715001307 REV.

 G 1 OF 33

Controlling Contamination in LC/MS Systems
Best Practices

This document outlines best practices for controlling contamination in UPLC/MS and HPLC/
MS systems (both clinical and non‐clinical). A good contamination control plan includes 
measures for preventing, troubleshooting, and cleaning contamination.  

Important:  This document updates, supersedes, and supplements all other 
Waters documents on preventing, troubleshooting, and 
cleaning contamination.

Note:  To understand what causes contamination, see Major contaminants and their sources, 
page 31.

Note:  If you have followed the recommendations in this document and still need help with 
contamination, contact your Waters representative.

© 2016 WATERS CORPORATION. ALL RIGHTS RESERVED.

715001307 REV. G 2 OF 33

Table of Contents

Preventing contamination  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  3
Select, prepare, and handle solvents correctly . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Clean laboratory glassware properly . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Prepare and handle samples correctly . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Use clean fittings and tubing. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Wear gloves  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Use clean columns . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Check laboratory air  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Troubleshooting Contamination  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  11
Isolate the problem to the LC or MS system . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Troubleshoot the LC system . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Troubleshoot the MS system  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Cleaning to Eliminate Contamination  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  16
General guidelines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Cleaning MS Systems   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Reference Information  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  23
Solvent considerations. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
Recommended water purification process  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Gloves . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Major contaminants and their sources  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
Contaminant database  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 3 OF 33

Preventing contamination

Prevention is the most important factor in controlling contamination. It is much easier to 
prevent contamination than it is to troubleshoot or eliminate it. To prevent contamination, 
follow the steps in this section.

Select, prepare, and handle solvents correctly

Close attention to the selection and use of solvents (or mobile phases) is a critical safeguard 
against contamination (see Possible effects of low‐quality solvents, page 23). Waters 
recommends the following procedures when using solvents.1

Note:  For more information on solvent recommendations and cautions, see your system 
user guide.

Use clean, particle‐free solvents

Caution: Failure to use the proper grade of solvent for your application 
causes excessive background noise and loss of sensitivity.

When preparing mobile phase, always use chemically clean and particle‐free solvents 
(Table 3) and reagents. Solvent must be UPLC‐grade or a quality level suitable to the 
application being run. (See Solvent considerations, page 23.)

Use fresh solvents
Use the freshest solvents available; do not store solvents without taking measures to prevent 
microbial growth (see Store solvents in clean glass reservoirs with covers, page 6). When 
solvents are exposed to the atmosphere, they become vulnerable to airborne contamination.

Caution: If using organic solvents, pay attention to the expiration date 
suggested by the manufacturer. Open bottles of solvent can 
become contaminated.

1. The recommendations are based on experiences in Waters’ laboratories.

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 4 OF 33

Use ultra‐pure water
Use ultra‐pure water (defined as water that has been purified through a system that targets 
contaminants detrimental to UPLC®/MS and HPLC/MS systems). 

Note:  See Recommended water purification process, page 29.

Ultra‐pure water is sterile and contains no particles greater than 0.2 microns, no detectable 
ionizable compounds (>18‐MOhm.cm resistivity), and low UV absorbance at the monitoring 
wavelengths. Use of ultra‐pure water reduces the number of impurities in the water that can 
collect on the column during equilibration with the weak solvent.

Prevent microbial growth
Aqueous mobile phases and water are susceptible to microbial growth, which can cause 
peaks to appear during gradient operation and increase background absorbance during 
isocratic operation. Microbial growth can also block filters, frits, and columns, and can cause 
check valves to malfunction. Such problems can cause high column or pump back pressure 
and ultimately lead to premature column failure and system shutdown.

To prevent microbial growth in mobile phase, prepare, filter, and degas aqueous mobile 
phase daily. During shutdown or over a long period (such as a weekend), flush the system 
completely with water. Then flush with 10% (minimum) of an appropriate organic solvent 
(such as acetonitrile or methanol).

Caution: To prevent microbial contamination, do not store the system in 
water or >90% aqueous mobile phase. 

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 5 OF 33

Minimize the use of additives

Caution: To prevent microbial growth, do not add additives to stock bottles. 

• To reduce background, use the lowest concentration of mobile phase additive (for 
example, acid, base, or buffer that is compatible with good, stable chromatography). The 
more additive you use, the more contamination can be introduced into the mobile phase. 
• When developing a new method or transferring an old one to a new column, eliminate 
any additives that no longer affect the chromatography. For example, TEA is no longer 
necessary on many columns to obtain good peak shape for basic compounds.
• Use the highest‐quality additives available (at minimum, LC/MS‐grade additives)
• Use additives (for example, formic acid) that have low concentrations of iron and other 
metal ions. Acetic acid can contain a significant amount of iron and other metal ions.
• To prevent precipitation, avoid using inorganic salts or additives in high organic eluents. 
Such salts or additives can precipitate at the high‐organic end of the gradient.
• Use additives that are volatile and compatible with mass spectrometers. 

Caution: If you are using a mass spectrometer, avoid using non‐volatile 
additives such as sodium (Na+), potassium (K+), or phosphate 
(PO43‐).

Caution: Some additives can be incompatible with mass spectrometers. 
Consult the documentation shipped with your system for 
compatible additives.

• Volatile additives containing ammonium (NH4+), acetate, formate, or carbonate are 
recommended.

Caution: Solvents with a pH greater than 10 dissolve silica. If your system 
contains fused silica and glass components (for example, if you 
have a nanoACQUITY or M‐Class UPLC system), avoid using 
solvents with a pH greater than 10. Avoid storing the system in 
high pH. Flush and store in methanol or a minimum of 10% organic 
with no additives or buffers.

• To flush the system after using mobile phase containing additives, flush the system for at 
least 5 minutes (at least 50 mL of water). Follow with 10% (minimum) of an appropriate 
organic solvent (such as acetonitrile or methanol).

Use miscible solvents
Make sure all solvents and samples, including additives, are miscible. Proteins (from tissues, 
blood, or serum samples) can precipitate in high (>40%) organic solvents. The precipitated 
proteins can clog injectors and tubing, or adsorb the analyte or contaminants.

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 6 OF 33

Store solvents in clean glass reservoirs with covers
• Store mobile phases in clean amber or brown‐stained borosilicate glass reservoirs (see 
Clean laboratory glassware properly, page 6). Borosilicate glass must be type 1, class A, or 
type 3.3.

Caution: The brown bottles in which the manufacturer ships solvents are 
not borosilicate and must not be used to store aqueous solutions.

Caution: Never store liquids in plastic, which can contain plasticizers (for 
example, phthalates) and thus promote organic contamination. 

• Cover the reservoir to prevent airborne contaminants from entering the solvent.
• To cover the reservoir, use aluminum foil or caps supplied with the system. 

Caution: Do not use Parafilm® or other plastic films to cover solvent 
reservoirs.

• Use the smallest solvent reservoir appropriate for your analysis (it depends on your flow 
rate and the length of your runs).
• Do not top off solvents. Instead, discard old solvent, rinse the bottles and solvent inlet 
filters with the solvent that is used, and then refill with fresh solvent. Finally, prime the 
system.

Clean laboratory glassware properly

Any glass container used to prepare or store mobile phase must be thoroughly cleaned 
before use. 

Standard cleaning process

Caution: Never wash glassware with detergents or in a dishwasher.

Caution: Always clean glassware with the same mobile phase/solvent you 
use for the chromatography.

Rinse glassware with organic solvent and then water.

Aggressive cleaning process
If more aggressive cleaning is required (for example, when the container’s history is 
unknown), use the following procedure: 

1.   Sonicate with 10% formic or nitric acid, then water, then methanol or acetonitrile, then 
water. 
2.   Repeat two more times.
CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 7 OF 33

3.   Store glassware used to prepare or store mobile phase separately from other common‐
use glassware.
4.   If glassware or solvent reservoirs become contaminated with microbial growth, treat 
them in an autoclave:

a.  Remove and replace all filters and tubing between the mobile phase reservoir and the 
instrument. 
b.  Purge the system with acetonitrile or methanol and let it sit overnight.

Prepare and handle samples correctly

Make sure that your samples are particle‐free. At the same time, you must take care not to 
introduce contaminants during the process of preparing and handling samples. 

Use efficient cold traps
Use an efficient cold trap when concentrating, lyophilizing, or distilling your sample. 
Otherwise, vacuum pump oil can backstream and cause contamination.

Use clean vials, caps, and plates

1.   Use Waters‐brand vials; they have been certified for certain levels of cleanliness. (Select 
the vial appropriate for your application.) Other vials can contain contaminants that 
interfere with the application and contaminate the system.
2.   Make sure the liner on your vial and bottle caps does not contain contaminants (check 
the manufacturer’s description):
• Do not use vials or bottle caps lined with paper. Paper can be a source of
contaminants.
• Self-sealing septa contain silicone that can interfere with LC/MS applications.
• Single-layered septa are acceptable if they do not contain plastics or adhesives
that can contaminate the sample manager (PTFE is recommended).
3.   Use Waters‐brand wellplates. Other brands can leach plasticizers (for example, diisooctyl 
phthalates). 
4.   Foil‐lined plate covers are acceptable as long as the aluminum does not touch the solvent 
(possibly causing a possible reaction).
5.   Do not use self‐sealing or adhesive cap mats; they can contain contaminants from the 
adhesives.
6.   Do not use cap mats that are not compatible with the solvents used for sample diluents, 
mobile phase, and wash solvents.

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 8 OF 33

Use clean fittings and tubing

Use clean, inert materials for connections

1.   Connections that come into contact with solvents or sample include stoppers, O‐rings, 
check valves, and solvent inlet filters (sinkers).
2.   Labels on inlet tubing can contain contaminants. They must not come into contact with 
solvents or mobile phases.
3.   Some types of tubing (such as polyvinyl chloride, or PVC) contain plasticizers or other 
contaminants.

Caution: Do not touch or bring surfaces into contact with anything 
containing contaminants.

Wear gloves

Wear particulate‐free, powder‐free, non‐latex 
Use Waters’ sterile nitrile gloves (see Table 4) when:

•  Handling parts of the UPLC or HPLC system that come into contact with mobile phase or 
sample
•  Replacing old parts with parts that have the label “Critical Clean”. 

Caution: To avoid incidental skin contact, do not wear finger cots as a 
substitute for gloves.

Replace gloves if they become wet

Caution: Use caution when touching surfaces, even when wearing gloves. 
Keep gloves dry, and replace gloves if they become wet. Wet 
gloves can introduce contamination. Change gloves frequently.

Putting on gloves
For instructions on putting on gloves to prevent contamination, see How to put on gloves, 
page 30.

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 9 OF 33

Use clean columns

Important:  For detailed instructions on using and caring for columns, refer 
to the care and use instructions provided by the column 
manufacturer. (An example is the ACQUITY UPLC BEH Column 
Care and Use Manual, 715001371.)

Use clean columns
A UPLC or HPLC column can trap particles, precipitated proteins, and other organic 
contaminants at the head of the column. These contaminants can adversely affect column 
lifetime by increasing operating pressure or by altering chromatographic selectivity. In 
addition, they can slowly bleed off, increasing carryover and background noise. 

The column can also adsorb impurities from the solvents. This adsorption can occur when 
you:

• Equilibrate a reversed‐phase column (for example, C18) for long periods of time in high‐
aqueous conditions
• Run a reversed‐phase column isocratically at lower organic concentrations
The adsorbed compounds can elute as distinct peaks or as a smear across the chromatogram. 
The trace‐enriching effect amplifies the amount of contamination present in the solvents or 
the UPLC or HPLC system.

Note:  For guidelines on cleaning columns, see Cleaning columns, page 17.

Storing columns
Store columns in the solvent they originally came with (for example, 100% acetonitrile). Flush 
columns to remove buffers and additives before storing them.

Note:  For detailed instructions, refer to the solvent recommendations provided by the 
column manufacturer.

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 10 OF 33

Check laboratory air

Keep laboratory air clean
Compounds present in laboratory air can contaminate the LC/MS system:

• Siloxanes are often present in laboratory air. These compounds, which exist in deodorant 
and other cosmetic products, can cause contamination under certain conditions, such as 
NanoFlow (Figure 1).

Figure 1 ‐ ESI+ spectrum showing siloxane contamination

• Phthalates are also present in laboratory air. Airborne phthalates come from air 
conditioning filters and can contaminate any solvents or solids that come into contact 
with the air.

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 11 OF 33

Troubleshooting Contamination

This section outlines a common‐sense approach to troubleshooting contamination in an LC/
MS system. Use the flowchart to proceed.

Troubleshooting 
contamination

Isolate the 
Is it continuous  problem to the 
Continuous
background noise or  background LC or MS
chromatographic peaks?

Peaks

Check the 
sample  Gradient or 
Isocratic
manager isocratic?

Gradient

Yes Remove the column and 
run a blank. Peaks found?

No

Check the 
Run a gradient blank  solvent 
without injecting. Peaks  Yes
manager
found?

No

Make a 
zero‐volume 
injection

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 12 OF 33

Isolate the problem to the LC or MS system

Note:  Complete the flowchart steps on page 11 before beginning this section.

1.   Flush the ESI probe and infusion mechanism with clean solvent other than mobile phase 
and connect a syringe infusion kit directly to the ESI probe.

Important:  Infuse into the MS the mobile phase that you are using in the 
system (for example, a 50:50 A/B mixture at 0.3 mL/min). Make 
sure to bypass the entire LC and solvent management system. 

• If contamination levels decrease, contaminants are probably located primarily in

the LC system. Troubleshoot the LC system, page 12.
• If contamination spectra do not decrease in intensity, the source of contamination
is probably in the MS system (source, inlet tubing, fluidics unit, and so on).
Troubleshoot the MS system, page 15.

Troubleshoot the LC system

Try a new column

Note:   Contaminants can collect and concentrate on a column (trace enrichment) when you 
run low‐concentration organic mobile phases (for example, initial conditions) for a 
long time. The contaminants elute from the column when a gradient is run. 

Check the mobile phase
Mix 1 mL of mobile phase A with 1 mL of mobile phase B in a clean vial. Infuse the mixture 
into the mass spectrometer. 

• If contamination exists, the problem is in the bottles or mobile phase. See the guidelines 
on using clean solvents and containers in Preventing contamination, page 3.
• If there is no contamination on infusion, pump the 50:50 A/B mixture through a clean 
probe into the mass spectrometer. If you see contamination, it is located in the solvent 
manager/chromatographic pump or sample manager/autosampler (or both). To 
determine which component is the source, Make a zero‐volume injection.

Make a zero‐volume injection

• If you see contaminants, Check the solvent manager/chromatographic pump.
• If no contaminants are present, Check the sample manager/autosampler.

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 13 OF 33

Check the solvent manager/chromatographic pump
Disconnect the solvent manager/chromatographic pump from the sample manager/
autosampler and pump directly into the mass spectrometer. 

• If contamination exists, the solvent manager/chromatographic pump is the source of the 
contamination. Reconnect the sample manager/autosampler and follow General 
guidelines, page 16.
• If contamination does not exist, Check the sample manager/autosampler.

Check the sample manager/autosampler

1.   Remove the column if it has not already been removed.
2.   Pump a wash solution through the sample manager/autosampler to waste. 
To flush the needle wash flow path, use the same solution you used to flush the pumps. 
Also inject large volumes (for example, full loop with 3X overfills) of the cleaning 
solution. If the wash solution is an acid, flush with copious amounts of water. Then 
return to mobile phase and flush thoroughly. If contamination exists, determine whether 
it is in the sample, the diluent, the infusion device, or the sample container.

3.   Check the solvent, water, and acid used for dilution. 
Infuse the sample diluent — for example, a mixture of equal parts water and either 
acetonitrile or methanol plus 0.1% formic acid — into the mass spectrometer to check 
for contamination. If there is no contamination in this “blank”, then the contamination 
came with the original sample. 

If the contamination persists, Check the sample.

4.   Check the sample.
Infuse a diluted sample into the mass spectrometer.  

Note:  PEG can come from detergents used for sample preparation or PEGylated 
pharmaceutical compounds.

If the contamination persists, Check the infusion device and sample container.
5.   Check the infusion device and sample container. 
Clean or replace each component. Then repeat the infusion test. If the infusion device 
and container are clean, Check the needle wash solutions.

6.   Change the injection volume.
If replacing the sample diluent did not solve the problem, try adjusting the injection 
volume by a factor of 2 or more. If the contamination increases or decreases in 
proportion to the injection volume change, it is probable that the sample is 
contaminated. New sample or further sample clean‐up may be required. 

If the sample volume change has no effect on the size of the carryover peak, Change the 
injection mode.

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 14 OF 33

7.   Change the injection mode. 
Partial loop needle overfill (PLNO) mode can cause more carryover than partial loop or 
full loop mode. That is because the sample is pulled through the VDD, which is not 
flushed with strong needle wash.

If the contamination persists, Check the needle wash solutions.

8.   Check the needle wash solutions. 
Are the wash solvents correct? If not, use the correct wash solutions. Make another 
injection and check for contamination. If it still exists, Check the tubing and fittings on 
the injector.

9.   Check the tubing and fittings on the injector.
In particular, check the injector outlet to column inlet. If there is dead volume, 
contamination can accumulate in those spaces. Replace the tubing and fittings. Make 
another injection and check for contamination. If it still exists, Replace the needle.

10.  Replace the needle.
Replace the needle, then make another injection. Some hydrophobic compounds adsorb 
to PEEK needles. If contamination persists, try replacing it with a stainless steel needle. If 
contamination still persists, Replace the other injector parts.
11.  Replace the other injector parts.
Replace the other injector parts (for example, needle wash port, injector valve pod). 
Refer to the operator’s manual for specific injector parts that can be replaced. Flush the 
system with mobile phase. Make another injection and then check for contamination. 

a.  If contamination still exists, Troubleshoot the MS system, page 15.
b.  If contamination does not exist, Reinstall the column.
12.  Reinstall the column.
Reinstall the column, and then check for contamination. If contamination appears, 
repeat the following steps with the column installed (but omit the infusion steps):
• Make a zero-volume injection, page 12
• Check the solvent manager/chromatographic pump, page 13
• Check the sample manager/autosampler, page 13

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 15 OF 33

Troubleshoot the MS system 

If troubleshooting the liquid chromatography system does not yield the location of 
contamination, the likely source is the mass spectrometry system. 

Important:  Do not waste time and resources attempting to remove typical 
background noise. The sensitive nature of MS systems means 
that some degree of chemical background is a constant. In 
addition, different types of MS systems have different degrees 
of sensitivity. For example, you see a higher background in a 
more sensitive instrument. Sensitivity is signal‐to‐noise ratio, 
not just absolute counts.

Check the front‐end components
Likely locations for MS contamination are front‐end components: 

• ESI probe (probe tip, capillary, unions)
• Sample cone
• LockSpray baffle
• Ion source block
• Source enclosure
• PEEK tubing connecting column outlet to API source
• Components of the integral flow divert/injection valve (if fitted)
• Throttle valve (if fitted)
• PEEK support block
• LC tubing
• Nitrogen gas tubing
• Nitrogen gas source (for example, generator)

Remove, clean or replace, and test the components
Remove, clean or replace, and test each of these components one at a time. If contamination 
still exists, the MS components possibly have become recontaminated after cleaning. To 
avoid this problem, clean and replace all suspected parts simultaneously. 

Clean or replace the contaminated component
If background noise is high after any test, clean or replace the last component added (see 
Cleaning to Eliminate Contamination, page 16). 

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 16 OF 33

Cleaning to Eliminate Contamination

Warning:  To prevent injury, always use safe laboratory practices when 
working with solvents and wash solutions. Know the chemical 
and physical properties of the solvents and solutions. Refer to 
the safety data sheets for each solvent and solution in use.
Always use eye protection and gloves when handling solvents or 
cleaning mixtures.

Caution:  Do not attempt to clean the system until you have found and 
eliminated the source of contamination. If you clean without 
finding the source, the contamination will soon return and the 
system will require cleaning again.
Disconnect the LC system from the column and detector before 
cleaning. 
Solvents and acid or base must be of the highest purity for 
cleaning and use.

If you must clean the LC/MS system, an understanding of contaminants and their sources is 
essential. For information, see Major contaminants and their sources, page 31.

General guidelines

To clean contamination in Waters systems, use only mobile phase‐ (highest‐) quality solvents 
and acid or base.1 Remove the column and detector (any detector, including the mass 
spectrometer). If you know what the contaminant is, use the mixture in which it is most 
soluble.

Flush the system component with a high‐organic solvent such as 80% organic solvent and 
20% water, and then test for contamination. Repeat the procedure until the background is 
reduced to an acceptable level.

After using any wash, rinse with 50% acetonitrile or mobile phase to remove the cleaning 
solution. If you use a phosphoric acid wash, pump ultra‐pure water (see Use ultra‐pure water, 
page 4) through the system until the pH is close to neutral (pH=7).

1. These cleaning guidelines are based on traditional techniques using materials that are readily available 
in the laboratory. They apply primarily to reversed‐phase LC/MS.

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 17 OF 33

Cleaning columns 

Important:  If washed in solvents containing additives such as ammonium 
hydroxideome, silica packing materials dissolve at pH > 8 . If 
your mobile phase pH exceeds 8, use a column that is more 
stable to high pH, such as the Waters ACQUITY UPLC™ BEH or 
XBridge™ column. 

For detailed guidelines on washing silica packing materials, 
refer to the care and use instructions provided by the column 
manufacturer.

To clean a contaminated column, wash the column with solvents that remove the 
contaminants and do not damage the column. It is good practice to clean a reversed phase 
column at the end of a run by flushing it with a high‐percentage (for example, 80%) organic 
mobile phase.

Note:  For full instructions on cleaning a column, refer to the care and use instructions 
provided by the column manufacturer.

Recommended cleaning procedures for MS systems
To clean a standalone MS system, use the cleaning procedure (available in the Waters 
Support Library) appropriate to your system:

• Mass spectrometry user guides

Recommended cleaning mixtures for LC inlet components

Caution: To prevent cross‐contamination, remove the connection to the 
column and mass spectrometer before cleaning the LC inlet.

To clean the LC inlet, use the recommended cleaning mixtures in Table 1. 

For other cleaning procedures that may be appropriate for your system, refer to the Waters 
Support Library:

• Routine cleaning procedures for separations systems 
• UPLC/UHPLC user guides
• Alliance HPLC user guides

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 18 OF 33

Final rinse
After cleaning with any of the mixtures, rinse the LC inlet with one of the following:

• Ultra‐pure water (required for phosphoric acid wash)
• 50:50 mixture of water/organic solvent
• 50:50 mixture of the chromatographic method’s mobile phases

Important:  Always leave the system in the wash solvent that is most similar 
to your mobile phase (pH) conditions.

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
 715001307 REV. G
CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS

Table 1: Recommended cleaning mixtures for LC inlets1

Cleaning 
Solvent mixtures (v/v) Stock concentration Description Cautions Comments
conditions

1 • 80% 2‐isopropanol (IPA) • ~99% formic acid An aggressive cleaning  • To prevent retention time  • Standard, or “acid wash”

• 10% water mixture for compounds  problems, flush with at  • Cleans the LC inlet for use 
• 10% formic acid more soluble in acids least 50 mL of a solvent  with acidic mobile phases.
compatible with the  • Formic acid is volatile.
cleaning solution.
• High‐purity formic acid is 
expensive.
• Do not leave wash 
solution overnight when 
not flowing. 
• Do not mix 100% organic 
with strong acid.

• Final rinse: Prime with ultra‐pure water through the lines used for cleaning for several minutes. 

2 • 80% 2‐isopropanol (IPA) • ~29% ammonium An aggressive cleaning  • Never use in ACQUITY M‐ • “Basic wash”

• 10% water • ~56.6% ammonium  mixture for compounds  Class, nanoACQUITY, or  • Cleans the LC inlet for use 
• 10% ammonium  hydroxide more soluble in base ‐ for  any system containing  with basic mobile phases.
hydroxide (concentrated) example, phthalates and  silica capillary tubing that  • Ammonium hydroxide is 
PEG‐containing compounds,  dissolves >pH10. volatile.
including detergents (Triton  • To prevent retention time 
X‐100, Triton X‐114, Brij 35). problems, flush with at 
least 50 mL of solvent 
compatible with the 
cleaning solution.
• Do not leave wash 
solution overnight when 
not flowing. 
• Do not mix 100% organic 
with strong acid.

• Final rinse: Prime with ultra‐pure water through the lines used for cleaning for several minutes. 

19
OF
33
 Table 1: Recommended cleaning mixtures for LC inlets1

715001307 REV. G
CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS

Cleaning 
Solvent mixtures (v/v) Stock concentration Description Cautions Comments
conditions

3 • 30% phosphoric acid  ~85% Phosphoric acid An aggressive mixture for  • To prevent burns from  • “Phosphoric acid wash”

(concentrated) removing organic  splattering solvent,  • Phosphoric acid works as 
contaminants. slowly add the acid to  both a strong acid and an 
• 70% water
water while stirring.  oxidizing agent, 
• Not compatible with  destroying compounds.
mass spectrometers. • Not volatile and not 
• To prevent retention time  compatible with mass 
problems, flush until you  spectrometers.
reach neutral pH (pH=7)  • Loss in sensitivity.
with a solvent compatible  • You might see clusters at 
with the cleaning solution  98.
(for example, 100% 
water).
• Do not leave wash 
solution overnight when 
not flowing. 
• Phosphate is insoluble in 
high‐organic 
concentrations. Always 
flush phosphate with 
large quantities of water.
• Do not mix 100% organic 
with strong acid.

• Final rinse: Prime with ultra‐pure water through the lines used for cleaning for several minutes. 

4 100% IPA N/A Neutral, hydrophobic  • Do not mix 100% organic   N/A

compounds with strong acid.
• Inorganic salts containing 
sodium, potassium, 
phosphate precipitates.

1. Use these cleaning solutions only to clean LC inlet components that have been identified as the source of contamination (see Troubleshooting Contamination, page 
11). Do not use any of these cleaning solutions to clean a column. Refer to the care and use instructions provided by the column manufacturer.

20
OF
33
715001307 REV. G 21 OF 33

Cleaning the solvent manager/chromatographic pump
Pump the cleaning solution through the solvent manager/chromatographic pump (or solvent 
manager/chromatographic pump and sample manager/autosampler) to waste. Then flush 
thoroughly with mobile phases.

Caution: If you have flushed with phosphoric acid, you must flush with 
water before mobile phase.

Cleaning the sample manager/autosampler 
Pump the cleaning solution through the sample manager/autosampler to waste. Use the 
same solution to flush the needle wash flow path. Also inject large volumes (full loop for the 
fixed loop sample manager, or the largest volume available for the FTN sample manager) of 
the cleaning solution. Then return to the mobile phase and wash solutions required for 
analysis and flush thoroughly.

Cleaning the column
See Cleaning columns, page 17.

Cleaning MS Systems

Remove and clean or replace suspected MS components
Remove and clean or replace MS components suspected of causing contamination. Use the 
highest‐purity solvents. The objective is to dissolve contamination from the surface of the MS 
component. To avoid recontaminating clean or new components, use a methodical cleaning 
process. Sometimes you clean or replace one component at a time, working from the first 
component to come into contact with solvent to the last component. In other cases, it is 
better to clean all suspected components simultaneously. Be sure to use ultra‐pure solvents 
and clean glassware (see Preventing contamination, page 3).

1.   Carefully wipe the component with a clean swab or lint‐free wipe. 

Caution: To avoid contact with toxic contaminants, wear gloves and eye 
protection.

2.   Sonicate components in solvent for between 15 minutes to 1 hour. See Table 1 for 
recommended MS cleaning solutions.

Note:   Effective removal of contamination can require several sonication steps, using fresh 
cleaning solvent at each step. Each sonication step should last between 15 minutes to 
1 hour. Longer times may be required if the flow rates are low (for example, M‐Class).

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 22 OF 33

3.   If these solutions fail to reduce contamination levels, replace the parts.

Caution: To avoid damaging PEEK components and T‐Wave assemblies, do 
not sonicate in chlorinated solvents, hexane, acetone, or acids.

4.   Be sure to rinse the glassware thoroughly and use fresh, clean solvent between each 
step.
5.   After final sonication, remove the MS component from the cleaning solution. Quickly dry 
the component with a strong stream of clean, dry nitrogen.

Caution: Fast, thorough drying is necessary to prevent solvent spots, which 
can affect MS performance.

Fluidics
After decontaminating the rest of the plumbing, strip and clean the fluidics according to 
manufacturer instructions. Pay particular attention to the rotor seal, on which mechanical 
wear (observable as circular grooves) can serve as a site of contamination. Replace the seal if 
necessary.

API source
Because it can be exposed to a large quantity of sample material during normal operation, 
the atmospheric‐pressure ionization (API) source is the most common location of MS 
contamination. Disassemble and clean the source using normal maintenance procedures. 
Sonicate API source components in solvent for between 15 minutes to 1 hour.

Important:  Ensure that solvent quality and glassware cleanliness (Select, 
prepare, and handle solvents correctly, page 3).

Notice:  Ion optics from the ion transfer region forward are an unlikely 
location of contamination detectable by MS analyses.

API probes
Replace or rebuild contaminated API probes rather than cleaning or flushing it.

LC tubing
Replace contaminated LC tubing rather than cleaning it through repeated flushing.

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 23 OF 33

Reference Information

Solvent considerations

Possible effects of low‐quality solvents
Not all assays require a high‐grade solvent. When selecting a solvent, choose the highest‐
purity solvent appropriate for your application. Consider the solvent contaminant types and 
consequences. Table 2 shows the possible effects of low‐quality solvents on your assay.

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
 715001307 REV. G
CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS

Table 2: Possible effects of low‐quality solvents

Solvent contaminants Possible problems Analytical considerations Preventive actions

Particle content less than (<) 0.2  • Increased system back pressure  More down time and less  • Use only high purity solvents 

microns and high‐pressure shutdowns productivity that are filtered by the vendor to 
• Clogged tubing and columns remove particulates greater than 
• Damage to pumps and injector  0.2 microns.
causing leaks and non‐ • Wear gloves to eliminate oils 
reproducible results from skin and hand creams.
• Do not refilter vendor‐filtered 
solvents.

Micro‐organisms ‐ bacteria, algae,  • Behave like particulates • More down time and less  • Use fresh aqueous mobile 

fungus • Produce organic and ionic  productivity to remove  phases.
contaminant compounds contamination • Wear gloves to eliminate oils 
• Loss of sensitivity  from skin and hand creams.
• Use fresh, high purity, filtered 
water (<0.2‐micron filter).
• Never top‐off bottles; empty, 
clean, and refill with fresh 
mobile phase.
• Never store the system in high 
aqueous mobile phase.
• Use appropriate caps on mobile 
phase bottles.

24
OF
33
 Table 2: Possible effects of low‐quality solvents

715001307 REV. G
CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS

Solvent contaminants Possible problems Analytical considerations Preventive actions

UV absorbing organic compounds  • Noisy or changing (sloping)  • For high sensitivity and  • Do not use plastic bottles as 

(detectable in TUV, PDA) baseline detection of low concentrations  solvent or mobile phase 
• Ghost peaks of analytes, a smooth, flat  reservoirs.
• Loss of sensitivity baseline is desired for the  • Wear gloves to eliminate oils 
highest signal‐to‐noise ratio. A  from skin and hand creams.
• Loss of linearity
high signal‐to‐noise ratio  • Use vials, well plates, and caps 
• Shifting retention times improves the reproducibility of  appropriate for LC organic 
• Abnormal peak shapes quantitation. solvents.
• High UV background can  • Never wash LC glassware 
decrease the linearity of the  (bottles, funnels, graduated 
method at high analyte  cylinders, etc.) with detergents.
concentrations.
• Have dedicated LC glassware.
• Do not refilter vendor‐filtered 
solvents. Filters or filtering 
apparatus can add 
contaminants.

25
OF
33
 Table 2: Possible effects of low‐quality solvents

715001307 REV. G
CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS

Solvent contaminants Possible problems Analytical considerations Preventive actions

Ionizable organic compounds  • Noisy or high baseline • Contamination from low mass  • Do not use plastic bottles as 

detectable in the mass  • Loss of sensitivity ions, PEG compounds, and  solvent or mobile phase 
spectrometer • Ghost peaks phthalates (plasticizers) can  reservoirs.
cause: • Plastics are the source of 
• Shifting retention times
• Loss of sensitivity, lower signal‐ phthalates and are found 
• Abnormal peak shapes
to‐noise ratio due to ion  everywhere including in air, 
suppression water, and solvents.
• Spectral peaks at the same  • Wear gloves to protect skin from 
masses as the analytes oils and hand creams containing 
PEG.
• Use vials, well plates, and caps 
appropriate for LC organic 
solvents.
• Never wash LC glassware 
(including bottles, funnels, 
graduated cylinders) with 
detergents or in a dishwasher.
• Have dedicated LC glassware.
• Do not refilter vendor‐filtered 
solvents. Filters or filtering 
apparatus can add 
contaminants.

26
OF
33
 Table 2: Possible effects of low‐quality solvents

715001307 REV. G
CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS

Solvent contaminants Possible problems Analytical considerations Preventive actions

Inorganic ions • Adduct for formation with  • Loss of sensitivity due to adduct  • Use fresh, high‐purity, filtered 

cations (Na+, K+) detected in the  formation which splits the  (<0.2‐micron filter) water and 
mass spectrometer analyte spectral peak into  solvents.
• Loss of sensitivity several peaks with different  • Use high‐purity mobile phase 
• High pressure and clogging masses (for example, Na+  additives.
increases m/z by 22 amu). • Use borosilicate (hardened) 
• Cluster formation (for example 
NaCl clusters, delta mass =  • Inorganic compounds are not  glass for mobile phase reservoirs 
57.96) soluble in high organic solvent  (for example, Pyrex® or Schott®).
concentrations, resulting in high  • Do not use original solvent 
• Appearance of red deposits, 
pressure and clogging, or  bottles for mobile phases 
“rust”, from iron Fe+3
clusters. containing acids, bases, or 
buffers. They cause ions to leach 
from the glass.

Gases Unwanted spectra from  Poor‐quality gases introduce  • Obtain gases that meet the mass 

impurities, for example oils background contamination. spectrometer site requirements 
(nitrogen 95% pure or better, 
99.5% pure for IMS or GC; argon 
99.997% pure; helium 99.5% 
pure).
• Use a nitrogen generator that 
has particles <0.01 microns, no 
phthalates, no liquids (for 
example, water).
• Use a well‐maintained nitrogen 
generator.
• Gas plumbing must be 
chemically cleaned copper, 
medical‐grade stainless steel 
with no soldered or brazed joints 
to minimize metal ion 
contamination.

27
OF
33
715001307 REV. G 28 OF 33

Solvent purity recommendations
A high‐purity solvent meets the criteria shown in Table 3.

Note:  Table 3 values were obtained from known usable LC/MS solvents. Some brands have 
certificates of analysis indicating higher purity than these values.

Table 3: LC/MS solvent purity recommendations

Suggested level
Parameter
Acetonitrile Methanol Isopropanol Water

Assay 99.9% 99.9% 99.9% 99.9%

Filtered 0.2 microns 0.2 microns 0.2 microns 0.2 microns

Aluminum (Al) 25 ppb 50 ppb 20 ppb 50 ppb

Calcium (Ca) 50 ppb 50 ppb 50 ppb 50 ppb

Iron (Fe) 20 ppb 20 ppb 20 ppb 10 ppb

Lead (Pb) 20 ppb 20 ppb 20 ppb 10 ppb

Magnesium (Pb) 20 ppb 20 ppb 20 ppb 10 ppb

Potassium (K) 50 ppb 50 ppb 50 ppb 50 ppb

Sodium (Na) 50 ppb 50 ppb 50 ppb 50 ppb

Residue after  25 ppb 25 ppb 25 ppb 25 ppb

evaporation

Water 0.01% 0.05% 0.05% N/A

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 29 OF 33

Recommended water purification process

Ultra‐pure water is sterile and contains no particulates, no detectable ionizable compounds, 
and no UV‐absorbing compounds. The purification process must include all the following 
steps:

a.  Reverse osmosis (to remove most contaminants)
b.  UV sterilization (to kill bacteria)
c.  Ion exchange (to remove any remaining ions)
d.  Carbon filtration (to remove any remaining ionizable compounds)
e.  A pharmaceutical‐grade 0.2‐µm membrane filter (to remove any remaining particu‐
lates)

Caution: House deionized (DI), reverse‐osmosis (RO), and distilled water do 
not meet these criteria.

Caution: If using a purification system, you must perform regular 
maintenance on it.

Other considerations

• If outlet lines have been without flow for more than 24 hours, flush them to eliminate 
bacterial growth.
• Once the water has been purified, do not store it for longer than 24 hours without taking 
measure to prevent the growth of microorganisms.
• If using bottled water, pay attention to the expiration date suggested by the manufacturer, 
and discard the water after that date. Open bottles of water can become contaminated.

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 30 OF 33

Gloves

Order gloves
Table 4: Nitrile gloves

Part Number Description Qty

700002964 Sterile Nitrile Gloves, Size 7 3 pairs

700002965 Sterile Nitrile Gloves, Size 9 3 pairs

How to put on gloves
Open the gloves by unfolding the packaging leaves until the cuffs are exposed (Figure 2).

Figure 2 ‐ Removing gloves from package
Grasp the cuff of one glove and pull it over your hand, leaving the cuff turned up. Repeat with 
the other glove. Then turn down the cuffs of both gloves.

Caution: When putting on gloves, do not touch the glove fingers with your 
bare hand. Once the gloves are on, do not touch anything other 
than the critical‐clean parts being handled or serviced.

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 31 OF 33

Major contaminants and their sources

This section lists some major contaminants in LC/MS systems, along with their sources and 
spectra.

Polyethylene glycol (PEG) or PEG‐like materials
PEG (Figure 3) is a synthetic polymer produced in a range of molecular weights. Common 
sources of PEG contamination include:

• Organic solvents (methanol, 2‐propanol, acetonitrile, water)
• Mass spectrometer calibration solution
• Hand cream and other personal care products
• Detergent (Triton X‐100, glassware detergents, and so on)
• Cutting solutions in machining
• Column manufacturing

Figure 3 ‐ PEG contamination spectra (series of mass peaks separated by 44 Da)

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 32 OF 33

Metal ions 
Metal ions such as lithium (Li), sodium (Na), potassium (K), copper (Cu), platinum (Pt), and 
iron (Fe) can be sources of contamination. 

For example, iron forms adducts with varying numbers of acetate in acetic acid or acetate 
mobile phases. Iron can contaminate an LC/MS system through the following sources:

• Solvents such as water and acetonitrile
• Acetic acid (lower in formic acid)
• Formic acid
• Non‐passivated stainless steel parts
• Titanium or inert metal parts fabricated with steel tools

Figure 4 shows the typical pattern of Fe‐acetate cluster spectra. The strongest ion (base peak 
intensity, or BPI) mass can differ, depending on the number of acetates in the cluster. The 
upper spectra are based on the MassLynx isotope model.

Figure 4 ‐ Fe contamination spectra

Phthalates 
Phthalates are chemical compounds used chiefly as plasticizers, and can cause 
contamination. The compounds can be detected on a wide range of laboratory materials, 
including water and other solvents, laboratory air, and plastic materials such as tubing and 
water storage containers. Common phthalates include di‐2‐ethyl hexyl phthalate (DEHP), 
diisodecyl phthalate (DIDP), diisononyl phthalate (DINP), and diisooctyl phthalate (DIOP).

CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS
715001307 REV. G 33 OF 33

Diisooctyl phthalates can form the following adducts:

• [M+H]+ = 391
• [M+Na]+ = 413
• [M+K]+= 429
• [2M+NH4]+= 798
• [2M+Na]+ = 803

Slip agents (amides)
Avoid using components packed in plastic bags containing slip agents, or amides (Figure 5). 
The three most commonly used amides are:

• Oleamide ([M+H]+=282)
• Stearamide ([M+H]+=284)
• Erucamide ([M+H]+=338)

Figure 5 ‐ Contamination spectrum of oleamide and erucamide in zip bag

Contaminant database

For a comprehensive list of major contaminants, see PEG master list and Background Ion 
Master List.
CONTROLLING CONTAMINATION IN LC/MS SYSTEMS