SNI 01-2332.

2-2006

Standar Nasional Indonesia

Cara uji mikrobiologi - Bagian 2: Penentuan

Salmonella pada produk perikanan
ICS 67.120.30 Badan Standardisasi Nasional
Daftar isi

Daftar isi ........................................................................................................................... i

Prakata ............................................................................................................................ ii

Pendahuluan .................................................................................................................... iii

1 Ruang lingkup ............................................................................................................ 1

2 Istilah dan definisi ...................................................................................................... 1

3 Prinsip ......................................................................................................................... 2

4 Peralatan ................................................................................................................... 2

5 Media dan pereaksi .................................................................................................... 2

6 Preparasi contoh ....................................................................................................... 3

7 Prosedur .................................................................................................................... 3

8 Keamanan dan keselamatan kerja ............................................................................ 11

Annex A (normative) Preparation ........................................... media ............................. 13

Annex B (normative) Preparation of reagents ........................................... ........................ 20

Annex C (informative) Schematic determination of Salmonella .......................................... .........

22

Bibliography ................................................. .................................................. ...................... 23

Table 1 Weight the samples to be tested ......................................... ............. 3

Table 2 Biochemical reactions of Salmonella in TSI and LIA ......................................... ...... 5

Table 3 biochemical and serological reactions for Salmonella .......................................... ... 8

Tabel 4 Kriteria untuk pemisahan kultur non Salmonella ............................................ 11

SNI 01-2332.2-2006
 i
SNI 01-2332.2-2006

Prakata

Dalam rangka memberikan jaminan mutu dan keamanan pangan terhadap komoditas yang
akan dipasarkan di dalam dan luar negeri, maka perlu disusun suatu Standar Nasional
Indonesia (SNI) metode uji yang dapat memenuhi jaminan tersebut.

Metode pengujian ini merupakan revisi dari SNI 01-2335-1991,Standar metode pengujian
mikrobiologi-Produk perikanan penentuan Salmonella, dirumuskan oleh Panitia Teknis
Perikanan melalui rapat-rapat teknis, rapat prakonsensus dan rapat konsensus nasional pada
tanggal 18 Maret 2005 di Jakarta. Dihadiri oleh wakil-wakil produsen, konsumen, asosiasi,
lembaga penelitian, perguruan tinggi serta instansi terkait sebagai upaya untuk meningkatkan
jaminan mutu dan keamanan pangan.

In connection with the preparation of Indonesia's National Standard, the rules that form the basis
or guidelines are:

1 of Government Regulation No. 69 of 1999 on Food Label and Advertisement. 2 Decree of the
Minister of Marine Affairs and Fisheries. No. KEP. 01 / MEN / 2002
Integrated Quality Management System Fishery Products. 3 of the Decree of the Minister of
Marine Affairs and Fisheries. No. KEP. 06 / MEN / 2002 concerning Requirements and
Procedures for Quality Inspection Fishery Go to the Territory of the Republic of Indonesia. 4
Decree of the Minister of Marine Affairs and Fisheries. No. KEP. 21 / MEN / 2004 on the System
Supervision and Quality Control of Fisheries for the European Union market. 5 Data
Salmonella verification testing method microbiology laboratory BPPMHP 2003.
 ii

preliminary

Changes that occur in this standard are as follows:

1 Preparation of media and reagents

Although the media and reagents used for testing are widely available commercially, but the
inclusion of media and reagents manufacture is expected to further facilitate the analyst in
preparing media and reagents that are not commercially available.

2 Use of media Rappaport-Vassiliadis (RV) and Tetrathionate Broth (TTB).

Sebelumnya, RV medium hanya direkomendasikan untuk pengujian udang. Hasil studi pre
kolaboratif dan kolaboratif yang dilakukan oleh FDA menunjukkan bahwa RV medium sesuai
untuk menganalisa makanan mentah, makanan dengan tingkat kontaminasi tinggi, dan
makanan ternak. Data-data pendukung lain menunjukkan bahwa RV medium dapat
menggantikan penggunaan media Selenite Cystine Broth untuk menganalisa semua jenis
makanan. Penggunaan Tetrathionate Broth tetap dilakukan sebagai media pengkayaan selektif
kedua. Akan tetapi, inkubasi TTB dilakukan pada 43°C untuk menganalisa makanan mentah,
makanan dengan tingkat kontaminasi tinggi, dan makanan ternak; dan 35°C untuk menganalisa
jenis makanan yang lain.

Hasil verifikasi metoda yang dilakukan oleh Balai Pengembangan dan Pengujian Mutu Hasil
Perikanan menunjukkan bahwa RV dapat direkomendasikan untuk menganalisa produk
perikanan dengan tingkat kontaminasi tinggi.

3 Petunjuk pengambilan koloni dari media agar selektif

Petunjuk pengambilan koloni dari media agar selektif lebih terarah. Jika tidak ada koloni yang
khas atau koloni terduga pada media agar selektif, disarankan untuk menginokulasi koloni yang
tidak khas ke dalam media TSI dan LIA. Hal ini berdasarkan kenyataan bahwa 4% kultur
Salmonella yang diisolasi oleh analis FDA dari makanan tertentu terutama makanan dari
laut/seafoods selama beberapa tahun menunjukkan koloni yang tidak khas.
SNI 01-2332.2-2006
 iii

Cara uji mikrobiologi - Bagian 2: Penentuan

Salmonella pada produk perikanan

1 Ruang lingkup

Standar ini digunakan untuk mendeteksi, mengisolasi dan mengkonfirmasi bakteri Salmonella
pada produk perikanan.

2 Istilah dan definisi

2.1 inkubasi pengkondisian mikroorganisma untuk tumbuh dan berkembang biak sesuai
dengan suhu dan waktu yang diperlukan

2.2 media pengkayaan media yang digunakan untuk memperbaiki sel-sel bakteri yang rusak
atau meningkatkan jumlah populasi bakteri

2.3 media selektif media yang mengandung bahan-bahan selektif untuk menghambat
pertumbuhan bakteri selain bakteri yang dianalisa

2.4 media agar media padat yang digunakan untuk pertumbuhan

mikrorganisma

2.5 mikroorganisma kelompok organisma yang berukuran kecil dan hanya dapat dilihat
di bawah mikroskop

2.6 fishery products including aquatic biota are handled and / or processed to be used as
other end products such as fresh fish, frozen fish and other processed products for
human consumption

2.7 fishery products with high contamination levels of fisheries products which have a
tendency lot of bacteria due to the nature of the product is appropriate for the bacteria to
grow and multiply

2.8 Salmonella Gram-negative, rod-shaped without spores to the size of 0,7μm - 1,5μm x 25μm.
Salmonella generally have peritrichous flagella, except for Salmonella pullorum and Salmonella
gallinarum
SNI 01-2332.2-2006
 1 of 23
SNI 01-2332.2-2006

2.9 colony unexpected (suspected colonies) colonies on selective agar medium which
gives the characteristics of a typical Salmonella. These colonies should be confirmed to
ensure the validity of Salmonella

3 Prinsip

Contoh yang diuji ditumbuhkan terlebih dahulu pada media pengkayaan kemudian dideteksi
dengan menumbuhkannya pada media agar selektif. Koloni-koloni yang diduga Salmonella
(suspected colonies) pada media selektif diisolasi dan dilanjutkan dengan konfirmasi melalui uji
biokimia dan uji serologi untuk meyakinkan ada atau tidaknya bakteri Salmonella.

4 Peralatan

− Blender beserta Jar yang dapat disterilisasi atau stomacher beserta plastik steril − Pipet
− Petridish ukuran 15 mm x 100 mm − Tabung reaksi ukuran 16 mm x 150 mm dan 20 mm x
150 mm − Rak tabung reaksi − Timbangan dengan ketelitian 0,1 g − Inkubator 35°C ± 1°C −
Inkubator 37°C ± 0,5°C − Waterbath 43°C ± 0,2°C − Waterbath 42°C ± 0,2°C − Waterbath
48°C - 50°C − Jarum inokulasi − Autoclave − Alat pengocok (Vortex mixer) − Bunsen − pH
meter − Spatula − Filter apparatus − Oven − Hot plate dan stirer

5 Media and reagents

- Bismuth sulfite order (BSA) (A.1) - Brain Heart

Infusion Broth (A.2) - Hectoen Enteric (HE)
order (A.3) - lactose Broth (A.4) - Lysine
Decarboxylase Broth (A.5) - Lysine Iron order
(LIA) (A.6) - malonate Broth (A.7) - Motility Test
Medium (A.8) - MR-VP Broth (A.9) - Phenol red
Carbohydrate Broth (A.10) - Potassium Cyanide
(KCN) Broth (A.11) - Purple Carbohydrate Broth
(A.12) - Rappaport-Vassiliadis (RV) medium
(A.13)

2 of 23

- Selenite Cystine Broth (SCB) (A.14) - Simmons

Citrate order (A.15) - Tetrathionate Broth (TTB) (A.16)
- Triple Sugar Iron (TSI) order (A.17) - Trypticase Soy
Broth -Tryptose (A.18) - Tryptone (Tryptophane) Broth
(A.19) - urea Broth (A.20) - Urea Broth (Rapid) (A.21) -
Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) order (A.22) -
aquadest - ethanol 70% - Solution Brillian Green Dye
(B.1) - The solution Formalized Physiological Saline
(B.2) - Kovac's reagent (B.3) - Indicators methyl Red
(B.4) - The solution Physiological Saline 0.85% (B.5) -
The solution potassium Hydroxide 40% (B.6) - Reagent
VP (B.7) - A solution of 1 N sodium Hydroxide (B.8) - A
solution of 1 N hydrochloric Acid (B.9) - Salmonella
polyvalent Somatic O antiserum - Salmonella flagellar
polyvalent H antiserum

NOTE The procedure for media preparation are described in Appendix A and the procedure for the
manufacture of reagents described in Appendix B

6 Preparation example

By applying aseptic technique, a sample was taken at random and cut into small pieces up to
the weight of each sample to be tested according to the provisions in Table 1.

Examples melted frozen at the time will be analyzed. Melting carried out for 18 hours at a
temperature of about 2 ° C - 5 ° C or below 45 ° C and no more than 15 minutes.

Tabel 1 Berat contoh yang diambil yang akan diuji

Berat contoh Berat contoh yang akan diuji < 1 kg atau 1 l 100 g atau 100
ml 1 kg atau 1 l - 4,5 kg atau 4,5 l 300 g atau 300 ml > 4,5 kg
atau 4,5 l 500 g atau 500 ml

7 Prosedur

7.1 Pra pengkayaan

a) Metoda ini didasarkan pada analisa 25 g atau 25 ml contoh dengan perbandingan 1 : 9 untuk
contoh dan media pengkayaan. Jika pengujian dilakukan secara komposit, tambahkan media
pengkayaan yang cukup untuk menjaga perbandingan 1:9.

a) Untuk contoh dengan berat lebih kecil atau sama dengan 1 kg atau 1 l sampai dengan 4,5 kg
atau 4,5 l timbang contoh padat sebanyak 25 g atau contoh cair sebanyak 25 ml dari
SNI 01-2332.2-2006
 3 dari 23
SNI 01-2332.2-2006

contoh yang akan diuji , kemudian masukkan dalam wadah atau plastik steril dan tambahkan
225 ml larutan Lactose Broth.

b) For example with a weight greater than 4.5 kg or 4.5 l weigh as much as 50 g solid sample or
liquid sample 50 ml, then enter it in a plastic container or sterildan add 450 ml of Lactose Broth.

c) Homogenkan example for 2 minutes for analysis. Aseptic, transfer the sample solution in
sterile containers suitable and leave at room temperature for 60 minutes with the cover closed.
Shake gently and if necessary specify the pH to (6.8 ± 0.2). Beat well and loosen the lid
sufficiently. Incubation 24 hours ± 2 hours at 35 ° C ± 1 ° C. Continue testing in accordance with
the procedure.

7.2 enrichment

a) Tighten the lid and gently shake incubated sample. For fishery products with high levels of
contamination, remove 0.1 ml of sample into a 10 ml Rappaport-Vassiliadis (RV) medium and 1
ml of sample solution into a 10 ml Tetrathionate Broth (TTB); For other types of fishing products,
transfer 1 ml of sample solution into each 10 ml and 10 ml TTB SCB.

b) Incubation of selective enrichment media as follows: For fishery products with high
contamination levels, RV incubation medium for 24 hours ± 2 hours at a temperature of 42 ° C ±
0.2 ° C (Water bath); TTB incubation for 24 hours ± 2 hours at a temperature of 43 ° C ± 0.2 ° C
(Water bath); For other types of fishing products, TTB and SCB incubation for 24 hours ± 2
hours at 35 ° C ± 1 ° C.

7.3 Isolation of
Salmonella

7.3.1 Shake the tube (by vortex) and by using a needle loop (3mm) TTB were incubated
scratch into media HE, XLD and BSA. BSA Prepare one day before use and store in a
dark place at room temperature

7.3.2 Scratch into the same medium of RV Broth or SCB.

7.3.3 Incubation cup BSA, HE and XLD for 24 hours at a temperature of 35 ° C

± 1 ° C.

7.3.4 Observe possible presence of Salmonella

colonies

7.3.4.1 Observations Salmonella colony morphology typical (typical)

Take 2 or more Salmonella colonies from each selective media order after 24 hours ± 2 hours
of incubation. Salmonella colonies typical (typical) is as follows:
 a) HE Agar. Bluish green to blue colonies with or without black core. Salmonella culture
generally form large colonies, shiny black core or almost all colonies look black.

b) XLD Agar. Koloni merah jambu (pink) dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur
Salmonella membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat
berwarna hitam.

c) BSA. Koloni coklat, abu-abu atau hitam; kadang-kadang metalik. Biasanya media di sekitar
koloni pada awalnya berwarna coklat, kemudian berubah menjadi hitam (halo

4 dari 23
effect) dengan makin lamanya waktu inkubasi. Apabila koloni yang khas (typical) tumbuh pada BSA
setelah 24 jam ± 2 jam inkubasi, ambil 2 koloni atau lebih. Inkubasikan kembali media BSA selama 24
jam ± 2 jam. Setelah 48 jam ± 2 jam, ambil 2 atau lebih koloni yang khas (typical) yang tumbuh pada
media BSA. Pengambilan ini dilakukan hanya bila koloni yang tumbuh pada media BSA yang diinkubasi
selama 24 jam ± 2 jam memberikan reaksi yang tidak sesuai pada TSI dan LIA, yang menjadikan kultur
ini dinyatakan sebagai bukan Salmonella. Lihat pasal 7.3.6 dan 7.3.7 di bawah untuk keterangan lebih
lanjut dalam menginterpretasikan reaksi TSI dan LIA.
7.3.4.2 Pengamatan morphologi koloni Salmonella yang tidak khas (typical)
Ciri-ciri koloni Salmonella yang tidak khas adalah sebagai berikut:
a) HE and XLD Agar; Some cultures Salmonella forming yellow colonies with or without black core. If no
typical colonies that grow on HE and XLD media after incubation of 24 hours ± 2 hours, take 2 or more
colonies that are not typical.
b) BSA; Which is not typical colony forming green colonies with little or no blackish color around media. If
no typical colonies or colonies on media unexpected BSA after incubation of 24 hours ± 2 hours, do not
take the colony, but the incubation back media for 24 hours ± 2 hours. If no typical colonies or colonies of
the suspect to the media BSA after incubation 48 hours ± 2 hours, take 2 or more colonies that are not
typical.
7.3.5 Ambil secara hati-hati bagian tengah koloni dengan menggunakan jarum inokulasi steril dan
goreskan ke permukaan media TSI agar dengan cara menggores agar miring dan menusuk agar
tegak. Tanpa mengambil koloni baru, gunakan jarum yang sama untuk menggores media LIA
dengan cara menusuk agar tegak lebih dahulu, setelah itu goreskan pada agar miring. Karena
reaksi Lysine Decarboxylase sangat anaerobik, LIA miring harus mempunyai tusukan yang dalam
(4 cm). Simpan media agar selektif yang telah diambil koloninya pada suhu 5°C – 8°C.
7.3.6 Inkubasi TSI dan LIA selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C dengan membiarkan tutup

sedikit kendur untuk mencegah terbentuknya H 2S yang berlebihan. Pada TSI, kultur Salmonella yang
khas memberikan reaksi alkalin (merah) pada goresan agar miring dan asam (kuning) pada tusukan agar

tegak, dengan atau tanpa H2S (warna kehitaman pada agar). Pada LIA, kultur Salmonella yang khas
memberikan reaksi alkaline (ungu) pada keseluruhan tabung. Reaksi yang benar-benar kuning pada
tusukan dinyatakan sebagai kultur negatif. Jangan hanya melihat diskolorisasi pada tusukan untuk

menyatakan kultur negatif. Umumnya kultur Salmonella membentuk H 2S pada LIA. Beberapa kultur non
Salmonella membentuk reaksi merah bata pada agar miring LIA. Reaksi TSI dan LIA dapat dilihat pada
Tabel 2 di bawah ini:
Tabel 2 Reaksi biokimia Salmonella pada TSI dan LIA
Media Agar Miring (goresan) Agar Tegak (tusukan) H2S
 Alkalin/K
TSI (merah)
+/− Alkalin/ K
Asam/A (kuning) LIA
(ungu)
Alkalin/ K
+/−a
(ungu) a umumnya kultur Salmonella membentuk H2S pada LIA

7.3.7 All cultures give an alkaline reaction to the jab in order to erect the LIA, regardless of the
reaction of the TSI, should be considered as a potential Salmonella and should be carried out
biochemical and serological tests. Cultures that gives sour reaction to the jab in order
SNI 01-2332.2-2006
5 of 23
SNI 01-2332.2-2006

LIA and alkaline upright on agar slant and acid in order to erect prick TSI must also be
considered as potential Salmonella and should be carried out biochemical and serological tests.
Cultures that gives sour reaction to the jab in order to erect the LIA and good acid for oblique
scratches and punctures in order to erect the TSI, can be expressed as not Salmonella. Perform
biochemical and serological testing presumptive positive culture 7.3.8 TSI conform to determine
the presence of Salmonella, including Salmonella arizonae. When culture TSI does not provide
typical reaction Salmonella (alkaline scratches for oblique and acid in order to erect prick)
download other additional incidental colonies from the plate of selective media and scratched
into the surface of the TSI and LIA appropriate media 7.3.5.

7.3.8 Perform biochemical and serological tests:

a) Tiga kultur presumtif-positif TSI dari 1 set media selektif (HE, XLD dan BSA) yang digoreskan
dari SCB (atau RV Broth.untuk produk perikanan dengan tingkat kontaminasi tinggi) jika ada,
dan tiga kultur presumtif-positif TSI dari media selektif yang digoreskan dari TTB jika ada.

b) Jika tiga kultur presumtif-positif TSI tidak terisolasi dari 1 set media selektif, uji kultur
presumtif-positif TSI yang lain. Uji sedikitnya 6 kultur TSI untuk setiap contoh yang dianalisa.

7.4 Identifikasi Salmonella

7.4.1 Kultur campuran

Apabila kultur pada TSI agar terlihat tercampur, maka goreskan kembali ke dalam media HE
atau XLD agar. Inkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C. Amati koloni yang
diduga Salmonella:

a) HE order; Bluish green to blue colonies with or without black core. In general, the culture of
Salmonella forming large colonies, shiny black core or almost all colonies look black.

b) XLD order; Colonies of pink (pink) with or without black core. In general, the culture of
Salmonella forming large colonies, shiny black core or almost all colonies look black. Move at
least two unexpected Salmonella colonies on media TSI and LIA as in point 7.3. and proceed as
in point 7.3g.

7.4.2 pure culture

Urease test can be done with one of the following ways:

a) urease test (conventional). Move 1 loopful of each presumptive positive angle into the TSI
order Urea Broth. Inkubasikan for 24 hours ± 2 hours at 35 ° C ± 1 ° C.

b) urease test (fast) Move 1 ose of each presumptive positive TSI To be skewed into Rapid Urea
Broth. Inkubasikan for 2 hours in a water bath at 37 ° C ± 0.5 ° C. Salmonella typical reaction for
Urease tests gave negative results (no color change).

7.4.3 Test serology polyvalent flagellar (H)

a) The test can also be done after biochemical tests as described in paragraph 7.4.4.

6 of 23

Pindahkan1 ose of each TSI Agar reacted into the negative Urease:

- 5 ml of BHI Broth, and incubate for 4 hours - 6 hours at a temperature of 35 ° C ± 1 ° C until

visible growth. Add 2.5 ml of Physiological Saline formanilized into BHI Broth (to be tested on
the same day or

- 5 ml of soy -Tryptose tryticase Broth (TSTB) and incubation for 24 hours ± 2 hours at 35 ° C ±
1 ° C. Add 2.5 ml of Physiological Saline formanilized into TSTB (to be tested the next day).

b) Siapkan 2 kultur dari TSI (contoh dan kontrol) yang telah diberi formanilized Physiological
Saline dan uji dengan Salmonella Polyvalent Flagellar (H) antisera. Masukkan ± 0,5 ml larutan
Salmonella Polyvalent Flagellar (H) antisera dalam tabung serologi 10 x 75 mm atau 13 x 100
mm. Tambahkan 0,5 ml antigen yang akan diuji (butir 1 dan 2). Siapkan kontrol saline dengan
mencampur 0,5 ml formanilized Physiological Saline dengan 0,5 ml formalinized antigen.
Inkubasikan campuran tersebut dalam water bath pada suhu 48°C – 50°C. Amati setiap interval
waktu 15 menit dan amati hasilnya selama1 jam. - Positif apabila terjadi penggumpalan dalam
uji campuran dan tidak ada penggumpalan dalam kontrol. - Negatif apabila tidak ada
penggumpalan dalam uji campuran dan tidak ada penggumpalan dalam kontrol.

c) Perlakuan terhadap kultur yang memberikan hasil uji serologi flagellar (H) negatif
Bila reaksi biokimia dari kultur serologi flagellar (H) negatif menunjukkan bahwa kultur
tersebut adalah Salmonella, penggumpalan flagellar (H) negatif mungkin disebabkan
karena organisme nonmotil atau karena kurang cukupnya perkembangan antigen
flagellar. Perlakukan kultur sebagai berikut: inokulasi Motility Test Medium dalam petridish
dengan menggunakan koloni yang tumbuh pada TSI miring. Inokulasi dengan cara
menusuk media sekali sekitar 10 mm dari bagian tepi cawan sedalam 2 mm - 3 mm.
Jangan menusuk sampai dasar cawan atau menginokulasi bagian yang lain. Inkubasi
selama 24 jam pada suhu 35°C ± 1°C. Bila organisme berpindah sejauh 40 mm atau lebih
lakukan uji ulang sebagai berikut:
 - inokulasi dengan menggunakan jarum inokulasi sejumlah pertumbuhan terjauh ke
dalam Trypticase Soy-Trytose Broth. - ulangi pengujian Polyvalent Flagellar (H), bila tidak terjadi
pergerakkan setelah 24 jam pertama, inkubasi kembali selama 24 jam pada suhu 35°C ±
1°C; bila masih tidak bergerak inkubasi sampai 5 hari pada suhu 25°C. - nyatakan kultur
sebagai tidak bergerak (nonmotile) bila semua uji di atas masih tetap negatif, bila kultur
memberikan reaksi flagellar (H) negatif tetapi memberikan reaksi biokimia positif, kirim
kultur untuk diuji serotyping.

7.4.4 Pengujian kultur Urease negatif

a) LDB
Uji ini dilakukan hanya jika reaksi LIA meragukan. Pindahkan 1 ose dari TSI ke dalam media
LDB. Kendurkan tutupnya dan inkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi
amati setelah 24 jam. Salmonella memberikan reaksi alkalin ditandai dengan warna ungu
pada seluruh media. Reaksi negatif ditunjukkan dengan warna kuning pada seluruh media.
Jika hasil reaksi tidak menunjukkan warna kuning atau ungu, tambahkan beberapa tetes
0,2% bromocresol purple dye dan amati perubahan warnanya.
SNI 01-2332.2-2006
 7 dari 23
SNI 01-2332.2-2006
b) Phenol red dulcitol atau purple Broth base dengan 0,5% dulcitol
Move 1 ose of TSI into dulcitol Broth media. Loosen the lid and incubate for 48 hours ± 2 hours at 35 ° C
± 1 ° C, but observed after 24 hours. Salmonella generally give positive results, characterized by the
formation of gas in the Durham tube and acidic pH (yellow) on the media. The negative reaction is
characterized by the formation of gas in the Durham tube and red (phenol red as an indicator) or purple
(Bromocresol purple as an indicator) in all media.
c) TB Move 1 ose of TSI into Tryptone Broth media. Incubation for 24 hours at
temperature of 35 ° C ± 1 ° C and then follow the procedure below:
- Potassium Cyanida (KCN) Broth
Pindahkan 1 ose dari TB 24 jam kedalam media KCN Broth. Tutup tabung rapat- rapat dan lapisi dengan
kertas parafilm. Inkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C tetapi amati setelah 24 jam.
Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan (ditandai dengan adanya kekeruhan). Umumnya
Salmonella tidak tumbuh pada media ini yang ditandai dengan tidak terjadinya kekeruhan.
- Malonate Broth
Pindahkan 1 ose dari TB 24 jam kedalam media Malonate Broth. Inkubasikan selama 48 jam ± 2 jam
pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam. Kadang-kadang tabung Malonate Broth yang tidak
diinokulasi berubah menjadi biru. Oleh karena itu gunakan Malonate Broth sebagai kontrol. Reaksi positif
ditandai dengan perubahan warna menjadi biru. Umumnya Salmonella memberikan reaksi negatif (hijau
atau tidak ada perubahan warna) pada Broth ini.
- Uji Indol
Pindahkan 5 ml TB 24 jam kedalam tabung kosong dan tambahkan 0,2 ml – 0,3 ml Reagent kovacs’.
Amati segera setelah penambahan Reagen. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya cincin merah
pada permukaan media. Umumnya Salmonella memberikan reaksi negatif (tidak terbentuk cincin merah
pada permukaan media). Reaksi yang warnanya berada antara orange dan pink dinyatakan sebagai ±.
Tabel 3 Reaksi biokimia dan serologi untuk Salmonella
Hasil Reaksi Salmonella
No. Pengujian
Positif Negatif Reaksi spesies a 1. Glucose (TSI) Tusukan kuning Tusukan merah + 2. Lysine
Decarboxylase
Tusukan ungu Tusukan kuning + (LIA) 3. H2S (TSI dan LIA) Hitam Tidak hitam + 4. Urease Warna ungu
sampai merah
8 dari 23
Tidak ada perubahan warna
-
5. Lysine Decarboxylase
Broth (LDB)
Warna ungu Warna kuning +
6. Phenol red Dulcitol
Broth
Warna kuning
Tidak ada
+b and / or gas
gas formation and no color change KCN Broth 7. Growth No
growth
-
Table 3 (Continued)
 Results Reaction Salmonella
No. examination
Positive Negative Reaction species a 8. malonate blue color Broth No
-c
discoloration 9. Test Indol violet color
on the surface
-
Yellow color on the surface 10. Serologic Test polyvalent
Flagellar (H)
Clots No
+
conglomeration 11. Test serology polyvalent
Somatic (O)
Clots No
+
conglomeration 12. Phenol red lactose
broth
-c
13. Phenol red sucrose
broth
Yellow and / or gas
No formation of gas and do not change color yellow and / or gas
No formation of gas and do not change color
-
14. Voges Proskauer Test Pink
to red
No discoloration
_
15. Test Methyl Red Color Red
spread
+
Yellow color spreads 16. Simmons citrate There
pertumbuhan, warna biru
Tidak ada pertumbuhan dan tidak ada perubahan warna
V
Dengan: a +, 90% atau lebih positif dalam 1 atau 2 hari;

−, 90% atau lebih negatif dalam 1 atau 2 hari; v, variabel b Mayoritas dari kultur Salmonella arizonae: Negatif C Mayoritas

dari kultur Salmonella arizonae: Positif

- Uji serologi Polyvalent Flagellar (H)
Jika uji serologi Polyvalent Flagellar (H) belum dilakukan, maka pengujian pada butir 7.4.3 dapat
dilakukan pada tahap ini.
- Nyatakan kultur sebagai bukan Salmonella bila reaksi Indol dan flagellar (H) negatif,
atau KCN positif dan LDB negatif.
7.4.5 Uji serologi Polyvalent Somatic (O)
Ambil 1 ose kultur dari TSI (dari butir 8.3f) yang telah diinkubasikan selama 24 jam – 48 jam dan letakkan
diatas gelas preparat, kemudian tetesi dengan larutan saline 0,85% steril dan emulsikan. Letakkan 1
tetes Salmonella Polyvalent Somatic (O) Antiserum disamping suspensi koloni. Campurkan koloni
Antiserum sedikit demi sedikit dengan suspensi koloni sampai tercampur sempurna. Lakukan kontrol
dengan menggunakan larutan saline dan Antiserum. Miringkan campuran tersebut ke kiri dan ke kanan,
dan amati segera pada latar belakang yang gelap. Amati hasil uji sebagai berikut:
Positif apabila terjadi penggumpalan pada larutan kultur dan tidak terjadi penggumpalan
pada larutan kontrol.
Negatif apabila tidak terjadi penggumpalan baik pada larutan kultur maupun larutan kontrol.
SNI 01-2332.2-2006
9 dari 23
SNI 01-2332.2-2006

7.4.6 Uji biokimia tambahan

Nyatakan sebagai Salmonella, kultur yang memberikan reaksi yang khas seperti pada pada
Tabel 3 butir 1 – 11. Jika 1 kultur TSI dari setiap contoh yang diuji menunjukkan Salmonella, uji
biokimia tambahan tidak diperlukan. Kultur yang memberikan reaksi positif pada uji serologi
flagellar (H) tapi tidak menunjukkan karakteristik Salmonella pada uji biokimia, harus dimurnikan
seperti pada butir 7.4.1 diatas dan uji kembali mulai pada butir 7.4.2. Lakukan uji tambahan
berikut ini terhadap kultur yang tidak memberikan reaksi yang khas seperti pada Tabel 3:

a) Phenol red lactose atau purple Lactose Broth.

− Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring yang telah diinkubasi selama 24 jam – 48 jam
kedalam phenol red lactose atau purple Lactose Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam
pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam. Positif, apabila terjadi pembentukan
asam (kuning) dan gas pada tabung durham. Apabila hanya terjadi pembentukan asam,
maka dapat dinyatakan positif. Umumnya Salmonella memberikan hasil negatif
ditunjukkan dengan tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna merah
(phenol red sebagai indikator) atau ungu (bromcresol purple sebagai indikator) pada
seluruh media.

− Nyatakan sebagai bukan Salmonella jika kultur memberikan reaksi lactose positif,
kecuali kultur yang memberikan reaksi asam pada tusukan agar tegak TSI dan
reaksi alkalin pada tusukan agar tegak LIA, atau reaksi positif pada Malonate Broth.

b) Phenol red sucrose atau purple sucrose Broth.

− Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring yang telah diinkubasi selama 24 jam – 48 jam
kedalam Phenol red sucrose atau purple sucrose Broth. Inkubasi selama 48 jam ± 2 jam
pada suhu 35°C ± 1°C, tetapi amati setelah 24 jam. Positif, apabila terjadi pembentukan
asam (kuning) dan gas pada tabung durham. Apabila hanya terjadi pembentukan asam,
maka dapat dinyatakan positif. Umumnya Salmonella memberikan hasil negatif,
ditunjukkan dengan tidak terbentuknya gas pada tabung durham dan warna merah
(phenol red sebagai indikator) atau ungu (bromcresol purple sebagai indikator) pada seluruh
media. − Nyatakan sebagai bukan Salmonella jika kultur memberikan reaksi sucrose
positif, kecuali kultur yang memberikan reaksi asam pada tusukan agar tegak TSI
dan reaksi alkalin pada LIA.

c) Methyl Red - Voges-Proskauer (MR – VP) Broth

 Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring ke dalam media MR-VP Broth dan inkubasikan
selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.

− Lakukan uji Voges-Proskauer (VP) pada suhu ruang sebagai berikut:

Pindahkan 1 ml MR-VP Broth yang telah diinkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu
35°C ± 1°C ke dalam tabung reaksi steril dan inkubasikan kembali MR-VP Broth
selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C untuk pengujian Methyl Red.
Tambahkan 0,6 ml Alpha Alphanaphtol dan kocok. Tambahkan 0,2 ml larutan 40%
KOH dan kocok kembali. Untuk mempercepat reaksi tambahkan sedikit kristal kreatin,
dan amati hasilnya setelah 4 jam. Perubahan warna menjadi merah muda eosin
sampai merah mirah delima (ruby) pada media menunjukkan reaksi positif. Umumnya
Salmonella memberikan reaksi VP negatif.

10 dari 23
− Uji Methyl Red (MR)
Tambahkan 5 tetes - 6 tetes indikator Methyl Red kedalam media MR - VP yang telah diinkubasi selama
96 jam. Amati hasilnya dengan segera. Umumnya Salmonella memberikan reaksi positif, ditandai dengan
terjadinya difusi warna merah pada media. Terjadinya warna kuning menunjukkan reaksi negatif.
Nyatakan sebagai bukan Salmonella kultur yang memberikan reaksi KCN dan VP positif serta MR
negatif.
d) Simmons citrate Agar
Pindahkan 1 ose dari TSI Agar miring kedalam media Simmon Citrate Agar miring dengan cara
menggores agar miring dan menusuk agar tegak. Inkubasikan selama 96 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ±
1°C.
Positif, apabila terjadi pertumbuhan yang biasanya diikuti dengan perubahan warna dari hijau
menjadi biru. Umumnya Salmonella memberikan hasil citrate positif. Negatif, apabila tidak ada
atau sedikit sekali pertumbuhan dan tidak terjadi perubahan warna.
Tabel 4 Kriteria untuk pemisahan kultur non Salmonella
No. Pengujian Hasil
1. Urease Positif (warna ungu sampai merah) 2. Uji Indol dan
Polyvalent Flagellar (H)
Positif (warna merah pada permukaan) Negatif (tidak ada penggumpalan) 3. Lysine Decarboxylase dan
KCN Broth
Negatif (warna kuning) Positif (ada pertumbuhan) 4. Phenol red lactose Broth Positif (warna kuning dan/
atau gas)a,b 5. Phenol red sucrose Broth Positif (warna kuning dan atau gas) b 6. Uji Voges- Proskauer
Uji Methyl Red
Positif (merah muda sampai merah) Negatif (warna kuning menyebar) Dengan: a Uji Malonate Broth positif

lebih lanjut untuk menentukan jika biakan tersebut Salmonella

arizonae. Lakukan uji Malonate Broth untuk menentukan adanya Salmonella arizonae b Jangan membuang kultur

Broth yang positif jika LIA menunjukkan reaksi Salmonella yang

khas; lakukan pengujian lebih lanjut untuk menentukan adanya bakteri Salmonella.
7.4.7 Pelaporan
Apabila tidak ada 1 kultur TSI yang menunjukkan reaksi Salmonella pada uji biokimia, lakukan uji
biokimia mulai dari butir 7.4.4 terhadap kultur TSI lain yang memberikan reaksi Urease negatif dari contoh
yang sama. Laporkan sebagai Salmonella kultur-kultur yang mempunyai reaksi seperti pada Tabel 3
Laporkan sebagai bukan Salmonella kultur-kultur yang memberikan reaksi seperti pada Tabel 4
8 Keamanan dan keselamatan kerja
Untuk menjaga keamanan dan keselamatan kerja selama melakukan analisa maka perlu diperhatikan
hal-hal sebagai berikut: a Gunakan jas laboratorium selama melakukan analisa;
SNI 01-2332.2-2006
11 dari 23
SNI 01-2332.2-2006

b Lakukan analisa di dalam laminar air flow; c Jangan menyedot pipet dengan mulut; d
Bersihkan meja kerja sebelum dan sesudah melakukan analisa; e Bersihkan segera contoh
yang tercecer dan mengandung bakteri dengan menggunakan
bahan desinfectan; f Media yang sudah digunakan disterilkan terlebih dahulu sebelum dicuci;
g Jangan membuka Autoclave setelah melakukan sterilisasi sebelum alat penunjuk
tekanan udara mencapai titik terendah.
 12 dari 23
SNI 01-2332.2-2006

Lampiran A
(normatif)

Pembuatan media

A.1 Bismuth sulfite Agar

PolyPeptone (atau Peptone) 10 g Beef

extract 5 g Dextrose 5 g Na 2HPO4 (kering) 4 g

FeSO4 (kering) 0,3 g Bismuth sulfit (indicator)

8 g Brilliant green 0,025 g Agar 20 g
Aquadest 1 liter

Larutkan semua bahan dan panaskan dengan pengadukan. Didihkan selama 1 menit untuk
mendapatkan suspensi homogen. Dinginkan sampai suhu 45°C - 50°C. Tuang sebanyak 20 ml
ke dalam cawan petri. Biarkan hingga kering selama 2 jam dengan cara membuka sedikit tutup
cawan petri, kemudian tutup. pH akhir 7,7 ± 0.2. Jangan di Autoclave. Siapkan media ini 1 hari
sebelum digunakan dan simpan di tempat gelap. Selektifitas akan menurun dalam waktu 48
jam.

A.2 Brain Heart Infusion (BHI) Broth

Calf brain infusion 200 g Beef heart infusion

250 g Proteose Peptone atau gelysate 10 g

NaCl 5 g Na2HPO4.12H2O 2,5 g Dextrose 2

g Aquadest 1 liter

Larutkan semua bahan dalam Aquadest dan panaskan perlahan-lahan. Masukkan ke dalam
botol atau tabung untuk disimpan. Sterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit. pH akhir 7.4 ±
0.1. Untuk persiapan BHI Agar, tambahkan 15 g agar ke dalam 1 liter BHI Broth. Panaskan
untuk melarutkan agar sebelum dimasukkan ke dalam botol atau labu. Sterilisasi pada suhu
121°C selama 15 menit. pH akhir 7.2 ± 0.1.

A.3 Hektoen Enteric (HE) Agar

Peptone 12 g Sodium thiosulphate 5 g Yeast extract 3 g Ferric ammonium citrate 1,5 g Bile
salts no. 3 9 g NaCl 5 g Lactose 12 g Bromthymol blue 0,065 g Sucrose 12 g Agar 14,0 g
Salicin 2 g Acid fuchsin 0,1 g NaCl 5 g Aquadest 1 liter
 13 dari 23
SNI 01-2332.2-2006

Panaskan sampai mendidih sambil diaduk. Didihkan tidak lebih dari 1 menit. Jangan terlalu
panas. Dinginkan dalam water bath. Tuang sebanyak 20 ml ke dalam cawan petri steril. Biarkan
kering selama 2 jam dengan cara membuka sedikit tutup cawan petri. pH akhir 7,5 ± 0.2.
Jangan menyimpan media ini lebih dari 1 hari.

A.4 Lactose Broth

Beef extract 3 g Peptone 5 g Lactose 5 g Aquadest 1 liter Larutkan semua bahan dan
sterilisasi pada suhu 121°C 15 menit. pH akhir 6,9 ± 0.2.

A.5 Lysine Decarboxylase Broth

Gelysate atau Peptone 5 g Yeast extract

3 g Glucose 1 g L-lysine 5 g Bromcresol
purple 0,02 g Aquadest ` 1 liter

Panaskan hingga semua bahan larut. Pipet sebanyak 5 ml ke dalam tabung bertutup. Sterilisasi
pada suhu 121°C selama 15 menit dengan tutup tabung dikendurkan. Kencangkan tutup tabung
selama penyimpanan dan sesudah inokulasi. pH akhir 6,8 ± 0.2.

A.6 Lysine Iron Agar (LIA)

Gelysate atau Peptone 5 g Yeast extract 3 g

Glucose 1 g L-lysine hydrochloride 10 g
Ferric ammonium citrate 0,5 g Sodium
thiosulphate (kering) 0,04 g Bromcresol
purple 0,02 g Agar 15 g Aquadest 1 liter

Panaskan hingga semua bahan larut. Pipet sebanyak 7.5 ml ke dalam tabung bertutup.
Sterilisasi pada suhu 121°C selama 12 menit. pH akhir 6,7 ± 0.2. Setelah sterilisasi miringkan
tabung untuk memperoleh bagian agar miring (slant) dan tusukan (butt).

A.7 Malonate Broth

Yeast extract 1 g (NH4)2SO4 2 g K2HPO4 0,6 g

KH2PO4 0,4 g NaCl 2 g Sodium malonate 3 g

Dextrose 0,25 g

14 dari 23
Bromthymol blue 0,025 g Aquadest 1 liter

Larutkan semua bahan dengan pemanasan jika perlu. Pipet sebanyak 3 ml ke dalam tabung
reaksi. Sterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit. pH akhir 6,7 ± 0.2.

A.8 Motility Test Medium (Semisolid)

Beef extract 3 g Peptone atau gelysate 10

g NaCl 5 g Agar 4 g Aquadest 1liter

Panaskan sambil diaduk dan didihkan selama 1 – 2 menit untuk melarutkan agar. Sterilisasi
pada suhu 121°C selama 15 menit. Dinginkan sampai 45°C. Tuang sebanyak 20 ml kedalam
cawan petri steril, tutup dan biarkan kering. Gunakan pada hari yang sama setelah dibuat. pH
akhir 7,4 ± 0.2.

A.9 MR-VP Broth

Medium 1 Buffered Peptone-water powder 7

g Glucose 5 g K2HPO4 5 g Aquadest 1 liter

Medium 2 Pancreatic digest of casein 3,5 g

Peptic digest of animal tissue 3,5 g Dextrose 5
g Potassium phosphate 5 g Aquadest 1 liter

Larutkan bahan-bahan dalam Aquadest, panaskan bila perlu. Tuang sebanyak 5 ml kedalam
tabung reaksi dan Autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit. PH akhir 6,9 ± 0,2.

A.10 Phenol red Carbohydrate Broth

Trypticase atau Proteose Peptone No. 3 10 g NaCl 5 g Beef

extract (pilihan) 1 g Phenol red (7,2 ml larutan phenol red
0,25 %) 0,02 g Aquadest 1 liter Carbohydrate *

* Larutkan baik 5 g dulcitol, 10 g lactose, atau 10 g sucrose (seperti yang disebutkan dalam uji
Salmonella) dalam media basal ini. Pipet sebanyak 2,5 ml kedalam tabung reaksi yang berisi
durham. Sterilisasi pada suhu 118°C selama 10 menit. pH akhir 7,4 ± 0.2. Alternatif lain,
larutkan semua bahan kecuali Carbohydrate kedalam 800 ml Aquadest dan panaskan sambil
sesekali diaduk. Pipet sebanyak 2 ml kedalam tabung reaksi yang berisi durham.
SNI 01-2332.2-2006
 15 dari 23
SNI 01-2332.2-2006

Sterilisasi pada suhu 118°C selama 15 menit dan biarkan dingin. Larutkan Carbohydrate dalam
200 ml Aquadest dan steril filter. Secara aseptis, tambahkan 0,5 ml Carbohydrate steril kedalam
tabung media basal steril. Kocok agar tercampur. pH akhir 7,4 ± 0,2.

A.11 Potassium cyanide (KCN) Broth

Potassium cyanide 0,5 g Protease Peptone No. 3 atau

PolyPeptone 3 g NaCl 5 g KH2PO4 0,225 g Na2HPO4 5,64 g

Aquadest 1 liter

Larutkan semua bahan (kecuali potassium cyanide) dan sterilisasi pada suhu 121°C selama 15
menit. Dinginkan dan simpan pada suhu 5°C-8°C. pH akhir 7.6 ± 0.2. Siapkan larutan KCN
stock dengan cara melarutkan 0.5 g KCN kedalam 100 ml Aquadest steril, dinginkan hingga
suhu 5°C-8°C. Dengan menggunakan pipet bulb, tambahkan 15 ml larutan KCN stock kedalam
1 liter media basal steril dingin. Jangan dipipet dengan mulut. Kocok dan pindahkan sebanyak
1-1,5 ml ke dalam tabung steril dan tutup dengan paraffin. Media ini dapat disimpan pada suhu
5°C-8°C, selama 2 minggu sebelum digunakan.

A.12 Purple Carbohydrate Broth

Proteose Peptone No. 3 10 g Beef extract 1

g NaCl 5 g Bromcresol purple 0,02 g
Aquadest 1 liter

Siapkan seperti pada Phenol red Carbohydrate Broth (M11). pH akhir 6.8 ± 0.2.

A.13 Rappaport-Vassiliadis Medium

Medium basal Tryptone 5 g NaCl 8

g KH2PO4 1,6 g Aquadest liter

Larutan magnesium chlorida Mg Cl2

6H2O 400 g Aquadest 1 liter

Larutan Malachite green oxalate

Malachite green oxalate 0,4 g
Aquadest 100 ml

Siapkan larutan tersebut diatas dengan perbandingan 1000 ml larutan basal, 100 ml larutan
magnesium chlorida dan 10 ml larutan malachite green (total volume 1110 ml). Larutan basal
harus disiapkan pada hari yang sama dan dicampur dengan larutan lainnya.

16 dari 23

Larutan magnesium chlorida dapat disimpan dalam botol gelap pada temperatur ruang hingga 1

tahun. Untuk menyiapkan larutan ini, larutkan Mg Cl2 6H2O dalam wadah tertutup karena garam
ini sangat higroskopis. Larutan Malachite green oxalate dapat disimpan dalam botol gelap pada
suhu ruang hingga 6 bulan. Masukan sebanyak 10 ml ke dalam tabung 16 mm x 150 mm.
Autoclave selama 15 menit pada suhu 115°C. pH akhir 5,5 ± 0,2. Simpan dalam refrigerator dan
gunakan dalam waktu 1 bulan Media ini harus dibuat dari masing-masing bahan. Penggunaan
media komersial tidak disarankan, dan sebaiknya memperhatikan formula dan suhu inkubasi
yang digunakan.

A.14 Selenite Cystine Broth

Tryptone atau PolyPeptone 5 g Lactose 4 g

Sodium acid selenite (NaHSo4) 4 g Na2HPO4 10

g L – Cystine 0,01 g Aquadest 1 liter

Panaskan sampai mendidih agar melarut. Tuang sebanyak 10 ml kedalam tabung reaksi steril.
Panaska 10 menit dalam uap panas. Jangan di Autoclave. pH akhir 7,0 ± 0,2. Media ini tidak
steril. Gunakan pada hari yang sama.

A.15 Simmons citrate Agar

Sodium citrate 2 g NaCl 5 g K 2HPO4 1 g

NH4H2PO4 1 g MgSO4 0,2 g Bromthymol

blue 0,08 g Agar 15 g Aquadest 1 liter

Larutkan bahan-bahan dan panaskan selama 1 menit – 2 menit sampai agar terlarut. Tuang
kedalam tabung reaksi. Sterilisasi pada suhu121°C selama 15. Miringkan tabung dengan
kemiringan 4 cm - 5 cm sebelum media menjadi padat. pH akhir 6,8 ± 0.2.

A.16 Tetrathionate Broth

Tetrathionate Broth basal Poly Peptone 5 g

Bile salts 1 g Calcium carbonate 10 g

Sodium thiosulfate 5H2O 30 g Aquadest 1

liter
Larutkan bahan-bahan dalam 1 liter Aquadest, campur, dan panaskan hingga mendidih. Jangan
di Autoclave. (Bahan tidak semuanya terlarut). Dinginkan sampai kurang dari 45°C. simpan
pada suhu 5°C - 8°C. pH akhir 8,4 ± 0,2.
SNI 01-2332.2-2006
 17 dari 23
SNI 01-2332.2-2006

Larutan Iodine-Potassium iodide (I2-KI)

Potassium iodide 5 Iodine, resublimed 6 g
Aquadest steril 20 ml

Larutkan Potassium iodide dalam 5 ml Aquadest steril. Tambahkan iodine dan aduk agar
melarut. Larutkan sampai 20 ml.

Larutan Brilliant green Brilliant green dye

steril 0,1 g Aquadest steril 100 ml

Pada saat digunakan, tambahkan 20 ml larutan I 2-KI dan 10 ml larutan Brilliant green kedalam 1
liter basal. Aduk agar semua bahan tercampur dan tuang sebanyak 10 ml kedalam tabung

reaksi steril. Jangan memanaskan media setelah penambahan larutan I 2-KI dan larutan Brilliant
green.

A.17 Triple Sugar Iron (TSI) Agar

Media 1 Media 2 PolyPeptone 20 g Beef extract 3 g NaCl 5 g Yeast extract 3 g Laktose 10

g Peptone 15 g Sucrose 10 g Proteose Peptone 5 g Glucose 1 g Glucose 1 g

Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O 0,2 g Lactose 10 g Na2S2O3 0,2 g Sucrose 10 g Phenol red 0,025 g

FeSO4 0,2 g Agar 13 g NaCl 5 g Aquadest 1 liter Na2S2O3 0,3 g Phenol red 0,024 g Agar 12
g Aquadest 1 liter

Kedua media dapat ditukar untuk keperluan umum. Larutkan semua bahan Media 1 dalam 1
liter Aquadest dan panaskan sambil sesekali diaduk. Didihkan selama 1 menit agar semua
bahan terlarut. hingga mendidih. Sterilisasi media pada suhu 118°C selama 15 menit. Siapkan
media 2 seperti pada media 1, kecuali sterilisasi dilakukan pada suhu 121°C selama 15 menit.
Sebelum media menjadi padat, miringkan tabung agar memperoleh agar miring 4 cm - 5 cm dan
agar dasar 2 cm - 3 cm pH akhir 7,3 ± 0.2 (Media 1) dan 7,4 ± 0.2 (Media 2).

A.18 Trypticase Soy – Tryptose Broth

Trypticase Soy Broth 15 g Trytose Broth

13.5 g Yeast extract 3 g Aquadest 1 liter

Larutkan semua bahan dalam 1 liter Aquadest dengan sedikit pemanasan. Tuang sebanyak 5
ml kedalam tabung reaksi. Sterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit. pH akhir 7,2 ± 0,2.
 18 dari 23

A.19 Tryptone (Trytophane) Broth 1%

Tryptone atau Trypticase 10 g Aquadest 1

liter

Larutkan semua bahan dan pindahkan sebanyak 5 ml tabung reaksi. Sterilisasi pada suhu121°C
selama 15. pH akhir 6,9 ± 0.2.

A. 20 Urea Broth

Urea 20 g Yeast extract 0,1 g Na 2HPO4 9,5 g

K2HPO4 9,1 g Phenol red 0,01 g Aquadest 1

liter

Larutkan semua bahan dalam 1 liter Aquadest. Jangan dipanaskan. Sterilisasi menggunakan
membran filter 0,45 μm. Pindahkan 0,1 ml -3,0 ml ke dalam tabung steril. pH akhir 6,8 ± 0,2.

A.21 Urea Broth (Rapid)

Urea 20 g Yeast extract 0,1 g

Na2HPO4 0,095 g KH2PO4 0,091 g

Phenol red 0,01 g Aquadest 1 liter

Larutkan semua bahan dalam 1 liter Aquadest. Jangan dipanaskan. Sterilisasi menggunakan
membran filter 0,45 μm. Pindahkan 0,1 ml -3,0 ml ke dalam tabung steril. pH akhir 6,8 ± 0,2.

A.22 Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Agar

Yeast extract 3 g Ferric ammonium citrate 0,8 g L-lysine 5 g Sodium thiosulfate 6,8 Xylose 3,75
g NaCl 5 g Lactose 7,5 g Agar 15 g Sucrose 7,5 g Phenol red 0,08 g Sodium dexoxycholate 2,5
g Aquadest 1 liter Larutkan semua bahan hingga mendidih dalam erlenmeyer steril. Jangan di
Autoclave. Tuang ke dalam cawan petri. Tunggu sampai kering dengan cara membuka sedikit
tutup cawan petri, pH akhir 7.4 ± 0.2.
SNI 01-2332.2-2006
 19 dari 23
SNI 01-2332.2-2006

Lampiran B
(normatif)

Pembuatan pereaksi

B.1 Larutan Brilliant green Dye, 1%

Brilliant green dye 1 g Aquadest

steril 10 ml

Larutkan Brilliant green dye dalam Aquadest steril.

B.2 Larutan Formalinized Physiological Saline

Larutan formaldehyde 6 ml NaCl 8,5 g Aquadest 1

liter

Larutkan 8,5 g NaCl dalam 1 liter Aquadest. Sterilisasikan pada suhu 121°C selama 15 menit.
Dinginkan pada temperatur ruang. Tambahkan 6 ml larutan formaldehyde . Jangan di Autoclave
setelah penambahan formaldehyde .

B.3 Reagen Kovacs’

P-Dimethylaminobenzaldehyde 5 g Amyl alcoho

(normal) 75 ml HCl (pekat) 25 ml

Larutkan P-Dimethylaminobenzaldehyde dalam amyl Alcohol normal. Tambahkan HCl perlahan-

lahan. Simpan pada suhu 4°C. Untuk uji Indol, tambahkan 0,2 ml – 0,3 ml Reagen kedalam 5 ml
kultur Tryptone Broth yang diinkubasi 24 jam. Terbentuknya cincin merah pada permukaan
menunjukkan hasil yang positif.

B.4 Indikator Methyl Red

Methyl Red 0,10 g Ethanol, 95% 300 ml

Aquadest untuk membuat 500 ml larutan

Larutkan Methyl Red dalam 300 ml Ethanol. Tepatkan volumenya hingga 500 ml dengan
Aquadest.
B.5 Larutan Physiological Saline 0,85%

NaCl 8,5 g Aquadest 1 liter

Larutkan 8,5 g NaCl dalam Aquadest. Sterilisasikan pada suhu 121°C selama 15 menit.

20 dari 23

B.6 Larutan Potassium hydroxide, 40 %

KOH 40 g Aquadest 100 ml

Larutkan KOH dalam Aquadest.

B.7 Reagen VP

Larutan 1 Alpha-Alphanaphtol 5 g Alcohol

(absolut) 100 ml

Larutan 2 Potassium hydroxide 40 g

Aquadest 100 ml

Uji VP. Pindahkan 1 ml kultur 48 jam kedalam tabung reaksi dan tambahkan 0,6 ml larutan 1
dan 0,2 ml larutan 2. Kocok setelah penambahan larutan. Untuk mempercepat reaksi,
tambahkan kristal creatine kedalam campuran larutan. Biarkan pada suhu ruang. Baca hasilnya
setelah 4 jam. Pembentukan warna eosin pink menunjukkan hasil yang positif.

B.8 Larutan1 N Sodium Hydroxide Solution

NaOH 40 g Aquadest 100 ml

Larutkan NaOH dalam Aquadest.

B.9 Larutan1 N Hydrochloric Acid

HCl 89 g Aquadest 1liter

Larutkan HCl dalam Aquadest.

SNI 01-2332.2-2006
 21 dari 23
SNI 01-2332.2-2006
Lampiran C (Informatif)
Skema penentuan Salmonella
PRA PENGKAYAAN
Homogenasi 25 g / 25 ml atau 50 g / 50 ml contoh dalam 225 ml / 450 ml Lactose Broth Inkubasi 24 jam ± 2 jam,
35°C ± 1°C
PENGKAYAAN
Produk perikanan dengan tingkat
Produk Perikanan lain kontaminasi tinggi
1 ml 1 ml 1 ml
0,1 ml
10 ml
10 ml RV Broth
TTB
Inkubasi 24 jam ± 2 jam, 42°C ± 0,2°C. Waterbath

HE XLD BSA HE XLD BSA Inkubasi 24 jam ± 2 jam, 35°C ± 1°C HE XLD BSA HE XLD BSA Inkubasi 24 jam ±

2 jam, 35°C ± 1°C

Ambil 2 atau lebih koloni terduga pada media agar selektif, gores dan tusuk kedalam media agar miring
TSI LIA
Inkubasi 24 jam ± 2 jam, 35°C ± 1°C
• Urease : Jika hasil negatif, lakukan pengujian
: - LDB
- Dulcitol IDENTIFIKASI - TB :
Lakukan pengujian : - KCN
- Malonate - Indol
22 dari 23
10 ml TTB
10 ml SCB
Inkubasi 24 jam + 2 jam, 35°C ± 1°C Inkubasi 24 ± 2 jam 43°C ± 0,2 °C. Waterbath
ISOLATION From each enrichment media to the media in order to selectively scratched
• Serology: polyvalent H and O
• Additional test: - Lactose
- Sucrose - MRVP
SNI 01-2332.2-2006

Bibliograp
hy

Food and Drug Administration, the Bacteriological Analytical Manual. 8th edition, 1998. Chapter
5. AOAC International

Food and Drug Administration. Bacteorological Analytical Manual, 1998. 8 thedition.

23 of 23