Tre avlange pinner i plast. I den ene enden er det et rosa lokk, midt på er det felt som viser én eller to streker.
Graviditetstester som kjøpes på butikker og apotek baserer seg på metoden ELISA. For å ta testen tar man av det rosa lokket og dypper målepinnen i urin. Etter en stund, kan man lese av om man er gravid. Om det er én strek, har testen virket som den skal, men kvinnen er ikke gravid. Er det to streker, er kvinnen gravid.
Foto
Av /Shutterstock.

ELISA er en av mange immunologiske metoder som baserer seg på antistoffers spesifikke bindingsevne. Enzymatiske immunoassays som ELISAs og EIAs har flere likheter, og betegnelsene brukes ofte som generelle begrep for lignende metoder der reaksjonen mellom et antigen og et antistoff detekteres (måles) via en fargeendring. ELISAs kan brukes til å måle små mengder biologiske substanser i væsker som for eksempel hormoner i blodomløpet. Metoden har blitt brukt i flere tiår. ELISAs er relativt hurtig, billig, fri for farlig avfall og kan brukes enten kvalitativt eller kvantitativt avhengig hvilken type ELISA som anvendes.

Faktaboks

Uttale

el'isa

Etymologi

forkortelse for engelsk enzyme-linked immunosorbent assay

Anvendelse

ELISAs har et bredt anvendelsesområde som blant annet inkluderer deteksjon og kvantifisering av antistoffer i blodet, deteksjon og estimering av mengde kreftmarkører (biomarkører) og hormonnivåer, sporing av sykdomsutbrudd, oppdagelse av tidligere utsettelse for ulike virus, kvalitetssjekk av donert blod og til å avdekke stoffmisbruk.

Det brede anvendelsesområdet kommer av at det kan utvikles antistoffer og antigener for spesifikke molekyler som peptider og proteiner, hormoner, vitaminer og medisiner. Disse molekylene finnes ofte i lave konsentrasjoner og kan detekteres grunnet den høyt spesifikke antigen-antistoff bindingen. Det er viktig at metoden kvalitetssjekkes da den er sårbar for en rekke mulige forstyrrelser. Det innebærer at komponentene og reagensene som brukes i hver enkelt ELISA må kontrolleres rutinemessig for å bekrefte at analyseresultatet er korrekt.

Metoder

ELISAs er en svært spesifikk og sensitiv analysemetode som har blitt anvendt i flere tiår. Spesifisiteten kommer av antistoffenes evne til å gjenkjenne og binde kun én type antigen. Sensitiviteten kommer av at det trengs svært små mengder antistoffer for å detektere ett antigen. Der noen typer immunologiske metoder behøver 6 nanogram antistoffer per milliliter for å detektere antistoffer, kan ELISA brukes til å detektere så små mengder som 0.01 nanogram antigen eller antistoff, og med kun 0.1 nanogram antistoff per milliliter. I ELISAs er antistoffet knyttet sammen med et enzym slik at en fargereaksjon utløses når antistoffet binder seg til forbindelsen som skal måles. Slik kan konsentrasjonen av testsforbindelsen bestemmes ut ifra den målte fargeintensiteten.

Hovedprinsipper:

Mikroplate til ELISA

ELISA utføres gjerne i mikroplater med mange brønner. Her er det 96 brønner, men ikke alle er brukt.

Mikroplate til ELISA
Av /Shutterstock.

For å kunne identifisere for eksempel et virus hos et menneske, må et antistoff kunne bindes til et antigen. Påvisningen av viruset kan foregå ved at en blodprøve tilsettes et prøverør som inneholder deler (fragmenter) av det aktuelle viruset. I dette tilfellet fungerer virus-fragmentet som et antigen, og hvis blodprøven inneholder antistoffer til viruset vil disse bindes til antigenet (viruset-fragmentet). Antistoffer er kun til stede i blodprøven hvis pasienten har vært eksponert for viruset. For å kunne detektere binding mellom antigenet som er til stede i prøverøret og antistoffene fra blodprøven, brukes det flere antistoffer, som har vært i kontakt med viruset (antigenet) tidligere. Disse antistoffene vil binde seg til de antistoffene som igjen er bundet til antigenet (virus-fragmentet). Dette ekstra antistoffet som tilsettes prøven er koblet til et enzym. Til slutt tilsettes et stoff (substrat) som vil reagere med enzymet som er festet på antistoffet, slik at en fargereaksjon observeres. Intensiteten (styrken) til denne fargereaksjonen vil avhenge av hvor mye antistoffer som er bundet antistoff-antigen-komplekset til stede i prøven. Ved at fargereaksjonen er proporsjonal med mengden antistoffer vil både tilstedeværelsen av viruset og mengden antistoffer kunne bestemmes.

For å kunne analysere flere prøver samtidig brukes ofte 96- eller 384-brønnsplater (mikroplater) av polystyren. Når proteinene og antistoffene tilsettes mikroplatene bindes de passivt til overflaten av brønnene. Denne passive bindingen gjør at man enkelt kan separere vekk materiale som bindes uspesifikt og beholde materiale som har bundet seg til antistoffene under analysen.

En praktisk beskrivelse av de fire hoveddelen av ELISA:

Antigen og antistoff
  1. Påføring av belegg/ oppfanging: Antigenene blir direkte eller indirekte festet til overflaten av brønnene på polystyren-mikroplaten.
  2. Blokkering av mikroplaten: For å dekke over alle ubrukte potensielle bindingsseter på platen tilsettes et protein som ikke reagerer med andre reagenser i analysen.
  3. Sondering/ deteksjon: Inkubering av platen med antistoffer som kan bindes spesifikt til antigene som er festet til overflaten til brønnene.
  4. Signalmåling: Måling av signalet som blir sendt ut når et antistoff affinitets-bindes til et antigen. Signalet stammer fra fargestoffet (substratet) som reagerer med enzymet som igjen er festet direkte eller sekundært til det spesifikke antistoffet.

Underkategorier av ELISAs

I dag finnes det fire hovedtyper ELISAs; direkte, indirekte, sandwich og kompetitiv. Metodene kan anvendes for deteksjon av antigener eller antistoffer. Skillet mellom direkte eller indirekte ELISA kommer hovedsakelig fra hvordan antigenet bindes til brønnene i mikroplaten og deteksjonen av antigenet etter binding. Metoden anvendes for å kvantifisere (måle mengden) av et spesifikt stoff i en prøve. Prøvematerialet er ofte en type pasientprøve. Stoffene som kan måles er for eksempel tilstedeværelsen av ulike proteiner, hormoner, antistoffer eller antigener.

Oversikt over typer ELISA
Oversikt over typer ELISA
Av .

Direkte ELISA

Dirkete ELISA egner seg blant annet til undersøkelse av immunresponsen til ett antigen. Først festes eller absorberes prøvematerialet uspesifikt til overflaten av brønnene i en mikroplate. Antigenet detekteres ved at det bindes spesifikt av ett antistoff som er direkte konjugert (festet) til et deteksjonsenzym. For hvert antigen som skal detekteres må det tilsettes ett antistoff som kan bindes spesifikt til det aktuelle antigenet.

Direkte ELISA har ett enkelt oppsett, men gir ett mindre spesifikt resultat. Den uspesifikke bindingen fører til at alle proteiner som er til stede i prøven vil feste seg til overflaten av brønnene, ikke kun det proteinet man eventuelt er interessert i å kvantifisere. Det er heller ikke mulig å amplifisere signalet da det ikke tilsettes ett sekundært antistoff. Til gjengled er metoden mindre sensitiv for forurensning eller kryss-kontaminering da det brukes færre reagenser.

Direkte ELISA
Direkte ELISA
Av .

Indirekte ELISA

Indirekte ELISA egner seg blant annet til å måle den totale konsentrasjonen av antistoffer i en prøve. Overflaten til brønnene i en mikroplate blir først dekket av et belegg bestående av et spesifikt antistoff. Det fører til at det kun er antigener som kan bindes til det spesifikke antistoffet som vil absorberes eller immobiliseres på overflaten av brønnene. Når antigenet skal detekteres gjøres det i to trinn. I det første trinnet bindes det spesifikke antigenet av ett umerket antistoff. I det andre trinnet brukes ett sekundert enzym-konjugert antistoff som reagerer med det primære antistoffet.

Sensitiviteten til indirekte ELISA er større da flere enn ett merket antistoff kan reagere og bindes til det sekundære antistoffet, og ulike primære antistoffer kan kombineres med ett enkelt sekundært antistoff. Metoden er derimot mer utsatt for bakgrunnsstøy eller uspesifikke målinger da det kan oppstå kryssreaktivitet mellom det absorberte antigenet og det sekundære antistoffet, og analysen tar lengre tid da den består av to trinn.

Sandwich-ELISA

Sandwich-ELISA egner seg til analyse og kvantifisering av proteiner i komplekse prøver ved at metoden er svært sensitiv og spesifikk. I denne metoden anvendes det par av antistoffer, ett “fange”-antistoff- og ett “deteksjons”-antistoff der hvert enkelt antistoff har en spesifikk bindingsmekanisme til en spesifikk del av overflaten på ett antigen (f.eks. ett protein). For at metoden skal være sensitiv og produsere troverdige resultater må bindingsmekanismen mellom parene av antistoffer mellom de ulike antistoffene og antigenet være nøye undersøkt.

Før prøvematerialet kan tilsettes, dekkes overflaten til brønnene i mikroplaten av et belegg bestående av ett “fange”-antistoff. Proteinet som skal undersøkes immobiliseres ved binding til “fange”-antistoffet. Et “deteksjons”-antistoff bindes så til det immobiliserte proteinet, slik at mål-proteinet er bundet i en “sandwich” mellom “fange”-antistoffet og “deteksjons”-antistoffet. Ved binding av substrat til “deteksjons”-antistoffet sendes det ut et signal som er direkte proporsjonalt med konsentrasjonen til proteinet som undersøkes.

Sandwich-ELISA
Sandwich-ELISA
Av .

Kompetitiv ELISA

Kompetitiv ELISA er ett alternativ til “sandwich”-ELISA. Enkelte mål-proteiner er av for liten størrelse til å kunne bli “fanget” mellom to antistoffer. Kompetitiv ELISA er en mindre spesifikk metode enn “sandwich”-ELISA da det kun brukes ett antistoff. Oppsettet er mer komplisert enn de overnevnte metodene, som alle kan konverteres til kompetitiv ELISA. Det er en forstyrrelse av deteksjons-signalet som indikerer konsentrasjonen av et antigen eller antistoff; ett omvendt proporsjonalt signal.

Ved kompetitiv ELISA dekkes først overflatene i en mikroplate med ett “fange”-antistoff. Når prøven tilsettes, vil mål-antigenet bindes av “fange”-antistoffet. Så tilsettes ett konjugert antigen som bindes til eventuelle ledige “fange”-antistoff. Jo lavere konsentrasjon av mål-antigen, jo flere ledige “fange”-antistoff og påfølgende sterkere signal sendes ut ved binding av substrat til det konjugerte antigenet.

Kompetitiv ELISA
Kompetitiv ELISA
Av .

Historie

Utviklingen av ELISA var et resultat av en modifisert versjon av radioimmunoassay (RIA), en metode med lignende prinsipp. RIA var både en kostbar og lite anvendelig metode sammenlignet med ELISA. Ved RIA ble antigen-antistoff merket med radioaktivt jod som senere ble byttet ut med enzym-merking. To ulike forskningsgrupper gjorde denne modifikasjonen under samme tidsperiode i 1971, bestående av de svenske forskerne Eva Engvall og Peter Perlman og de nederlandske forskerne Anton Schuurs og Bauke van Weemen. ELISA ble raskt tatt i bruk og ble etter hvert ytterligere modifisert.

Les mer i Store norske leksikon

Kommentarer

Kommentarer til artikkelen blir synlig for alle. Ikke skriv inn sensitive opplysninger, for eksempel helseopplysninger. Fagansvarlig eller redaktør svarer når de kan. Det kan ta tid før du får svar.

Du må være logget inn for å kommentere.

eller registrer deg