 

5.3. Bone Formation 
In that phase, MSCs previously recruited can differentiate into osteoblasts or chon‐
drocytes to initiate the bone formation. During the process of osteoblast differentiation, 
RUNX‐2 is crucial for the commitment of MSCs to the osteoblast lineage and positively 
influences early stages of osteoblast differentiation. Osterix (OSX) starts playing an im‐
portant role in osteoblast differentiation following RUNX2‐mediated mesenchymal con‐
densation. During the process of osteoblast differentiation, RUNX‐2 induces the expres‐
sion of bone matrix genes Collagen type 1 (col1a1), Osteopontin (opn), Bone Sialoprotein 
(ibsp),  and  Osteocalcin  (ocn).  However,  for  further  bone  maturation,  runx‐2  expression 
must be downregulated [14]. 
At  present,  the  molecular  pathways  known  to  be  involved  in  bone  formation  and 
activated by PEMFs exposure are as follows: 
1. Bone Morphogenetic Protein Signaling Pathway (BMPs) and Tumor Growth Factor 
β Signaling Pathway (TGF‐β) 
2. Phosphoinositide  3‐Kinases/Akt/mammalian  Target  of  Rapamycin  Signaling  Path‐
way (PI3K/Akt/mTOR) 
3. Notch Signaling Pathway (NSP) 
4. Mitogen‐Activated Protein Kinase (MAPK). 
   

 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403  6  of  18 
 

5.3.1. TGF‐β/BMPs Pathways 
TGF‐βs and BMPs are cell regulatory proteins belonging to the TGF‐β superfamily, 
which play critical role in the regulation of cell growth, differentiation, and development 
in a wide range of biological systems.   
Generally, the signaling starts with the ligand‐induced oligomerization of receptor 
kinases and phosphorylation (activation) of the cytoplasmic effectors SMADs (Sma and 
Mad Related Family): SMAD2 and SMAD3 for the TGF‐β pathway, or SMAD1/5/8 for the 
bone morphogenetic protein (BMP) pathway. Upon phosphorylation, SMADs associate 
with SMAD4 (co‐SMAD), responsible for the whole complex nuclear translocation. Acti‐
vated  SMADs  regulate  diverse  biological  effects  according  to  the  partner  proteins  se‐
lected.  Moreover,  the  activation  of  SMADs  is  balanced  by  the  presence  of  inhibitory 
SMADs (SMAD6, SMAD7) whose expression is induced by TGF‐β and BMP signaling as 
part of a negative feedback loop. 

TGF‐β Signaling Pathway 
The TGF‐β signaling pathway plays an important role in the development, homeo‐
stasis, and repair of most tissues in organisms. TGF‐β is a potent immune suppressor, and 
perturbation of the signaling is linked to autoimmunity, inflammation, and cancer [15]. 
Before binding to its receptors, TGF‐β is activated from a large latent complex composed 
by LTBP (latent TGF‐β binding protein) and LAP (Latency‐Associated Peptide). Ligand 
binding to the Type II receptor (TGF‐β RII) allows the recruitment and activation of Type 
I receptor (TGF‐β RI). The activated TGF‐β RI then phosphorylates its downstream targets 
SMAD2 and SMAD3 [16] which upon association with SMAD4, translocate into the nu‐
cleus,  whereby  interacting  with  other  transcription  factors,  regulate  gene  expression. 
However, a  part the  canonical  (SMADs—dependent)  signaling  pathway activation, the 
TGF‐β  signaling  may  trigger  SMADs  independent  pathways  too,  including  Erk, 
SAPK/JNK, and p38 MAPK signaling. 

BMPs Signaling Pathway 
BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) are a large subclass (more than 20 members) 
of the TGF‐β super family acting in many tissues under physiologic conditions. BMPs ac‐
complish  their  task  via  receptor‐mediated  intracellular  signaling,  ending  up  with  gene 
expression regulation. 
Two types of receptors are required in this process: type I and type II. While there is 
only one type II BMP receptor (BmprII), there are three type I receptors: Alk2, Alk3, and 
Alk6. Different combinations of type II and type I receptors determine the outcome of the 
signaling pathway activation. The canonical BMP pathway acts through receptor I medi‐
ated phosphorylation of SMAD1, SMAD5, or SMAD8. Then, two phosphorylated SMADs 
form a heterotrimeric complex with SMAD4. Finally, the formed heterotrimeric complex 
translocates into the nucleus and cooperates with other transcription factors to modulate 
the expression of target genes [17]. Even in this case, a part the canonical pathway activa‐
tion (SMADs—dependent), the BMPs signals may be transduced thanks to the intricate 
crosstalk occurring between the BMPs and other important signaling pathways, such as 
Wnt’s. 
Both the TGF‐β and BMPs pathways have been found to have a key role in osteogenic 
process; thus, as a master regulators of bone formation and healing, their activation after 
PEMFs exposure has been widely investigated. Several studies demonstrated that PEMFs 
stimulation  could  significantly  increase  the  expression  of  TGF‐β  in  osteoblast‐like  cells 
[18].  Moreover,  another  study  demonstrated  that  in  human  bone  marrow  stromal  cells 
(hBMSCs), PEMFs exposure was able to activate both the pathways inducing prolifera‐
tion, differentiation and mineralization of stem cells by up‐regulating the gene expression 
of runx‐2 [19]. The activation of these signaling pathways has been also confirmed by both 
in  vitro  and  in  vivo  (clinical  trials)  studies,  as  they  reported  that  PEMFs  stimulation 

 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403  7  of  18 
 

induced an increased transcription and synthesis of BMPs in an intensity‐dependent man‐
ner [20]. To conclude, different studies highlighted a synergy between the PEMFs treat‐
ments and the administration of BMPs, suggesting that these two stimuli may work on 
different intracellular pathways, enhancing new bone formation to a greater degree that 
treating with either stimulus [5]. 

Crosstalk between WNT & BMPs Pathways 
Both BMPs and Wnt ligands serve a role in the bone formation, as suggested by a 
multitude of in vitro and in vivo studies. However, it seems that the crosstalk between 
these two pathways in bone development is rather complicated, as the two signaling cas‐
cades interact differently according to the developmental stage considered [21]. In skeletal 
development, the mesenchymal precursors undertake the osteogenic differentiation pro‐
cess upon the activation of Wnt/β‐catenin pathway; at this stage, the Wnt/β‐catenin sig‐
naling keep osteoprogenitors dividing preventing their further maturation, a step regu‐
lated by BMPs. Therefore, BMP and Wnt signals have opposing effects in osteoprogenitor 
cells. 
However, once osteoprogenitors become osteoblasts, Wnt and BMP signals function 
cooperatively; both BMP2 and Wnt/β‐catenin pathways promote further differentiation, 
as  documented  by  the  expression  of  ALP  and  ECM  mineralization.  However,  what  is 
overt is that the outcome of the crosstalk between these two signaling pathways, strongly 
depends on cell type considered, the step of bone formation or healing, and on the whole 
cellular and extracellular contexts, as documented by the huge amount of data in litera‐
ture. This intricate relationship, takes place at different levels, as documented by the reg‐
ulation of both pathways in extracellular, cytoplasmic, and nuclear contexts. 

Extracellular Regulation 
In the extracellular environment, the binding of secreted molecules to components of 
both signaling pathways may result either in activation or repression of the two molecular 
cascades. For instance, the interaction occurring between sclerostin (SOST) with BMPs lig‐
ands and/or with the LRP6, prevents the pathways activation. On the other hand, other 
secreted  molecules  work  by  enhancing  and  encouraging  positive  interactions  between 
WNTs and BMPs signals [21]. 

Intracellular Regulation 
At the intracellular level, the transducer components of both signaling pathways in‐
teract with each other’s. 
For instance, BMPs inhibit Wnt pathway through a direct interaction between DSH 
and  the  phosphorylated  SMAD1  creating  an  inhibitory  complex  which  is  broken  upon 
WNT3  stimulation.  However,  when  the  cells  (bone  marrow  stromal  cells)  were treated 
with both WNT3a and BMP2, the interaction between the two proteins was further en‐
hanced thanks to the phosphorylation of SMAD1. 
However, the effect of Wnt signals on BMP pathway is still under deep investigation. 
To date, there are authors showing an inhibitory effect on BMP signaling [21] and others 
reporting a synergy between the two [22–26]. 
Finally, the interaction between β‐catenin and inhibitory SMADs might cause either 
the β‐catenin degradation upon ubiquitination or the enhancement of the Wnt/β‐catenin 
signaling pathway’s activation by promoting the formation of β‐catenin/LEF‐1 transcrip‐
tion complex. Accordingly, the outcome of the relationship depends on the whole cellular 
context [21]. 

Nuclear Regulation 
One of the most compelling evidence of the synergy and crosstalk between these two 
signaling pathways is the regulation of gene expression at promoter level. As described 

 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403  8  of  18 
 

above,  upon  signal  activation,  β‐catenin  translocates  into  the  nucleus  to  associate  with 
LEF/TFCs transcription factors, acting as a co‐activator. TCFs and LEF contain DNA bind‐
ing domains able to recognize conserved DNA sequences, a feature shared by the BMP’ 
signaling effector SMAD4. Indeed, many genes have been found to harbor the DNA bind‐
ing sites for both the TCFs/LEF complex and SMAD4. In most cases, the gene expression 
of target genes is synergistically increased, rather than having one stimulus alone. Indeed, 
when the SMAD4 binding sites were removed from the regulatory region, β‐catenin was 
not able to cause a full transcriptional activity, and the same results were found about the 
TCFs/LEF binding sites. [21]. 

5.3.2. PI3K/Akt/mTOR Signaling 
The PI3K/Akt/mTOR signaling is a crucial molecular cascade involved in a variety of 
physiological cellular processes such as cell cycle and metabolism regulation, transcrip‐
tion and translation, cell differentiation, motility, and apoptosis [5]. Indeed, because of its 
importance in core cell function, its proper signaling controls cell survival. 
The  mammalian/mechanistic  target  of  rapamycin  (mTOR)  is a  serine/threonine  ki‐
nase that integrates inputs from nutrients and growth factors to control many fundamen‐
tal cellular processes through two distinct protein complexes mTORC1 and mTORC2. In 
particular, mTORC1 has emerged as a common effector mediating the bone anabolic effect 
of IGF1, WNTs, and BMPs; thus, a dysregulation of mTORC1 could contribute to various 
skeletal diseases including osteoarthritis and osteoporosis [20]. Indeed, a study published 
in 2018 revealed that in the presence of an inflammatory environment, after PEMFs expo‐
sure the MSC commitment shifted towards an osteoblastic phenotype through the activa‐
tion of the mTOR signaling pathway [27]. 
Furthermore, activation of PI3K/Akt signaling in MSCs under PEMFs osteogenic in‐
duction has been reported. Zhang and colleagues described increased levels of phosphor‐
ylated Akt, phosphorylated GSK3β, and nuclear β‐catenin, indicating the Akt/GSK3β/β‐
catenin axis is involved in osteogenic differentiation, following PEMF exposure [28]. The 
involvement of Akt has been reported also by Poh and colleagues, who demonstrated that 
after  PEMFs  exposure  at  selected  parameters,  the  activation  of  Akt  in  adipose  derived 
mesenchymal stem cells, leads to a significant upregulation of bone‐specific genes [29]. 

5.3.3. Notch Signaling 
The Notch Signaling Pathway (NSP) is a highly conserved pathway for cell–cell com‐
munication. NSP is involved in the regulation of several processes such as cell differenti‐
ation, proliferation, and specification. Actually, NSP is used by a variety of renewing adult 
tissues to control  both the undifferentiated state in the stem cell  niche and the  cell  fate 
commitment  required  for  tissue  homeostasis  and  renewal (Reactome  Notch Signaling). 
The Notch signaling is activated upon cell‐to‐cell contact through the interactions occur‐
ring between Notch receptors and the ligands Delta and Jagged. The ligand binding in‐
duces the cleavage of Notch receptor resulting in the release of Notch intracellular domain 
(NICD), which translocates to the nucleus acting as a transcriptional co‐activator. How‐
ever, NICD requires a DNA‐binding protein, RBP‐J (recombination signal sequence‐bind‐
ing protein Jk), to activate the transcription of target genes. In the absence of NICD, the 
gene expression of its target genes is repressed by RBP‐J, thanks to the recruitment of co‐
repressor  complexes,  whereas  the  binding  of  NICD  displaces  the  co‐repressors  further 
allowing the recruitment of co‐activator complexes [30]. 
As a key regulator of cell differentiation, Bagheri and colleagues have found that after 
PEMFs exposure, the hBMSCs were able to acquire an osteoblastic phenotype through the 
activation of Notch signaling. Specifically, they reported an increase in the expression of 
several  players  acting  through  the  Notch‐4  signaling,  such  as  NOTCH‐4,  DLL4,  HEY1, 
HES1, and HES5 [22]. Moreover, the Notch pathway inhibitors inhibited the expression 
of osteogenic markers, including DLX5, OSX, as well as HES1 and HES5, indicating that 

 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403  9  of  18 
 

the Notch signaling plays an important regulatory role in PEMFs‐induced osteogenic dif‐
ferentiation of hMSCs [5]. 

5.3.4. ERK/MAPK Signaling 
The extracellular signal‐regulated kinase 1/2 (ERK) belongs to the mitogen‐activated 
protein kinase (MAPK) family, which plays a role in the signal transduction, conveying 
extracellular cues towards intracellular targets. These kinases have a variety of intracellu‐
lar targets, allowing them to control diverse cellular processes, like cell proliferation, cell 
differentiation, and stress response. The MAPK pathway plays a critical role in PEMFs‐
induced osteogenic differentiation and osteoblasts’ viability and function. Extremely low‐
frequency  pulsed  electromagnetic  fields  (ELF‐PEMFs)  treatment  could  significantly  in‐
crease  the  total  protein  content,  mitochondrial  and  ALP  activity,  and  enhance  the  for‐
mation of mineralized matrix of human osteoblasts with a poor initial osteoblast function, 
by triggering the ERK1/2 signaling pathway. When the cells were treated with an inhibitor 
of the ERK1/2 signaling cascade, the positive effects of the ELF‐PEMFs treatment on oste‐
oblast function were impaired [31]. 
Several other studies revealed the involvement of this signaling pathway in the pro‐
liferation  and  osteogenic  differentiation  of  bone  marrow  derived  stem  cells,  following 
PEMFs treatment. Specifically, upon PEMFs exposure, the cells displayed an augmented 
proliferation, an increased expression of some bone specific genes, such runx‐2, ibsp, opn 
and a rise of ALP enzymatic activity [5]. Moreover, also Poh and colleagues have revealed 
the MAPK/ERK signaling activation after PEMFs exposure. Shortly after PEMFs stimula‐
tion it has been detected an increase in phosphorylated ERK1/2, a mechanism involved in 
cell survival, growth and proliferation [29]. Interestingly, the PEMFs treatment, by acti‐
vating the ERK and p38 MAPK signaling, was able to modulate both the osteogenic and 
osteoclastogenic activities necessary for bone homeostasis and physiology [32]. 

5.4. Bone Remodeling 
In step 4, the mature osteoblasts begin to produce collagen and calcium deposits (Day 
18 onwards, lasting months to years), allowing for the growth of primary bone in fracture 
site, called woven bone or callus. If the process of union fails, the entire callus becomes 
fibro‐tissue. 
A key step of callus remodeling is the establishment of a fine balance between new 
bone formation, deposited by osteoblasts and bone resorption, executed by osteoclasts. 
In  physiological  conditions,  both  the  processes  are  tightly  regulated  to  achieve  al‐
most‐zero  changes in bone  mass, allowing for  bone tissue  renewal over time. Both GH 
and IGF‐I play key roles in the regulation of bone growth and homeostasis, thus control‐
ling bone mass. Indeed, GH through direct and indirect (IGF‐I mediated) stimulation in‐
duce osteoblasts proliferation and activity, promoting new bone deposition; however, its 
presence also enhances the osteoclasts’ activity and differentiation, causing bone resorp‐
tion.  The  result  is  the  increased  rate  of  the  overall  bone  remodeling,  with  different  net 
outcomes depending on the life stages considered. As a supportive element of the key role 
exerted by GH, its depletion results in a reduced rate of bone remodeling and a gradual 
loss of bone mineral density. Specifically, GH directly affects the resident chondrocytes of 
epiphyseal growth plates, leading them towards the terminal differentiation [33]. 

5.4.1. GH 
GH is a peptide hormone secreted from the pituitary gland under the control of hy‐
pothalamus. It exerts direct effect on various tissues including liver, kidney, muscle, cen‐
tral nervous system (CNS), and bone, through the interaction with its membrane receptor 
(GHR). The GH has two different dependent and independent mechanisms of action, one 
directly  through  the  GHR  and  the  other  inducing  IGF‐1  secretion.  Circulating  IGF‐1  is 
mostly  synthetized  in  the  liver,  but  IGF‐1  is  expressed  in  all  tissues,  suggesting  that 

 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403  10  of  18 
 

autocrine/paracrine  effects  of  local  IGF‐1  may  be  a  major  mechanism  controlling  tissue 
growth. The GHR system utilizes the Janus kinase (JAK) as a signal transducer activating 
the transcription (STAT) signal transduction pathway [34]. 
The activated GHR is associated with JAK2, a tyrosine kinase that once activated by 
GH, phosphorylates STATs‐1, ‐3, ‐5a, and 5b tyrosine’s. Therefore, STAT proteins translo‐
cate to the nucleus where they bind to the specific DNA sequences and activate gene tran‐
scription. In addition, recent studies have indicated that suppression of cytokine signaling 
(SOCS) proteins also controls the GH signaling pathway [34]. These proteins play an im‐
portant role in growth and skeletal development as well as in inflammation. Chronic in‐
flammation  is associated with  altered growth  and skeletal development, and the SOCS 
proteins may also have an important role to play in mediating these effects. As GH and 
IGF‐1 have a great effect on bone resorption and bone anabolism, and their administration 
has  a  positive  effect  on  osteoporosis  and  fracture  healing,  investigating  the  effects  of 
PEMFs  on  their  effects  would  be  a  golden  chance  to  clarify  the  molecular  mechanisms 
underneath bone healing processes. To date, there are no studies which put in evidence a 
correlation  between  the  PEMFs  exposure  and  the  activation  of  GH/IGF signaling  path‐
ways in the framework of bone repair and healing. Therefore, to take steps forward in the 
comprehension of PEMFs triggered cellular cascades, it would be of great interest inves‐
tigating the activation of this pathway too. 

5.4.2. IGF 
The insulin‐like growth factor (IGF) family consists of the ligands IGF‐I and IGF‐II, 
the type I and type II IGF cell surface receptors, six specific high‐affinity binding proteins 
(IGFBP‐1 to IGFBP‐6), IGFBP proteases, and other IGFBP‐interacting molecules [14]. 
The IGF‐I is the most abundant growth factor deposited in the bone matrix and stim‐
ulates cell proliferation and survival of osteoblasts. The primary function of IGF‐1 in the 
bone matrix is to maintain bone mass and skeletal homeostasis during bone remodeling 
[35]. 
Indeed, IGF‐1 promotes osteoclast differentiation, through the modulation of RANK 
and RANKL expression, facilitating the physiological interaction between the osteoblast 
and the osteoclast [36]. 
The results reported above are summarized in Table 1 and Figure 1. 

Table 1. Molecular pathways activated by PEMFs exposure. 

Pathway Activated  Cell Response  Bone Healing Phase 

NF‐kβ inhibition    phase 1‐ inflammatory phase; 
β‐Catenin/Wnt 
col1 and opn increase  phase 4‐ bone remodeling 
endothelial cells and osteo‐ phase 2‐ angio‐mesenchymal 
FGF and VEGF 
blastic stimulation  phase 
TGF‐β/BMPs  runx‐2 increase    phase 3‐ bone formation 
PI3K/Akt/mTOR  osteoblastic genes activation  phase 3‐ bone formation 
Notch  osteoblastic genes activation  phase 3‐ bone formation 
ERK/MAPK  osteoblastic genes activation  phase 3‐ bone formation 
GH/IGF  JAK‐STAT activation  phase 4‐ bone remodeling 

 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403  11  of  18 
 

 
Figure 1. Schematic representation of molecular pathways activated by pulsed electromagnetic fields (PEMFs). Abbrevia‐
tions: A2A (adenosine receptor); alp (alkaline phosphatase gene); BMPs (bone morphogenetic proteins); ibsp (bone sialo‐
protein gene); col1 (collagen type 1 gene); ERK ( extracellular signal‐regulated kinase 1/2); GH (growth hormone); GHR 
(growth hormone receptor); IGF (insulin‐like growth factor); JAK‐STAT (Janus kinase‐ signal transucer activating the tran‐
scription); MAPK (mitogen‐activated protein kinase); mTOR (mammalian‐mechanistic target of rapamycin); NICD (Notch 
intracellular  domain);  ocn  (osteocalcin  gene);  opn  (ostepontin  gene);  PTH  (parathyroid  hormone);  runx‐2  (runt‐related‐
transcription factor 2 gene); SMAD proteins (small mothers against decapentaplegic); TGF‐β (transforming growth factor‐
β); TGF‐β RI/RII (TGF‐β receptor I/receptor II); VEGF (vascular endothelial growth factor); VEGFR‐2 (vascular endothelial 
growth factor receptor 2). 

6. PEMFs Clinical Effects on Bone Healing 
There are tens of thousands of fractures every week in the world, and patients spend 
billions of dollars a year on treatments [37]. 
According to the Swedish Patient Register, an estimated 140,000 fractures are treated 
in Sweden each year. However, national data based on classification and assessments by 
orthopedic surgeons are scarce [38]. 
Though bone fracture is a common and costly condition, there is a scarcity of litera‐
ture focused on the additional costs of healthcare. Cost estimations for fracture healing 
complications also differ widely in the current literature, depending on the type of com‐
plication studied and the method of cost analysis. In UK, a review of evidence on treat‐
ments cost for long bone fractures, reported a total cost of £15,566 ($27,100 AUD) for hu‐
meral fractures, £17,200 ($29,944 AUD) for femoral fractures and £16,330 ($28,429 AUD) 
for tibial fractures. In US, treating tibial fractures was estimated as costly as $25,556 USD 
($34,472 AUD) per patient, including inpatient, outpatient, and pharmaceutical costs [39]. 
PEMFs have been widely used to enhance bone repair, accelerating healing process 
of recent fracture by promoting the callus formation [5], which can be achieved through 
four distinct phases: inflammatory, angio‐mesenchymal, bone formation, and remodeling 
phases. 

 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403  12  of  18 
 

There is a lack of consensus in the literature about how to recognize fracture healing, 
however radiological examinations are often used in the clinical practice. Radiologic eval‐
uation has historically relied upon radiographs and the most commonly fracture healing 
criteria includes: bridging of the fracture by bone, callus, or trabeculae; bridging of the 
fracture at three of four cortices; and obliteration of the fracture line and/or cortical conti‐
nuity [40]. Clinical healing can be defined as the lack of pain and movement at fracture 
site [41]. 
A meta‐analysis of randomized controlled trials published in 2014 demonstrated a 
faster  healing,  expressed  in  time  of  radiological  union,  in  patients  treated  with  PEMFs 
compared with patients treated with placebo, in acute non‐operatively treated fractures. 
However, data from randomized trials were not sufficient to suggest an advantage in us‐
ing PEMFs in order to reduce the incidence of nonunion in acute fractures [42]. 
On the other side only three studies out of the sixteen were about PEMFs, hence the 
authors could not be able to clarify the potential benefits of PEMFs. 
Recent  data  from  literature,  based  on  systematic  review  and  meta‐analysis  of ran‐
domized controlled trials, showed an evidence of increased fracture healing rate and re‐
duced  associated  pain  when  PEMFs  were  used;  otherwise,  there  is  a  lack  of  evidences 
regarding the acceleration of the healing time [37]. 
Hanneman and colleagues in 2012 and 2014 have conducted two randomized con‐
trolled trials for non‐operative treatment of undisplaced scaphoid fractures [43,44]. The 
authors suggested that the use of PEMFs in the non‐operative treatment of scaphoid frac‐
ture had no additional value, but in a well‐defined, stable, undisplaced scaphoid fracture, 
the union can be accelerated. 
Adie and colleagues, in a double‐blind randomized trial, suggested that PEMFs used 
as adjuvant of surgery in tibial acute fractures do not prevent secondary surgical inter‐
ventions for delayed union or nonunion and do not improve radiographic union or pa‐
tient‐reported functional outcomes. However, it should be considered that this study had 
a short follow‐up with low patient compliance (43% of patients provided radiographs at 
three months, while 36% at six) [45]. 
Data from literature suggest that the use of PEMFs, as adjuvant in femoral neck frac‐
tures fixed with cannulate screws, is able to accelerate fracture healing and to reduce pain 
[46]. 
Martinez and colleagues analyzed how electromagnetic therapy can affect the heal‐
ing  of  diaphyseal  femoral  fracture  treated  with  fixation.  They  showed  that  PEMFs  can 
promote a faster bone healing [47]. 
There is a great variability in term of intensity and frequency in each of the reported 
studies, as shown in Table 2. Actually, further studies are required to analyze and under‐
stand the dose–response relationship. 

Table 2. Each single study had their parameter in terms of frequency, dose, and duration. 

Frequency, Dose, Dura‐
Study  Field of Application  PEMFs (Device) 
tion 
Adjuvant in surgery (tib‐ EBI Bone Healing System (Bi‐ 10 h/day 
Adie et al. 
ial shaft)  omet, New Jersey)  12 weeks 
75 Hz, 2 mT 
Adjuvant in surgery (fem‐
Faldini et al.  Biostim (Igea,Carpi)  8 h/day 
oral neck fractures) 
90 days 
Hanneman et al.  24 h/day 
Acute scaphoid fractures  Ossatec (Uden) 
(2012)  6/12 weeks 
Hanneman et al.  24 h/day 
Acute scaphoid fractures  Ossatec (Uden) 
(2014)  6 weeks 
Adjuvant in surgery (Di‐ 5–105 Hz, 0.5–2.0 mT 
Martinez‐ Ron‐
aphiseal femoral frac‐ Authors provided  1 h/day 
danelli et al. 
tures)  8 weeks 

 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403  13  of  18 
 

The last phase of bone healing is the bone remodeling phase. In bone remodeling, 5–
10% of long bone fracture develop nonunion of fractures [41]. Nonunion occurs when the 
bone healing process ceases. Identify nonunion in an early stage can be advantageous to 
limit cost deriving form long period of treatments. 
Recently, an Italian group of orthopedic surgeons developed a score, called FRACT‐
ING score, which estimates how long the fracture will take to consolidate. The FRACTING 
score can be employed both to predict months needed for fracture healing and to identify, 
immediately after operative treatment, patients at risk of prolonged healing. In patients 
with high score values, new pharmacological and nonpharmacological treatments to en‐
hance osteogenesis could be tested selectively, which may finally result in reduced disa‐
bility time and health cost savings [48]. 
PEMFs are an FDA‐approved treatment for fracture nonunions [49]. In literature the 
efficacy of PEMFs in treating tibial delayed unions or nonunions has been reported from 
45% to 87% [50]. 
Cebriàn and colleagues found a rate of union of 91% in patient with tibial pseudoar‐
throsis, treated by intramedullary nailing and PEMFs, while, in absence of stimulation, 
the union rate was 83% [51]. 
A Chinese randomized controlled study investigated the clinical findings of the early 
application of PEMFs in delayed union of long‐bone with a success rate of 77.4% at the 
end of the study [52]. 

7. Discussion 
PEMFs stimulation used for bone repair is widely use in orthopedics clinical practice 
from nonunion to osteotomy [1]. 
The early application of PEMFs in fractures that are likely to require a long time to 
heal is gaining increasing interest [50]. Indeed, the ability to stimulate the healing process 
locally, without having systemic effects and adverse reactions, is a notable advantage. For 
these reasons, many efforts have been done in recent years to unravel the molecular mech‐
anisms underlying PEMF‐mediated tissue repair and regeneration. 
As described previously, our research in the literature highlighted how the PEMFs 
stimulation always causes the same signaling pathway activation, despite the huge vari‐
ability  between  the  selected  PEMFs  physical  parameters  and  the  cell  lines  considered. 
These results may be indicative of a common conserved response mechanism to physical 
stimuli. Moreover, even though the bone healing phases display a certain degree of over‐
lapping, the results in literature seem to indicate that the pathways activated upon phys‐
ical stimulation, were mainly involved in the bone formation phase: in fact, several studies 
reported that PEMF treatments were able to induce an increase of the TGF‐β expression 
and an augmented proliferation and osteogenic differentiation of stem cells, through the 
activation of TGF‐β, BMP, ERK/MAPK, and Notch signaling [18,19,31,53]. In contrast, the 
early inflammatory step seems to be attenuated by the influence of PEMFs stimuli. The 
inflammatory response triggered by the rupture of blood vessels and bone, plays a crucial 
role in bone healing allowing for the recruitment of cells necessary for tissue repair and 
regeneration. In the literature, it is reported that the application of PEMFs may help in 
modulating the inflammatory response, due to both the activation of Wnt and the inhibi‐
tion of NF‐kβ signaling upon ARs stimulation and the activation of mTOR signaling, re‐
sponsible for the regulation of cellular differentiation [1,27,54]. However, as the molecular 
pathways  strongly  interact  with  each  other’s,  a  deeper  spatial‐temporal  analysis  of  the 
pathway’s activation and inhibition would help in the comprehension of the complex cel‐
lular responses. Finally, in our work we depicted the role of GH and IGF‐I in bone growth 
and remodeling, required for the mature bone homeostasis. However, in the literature, 
data about the role of PEMFs on this phase are missing; therefore, for this reason, its in‐
vestigation should be considered. 
To sum up, all the data reported in literature give a solid base for the clinical appli‐
cation  of  PEMFs;  unfortunately,  the  selected  electromagnetic  field  parameters  are  very 

 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403  14  of  18 
 

different (frequency, waveform, and amplitude), thus preventing the possibility to carry 
out accurate analysis. Despite this variability, the intense efforts done were able to deci‐
pher, at least in part, how PEMFs could interact with the cellular physiology. However, 
limitations regard the scarce pool of molecular pathways investigated. Indeed, to deepen 
the knowledge about the cellular responses to PEMFs stimulation, broader investigations 
are required. For instance, it would be interesting analyzing in vivo the cell survival, apop‐
tosis, epigenetic changes, and stress responses as a way to have a broader look into the 
whole cellular context and on pathophysiology of the tissues. Thus, a better comprehen‐
sion of the in vitro effects of PEMFs on biological systems would be a golden chance to 
foresee  the  in  vivo  outcomes,  where  the  pathophysiological  dynamics  are  much  more 
complex. Unfortunately, to date, there is a great heterogeneity of the PEMFs physical pa‐
rameters used, both for in vitro and in vivo studies. As a consequence of lack of standard‐
ized experimental guidelines, controlled trials resulted with non‐comparable and incon‐
clusive data. 

8. Conclusions 
Further  in  vitro  studies  and  clinical  trials  with  clear  and  standardized  parameters 
(intensity, frequency, dose, duration, and type of coil) are required. Indeed, it is necessary 
to clarify the real dose–response relationship to understand the plausible PEMFs applica‐
tions  in  the  clinical  practice,  while  also  allowing  a  better  management  of  financial  re‐
sources in healthcare systems. 

Author Contributions: Conceptualization, L.C. and G.P.; methodology, A.C. and M.M. (Mario Mos‐
coni); investigation, M.M. (Marta Medetti), V.B., A.M.B., and A.I.; writing—original draft prepara‐
tion, L.C., M.M. (Marta Medetti), and V.B.; writing—review and editing, A.M.B., E.J., A.I., and S.A.; 
visualization, A.M.B., E.J., and S.A.; supervision, A.C., G.G., and M.M. (Mario Mosconi); project ad‐
ministration, G.G. and G.P. All authors have read and agreed to the published version of the man‐
uscript. 
Funding: This research received no external funding. 
Conflicts of Interest: The authors declare no conflicts of interest. 

Abbreviations 
A2A  adenosine receptor 
A3  adenosine receptor 
ADSCs  adipose‐derived stem cells 
ALP/alp  alkaline phosphatase protein/gene 
Alk2  activin receptor‐like kinase‐2 
Alk3  activin receptor‐like kinase‐3 
Alk6  activin receptor‐like kinase‐6 
APC  adenomatous polyposis coli 
BM‐MSCs  bone marrow mesenchymal stem cells 
BMPs  bone morphogenetic proteins 
BMP RI  bone morphogenetic protein receptor I 
BPS  bone sialoprotein 
CD31  cluster of differentiation 31 
CK1  casein kinase 1 
c‐fms  colony‐stimulating factor‐1 receptor 
CNS  central nervous system 
COL1/col1  collagen type 1 protein/gene 
DSH  disheveled 
EF  electrical stimulation 
ELF‐PEMF  extremely low‐frequency pulsed electromagnetic field 
ERK  extracellular signal‐regulated kinase 1/2 
FGF  fibroblast growth factor 
FGF‐2  fibroblast growth factor 2 

 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403  15  of  18 
 

Fz  frizzled 
GH  growth hormone 
GHR  growth hormone receptor 
GSK3  glycogen synthase kinase 3 
hBMSCs  human bone marrow stromal cells 
HUVECs  human umbilical vein endothelial cells 
IGF  insulin‐like growth factor 
IGFBP  Insulin‐like growth factor binding protein 
JAK  janus kinase 
KDR/Flk‐1  phosphorylated vegf receptor 2 
LAP  latency‐associated propeptide 
LEF  lymphoid enhancer factor family 
LIPUS  low‐intensity pulsed ultrasound 
LRP  low‐density lipoprotein receptor‐related protein 
LTBP  latent TGF‐β binding protein 
MAPK  mitogen‐activated protein kinase 
MCSF  monocyte/macrophage colony‐stimulating factor 
MSCs  mesenchymal stem cells 
mTOR  mammalian/mechanistic target of rapamycin 
NF‐kB  nuclear factor kappa‐light‐chain‐enhancer of activated B cells 
NICD  notch intracellular domain 
NSP  notch signaling pathway 
OCN/ocn  osteocalcin protein/gene 
OPN/opn  osteopontin protein/gene 
OSX/osx  osterix protein/gene 
PCP  planar cell polarity 
PEMFs  pulsed electromagnetic fields 
PI3K/Akt/mTOR  phosphoinositide 3‐kinases/akt/mammalian target of rapamycin 
PKA  protein kinase A 
PP2A  protein phosphatase 2 A 
PTH  parathyroid hormone 
RANK  receptor activator of nuclear factor κ B 
RANK‐L  nuclear factor kappa B ligand 
RUNX‐2/runx‐2  runt‐related transcription factor 2 protein/gene 
SAPK/JNK  stress‐activated protein kinase/c‐Jun NH2‐terminal kinase 
SMAD  small mothers against decapentaplegic 
SOCS  suppression of cytokine signaling 
SOST  sclerostin 
STAT  signal transducer activating the transcription 
TCF  T cell factor 
TGF‐β  transforming growth factor‐β 
TGF‐β R I  transforming growth factor‐β receptor I 
TGF‐β R II  transforming growth factor‐β receptor II 
VEGF  vascular endothelial growth factor 
VEGFR‐2  vascular endothelial growth factor receptor 2 

References 
1. Massari, L.; Benazzo, F.; Falez, F.; Perugia, D.; Pietrogrande, L.; Setti, S.; Osti, R.; Vaienti, E.; Ruosi, C.; Cadossi, R. Biophysical 
Stimulation of Bone and Cartilage: State of the Art and Future Perspectives. Int. Orthop. 2019, 43, 539–551, doi:10.1007/s00264‐
018‐4274‐3. 
2. Fukada, E.; Yasuda, I. On the Piezoelectric Effect of Bone. J. Phys. Soc. Jpn. 1957, 12, 1158–1162, doi:10.1143/JPSJ.12.1158. 
3. Huang, X.; Das, R.; Patel, A.; Nguyen, T.D. Physical Stimulations for Bone and Cartilage Regeneration. Regen. Eng. Transl. Med. 
2018, 4, 216–237, doi:10.1007/s40883‐018‐0064‐0. 
4. Bahney,  C.S.;  Zondervan,  R.L.;  Allison,  P.;  Theologis, A.;  Ashley,  J.W.;  Ahn,  J.;  Miclau,  T.;  Marcucio,  R.S.;  Hankenson,  K.D. 
Cellular Biology of Fracture Healing. J. Orthop. Res. Off. Publ. Orthop. Res. Soc. 2019, 37, 35–50, doi:10.1002/jor.24170. 
5. Yuan, J.; Xin, F.; Jiang, W. Underlying Signaling Pathways and Therapeutic Applications of Pulsed Electromagnetic Fields in 
Bone Repair. Cell. Physiol. Biochem. Int. J. Exp. Cell. Physiol. Biochem. Pharmacol. 2018, 46, 1581–1594, doi:10.1159/000489206. 

 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403  16  of  18 
 

6. Wu, S.; Yu, Q.; Sun, Y.; Tian, J. Synergistic Effect of a LPEMF and SPIONs on BMMSC Proliferation, Directional Migration, and 
Osteoblastogenesis. Am. J. Transl. Res. 2018, 10, 1431–1443. 
7. Chen,  Y.;  Alman,  B.A.  Wnt  Pathway,  an  Essential  Role  in  Bone  Regeneration.  J.  Cell.  Biochem.  2009,  106,  353–362, 
doi:10.1002/jcb.22020. 
8. Komiya, Y.; Habas, R. Wnt Signal Transduction Pathways. Organogenesis 2008, 4, 68–75, doi:10.4161/org.4.2.5851. 
9. Rodríguez‐Merchán, E.C. A Review of Recent Developments in the Molecular Mechanisms of Bone Healing. Int. J. Mol. Sci. 
2021, 22, E767, doi:10.3390/ijms22020767. 
10. Yun, Y.‐R.; Won, J.E.; Jeon, E.; Lee, S.; Kang, W.; Jo, H.; Jang, J.‐H.; Shin, U.S.; Kim, H.‐W. Fibroblast Growth Factors: Biology, 
Function, and Application for Tissue Regeneration. J. Tissue Eng. 2010, 2010, 218142, doi:10.4061/2010/218142. 
11. Callaghan, M.J.; Chang, E.I.; Seiser, N.; Aarabi, S.; Ghali, S.; Kinnucan, E.R.; Simon, B.J.; Gurtner, G.C. Pulsed Electromagnetic 
Fields Accelerate Normal and Diabetic Wound Healing by Increasing Endogenous FGF‐2 Release. Plast. Reconstr. Surg. 2008, 
121, 130–141, doi:10.1097/01.prs.0000293761.27219.84. 
12. Delle Monache, S.; Alessandro, R.; Iorio, R.; Gualtieri, G.; Colonna, R. Extremely Low Frequency Electromagnetic Fields (ELF‐
EMFs)  Induce  in  Vitro  Angiogenesis  Process  in  Human  Endothelial  Cells.  Bioelectromagnetics  2008,  29,  640–648, 
doi:10.1002/bem.20430. 
13. Tepper, O.M.; Callaghan, M.J.; Chang, E.I.; Galiano, R.D.; Bhatt, K.A.; Baharestani, S.; Gan, J.; Simon, B.; Hopper, R.A.; Levine, 
J.P.; et al. Electromagnetic Fields Increase in Vitro and in Vivo Angiogenesis through Endothelial Release of FGF‐2. FASEB J. 
Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 2004, 18, 1231–1233, doi:10.1096/fj.03‐0847fje. 
14. Majidinia, M.; Sadeghpour, A.; Yousefi, B. The Roles of Signaling Pathways in Bone Repair and Regeneration. J. Cell. Physiol. 
2018, 233, 2937–2948, doi:10.1002/jcp.26042. 
15. Yan,  X.;  Liu,  Z.;  Chen,  Y.  Regulation  of  TGF‐Beta  Signaling  by  Smad7.  Acta  Biochim.  Biophys.  Sin.  2009,  41,  263–272, 
doi:10.1093/abbs/gmp018. 
16. Tran,  D.Q.;  Andersson,  J.;  Wang,  R.;  Ramsey,  H.;  Unutmaz,  D.;  Shevach,  E.M.  GARP  (LRRC32)  Is  Essential  for  the  Surface 
Expression  of  Latent  TGF‐Beta  on  Platelets  and  Activated  FOXP3+  Regulatory  T  Cells.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  2009,  106, 
13445–13450, doi:10.1073/pnas.0901944106. 
17. Zhang, J.; Li, L. BMP Signaling and Stem Cell Regulation. Dev. Biol. 2005, 284, 1–11, doi:10.1016/j.ydbio.2005.05.009. 
18. Kuzyk, P.R.; Schemitsch, E.H. The Science of Electrical Stimulation Therapy for Fracture Healing. Indian J. Orthop. 2009, 43, 127–
131, doi:10.4103/0019‐5413.50846. 
19. Selvamurugan, N.; He, Z.; Rifkin, D.; Dabovic, B.; Partridge, N.C. Pulsed Electromagnetic Field Regulates MicroRNA 21 Ex‐
pression to Activate TGF‐β Signaling in Human Bone Marrow Stromal Cells to Enhance Osteoblast Differentiation. Stem Cells 
Int. 2017, 2017, 2450327, doi:10.1155/2017/2450327. 
20. Streit, A.; Watson, B.C.; Granata, J.D.; Philbin, T.M.; Lin, H.‐N.; O’Connor, J.P.; Lin, S. Effect on Clinical Outcome and Growth 
Factor Synthesis With Adjunctive Use of Pulsed Electromagnetic Fields for Fifth Metatarsal Nonunion Fracture: A Double‐Blind 
Randomized Study. Foot Ankle Int. 2016, 37, 919–923, doi:10.1177/1071100716652621. 
21. Itasaki, N.; Hoppler, S. Crosstalk between Wnt and Bone Morphogenic Protein Signaling: A Turbulent Relationship. Dev. Dyn. 
Off. Publ. Am. Assoc. Anat. 2010, 239, 16–33, doi:10.1002/dvdy.22009. 
22. Chen, X.‐J.; Shen, Y.‐S.; He, M.‐C.; Yang, F.; Yang, P.; Pang, F.‐X.; He, W.; Cao, Y.‐M.; Wei, Q.‐S. Polydatin Promotes the Osteo‐
genic  Differentiation  of  Human  Bone  Mesenchymal  Stem  Cells  by  Activating  the  BMP2‐Wnt/β‐Catenin  Signaling  Pathway. 
Biomed. Pharmacother. Biomedecine Pharmacother. 2019, 112, 108746, doi:10.1016/j.biopha.2019.108746. 
23. Yuan, C.; Gou, X.; Deng, J.; Dong, Z.; Ye, P.; Hu, Z. FAK and BMP‐9 Synergistically Trigger Osteogenic Differentiation and Bone 
Formation of Adipose Derived Stem Cells through Enhancing Wnt‐β‐Catenin Signaling. Biomed. Pharmacother. Biomedecine Phar‐
macother. 2018, 105, 753–757, doi:10.1016/j.biopha.2018.04.185. 
24. Liang, K.; Du, Y.; Chen, L.; Wang, L.; Li, R.; Yan, Z.; Liu, Y. Contrary Roles of Wnt/β‐Catenin Signaling in BMP9‐Induced Oste‐
ogenic and Adipogenic Differentiation of 3T3‐L1 Preadipocytes. Cell Biochem. Biophys. 2020, 78, 347–356, doi:10.1007/s12013‐020‐
00935‐0. 
25. Kim, M.‐B.; Song, Y.; Hwang, J.‐K. Kirenol Stimulates Osteoblast Differentiation through Activation of the BMP and Wnt/β‐
Catenin Signaling Pathways in MC3T3‐E1 Cells. Fitoterapia 2014, 98, 59–65, doi:10.1016/j.fitote.2014.07.013. 
26. Bae, S.J.; Kim, H.J.; Won, H.Y.; Min, Y.K.; Hwang, E.S. Acceleration of Osteoblast Differentiation by a Novel Osteogenic Com‐
pound, DMP‐PYT, through Activation of Both the BMP and Wnt Pathways. Sci. Rep. 2017, 7, 8455, doi:10.1038/s41598‐017‐08190‐
9. 
27. Ferroni, L.; Gardin, C.; Dolkart, O.; Salai, M.; Barak, S.; Piattelli, A.; Amir‐Barak, H.; Zavan, B. Pulsed Electromagnetic Fields 
Increase Osteogenetic Commitment of MSCs via the MTOR Pathway in TNF‐α Mediated Inflammatory Conditions: An in‐Vitro 
Study. Sci. Rep. 2018, 8, 5108, doi:10.1038/s41598‐018‐23499‐9. 
28. Zhang, B.; Xie, Y.; Ni, Z.; Chen, L. Effects and Mechanisms of Exogenous Electromagnetic Field on Bone Cells: A Review. Bioe‐
lectromagnetics 2020, 41, 263–278, doi:10.1002/bem.22258. 
29. Poh, P.S.P.; Seeliger, C.; Unger, M.; Falldorf, K.; Balmayor, E.R.; van Griensven, M. Osteogenic Effect and Cell Signaling Acti‐
vation of Extremely Low‐Frequency Pulsed Electromagnetic Fields in Adipose‐Derived Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells 
Int. 2018, 2018, 5402853, doi:10.1155/2018/5402853. 
30. Borggrefe, T.; Oswald, F. The Notch Signaling Pathway: Transcriptional Regulation at Notch Target Genes. Cell. Mol. Life Sci. 
CMLS 2009, 66, 1631–1646, doi:10.1007/s00018‐009‐8668‐7. 

 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403  17  of  18 
 

31. Ehnert, S.; Falldorf, K.; Fentz, A.‐K.; Ziegler, P.; Schröter, S.; Freude, T.; Ochs, B.G.; Stacke, C.; Ronniger, M.; Sachtleben, J.; et al. 
Primary Human Osteoblasts with Reduced Alkaline Phosphatase and Matrix Mineralization Baseline Capacity Are Responsive 
to  Extremely  Low  Frequency  Pulsed  Electromagnetic  Field  Exposure‐Clinical Implication  Possible.  Bone  Rep.  2015,  3, 48–56, 
doi:10.1016/j.bonr.2015.08.002. 
32. Hong, J.M.; Kang, K.S.; Yi, H.‐G.; Kim, S.‐Y.; Cho, D.‐W. Electromagnetically Controllable Osteoclast Activity. Bone 2014, 62, 99–
107, doi:10.1016/j.bone.2014.02.005. 
33. Olney, R.C. Regulation of Bone Mass by Growth Hormone. Med. Pediatr. Oncol. 2003, 41, 228–234, doi:10.1002/mpo.10342. 
34. Locatelli, V.; Bianchi, V.E. Effect of GH/IGF‐1 on Bone Metabolism and Osteoporsosis. Int. J. Endocrinol. 2014, 2014, e235060, 
doi:10.1155/2014/235060. 
35. Xian, L.; Wu, X.; Pang, L.; Lou, M.; Rosen, C.J.; Qiu, T.; Crane, J.; Frassica, F.; Zhang, L.; Rodriguez, J.P.; et al. Matrix IGF‐1 
Maintains Bone Mass by Activation of MTOR in Mesenchymal Stem Cells. Nat. Med. 2012, 18, 1095–1101, doi:10.1038/nm.2793. 
36. Wang, Y.; Nishida, S.; Elalieh, H.Z.; Long, R.K.; Halloran, B.P.; Bikle, D.D. Role of IGF‐I Signaling in Regulating Osteoclasto‐
genesis. J. Bone Miner. Res. Off. J. Am. Soc. Bone Miner. Res. 2006, 21, 1350–1358, doi:10.1359/jbmr.060610. 
37. Peng, L.; Fu, C.; Xiong, F.; Zhang, Q.; Liang, Z.; Chen, L.; He, C.; Wei, Q. Effectiveness of Pulsed Electromagnetic Fields on Bone 
Healing:  A  Systematic  Review  and  Meta‐Analysis  of  Randomized  Controlled  Trials.  Bioelectromagnetics  2020,  41,  323–337, 
doi:10.1002/bem.22271. 
38. Wennergren, D.; Ekholm, C.; Sandelin, A.; Möller, M. The Swedish Fracture Register: 103,000 Fractures Registered. BMC Mus‐
culoskelet. Disord. 2015, 16, 338, doi:10.1186/s12891‐015‐0795‐8. 
39. Ekegren, C.L.; Edwards, E.R.; de Steiger, R.; Gabbe, B.J. Incidence, Costs and Predictors of Non‐Union, Delayed Union and Mal‐
Union Following Long Bone Fracture. Int. J. Environ. Res. Public. Health 2018, 15, E2845, doi:10.3390/ijerph15122845. 
40. Fisher, J.S.; Kazam, J.J.; Fufa, D.; Bartolotta, R.J. Radiologic Evaluation of Fracture Healing. Skeletal Radiol. 2019, 48, 349–361, 
doi:10.1007/s00256‐018‐3051‐0. 
41. Griffin, X.L.; Costa, M.L.; Parsons, N.; Smith, N. Electromagnetic Field Stimulation for Treating Delayed Union or Non‐Union 
of Long Bone Fractures in Adults. Cochrane Database Syst. Rev. 2011, CD008471, doi:10.1002/14651858.CD008471.pub2. 
42. Hannemann, P.F.W.; Mommers, E.H.H.; Schots, J.P.M.; Brink, P.R.G.; Poeze, M. The Effects of Low‐Intensity Pulsed Ultrasound 
and Pulsed Electromagnetic Fields Bone Growth Stimulation in Acute Fractures: A Systematic Review and Meta‐Analysis of 
Randomized Controlled Trials. Arch. Orthop. Trauma Surg. 2014, 134, 1093–1106, doi:10.1007/s00402‐014‐2014‐8. 
43. Hannemann, P.F.W.; Göttgens, K.W.A.; van Wely, B.J.; Kolkman, K.A.; Werre, A.J.; Poeze, M.; Brink, P.R.G. The Clinical and 
Radiological Outcome of Pulsed Electromagnetic Field Treatment for Acute Scaphoid Fractures: A Randomised Double‐Blind 
Placebo‐Controlled Multicentre Trial. J. Bone Joint Surg. Br. 2012, 94, 1403–1408, doi:10.1302/0301‐620X.94B10.28844. 
44. Hannemann,  P.F.W.;  van  Wezenbeek,  M.R.;  Kolkman,  K.A.;  Twiss,  E.L.L.;  Berghmans,  C.H.J.;  Dirven,  P.A.M.G.M.;  Brink, 
P.R.G.; Poeze, M. CT Scan‐Evaluated Outcome of Pulsed Electromagnetic Fields in the Treatment of Acute Scaphoid Fractures: 
A  Randomised,  Multicentre,  Double‐Blind,  Placebo‐Controlled  Trial.  Bone  Jt.  J.  2014,  96‐B,  1070–1076,  doi:10.1302/0301‐
620X.96B8.33767. 
45. Adie, S.; Harris, I.A.; Naylor, J.M.; Rae, H.; Dao, A.; Yong, S.; Ying, V. Pulsed Electromagnetic Field Stimulation for Acute Tibial 
Shaft Fractures: A Multicenter, Double‐Blind, Randomized Trial. J. Bone Jt. Surg. 2011, 93, 1569–1576, doi:10.2106/JBJS.J.00869. 
46. Faldini, C.; Cadossi, M.; Luciani, D.; Betti, E.; Chiarello, E.; Giannini, S. Electromagnetic Bone Growth Stimulation in Patients 
with Femoral Neck Fractures Treated with Screws: Prospective Randomized Double‐Blind Study. Curr. Orthop. Pract. 2010, 21, 
282–287, doi:10.1097/BCO.0b013e3181d4880f. 
47. Martinez‐Rondanelli, A.; Martinez, J.P.; Moncada, M.E.; Manzi, E.; Pinedo, C.R.; Cadavid, H. Electromagnetic Stimulation as 
Coadjuvant in the Healing of Diaphyseal Femoral Fractures: A Randomized Controlled Trial. Colomb. Medica Cali Colomb. 2014, 
45, 67–71. 
48. Massari, L.; Benazzo, F.; Falez, F.; Cadossi, R.; Perugia, D.; Pietrogrande, L.; Aloj, D.C.; Capone, A.; D’Arienzo, M.; Cadossi, M.; 
et al. Can Clinical and Surgical Parameters Be Combined to Predict How Long It Will Take a Tibia Fracture to Heal? A Prospec‐
tive Multicentre Observational Study: The FRACTING Study. BioMed Res. Int. 2018, 2018, 1–7, doi:10.1155/2018/1809091. 
49. Cadossi, R.; Massari, L.; Racine‐Avila, J.; Aaron, R.K. Pulsed Electromagnetic Field Stimulation of Bone Healing and Joint Preser‐
vation: Cellular Mechanisms of Skeletal Response. JAAOS Glob. Res. Rev. 2020, 4, e19.00155, doi:10.5435/JAAOSGlobal‐D‐19‐
00155. 
50. Assiotis, A.; Sachinis, N.P.; Chalidis, B.E. Pulsed Electromagnetic Fields for the Treatment of Tibial Delayed Unions and Non‐
unions. A Prospective Clinical Study and Review of the Literature. J. Orthop. Surg. 2012, 7, 24, doi:10.1186/1749‐799X‐7‐24. 
51. Cebrián, J.L.; Gallego, P.; Francés, A.; Sánchez, P.; Manrique, E.; Marco, F.; López‐Durán, L. Comparative Study of the Use of 
Electromagnetic Fields in Patients with Pseudoarthrosis of Tibia Treated by Intramedullary Nailing. Int. Orthop. 2010, 34, 437–
440, doi:10.1007/s00264‐009‐0806‐1. 
52. Shi, H.; Xiong, J.; Chen, Y.; Wang, J.; Qiu, X.; Wang, Y.; Qiu, Y. Early Application of Pulsed Electromagnetic Field in the Treat‐
ment of Postoperative Delayed Union of Long‐Bone Fractures: A Prospective Randomized Controlled Study. BMC Musculo‐
skelet. Disord. 2013, 14, 35, doi:10.1186/1471‐2474‐14‐35. 
   

 
Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7403  18  of  18 
 

53. Bagheri, L.; Pellati, A.; Rizzo, P.; Aquila, G.; Massari, L.; De Mattei, M.; Ongaro, A. Notch Pathway Is Active during Osteogenic 
Differentiation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Induced by Pulsed Electromagnetic Fields. J. Tissue Eng. Re‐
gen. Med. 2018, 12, 304–315, doi:10.1002/term.2455. 
54. Cai, J.; Shao, X.; Yang, Q.; Yang, Y.; Yan, Z.; Luo, E.; Feng, X.; Jing, D. Pulsed Electromagnetic Fields Modify the Adverse Effects 
of Glucocorticoids on Bone Architecture, Bone Strength and Porous Implant Osseointegration by Rescuing Bone‐Anabolic Ac‐
tions. Bone 2020, 133, 115266, doi:10.1016/j.bone.2020.115266.