Barretti Souza Pozza, 2008
Barretti Souza Pozza, 2008
Barretti Souza Pozza, 2008
RESUMO
A partir de 150 isolados de bactérias endofíticas obtidos de folhas, caules e raízes de tomateiros sadios, 53 destacaram-se
quanto à habilidade em promover o crescimento de plantas de tomateiro (Solanum lycopersicum L.). Submetidos a uma nova seleção,
os isolados UFV-E17, UFV-E22, UFV-E25, UFV-E26, UFV-E27, Bacillus cereus (UFV-E29), UFV-E49, UFLA 06-LS, UFLA 08-LS
e UFLA 11-LS apresentaram maior promoção do crescimento. Avaliações semanais de altura e número de folhas e folíolos das plantas
aconteceram durante 45 dias. Após a sexta avaliação, mensurou-se a área foliar e o peso da matéria fresca e seca da parte aérea e da raiz
das plantas. O isolado UFV-E49 apresentou melhor resultado para altura, área foliar, número de folhas e peso da matéria fresca e seca,
tanto da parte aérea quanto da raiz. Dos isolados selecionados, somente dois apresentaram efeito inibitório direto in vitro a Ralstonia
solanacearum.
Termos para indexação: Endófitas, tomate, fixação de nitrogênio, Ralstonia solanacearum, Solanum lycopersicum.
ABSTRACT
Out of one hundred and fifty isolates of endophytic bacteria from leaves, stems and roots of healthy tomatoes (Solanum
lycopersicum L.), fifty three showed ability to promote tomato plant growth, among these, ten isolates UFV-E17, UFV-E22, UFV-
E25, UFV-E26, UFV-E27, Bacillus cereus (UFV-E29), UFV-E49, UFLA 06-LS, UFLA 08-LS and UFLA 11-LS, provided the largest
plant growth promotion. Weekly assessment of plant height and number of leaves and leaflets were carried out during 45 days. After
the sixth evaluation, the leaf area and the fresh and dry weight of the aerial part of plants and of the roots were measured. Isolate UFV-
E49 provided the largest values of height, leaf area, number of leaves and fresh and dry weight of the aerial part of plants as well as
the root. From the selected isolates, only two presented antimicrobial activity against Ralstonia solanacearum.
Index terms: Endophytes, tomato, nitrogen fixation, Ralstonia solanacearum, Solanum lycopersicum.
entanto, as bactérias endofíticas podem também promover Para se confirmar a natureza endofítica dos isolados,
o crescimento de plantas pela produção de hormônios utilizou-se o método descrito por Assis et al. (1998), porém,
vegetais ou de substâncias análogas (ARSHAD & com modificações. O fragmento de planta, após a terceira
FRANKENBERGER, 1991). lavagem do processo de desinfestação, foi seccionado em
Com relação às doenças, as bactérias endofíticas duas partes. Uma delas foi macerada, conforme já descrito,
mostraram-se eficientes agentes de biocontrole de diversos e a outra foi mergulhada rapidamente em tubo de ensaio
patógenos, tanto de origem fúngica quanto bacteriana contendo o meio 523 líquido e imediatamente retirada. O
(HALLMANN et al., 1997). Dentre eles, Ralstonia material no tubo de ensaio também foi incubado a 28°C e
solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., agente causal da observado, a fim de se comprovar a ausência de
murcha bacteriana do tomateiro (Solanum lycopersicum crescimento de organismos epifíticos. Não havendo
L.) (BARRETTI, 2001; NASCIMENTO, 1998). crescimento bacteriano nesses tubos de ensaio, os
Assim, conduziu-se este trabalho, com os objetivos isolados obtidos pela maceração dos tecidos foram
de avaliar a capacidade de dez isolados previamente considerados endofíticos.
selecionados em promover o crescimento de plantas de
Isolamento de bactérias endofíticas de raízes de tomateiro
tomateiro, bem como averiguar os possíveis mecanismos
envolvidos na promoção de crescimento. As raízes foram cuidadosamente lavadas em água
de torneira, transferidas para frascos contendo solução
MATERIAL E MÉTODOS tampão fosfato-potássio (PB) 0,02M esterilizada (pH 7,0) e
Parte dos isolados de bactérias endofíticas foi submetidas à agitação vigorosa em agitador orbital por 1
obtida no Laboratório de Bacteriologia de Plantas da hora. Essa operação foi repetida por quatro vezes, após a
Universidade Federal de Viçosa (UFV) e parte no troca da solução PB. Em seguida, procedeu-se a
Laboratório de Bacteriologia Vegetal da Universidade desinfestação superficial das raízes com álcool 50% por 30
Federal de Lavras (UFLA). segundos e hipoclorito de sódio 1% por 3 minutos, seguida
Os experimentos foram desenvolvidos em casa-de- de três lavagens em solução PB esterilizada. Para desalojar
vegetação e nos Laboratórios de Bacteriologia Vegetal e da superfície do material vegetal as bactérias epifíticas
Microbiologia do Solo, dos Departamentos de remanescentes, as raízes foram transferidas para frascos
Fitopatologia e Ciência do Solo e instalados na contendo solução PB 0,02M esterilizada (pH 7,0) e
Universidade Federal de Lavras (UFLA), Lavras, MG. submetidas a banho de ultra-som por 10 minutos. Nova
desinfestação superficial das raízes foi feita em hipoclorito
Isolamento de bactérias endofíticas de folhas e caules de de sódio 1% por 3 minutos, seguida de três lavagens em
tomateiro solução PB esterilizada. A seguir, as raízes foram transferidas
Folhas e caules das plantas de tomateiro para frascos com solução PB esterilizada e submetidas a
aparentemente sadias, coletadas em plantios novo banho de ultra-som por 10 minutos.
convencionais e hortas orgânicas nos municípios de A trituração das raízes foi feita em almofariz e pistilo
Lavras, Ribeirão Vermelho, Ijaci, Bom Sucesso, esterilizados contendo PB e o triturado novamente
Nepomuceno, Três Pontas e Viçosa, Minas Gerais, foram submetido a banho de ultra-som por 10 minutos, desta vez
lavadas em água de torneira e enxugadas com papel para desagregação das partículas e células bacterianas.
absorvente. Em seguida, foi feita a desinfestação Procedeu-se a diluição em série em solução PB com fator
superficial com álcool 50%, por 1 minuto, hipoclorito de diluição 1:10. Alíquotas de 100 l das diluições 10-1, 10-2,
sódio 2%, por 6 minutos e lavagem em água destilada 10-3 foram retiradas e transferidas para placas de Petri
esterilizada, por três vezes. Os fragmentos do tecido foram contendo meio Tryptic Soy Agar (TSA) (Difco) e
macerados em água estéril e o macerado deixado em espalhadas com alça de Drigalsky. Foram preparadas cinco
repouso por 15 minutos, para a difusão das bactérias para placas por diluição, que foram incubadas a 28°C durante
a solução (ROMEIRO, 2001). Após esse período, as 48 horas. Após esse tempo, as colônias bacterianas foram
suspensões bacterianas obtidas foram semeadas, pelo transferidas para tubos de ensaio contendo o meio TSA.
método de estrias paralelas, em placas contendo o meio Para confirmar a natureza endofítica dos isolados,
523 de Kado & Heskett (1970) e incubadas a 28°C. Foram 100 l da solução de PB utilizada após o segundo banho de
preparadas cinco placas por fragmento. Todas as colônias ultra-som foram transferidas para placas de Petri, contendo
obtidas foram repicadas para tubos de ensaio, contendo o o meio TSA e incubadas nas mesmas condições para as
meio 523. placas preparadas com as diluições dos triturados. Não
havendo crescimento bacteriano nessas placas dentro de Nova seleção entre os isolados de bactérias endofíticas
48 horas, os isolados obtidos pela trituração das raízes com potencial para promover o crescimento de plantas de
foram considerados endofíticos (NAVES et al., 2004). tomateiro em casa-de-vegetação
Cultivo e preservação das culturas bacterianas obtidas Os isolados de bactérias endofíticas que
proporcionaram aumento significativo da altura das plantas
As culturas bacterianas foram cultivadas em meio
em relação à testemunha foram submetidos a nova seleção
523 e preservadas em peptona-glicerol a -80ºC. Para o uso
em uma única bateria. O delineamento experimental foi blocos
experimental, as bactérias endofíticas foram transferidas
casualizados com 54 tratamentos, quatro repetições e duas
para placas de Petri contendo meio 523 e incubadas a 28ºC
plantas por parcela. Os tratamentos foram constituídos de 53
em câmara de crescimento. Após 48 horas, foram preparadas
isolados e uma testemunha absoluta. A avaliação da altura
as suspensões bacterianas, adicionando-se água de
das plantas foi realizada conforme descrito acima.
torneira e homogeneizando-se com a alça de Drigalsky.
Avaliação do potencial de promoção de crescimento de
Introdução das bactérias endofíticas em plantas de
tomateiro por isolados de bactérias endofíticas
tomateiro
previamente selecionados
A técnica eleita foi o corte do hipocótilo, descrita e
Os isolados endofíticos que proporcionaram as
patenteada por Kijima et al. (1995). Plântulas de tomateiro
maiores alturas foram selecionados para testes posteriores.
cv. Santa Clara, cultivadas em bandejas de isopor, contendo
O delineamento experimental foi blocos casualizados, com
o substrato Plantmax®, foram seccionadas na região do
11 tratamentos, quatro repetições e duas plantas por
hipocótilo quando apresentavam o segundo par de folhas
parcela. Os tratamentos foram constituídos de dez isolados
definitivas. O sistema radicular foi descartado e o restante
e uma testemunha absoluta.
da planta imerso por seis horas, em suspensão de células
As avaliações iniciaram-se 10 dias após a
de cada bactéria endofítica ajustada ao espectrofotômetro
introdução das bactérias endofíticas em plântulas de
para A540=0,2. Posteriormente, as seções da parte aérea
tomateiro e aconteceram semanalmente, durante 45 dias,
foram plantadas em vasos de 3kg de capacidade, contendo
nas quais foram mensuradas a altura e o número de folhas
a mistura de solo, areia e esterco (2:1:1) previamente
e folíolos das plantas. Após o término da sexta avaliação,
fumigada com brometo de metila e permaneceram em casa-
mensurou-se o peso de matéria fresca e seca da parte aérea
de-vegetação até o término do experimento.
e da raiz e a área foliar das plantas.
Seleção de bactérias endofíticas com potencial para
Matéria fresca, área foliar e matéria seca das plantas
promover o crescimento de plantas e controlar a murcha
bacteriana do tomateiro em casa-de-vegetação Ao término das avaliações de altura e do número
de folhas e folíolos, as plantas foram colhidas e separadas
Pela dificuldade em avaliar cento e cinqüenta
isolados de uma só vez, eles foram divididos e testados em em parte aérea e raízes. Em seguida, as partes aéreas foram
quatro baterias distintas, empregando-se 57 isolados na pesadas em balança eletrônica e as raízes cuidadosamente
primeira bateria e 31 nas demais. lavadas em água corrente e em água destilada, secas com
Na primeira bateria, o delineamento experimental papel absorvente e pesadas. Posteriormente, foram
foi inteiramente casualizado com 58 tratamentos, cinco acondicionadas em sacos de papel.
repetições e duas plantas por parcela. Os tratamentos foram Após a obtenção do peso de matéria fresca, as
constituídos por 57 isolados endofíticos e uma testemunha folhas foram cuidadosamente destacadas e digitalizadas.
tratada com água destilada esterilizada (testemunha Suas imagens foram processadas com o programa Quant
absoluta). Na segunda, terceira e quarta baterias, o v. 1.0.1 (VALE et al., 2003), obtendo-se a área foliar total de
delineamento experimental foi inteiramente casualizado com cada planta em cm2.
32 tratamentos, cinco repetições e duas plantas por parcela. Após a obtenção da área foliar, a parte aérea das
Os tratamentos foram constituídos por 31 isolados plantas de tomateiro foi cuidadosamente lavada em água
endofíticos e uma testemunha absoluta. corrente e em água destilada, acondicionada em sacos de
Para avaliar a promoção de crescimento das plantas, papel e seca em estufa (70ºC) até atingir peso constante. O
mediu-se a altura do ponto de inserção das folhas mesmo procedimento de secagem foi empregado para as
cotiledonares até o ápice, dez dias após a introdução das raízes. Em seguida, procedeu-se a pesagem do material,
endofíticas. tanto da parte aérea quanto das raízes.
Detecção de atividade in vitro das bactérias endofíticas Quando estes isolados foram submetidos à nova
selecionadas sobre Ralstonia solanacearum seleção, realizada em uma única bateria, dez isolados
Os isolados de bactérias endofíticas previamente proporcionaram aumento significativo da altura das plantas
selecionados foram cultivados em meio 523 líquido por 24 em relação à testemunha (Tabela 2). Destes, os isolados
horas a 28ºC, transferidos para placas de Petri com meio UFV-E17 e UFLA 06-LS também promoveram a inibição de
523 sólido em quatro pontos eqüidistantes e incubados R. solanacearum (Tabela 2).
por 48 horas a 28ºC. Em seguida, as placas foram invertidas Barretti (2001) verificou em plantas de tomate
e, em cada tampa, adicionou-se 1ml de clorofórmio para tratadas com o isolado UFV-E13 crescimento maior em
matar as colônias. Após 30 minutos, as placas foram relação às plantas não tratadas com a bactéria
entreabertas e deixadas por mais 30 minutos para a completa endofítica. De forma semelhante, Silva (2004) observou
evaporação do clorofórmio. A seguir, adicionou-se uma que a altura de plantas de tomateiro foi afetada pela
sobrecamada de 5ml de meio 523 semi-sólido fundente, introdução de algumas bactérias endofíticas, sendo que
contendo 100 l da suspensão de R. solanacearum. Foram Acinetobacter johnsonii e Bacillus pumilus
preparadas cinco placas para cada isolado. Após a promoveram a maior altura das plantas em 9,5% e 20,2%,
incubação a 28ºC por 48 horas, as placas de Petri foram respectivamente.
examinadas à procura de halos de inibição indicadores de Avaliação do potencial de promoção de crescimento de
antibiose (ROMEIRO, 2001). tomateiro por isolados de bactérias endofíticas
Avaliação da capacidade das bactérias endofíticas O efeito dos isolados endofíticos na promoção de
selecionadas em fixar nitrogênio (N2) crescimento variou em função das variáveis avaliadas
Fragmentos de colônias puras dos isolados (Tabela 3). Estes isolados foram estatisticamente superiores
endofíticos foram inoculados no centro do meio de cultura à testemunha, exceto para a variável número de folíolos
semi-sólido, sem nitrogênio e semi-específico para o (NFL), que não diferiu entre os tratamentos. Os isolados
diazotrófico desejado, ou seja, os meios JNFb, NFb e FAM, UFV-E17, UFV-E27 e Bacillus. cereus (UFV-E29)
para Herbaspirillum sp., Azospirillum sp., e A. apresentaram PMSr 10%, 15% e 15%, respectivamente,
amazonense, respectivamente (DOBEREINER et al., 1995). inferiores ao da testemunha (100%).
Foram preparados três frascos para cada isolado, os quais De maneira geral, os maiores incrementos foram
foram incubados a 28ºC por 10 dias. O crescimento proporcionados pelo isolado UFV-E49, cujos aumentos
bacteriano foi avaliado observando-se a presença ou na altura (ALT), área foliar (AF), número de folhas (NF),
ausência de uma película formada nos meios de cultura. peso da matéria fresca (PMFa) e seca da parte aérea
Análise Estatística (PMSa), peso da matéria fresca (PMFr) e seca das raízes
(PMSr) foram 23,40%, 105,80%, 19,53%, 42,40%, 61,64%,
Os dados de altura, número de folhas e folíolos, 100% e 225%, respectivamente, maiores do que a
área foliar, peso de matéria fresca e seca, tanto da parte testemunha (100%). Este isolado não diferiu do UFLA
aérea quanto da raiz das plantas foram submetidos à análise 11-LS para os parâmetros ALT e NF (Tabela 3). Frommel
de variância, no programa SISVAR (FERREIRA, 2000). As et al. (1991) verificaram que o isolado não fluorescente
médias entre os tratamentos foram agrupadas pelo teste F, de Pseudomonas sp., PsJN, induziu aumento
a 5% de probabilidade. As variáveis, cujos efeitos de significativo no número de raízes de batateira (24% a
tratamentos foram significativos, foram submetidas ao teste 196%), no peso de matéria seca de raiz (44% a 211%), no
Scott-Knott.
comprimento do caule (26% a 28%), na formação de
RESULTADOS E DISCUSSÃO pêlos foliares (55% a 110%) e no conteúdo total de
lignina (43%).
Seleção de bactérias endofíticas com potencial para De maneira semelhante, Chanway (1997) obteve
promover o crescimento de plantas de tomateiro aumentos de 33% e 57% na biomassa de plântulas de
Durante a seleção de bactérias endofíticas com pinheiro tratadas com os isolados PW2 e SM3-RN de
potencial para controlar a murcha bacteriana, realizada em Bacillus polymyxa e Pseudomonas chloroaphis,
quatro baterias distintas, observou-se que 53 isolados respectivamente. O autor também relatou aumentos na
promoveram o crescimento do tomateiro em relação à altura e no comprimento de raízes das plântulas inoculadas
testemunha inoculada com água (Tabela 1). com estes isolados variando entre 23% e 132%.
Tabela 1 Altura de plantas de tomateiro previamente tratadas com diferentes isolados de bactérias endofíticas.
Isolados Altura (cm)
1 Ensaio 2 Ensaio 3 Ensaio 4 Ensaio
UFV-E02 7,75 d 1 - - -
UFV-E06 7,34 d - - -
UFV-E10 6,99 d - - -
UFV-E13 7,87 d - - -
UFV-E14 7,33 d - - -
UFV-E15 7,41 d - - -
UFV-E17 8,57 c - - -
UFV-E21 8,39 c - - -
UFV-E22 8,45 c - - -
UFV-E24 7,72 d - - -
UFV-E25 10,55 a - - -
UFV-E26 10,94 a - - -
UFV-E27 8,79 c - - -
UFV-E28 7,94 d - - -
B. cereus (UFV-E29)2 8,99 c - - -
UFV-E31 7,64 d - - -
UFV-E33 6,96 d - - -
UFV-E35 6,94 d - - -
UFV-E37 6,14 e - - -
UFV-E39 6,41 e - - -
UFV-E40 6,15 e - - -
UFV-E42 6,38 e - - -
UFV-E45 9,23 c - - -
UFV-E48 7,75 d - - -
UFV-E49 11,07 a - - -
UFV-E51 9,46 b - - -
UFV-E53 6,26 e - - -
UFV-E54 8,01 d - - -
UFV-E57 6,99 d - - -
UFLA 01-LS - 7,24 c - -
UFLA 02-LS - 8,53 b - -
UFLA 03-LS - 7,8 c - -
UFLA 04-LS - 8,89 b - -
UFLA 07-LS - 11,64 a - -
UFLA 08-LS - 7,84 c - -
UFLA 09-LS - 8,37 b - -
UFLA 11-LS - 8,13 b - -
Continua...
Tabela 1 Continuação...
UFLA 31-TP - 7,66 c - -
UFLA 48-TP - - 8,04 a -
UFLA 51-TP - - 7,92 a -
UFLA 54-TP - - 8,45 a -
UFLA 55-TP - - 7,74 a -
UFLA 56-TP - - 7,93 a -
UFLA 57-TP - - 9,08 a -
UFLA 67-IJ - - 7,81 a -
UFLA 73-IJ - - 7,90 a -
UFLA 81-IJ - - - 7,82 a
UFLA 82-IJ - - - 8,74 a
UFLA 83-IJ - - - 7,98 a
UFLA 84-IJ - - - 9,08 a
UFLA 87-IJ - - - 8,02 a
UFLA 97-BS - - - 8,12 a
UFLA 106-RV - - - 7,92 a
Testemunha 6,07 f 6,41 d 7,69 b 7,20 b
1
Médias seguidas por letras distintas na coluna diferem entre si, pelo teste Scott-Knott, a 5% de probabilidade
2
Isolado identificado pela análise do perfil de ácidos graxos da membrana bacteriana.
Tabela 2 Altura de plantas de tomateiro tratadas com isolados de bactérias endofíticas após a segunda seleção e
efeito dos isolados sobre Ralstonia solanacearum (in vitro).
Isolados Altura (cm) Inibição in vitro à R. solanacearum
1
UFV-E49 21,26 a -
UFV-E25 20,31 a -
UFLA 08-LS 20,27 a -
UFV-E27 18,71 a -
UFV-E26 18,40 a -
B. cereus 18,38 a -
UFV-E22 18,16 a -
UFV-E17 17,95 a +
UFLA 06-LS 17,24 a +
UFLA 11-LS 17,17 a -
Testemunha 16,11 b
(+): Presença de halo de inibição; (-): Ausência de halo de inibição
1
Médias seguidas por letras distintas na coluna diferem entre si, pelo teste Scott-Knott, a 5% de probabilidade.
Altura, 3área foliar, 4número de folhas, 5número de folíolos, 6peso de matéria fresca da parte aérea, 7peso de matéria seca da parte aérea, 8peso de matéria fresca da raiz
Detecção de atividade in vitro das bactérias endofíticas
selecionadas sobre Ralstonia solanacearum
Dos dez isolados submetidos ao teste para
detecção de antibiose, verificou-se que somente os
isolados UFV-E17 e UFLA 06-LS inibiram o patógeno
desafiante (Tabela 2).
Vários mecanismos estão envolvidos na promoção
de crescimento das plantas por bactérias endofíticas. Estes,
porém, podem ser divididos em diretos e indiretos. Quando
o estímulo do crescimento das plantas é direto, o
antagonista produz fitormônios ou substâncias análogas
destes reguladores de crescimento capazes de estimular o
desenvolvimento das plantas (BASHAN & HOLGUIN,
1997). Quando o estímulo é indireto, o crescimento é
estimulado pela redução da população de microrganismos
deletérios ou patogênicos às plantas, ou seja, pelo controle
Médias seguidas por letras distintas na coluna diferem entre si, pelo teste Scott-Knott, a 5% de probabilidade
CONCLUSÕES
Cinqüenta e três isolados de bactérias endofíticas
agiram como promotores de crescimento de plantas de
tomateiro, sendo que o isolado UFV-E49 promoveu o maior
10
1
2
crescimento, propiciando maior altura, área foliar, número leguminosas. Brasília, DF: Embrapa/SPI; Itaguaí: Embrapa/
de folhas e peso da matéria fresca e seca, tanto da parte CNPAB, 1995. 60 p.
aérea quanto da raiz.
Os resultados negativos para a fixação de nitrogênio FERREIRA, D. F. Análises estatísticas por meio do SISVAR
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