Cultivos Tropicales, 2016, vol. 37, no. especial, pp.

81-90
Ministerio de Educacin Superior. Cuba
Instituto Nacional de Ciencias Agrcolas
https://ediciones.inca.edu.cu

ISSN impreso: 0258-5936

ISSN digital: 1819-4087
DOI: 10.13140/RG.2.1.2962.9045
http://dx.doi.org/10.13140/RG.2.1.2962.9045

ESTRATEGIA CRIOGNICA PARA EL ESTABLECIMIENTO

DE UN BANCO DE GERMOPLASMA DE PIA
(Ananas comosus var. Comosus)
Cryogenic strategy for the establishment of a germplasm
bank of pineapple (Ananas comosus var. Comosus)
Ariel Villalobos Olivera1), Roberto Mndez Pelegrn1,
Lelurlys Npoles Borrero2, Justo Gonzlez Olmedo2,
Alitza Iglesias Alfonso2, Julia Martnez Rodrguez2,
Ren C. Rodrguez Escriba2, Gustavo Y. Lorente Gonzlez2,
Nicols Quintana Bernab1, Romelio Rodrguez Snchez2,
Fernanda Vidigal Duarte Souza3 y Marcos E. Martnez Montero2
ABSTRACT. In pineapple have been used cryopreservation
protocols based on a vitrification procedure. However,
the influence of some technical factors is still unknown
to achieve a strategy cryogenic routine application to a
wide range of genotypes. Furthermore, there has been no
histological analysis to display any structural changes during
a process of cryopreservation. In the present investigation
different technical aspects of a cryogenic strategy are
determined to increase survival levels from the apexes to
immersion in liquid nitrogen. These were: type of apex,
consisting of 3-4 leaf primordia with an approximate size
of 2,5-3mm; preculture 0,3 mol L-1 sucrose; application of
the loading solution 0,4 mol L-1+2 0,4 mol L-1 mol glycerol;
application temperature of the vitrification solution PVS2 at
0 C for 420 min. The analysis of the display of structural
changes in the cryopreserved apices revealed that the
meristematic cells in the apical dome and leaf primordia
in formation, suffered few cellular alterations and kept
almost intact its morpho-physiological characteristics in
the best conditions of survival. The method of vitrification
was applied successfully for 9 accessions of the in vitro
genebank of Bioplant center. This is an important step for
the establishment of a gene bank for long-term cultivation
of pineapple.

RESUMEN. En la pia se han utilizado protocolos

de crioconservacin basados en un procedimiento de
vitrificacin. Sin embargo, se desconoce an la influencia
de algunos factores tcnicos para lograr una estrategia
criognica con una aplicacin de rutina a un amplio nmero
de genotipos. Adems hasta la fecha, no se han realizado
ningn anlisis histolgico para visualizar cambios
estructurales durante un procedimiento de crioconservacin.
En la presente investigacin se determinaron diferentes
aspectos tcnicos de una estrategia criognica para aumentar
los niveles de supervivencia de los pices a la inmersin en
nitrgeno lquido. Estos fueron: tipo de pice, compuesto por
3-4 primordios foliares con un tamao aproximado de
2,5-3mm; precultivo en 0,3 mol L-1 de sacarosa; aplicacin
de la solucin de carga 0,4 mol L-1+2 0,4 mol L-1 glicerol;
temperatura de aplicacin de la solucin vitrificadora PVS2
a 0 C durante 420 min. El anlisis de la visualizacin de los
cambios estructurales ocurridos en los pices crioconservados
revel que las clulas meristemtica presentes en el domo
apical y los primordios foliares en formacin, sufrieron
pocas alteraciones celulares y mantuvieron casi intacta sus
caractersticas morfo-fisiolgica en las mejores condiciones de
supervivencia. Se aplic de manera exitosa un procedimiento
de vitrificacin para nueve accesiones del banco de
germoplasma in vitro del centro de Bioplantas. Lo anterior
constituye una importante etapa para el establecimiento de
un banco de germoplasma a larga plazo del cultivo de la pia.

Key words: apices, germplasm, histology, vitrification

Palabras clave: pices, germoplasma, histologa, vitrificacin

Universidad de Ciego de vila (UNICA), Cuba.

Centro de Bioplantas, UNICA, Cuba.
3
EMBRAPA Mandioca e Fruticultura, Brasil.
) [email protected]
1
2

81

Ariel Villalobos Olivera, Roberto Mndez Pelegrn, Justo Gonzlez Olmedo /et al./

INTRODUCCIN

estrategia criognica que aumenten la supervivencia

en nitrgeno lquido para pices de vitroplantas de
pia, visualizar los cambios estructurales por histologa
durante la crioconservacin y aplicar el procedimiento
de vitrificacin para nueve accesiones del banco in vitro
de germoplasma de pia.

La pia (Ananas comosus var. Comosus) es

uno de los principales frutales del mundo, es cultivada
con el fin de satisfacer necesidades alimenticias de la
poblacin y constituye un importante rengln para la
produccin de conservas y venta de fruta fresca (1).
Esta fruta despus del banano y el mango, es la fruta
tropical ms importante, con una produccin mundial
en el ao 2012 que alcanz 23 333 886 toneladas (2).
La pia para Cuba constituy una de las
principales plantaciones de la provincia de Ciego
de vila, recayendo ms del 80 % de la produccin
nacional en la variedad Espaola roja, de bajo
potencial reproductivo, aunque en los ltimos aos
se han introducido nuevos cultivares como el Cayena
lisa y el MD-2, de buenos rendimiento, pero son ms
exigente a las condiciones ambientales (1, 2, 3).
En la actualidad, los recursos genticos de la
pia son conservados generalmente en colecciones
de campo (4). Adems se utilizan las tcnicas de
cultivo in vitro, como alternativa para responder a las
necesidades de conservacin de genes (5). Sin embargo,
hasta la fecha, la opcin ms prometedora para el
almacenamiento a largo plazo es la crioconservacin
mediante la creacin de un banco gentico bsico
donde los cultivos se almacenaran en espacio
reducido, protegidos de las contaminaciones y con
un mantenimiento limitado (6, 7, 8, 9). El material
vegetal se transfiere a nitrgeno lquido, en el cual
la temperatura es suficientemente baja (-196 C),
para que se suspenda el metabolismo y se eviten los
procesos que reducen la estabilidad gentica durante
el almacenamiento (10, 11, 12).
En la crioconservacin de especies que se
propagan vegetativamente, los tejidos organizados
tales como pices o meristemos son de preferencia
por su estabilidad gentica (13, 14). Adems,
stos se recomiendan como el explante por
excelencia a almacenar germoplasma porque se
pueden obtener plantas libres de virus (crioterapia)
regeneradas directamente a partir de estos materiales
crioconservados (15, 16).
En el caso de la pia se han utilizado protocolos
basados en un procedimiento de vitrificacin (17, 18).
En los ltimos aos se ha implementado la tcnica
de micro-goteo/vitrificacin en pices de pia donde
se ha logrado incrementar la supervivencia de los
pices (19, 20). Sin embargo, se desconoce an la
influencia de algunos factores tcnicos para lograr
una estrategia criognica con una aplicacin de
rutina a un amplio nmero de genotipos de pia.
Adems se han realizado pocas investigaciones para
visualizar los cambios estructurales a nivel celular
durante las diferentes etapas de un procedimiento de
crioconservacin. Por lo que este trabajo tuvo como
objetivo determinar diferentes aspectos tcnicos de una

MATERIALES Y MTODOS
La investigacin se realiz en el laboratorio de
Mejoramiento Gentico del Centro de Bioplantas de
la (Universidad de Ciego de vila), utilizando como
material vegetal vitroplantas de pia (Ananas comosus
var. Comosus) MD-2 provenientes de un Banco
de germoplasma in vitro micropropagadas segn el
protocolo establecido (21).
Etapa I. Acondicionamiento de las vitroplantas
donantes: Se utilizaron vitroplantas despus de cuatro
subcultivos. Multiplicadas en medio de cultivo lquido
con sales MS+100 mg L-1mioinositol +2,1 mg L-1BA+
0,3 mg L-1ANA +1,0 mg L-1Tiamin +30 g L-1 sacarosa
(0,08 mol L -1), con un pH del medio justado a 5,67
segn Skoog (22). Las plantas se subcultivaron
cada 30 das y crecieron a 272C y fotoperodo de
luz artificial de 18 h da-1, entre 1500 y 2000 lux de
iluminacin.
Etapa II. Pre-cultivo de pices: Se utilizaron dos
tipos de pices: pices tipo I (2,5-3 mm de longitud)
con una pequea base apical y tres a cuatro primordios
foliares que lo cubran; y pices con la pequea base
apical con uno o dos primordios foliares (pices tipo II)
(0,8-1,3 mm de longitud), para luego determinar el tipo
de pice ms adecuado antes y despus de inmersin
en nitrgeno lquido durante un tiempo de (0-30 min).
La diseccin del explante se realiz bajo un estreo
microscopio (ACUS SCOPE) en un gabinete de flujo
laminar a partir de vitroplantas. Los pices se cultivaron
durante dos das, cinco pices por placa de Petri que
contenan un medio de cultivo MS semislido suplementado
con 100 mg L-1 Mioinositol 1,0 mg L-1, Tiamina 30 g L-1
y 0,08 mol L-1 sacarosa. Luego se determin los efectos
del precultivo en sacarosa suplementando 0,1; 0,3; 0,5
y 0,7 mol L-1 de sacarosa, para mejora de la supervivencia
de los pices crioconservados. Despus se determin el
efecto de la solucin de carga, teniendo en consideracin
los mejores tratamientos del experimento anterior, donde
los explantes precultivados en sacarosa se sometieron a
1mL de las soluciones de carga (0,4 mol L-1 sacarosa+
2,0 mol L -1 glicerol; 0,75 mol L -1 sacarosa+
1,0 mol*L-1glicerol) en crioviales con capacidad total de
2 ml durante 25 min a 25 C.
Etapa III. Deshidratacin con la solucin vitrificadora
PVS2: A los dos das de precultivo los pices pasaron a
los crioviales (2mL de volumen total) que contenan 1,5
mL de solucin de PVS2 a temperatura ambiente 25
C. El material vegetal se mantuvo durante un perodo
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Cultivos Tropicales, 2016, vol. 37, no. especial, pp. 81-90

agua corriente durante 24 h para eliminar el exceso

de fijador. Una vez concluido el lavado, el tejido fue
deshidratado en concentraciones seriadas de alcohol
etlico (30, 50, 70, 80 y 90 %) y tres veces por alcohol
etlico absoluto, durante 2 h cada pase. Despus del
proceso de deshidratacin las muestras se aclararon
en alcohol- Bensol (50 % v/v), Luego se continu la
deshidratacin en tres pases de Bensol durante 1 h y
finalmente se embebieron en una serie de tres pases
de parafina con un perodo de impregnacin de 1 h
por pase. Seguidamente se incluyeron en bloques
de parafina a los que se le realizaron cortes seriados
con un grosor de 20 m, en un micrtomo manual de
deslizamiento vertical. La tcnica de tincin utilizada
fue la tincin de Flemming (24). Para la observacin
de las muestras se utiliz un microscopio Carl Zeiss
al cual se le acopl una cmara digital Canon Power
Shot A620 con la que se tomaron todas las imgenes.
Despus de realizado el procedimiento de vitrificacin,
fue validado en nueve accesiones del banco de
germoplasma nacional pia, tomando en consideracin
los mejores tratamientos de los acpites anteriores
(Tabla I). Adems de la evaluacin de la supervivencia,
de los pices deshidratados y crioconservados,
respectivamente a las seis semanas de incubacin.
Tratamiento estadstico de los datos
Se realizaron experimentos monofactoriales con
ms de dos niveles, con cinco repeticiones y se aplic un
diseo completamente aleatorizado. En el procesamiento
estadstico de los datos se emple el utilitario SPSS
para Windows (25). En todos los casos se comprob la
distribucin normal de los datos mediante la prueba de
homogeneidad de las varianzas a travs de la prueba
Levene. Se realizaron pruebas aramtricas (ANOVA
y Tukey) p<0,05. En algunos casos se necesit la
transformacin de datos segn x=2 arcosen ((x/100)0,5.

de tiempo (0-30 min) a 25 C, para determinar el tiempo

de deshidratacin en PVS2. Despus se determin el
tiempo de deshidratacin en PVS2 del material en un periodo
de tiempo (0180 min) a 25 C de acuerdo vegetal segn
la aplicacin de la solucin de carga antes de la inmersin
en nitrgeno lquido y posterior a la inmersin en nitrgeno
lquido. Adems, es necesario sealar que se realiz la
evaluacin del nmero total de grupos OH por la frmula
siguiente: Molaridad * NA * [OH] Donde, NA- Constante de
Avogadro 6,022 x 10 23mol-1, [OH] grupos OH por molcula.
Despus para mejorar la supervivencia de los
pices durante la crioconservacin se evalu el
efecto de la temperatura teniendo en consideracin
los mejores tratamientos de los acpites anteriores
con las siguientes modificaciones, donde el material
vegetal se mantuvo durante un perodo de tiempo
(0540 min) a 25 C y 0 C.
Etapa IV. Inmersin en nitrgeno lquido: Posteriormente
los crioviales se sumergieron en nitrgeno lquido y se
mantuvieron por 2 h en estas condiciones.
Etapa V. Calentamiento: El calentamiento de los
crioviales se realiz en un bao de agua a (+) 40 C,
durante 2-3 min.
Etapa VI. Destoxificacin (solucin de descarga):
La solucin vitrificadora PVS2 de los crioviales se
reemplaz una vez por 1 mL de una solucin de 1,2 mol L-1
de sacarosa y se mantuvo durante 30 min a 25 C.
Etapa VII. Recuperacin: Los pices de los diferentes
tratamientos se pasaron a papel de filtro que cubri
la superficie de placas de Petri que contena el
medio de micropropagacin pero desprovistos de los
reguladores del crecimiento.
Etapa VIII. Evaluacin de supervivencia: A la semana,
los pices se transfirieron a placas de Petri que contenan
medio de micropropagacin con idnticas condiciones
iniciales 272C y fotoperodo de luz artificial de 18 h da-1,
entre 1500 y 2000 lux de iluminacin, durante tres
semanas. La evaluacin de la supervivencia se realiz
segn lo establecido por Martinez- Montero (23),
considerando la porcentaje de supervivencia, el nmero
de pices que mostr sntomas de recrecimiento a las
cinco semanas de recuperacin midindole su tamao.
Los porcentajes de supervivencia se expresaron con
respecto al total de pices usados por tratamiento.

RESULTADOS Y DISCUSIN
En la Figura 1 se observ una mayor tolerancia
con diferencias significativas para los pices del
tipo I (Figura 1A) con respecto a los pices del tipo II
(Figura 1B). Los pices del tipo I soportaron los niveles
de deshidratacin al PVS2 tres veces ms, hasta los
30 min de exposicin.
Cuando se realiz una observacin al microscopio
ptico tambin se evidenciaron diferencias entre los
tipos de pices utilizados. La Figura 2 muestra la
seccin longitudinal de los dos tipos de pices. El pice
tipo I (Figura 2A), consta de 3 a 4 primordios foliares,
que garantizan cierto grado de proteccin al meristemo,
y un pice tipo II (Figura 2B) compuesto por uno o
dos primordios foliares donde el meristemo queda
prcticamente descubierto, los cuales resultaron ser
ms susceptibles a los tratamientos de deshidratacin.

Anlisis histolgico durante la crioconservacin

de pices de pia
El anlisis histolgico se realiz a partir de muestras
de pices deshidratados y crioconservados del cultivar
MD2 los cuales fueron sometidos durante 0, 180, 300,
420 y 540 min en la solucin vitrificadora PVS3 a 0 C.
Se sigui un procedimiento similar para todas
las muestras. Estas se fijaron en solucin F.A.A
(formol - cido actico - alcohol etlico) al 5-5-50 %
(v/v), respectivamente. A continuacin se lavaron en
83

Ariel Villalobos Olivera, Roberto Mndez Pelegrn, Justo Gonzlez Olmedo /et al./
Tabla I. Accesiones del Banco in vitro de germoplasma de pia que se utilizaron en la validacin
de la estrategia criognica
Nmero

Gnero

Especie

Ananas

comosus

Grupo horticultural
Espaola

Cabezona

Cultivar

Ananas

comosus

Espaola

Espaola Roja P3R5

Ananas

comosus

Espaola

Espaola Roja del Caney

Ananas

comosus

Cayena

Cayena lisa Serrana

Ananas

comosus

Cayena

MD2

Ananas

comosus

Cayena

Cayena de Puerto Rico

Ananas

comosus

Maipure

Perolera

Ananas

comosus

Pernambuco

Pia blanca

Ananas

comosus

Gnero afn

Piuela Karata

Medias con letras iguales no difieren (ANOVA, Tukey, p<0,05). Los datos se transformaron para el anlisis segn x= 2 arcsen ((x/100)0,5

Figura 1. Supervivencia del pice en la supervivencia antes de la inmersin en nitrgeno lquido (A) y posterior
a la inmersin en nitrgeno lquido (B)

A: pice tipo I con primordios foliares en desarrollo que le sirven deproteccin al meristemo apical
B: pice tipo II desprovisto de primordios foliares

Figura 2. Vista general del material vegetal utilizado en los experimentos de crioconservacin

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Cultivos Tropicales, 2016, vol. 37, no. especial, pp. 81-90

Generalmente, diversos autores aceptan, que

para una crioconservacin exitosa de los pices,
stos deben consistir en un domo meristemtico
ms uno o dos primordios foliares con un tamao de
0,5-2 mm de longitud, dependiendo de las especies
(26). Sin embargo, se recomienda, que es necesaria
una seleccin apropiada del tamao y el estado de
desarrollo del material inicial como factor esencial
para alcanzar altas tasas de recuperacin despus del
calentamiento (27). Por lo anterior se seleccionaron
los pices de tipo I para continuar en la estrategia
criognica en los siguientes experimentos.
En contraste con los resultados de tolerancia
obtenidos anteriormente solo se observ un 5,3 % de
supervivencia para los pices del tipo I cuando a los
25 min se deshidrataron por la solucin vitrificadora

PVS2, se enfriaron en nitrgeno lquido. Al realizar la

evaluacin de la coloracin del tejido se observ que
en la totalidad de los casos si stos se mantenan de
color verde intenso, podan recrecer a los 45 das de
evaluacin. Sin embargo, si cambiaban de coloracin
verde hacia amarilla-plida no podan crecer, y por lo
tanto moran.
Por otro lado, y para comparar el comportamiento
de los pices seleccionados en las Figuras 3 y 4 se
muestra la histologa realizada a pices de tipo I sin
tratamientos crioprotectores (tiempo 0) antes (Figura 3A
y B) y despus (Figura 4A y B) de la inmersin en
nitrgeno lquido. Los explantes estuvieron formados
por el domo meristemtico o meristemo apical
(Figura 3A y 4A) y una zona subapical de clulas
parenquimticas (Figura 3B y 4B).

A. primordio foliar (pf), domo meristemtico (dm) y zona parenquimtica subapical (zp). B. ampliacin de la zona parenquimtica con
clulas grandes vacuoladas (v), paredes celulares ligeramente engrosadas (pc) y ncleos ms o menos cntricos (n)

Figura 3. Microfotografas de pices del brote en la variedad MD2 sin tratamientos crioprotectores, antes
de la inmersin en nitrgeno lquido

A. Flanco del domo (fd) y primordio foliar (pf). Obsrvese clulas necrticas (cn), clulas meristemticas con paredes celulares
anormalmente engrosadas (cm) y muy vacuoladas y capas de la tnica multiseriada (ct). B. Zona parenquimtica subapical donde se
observan zonas de ruptura celular (zrc) con restos de paredes celulares y contenido nucleoplasmtico disperso. Ntese la presencia de
clulas parenquimticas con paredes celulares muy engrosadas y ncleo adosado (cp).

Figura 4. Microfotografas en pices vegetativos de la variedad MD2 sin tratamientos crioprotectores, despus
de la inmersin en nitrgeno lquido
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Ariel Villalobos Olivera, Roberto Mndez Pelegrn, Justo Gonzlez Olmedo /et al./
La histologa de los pices sin tratamientos
crioprotectores antes de la inmersin en nitrgeno lquido
mostr que las clulas de la zona subapical o clulas
parenquimticas (Figura 4B), se presentan ms grandes
con paredes celulares ms o menos engrosadas, vacuolas
ms grandes en comparacin con la zona meristemtica.
No existe una clara definicin en cuanto a la formacin
del meristemo en fila (rib meristem) como se observa
claramente en plantas adultas desarrolladas ex vitro.
Por su parte, en la histologa de los pices sin
tratamientos crioprotectores despus de la inmersin
en nitrgeno lquido, se observ que en la zona apical
(Figura 4A) existi heterogeneidad celular, donde algunas
clulas conservaron sus caractersticas meristemticas,
en el caso de los estratos celulares correspondiente a
las clulas ms jvenes del domo meristemtico, se
observaron clulas necrticas, clulas meristemticas
con paredes celulares anormalmente engrosadas y con
pequeas vacuolas o espacios eriplamticos, adems las
capas de la tnica se mostraron multiseriadas. Mientras
que en la zona parenquimtica subapical (Figura 4B),
las clulas estuvieron ms vacuoladas, algunas fueron
daadas, mostrando zonas de ruptura celular, con restos
de paredes celulares y contenido ncleo plasmtico
disperso. Ntese la presencia de clulas parenquimticas
con paredes celulares muy engrosadas y ncleo adosado.
Finalmente se observ que existi un nmero de clulas
con el citoplasma contrado en la pared celular.
Semejantes observaciones fueron realizadas por (28)
en meristemos de Musa spp, donde en los meristemtico
no enfriados las clulas mantenan forma ms o menos
regular y no se distinguan vacuolas en su citoplasma. Sin
embargo, despus de congelar las muestras por debajo
de -30 oC, observaron que a medida que las clulas eran
menos meristemticas exista un incremento en nmero
y tamao de las vacuolas presentes en estas.
Como era esperado para una concentracin de
sacarosa de 0,3 mol L-1 se alcanzaron los mejores niveles
de supervivencia para los pices posterior a la inmersin

en nitrgeno lquido y al calentamiento (Figura 5B). Por

lo tanto, esta concentracin de sacarosa se seleccion
para continuar la experimentacin. Los resultados de
diferentes grupos de investigacin son variados en el
sentido de estandarizar concentraciones apropiadas de
sacarosa durante la crioproteccin. Para cada material
a crioconservar debe encontrarse la concentracin
adecuada ya que esta vara segn la especie o explante
(4, 13, 28).
Cuando se emplea sacarosa se debe determinar la
concentracin adecuada que toleran las clulas antes
de iniciar el proceso de crioconservacin, basado en
dos aspectos fundamentales, la deshidratacin osmtica
y la toxicidad a las clulas (4). Los resultados ms
importantes de este experimento fue la seleccion de la
concentracin de sacarosa de 0,3 mol*L-1 para continuar
la experimentacin.
En la Figura 6 se observ que los niveles de
tolerancia a la deshidratacin por la solucin PVS2 se
incrementaron notablemente al emplear los tratamientos
de la solucin de carga hasta 180 min (Figura 6A).
Por su parte, los niveles de supervivencia a
la crioconservacin tambin se elevaron hasta un
40 %, con diferencias significativas a los 150 min
de deshidratacin en PVS2 a favor de la mezcla
crioprotectora de sacarosa 0,4 mol*L -1 y glicerol
2 mol*L-1 (Figura 6B), por lo que sta ltima ser la
solucin de carga que se emplear en los siguientes
experimentos. Sin embargo, se evidenci que no fue
posible obtener un incremento en la supervivencia de los
pices aunque se utilice un mayor tiempo de incubacin.
Lo anterior coincide con los resultados publicados
con respecto a la utilizacin del tiempo de pre-tratamiento
en las concentraciones de glicerol y sacarosa mediante
los procedimientos de vitrificacin (9, 12). Lo que indica
que es el tiempo adecuado para que se activen los
mecanismos necesarios involucrados en la tolerancia
de las clulas a los diferentes momentos estresantes en
una estrategia de crioconservacin.

A: antes de la inmersin en nitrgeno lquido

B: posterior a la inmersin en nitrgeno lquido
Medias con letras iguales no difieren (ANOVA, Tukey, p<0,05)
Los datos se transformaron para el anlisis segn x= 2 arcsen ((x/100)0,5

Figura 5. Efecto del tiempo de deshidratacin en PVS2 en la supervivencia de los pices (segn el precultivo
en sacarosa)
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Cultivos Tropicales, 2016, vol. 37, no. especial, pp. 81-90

A: antes de la inmersin en nitrgeno lquido

B: posterior a la inmersin en nitrgeno lquido
Medias con letras iguales no difieren (ANOVA, Tukey, p<0,05)
Los datos se transformaron para el anlisis segn x= 2 arcsen ((x/100)0,5

Figura 6. Efecto del tiempo de deshidratacin en PVS2 en la supervivencia de los pices (segn la aplicacin
de la solucin de carga)
la desorganizacin de la estructura de los cristales
de hielo.
En la Figura 8 se observ que existieron claras
evidencias estadsticas donde la solucin vitrificadora
PVS2 (Figura 8 A) es menos efectiva que la PVS3
(Figura 8 B) para el caso de los pices de pia
empleados. Esto se manifiesta en los mayores valores
de supervivencia a partir de los 180 min de aplicadas
las soluciones vitrificadoras durante la deshidratacin
de los pices. En el caso, de la supervivencia de los
pices crioconservados tambin los mximos niveles
se alcanzan con la solucin vitrificadora PVS3.
Lo anterior pudiera tener su explicacin en
que la solucin PVS2 utiliza al compuesto qumico
dimetilsulfxido que debe ser muy bien investigado su
empleo porque tiene efectos fisiolgicos y mutagnicos
negativos para algunos materiales vegetales.
Los resultados negativos de tolerancia coinciden
con lo informado para otros sistemas biolgicos y est
asociado al alto grado de toxicidad del dimetilsulfxido
(9) accesiones, se puede apreciar que el material
vegetal mantuvo un porcentaje de supervivencia entre
6,3 -65 %.
Con relacin a lo anterior, en la Tabla II se puede
apreciar la aplicacin de la estrategia criognica
a nueve accesiones del banco de germoplasma
in vitro, donde se pudo comprobar la respuesta
variada de los diferentes genotipos en la supervivencia
despus de la crioconservacin. El material vegetal
durante el proceso de crioconservacin puede sufrir
varios estreses entre los que se encuentran cambios
de pH, cambios mecnicos, deshidratacin (daos
osmticos), daos en la rehidratacin, estrs oxidativo
y estrs por bajas temperaturas (30). Los porcentajes
de supervivencia alcanzados por los pices de pia
crioconservados pudran estar influenciados por
alguno de estos estreses.

Cuando se determin el nmero total de grupos

OH por molculas de las mezclas utilizadas (sacarosa +
glicerol) para comparar los resultados de supervivencia
con diferencias estadsticas obtenidos en la Figura 6.
Para el caso de la mezcla 0,4 mol*L-1 sacarosa + 2,0
mol*L-1 glicerol rinde 55,402 x 1023 grupos OH total
por molculas mientras que la mezcla 0,75 mol*L-1
sacarosa + 1,0 mol L-1 glicerol rinde 54,198 x 1023
grupos OH total por molculas. De esta forma es
evidente el porqu de las diferencias significativas.
El reordenamiento de los grupos hidroxilo de las
molculas de diferentes azcares y poli-alcoholes
constituye un factor importante para una efectiva
crioconservacinA.
En la Figura 7 se muestran los resultados al
disminuir la temperatura de aplicacin del PVS2. Se
observ un aumento en el tiempo de tolerancia hasta
los 480 min (Figura 7A) y los mximos valores de
supervivencia a la crioconservacin se incrementaron
hasta un 45 % a los 420 min de exposicin al PVS2
(Figura 7B). Por lo tanto, en la continuacin de la
estrategia criognica se disminuir la temperatura
hasta 0 C para aplicar el PVS2.
Segn Takagi (29) en la crioconservacin de
pices de brotes de especies tropicales mejoro la
supervivencia de Dioscorea alata a la crioconservacin
desde un 47 % hasta un 91 % disminuyendo la
temperatura desde 25 C hasta 0 C durante la
deshidratacin por PVS2). En la actualidad existen
evidencias de estudios de Calorimetra Diferencial de
Barrido donde varios autores hipotetizan al respecto
(15). Los autores plantean que el mecanismo de
proteccin del PVS2 no solo est relacionado con la
no formacin de cristales de hielo, sino que adems
se basa en la restriccin de la movilidad molecular y
A

Thinh, N. T. Cryopreservation of germplasm of vegetatively propagated

tropical monocots by vitrification. Doctoral Paper, Kobe University,
Faculty of Agriculture, Japan, 1997.

87

Ariel Villalobos Olivera, Roberto Mndez Pelegrn, Justo Gonzlez Olmedo /et al./

A: antes de la inmersin en nitrgeno lquido

B: posterior a la inmersin en nitrgeno lquido
Medias con letras iguales no difieren (ANOVA, Tukey, p<0,05
Los datos se transformaron para el anlisis segn x= 2 arcsen ((x/100)0,5

Figura 7. Efecto del tiempo de deshidratacin en PVS2 en la supervivencia de los pices (segn la temperatura
de aplicacin de la solucin vitrificadora)

A: antes de la inmersin en nitrgeno lquido

B: posterior a la inmersin en nitrgeno lquido
Medias con letras iguales no difieren (ANOVA, Tukey, p<0,05)
Los datos se transformaron para el anlisis segn x= 2 arcsen ((x/100)0,5

Figura 8. Efecto del tiempo de deshidratacin en la supervivencia de los pices (segn la solucin vitrificadora
empleada)
Tabla II. Porcentaje de supervivencia que se obtuvo con la aplicacin del procedimiento de crioconservacin
por vitrificacin en nueve accesiones del banco in vitro de germoplasma de pia
Cultivar

No Crioconservar

Supervivencia (%)

Crioconservado

Cabezona

61,5

27,9

Espaola Roja P3R5

53,1

20,0

Espaola Roja del Caney

45,5

12,1

Cayena lisa Serrana

50,3

25,3

MD2

80,1

60,2

Cayena de Puerto Rico

80,2

65,5

Perolera

49,9

33,8

Pia blanca

57,9

24,7

Piuela Karata

33,1

6,3

88

Cultivos Tropicales, 2016, vol. 37, no. especial, pp. 81-90

CONCLUSIONES

7.

Se determinaron diferentes aspectos tcnicos de

una estrategia criognica para aumentar los niveles de
supervivencia de los pices a la inmersin en nitrgeno
lquido. Estos fueron: tipo de pice compuesto por 3-4
primordios foliares con un tamao aproximado 2.5-3 mm;
precultivo en 0,3 mol L-1 de sacarosa; aplicacin de
la solucin de carga 0,4 mol L-1 sacarosa +2 mol L-1
de glicerol; temperatura de aplicacin de la solucin
vitrificadora PVS3 a 0 oC durante 420 min. Mientras
que en la visualizacin de los cambios estructurales
ocurridos en los pices crioconservados se observ
que las clulas meristemticas presentes en el domo
apical y los primordios foliares en formacin, sufrieron
pocas alteraciones celulares y mantuvieron casi
intactas sus caractersticas morfo-fisiolgicas en las
mejores condiciones de supervivencia. Se aplic de
manera exitosa un procedimiento de vitrificacin para
9 accesiones del banco de germoplasma in vitro del
Centro de Bioplantas.

8.

9.

10.

11.

12.

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Publisher, 2012, book p., ISBN 978-953-51-0191-8.

Recibido: 15 de mayo de 2015

Aceptado: 28 de enero de 2016

NMERO ESPECIAL
Este nmero de la revista est dedicado
al X Congreso Internacional de Biotecnologa Vegetal (BioVeg2015)

Nota:
Durante el proceso de edicin no se pudo acceder al trabajo
de retoque y mejoramiento de imgenes, por lo que estas han
sido insertadas con la misma calidad con la que enviaron
sus autores.
La Editorial
90

Ministerio de Educacin Superior. Cuba

Instituto Nacional de Ciencias Agrcolas

Revista Cultivos Tropicales

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TUTORIAL
NMERO ESPECIAL
Este nmero de la revista est dedicado
al X Congreso Internacional de Biotecnologa Vegetal (BioVeg2015)
El Centro de Bioplantas es una institucin de investigaciones cientficas, adscrita a la Universidad
de Ciego de vila Mximo Gmez Bez del Ministerio de Educacin Superior de Cuba.
El mismo surge en 1987 como un laboratorio de investigaciones y micropropagacin de plantas
frutales. Desde 1992, tiene como misin desarrollar, aplicar y ofrecer tecnologas, productos,
asistencia tcnica y servicios acadmicos de excelencia en el marco de la Biotecnologa Vegetal.
El grupo de investigadores, tcnicos de laboratorio y otro personal auxiliar altamente calificados,
han sido galardonados con premios relevantes de la Academia de las Ciencias de Cuba y con
reconocimientos por la labor que realizan en la transferencia de resultados cientficos y tecnolgicos,
la produccin de vitroplantas para el comercio internacional, y la educacin postgraduada.
Para el trabajo cientfico cuenta con seis laboratorios: Cultivo de Clulas y Tejidos Vegetales,
Agrobiologa, Interaccin Planta-Patgeno, Ingeniera Metablica, Mejoramiento Gentico de
Plantas y Computacin Aplicada. Todos con las mejores facilidades y un equipamiento de alta
calidad para asegurar resultados relevantes.
El Centro de Bioplantas desde 1997 y, como bienal, desarrolla su Congreso Internacional de
Biotecnologa Vegetal (BioVeg), el cual constituye un marco excepcional para el intercambio
de conocimientos y experiencias entre cientficos, docentes y productores. En este se debaten en
forma de Conferencia Magistrales, Talleres y Mesas Redondas durante sesiones de trabajo, los
resultados ms relevantes y los problemas ms acuciantes que enfrenta la biotecnologa vegetal
cubana y mundial.
Por todo lo anterior, el Comit Organizador de BioVeg2015 en su dcima edicin se complace en
presentarles una muestra representativa de 19 trabajos cientficos completos recibidos y siente
profunda satisfaccin en invitarlos para el prximo BioVeg2017 que se desarrollar en la fecha
22-26 del mes de mayo.

Nota:
Durante el proceso de edicin no se pudo acceder al trabajo de retoque y mejoramiento de imgenes, por lo que estas han
sido insertadas con la misma calidad con la que enviaron sus autores.
La Editorial
2

ISSN impreso: 0258-5936

ISSN digital: 1819-4087