Buletinul AM. tiinele vieii. Nr.

3(318) 2012

Genetica, Biologia molecular i Ameliorarea

Bibiliograe
1. Arppe A., Milin R. P., Baayen H. Package Naive Discriminative Learning Version 0.1.1, 2011, http://cran.r-project.org/web/packages/ndl/ndl.pdf. 2. Barrett T. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets - 10 years on. // Nucleic Acids Research, 2011, 39:10051010. 3. Barrett T. NCBI GEO: mining millions expression proles- database and tools. // Nucleic Acids Research, 2005, 33: 562566. 4. Barrett T. NCBI GEO: mining tens of millions of expression proles - database and tools update. // Nucleic Acids Research, 2007, 35:760765. 5. Brazma A., Hingamp P., Quackenbush J., et al. Minimum information about a microarray experiment (MIAME) toward standards for microarray data. // Nat. Genet., 2001, 29, (4):365371. 6. Davis S., Meltzer P. S. GEOquery: a bridge between the Gene Expression Omnibus (GEO) and BioConductor. // Bioinformatics, 2007, 23, (14):18461847. 7. Gentleman R. C., Carey V. J., Bates D. M. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. // Genome Biol, 2004, 5(10):80. 8. Giorgi F. M., Bolger A. M., Lohse M., et al. Algorithm-driven Artifacts in median polish summarization of Microarray data. // BMC Bioinformatics, 2010, 11:553. 9. R Development Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. Version 2.11.1 (2010-05-31), ISBN 3-900051-07-0. 10. Rhee S. Bioinformatic resources, challenges, and opportunities using Arabidopsis as a model organism in a postgenomic era. // Plant Physiology, 2000, 124(4):14601464. 11. Ron E., Barrett T. NCBI GEO standards and services for microarray data. // Nat. Biotechnol., 2006, 24(12):14711472. 12. Tukey J. W. We need both exploratory and conrmatory. // The American Statistician, 1980, 34(1):2325. 13. Walbot V. A green chapter in the book of life. // Nature, 2000, vol. 408, p. 794795. 14. Wilson R., Heckman J., Somerville C. Gibberellin is required for owering in Arabidopsis thaliana under short days. // Plant Physiol., 1992, 100:403408. 15. Zentella R., Zhang Z. L, Park M., et al. Global analysis of DELLA direct targets in early gibberellin signaling in Arabidopsis. // Plant Cell, 2007, 19(10):30373057. 16. Zhang A. Advanced analysis of gene expression microarray data. // World Scientic Publishing Co. Pte. Ltd., 2006, 4:5182.

PRIMERII OMOLOGI TRANSPOZONULUI ACTIVATOR N EVIDENIEREA POLIMORFISMULUI MOLECULAR AL GENOMURILOR VEGETALE

Paa Lilia Institutul de Genetic i Fiziologie a Plantelor al Academiei de tiine a Moldovei
n lucrare, este artat posibilitatea utilizrii primerilor omologi elementului transpozabil Activator n evidenierea polimorsmului molecular al speciilor de plante distanate logenetic Asparagus ofcinalis L. (sparanghel), Allium cepa L. (ceap), Magnolia sp. (magnolia), Buxus sempervirens L. (cimiir), Anethum graveolens L. (mrar). Cuvinte cheie: element transpozabil Activator - polimorsm molecular - Asparagus

Rezumat

112

Buletinul AM. tiinele vieii. Nr. 3(318) 2012

Genetica, Biologia molecular i Ameliorarea

ofcinalis L. - Allium cepa L. - Magnolia sp. - Buxus sempervirens L. - Anethum graveolens L. Depus la redacie: 22 octombrie 2012 --------------------------------------------------------------------------------------------------------Adresa pentru coresponden: Paa Lilia, Institutul de Genetic i Fiziologie a Plantelor al AM, laboratorul Genetic molecular, str. Pdurii 20, MD 2002 Chiinu, Republica Moldova, tel. (+37322)660434, e-mail: [email protected]

Introducere Elementele transpozabile (ET) reprezint elemente genetice, care se pot deplasa dintr-un site al unui cromozom, n un alt site al aceluiai cromozom sau al unuia diferit i, prin urmare, snt capabile s modice constituia genetic a organismului [1]. n funcie de mecanismul transpoziiei, ET se clasic n dou clase. Din clasa I fac parte elementele transpozabile ARN numite i retrotranspozoni sau retroelemente, care prezint un mecanism de transpoziie copie-insereaz mediat de ARN [2]. Elementele clasei II, sau transpozonii, utilizeaz un intermediar ADN, transpoziia lor asigurndu-se printr-un proces de tipul taie-insereaz. Transpozonii constituie clasa majoritar de ET identicate n genomul plantelor, dar majoritatea transpozonilor snt transcripional inactivi i imobili [3, 4]. Fiind prezentate n genom ntr-un numr diferit de copii i avnd o localizare aleatorie, ET prezint interes practic prin perspectiva utilizrii lor n studiul polimorsmului molecular al speciilor. Astfel au fost propuse procedee n baza tehnicii PCR (polymerase chain reaction reacia polimerazei n lan) cu utilizarea primerilor ET, att a retrotranspozonilor, cum ar IRAP (Inter Retrotransposon Amplied Polymorphism), REMAP (Retrotransposon Microsatellite Amplied Polymorphism), RBIP (Retrotransposon-Based Insertion Polymorphisms), S-SAP (Sequence-Specic Amplication Polymorphism) [5, 6], ct i a transpozonilor, de exemplu, polimorsmul speciilor i hibrizilor interspecici ai g. Helianthus utiliznd primerii ET MuDR [7]. Scopul prezentei lucrri a fost evaluarea primerilor omologi ET din clasa a II-a Activator (Ac) n calitate de marcheri n evidenierea polimorsmului molecular al unor specii de plante angiosperme distanate logenetic. Materiale i metode Obiectul de cercetare l-au constituit genomurile speciilor de angiosperme Asparagus ofcinalis L. (sparanghel), Allium cepa L. (ceap), Magnolia sp. (magnolia), Buxus sempervirens L. (cimiir), Anethum graveolens L. (mrar), n genomul crora au fost identicate secvene nucleotidice omoloage ET Ac [8]. ADN-ul genomic a fost izolat utiliznd metoda CTAB (cetiltrimetilamonium bromide) - cloroform modicat (Shaghai-Maroof) [9]. Au fost testai opt primeri, creai n Laboratorul Genetic molecular al IGFP al AM, n baza secvenei nucleotidice complete a Ac (4565 p. b.) din genomul de Zea mays L., prezentate n baza de date GeneBank [10]. Primerii E16, D3, E17, E18 snt de la extremitatea 5 a Ac, E19, E20, E21, E22 de la extremitatea 3 a Ac, E16, E19 i E20 au orientarea 5 3, iar D3, E17, E18, E21, E22 3 5 (gura 1). Modelul structurii Ac (4565 p. b.) al Zea mays L., a fost executat cu utilizarea softului Vector NTI Delux40, n baza secvenei nucleotidice complete a Ac i descrierii acestea [11].

113

Buletinul AM. tiinele vieii. Nr. 3(318) 2012

Genetica, Biologia molecular i Ameliorarea

Figura 1. Modelul structurii transpozonului Activator (4565 p. b.) al Zea mays cu indicarea poziiei primerilor utilizai n studiu. TIR (terminal inverted repeats) repetiii terminale inversate, ORFa (open reading frame) cadru deschis citirii

A fost utilizat tehnica single primer PCR (reacia polimerazei n lan cu un singur primer), care s-a desfurat n 8 cicluri: denaturarea 95 0C 1 min., alinierea 400C 2 min., extensia 720C 1 min., urmate de 35 cicluri: denaturarea 950C 0,5 min., alinierea 65 0C 1 min., extensia 72 0C 1 min.. Amestecul reactiv pentru PCR a inclus 5 pM primer, 5-10 ng ADN, soluie tampon: 66 mM tris-HCl (pH-8,4), 16 mM (NH4)2SO4, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Tween 20, 7 % glicerol, 100 g ml-1 BSA (Bovin Serum Albumin), cte 0,2 mM de ecare dNTP, 1,25 U Taq DNA polymeraza (Fermantas). Amplimerii au fost separai prin electroforez (5-8 V/cm) n gelul de agaroz de 2%, cu bromur de etidiu, n soluia tampon de migrare tris-borat-EDTA (pH 8,3), vizualizate prin diafonoscopie n unde UV scurte (302 nm) i fotograate (DigimaxS600/ KenoxSamsung). Pentru calcularea dimensiunilor amplimerilor, s-a utilizat marcherul de referin 100 bp Ladder DNA marker (Axygen biosciences), softurile Paint Shop Pro 7 i Microsoft Ofce Excel 2003 (curba exponenial y = a*e^bx). Rezultate i discuii Spectrele polimorfe de ADN ale genomurilor studiate, obinute n rezultatul single primer PCR snt prezentate n gura2 i tabelul 1. Numrul fragmentelor polinucleotidice amplicate, de ecare primer, pentru diferite genomuri nu difer semnicativ. Astfel primerul E16 a asigurat amplicarea a 3-4 amplimeri specici pentru ecare din genomurile analizate, D3: 2 - 5 i 7 - 8 fragmente, E17: 4 - 5 fragmente (excepie Allium cepa L.), E18: 4 - 7 fragmente, E19: 6 - 8 fragmente, E20: 5 - 8 fragmente, E21: 6 - 9 fragmente, E22: 7 - 11 fragmente. Se observ c, primerul E22 a determinat amplicarea unui numr mai mare de fragmente pentru toate genomurile analizate. Fragmentele sintetizate de acelai primer pe ADN-ul genomic al diferitor specii difer dup mrime, ponderea fragmentelor de dimensiuni identice ind neglijabil n raport cu numrul total de fragmente polimorfe. De exemplu, primerul E20 determin sinteza a 32 fragmente polimorfe i doar a dou fragmente identice, ca mrime (847 p. b.), pentru Magnolia sp. i Anethum graveolens L.. Snt sau nu, aceste fragmente, identice n ceea ce privete succesiunea nucleotidelor, rmne de a stabilit prin cercetri de secveniere.

114

Buletinul AM. tiinele vieii. Nr. 3(318) 2012

Genetica, Biologia molecular i Ameliorarea

Figura 2. Electroforegramele produselor PCR amplicate cu utilizarea primerilor E16 (A: 1-5), E17 (A: 6-10), E18 (B:1-5), E19 (B: 6-10), E20 (C: 1-5), E21 (C: 6-10), E22 (D: 1-5), D3 (D: 6-10): Asparagus ofcinalis L (1, 6)., Allium cepa L. (2, 7), Buxus sempervirens L., (3, 8), Magnolia sp. (4, 9), Anethum graveolens L. (5, 10), M marcherul.

n majoritatea reaciilor cel puin 40 % din ampliconi au dimensiuni mai mari de 500 p.b., iar n jumtate de variante: de la 1 pna la 5 ampliconi au mai mult de 1000 p.b.. Numrul fragmentelor polinucleotidice amplicate, de diferii primeri, pentru un anumit genom variaz n limite mai mari. Astfel, pentru genomul Asparagus ofcinalis L. se identic de la 3 (E16) pn la 9 (E22) fragmente, pentru Allium cepa L. de la 1 (E17) pn la 8 (E19), pentru Buxus sempervirens L. de la 4 (E16) pn la 11 (E22), pentru Magnolia sp. de la 4 (E16, E17, E 14) pn la 8 (E19), pentru Anethum graveolens L. de la 3 ( E16) pn la 9 (E22). Se presupune c, n cazul primerilor 53 de la extremitatea 5 a Ac i primerilor cu 35 de la extremitatea 3, diferenele atestate n dimensiunile ampliconilor sintetizai pe ADN-ul genomic al anumitei specii, snt determinate de deleiile sau inseriile din interiorul copiilor ET Ac. n cazul primerilor 5 cu orientarea 35 i 3 cu orientarea 53 polimorsmul fragmentelor scurte poate avea aceeai explicaie, iar polimorsmul ampliconilor mai mari de 600 p. b., care, ar include succesiuni ale Ac i parial succesiuni ale site-ului int, snt determinate de localizarea copiilor Ac n genom. Astfel, spectrele polimorfe specice ecrui genom constituie, o dovad

115

Buletinul AM. tiinele vieii. Nr. 3(318) 2012

Genetica, Biologia molecular i Ameliorarea

indirect, att a polimorsmului ET Ac, n cadrul genomului, ct i a polimorsmului site-urilor de inserie a acestuia.
Tabelul 1: Polimorsmul molecular al genomurilor analizate
Primerii E16 5 53 D3 5 35
5: 712, 809, 934, 1207, 1485

E17 5 35
4: 474, 542, 656, 1040

E18 5 35
7: 302, 378, 501, 609, 755, 1051, 1381

E19 3 53
7: 353, 521, 586, 698, 816, 1408, 1815

E20 3 53
7: 271, 333, 419, 543, 744, 879, 947

E21 3 35
6: 215, 301, 404, 524, 612, 879

E22 3 35
9: 278, 335, 455, 597, 657, 723, 934, 1079, 1246

3: 491, 679, 1165

4: 302, 370, 562, 607

2: 228, 310

1: 474

8: 501, 658, 755, 899, 1011, 1436, 1779, 2338

5: 245, 279, 349, 505, 585

6: 269, 435, 505, 630, 947, 1098 9: 389, 469, 524, 704, 801, 1001, 1182, 1589, 1983

7: 358, 406, 597, 667, 786, 1079, 1206

4: 330, 423, 474, 1746

8: 440, 485, 560, 646, 876, 1187, 1286, 1559 7: 335, 381, 616, 700, 905, 1132, 1416 7: 352, 509, 597, 667, 934, 1150, 1371

5: 405, 474, 598, 777, 973

6: 658, 872, 980, 1303, 1522

6: 521, 684, 816, 1051, 1493, 2121

7: 228, 274, 349, 419, 585, 805, 1070

11: 295, 381, 400, 440, 525, 560, 657, 735, 822, 1393, 1716

4: 476, 643, 743, 1114,

4: 432, 507, 926, 1139

4: 542, 684, 899, 1051

8: 389, 542, 684, 935, 1072, 1253, 1646, 2121

7: 290, 336, 443, 533, 574, 666, 847

7: 312, 435, 524, 585, 758, 879, 1038

7: 335, 381, 462, 542, 689, 1028, 2401

3: 476, 542, 1246

4: 387, 453, 607, 710

4: 404, 521, 658, 1134

7: 326, 482, 1011, 1229, 1552, 1711, 2293

8: 232, 306, 404, 448, 581, 801, 847, 1057

6: 362, 419, 524, 678, 816, 946

9: 228, 310, 357, 462, 657, 849, 964, 1079, 1207

Concluzie Primerii ET Ac al Zea mays L. asigur obinerea unor spectre polimorfe distincte ale genomurilor Asparagus ofcinalis L., Allium cepa L., Buxus sempervirens L., Magnolia sp., Anethum graveolens L., astfel ind posibil utilizarea lor n calitate de marcheri universali n evidenierea polimorsmului molecular i, deci, n genotiparea speciilor de plante angiosperme. Bibliograe
1. http://www.thefreedictionary.com/transposon (vizitat 26.09.2012). 2. Grandbastien M-A., Audeon C., Bonnivard E. et all. Stress activation and genomic impact of Tnt1 retrotransposons in Solanaceae // Cytogenet. Genome Res. 2005. Vol.110, p. 229241.

116

Buletinul AM. tiinele vieii. Nr. 3(318) 2012

Genetica, Biologia molecular i Ameliorarea

3. Craig N., Craigie R.,Gellert M. et all. Mobile DNA II //Washington, DC: Am. Soc. Microbiol. Press. 2002, p. 16. 4. enea G. Elementele transpozabile, silenierea i rolul lor n evoluia genomului vegetal, Bucureti 2002. p. 123-124. 5. Kalendar R., Grob T., Regina M., et all. IRAP and REMAP: Two new retrotransposonbased DNA ngerprinting techniques // Theoretical and Applied Genetics, 1999, p. 704-711. 6. Grzebelus D. Transposon insertion polzmorphism as a new source of molecular markers // Journal of Fruit and Ornamental Plant Research, 2006, Vol. 14 (Suppl. 1). 7. .., . ., .. . // , 2009, 8 (45), . 1067-1077. 8. Deaghileva A., Paa L., Mitin V., Tumanova L. Ac-like transposonii n genomurile plantelor superioare // Buletinul Academiei de tiine a Moldovei. tiinele vieii, 2009, nr.2, p. 70-73. 9. Shaghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A., Allard R.W. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley. Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 80148018. 10. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 11. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/22112?report=genbank&log$=nucltop&bla st_rank=47&RID=7WT4P9FY014

ANALIZA EXPLORATIV A EXPRESIEI GENELOR IMPLICATE N MORFOGENEZA FLORII

Duca Maria, Levichi Alexei, Martea Rodica Laboratorul de Bioinformatic, Centrul universitar Biologie molecular, Universitatea Academiei de tiine a Moldovei
Studierea expresiei genelor care particip n morfogeneza oral, n baza prolurilor de expresie microarray, a permis identicarea i analiza intelor de reglare direct/ indirect a proceselor de formare a orii. Au fost puse n eviden 44 gene implicate n ase categorii de procese ce contribuie la morfogeneza orii, care ipotetic i modic expresia sub controlul genelor din sistemul ABC. Dintre acestea, opt gene nu posed adnotare funcional, astfel, prezentnd interes deosebit pentru studierea ulterioar a funciilor genelor. Cuvinte-cheie: microarray - modelul oral ABC - reelele reglatoare de gene Depus la redacie 14 noiembrie 2012 --------------------------------------------------------------------------------------------------------Adresa pentru coresponden: drd. Rodica Martea, Laboratorul de Bioinformatic, Centrul universitar Biologie molecular, Universitatea Academiei de tiine a Moldovei, str. Academiei 3/2, MD 2028 Chiinu, Republica Moldova, e-mail : lab.bi.unasm@ gmail.com, tel. (+373) 73 74 15.

Rezumat

Introducere Formarea orii reprezint o etap primordial n reproducerea plantelor i crearea diversitii genetice, care se desfoar n baza proliferrii active a esuturilor meristematice. Procesele de specicare i determinare a organelor orii reprezint momente cruciale n ciclul de via, care asigur creterea i dezvoltarea individual a plantei.

117