Aline de Marco Viott

“Prevalência de enteropatógenos em suínos de recria/terminação em Minas Gerais e

desenvolvimento de modelo experimental murino de enteropatia proliferativa”

Tese apresentada no curso de Doutorado em Ciência

Animal da Escola de Veterinária da UFMG, como
requisito parcial para obtenção do grau de Doutor(a)
em Ciência Animal na área de Patologia Veterinária,
sob a orientação do Prof° Roberto Maurício Carvalho
Guedes

Belo Horizonte
Escola de Veterinária - UFMG
2010
2
Tese defendida em 29 de janeiro de 2010, e avaliada pela comissão examinadora constituída por:

Prof. Roberto Maurício Carvalho Guedes

(Orientador)

Dr. José Lúcio dos Santos

Profa. Zélia Inês Portela Lobato

Prof. Marcos Bryan Heinemann

Profa. Andrea Micke Moreno

3
4
 Dedicado á Benicia Fátima Viott e
a Everton Poletto...”you make me happy
when skies are gray”.

AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus e aos espiritos de luz que me acompanharam durante toda minha jornada de
vida e trabalho. Fonte de paz e conforto nas horas de dificuldade. Agradeço a minha mãe, por fazer dos
meus sonhos, seus principais objetivos, não medindo esforços para que eles se tornassem realidade. Sem
sua dedicação e amor incondicional eu sei que não chegaria até aqui. Ao Everton pelo apoio, paciência e
amor “... você é algo assim, é tudo pra mim...é mais do que eu sonhava”. Ao seu Walter, dona Regina,
Eveline, Ilizandro e “mãezinha” Maria Helita pelo apoio e carinho. Vocês dão um brilho especial a minha
vida!

Agradeço ao meu orientador Prof° Roberto Guedes pela oportunidade oferecida. Muito obrigada
pela amizade, atenção e dedicação oferecidas durante os quatro anos de doutorado. A profa Roselene Ecco
pela amizade e pelo carinho durante a minha vivência em Belo Horizonte. Aos demais professores do
laboratório de patologia veterinária, Rogéria Serakides, Ernane F. Nascimento e Renato Lima Santos pela
ótima convivência e pelos conhecimentos transmitidos. Um agradecimento especial ao prof° Andrey
Pereira Lage, muito obrigada pela ajuda.

Aos amigos e tecnicos do laboratório e da escola de veterinária, cúmplices das dificuldades

diárias, muito obrigada pela ajuda, pelos momentos agradáveis, pelo ombro amigo e pel as piadas nas
horas de tristeza. Um agradecimento especial para a Tatiane A. Paixão, Alcina V. Carvalho Neta, Erica
Costa, Adriana, Eduardo Couland, Juliana Oliveira, Mirella C. Costa, Fabio Vanucci, Silvia França,
Núbia Macedo, Jankerle Boeloni e Marina Rios vocês são muito especiais para mim.

A minha família Belo Horizontina, Joana (Jô), Catarina (Cati), Moises (Mosega), e Lilian. A
nossa convivência diária tornou meus dias mais fáceis, as dificuldades menores e o meu coração maior.
Muito obrigada!

Aos veterinários e técnicos que auxiliaram nas coletas, meu muito obrigada.

A universidade federal de Minas Gerais –UFMG e a escola de veterinária muito obrigada por me
acolher durante os quatro anos de doutorado. Agradeço ao CNPq e a FAPEMIG pelo apoio financeiro.

5
 SUMÁRIO

RESUMO............................................................................................................................... 11
ABSTRACT............................................................................................................................ 11
INTRODUÇÃO GERAL..................................................................................................... 11

1. Capítulo 1 - Agentes enteropatogênicos causadores de diarreia em suínos de recria e

terminação – Revisão de
Literatura.............................................................................................................................. 12
1.1 INTRODUÇÃO.................................................................................................................... 12
1.2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................................ 12
1.2.1 Diarreia em suínos de recria e
terminação.............................................................................................................................. 12
2. Capítulo 2 - Prevalência de agentes enteropatogênicos envolvidos com diarreia em
suínos de recria e terminação no estado de Minas
Gerais..................................................................................................................................... 25
2.1 RESUMO............................................................................................................................... 25
2.2 INTRODUÇÃO.................................................................................................................... 26
2.3 MATERIAL E METODOS................................................................................................. 27
2.3.1 Granjas, animais e coleta de fezes.......................................................................................... 27
2.3.2 Metodologia empregada no Isolamento de Salmonella spp................................................... 27
2.3.3 Metodologia empregada no isolamento de colônias Lactose positiva sugestivas de
Escherichia coli ..................................................................................................................... 28
2.3.4 Detecção de Lawsonia intracellularis, Brachyspira hyodysenteriae e Brachyspira
pilosicoli pela PCR Multiplex................................................................................................ 29
2.3.5 Detecção de Escherichia coli enterotoxigênica..................................................................... 30
2.3.6 Exame parasitológico para Trichuris suis.............................................................................. 31
2.3.7 Avaliação histológica............................................................................................................. 31
2.3.8 Imuno-histoquímica................................................................................................................ 31
2.3.9 Analise estatística................................................................................................................... 32
2.4 RESULTADOS..................................................................................................................... 33
2.4.1 Salmonella spp........................................................................................................................ 33
2.4.2 Lawsonia intracellularis, Brachyspira pilosicoli e Brachyspira hyodysenteriae.................. 34
2.4.3 Escherichia coli (E. coli) enterotoxigênica............................................................................ 35
2.4.4 Trichuris suis.......................................................................................................................... 36
2.4.5 Infecções Mistas..................................................................................................................... 38
2.4.6 Histopatologia e Imuno-histoquímica.................................................................................... 38
2.5 DISCUSSÃO......................................................................................................................... 41
2.6 CONCLUSÃO...................................................................................................................... 44
3. Capitulo 3 - Desenvolvimento de modelo experimental murino para enteropatia
proliferativa (Lawsonia intracellularis), utilizando homogeneizado de mucosa
intestinal e cultura pura....................................................................................................... 44
3.1 RESUMO............................................................................................................................... 44
3.2 INTRODUÇÃO.................................................................................................................... 44
3.3 MATERIAL E METODOS................................................................................................. 46
3.3.1 Camundongos......................................................................................................................... 46
3.3.2 Inoculos.................................................................................................................................. 46
3.3.3 Quantificação do inoculo........................................................................................................ 47
3.3.4 Bioensaio em Hamster............................................................................................................ 47
3.3.5 Delineamento experimental.................................................................................................... 47
3.3.6 Histologia e Imuno-histoquimica........................................................................................... 47
3.3.7 Detecção de L. intracellularis nas fezes dos camundongos.................................................... 48
3.3.8 Analise Estatística.................................................................................................................. 48

6
3.4 RESULTADOS..................................................................................................................... 48
3.4.1 Histopatologia e IHQ.............................................................................................................. 49
3.4.2 Resultados Nested PCR.......................................................................................................... 51
3.4.3 Resultados da Analise Estatística........................................................................................... 51
3.5 DISCUSSÃO......................................................................................................................... 56
3.6 CONCLUSÃO....................................................................................................................... 57
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS............................................................................... 57
5. ANEXOS............................................................................................................................... 67

LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Número de propriedades coletadas de cada região relacionada com o número de
matrizes................................................................................................................................... 33

Tabela 2 - Distribuição da prevalência encontrada de sorotipos não patogênicos de Salmonella

diarreia no estado de Minas Gerais de acordo com o tamanho do rebanho e região
considerando positividade da granja dentre as 46
avaliadas................................................................................................................................. 34

Tabela 3 - Distribuição da prevalência encontrada no estado de Minas Gerais de acordo com o

tamanho do rebanho, região e enteropatógeno; Lawsonia intracellularis, Brachyspira
pilosicoli, E. coli enterotoxigênica, Salmonella iarréia sorotipo Typhimurium e
infecção mista considerando positividade da granja dentre as 46
avaliadas................................................................................................................................. 37

Tabela 4 - Distribuição das amostras positivas para E. coli enterotoxigênica de acordo com os
genótipos observados, região e tamanho das granjas............................................................. 38

Tabela 5 - Resultados individuais das lesões histopatológicas, marcação imunistoquímica e

resultados da PCR do pool de fezes das diferentes linhagens de camundongos inoculadas
com homogeneizado de mucosa e cultura pura, contendo L. intracellularis, nos dias 7, 14,
21 e 28 pós inoculação (dpi)................................................................................................... 53

LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Características das Brachyspiras spp. Intestinais dos suínos................................................. 17

Quadro 2 - Primers para fatoress de virulência de Escherichia coli........................................................ 31

LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Idade de maior ocorrência das principais diarreias dos suínos nas fases de recria e
terminação. * EPH- Enteropatia proliferativa hemorrágica, forma aguda da infecção por
L. intracellularis, até 360 dias de idade. Fonte: modificado de Barcellos (2001)................. 14

Figura 2 - Suíno, intestino delgado, íleo, macroscopia da forma aguda de infecção por Lawsonia
intracellularis. Observa-se espessamento e engrossamento da serosa intestinal com áreas
multifocais a coalescentes de hemorragia (seta). Fonte: Prof. Roberto
Guedes.................................................................................................................................... 15
Figura 3 - Suíno, intestino delgado, íleo, macroscopia da forma crônica de infecção por Lawsonia
intracellularis. Observa-se espessamento da mucosa intestinal (seta). Fonte: Prof. Roberto
Guedes.................................................................................................................................... 15

7
Figura 4 - Suíno, intestino delgado. Detecção imuno-histoquímica de Lawsonia intracellularis,
observa-se marcação no ápice dos enterócitos da cripta intestinal (seta) e em macrófagos
na lâmina própria (asterisco) (IHQ 40X). Fonte: Prof. Roberto
Guedes.................................................................................................................................... 16

Figura 5 - Suíno colón. Lesão microscópica de colite espiroquetal. Cólon observa-se inúmeras
bactérias (B. pilosicoli) aderidas aos enterócitos (seta), “falso bordo em escova” (HE,
40X). Fonte: Prof. Roberto Guedes........................................................................................ 18

Figura 6 - A) Suíno de terminação com diarreia, em uma granja com 101-500 matrizes da região sul
e sudoeste de Minas Gerais. B) Presença de fezes diarréicas no piso da baia da granja da
figura A. Nessa propriedade foram identificadas amostras de fezes positivas para L.
intracellularis e casos de coinfecção de L. intracellularis com E. coli enterotoxigênica e
PCV-2..................................................................................................................................... 33

Figura 7 - Gel de agarose a 1%. A) Teste de sensibilidade analítica da B. pilosicoli. Kb marcador de

pares de base (100pb). Observa-se a detecção da bactéria até a concentração de 103
bact/ml. B e C) Resultado do teste de sensibilidade analítica da L intracellularis e da B
hyodysenteriae, respectivamente. As bactérias apresentaram sensibilidade de detecção de
104 bact/ml. Kb marcador de pares de base (100pb). D) Teste de sensibilidade analítica da
PCR multiplex para B pilosicoli, L intracellularis e B hyodysenteriae, observa-se que
quando as três bactérias são adicionadas a PCR a sensibilidade analítica é 104 bact/ml. Kb
marcador de pares de base (100pb)........................................................................................ 35

Figura 8 - Gel de agarose a 1%. PCR Multiplex Gel de agarose a 1% mostrando o tamanho dos
produtos da PCR de algumas amostras coletadas a campo, B pilosicoli 823 pb; L.
intracellularis 655 pb; B. hyodysenteriae 354 pb; Kb, marcador de pares de base (100pb),
C+, controle positivo e C-, controle negativo. Linhas 1, 2, 11, infecção mista por B.
pilosicoli e L. intracellularis; 3, B. pilosicoli; 4, 7, 9, 10, L. intracellularis; 5, 6, 8,
amostras negativas.................................................................................................................. 36

Figura 9 - Gel de poliacrilamida a 6%. PCR multiplex dos fatores de virulência para E. coli
enterotoxigenica. Produtos da PCR de algumas amostras coletadas a campo (linhas 5 a 8).
Kb marcador de pares de base (100pb); controle 1 (C1) [STx2e (733 pb) - F18 (313 pb) -
StaP (158 pb) -Stb (113 pb)];controle 2 (C2) [K88 (499 pb)- LT (272 pb) -Stb (113pb)];
controle 3 (C3) [987p (409 pb) e-StaP (158 pb)]; controle 4 (C4) [F41 (612 pb)- K99 (230
bp)- StaP (158 pb)]; controle negativo C-; 5, 8 E. coli não enterotoxigênica; 6,7, amostras
positivas para E. coli enterotoxigênica, fimbria F18 (313 pb) e toxinas termo estáveis StaP
(158 pb) e Stb (113
pb)........................................................................................................................................... 36

Figura 10 - Lesão histológica de enteropatia proliferativa (L. intracellularis). A) Ceco. Observa-se

proliferação difusa das criptas intestinais (setas), com espessamento da mucosa, HE, 4X.
B) Nas criptas observa-se grande quantidade de enterócitos jovens (seta) com ausência de
células caliciformes e restos celulares no lúmen (cabeça de seta), HE, 40X. C) Observa-se
marcação positiva (vermelho) para o antígeno da L. intracellularis, no ápice do
citoplasma dos enterócitos das criptas intestinais (setas), IHQ,
20X......................................................................................................................................... 39

Figura 11 - Lesões histológicas de salmonelose (S. enterica sorotipo Typhimurium). A) Cólon

necrose da mucosa intestinal com a formação de uma membrana fibrino necrótica (cabeça
de seta) sobre a área de lesão, HE, 20X. B) Observa-se com maior detalhe os restos
celulares composto em sua maioria por neutrófilos degenerados entremeados à fibrina
(asterisco), HE, 40X............................................................................................................... 40

8
Figura 12 - Lesão histológica de colite espiroquetal (B. pilosicoli). A) Observa-se grande quantidade
de bactérias aderidas perpendicularmente a mucosa, formando um “falso bordo em
escova” (seta), HE, 20X. B) Há marcação imuno-histoquímica positiva (vermelho) nas
bactérias aderidas a mucosa intestinal (seta), IHQ, 40X........................................................ 40

Figura 13 - Lesões histológicas de circovirose (PCV2). A) Enterite granulomatosa difusa acentuada,

há grande quantidade de macrófagos, macrófagos epitelióides e células gigantes (seta) na
lâmina própria, HE, 20X. B) Observam-se as células do infiltrado granulomatoso em
maior detalhe, notar a grande quantidade de células gigantes (setas), HE, 40X. C)
Marcação imuno-histoquímica positiva para PCV-2, no interior dos macrófagos (cabeça
de seta) e células gigantes na lâmina própria (seta),
IHQ......................................................................................................................................... 41

Figura 14 - Inoculação intragastrica, utilizando agulha de gavage, de um camundongo da linhagem

Swiss com homogeneizado de mucosa contendo Lawsonia
intracellularis......................................................................................................................... 47

Figura 15 - Lesão macroscópica de L. intracellularis (Enteropatia Proliferativa) em um camundongo

da linhagem DB-A 14 dias após a inoculação. Observa-se espessamento da alça intestinal
(Íleo) com rugosidade acentuada na serosa
(setas)..................................................................................................................................... 49

Figura 16 - Enteropatia proliferativa. A) Camundongo Swiss, ileo, 7 dias pós inoculação. Observa-se
proliferação multifocal leve multifocal das criptas intestinais com ausência de células
caliciformes e grande quantidade de enterócitos jovens (seta), HE, 4X. B) Camundongo,
Swiss, íleo, 14 dias pós inoculação. Há hiperplasia difusa acentuada das criptas intestinais
(setas) com ausência de células caliciformes, espessamento da mucosa e enterócitos
jovens, HE, 20X. C) Camundongo, Swiss, ceco, 7 dias pós inoculação. Observa-se
marcação imuno-histoquímica focal leve (seta), IHQ, 40X. D) Camundongo, Swiss, ileo,
14 dias pós inoculação. Há marcação difusa acentuada para o antígeno de Lawsonia
intracellulares, nas criptas (seta) e na superfície da mucosa intestinal, IHQ, 4X.................. 50

Figura 17 - Enteropatia proliferativa. A) Camundongo C-57 Black 6, ileo, 14 dias pós inoculação. Há
hiperplasia focal leve das criptas intestinais (seta) com ausência de células caliciformes e
grande quantidade de enterocitos jovens, HE, 4X. B) Camundongo, C-57 BLACK 6, ileo,
14 dias pós inoculação. Há marcação imuno-histoquímica leve para o antígeno da
Lawsonia intracellularis, IHQ, 40X....................................................................................... 51

Figura 18 - Enteropatia proliferativa. A) Camundongo DB-A, ileo, 14 dias pós inoculação. Observa-
se espessamento difuso acentuado da mucosa intestinal com hiperplasia das criptas
intestinais (seta), HE, 4X. B) Lesão histológica de enteropatia proliferativa em um
camundongo, DB-A, ileo, 21 dias pós inoculação. Há hiperplasia difusa moderada das
criptas intestinais (setas), HE, 20X. C) Camundongo, DB-A, ceco, 14 dias pós inoculação.
Observa-se marcação imunoístoquimica difusa acentuada, no ápice das células das criptas
intestinais (seta), IHQ, 4X. D) Camundongo, DB-A, ileo, 21 dias pós inoculação. Há
marcação imunoístoquimica multifocal moderada, no ápice das células da cripta intestinal
(seta), IHQ, 40X..................................................................................................................... 52

Figura 19 - Enteropatia proliferartiva. Camundongo, Swiss, ileo, 7 dias pós inoculação com cultura
pura de L. intracellularis. Observa-se marcação imuno-histoquímica multifocal acentuada
no ápice das vilosidades intestinais (enterócitos maduros) (setas), IHQ,
40X......................................................................................................................................... 54

9
Figura 20 - Enteropatia proliferativa. A) Camundongo DB-A, ceco, 28 dias pós inoculação. Observa-
se hiperplasia difusa acentuada das criptas intestinais próximas as placa de Peyer (seta),
HE, 20X. B) Camundongo, DB-A, ileo, 28 dias pós inoculação. Há marcação imuno-
histoquímica multifocal leve nos enterócitos que recobrem a placa de Peyer (setas), IHQ,
20X......................................................................................................................................... 54

Figura 21 - A) Gel de agarose a 1%, Nested PCR, 7 dias após a inoculação. Da esquerda para direita:
Kb, marcador de peso molecular; C-, controle negativo; C+, controle positivo Lawsonia
intracellularis (218 pb); 1, controle negativo Swiss; 2, Swiss inoculado com
homogeneizado de mucosa; 3, Swiss inoculado com cultura pura; 4, controle negativo
BALB/C; 5, BALB/C inoculado com homogeneizado de mucosa; 6, BALB/C inoculado
com cultura pura; 7, controle negativo C-57 BLACK 6; 8, C-57 BLACK 6 inoculado com
homogeneizado de mucosa; 9, C-57 BLACK 6 inoculado com cultura pura; 10, controle
negativo DB-A; 11, DB-A inoculado com homogeneizado de mucosa; 12, DB-A
inoculado com cultura pura. Observe as bandas positivas nas linhas 3, 9, 11 e 12. B) Gel
de agarose, Nested PCR, 14 dias após a inoculação. Numeração idêntica à figura 21A.
Observe as bandas positivas nas linhas 2, 3, 5, 6, 9, 11 e 12................................................. 55

Figura 22 - A) Gel de agarose a 1%, Nested PCR, 21 dias após a inoculação. Da esquerda para direita:
Kb, marcador de peso molecular; C-, controle negativo; C+, controle positivo Lawsonia
intracellularis (218 pb); 1, controle negativo Swiss; 2, Swiss inoculado com
homogeneizado de mucosa; 3, Swiss inoculado com cultura pura; 4, controle negativo
BALB/C; 5, BALB/C inoculado com homogeneizado de mucosa; 6, BALB/C inoculado
com cultura pura; 7, controle negativo C-57 BLACK 6; 8, C-57 BLACK 6 inoculado com
homogeneizado de mucosa; 9, C-57 BLACK 6 inoculado com cultura pura; 10, controle
negativo DB-A; 11, DB-A inoculado com homogeneizado de mucosa; 12, DB-A
inoculado com cultura pura. Observe as bandas positivas nas linhas 11 e 12. B) Gel de
agarose, Nested PCR, 28 dias após a
inoculação............................................................................................................................... 55

10
 RESUMO

A prevalência de enteropatógenos em suínos de recria e terminação, bem como a susceptibilidade de

quatro diferentes linhagens de camundongos (Swiss, BALB/c, C-57 BLACK 6 e DB-A) a infecção por
Lawsonia intracellularis foram investigadas. Quarenta e seis rebanhos foram selecionados nas quatro
maiores regiões produtoras de suínos no estado de Minas Gerais. Das 46 propriedades analisadas
constatou-se que a prevalência geral dos rebanhos com L. intracellularis, Salmonella enterica sorotipo
Typhimurium e E. coli enterotoxigênica foi 19,56%, 6,52%, 10,87%, respectivamente. Infecções mistas
foram diagnosticadas em 30,43% dos rebanhos analisados, e a coinfecção com L. intracellularis e a S.
enterica sorotipo Typhimurium foi a mais frequente (10,87%). Brachyspira pilosicoli foi diagnosticada
em somente dois rebanhos, sempre associada com infecções mistas. Brachyspira. hyodysenteriae e
Trichuris suis não foram identificados em nenhuma amostra analisada. Cento e sessenta camundongos (n
= 40, por linhagem) foram inoculados por via gástrica com cultura pura e homogeneizado de mucosa
contendo L. intracellularis. Dois animais da linhagem DB-A exibiram lesões macroscópicas 14 dias pós-
inoculação. Todas as linhagens de camundongos avaliadas apresentavam lesões histológicas de
enteropatia proliferativa e IHQ positiva, com variações na intensidade das lesões. As lesões mais graves
foram observadas em camundongos DB-A e Swiss inoculados com cultura pura. A eliminação nas fezes
de L. intracellularis foi observada, por Nested PCR, em todas as linhagens com algumas variações.

Palavras-chave: suíno, recria e terminação; prevalência; enteropatia proliferativa; Lawsonia

intracellularis; modelo experimental; camundongos.

ABSTRACT

The prevalence of Lawsonia intracellularis, Brachyspira pilosicoli, Brachyspira hyodysenteriae,

Salmonella spp., enterotoxigenic E. coli, Trichuris suis and the occurrence of mixed infections was
investigated, as well as the susceptibility of four different mice strains (Swiss, BALB / c, C-57 BLACK 6
and DB-A) to L. intracellularis infection. Forty-six herds were selected in the four main swine production
regions in the state of Minas Gerais. The overall herd prevalence of L. intracellularis, Salmonella enterica
serotype Typhimurium and enterotoxigenic E. coli were 19,56%, 6,52%, 10,87% respectively. Mixed
infection was diagnosed in 30,43% of herds, and L. intracellularis and Salmonella enterica serotype
Typhimurium are the main pathogens association (10,87%). Brachyspira pilosicoli was diagnosed only in
two herds, always associated with mixed infections. B. hyodysenteriae and Trichuris suis were not
identified in any samples analyzed. One hundred sixty mice (n = 40 per strain) were intragastrically
inoculated with pure culture or mucosa homogenate containing L. intracellularis. Two DB-A mice
exhibited gross lesions at 14 days after inoculation. All mice strains studied showed histological lesions
of proliferative enteropathy and positive IHC, varying according to the intensity of the lesion. The most
severe lesions were observed in DB-A and Swiss mice inoculated with pure culture. The elimination in
feces of L. intracellularis was observed, by Nested PCR, in all lines with some variations.

Keywords: growing and finishing pig, prevalence, proliferative enteropathy, Lawsonia intracellularis,
epidemiology; mice.

INTRODUÇÃO GERAL agentes no rebanho suíno do estado de Minas

Gerais, o quarto maior produtor suinícola do
No primeiro capítulo desta tese faz-se Brasil. Para isso foram analisadas granjas de
uma revisão de literatura abrangendo os ciclo completo com diarreia ou com histórico de
principais agentes causadores de diarreia em diarreia em quatro regiões diferentes no estado.
suínos de recria e terminação. Devido aos dados
epidemiológicos escassos desses Com a padronização de novas técnicas
enteropatógenos no Brasil, no segundo capítulo, no laboratório de Patologia Molecular da
realizou-se um estudo epidemiológico desses UFMG, realizou-se a pesquisa de sete agentes

11
enteropatogênicos incluindo cinco bactérias ser potencialmente patogênicas para os
(Salmonella spp., L. intracelullaris, B. humanos, representando um risco para saúde
pilosicoli, B. hyodysenteriae e E. coli pública (Weiss et al., 1999).
enterotoxigênica), um parasita (T. suis) e um
vírus (PCV2). Assim sendo, acredita-se que o As infecções entéricas podem levar a
desenvolvimento de técnicas laboratóriais e altas taxas de mortalidade e morbidade em
estudos sobre prevalência e epidemiologia dos qualquer faixa etária, entretanto, as maiores
patógenos causadores de doenças em suínos no perdas são observadas nas fases de recria e
estado de Minas Gerais e, consequentemente, no terminação onde frequentemente cursam com
Brasil sejam imperativos para o contínuo seqüelas no trato gastrintestinal (McOrist e
sucesso e crescimento da suinocultura estadual e Gebhart, 1999). Estas lesões podem ser
nacional. permanentes ou transitórias, resultando em
expressivo atraso no crescimento, na redução da
A Lawsonia intracelluaris é uma eficiência alimentar e no custo com tratamentos
bactéria de extrema importância no nosso e alimentação adicionais, respondendo por 60%
sistema de produção (Moreno et al., 2002). dos gastos com antimicrobianos na suinocultura
Consequentemente aprofundamos nosso estudo moderna (Jacobson et al., 2005; Pearce, 1999).
nesse agente, analisando, no terceiro capítulo, a
susceptibilidade de diferentes linhagens de As principais bactérias associadas à
camundongos a infecção por L. intracellularis patogênese das enterites nas fases finais de
utilizando-se homogeneizado de mucosa produção são a Salmonella spp. (Schwuartz,
intestinal e cultura pura. A epidemiologia da 2000), Brachyspira hyodysenteriae,
enteropatia proliferativa, doença causada pela L. Brachyspira pilosicoli (Hampson e Trott, 1999)
intracellularis, é pouco conhecida. Os principais e a Lawsonia intracellularis (McOrist e
objetivos deste estudo foram (1) o de avaliar o Gebhart, 1999). Alguns trabalhos vêm
papel de espécimes de roedores na disseminação demonstrando a importância da Escherichia coli
da doença, já que esses animais, na grande enteropatogênica (Bertschinger & Fairbrother,
maioria das granjas, co-habitam as instalações 1999, Jacobson et al., 2003) em animais
com os suínos; (2) e desenvolver um possível terminados e citações mais antigas levantam a
modelo experimental animal que facilite o importância do parasita Trichuris suis nas fases
estudo da patogenia da L. intracellularis, que de recria e terminação (Batte et al., 1977).
ainda é pouco conhecida. Recentemente, a ocorrência de infecções
entéricas mistas vêm sendo avaliada
principalmente nos rebanhos de terminação com
1. Capítulo 1:
baixo desempenho. O objetivo desse capítulo é
realizar uma revisão de literatura atualizada
Agentes enteropatogênicos causadores de sobre os principais enteropatógenos causadores
diarreia em suínos de recria e terminação de diarreia em suínos de recria e terminação.
– Revisão de Literatura
1.2 REVISÃO DE LITERATURA

1.1 INTRODUÇÃO
1.2.1 Diarreia em suínos de recria e
As infecções bacterianas entéricas em terminação
suínos têm importância crescente e são Nas fases de recria e terminação
frequentemente observadas em diferentes faixas espera-se que os suínos tenham um bom
etárias, provocando um grande impacto para crescimento, representado por adequado ganho
indústria de suínos em todo o mundo (Jacobson de peso diário e boa conversão alimentar. Além
et al., 2005). Estas infecções são responsáveis disso, devem chegar ao abate dentro do tempo
por aproximadamente 30% das perdas programado, atendendo as necessidades da
econômicas na suinocultura moderna (Burch, indústria em peso, qualidade de carcaça e pouca
2000). Além disso, algumas etiologias podem variação no desenvolvimento dos animais de um

12
mesmo lote. Portanto, a eficiência produtiva demonstrou que entre as variáveis estudadas
dessa fase é medida por parâmetros como, taxa (sexo, peso a entrada do crescimento, doenças
de mortalidade, ganho de peso dos animais, em geral), os animais que tiveram episódios de
uniformidade do rebanho e ocorrência de diarreia na fase de terminação apresentaram 4,5
doenças (Almeida, 2008). Dentre as doenças vezes mais chances de ter baixo peso ao abate.
que afetam o rebanho suíno destacam-se as
infecções entéricas, que diminuem Na fase de crescimento a diarreia em
sensivelmente os índices zootécnicos do plantel, suínos tem uma determinação complexa
principalmente quando presente nas fases finais (multifatorial), dependendo da interação de
de produção (Almeida 2009). agentes infecciosos com a qualidade do
ambiente, grau de imunidade de rebanho e
As afecções entéricas são um problema outras variáveis relacionadas à população de
comum nos sistemas de criação de suínos em micro-organismos intestinais e composição da
todo o mundo. Essas doenças têm um grande alimentação (Barcellos et al., 2003). As causas
impacto, pois causam perdas por mortalidade, são muitas e exigem avaliações aprofundadas
reduzem a conversão alimentar, acarretando em cada sistema de criação, para identificá-las e
perda de peso e refugos, aumentando o custo da tomar medidas corretivas (Almeida, 2008). A
produção em função da aquisição de medida de controle mais usualmente adotada é a
medicamentos (Baccaro et al., 2003; Jacobson utilização de agentes antimicrobianos na ração
et al., 2005). Procurando identificar os fatores de forma preventiva ou terapêutica o que requer
que contribuem para a falta de uniformidade de uma precisa detecção e identificação dos
suínos na terminação, Almeida (2008) patógenos envolvidos (Zlotowiski et al., 2008).
salmonelose suína causada pela Salmonella
O conhecimento da patogenia e dos spp., a colibacilose causada pela Escherichia
agentes responsáveis é uma importante coli enteropatogênica e a tricuriase causada pelo
ferramenta para o diagnóstico das doenças Trichuris suis, são as principais doenças que
(Zlotowiski et al., 2008). A enterite proliferativa causam diarreia em suínos no período de recria
suína (EPS) causada por Lawsonia e terminação (Figura 1) (Batte et al., 1977;
intracellularis, espiroquetose intestinal suína Barcellos 2001; Stege et al., 2000; Baccaro et
causada por Brachyspira pilosicoli, disenteria al., 2003, Suh e Song, 2005).
suína causada pela Brachyspira hyodysenteriae,
bactéria, não demonstrou diferença entre elas,
caracterizando a L. intracellularis como o
1.2.1.1 Lawsonia intracellularis agente etiológico da doença em todas as
A L. intracellularis é uma bactéria espécies acometidas (Cooper et al., 1997a).
Gram-negativo curva, intracelular obrigatória
que causa a enteropatia proliferativa (EP). A EP A infecção de animais susceptíveis
afeta principalmente suínos (Guedes, 2002; ocorre por via oro-fecal (Lawson e Gebhart,
Lindecrona et al, 2002) mas, já foi 2000). Animais infectados podem eliminar até
diagnosticada em hamster (Johnson e Jacoby, cerca de 108 organismos de L. intracellularis
1978), cobaio (Elwell et al., 1981), equino por grama de fezes (Smith e McOrist, 1997). A
(Duhamel e Wheeldon, 1982), rato eliminação da bactéria nas fezes pode ocorrer
(Vandenberghe et al., 1985), furão (Fox e por um período de até 3 meses em alguns
Lawson, 1988), raposa (Ericksen et al., 1990), animais (Guedes et al, 2002b; Guedes e
cão (Leblanc et al., 1993), coelho (Hotchkins et Gebhart, 2003b) sendo que a bactéria pode
al., 1996), avestruz, veado (Cooper et al., sobreviver por até 2 semanas à temperatura
1997ab), emu (Lemarchand et al., 1997), ambiente (Collins et al, 2000).
macaco (Klein et al., 1999), camundongo
(Smith et al., 2000), bovino, porco-espinho e Existe pouco conhecimento sobre os
girafa (Herbst et al., 2003). mecanismos celulares de infecção pela L.
Estudo comparativo entre as amostras intracellularis (McOrist et al., 1997a;
isoladas de diferentes espécies animais, baseado McCluskey et al., 2002). Sabe-se que essa
no sequenciamento do DNA ribossomal 16S da bactéria tem tropismo por células epiteliais
intestinais, e a maior consequência patológica

13
da infecção é a hiperplasia dos enterócitos caracterizada por redução no ganho de peso,
(Lawson e Gebhart, 2000). Mas, o mecanismo diminuição do crescimento e desuniformidade
através do qual a L. intracellularis se adere e entre animais da mesma idade, diarreia
penetra a célula não é conhecido. Entretando, transitória que acomete animais de faixa etária
McCluskey et al. (2002) identificaram o gene de 6 a 20 semanas (Lawson e Gebhart, 2000;
lsaA que é expresso durante a infecção, com Guedes, 2002). A forma subclínica é
possível importância na adesão e entrada da assintomática e caracterizada principalmente por
bactéria nas células epiteliais imaturas. Esse baixo ganho de peso (Ward e Winkelman,
gene seria responsável pela síntese de algumas 1990).
proteínas de superfície que se ligariam a Os sinais clínicos começam a ser
receptores específicos presentes na superfície observados de sete a dez dias após a infecção
apical de enterócitos (McCluskey et al., 2002). (Lawson e Gebhart, 2000; Guedes, 2002). As
Primeiramente, ocorre a interação entre bactérias colonizam, predominantemente, o
antígenos de superfície da L. intracellularis e terço médio e final do intestino delgado, ceco e
receptores específicos presente na superfície cólon, resultando em proliferação das células
externa apical do enterócito imaturo (McOrist et epiteliais das criptas de Lieberkühn no intestino
al., 1997a). Posteriormente, através de processo delgado e glândulas mucosas do intestino grosso
endocítico, envolvendo polimerização de actina com subsequente espessamento da mucosa
pela célula epitelial, a bactéria penetra na célula intestinal (Jubb et al., 1993; Huerta et al., 2003).
(Lawson et al., 1995). Especula-se que a L.
intracellularis produza toxinas que permitam a
Macroscopicamente na forma aguda,
evasão do vacúolo endocítico e da digestão
observam-se lesões intestinais caracterizadas
lisossômica, possibilitando a multiplicação no
por espessamento da parede intestinal, edema e
citoplasma do enterócito infectado (Guedes et
congestão do mesentério, rugosidade da mucosa
al., 2003c).
com pregas espessas e evidentes e conteúdo
fibrino-hemorrágico com coágulo sanguíneo
A doença no suíno possui formas
preenchendo o lúmen intestinal (Figura 2).
clínicas, aguda e crônica, e a forma subclínica.
Animais com a forma crônica apresentam
A forma aguda é caracterizada por diarreia
edema de mesentério próximo à
hemorrágica e morte em animais de reposição e
cevados próximos à idade de abate. A crônica é

Figura 1 - Idade de maior ocorrência das principais diarreias dos suínos nas fases de recria e terminação.
* EPH- Enteropatia proliferativa hemorrágica, forma aguda da infecção por L. intracellularis,
até 360 dias de idade. Fonte: modificado de Barcellos (2001).

14
inserção com a alça intestinal lesada, serosa frequentemente afetado, mas lesões podem ser
intestinal apresenta aspecto cerebróide, parede encontradas em qualquer segmento intestinal,
intestinal espessada e a mucosa com pregas bem do duodeno ao reto com distribuição focal ou
evidentes (Figura 3). Tanto na forma aguda multifocal (Lawson e Gebhart, 2000).
quanto na forma crônica, o íleo é mais
As duas formas da doença, aguda e
crônica, têm basicamente as mesmas
características histopatológicas. As criptas de
Lieberkühn alongadas e alargadas com um
número aumentado de células epiteliais imaturas
com elevado índice mitótico. Observa-se uma
proliferação das células epiteliais dessas criptas
no intestino delgado e glândulas mucosas do
intestino grosso com a presença de um micro-
organismo intracelular curvo na porção apical
destes enterócitos (Rowland e Lawson, 1974;
Jubb et al., 1993). Há uma redução marcante do
número de células caliciformes nas criptas
afetadas (Lawson e Gebhart, 2000). O animal
com a forma subclínica, na maioria dos casos,
Figura 2 – Suíno, intestino delgado, íleo, apresenta características macroscópicas e
macroscopia da forma aguda de histopatológicas semelhantes às observadas em
infecção por Lawsonia animais com a forma crônica (Ward e
intracellularis. Observa-se Winkelman, 1990; Guedes, 2002).
espessamento e engrossamento
da serosa intestinal com áreas
multifocais a coalescentes de O diagnóstico ante-mortem pode ser
hemorragia (seta). Fonte: Prof. feito pela de sorologia através de amostras de
Roberto Guedes. sangue ou pela reação em cadeia pela
polimerase (PCR) utilizando-se as fezes
(Guedes et al., 2002a). Já o diagnóstico post-
mortem pode ser feito através de exames
anatomopatológicos pelo ensaio de PCR de
mucosa intestinal em animais com sinais
clínicos da doença (Guedes, 2003). Além da
coloração de rotina pela hematoxilina e eosina,
métodos auxiliares, como técnicas
histoquímicas de coloração pela prata (Warthin
Starry, Young modificado ou Levaditi)
(Rowland e Lawson, 1974; Mores et al, 1985),
imunofluorescência indireta (McOrist et al,
1987) e imuno-histoquímica (IHQ) (Jensen et al,
1997) usando anticorpo monoclonal ou
Figura 3 - Suíno, intestino delgado, íleo, policlonal específico contra Lawsonia
macroscopia da forma crônica de intracellularis (Figura 4) (McOrist et al, 1987;
infecção por Lawsonia Guedes e Gebhart 2003c) facilitam o
intracellularis. Observa-se diagnóstico histopatológico, possibilitando
espessamento da mucosa intestinal a visualização da bactéria na porção apical
(seta). Fonte: Prof. Roberto Guedes. de enterócitos imaturos.

15
 um alto número de fatores de risco associados a
essa faixa etária como transporte e repopulação
(Moreno et al., 2002). Baccaro et al. (2003)
observaram que 13% de 541 amostras de fezes
analisadas foram positivas pela técnica da PCR.
Já em um estudo realizado em Santa Catarina
observou-se que somente 7,5% dos 386 animais
em fase de terminação e 0,6% de 330 animais
em fase de creche foram positivos para
Lawsonia intracellularis (Menin et al., 2008).

1.2.1.2 Brachyspira pilosicoli

Figura 4 – Suíno, intestino delgado. Detecção Um patôgeno emergente, a
imuno-histoquímica de Lawsonia Brachyspira pilosicoli, vem sendo
intracellularis, observa-se diagnosticado nos sistemas de produção atual
marcação no ápice dos enterócitos (Barcellos et al., 2000). Até o final da década de
da cripta intestinal (seta) e em 70, todas as espiroquetas intestinais β
macrófagos na lâmina própria hemolíticas (EIBH) presentes no intestino dos
(asterisco) (IHQ 40X). Fonte: Prof. suínos eram consideradas não patogênicas.
Roberto Guedes. Posteriormente, Taylor et al. (1980) sugeriram
que EIBH poderiam estar associadas com
A L. intracellularis tem distribuição diarreias não fatais em suínos na fase de
mundial tendo sido diagnosticada na América crescimento. Na década de 90, Duhamel et al.
do Norte, América do Sul, Europa, Ásia, África (1996) determinaram que as EIBH associadas
e Austrália (Lawson & Gebhart 2000). A com uma determinada forma de infecção
prevalência da L. intracellularis, na literatura, intestinal em suínos, denominada colite
utilizando a técnica da PCR varia de 15 a 93,7% espiroquetal, eram diferentes das outras espécies
sendo o principal agente tanto em infecções do gênero, mas apresentavam algumas
clínicas como em subclínicas (Moller et al., características fenotípicas em comum com
1998; Jacobson et al., 2005; Suh e Song 2005; espécies apatogênicas, chamadas “Serpulina (S.)
La et al., 2006; Biski et al. 2007). Estima-se que innocens” e “S. murdochii”. Os autores
20 a 50% das propriedades produtoras de suínos propuseram o nome Serpulina pilosicoli para
no mundo inteiro estejam infectadas pela L. descrever a espiroqueta fracamente beta
intracellularis (Kroll et al., 2005). Muitos hemolítica patogênica. Essa nova espiroqueta
fatores contribuem para essa alta prevalência de tinha a capacidade de aderir às células epiteliais
L. intracellularis nas granjas incluindo idade, do intestino grosso, sendo que a colonização
linhagem, dieta, estado sanitário do rebanho, pela massa bacteriana era capaz de reduzir a
uso de antibióticos, vacinas, desinfetantes, eficiência da absorção e causar diarreia
manejo e sistemas de produção além é claro da mucóide, característica da colite espiroquetal
alta capacidade de transmissão e sobrevivência (Duhamel et al., 1996). Por fim, foram
da L. intracellularis no meio ambiente (Lawson realizados estudos moleculares usando o
e Gebhart 2000). sequenciamento do RNA ribossomal 16S e os
resultados permitiram o reposicionamento das
Estudos de frequência da L. amostras de “S. pilosicoli” no gênero
intracellularis, no Brasil, identificaram Brachyspira, levando a unificação dos gêneros
positividade em 30% das granjas das principais Serpulina e Brachyspira (Barcellos 2000)
regiões produtoras do país. As amostras
positivas provinham principalmente de animais Foram identificadas até o momento,
com mais de 180 dias de idade. Acredita-se que nos suínos, sete espécies de Brachyspira sp.
essa faixa etária esteja mais susceptível a (Sobestiansky et al., 2001; Rasback et al.,
infecção em função do baixo uso de antibióticos 2007), mas destas, somente a Brachyspira
e promotores de crescimento como também por hyodysenteriae e a Brachyspira pilosicoli são

16
realmente importantes na suinocultura e até 50% dos leitões expostos à infecção
comercial (Quadro 1) (Thomson et al., 1998). podem ser afetados (Barcellos, 2000).
Recentemente, uma nova espécie de
Brachyspira, a B. suanatina, foi identificada em A patogenia da infecção relaciona-se
patos Mallard e sua inoculação experimental em principalmente com a aderência da bactéria ao
suínos desmamados demonstrou lesões intensas epitélio do intestino grosso (Barcellos 2000). A
(Rasback et al., 2007; Jansson et al., 2009). colonização bacteriana maciça do epitélio
interfere com a absorção intestinal e causa uma
A Brachyspira pilosicoli é uma diarreia mucóide (Duhamel et al. 1996). Até o
espiroqueta Gram negativo, anaeróbia, momento, é desconhecida a forma precisa dessa
flagelada, que produz fraca hemólise em ágar ligação, a quimiotaxia das espiroquetas para a
sangue (Guedes, 2005). A B. pilosicoli é um mucina da superfície das células epiteliais do
possível agente zoonótico associado com intestino parece ser um ponto importante na
doenças colônicas em humanos, macacos, aves patogenia da doença. As espiroquetas possuem
domésticas e selvagens, ratos, cães e suínos um movimento espiralado que ajuda na
(Boye et al., 2001). Com relação à infecção em penetração e movimentação através do muco até
humanos, a colonização do trato intestinal a superfície do epitélio. O envelope externo das
geralmente tem sido descrita em países espiroquetas contém lipossacarídeos
africanos e entre aborígines australianos (Lee et semirrugosos que são sorologicamente
al., 1993). Para a sociedade ocidental, a doença heterogêneos entre as diferentes cepas. Estudos
se limita exclusivamente a grupos de indivíduos comparativos com células cultivadas e em
imunodeprimidos e homossexuais (Trott et al. modelos animais sugerem que a união das
1995). Já a infecção dos leitões ocorre mais células epiteliais envolve a relação entre
frequentemente na fase imediatamente posterior moléculas específicas nas espiroquetas
a transferência dos animais entre creche e recria. (adesinas) e receptores na célula do hospedeiro
Os fatores predisponentes capazes de explicar (Muniappa et al., 1996; Duhamel 2006). Outro
esse aumento de ocorrência seriam o estresse mecanismo de patogenicidade descrito é a
que se segue a movimentação entre a creche e capacidade de ligação da bactéria com o
recria, alojamento em ambiente pior que o da receptor glicose-galactose da célula alvo, essa
creche e mistura de animais infectados proteína bacteriana é codificada pelo gene
(excretores sadios) e não infectados (sem defesa mglB. Esse gene determina a síntese de um
imunitária). A infecção dos animais ocorre produto de expressão que interfere diretamente
principalmente por contaminação com matéria com a capacidade da B. pilosicoli em causar
fecal. Foi sugerido que um período de 21 dias infecção intestinal (Zhang et al., 1998).
seja requerido para a eliminação da B. pilosicoli

Quadro 1 - Características das Brachyspiras spp. intestinais dos suínos.

Espiroqueta Origem Relação com o Hospedeiro Localização no intestino
grosso
B. hyodysenteriae Fezes e conteúdo do cólon de Patógeno Muco sobre o epitélio,
suínos com a disenteria suína espaços intraepiteliais
B. pilosicoli Fezes de suínos, outros Patógeno Aderida ao epitélio intestinal
animais e seres humanos com
diarreia
B. innocens Fezes de suínos hígidos Comensal Superfície das células
epiteliais.
B. intermedia Fezes de suínos e aves hígidas Provável patógeno Desconhecido
e com diarreia
B. murdochii Fezes de suínos hígidos Comensal Desconhecido
B. alvinipulli Fezes de aves com diarreia Patógeno Aderido ao epitélio intestinal
B. suanatina Fezes de suíno com diarreia e Patógeno Aderido ao epitélio das
de patos Mallard hígidos criptas do ceco
Fonte: modificado de Barcellos (2000).

17
 A colite espiroquetal apresenta-se infiltração neutrofílica da lâmina própria,
como uma forma mais branda da disenteria hemorragia, hiperemia e dilatação das criptas.
suína, geralmente auto limitante. A mortalidade,
praticamente inexiste e os prejuízos da infecção
resultam de uma redução no ganho de peso
diário e piora na conversão alimentar (Girard et
al., 1995; Thomson et al., 1998). A diarreia
começa 10 a 14 dias após a infecção, isso ocorre
geralmente 2 a 3 semanas após a entrada dos
leitões na fase de crescimento. Leitões muito
jovens, com 4 semanas de idade, ou mais
maduros, com até 20 semanas de idade, podem
mostrar sinais de diarreia. Os sintomas podem
persistir, mas é raro a observação de sinais
clínicos em leitões com mais de 20 semanas
(Johnston et al., 1999). As fezes são moles com
consistência e aspecto semelhante a “cimento
fresco”. A temperatura corporal pode subir até Figura 5 – Suíno colón. Lesão microscópica de
40-41°C (Duhamel 2001). colite espiroquetal. Cólon observa-
se inúmeras bactérias (B. pilosicoli)
As alterações mais específicas para a aderidas aos enterócitos (seta),
infecção pela B. pilosicoli são limitadas ao “falso bordo em escova” (HE,
intestino grosso, que se encontra geralmente 40X). Fonte: Prof. Roberto Guedes.
flácido e com a parede engrossada, em casos
iniciais, com edema no mesentério. O conteúdo O diagnóstico presuntivo pode ser feito
do intestino é fluido, mas pode se tornar mais por microscopia de esfregaço das fezes coradas.
denso próximo ao reto (Taylor e Trott 1997). Entretanto, a técnica considerada como a mais
Ocasionalmente, os danos à mucosa se eficiente (“padrão ouro”) para o diagnóstico
caracterizam por erosões focais coalescentes, laboratorial das infecções intestinais por
com aderência de partículas de alimento, dando espiroquetas em suínos é o isolamento
ao mesmo uma aparência de calçamento com bacteriano, por detectar pequenas quantidades
paralelepípedos (Johnston et al., 1999). Em de bacterias nas fezes (Barcellos, 2000;
casos avançados, a mucosa frequentemente Komarek et al., 2009). A colonização da
encontra-se congesta com áreas multifocais de mucosa, por parte das espiroquetas, pode ser
hemorragia e aumento da produção de muco evidenciada por exames histopatológicos de
(Duhamel 2001). rotina, mas a confirmação da infecção deve ser
feita pela coloração pela prata (Harrisson e
O principal achado histológico da Gosser, 1979) ou por técnicas mais precisas
colite espiroquetal é a colonização da superfície como a imunoistoquimica utilizando anticorpos
do ceco e do cólon por um grande número de monoclonais ou policlonais específicos
espiroquetas, unidas por uma extremidade ao (Thomas e Selwood, 1992; Joens et al., 1993).
epitélio formando uma figura definida como Técnicas baseadas na análise do ácido nucléico
“falsa borda em escova” (Figura 5). As vieram a facilitar e dinamizar o diagnóstico das
espiroquetas também podem ser encontradas infecções por Brachyspira spp principalmente
dentro das criptas, assim como entre as células no diagnostico ante morte. Ensaios de PCR que
epiteliais descamadas e em multiplicação ativa aplificaram segmentos dos genes ribossomais
dentro de macrófagos (Sobestiansky et al., 16S ou 23S (16S rRNA e 23S rRNA) ou do
2001). Neef et al. (1994) observaram gene codificador da NAD oxidase vem sendo
engrossamento da lâmina própria em cortes do amplamente utilizada no diagnostico da colite
ceco, associado a um incremento na espiroquetal (Elder et al., 1994; La et al., 2006;
profundidade das criptas. Acompanhando essas Phillips et al., 2009). O RFLP (Restriction
alterações puderam ser evidenciadas lesões Fragment Length Polymorphism) possibilita um
inflamatórias e danos às células epiteliais, como diagnostico rápido e especifico capaz de
discriminar as espiroquetas patogênicas e não

18
patogênicas presentes no intestino dos suínos e espiroqueta já foi recuperada de emas, ratos,
de aves (Barcellos et al., 2000). gaivotas e patos Mallard (Hampson et al.,
2006). Camundongos são frequentemente
usados como modelos experimentais e podem
A colite espiroquetal vem sendo também se infectar naturalmente eliminando a
diagnosticada na maioria dos países produtores B. hyodysenteriae por mais de 120 dias
de suínos no mundo. Está disseminada nos (Hampson et al., 2004; Sobestiansky e
Estados Unidos da América, onde o agente tem Barcellos, 2007). A transmissão ocorre
sido isolado de praticamente todos os estados e primariamente pela ingestão de material fecal
cidades com produção significativa de suínos proveniente de suínos com sinais clínicos ou
(Duhamel, 1998). Achados clínicos e assintomáticos. A disseminação da doença pode
laboratoriais indicam que espiroquetas ocorrer por meio da água, particularmente
patogênicas intestinais estão presentes em lâmina d’água, fômites como botas e roupas
76,5% das granjas suínas do Rio Grande do Sul, sujas de fezes contaminadas e de alimentos
sugerindo que esses patógenos podem ter uma contaminados (Komarek et al., 2009).
importante relação com as causas de diarreia em Movimentação e mistura de animais,
suínos dessa região (Barcellos et al., 2000). Já superpopulação em baias, mudanças de rações e
em Santa Catarina, a B. pilosicoli foi retirada de medicação, fornecimento de rações
identificada em 8,8% das 716 amostras de fezes ricas em carboidratos ou ricas em energia e
provenientes de suínos de creche e terminação pouca fibra, rações deficientes de vitamina E e
(Menin et al., 2008). Na Europa, estudos selênio, entre outros, provocam sintomatologia
epidemiológicos sobre a prevalência da infecção mais grave com maior índice de perdas
com B. pilosicoli em suínos também têm sido (Guedes, 2005). A morbidade pode chegar a
publicados. Uma investigação realizada entre 90% e a mortalidade varia de 5 a 15% podendo
1992 e 1996 na Grã- Bretanha revelou que em chegar a 30%. No entanto, a morbidade e a
32,9% das granjas de suínos a B. pilosicoli era o mortalidade são diretamente influenciadas por
único patógeno isolado de animais com colite condições estressantes presentes na granja,
em fase de crescimento (Thomson et al., 1998). como alimentação, tamanho do lote, fluxo de
Outros 18,9% tinham infecções mistas com B. produção e peso dos animais (Sobestiansky e
pilosicoli e Y. pseudotuberculosis (9,4%), com Barcellos, 2007).
L. intracellularis (7,1%) e com B.
hyodysenteriae (2,4%). A patogênese da disenteria suína é
complexa e ainda não está completamente
1.2.1.3 Brachyspira hyodysenteriae entendida. Várias bactérias da microbiota
intestinal, além da influência da dieta sobre a
A B. hyodysenteriae é o agente causal densidade e composição dessa microbiota,
da disenteria suína. É uma enfermidade parecem exercer um sinergismo com a B.
economicamete importante que afeta suínos de hyodysenteriae favorecendo a colonização do
crescimento e terminação, entre 15 e 70 Kg de intestino grosso (Nibbelink et al., 1990). A B.
peso vivo (Guedes 2005). A B. hyodysenteriae é hyodysenteriae ingerida é protegida da acidez
uma espiroqueta anaeróbia, flagelada, Gram estomacal pelo muco das fezes diarreicas, e,
negativo, produz β hemólise em ágar sangue após atingir o intestino grosso, invade as criptas
boviino, é sensível ao calor e ao pH ácido não da mucosa, nas quais se multiplica. Apesar do
sobrevivendo muito tempo fora do hospedeiro agente ser visto, ocasionalmente, dentro de
quando exposta ao ar e a luz solar (Sobestiansky células epiteliais e na lâmina própria das áreas
et al., 2001). No ambiente, quando protegida afetadas, acredita-se que as lesões sejam
principalmente por fezes, pode sobreviver por produzidas pela ação da hemolisina liberada
até 112 dias (Boye et al., 2001). durante a sua multiplicação e por
lipooligossacarídeos de superfície de outras
Suínos de todas as idades podem se bactérias Gram negativas. Essas substâncias
infectar, mas a doença é mais comum em tóxicas rompem as junções celulares e permitem
animais de recria e terminação, particularmente a penetração de espiroquetas e outros agentes
no período logo após a saída da creche. A secundários na lâmina própria (Sobestiansky e
Barcellos, 2007). As proteínas de membrana

19
externa da B. hyodysenteriae incluem as grosso, com linha de demarcação quase sempre
proteínas variáveis de superfície (Vsp) e evidente na junção íleo-cecal. A alteração
lipoproteínas como a SmpA e a BmpB que macroscópica básica é uma enterite muco-
parecem estar envolvidas na evasão do sistema hemorrágica ou fibrino-hemorrágica. O
imune (Trott et al., 2001). conteúdo é fluido, contendo muco e sangue e,
algumas vezes, membranas fibrino necróticas. A
A diarreia da disenteria suína ocorre mucosa apresenta-se edematosa, avermelhada e
por má absorção em conseqüência de uma recoberta por quantidades variáveis de fibrina e
falência dos canais transportadores de íons muco. Pode haver aumento dos linfonodos
epiteliais, que normalmente transportam íons mesentéricos (Sobestiansky e Barcellos, 2007).
sódio e cloreto do lúmen intestinal para o
sangue. Nos animais infectados os níveis de As lesões histológicas significativas
adenosina monofosfato cíclica (cAMP) e são somente encontradas no ceco, cólon e reto
guanosina monofosfato cíclica (cGMP), na (Sobestiansky e Barcellos, 2007). As lesões
mucosa do colon são normais, mas a sua agudas típicas incluem espessamento da mucosa
resposta aos estímulos está marcadamente e da submucosa devido à congestão vascular e
reduzida (Argenzio, 1980). ao extravasamento de fluidos e leucócitos. Há
hiperplasia das células caliciformes e das
Os sinais clínicos são de diarreia células epiteliais na base das criptas que podem
mucosa com sangue, ocasionalmente com se apresentar alongadas e hipercoradas. As
fibrina, associada a anorexia e morte em poucos espiroquetas podem ser observadas no interior
dias após o inicio dos sinais clínicos em animais das células caliciformes e entre os enterócitos.
não tratados (Guedes, 2005). Geralmente um Como conseqüência da perda de conectividade
surto de disenteria suína começa atingindo dos enterócitos, ocorre necrose e
somente alguns animais num lote. Esses casos desprendimento do epitélio. Há um aumento do
isolados podem repetir-se por algum tempo, infiltrado inflamatório na lâmina própria com
constituindo a única manifestação clinica da acúmulo excessivo de neutrófilos,
doença, encobrindo assim seu caráter principalmente ao redor de capilares sanguíneos
infeccioso. Com o aumento da pressão de próximos ao lúmen intestinal. Ocorre
infecção o número de infectados aumenta de hemorragia ao redor das áreas de ulceração que
forma progressiva, com diferentes graus de normalmente são invadidas por colônias de
severidade (Sobestiansky e Barcellos, 2007). bactérias secundárias. Nas lesões crônicas
evidencia-se o acúmulo de grandes quantidades
Na forma aguda a B. hyodysenteriae de fibrina, muco e restos celulares sobre a
causa uma colite severa que cursa com diarreia mucosa intestinal e também no interior das
sanguinolenta, que se não tratada pode levar os criptas. A hemorragia e o edema são menos
suínos a morte em até 24 horas. Os suínos ainda pronunciados. A necrose superficial pode ser
podem apresentar anorexia, sede intensa, intensa, mas ulcerações profundas não ocorrem
flancos do abdômen retraídos, emagrecimento e (Fellström et al., 1996; Sobestiansky et al.,
a temperatura corporal pode atingir 40°C. 2001).
Posteriormente as fezes muco sanguinolentas
adquirem coloração marrom-chocolate e podem Os dados clínicos, as alterações
conter fragmentos de material brancacento macroscópicas e os achados histológicos são
muco fibrinoso. Na sua forma crônica, a B. importantes para o estabelecimento do
hyodysenteriae causa diarreia não diagnóstico. Esfregaços da mucosa ou de fezes
sanguinolenta, depressão e diminuição do ganho observados em microscópio de campo escuro,
de peso diário. A forma super aguda, em que de contraste de fase ou corados pela Safranina
morrem animais em poucas horas sem ocorrer indicam um aumento no numero de
diarreia, é rara (Sobestiansky, 1999). espiroquetas. A confirmação do diagnóstico
pode ser feita pelo isolamento e identificação
Os animais mortos apresentam bioquímica da B. hyodysenteriae ou por técnicas
emaciação acentuada e o períneo encontra-se moleculares nas amostras de fezes ou da mucosa
sujo de fezes. A desidratação é evidente. As afetada. Alguns testes sorológicos como
lesões macroscópicas se limitam ao intestino aglutinação microscópica, imunofluorescência

20
indireta, hemólise passiva, ELISA e enterica e Salmonella bongori (Campos, 1999).
imunodifusão podem ser feitos, mas somente Um esquema de identificação denominado
permitem identificação de positividade de Kauffmann e White, divide o gênero em
rebanho, além de serem sorotipo especifico. sorovares, tendo como base a composição de
seus antígenos O (somático), Vi (capsular) e H
A doença é relatada em todo mundo e (flagelar) (Campos, 1999) e é amplamente
no Rio Grande do Sul tem sido reportada em utilizado para classificar as salmonelas.
3,2% das infecções em criações comerciais
(Barcellos et al., 2000). Os EUA reportaram O suíno pode ser infectado por uma
uma diminuição da incidência da disenteria variedade de sorotipos de Salmonella enterica.
suína nos últimos anos caindo de 33% para Os três sorotipos de maior importância na saúde
11%. Recentes mudanças na estrutura e manejo animal são a S. enterica sorotipo Choleraesuis,
da indústria de produção de carne suína, S. enterica sorotipo Typhisuis e S. enterica
incluindo a adoção de práticas produtivas mais sorotipo. Typhimurium (Guedes 2005). A
intensivas, tem levado a um decréscimo na doença se manifesta principalmente em animais
prevalência da infecção por B. hyodysenteriae de crescimento, entre 8 e 16 semanas, causando
na maioria dos paises produtores de suínos. enterite em caso de infecção por S. typhimurium
Entretanto a disenteria suína ainda é uma e septicemia em casos de infecção por S.
doença relativamente comum e importante na choleraesuis (Reed et al., 1986). No entanto, as
Europa. Na união européia a B. hyodysenteriae síndromes clínicas em suínos, causadas por
foi identificada como o agente causal de diarreia sorotipos adaptados, não são o principal motivo
em 6 propriedades (7%), das 85 analisadas de preocupação na infecção por salmonelas
(Thomson et al., 1998). Na Suécia de 72 granjas nesta espécie (Van Der Gaag et al., 2003), mas
com problemas de diarreia 14% estavam as questões relevantes à segurança dos
infectadas pela B. hyodysenteriae (Mϕller et al., alimentos e presença de Salmonella spp
(sorotipos não-adaptados) em produtos cárneos
1998).
de origem suína (Davies e Nichols, 2001).
1.2.1.4 Salmonella spp.
A S. choleraesuis há alguns anos era o
A salmonelose é das doenças sorotipo mais frequentemente isolado de
septicemicas e entéricas de maior importância animais com salmonelose clínica, estando
econômica da suinocultura mundial (Reed et al., associado a quadros de septicemia fatal. Este
1986). A Salmonella spp. é um bacilo Gram sorotipo já foi encontrado em 96% dos isolados
negativo, aeróbio facultativo, móvel (com de suínos clinicamente recuperados e sadios de
exceção dos sorovares Gallinarum e Pullorum) planteis afetados (Morehouse 1972). Hoje a
com múltiplos flagelos, cresce bem em meios de Salmonella enterica sorotipo Thyphimurium é a
cultivo convencionais e não fermentam a lactose mais presente das salmonelas em suínos, sendo
ou o fazem lentamente (Clarke e Gyles, 1993). o sorotipo mais isolado dos casos de infecção
A temperatura ótima para crescimento é 37°C alimentar em humanos (Nadvorny et al., 2004).
(Franco e Landgraf, 1996), porém desenvolvem-
se numa faixa de crescimento de 7°C a 45°C, A infecção por salmonelas ocorre pela
são resistentes a dessecação e ao congelamento, via fecal-oral. A transmissão nasal (nariz-nariz)
possuindo a capacidade de sobreviver no e por aerossol já foi confirmada para a S.
ambiente por anos (Wilcock e Schwartz, 1993). typhimurium (Oliveira et al., 2007). As fontes
No entanto, são sensíveis à luz solar e à maioria relevantes de disseminação do micro-organismo
dos desinfetantes como fenóis, clorados e para os suínos são o contato com as fezes de
iodados (Sobestiansky et al., 1999). animais infectados, a inadequada limpeza e
desinfecção das baias, a introdução de animais
A classificação e a nomenclatura das portadores assintomáticos e alimentos
salmonelas sofreram várias modificações nos contaminados por Salmonella sp. na granja e
últimos anos e ainda não estão totalmente componentes de ração animal contaminados
definidas. A classificação atual, que é baseada contendo subprodutos de leite e carne (Linton,
em características bioquímicas, divide o gênero 1979; Hirsh, 1990; Sobestiansky et al., 1999).
da Salmonella em duas espécies, Salmonella No entanto, é importante enfatizar que

21
ingredientes de origem vegetal também podem estão aumentados (Sobestiansky et al., 2001).
ser fonte de contaminação para os alimentos Em processos crônicos, a necrose difusa da fase
(Schwartz, 2000). aguda se regenera, com exceção das áreas de
trombose e causa isquemia, que provoca a
De maneira geral, após a chegada da formação das úlceras. Lesões agudas ou
bactéria no intestino há uma invasão de células crônicas podem estar localizadas tanto no
M e de enterócitos por meio de um rearranjo do intestino delgado quanto grosso (Guedes, 2005).
citoesqueleto dessas células, induzido por Os animais afetados apresentam
proteínas efetoras secretadas pela Salmonella histologicamente maior frequência enterite
sp. Durante esse processo há uma atração de necrótica, focal ou difusa e colite, com grande
neutrófilos para o local, mediada pela IL-8, quantidade de neutrófilos na lâmina própria. No
seguida da infiltração dessas células na lâmina lúmen intestinal, próximo à mucosa, observam-
própria. Uma hora após infecção, as se placas diftéricas composta por restos de
Salmonellas alcançam a porção basal da célula e células, fibrina e colônias bacterianas (Kich,
são fagocitadas por macrófagos e neutrófilos. 2007).
Enquanto em macrófagos há aparentemente
indução de apoptose, os neutrófilos parecem O diagnóstico baseia-se no isolamento
sofrer uma maior atração para o sítio da da Salmonella spp. através de exames
infecção, ocorrendo uma massiva resposta bacteriológicos. Segundo Oliveira (2000), a
inflamatória local. A liberação de proteases e técnica microbiológica convencional pode
outros mediadores das células inflamatórias incluir um passo de pré-enriquecimento ou
resultam em necrose da mucosa levando a começar diretamente no enriquecimento seletivo
diarreia e excreção da bactéria no ambiente seguido de posterior plaqueamento. No animal
(Santos et al., 2003). Posteriormente, as vivo, o exame pode ser realizado a partir de
salmonelas migram para o sistema reticulo suabes retais individuais ou “pool” de fezes
endotelial pelas vias linfáticas e sanguínea e são frescas em rebanhos. Por ocasião da necropsia,
eliminadas quando o animal é submetido a o material a ser coletado inclui fezes, de
fatores estressantes (Ekperigin e Nagajara, preferência do íleo. A presença de colonização
1998; Ohl e Miller, 2001). superficial do epitélio e invasão da lâmina
própria por Salmonella sp. pode ser evidenciada
A Salmonella enterica sorotipo através da técnica de imuno-histoquímica com o
Thyphimurium esta associada com enterocolites uso de anticorpos policlonais. O exame
prolongadas e usualmente fatais em criações sorológico pelo teste de ELISA pode ser
intensivas de suínos (Reed et al., 1986). A utilizado, porém o estado de portador
doença dissemina-se rapidamente no rebanho. O assintomático apresenta resultado positivo
sinal clinico inicial da enterocolite é diarreia dependendo dos sorovares presentes na granja e
aquosa, amarelada, inicialmente sem sangue e do antígeno que compõem o Kit. Amostras de
muco. O sangue pode aparecer esporadicamente fezes utilizadas para ensaios de PCR têm
nas fezes, mas não com a mesma intensidade utilidade limitada, devido à baixa sensibilidade
que ocorre em disenterias hemorrágicas. Em da técnica neste tipo de material e à
alguns casos, moldes de fibrina podem ser impossibilidade de diferenciação entre cepas
observados entremeados as fezes, patogênicas e não patogênicas de Salmonella
principalmente nos casos mais graves. Os suínos (Côté et al., 2004; Guedes 2005; Kich et al.,
afetados apresentam-se febris, alimentam-se 2007).
menos e apresentam desidratação em
decorrência da severidade e duração da diarreia. A prevalência nos suínosde abate dos
A mortalidade é baixa, ocorrendo somente após sorotipos Typhimurium, Agona, Derbey,
muitos dias de diarreia (Kich 2007). Bredney e Panamá é maior que 50% e os
sorotipos mais frequentes são Salmonella
Macroscopicamente, observam-se na enterica sorotipo Thyphimurium é a segunda
mucosa do ceco e cólon, áreas de tecido mais importante nas infecções alimentares em
necrosado de tamanhos variados. O conteúdo é humanos. Isto enfatiza a necessidade e
liquido e fétido, contendo grumos de tecido importância de implementar programas de
necrótico e fibrina, os linfonodos mesentéricos controle, tanto nas unidades produtoras como no

22
transporte, abate e interior dos abatedouros. No (Holland, 1990). A colonização bacteriana e o
estado de São Paulo acredita-se que a quadro clinico da infecção são específicos com
prevalência seja de 4,8% do rebanho (Baccaro a idade e linhagem do animal, ou seja, leitões
et al, 2003). Em Santa Catarina a frequência de lactentes são infectados mais frequentemente
Salmonella sp. foi de 7,3% na creche e 10,9% por cepas possuidoras de determinadas fímbrias
na terminação, de um total de 330 e 386 como 987P e F41 e, suínos de creche tem a
amostras analisadas, respectivamente (Menin et tendência de se infectar por cepas com a fímbria
al., 2008). F18. Isso ocorre porque os enterócitos possuem
receptores específicos para as fímbrias e estes
Estudos de prevalência na Corea do Sul mudam de acordo com a faixa etária do animal
identificaram que 51,1% das granjas eram (Francis et al, 1998).
positivas para Salmonella sp. (Suh e Song,
2005). Essa alta prevalência também já foi Na forma clinica, a doença afeta
identificada na Finlândia (54,83%) (Biksi et al., principalmente leitões logo após o nascimento
2007) e na Dinamarca onde 19 (24,1%) das 79 (Mores e Moreno, 2007), mas, Stege et al.
granjas analisadas eram positivas para o agente (2000) identificaram cepas de ETEC em suínos
(Stege et al., 2000). de recria com ou sem sintomas de diarreia, o
que indica a presença desse agente nas fases
1.2.1.5 Escherichia coli enterotoxigênica finais da cadeia produtiva. Meni et al. (2008)
A Escherichia (E.) coli é um bastonete identificaram em Santa Catarina que a ETEC foi
fermentativo, Gram-negativo, que cresce o agente bacteriano mais frequentemente
rapidamente em meios de cultivo simples isolado de quadros clínicos de diarreia nas fases
incluindo agar MacConkey, onde forma grandes de maternidade, creche e terminação sendo que
colônias rosadas. A E. coli é um dos agentes nessa ultima, foi diagnostica em 26,9% das 386
etiológicos mais frequentemente isolados em amostras analisadas. A partir da análise
casos de diarreia no homem e em diferentes fenotípica das cepas isoladas de E. coli,
espécies animais (Holland, 1990; Nataro e observou-se que o sorotipo fímbrial mais
Kaper, 1998). A maioria das cepas de E. coli prevalente na fase de terminação foi a cepa F4
presentes no trato gastro-intestinal são (K88) com 5,4% de frequência. Estes dados
comensais (Nataro e Kaper, 1998). descrevem um intervalo além do relatado por
outros autores que julgam os animais suscetíveis
Numerosas fimbrias são expressas somente até a fase de creche (até os 60-65 dias
pelas E. coli enterotoxigênicas (ETEC) que de idade) (Mcorist e Gebhart, 1999).
causam diarreia em suínos, essas fímbrias
incluem: F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F7 A presença de E. coli enteropatogênica
(F41) e F18. As ETEC são classificadas tem maior importância clinica nas fases da
baseadas na sua estabilidade termal. Elas são maternidade e creche. Quando na recria e
divididas em toxinas termo labéis (LT-I e LT- terminação, não cursa com diarreia, mas pode
II), termo estavéis (STa. STb) e shiga toxina causar um desequilíbrio na flora intestinal
(Stx2e). Para que a ETEC seja capaz de realizar predispondo infecções entéricas (Thonson et al.,
infecção as cepas devem possuir esses fatores de 1998; Jacobson et al., 2003). Jacobson et al.
virulência (fímbria e toxina) (Dubreull, 2008). (2003) identificaram cepas de ETEC em quatro
As fímbrias são consideradas fatores de de seis rebanhos de baixo desempenho. Todas
virulência, pois permitem a aderência dessas as granjas possuíam casos ou histórico de
bactérias a receptores específicos localizados na diarreia pós-desmane, portanto, a presença de
superfície dos enterócitos (Macedo et al., 2007). ETEC em animais de terminação pode indicar
Cepas toxigênicas de E. coli causam diarreia uma alta pressão de infecção de agentes
aquosa profusa e/ou lesões vasculares sistêmicas causadores de diarreia na creche e maternidade
devido à liberação de enterotoxinas (Francis, ou que a diarreia pós desmame predispõe surtos
2002). Após a adesão as ETEC produzem de doenças entéricas nas fases de recria e
toxinas que induzem a hipersecreção pelas terminação. Recentemete, Pittman (2010)
células do intestino (LT e ST) ou que interferem reportou um surto de diarreia, em suínos de 11
com a síntese protéica das células (Stx2e) semanas de idade, onde o único agente
observado foi a E. coli F18 que produzia toxina

23
Shiga semelhante. Este autor sugere a
introdução das cepas de E. coli As fêmeas adultas medem de 6 a 8 cm
enterotoxigenicas F18 no diagnostica diferencial e os machos possuem metade desse tamanho. O
das diarreias em suínos de recria e terminação. Trichuris sp. possui uma morfologia única, a
porção do esôfago anterior está aderida a
As duas formas mais frequentemente mucosa do ceco e/ou colón, possui 0,5mm de
utilizadas para a detecção dos fatores de diâmetro, e estende-se até o terço médio do
virulência em E. coli em animais são a helminto. O terço posterior do parasita é mais
imunofluorescência indireta em esfregaço de espesso com aproximadamente 0,65 mm de
mucosa, ou em cortes de congelação de diâmetro e projeta-se para o lúmen intestinal. Os
intestino corados com anticorpos específicos ovos se apresentam, ao exame microscópico,
para antígenos fimbriais (Mullaney et al., 1991), como bipolares, de parede espessa, coloração
e a detecção de genes de virulência pela PCR. A amarela a marrom, e tamanho de 60 por 25
técnica da PCR multiplex permite a pesquisa de micrômetros, contendo uma célula no seu
diferentes alvos de amplificação de DNA, interior (Sobestiansky et al., 2001).
utilizando-se diferentes primers em uma mesma
reação, o que reduz sensivelmente os custos do Após eliminação nas fezes, os ovos
teste (Macedo et al., 2007). tornam-se infectantes depois de 3 a 4 semanas e
podem permanecer no ambiente por até seis
São poucos os estudos brasileiros sobre anos (Burden et al., 1987). A partir do momento
a prevalência e importância de diferentes cepas que a L1 atinge o ceco e o cólon, ela penetra nas
patogênicas de E. coli na terminação (Menin et células da cripta e migra pela lâmina própria até
al., 2008). No Reino Unido de 85 granjas, a atingir a submucosa onde o parasita se adere até
ETEC (K88) foi identificada como agente a fase adulta. O período pré patente é de 6 a 7
causador primário de diarreia em uma única semanas. A infecção por Trichuris suis causa
granja, em contrapartida as ETEC foram destruição dos enterócitos, ulceração da mucosa
diagnosticas em infecções mistas em 5 granjas e destruição dos capilares sanguíneos causando
atuando simultaneamente com a L. hipoxia tecidual (Mansfield e Urban, 1996).
intracellularis, B, pilosicoli e Yersinia
pseudotuberculosis (Thomson et al, 1998). Na Este parasita é implicado como causa
Dinamarca, a ETEC estava presente em 84 das de proliferação bacteriana no cólon. A lesão
720 amostras de fezes de suínos da terminação primária causada pelo T. suis pré-dispõem à
totalizando 8 das 72 granjas avaliadas (Mϕller adesão e proliferação das bactérias B.
hyodysenteriae, S. cholerasuis, S. typhimurium,
et al., 1998). Posteriormente, Stege et al. (2000)
S. typhisuis e a L. intracellularis que podem
observaram um aumento na prevalência de
causar doenças entéricas primarias no cólon de
ETEC, pois dentre 79 propriedades estudadas 19
suínos em crescimento (Masnfield e Urban;
(24,1%) foram positivas.
Sobestiansky et al., 2001). A sobreposição das
manifestações clínicas e patofisiologicas dos
agentes causais de colite e do T. suis podem
1.2.1.6 Trichuris suis
causar dúvidas quanto a primasia do agente
O Trichuris sp. é um parasita implicado nas diarreias mucohemorrágicas
gastrointestinal de distribuição mundial e pode (Masnfield e Urban 1996). Quando associado a
ser encontrado em uma grande variedade de agentes bacterianos secundários, os sinais
hospedeiros. A tricuriase humana tem clínicos tendem a ser mais acentuados levando
distribuição mundial, e estimativas apontam que rapidamente a morte (Batte et al., 1977;
mais de 1 bilhão de pessoas são afetadas no Sobestiansky et al., 2001).
mundo todo. Suínos são considerados os
hospedeiros naturais do Trichuris suis apesar do Macroscopicamente, ocorre edema de
parasita ser encontrado em primatas e humanos parede intestinal, que apresenta nódulos
(Stewart e Hoyt, 2005). Os sinais clínicos contendo exsudato e restos de parasitas. A
incluem anemia, hipoalbuminemia, anorexia, mucosa do intestino pode apresentar uma
desidratação e diarreia mucosa sanguinolenta membrana fibrinonecrótica e áreas de
(Batte et al., 1977). hemorragia (Stewart e Hoyt, 2005). O

24
diagnóstico é feito preferencialmente mediante a Song 2005; Jacobson et al., 2005) indicando
necropsia. O quadro clínico e o exame uma clara interação da L. intracellularis com
coprológico também são importantes. Os ovos outros agentes causadores de diarreia em suínos.
do parasita podem ser escassos nas fezes o que Estima-se que a ocorrência de infecções mistas
muitas vezes dificulta o diagnóstico nos rebanhos brasileiros seja de 4,8%, sendo
(Sobestiansky et al., 2001). que a coinfecção por L. intracellularis e B.
pilosicoli seja a mais prevalente, totalizando
O T. suis é comumente encontrado em 3%, seguida da associação de L. intracellularis
suínos. Estudos de prevalência identificaram e Salmonella sp, 1% (Bacarro et al., 2003).
ovos de T. suis em 20% dos rebanhos ingleses e
em 23% dos rebanhos dinamarqueses (Kringel e Suh e Song (2005) analisando 462 amostras de
Roepstorff 2006). No Brasil, de 72 granjas fezes de suínos observaram a ocorrência de
foram coletadas 1.795 amostras fecais, das quais infecções mistas, onde 3% das amostras foram
15,82% apresentaram resultados positivos para simultaneamente infectados com Salmonella sp.
parasitas, indicando a ocorrência dos gêneros e B. hyodysenteriae, 2.2% com L. intracellularis
Oesophagostomum, Hyostrongylus, Trichuris e e Salmonella enterica spp e 1.3% com L.
Ascaris. Neste trabalho observou-se que as intracellularis e B. hyodysenteriae.
percentagens de infectados por Trichuris na
idade de seis semanas a seis meses (5,94%) 2. Capítulo 2:
foram estatisticamente superiores às taxas de
infecções nos animais com mais de 6 Prevalência de agentes enteropatogênicos
meses(0,8%) (Lignon et al., 1981), indicando
envolvidos com diarreia em suínos de
que as fases de creche, recria e terminação são
as mais afetadas por esse parasita. recria e terminação no estado de Minas
Gerais

1.2.1.7 Infecções mistas 2.1 RESUMO

Os riscos de diarreia aumentam quando
os suínos são infectados por dois ou mais Diarreia em suínos, nas fases de recria e
patôgenos, simultaneamente (Stege et al., 2000, terminação, é um problema importante em
Suh e Song., 2005), pois os sinais clínicos e a muitos rebanhos. A prevalência da Lawsonia
lesão intestinal tendem a ser mais intensos intracellularis, Brachyspira pilosicoli,
(Jacobson et al., 2003). As infecções entéricas Brachyspira hyodysenteriae, Salmonella spp.,
assim como as infecções mistas representam um E. coli enterotoxigênica, Trichuris suis e a
grande desafio para a suinocultura atual, pois ocorrência de infecções mistas foram
exigem formas eficientes de controle e investigadas. Quarenta e seis rebanhos com
tratamento. Rebanhos com baixo desempenho diarreia ou com histórico de diarreia foram
frequentemente apresentam diarreia e as selecionados em quatro regiões produtoras de
infecções mistas nestes casos são comuns. Em suínos no estado de Minas Gerais. Das
58% dos casos de diarreia em suínos de recria e propriedades analisadas constatou-se que a
terminação de rebanhos de baixa performance prevalência geral dos rebanhos com L.
apresentavam co-infecção por B. pilosicolie e intracellularis, Salmonella enterica sorotipo
L. intracellularis, sugerindo uma forte Typhimurium e E. coli enterotoxigênica foi
associação entre esses dois agentes (Jacobson et 19,56% (IC 8,1-31,02%), 6,52% (IC 0-13,65%),
al., 2003; Jacobson et al., 2005). 10,87% (IC 1,87-19,87%), respectivamente.
Infecções mistas foram diagnosticadas em
A L. intracellularis é o agente entérico 30,43% (IC 17,13-43,73%) dos rebanhos
mais prevalente em suínos de terminação analisados, e a coinfecção com L. intracellularis
(Jacobson et al., 2003; Thomson et al., 1998). e a S. enterica sorotipo Typhimurium foi a mais
Interessante que na maioria dos casos de frequente (10,87%) (IC 1,87-19,87%).
diarreia as infecções são combinadas com outras Brachyspira pilosicoli foi diagnosticada em
bactérias como a B. hyodysenteriae e somente dois rebanhos, sempre associada com
Salmonella spp (Mooller et al., 1998; Suh e infecções mistas. Brachyspira. hyodysenteriae e
Trichuris suis não foram identificados em

25
nenhuma amostra analisada. Esses dados são unidades de produção de leitões (2,7%)
contribuem para o estabelecimento de (IMA, 2009).
programas de prevenção e controle dos
enteropatógenos em rebanhos de recria e A receita das exportações mineiras de
terminação no estado de Minas Gerais. carne suína, no período de janeiro a julho de
2009, aumentou quase 67%. O valor alcançado
Palavras-chave: suíno, enteropatógenos, recria com a comercialização do produto no exterior
e terminação, epidemiologia, Minas Gerais. foi de US$ 61,4 milhões, na comparação com a
cifra de US$ 36,8 milhões do mesmo período de
2.2 INTRODUÇÃO 2008 (IMA 2009). Com base na análise dos
problemas e potencialidades dos grandes
O Brasil é o quarto maior produtor de produtores nacionais, fica claro que Minas
suínos do mundo atrás apenas da China, União Gerais apresenta amplas possibilidade de se
Européia e Estados Unidos. Em 2008, o Brasil firmar como um grande fornecedor de carne
exportou 606,51 mil toneladas, aumento suína para o Brasil e o mundo.
significativo em relação as 529,41 mil toneladas Em decorrência dessa importante
de 2007, atingindo a cifra recorde de US$ 1,48 participação na economia, os patógenos e as
bilhão em exportações de carne suína, 20% a doenças que afetam o rebanho suinícula
mais do que em 2007 (US$ 1,23 bilhão) estadual e nacional devem ser avaliados. Dentre
(ABIPECS, 2008). Essa expansão da produção as doenças de maior importância na
nacional voltou-se para a potencialização da suinocultura podemos citar as diarreias,
suinocultura em algumas regiões brasileiras, principalmente as que ocorrem nas fases de
principalmente a região Sudeste e Centro-Oeste recria e terminação, pois cursam com perdas
(Fávero, 2003), incluindo o estado de Minas econômicas significativas, principalmente
Gerais. Hoje Minas Gerais ocupa a quarta relacionadas ao uso de medicamentos e perda de
posição em produção de suínos no Brasil e a peso dos animais.
produção vem aumentando gradativamente ano
a ano (ABIPECS, 2008). Estudos recentes internacionais têm
demonstrado que a Lawsonia intracellularis
No ano de 2006, foram recadastradas causadora da enteropatia proliferativa,
1.493 granjas que comercializam suínos, Salmonella enterica sorotipo Typhimurium
situadas em 374 municípios mineiros, somando causadora da salmonelose suína, Brachyspira
203.640 matrizes e 2.320.582 suínos (Garcia, pilosicoli causadora da espiroquetose intestinal,
2006). Em 2008 a produção estadual atingiu 348 Brachyspira hyodysenteriae causadora da
mil toneladas, um aumento de 3,77% disenteria suína e o Trichuris suis causador da
comparado ao ano anterior. Só a região de tricuriase são os patógenos mais frequentes
Uberlândia teve um aumento de mais de 500% durante as fases de recria e terminação (Stege et
no seu efetivo suíno. Atualmente, a região do al., 2000; Baccaro et al., 2003, Suh e Song,
Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba possui 2005; Haugegaard, 2009). Stege et al. (2000)
64.780 matrizes sendo a região com maior observaram que amostras de E. coli
produção no estado, seguida pela Zona da Mata enterotoxigênica podem ser detectadas em
com 56.661 matrizes e região Metropolitana de suínos de 30 a 50Kg com ou sem sinal de
Belo Horizonte com 25.044 matrizes (Garcia, diarreia, o que colocou essa bactéria em
2006). evidência na fase de recria como causadora de
diarreia (Pittman 2010).
O crescimento da produção de suínos
no estado vem sendo acompanhado Os riscos de diarreia aumentam quando
detalhadamente pelo Instituto Mineiro de os suínos são infectados por dois ou mais
Agropecuária (IMA). Em 2006, o IMA efetuou patôgenos simultaneamente (Stege et al., 2000,
o georreferenciamento de 88% das granjas, Suh e Song., 2005), pois os sinais clínicos e as
abrangendo 94% das matrizes suínas lesões intestinais tendem a ser mais intensos
cadastradas. Do total de granjas cadastradas, (Jacobson et al., 2003). As infecções entéricas
1.186 são de ciclo completo (79,4%), 264 são por um único patogêno assim como as infecções
unidades de recria e terminação (17,7%) e 41 entéricas mistas representam um grande desafio

26
para a suinocultura atual, pois exigem formas pelo órgão governamental de defesa sanitário,
eficientes de controle e tratamento. Apesar dos Instituto Mineiro de Agropecuária (IMA), que
relatos sobre a importância de patógenos totalizaram 256 granjas de ciclo completo no
entéricos em animais de recria e terminação estado, foram avaliadas 46 granjas de ciclo
serem frequentes na literatura internacional completo de suínos divididas em dois níveis;
(Thomson et al, 1998; Stege et al., 2000; mais de 500 matrizes (>500) e entre 101 a 500
Jacobson et al., 2005; Suh e Song 2005; La et matrizes (101-500). Foram coletada fezes de
al., 2006), sua relevância e frequência na uma média de 11 animais por propriedade (total
suinocultura brasileira são pouco conhecidos. 512 amostras) no período de janeiro de 2008 a
fevereiro de 2010. As granjas foram
A principal justificativa pela falta de selecionadas a partir de quatro diferentes
informações sobre a freqüência destes agentes regiões geográficas do estado de Minas Gerais,
causadores de problemas entéricos é a Brasil: regiões sul e sudoeste (SSO),
dificuldade de isolamento e detecção destes metropolitana de Belo Horizonte (MBH), Zona
patógenos. L. intracellularis é uma bactéria da Mata (ZM) e Triângulo Minério e Alto
intracelular obrigatória que não permite Paranaíba (TAP). Essas regiões foram
isolamento para comprovação de diagnóstico. escolhidas para a amostragem por serem as
As duas Brachyspiras, por serem anaeróbias quatro maiores áreas produtoras de suínos no
restritas, são de difícil isolamento, não sendo estado.
cultivadas rotineiramente no Brasil atualmente.
Desta forma, para o diagnóstico destes
enteropatógenos têm-se utilizado técnicas Os animais amostrados tinham entre 60
moleculares em amostras fecais ou intestinais, e 140 dias, idade correspondente às fases de
como a PCR e a PCR-duplex (Baccaro et al, recria e terminação e estavam recebendo ração
2003). Já a Salmonella enterica sorotipo medicada. (promotores de crescimento). As
Typhimurium tem de ser necessariamente fezes eram coletadas diretamente do reto,
isolada, uma vez que o teste da PCR não identificadas e enviadas sob refrigeração ao
diferencia cepas patogênicas de não Laboratório de Patologia Molecular da
patogênicas. Universidade Federal de Minas Gerais.

O objetivo desse estudo foi determinar 2.3.2 Metodologia empregada no

a prevalência dos enteropatógenos L.
intracellularis, B. pilosicoli, B. hyodysenteriae,
isolamento de Salmonella spp.
S. enterica, E. coli enterotoxigênica, T. suis e a
2.3.2.1 Pré-enriquecimento das amostras
ocorrência de infecções mistas bacterianas em
suínos, provenientes de propriedades com Alíquotas de 1 grama de fezes foram
diarreia ou com histórico de diarreia, do estado homogenizadas com 4 ml de solução salina
de Minas Gerais, Brasil. fosfatada tamponada (PBS) por 60 segundos sob
agitação constante. Posteriormente, 1 ml dessa
solução foi transferido para um tubo de
2.3. MATERIAL E MÉTODOS hemólise com 9 ml de Água Peptonada
Tamponada1 estéril a 1% e incubadas em estufa
2.3.1 Granjas, animais e coleta de fezes a 37°C por 18-24 horas, sob condições normais
de aeração (Bessa et al., 2004).
A amostragem foi realizada em dois
níveis: propriedades e animais. Para a
determinação do número de rebanhos a serem 2.3.2.2 Enriquecimento seletivo
estudados foi utilizada amostragem simples Alíquotas de 100µL, provenientes do
empregando a prevalência crítica (50%); devido pré-enriquecimento, foram transferidas para 9,9
à ausência de dados prévios no estado; com
intervalo de confiança de 95% e erro de 15%
(Noordhuizen et al., 1997). A partir da lista
1
conjunta de propriedades cedida pela professora DB DIFCOTM, Buffered Peptone Water, cat n°
Simone Koprowsky Garcia (Garcia, 2006) e 218105, Interlab, São Paulo, SP, Brasil.

27
ml de caldo Rappaport-Vassiliades2 e incubadas Ágar Infusão Cérebro e Coração9 (BHI).
em estufa a 42°C por 24 horas, sob condições de Coletou-se com a alça de platina uma colônia
aeração normais (Clarke &Gyles, 1993). bacteriana suspeita de Salmonella sp., e, sobre
uma lâmina de vidro e homogenizou-se-a em
uma gota de solução salina a 0,85%. Foi
2.3.2.3 Isolamento em meio sólido adicionada a esta solução inicial, uma gota de
Uma alçada do caldo de soro que foi homogeneizada com movimentos
enriquecimento de cada amostra foi semeada rotatórios delicados para a observação da
nos meios seletivos Ágar verde brilhante3 aglutinação.
(AVB) e Ágar Xilose-Lisina-Tergitol 44 (XLT-
4). As placas foram incubadas em estufa a 37°C
por 24 a 48 horas, sob condições normais de 2.3.2.6 Sorotipificação de Salmonella sp.
aeração (Davies & Nichols, 2001; Bessa et al., Após a identificação, confirmação
2004). bioquímica e sorológica dos isolados, estes
foram repicados em placas de Ágar MacConkey
10
2.3.2.4 Identificação dos isolados e incubados na estufa por 24 horas a 37°C sob
As colônias suspeitas de Salmonella sp. condições normais de aeração. Em seguida
foram identificadas pelas características tocou-se uma colônia, de cada placa, com
morfológicas e bioquímicas. Para as provas agulha de inoculação e semeou-se em
bioquímicas foram utilizados os meios Triple profundidade em microtubos contendo 4 ml de
Sugar Iron agar5 (TSI), caldo lisina6 e caldo ágar de manutenção. Estes microtubos foram
uréia7. Os meios foram semeados e incubados então identificados e incubados por 18 horas sob
em estufas por 18-24 horas a 37°C, sob as mesmas condições de temperatura e de
condições normais de aeração (Clarke &Gyles, aeração (Oliveira, 2000; Bessa et al., 2004). Os
1993; Bessa et al., 2004). microtubos contendo os isolados foram
embalados e enviados ao setor de
Enterobactérias do departamento de
2.3.2.5 Confirmação sorológica dos resultados bacteriologia do instituto Oswaldo Cruz, no Rio
de Janeiro, para sorotipificação.
A confirmação definitiva dos isolados
identificados pelas provas bioquímicas como
2.3.3 Metodologia empregada no
sendo Salmonella sp. foi feita pela aglutinação
em lâmina, utilizando o Soro Salmonella isolamento de colônias Lactose positiva
Polivalente Somático8. O teste foi realizado a sugestivas de Escherichia coli
partir de culturas de 18 horas a 37°C, sob
condições normais de aeração, crescidas em Alíquotas de 1 grama de fezes
homogeneizadas em 4 ml de PBS estéril foram
plaqueadas em ágar MacConkey e incubados
em estufa por 24 horas a 37°C sob condições
2 normais de aeração. Posteriormente, as colônias
DB DIFCOTM, Rappaport-Vassiliades R10 lactose positiva com características
Broth, cat n° 218581, Interlab, São Paulo, SP, morfológicas de Escherichia coli foram
Brasil. selecionadas com o auxilio de uma alça
3
DB DIFCOTM, Brilliant Green Agar, cat n° descartável. Essas colônias foram congeladas
228530, Interlab, São Paulo, SP, Brasil. em uma solução com 70% de caldo BHI e 30%
4
DB DIFCOTM, XLT4 Agar base, cat n° de Glicerol11 a -80°C para posterior
223420, Interlab, São Paulo, SP, Brasil genotipagem dos fatores de patogenicidade.
5
DB DIFCOTM, Triple sugar iron agar, cat n°
226540, Interlab, São Paulo, SP, Brasil
6
DB DIFCOTM, Lysine Broth, cat n° 211759, 9
DB BACTOTM, Brain Heart Insufion, cat n°
Interlab, São Paulo, SP, Brasil. 237500, Interlab, São Paulo, SP, Brasil
7
DB DIFCOTM, Urea Broth, cat n° 227210, 10
DB DIFCOTM, Agar MacConkey, cat n°
Interlab, São Paulo, SP, Brasil 212123, Interlab, São Paulo, SP, Brasil
8 11
PROBAC do Brasil, Soro polivalente somático Ultra Pure Glycerol, Lab Synth, Diadema, SP,
Anti “o”, Higienópolis, SP, Brasil. Brasil.

28
 proporção de 1:1 em homogenizador por cerca
2.3.4 Detecção de Lawsonia de um minuto (Winkelman e Tasker, 2002).
intracellularis, Brachyspira Esse material foi submetido a avaliação
bacteriológica e parasitológica que asseguraram
hyodysenteriae e Brachyspira pilosicoli
a ausência de outros patógenos relevantes como
pela PCR Multiplex Salmonella sp e T. suis. Esse material foi
utilizado como controle positivo durante todo o
A técnica de PCR multiplex utilizada experimento.
para o diagnóstico de L. intracellularis, B.
hyodysenteriae e B. pilosicoli foi feita de acordo
com o protocolo descrito por La et al., (2006) 2.3.4.2 Extração de DNA
sendo descrito aqui brevemente.
O DNA foi extraído de todas as
amostras de fezes utilizando-se o QIAamp DNA
Stool Mini Kit13 de acordo com instruções do
2.3.4.1 Controle positivo
fabricante.
Os controles positivos de B. pilosicoli
(cepa P51 - NCTC 12874) e B. hyodysenteriae
(cepa B204T - ATCC 31212) foram gentilmente 2.3.4.3 Pares de Primers do PCR multiplex
cedidos pelo Departamento de Veterinária e
Ciências Biomédicas da Universidade de Os pares de primers utilizados na PCR
Minnesota, EUA. As bactérias chegaram ao foram respectivamente: H1 (FWH) (5’-
laboratório em meio de congelamento contendo ACTAAAGATCCTGATGTATTTG-3’) e H2
sangue e soro fetal bovino (SFB). Após o (REV) (5’-CTAATAAACGTCTGCTGC-3’)
descongelamento alíquotas de cada amostra que tem como alvo a amplificação de um
foram semeadas até o esgotamento em placas de fragmento de 354 pb no gene nox da
ágar sangue ovino a 5%. Foram feitos de 2 a 3 Brachyspira hyodysenteriae; P1 (FWH) (5’-
cortes no ágar, com o auxilio de uma alça AGAGGAAAGTTTTTTCGCTTC-3’) e P2
estéril, para facilitar o crescimento das colônias (REV) (5’-
de Brachyspira sp.. As placas foram GCACCTATGTTAAACGTCCTTG-3’)
posteriormente incubadas em cubas de amplificando uma região de 823 pb do
anaerobiose, juntamente com uma placa de segmento 16S do rRNA da B. pilosicoli; e os
Anaerobac12 para o estabelecimento da primers Lint-146F (5’-
anaerobiose, por 72 horas a 37°C. GATAATCTACCTTCGAGACGG-3’) e Lint-
745R (5’-TGACCTCAGTGTCAGTTATCGT-
Após crescimento, as placas foram 3’) que amplificam um segmento de 655 pb do
lavadas com 1 ml de PBS estéril. Desse lavado, gene 16S do rRNA da L. intracellularis.
250 µL froam acondicionados em microtubos de
1,5 ml contendo 500 µL de SFB para posterior
2.3.4.4 PCR Multiplex
congelamento a -80°C. Esse material foi
utilizado como controle positivo da reação da Todos os testes da PCR foram
PCR durante todo o experimento. executados em um volume de 25 µl por
microtubo. O mix da PCR consistia de: 1X de
O controle positivo de L. intracellularis tampão para PCR (contendo 1, 5 mmol-1 de Mg
foi obtido a partir do pool de segmentos Cl2), 1,25 U de Taq DNA polymerase14, 0,1
intestinais de suínos com lesões típicas de mmol-1 de cada dNTP15, 0,2 µmol-1 de cada par
enteropatia proliferativa, confirmada por IHQ, de primer (H1 e H2, P1 e P2, Lint-146F e Lint-
que foram congelados e mantidos a -80ºC. A 745R) e 2,5 µl da amostra de DNA (template).
mucosa foi raspada utilizando-se lâminas de
13
vidro e o material obtido a partir da mucosa QIAamp DNA Stool Mini Kit, QIAGEN, cat
lesada foi homogeneizado em solução de n° 51504, Uniscience, São Paulo, SP, Brasil.
14
Sacarose, fosfato e glutamato (SPG) na Cenbiot, Taq. DNA polymerase, Ludwig
Biotec, Porto Alegre, RS, Brasil.
12 15
PROBAC do Brasil, Anaerobac, INVITROGEN, dNTP set, Carlsbad, CA,
Higienópolis, SP, Brasil. EUA.

29
As condições da PCR evolveram um passo bactérias acrescidas das fezes. Para a realização
inicial de 5 min a 95°C para a ativação da Taq desse mix pesou-se 0,6 gramas de fezes e esta
DNA polimerase, seguido de 35 ciclos de foi acrescida de 200 µL de L. intracellularis,
desnaturação a 95°C por 30s, anelamento a 200 µL B. pilosicoli e 200 µL B.
58°C por 90s e extensão a 68°C por 120s. O hyodysenteriae. Essa mistura foi realizada em
último passo consistiu de extensão final a 68°C um microtudo de 2 ml que posteriormente foi
por 10 min. Os produtos da PCR (amplicons) homogeneizado em um vórtex por 60 s. Pesou-
foram submetidos à eletroforese em gel de se 0,2 gramas desse homogeneizado para a
agarose a 1% com tampão TAE 1X, e marcados realização da PCR multiplex de cada uma das
com Brometo de Etídio e revelados sob luz ultra diluições analisadas.
violeta.
2.3.5 Detecção de Escherichia coli
enterotoxigênica
2.3.4.5 Teste de sensibilidade analítica do PCR
multiplex O método empregado para a detecção
A quantificação de cada um dos de E. coli enterotoxigênica é o mesmo descrito
controles positivos utilizados foi feita através de por Macedo et al. (2007). Como controle
diluições seriadas de 1:10 do inóculo em PBS positivo para os fatores de virulência da técnica
(pH 7,2), impregnação de lâmina de vidro e da PCR multiplex foram utilizadas quatro
coloração por IHQ. Resumidamente, colocou-se amostras referência de E. coli, gentilmente
10 µL de cada diluição em um poço de lâmina cedidas pelo Veterinary Diagnoses Laboratory
de vidro de 15 poços. A lâmina foi incubada em da University of Minnesota (EUA): 2568 (Stb,
estufa à 37°C, por 30 min, para secagem do StaP, F18 e Stx2e) (Cepa 31385-97), 2569 (Stb,
líquido. Em seguida, a lâmina foi fixada em LT e K88) (Cepa 45556-97), 2570 (987P e
acetona gelada e corada através da técnica de StaP) (Cepa C3-98) e 2571 (StaP, K99 e F41)
imunoperoxidase indireta utilizando-se (Cepa C5-98).
anticorpo policlonal específico para L.
intracellularis e Brachyspira sp.. O número de
organismos foi contado ao microscópio ótico. A 2.3.5.1 Extração de DNA
concentração final foi obtida através da As amostras de colônia lactose positiva
multiplicação do número de bactérias presentes foram descongeladas e plaqueadas em ágar
e o valor da diluição avaliada. MacConkey. As colônias isoladas foram
coletada usando alça de platina e ressuspendida
em microtubo contendo 500µl de solução
Os controles positivos, L. tampão fosfato (PBS), pH 7,2, estéril. Após
intracellularis, B. pilosicoli e B. hyodysenteriae, homogeneização em vortex, as amostras foram
todos com 109 bactérias por ml, foram centrifugadas a 7.000xg por 10min sob
submetidos a diluições seriadas de 101 até 106 refrigeração, para sedimentação de bactérias. Ao
bactérias por ml. O PCR de cada uma da sedimento, foi adicionado 270µl de solução de
amostras nas suas diferentes diluições foi feito e lise (Tris HCl 1,0M, pH 8,0; EDTA 0,5M; NaCl
posteriormente, essas diluições de bactérias, 4,5M; SDS 10%; qsp água destilada), 200µl de
foram misturadas a fezes, sabidamente High TE (Tris HCl 1,0M, pH 8,0; EDTA 0,5M;
negativas para cada um dos agentes testados, na qsp água destilada) e 5µl de proteinase K
proporção de 0,2 gramas de fezes e 200 µL de (20mg/ml). Após vigorosa agitação por 20 a 30s
cada diluição. Essa mistura foi homogeneizada (vortex), a mistura foi incubada a 55°C por, no
em vórtex por aproximadamente 60s e desse mínimo, três horas. O lisado, contendo o DNA
homogeneizado foram retiradas 0,2 gramas para bacteriano total, foi submetido ao método de
a realização da PCR multiplex. Após a analise extração de DNA fenol-clorofórmio, descrito
inicial de cada uma das bactérias nas suas por Sambrook et al. (1989). O DNA total
respectivas diluições com e sem fezes, extraído foi dosado por espectrofotometria para
realizamos um mix das três bactérias em cada quantificação do DNA total da amostra.
uma das diluições, somente com as três
bactérias reunidas e, posteriormente, das três

30
2.3.5.2 Primers do PCR multiplex 2.3.7 Avaliação histológica
Os primers utilizados para os diferentes Em algumas amostras provindas de campo
genes de fatores de virulência estão descritos no amostras teciduais de intestino foram remetidas
Quadro 2. junto com as fezes. Essas amostras teciduais foram
fixadas em formol tamponado 10%, processadas
2.3.5.3 PCR multiplex para fator de pela técnica rotineira de inclusão em parafina e
patogenicidade da Escherichia coli corados pela técnica histológica de Hematoxilina e
Eosina (HE) (Luna, 1968). As lesões histológicas,
Todos os testes da PCR foram
quando presentes, eram classificadas de acordo
executados em um volume de 10µl, contendo
com sua intensidade como ausente, leve, moderada
10ng de DNA bacteriano, 0,2µM de cada
ou acentuada (AFIP, 2010).
dNTP1, 1,5µM de MgCl2, 0,5µM de cada
primer e uma unidade de Taq DNA
polimerase16. Água ultra pura estéril17 foi usada 2.3.8 Imuno-histoquímica
como controle negativo da PCR e algumas
amostras negativas foram submetidas a mais de 2.3.8.1 Lawsonia intracellularis
uma PCR, desta vez usando os primers Fragmentos de intestino; duodeno, jejuno,
separadamente, para comprovação da ausência íleo, colon e ceco foram fixados em formol
dos genes nessas amostras. O programa de tamponado 10% e processados para inclusão em
amplificação utilizado foi de 25 ciclos de 94°C parafina. Lâminas silanizadas com secções de 3
por 1min, 55°C por 1min e 70°C por 2min; µm de cada tecido foram submetidas à técnica de
extensão final no último ciclo por 10min a 72°C imuno-histoquímica (IHQ) utilizando a
e, finalmente, 4°C. Os produtos da amplificação Streptavidina18 marcada e anticorpo policlonal
foram separados em eletroforese em gel de específico para L. intracellularis na diluição
poliacrilamida (6%) e corados pela prata. de1:30.000 (Guedes e Gebhart, 2003). O protocolo
da técnica encontra-se detalhado no ANEXO 1.
2.3.6 Exame parasitológico para
Trichuris suis A marcação positiva foi detectada
Para a detecção dos ovos de T. suis nas utilizando-se 3-amino-9-etilcarbazol19 (AEC). A
fezes dos suínos, as amostras foram marcação pela IHQ foi graduada de ausente a
individualmente examinadas pela técnica de acentuada, sendo zero nenhuma marcação para
flotação, Willis-Mollay modificado (Hoffmann, L. intracellularis, leve foco único ou múltiplos
1987). Dois gramas de fezes foram pesados, de marcação antigênica (cerca de 25% das
diluídos e homogeneizados em uma solução criptas), moderada quando a maioria da mucosa
hipersaturada de NaCl. Posteriormente, essa apresenta marcação (26 a 75% das criptas) e
solução foi filtrada por duas gases sobrepostas e acentuada quando quase a totalidade da mucosa
o filtrado obtido foi colocado em um tubo intestinal apresenta marcação antigênica (acima
Falcon de 15 ml até a formação de um menisco. de 80% das criptas) (Guedes, 2002).
Sobre o menisco acrescentou-se uma lamínula
de vidro por 15 min, com cuidado para não 2.3.8.2 Brachyspira sp.
formar bolhas. Posteriormente, essa lamínula foi Lâminas silanizadas contendo
virada sobre uma lâmina de vidro e analisada ao secções de 3 µm de espessura de vários
microscópico. A intensidade da infecção foi segmentos do intestino grosso foram submetidas
avaliada de acordo com o número de ovos de à técnica de IHQ para a identificação de
parasitas observados; onde, 0 ausente, 1-5 leve, antígenos de bactérias do gênero Brachyspira
5-10 moderada e mais de 10 acentuada. sp.. Foi utilizada a técnica da Streptavidina
marcada e anticorpo policlonal

18
Dako LSAB+ System –HRP Biotinnylated,
cat n° K0690, INVITROGEN, Carpinteria,
16
Cenbiot, Taq. DNA polymerase, Ludwig USA.
19
Biotec, Porto Alegre, RS, Brasil. Dako, Corporation, AEC Substrate-
17
Ultra Pura Water, INVITROGEN, São Paulo, Chromogen, cat n°. K3464, INVITROGEN,
SP, Brasil. Carpinteria, USA.

31
Quadro 2 – Sequencia alvo de amplificação e tamanho dos produtos amplificados (Produto pb) pelos
primers para genes de fatores de virulência de Escherichia coli.
Produto
Seqüência de primer Fator pb

Stb: Forward 5’ – TGC CTA TGC ATC TAC ACA AT – 3’ enterotoxina B 113
Reverse 5’ – CTC CAG CAG TAC CAT CTC TA– 3’

StaP: Forward 5’ – CAA CTG AAT CAC TTG ACT CTT –3’ enterotoxina A 158
Reverse 5’ – TTA ATA ACA TCC AGC ACA GG– 3’

K99: Forward 5’ – AAT ACT TGT TCA GGG AGA AA – 3’ fímbria de adesão 230
Reverse 5’ – AAC TTT GTG GTT AAC TTC CT - 3’ (bovino e suíno)

LT: Forward 5’ – GGC GTT ACT ATC CTC TCT AT – 3’ enterotoxina 272
Reverse 5’ – TGG TCT CGG TCA GAT ATG T– 3’ termo-lábil

F18: Forward 5’ – TGG TAA CGT ATC AGC AAC TA – 3’ fímbria de adesão 313
Reverse 5’ – ACT TAC AGT GCT ATT CGA CG – 3’ (homem, bovino e
suíno)

987P: Forward 5’ – GTA ACT CCA CCG TTT GTA TC – 3’ fímbria de adesão 409
Reverse 5’ – AAG TTA CTG CCA GTC TAT GC –3’ (suíno)

K88: Forward 5’ – GTA TCT GTC CGA GAA TAT CA - 3’ fímbria de adesão 499
Reverse 5’ – GTT GGT ACA GGT CTT AAT GG – 3’ (suíno)

F41: Forward 5’ – AGT ATC TGG TTC AGT GAT GG – 3’ fímbria de adesão 612
Reverse 5’ – CCA CTA TAA GAG GTT GAA GC – 3’ (bovino, suíno e
ovino)

Stx2e Forward 5’ – AAT AGT ATA CGG ACA GCG AT – 3’ Shiga like toxina II 733
Reverse 5’ – TCT GAC ATT CTG GTT GAC TC – 3’ (homem, bovino e
suíno)

Fonte: Modificado de Macedo et al., 2007.

especifico para o gênero Brachyspira sp. na

diluição de 1:75. A marcação positiva foi detectada 2.3.8.3 Circovírus suíno tipo II (PCV 2)
utilizando-se AEC. A técnica aplicada está descrita Quando eram obsevadas lesões
com maiores detalhes no ANEXO 2. histológicas sugestivas de infecção por PCV-2
empregava-se a IHQ, utilizando-se um
A marcação pela IHQ foi graduada em escala de anticorpo policlonal, anti-PCV-2, na diluição de
ausente, leve, moderada e acentuada, sendo ausente 1:800 (Ciacci-Zanella et al., 2006) de Iowa State
nenhuma marcação, leve foco isolado ou múltiplos University (ANEXO 3).
de marcação antigênica, (cerca de 25% do corte),
moderada quando a maioria da mucosa apresenta 2.3.9 Análise estatistica
marcação (26 a 75% do corte) e acentuada onde Para análise estatística, que avaliou a
quase a totalidade da mucosa intestinal apresenta associação entre a presença de patógenos e o
marcação antigênica (acima de 80% da mucosa). O tamanho da granja, utilizou-se o teste exato de
anticorpo policlonal para Bachyspira sp. foi
gentilmente cedido pelo professor David Barcellos
da UFRGs, Porto Alegre, Brasil.
Fischer, através do programa SAS20. A
prevalência foi calculada de acordo com
Noordhuizen et al. (1997) e o intervalo de
confiança foi calculado através do programa
SAS.

2.4 RESULTADOS

O estudo analisou 46 granjas

produtoras de suínos de ciclo completo. Dessas,
31 tinham 101-500 matrizes e 15 tinham mais
de 500 matrizes. A amostragem de granjas por
estrato e região está demonstrada na Tabela 1.
Um total de 512 amostras de fezes foram
coletadas e examinadas (Figura 6). A análise
estatística pelo teste exato de Fisher não
mostrou associação significativa entre a
presença de patógenos e o tamanho da granja.

Tabela 1 – Número de propriedades coletadas

de cada região relacionada com o
número de matrizes.

Número Região*
de Total
Matrizes Figura 6 – A) Suíno de terminação com
ZM TMAP MBH SSO
diarreia, em uma granja com 101-500
matrizes da região sul e sudoeste de
Minas Gerais. B) Presença de fezes
101-500 11 5 8 7 31 diarréicas no piso da baia da granja da
>500 7 5 2 1 15 figura A. Nessa propriedade foram
Total 18 10 10 8 46
identificadas amostras de fezes
Zona da Mata (ZM), Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba
(TMAP), Área Metropolitana de Belo Horizonte (MBH), positivas para L. intracellularis e casos
Sul e Sudoeste (SSO). de coinfecção de L. intracellularis com
E. coli enterotoxigênica e PCV-2.

2.4.1 Salmonella spp.

O único sorotipo de Salmonella
enterica potencialmente patogênico encontrado,
foi o Typhimurium. O número de granjas e
amostras positivas para Salmonella enterica
sorortipo Thyphimurium foi de 6,52%, com um
intervalo de confiança (IC) de 0% a 13,65%, e
31 amostras (6,05%) respectivamente. Uma
propriedade com 101-500 matrizes e duas
propriedades com mais de 500 matrizes foram
positivas para Salmonella enterica sorotipo
Typhimurium. Este sorotipo foi mais prevalente
na região MBH seguida pela região da ZM.
Nenhuma granja ou amostra positiva para
Salmonella spp. foi observada na região SSO e
TMAP (Tabela 3).
20
SAS Institute, Cary, North Caroline, USA
1999

33
 Sorotipos de Salmonella enterica não 2.4.2 Lawsonia intracellularis,
patogênicos para os suínos foram detectados em Brachyspira pilosicoli e Brachyspira
sete rebanhos (15,2%). Salmonella enterica hyodysenteriae
sorotipo Agona foi observada em duas amostras
(0,4%) de um rebanho (2,17%) entre 101 e 500 O teste de sensibilidade analítica da
matrizes na região MBH. A Salmonella enterica PCR multiplex evidenciou que o limite de
sorotipo Panana foi diagnosticada em três detecção obtido para a B. pilosicoli, tanto na
propriedades (6,52%) e 13 amostras (2,54%). forma de cultura pura como misturada às fezes,
Todas as granjas estavam localizadas na região foi de 103 bactérias por grama de fezes (Figura
da ZM, duas delas possuíam 101-500 matrizes e 7A). Para a B. hyodysenteriae e para a L.
uma tinha mais de 500 matrizes. A Salmonella intracellularis o limite de detecção ficou em 104
enterica sorotipo Schwarzenground foi bactérias (Figura 7B e C), tanto na PCR com
observada em somente um rebanho (2,17%) da culturas puras como naquele realizado junto
região MBH com mais de 500 matrizes, com as fezes. Quando as três bactérias foram
totalizando duas amostras (0,4%). Duas misturadas, com e sem fezes, a sensibilidade
propriedades da região metropolitana (4,34%), analítica obtida foi de 104 bactérias por grama
uma com 101-500 matrizes e outra com mais de de fezes (Figura 7D).
500 matrizes, apresentaram amostras de
Salmonella enterica não-tipavéis, sendo que
somente uma amostra em cada granja foi
detectada (0,4%) (Tabela 2).

Tabela 2 - Distribuição da prevalência encontrada de sorotipos não patogênicos de Salmonella enterica

no estado de Minas Gerais de acordo com o tamanho do rebanho e região considerando
positividade da granja dentre as 46 avaliadas.
Granjas
PATOGENO 101-500 >500 Total Prevalência
Região* nº % nº % nº %
S. enterica Agona 1 2,17 0 0 1 2,17
MBH 1 2,17 0 0 1 2,17

S. enterica Panama 2 4,34 1 2,17 3 6,52

ZM 2 4,34 1 2,17 3 6,52

S. enterica
Schwarzengroud 0 0 1 2,17 1 2,17
MBH 0 0 1 2,17 1 2,17

S. enterica Não tipável 1 2,17 1 2,17 2 4,34

MBH 1 2,17 1 2,17 2 4,34
*
Área Metropolitana de Belo Horizonte (MBH), Zona da Mata (ZM).

34
 Figura 7 – Gel de agarose a 1%. A) Teste de sensibilidade analítica da B. pilosicoli. Kb marcador de
pares de base (100pb). Observa-se a detecção da bactéria até a concentração de 103 bact/ml.
B e C) Resultado do teste de sensibilidade analítica da L intracellularis e da B
hyodysenteriae, respectivamente. As bactérias apresentaram sensibilidade de detecção de
104 bact/ml. Kb marcador de pares de base (100pb). D) Teste de sensibilidade analítica da
PCR multiplex para B pilosicoli, L intracellularis e B hyodysenteriae, observa-se que
quando as três bactérias são adicionadas a PCR a sensibilidade analítica é 104 bact/ml. Kb
marcador de pares de base (100pb)

O número de amostras e granjas

A B. hyodysenteriae e a B. pilosicoli positivas foi de 26 (5,49%) e 5 (10,87%) (IC
não foram detectadas em nenhuma das 46 1,87-19,87%), respectivamente. Das 512
propriedades analisadas. A B. pilosicoli foi amostras de fezes coletadas, 473 amostras
diagnosticads somente em casos de infecção apresentaram crescimento de colônias lactose
mista associada a L. intracellularis (Figura 8) e positiva em ágar MacConkey. A bactéria E. coli
a S. enterica sorotipo Thyphimurium. A L. enterotoxigênica foi mais prevalente na ZM
intracellularis foi o enteropatógeno mais (6,52%), seguido pelo TMAP e SSO (2,18%).
prevalente em nosso estudo, 19,56% (IC 8,10- Duas granjas com 101-500 matrizes e três com
31,02%). A L. intracellularis foi diagnosticado mais de 500 matrizes apresentaram propriedades
em 9 rebanhos e foi detectada em 59 amostras positivas para E. coli enterotoxigênica (Tabela
(11,52%) das 512 avaliadas. Esta bactéria foi 3).
mais prevalente na ZM (8,69%), seguido pelo
TMHP (6,52%), e MBH e SSO (2,18%). Dessas O genótipo enterotoxigênico mais
9 granjas, 5 possuíam 101-500 matrizes e quatro observado foi o perfil STAP-Stb-F18 com 8/26
mais de 500 (Tabela 3). (30,76%) amostras positivas (Figura 9), seguido
pelo genótipo STAP-Stb-987P com 6/26
2.4.3 Escherichia coli (E. coli) (23,07%) positivos amostras. Outros perfis
enterotoxigênica genéticos encontrados foram: LT-K88, STAP-
Stb-K99, Stb-987P-K99, STAP-987P todos com

35
duas amostras de cada um e K99-LT, Stx2e-
987P, LT-K88-Stx2e e 987P-LT, todos com C1 C2 C3 C4
uma amostra positiva detectada (Tabela 4).

2.4.4 Trichuris suis

Ovos de T. suis não foram

diagnosticados em nenhuma das 46
propriedades avaliadas.

Figura 9 – Gel de poliacrilamida a 6%.

PCR multiplex dos fatores de
virulência para E. coli
enterotoxigenica. Produtos da
PCR de algumas amostras
coletadas a campo (linhas 5 a 8).
Kb marcador de pares de base
(100pb); controle 1 (C1) [STx2e
(733 pb) - F18 (313 pb) - StaP
(158 pb) -Stb (113 pb)];controle 2
(C2) [K88 (499 pb)- LT (272 pb) -
Figura 8 – Gel de agarose a 1%. PCR Stb (113pb)]; controle 3 (C3)
Multiplex Gel de agarose a 1% [987p (409 pb) e-StaP (158 pb)];
mostrando o tamanho dos produtos controle 4 (C4) [F41 (612 pb)-
da PCR de algumas amostras K99 (230 bp)- StaP (158 pb)];
coletadas a campo, B pilosicoli 823 controle negativo C-; 5, 8 E. coli
pb; L. intracellularis 655 pb; B. não enterotoxigênica; 6,7,
hyodysenteriae 354 pb; Kb, amostras positivas para E. coli
marcador de pares de base (100pb), enterotoxigênica, fimbria F18
C+, controle positivo e C-, controle (313 pb) e toxinas termo estáveis
negativo. Linhas 1, 2, 11, infecção StaP (158 pb) e Stb (113 pb).
mista por B. pilosicoli e L.
intracellularis; 3, B. pilosicoli; 4, 7,
9, 10, L. intracellularis; 5, 6, 8,
amostras negativas.

36
Tabela 3 - Distribuição da prevalência encontrada no estado de Minas Gerais de acordo com o tamanho do
rebanho, região e enteropatógeno; Lawsonia intracellularis, Brachyspira pilosicoli, E. coli
enterotoxigênica, Salmonella enterica sorotipo Typhimurium e infecção mista considerando positividade
da granja dentre as 46 avaliadas.
Granja
PATÓGENO 101-500 >500 Total Prevalence IC(95%)
Região nº % nº % nº % IL(%) SL(%)
8,10 31,02
L. intracellularis 5 10,87 4 8,69 9 19,56
a
TMHP 1 2,18 2 4,34 3 6,52
b
MBH 1 2,18 0 0 1 2,18
ZMc 2 4,34 2 4,34 4 8,69
d
SSW 1 2,18 0 0 1 2,18

E. coli 1,87 19,87

2 4,36 3 6,52 5 10,87
TMHPa 0 0 1 2,18 1 2,18
ZMc 2 4,34 1 2,18 3 6,52
d
SSW 0 0 1 2,18 1 2,18

S. typhimurium 0 13,65
1 2,18 2 4,34 3 6,52
b
MBH 1 2,18 1 2,18 2 4,34
c
ZM 0 0 1 2,18 1 2,18

S.typhimurium/L.intracellularis 1,87 19,87

4 8,69 1 2,18 5 10,87
TMHPa 2 4,34 0 0 2 4,34
MBHb 1 2,18 1 2,18 2 4,34
c
ZM 1 2,18 0 0 1 2,18

L.intracellularis/E. coli 0 13,65

1 2,18 2 4,34 3 6,52
a
TMHP 0 0 1 2,18 1 2,18
c
ZM 0 0 1 2,18 1 2,18
SSWd 1 2,18 0 0 1 2,18

L.intracellularis/E.coli/
S.typhimurium 0,55 16,83
4 8,69 0 0 4 8,69
TMHPa 1 2,18 0 0 1 2,18
MBHb 1 2,18 0 0 1 2,18
c
ZM 2 4,34 0 0 2 4,34

B.pilosicoli/L.intracellularis 0 6,4
1 2,18 0 0 1 2,18
MBHb
1 2,18 0 0 1 2,18

B.pilosicoli/L.intracellularis/S
typhimurium 0 6,4
0 0 1 2,18 1 2,18
b
MBH
0 0 1 2,18 1 2,18
*
Zona da Mata (ZM), Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba (TMAP), Área Metropolitana de Belo Horizonte (MBH), Sul e Sudoeste (SSO),
Intervalo de confiança (IC), Limite Inferior (LI), Limite Superior (LS).

37
Tabela 4 – Distribuição das amostras positivas para E. coli enterotoxigênica de acordo com os genótipos
observados, região e tamanho das granjas.
Região* ZM TMAP SSO MBH
Total
Genótipo 101-500 >500 101-500 >500 101-500 >500 101-500 >500
StaP-Stb-F18 1 3 3 1 8
StaP-Stb-987p 2 4 6
K99-LT 1 1
K88-LT 1 1 2
STx2e-987p 1 1
LT-K88-STx2e 1 1
StaP-Stb-K99 2 2
987p-StaP 1 1 2
987p-LT 1 1
Stb-987p-K99 2 2
Total 5 5 3 3 4 1 - 5 26
*
Zona da Mata (ZM), Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba (TMAP), Sul e Sudoeste (SSO), Área
Metropolitana de Belo Horizonte (MBH).

2.4.5 Infecções Mistas enterica Salmonella Typhimurium, um rebanho

A prevalência de infecções mistas no (2,18%) e três amostras (0,58%) (Tabela 3).
estado de Minas Gerais foi alta 30,43%. A
infecção mista foi diagnosticada em 14 granjas e 2.4.6 Histopatologia e Imuno-
foi detectada em 67 (13,08%) amostras. Houve histoquímica
uma maior frequência de infecção múltipla em Foram recebidas amostras para
rebanhos com 101-500 matrizes, 10 no total, em histopatologia de somente 13 granjas das 26
comparação com rebanhos de mais de 500 granjas, totalizando 28,26% das granjas
matrizes, quatro apenas. Nove rebanhos foram estudadas. Das 19 amostras que foram
positivos para dois agentes (19,56%) e 5 processadas, foi possível estabelecer o
rebanhos foram positivos para três agentes diagnóstico histológico em 17 casos. Nove
bacterianos (10,87%). amostras provenientes de 5 granjas da região
MBH apresentaram lesões histológicas
A região MBH teve a maior ocorrência consistentes com infecção por L. intracellularis.
de infecção mista, cinco rebanhos. A coinfecção Microscopicamente, observou-se proliferação
mais observada foi a da infecção por L. multifocal a focalmente extensa das criptas do
intracellualris e S. enterica sorotipo íleo e do ceco. Havia um grande número de
Thyphimurium, esta compreendeu 5 granjas (10, enterócitos jovens com aumento do número de
87% IC 1,87-19,87%) e 28 amostras (5,47%), figuras de mitose e ausência de células
seguida por L. intracellularis associada com E. caliciformes. No interior de algumas criptas
coli enterotoxigênica e Salmonella enterica havia restos celulares (Figura 10A e 10B). Essa
sorotipo Typhimurium presente em 4 lesão variou de moderada a acentuada nos
propriedades (8,69%) e 20 amostras (3,9%) tecidos corados por HE.
(Tabela 3). A detecção simultânea de E. coli
enterotoxigênicas e L. intracellularis foi Duas amostras provenientes de duas
diagnosticada em três rebanhos (6,52%) e 12 granjas, uma da região MBH (101-500 matrizes)
amostras (2,34%). B. pilosicoli tinha detecção e a outra da ZM (>500 matrizes), apresentaram
concomitante com L. intracellularis em um lesões sugestivas de infecção por Salmonella
rebanho (2,18%) correspondente a quatro enterica sorotipo Typhimurium. Havia necrose
amostras (0,78%) (Fig. 1), e com L. da mucosa do íleo, mas essa lesão era mais
intracellularis mais subespécies Salmonella evidenciada no colon e no ceco, sendo que

38
nesses segmentos a necrose se estendia até a concentrava-se no ápice das células epiteliais e
lâmina própria. Sobre essas áreas havia grande apresentava-se disposto paralelamente nas
quantidade de restos celulares e fibrina criptas intestinais afetadas (Figura 10C).
formando uma membrana fibrinonecrótica, com Marcação positiva também era observada nos
colônias bacterianas basofilicas aderidas (Figura enterócitos maduros da mucosa intestinal. A
11A e 11B). Na lâmina própria observou-se marcação foi leve em três animais, moderada
grande quantidade de neutrófilos e macrófagos. em quatro e acentuada em dois casos. A
No ceco de um suíno proveniente de uma granja detecção do antígeno de Brachyspira sp. foi
com 101-500 matrizes da região MBH, havia evidente nos focos de lesão, onde as bactérias
grande quantidade de bactérias aderidas em grande quantidade se alinhavam
intimamente na mucosa formando uma lesão perpendicularmente a mucosa do intestino
denominada de “falso bordo em escova” (Figura (Figura 12B).
12A), lesão característica de B. pilosicoli.
Em quatro amostras de tecido
intestinal, vindas de três granjas da região MBH
(2 com 101-500 matrizes e 1 com
>500matrizes), e em uma amostra vinda de uma
granja da região SSO de Minas (101-500
matrizes), observou-se lesões características de
circovírus suíno tipo II (PCV-2). Havia enterite
granulomatosa caracterizada por macrófagos
epitelióides e células gigantes multinucleadas na
lâmina própria e em alguns casos corpúsculos
de inclusão basofílicos intracitoplasmaticos
(Figura 13A e 13B). Nas placas de Peyer de
todos os quatro animais verificou-se depleção
linfóide em áreas interfoliculares e nos centros
foliculares e, esporadicamente, presença de
células sinciciais dentro de folículos linfóides.
Infiltração por histiócitos nas áreas
interfoliculares e inclusões intracitoplasmáticas
em macrófagos também foram observadas. A
marcação IHQ revelou antígenos de PCV-2 no
citoplasma de macrófagos, macrófagos
epitelióides e células gigantes (Figura 13C).
Figura 10 - Lesão histológica de enteropatia Essa marcação era leve em um animal,
proliferativa (L. intracellularis). A) moderada em três e acentuada em um suíno.
Ceco. Observa-se proliferação difusa
das criptas intestinais (setas), com Das granjas analisadas, positivas para
espessamento da mucosa, HE, 4X. B) PCV-2 e com síndrome da refuagagem,
Nas criptas observa-se grande observou-se que em três casos o vírus estava
quantidade de enterócitos jovens associado a um patôgeno entérico. Duas
(seta) com ausência de células propriedades com 101-500 matrizes uma da
caliciformes e restos celulares no região SSO e outra da região MBH
lúmen (cabeça de seta), HE, 40X. C) apresentavam coinfecção simultânea de PCV-2
Observa-se marcação positiva com L. intracellularis. Em outra granja da
(vermelho) para o antígeno da L. região MBH com 101-500 matrizes o PCV-2
intracellularis, no ápice do estava associado a S. thiphymurium. Na granja
citoplasma dos enterócitos das criptas com >500 matrizes localizada na região MBH
intestinais (setas), IHQ, 20X. nenhum enteropatógeno associado foi
encontrado.
A marcação de IHQ para L.
intracellulares evidenciou que o antígeno Em duas amostras processadas em HE
não foi possível estabelecer o diagnóstico. Essas

39
amostras de tecidos foram oriundas de uma foram positivas para nenhum dos agentes
granja da região da ZM com 101-500 matrizes. avaliados. Todos os demais diagnósticos
As lesões histológicas foram inespecíficas e histológicos foram comprovados através da
consistiam de restos celulares no interior das PCR e dos exames microbiológicos.
criptas com focos multifocais leves de
neutrófilos na lâmina própria. As fezes não

Figura 12 - Lesão histológica de colite

espiroquetal (B. pilosicoli). A)
Observa-se grande quantidade de
bactérias aderidas
Figura 11 - Lesões histológicas de perpendicularmente a mucosa,
salmonelose (S. enterica sorotipo formando um “falso bordo em
Typhimurium). A) Cólon necrose escova” (seta), HE, 20X. B) Há
da mucosa intestinal com a marcação imuno-histoquímica
formação de uma membrana positiva (vermelho) nas bactérias
fibrino necrótica (cabeça de seta) aderidas a mucosa intestinal
sobre a área de lesão, HE, 20X. (seta), IHQ, 40X.
B) Observa-se com maior detalhe
os restos celulares composto em
sua maioria por neutrófilos
degenerados entremeados à
fibrina (asterisco), HE, 40X.

40
 de desuniformidade e desequilíbrio nos
indicadores de produtividade desta atividade.
Estas patologias são muito prevalentes na
suinocultura devido ao confinamento total,
sendo que diagnóstico e controle são um
constante desafio, devido à participação de
vários fatores de vários fatores infecciosos e não
infecciosos, na etiopatogenia, agindo de maneira
sinérgica ou somatória contribuindo para
instalação do quadro patológico e aumentando
seu impacto (Mores, 1994).

Geralmente, os estudos sobre doenças

entéricas se concentraram em um patógeno
específico (Fellström et al., 1996), diminuindo
as chances de um diagnóstico correto dos
Figura 13 - Lesões histológicas de circovirose problemas sanitários que afetam o rebanho.
(PCV2). A) Enterite granulomatosa difusa Têm-se relatos que os surtos de L.
acentuada, há grande quantidade de intracellularis e Brachyspira spp. ocorrem mais
macrófagos, macrófagos epitelióides e frequentemente em grandes unidades de
células gigantes (seta) na lâmina própria, produção (Holyoake et al., 1994), isto é, parece
HE, 20X. B) Observam-se as células do existir uma associação entre o tamanho do
infiltrado granulomatoso em maior rebanho e a presença do patógeno. No entanto,
detalhe, notar a grande quantidade de os resultados deste estudo não demonstraram
células gigantes (setas), HE, 40X. C) essa relação, já que não houve diferença
Marcação imuno-histoquímica positiva estatística entre a presença dos enteropatógenos
para PCV-2, no interior dos macrófagos e o tamanho das granjas avaliadas.
(cabeça de seta) e células gigantes na
lâmina própria (seta), IHQ, 40X. A prevalência de rebanhos infectados
por L. intracellularis foi de 19,56% (8,10 –
2.5 DISCUSSÃO 31,02%). Esse resultado está de acordo com o
relatado em outros países, onde a prevalência de
L. intracellularis variou de 15% a 93,7%
A situação sanitária global do rebanho
(Thomson et al., 1998; Stege et al., 2000, Jensen
suíno brasileiro é boa quando comparada à
et al., 2006; Biksi et al., 2007). Esse resultado
situação dos maiores países produtores de
de prevalência também concorda com outros
suínos. A evidência disso está nos índices
estudos brasileiros. Moreno et al. (2002) e
produtivos alcançados pelos nossos rebanhos
Bacarro et al. (2003) relataram 15% de amostras
tecnificados, que são iguais ou superiores à de
fecais positivas (146/971 em idades variando de
outros países onde a suinocultura é
35 a 180 dias de idade) e 30% de granjas
desenvolvida (ABIPECS, 2008; Mores, 1994).
infectadas (203 granjas provenientes de sete
Infelizmente, no Brasil, com exceção das
regiões produtoras de suínos no Brasil) por L.
Granjas de Reprodutores Suídeos (GRSC) e de
intracellularis, respectivamente. A diferença
algumas das doenças listadas pela Organização
entre as prevalências observadas pode ser
Internacional de Epizootias (OIE), os estudos
explicada por variações regionais, diferenças no
epidemiológicos para muitas das doenças de
sistema de criação de suínos, uso de
ocorrência enzoótica, ainda são escassos.
antibióticos, população amostrada (doentes ou
animais saudáveis) e tecnicas de diagnóstico
As doenças entéricas têm sido
utilizadas.
identificadas com alta frequência na
suinocultura tecnificada, não só no Brasil, mas
Utilizando diferentes técnicas de
em todo mundo, representando importante fator
detecção (isolamento bacteriano e PCR), a

41
prevalência de B. pilosicoli e B. hyodysenteriae resultando em falsos negativos. O limite de
já foi estimada em várias regiões do globo. Em detecção da PCR multiplex quando se associava
um estudo dinamarquês, a B. pilosicoli foi as três bactérias foi de 104 bactérias por grama
isolada de 19% de 79 rebanhos avaliados e a B. de fezes. Estes níveis de detecção são
hyodysenteriae estava presente em 2,5% dessas consistentes com outros já relatados
granjas (Stege et al, 2000). Em uma pesquisa anteriormente (Jones et al., 1993; MФller et al.,
realizada no Reino Unido entre 1992 e 1996, 1998; La et al., 2003). A inibição da PCR, por
envolvendo 85 propriedades de suínos, a B. sais biliares presentes nas fezes, também é um
pilosicoli foi identificada em 21 granjas (25%) e problema para o diagnóstico de amostras fecais
a B. hyodysenteriae em 6 (7%) (Thomson et al., preparadas diretamente para PCR. Portanto a
1998). Um estudo recente da Suécia revelou a inibição pode ser um problema na detecção de
presença de B. pilosicoli em 34 rebanhos de 105 amostras positivas tanto de portadores clínicos
estudados e a ausência de B. hyodysenteriae nos como subclínicos (Jacobson et al., 2004). Mas,
rebanhos avaliados. Nesse mesmo trabalho, a acredita-se que o kit de extração utilizado em
presença da B. pilosicoli estava nosso estudo tenha eliminado essa variante.
significativamente associada com rebanhos de
terminação de baixo desempenho (Jacobson et A prevalência total de S. enterica
al., 2005). Em nosso estudo nenhuma amostra sorotipo Typhimurium (6,52%) e dos demais
positiva de B. hyodysenteriae foi detectada e a sorotipos de S. enterica (15,2%) encontrados foi
presença de B. pilosicoli estava sempre asociada elevada quando comparada à resultados de
a outros agentes entéricos (infecções mistas) e outros países como a Dinamarca (10,1%) e
em poucas propriedades. Esta baixa prevalência Reino Unido (13%) (Thomson et al., 1998;
pode ser explicada pelo uso de aditivos na Stege et al, 2000). Essa variação na prevalência
alimentação. Têm-se relatos de que a ocorrência pode ser causada por diferenças de manejo
de Brachyspira sp. pode ser subestimada devido principalmente no que se diz respeito a
ao uso de promotores de crescimento na ração programas de limpeza e desinfecção das
(Hampson, 2000) o que pode explicar o instalações, presença de portadores
resultado observado. Dessa forma, podemos assintomáticos, qualidade da matéria prima para
inferir que os altos valores de prevalência rações, qualidade da água, além da presença de
observados na Europa, estão diretamente possíveis vetores nas granjas como roedores e
relacionados com a não utilização de pássaros que podem afetar o grau de
promotores de crescimento e antibióticos na transmissão (Hampson, 2000). A Salmonella
alimentação dos suínos. Em um estudo realizado spp. foi diagnosticada na ZM e região MBH.
no Brasil por Barcellos et al. (2003), 38 Acredita-se que a maior densidade de suínos
propriedades foram examinadas (22 com rações nessas áreas associado a presença de instalações
medicadas e 16 com ração não medicada), B. mais antigas tenha contribuído para o
hyodysenteriae e B. pilosicoli foram detectadas surgimento de tais valores. A S. enterica
respectivamente em 0% e 6,25% das granjas sorotipo Typhimurium pode causar diarreia em
medicadas e de 31,8% e 45,5% em granjas não suínos, mas, o mais importante é que a
medicadas. Salmonella spp. é um agente zoonótico
(Weneger e Bager, 1997; Stege et al., 2000).
Sabe-se, que o isolamento bacteriano
para Brachyspira sp. apresenta uma maior A Salmonella spp. tem um papel
sensibilidade de diagnóstico do que a técnica da importante na contaminação da carne suína e
PCR (Komarek et al., 2009), o que também seus derivados o que pode causar graves
pode explicar os baixos valores observados doenças no homem (Weiss et al., 1999). Em
nesse estudo. Além disso, variações estudos realizados pelo setor de Medicina
relacionadas às técnicas da PCR podem ser Veterinária da UFRGs, no Rio Grande do Sul
observadas, o que pode interferir nos resultados encontrou-se 55,6% dos suínos portadores de
dos exames. Demonstrou-se que mudanças, Salmonella sp. em amostras de fezes e
como a utilização de pool de amostras ou linfonodos mesentéricos colhidos ao abate
simplesmente a troca de protocolos de extração (Bessa et al., 2004). Estudos posteriores
de DNA pode interferir negativamente com a demonstraram que 88% das amostras de massa
sensibilidade do teste (Chiriboga et al., 1999), de embutidos (Castagna et al., 2004) e 50% de

42
cortes de pernil produzidos em frigoríficos onde diarreia grave, com morte de suínos, que nesses
a prevalência de animais portadores era elevada, casos, apresentam lesões intestinais acentuadas
tinham a presença de Salmonella sp. (Bandeira (Jacobson et al., 2005; Suh e Song, 2005). As
et al., 2003). Devido à importância sanitária infecções mistas foram observadas em 30,43%
desse agente, nos últimos anos a Europa vem das granjas estudadas, e a principal associação
implementando programas de redução na carga observada foi de S. typhimurium com
infectante de Salmonella sp. nos rebanhos L.intracellularis e S.
suínos, e têm alcançado grande êxito typhimurium/L.intracellularis e E. coli
principalmente na Dinamarca (Schuwart, 2006). enterotoxigênica. Esta associação foi relatada
por Suh e Song (2005) que encontraram 2,2%
E. coli patogênica foi previamente das 462 amostras positivas para Salmonella spp
identificada em 49 de 54 rebanhos de suínos de e L. intracellularis. Outras associações já foram
baixo desempenho (Jacobson et al., 2003). relatadas na Suécia, 58% das 320 amostras
MФller et al. (1998) observaram que de 72 fecais eram infectadas concomitante por B.
granjas, 76,8% estavam infectadas por E. coli pilosicoli e L. intracellularis (Jacobson et al.,
hemolítica. Stege et al. (2000) demonstraram 2005). Thomson et al. (1998) relataram a
que 24,1% dos rebanhos dinamarqueses eram ocorrência de infecção mista por B. pilosicoli e
positivos para E. coli patogênica. Apesar de L. intracellularis, B pilosicoli e Salmonella spp.
todos esses resultados, a importância da e B. pilosicoli e E. coli enteropatogênica em 7%,
presença de E. coli enteropatogênica em 4,7% e 3,52%, respectivamente.
rebanhos de recria e terminação ainda não está
bem esclarecida. Recentemente Pitman (2010), O parasita T. suis já relatado como
descreveu uma apresentação atípica de enterite comum na indústria de suínos (Batte et al.,
provocada pela E. coli enterotoxigênica F18 e 1977), não foi detectado em nenhuma das
Stx2e, em suínos de onze semanas de idade. amostras analisadas. Em um estudo
Dinamarquês recente realizado em 79
A E. coli enterotoxigênica está propriedades, os ovos de Trichuris suis foram
associada a danos nas vilosidades intestinais, identificados em somente 3 granjas refletindo a
perda do epitélio das vilosidades e diarreia em baixa ocorrência desse agente (Haugegaard,
leitões lactentes ou recém desmamados 2009). O controle parasitário melhorado dos
(Macedo et al., 2007). Entretanto, em suínos de últimos anos, associado com a modernização
recria e terminação este patógeno entérico pode tecnológica da indústria de suínos, tornaram os
alterar o equilíbrio ecológico da microbiota helmintos entéricos raros no rebanho suinícola
intestinal mudando as condições do ambiente nacional. Além disso, a doença ocorre mais
intestinal, que pode favorecer algumas bactérias frequentemente em granjas onde os animais são
(Jacobson et al., 2003). Normalmente, os criados soltos, ou quando estes, em alguma das
rebanhos positivos para E. coli enterotoxigênica fases de criação têm acesso a terra
possuem histórico de diarreia pós-desmame, (Sobestiansky e Barcellos, 2007), o que não
isso pode ser um indicativo de alta pressão de ocorria nas granjas avaliadas neste estudo. Sabe-
infecção de enteropatógenos nas granjas se que os ovos são eliminados com as fezes e se
avaliadas, ou que a diarreia pós-desmame tornam infectantes ainda no estágio L1, e
podem predispor a outras doenças entéricas embora muito sensíveis a dessecação, sua
(MФller et al. 1998, Thomson et al., 1998; viabilidade, sob condições ambientais
Stege et al., 2000; Jacobson et al., 2005). Das favoráveis, pode ser bastante longa, podendo
512 amostras testadas, 39 não apresentaram chegar até a seis anos (Burden et al., 1987).
crescimento de colônias Lactose +, acredita-se
que o uso excessivo de antibióticos na fase de A histopatologia apesar de pouco
recria e terminação, pode ter inibido o utilizada neste estudo apresentou resultados
crescimento dessas bactérias em ágar condizentes com aqueles observados nas
MacConkey. técnicas de cultivo e diagnóstico molecular, o
que demonstra a eficiência dessa ferramenta de
Interações entre patógenos entéricos diagnóstico. O exame anatomopatológico é de
são comuns e normalmente ocorrem em baixo custo quando comparado a outras
rebanhos que têm ou tinham histórico de técnicas, e a análise detalhada das lesões

43
observadas na microscopia, aliada a mucosa de suínos infectados por L.
informações clinicas podem definir um intracellularis, 16 receberam cultura pura de L.
diagnóstico. Das granjas analisadas, positivas intracellularis (PHE/MN00-1) e oito animais
para PCV-2, observou-se que em três casos o receberam placebo. Dois animais do grupo
vírus estava associado a um patôgeno entérico, controle e quatro camundongos de cada grupo
L. intracellularis ou Salmonella enterica foram eutanaziados nos dias 7, 14, 21 e 28 pós-
sorotipo Typhimurium. Cita-se que apesar da inoculação. Fragmentos de intestino foram
acentuação das lesões intestinais, a presença de coletados para análise histológica e imuno-
PCV-2 juntamente com outros agentes como histoquímica (IHQ) e “pool” de fezes de cada
Salmonella enterica sorotipo Typhimurium e L. grupo foi coletado para a realização da Nested
intracellularis, não causa maiores perdas PCR para L. intracellularis. Dois camundongos
produtivas do que aquelas causadas pelas da linhagem DB-A exibiram lesões
infecções isoladas desses agentes (Opriessnig et macroscópicas de enteropatia proliferativa (EP)
al., 2008). no 14 dia pós-inoculação. Todas as linhagens de
camundongos avaliadas apresentavam lesões
2.6. CONCLUSÕES histológicas de EP e IHC positiva, que variava
de acordo com a intensidade da lesão. As lesões
(1) Os agentes enteropatogênicos foram mais acentuadas especialmente naqueles
causadores de diarreia estão presentes nos animais inoculados com cultura pura. As lesões
rebanhos de recria e terminação do estado de mais graves foram observadas em camundongos
Minas Gerais. (2) A B. hyodysenteria e T suis DB-A e Swiss. A eliminação nas fezes de L.
não estão presentes nos rebanhos mineiros. (3) intracellularis foi observada em todas as
As infecções mistas são muito frequentes em linhagens com algumas variações. Apesar de
nosso sistema de produção de suínos de recria e todas as linhagens de camundongos utilizadas
terminação. Os enteropatógenos L. serem susceptíveis a infecção, existiram
intracellularis e S. typhimurium foram os diferenças entre elas no estabelecimento das
principais patógenos causadores de infecção lesões.
mista em suínos de recria e terminação no
estado de Minas Gerais. (4) A L. intracellularis Palavras-chave: Lawsonia intracellularis,
é o agente entérico mais observado nos casos de modelo experimental, camundongo, DB-A,
infeção simples. (5) A B. pilosicoli apresenta BALB/c, Swiss, C-57 Black 6.
uma baixa prevalência e sua ocorrência, no
nosso estudo, está associada a casos de infecção 3.2 INTRODUÇÃO
mista.
A L. intracellularis é uma bactéria
3. Capítulo 3: gram-negativa, intracelular obrigatória
causadora da enteropatia proliferativa (EP) em
suínos e em muitas outras espécies animais
Desenvolvimento de modelo
(McOrist et al, 1995; Gebhart e Guedes 2004;
experimental murino para enteropatia Kroll et al., 2005). A EP é caracterizada
proliferativa (Lawsonia intracellularis), macroscopicamente por espessamento da
utilizando homogeneizado de mucosa mucosa intestinal e histopatologicamente pela
intestinal e cultura pura hiperplasia das criptas intestinais,
principalmente no íleo, mas também no ceco e
3.1 RESUMO cólon (Lawson e Gebhart, 2000).

A susceptibilidade a infecção por L. A EP é a principal causa de perdas na

intracellularis em quatro diferentes linhagens de indústria suína em todo o mundo (Jacobson et
camundongos (Swiss, BALB/c, C-57 Black 6 e al., 2009). Estas perdas são representadas por
DB-A) foi estudada. Cento e sessenta diminuição do ganho de peso, diarreia em
camundongos (n = 40, por linhagem) foram suínos cronicamente afetados, mortalidade de
inoculados por via gástrica. De cada linhagem, jovens adultos e de cevados próximo a idade de
16 animais receberam homogeneizado de abate. O diagnóstico da infecção por L.

44
intracellularis é baseado na reação em cadeia da inóculo foi capaz de provocar a infecção em
polimerase (PCR) em amostras de fezes ou de leitões. Além disso, é resistente a
fragmentos intestinais, teste de peroxidomonosulfato de potássio e misturas
imunofluorescência indireta (IFI), ELISA ou fenólicas nas concetrações de 1% e 0,33%,
IPMA no soro, e por hibridização in situ, respectivamente (Guedes, 2008). Por esses
histopatologia e imuno-histoquímica (IHQ) nas motivos, estudos sorológicos de prevalência da
amostras de tecidos fixados em formalina (Boye enfermidade vêm mostrando índices entre 60 e
et al, 1998). 90% de rebanhos positivos em diferentes países
(Lawson e Gebhart, 2000).
Pouco se sabe sobre a epidemiologia
dessa doença. São conhecidos somente alguns A susceptibilidade a infecção de
poucos fatores da bactéria e do hospedeiro que camundongos de laboratório pela L.
contribuem para o estabelecimento da EP intracellularis foi comprovada
(Guedes e Gebhart, 2002b, Friedman et al., experimentalmente (Smith et al, 2000).
2008). A presença de animais subclinicamente Entretanto, a ocorrência de lesões de EP variou
infectados, eliminando L. intracellularis nas entre as diferentes linhagens de camundongos.
fezes, levam a contaminação das instalações e Camundongos A/J (Murakata et al., 2007), C-57
transmissão para animais susceptíveis (Guedes, Black 6, BALB/c (Go et al., 2005, Colins et al.,
2003). Entretanto a ocorrência de surtos de EP 1999) e ICR (Go et al., 2005) demonstram como
em granjas nunca antes povoadas e que não susceptíveis a infecção por L.
receberam animais de reposição de granjas sem intracellularis. Já outros autores relatam as
história clínica da doença têm sido observada. linhagens BALB/c, C3H/HeJ, ICR e C-57 Black
Desta forma, surgem suspeitas com relação a 6 como suceptiveis a infecção (Murakata et al.,
possível existência de vetores biológicos ou 2008).
mecânicos (Guedes, 2002).
Friedman et al. (2008) demonstrou que
A EP tem sido descrita em hamsters, roedores capturados em granjas de suínos,
furões, coelhos, raposas, cães, cavalos, cobaias, positivas para L. intracellularis, ou nas suas
primatas, ovelhas e cabritos (Kroll et al., 2005). adjacências, apresentavam bactérias nas fezes
Há relatos da doença em aves, como o Emu ou eram sorologicamente positivos, indicando
(Dromaius novaehollandiae) (Lemarchand et al. infecção natural. Dentre as espécies analisadas,
1997), avestruz (Struthio camelus) (Cooper et o camundongo foi o que apresentou maior
al. 1997) e “Brewer’s Blackbird” (Euphagus número de amostras positivas, sendo essa
cyanocephalus) (Pusterla et al., 2008). Ratos e espécie presente em todas as granjas analisadas.
camundongos representam um reservatório em
potencial, sobretudo para os suínos, onde o Em um dos primeiros relatos de
ambiente é particularmente coabitado por infecção experimental de L. intracellularis em
roedores (Pusterla et al., 2008). ratos e camundongos observou-se que os ratos
apresentam um quadro de infecção intestinal
A infecção de animais susceptíveis transiente e diminuto, sendo que das duas
ocorre por via oro-fecal (Lawson e Gebhart, linhagens analisadas, Wistar e Sprague Dawley
2000). Animais infectados podem eliminar até somente um animal da linhagem Wistar
cerca de 108 organismos de L. intracellularis apresentou lesões leves de EP, ou seja, menos
por grama de fezes (Smith e McOrist, 1997). A de 5% das criptas afetadas (Collins et al, 1999).
bactéria pode ser eliminada nas fezes por um Entretanto, é interessante notar que os estudos
período de até 3 meses em alguns animais in vitro realizados para avaliar a penetração da
(Guedes et al., 2002b; Guedes e Gebhart, L. intracellularis nas células intestinais, são
2003a) e pode sobreviver nas fezes por até 2 realizados na sua maioria em células epiteliais
semanas em temperatura ambiente (Collins et al. do intestino delgado de ratos (IEC-18) (Lawson
2000). De acordo com Collins et al. (2001), um et al., 1995). Das três linhagens comerciais de
número reduzido de bactérias é suficiente para camundongos testadas com cultura pura,
infectar animais susceptíveis. Cerca de 103 BALB/c, C-57 Black 6 e A129 somente a
organismos de L. intracellularis contidas no linhagem A129 apresentou lesões histológicas

45
sugestivas de EP e essas lesões foram detectadas 3.3.2 Inóculos
na segunda semana após a inoculação (Collins
et al, 1999). 3.3.2.1 Cultura pura de L. intracellularis
O inóculo foi preparado como descrito
Murakata et al. (2008) demonstrou que por Guedes e Gebhart (2003abc), no laboratório
há diferenças no que diz respeito ao de enteropatia proliferativa da University of
estabelecimento de lesões de EP em Minnesota, EUA. Resumidamente, a
camundongos de acordo com o tipo de inóculo monocamada de células McCoy (ATCC CRL
utilizado. O experimento demonstrou que os 1696) cultivadas em meio Eagle modificado
camundongos inoculados com homogeneizado Dulbecco’s com 1% de L-glutamina e 5% de
de mucosa intestinal extraída de coelhos SFB, sem antibióticos, à 37ºC e atmosfera de
afetados apresentavam lesões mais graves do 5% de CO2, foi infectada com a suspensão de L.
que aqueles inoculados com homogeneizado de intracellularis, cepa PHE/MN1-00 (ATCC
mucosa intestinal de suínos. Portanto, a PTA-3457). A monocamada infectada foi
susceptibilidade de camundongos parece estar tratada com cloreto de potássio a 0,1% e depois
relacionada à linhagem dos animais e ao tipo de recuperada por raspagem das garrafas de cultivo
inóculo utilizado. Suínos infectados com cultura celular. Após o rompimento das células, o
pura ou homogeneizado de mucosa não sobrenadante era utilizado para infectar novas
apresentam diferenças no estabelecimento das células McCoy. O nível de infecção era
lesões de EP (Guedes e Gebhart, 2003a). calculado antes de cada passagem através da
técnica de imunoperoxidase indireta. Na nona
Neste contexto, esse trabalho tem como passagem, quando as células apresentavam-se
objetivo avaliar o desenvolvimento das lesões altamente infectadas, entre seis e sete dias de
de enteropatia proliferativa em quatro linhagens infecção, o cultivo era então tratado com cloreto
de camundongos, Swiss, BALB/C, C-57 Black de potássio a 0,1%. Neste momento, os
6 e DB/A2 a partir da inoculação experimental organismos de L. intracellularis em suspensão
de cultura pura de L. intracellularis e no meio de cultivo e as bactérias liberadas pelas
homogeneizado de mucosa intestinal de suínos células McCoy destruídas pela raspagem foram
infectados e avaliar a eliminação de L. misturadas, homogeneizadas por 15s e
intracellularis nas fezes desses animais. centrifugadas por 20 minutos a 3.400 x g, para
formação de um precipitado de L.
3.3 MATERIAL E METÓDOS intracellularis. Esse material foi ressuspendido
em solução de sacarose fosfato glutamato (SPG)
3.3.1 Camundongos com 5% de SFB. A suspensão foi aliquotada em
Foram utilizados quarenta tubos criogênicos de 3,6 mL e armazenada a -
camundongos de cada uma das quatro linhagens 80ºC, até a inoculação.
analisadas (BALB/c, C-57 Black 6, DB/A2 e
Swiss) totalizando 160 animais, todos machos
de 3-4 semanas de idade, pesando 13,6g ±
3.3.2.2 Homogeneizado de mucosa
2.341g, e provenientes do biotério do Instituto
de Ciências Biológicas da Universidade Federal Para inoculação dos camundongos,
de Minas Gerais (ICB-UFMG). Todos os utilizaram-se segmentos intestinais de suínos
camundongos foram alojados em gaiolas de com lesões típicas de EP, doença confirmada
plástico, com oito animais cada, recebendo por IHQ, que foram congelados e mantidos a -
alimentação e água ad libitum e iluminação 80ºC. No dia da inoculação, os segmentos
controlada. Os animais foram aclimatados por intestinais foram descongelados em água
uma semana antes da realização do corrente, seccionados longitudinalmente com
experimento. O experimento foi conduzido em tesoura e a mucosa foi raspada utilizando-se
conformidade com o Comitê de Ética da lâminas de vidro. O material obtido da mucosa
Universidade Federal de Minas Gerais foi homogeneizado em solução de SPG na
(CETEA), processo número 162/2008. proporção de 1:1 em homogenizador por cerca
de um minuto (Winkelman e Tasker, 2002).
Esse material foi submetido à avaliação
bacteriológica para Salmonella spp. e

46
parasitológica (como descrito no Cap. 2), que infecção. Antes da eutanásia as caixas eram
asseguraram a ausência de outros patógenos forradas e os camundongos foram mantidos por
relevantes (Salmonella spp. e E. coli um período de duas horas. Após esse período
enterotoxigênica). um pool de amostras fecais foi coletado de cada
caixa e armazenado a menos 20°C para análise
3.3.3 Quantificação do inoculo posterior.
A quantificação de cada um dos
inóculos foi feita a partir de diluições seriadas
na base 10 em PBS (pH 7,2), impregnação de
lâmina de vidro e coloração por
imunoperoxidase (IPX). Resumidamente,
colocou-se 10 µL de cada diluição em um poço
de lâmina de vidro de 15 poços, que foi
colocada em estufa à 37°C, por 30 min, para
secagem do líquido. Em seguida, a lâmina foi
fixada em acetona gelada e corada através da
técnica de imunoperoxidase indireta utilizando-
se anticorpo policlonal específico para L.
intracellularis (Guedes e Gebhart, 2003c). O
número de organismos foi contado ao
microscópio ótico. A concentração final foi Figura 14 – Inoculação intragastrica, utilizando
obtida através da multiplicação do número de agulha de gavage, de um
bactérias presentes e o valor da diluição camundongo da linhagem Swiss
avaliada. com homogeneizado de mucosa
contendo Lawsonia intracellularis.
3.3.4 Bioensaio em Hamster
Foi realizado um bioensaio em 3.3.6 Histotologia e Imuno-histoquímica
hamsters com a finalidade de comprovar a Fragmentos do intestino (duodeno,
patogenicidade do inóculo de culturas puras de jejuno, ileo, ceco, colon e reto) foram fixados
L. intracellularis PHE/MN1-00 (ATCC PTA- em formol tamponado a 10%, embebidos em
3457) (Guedes e Gebhart, 2003ab). Para isto, parafina, e seccionados a uma espessura de
foram utilizados oito hamsters que, no dia zero
5µm. Um dos cortes foi corado com HE e o
do experimento, estavam com 18 dias de idade e
outro foi submentido a imuno-histoquímica.
peso médio de 18,52 g. Estes foram alojados em
Lâminas silanizadas com secções de 3 µm de
caixas plásticas, recebendo ração comercial e
cada tecido foram submetidas à técnica de
água à vontade e mantidos em regime de 12
imuno-histoquímica (IHQ) utilizando a
horas de luz diária. As lesões de EP foram
Streptavidina21 marcada e anticorpo policlonal
confirmadas através das lesões histopatológicas
específico para L. intracellularis na diluição
e IHQ.
de 1:30.000 (Guedes e Gebhart, 2003)
3.3.5 Delineamento experimental (ANEXO 1). A marcação positiva foi
De cada uma das quatro linhagens de detectada utilizando-se 3-amino-9-
camundongos, 16 animais foram inoculados etilcarbazol22 (AEC). As lesões histológicas
com 0,5 ml de cultura pura de L. intracellulares foram graduadas de acordo com a intensidade:
(cepa PHE/MN00-1) contendo 7,75x107 0, nenhum; 1 leve, 2, moderado; e 3,
bactérias por ml, 16 com 0,5 ml de acentuado. Um sistema idêntico de graduação
homogeneizado de mucosa intestinal de suínos foi utilizado para avaliar o grau de
contendo 8,9x108 bactérias por ml (Figura 14) e
oito com água destilada estéril (controle), 21
Dako LSAB+ System –HRP Biotinnylated,
utilizando uma agulha intragástrica (agulha de cat n° K0690, INVITROGEN, Carpinteria,
gavage). Quatro animais de cada grupo de USA.
camundongos infectados e dois do grupo 22
Dako, Corporation, AEC Substrate-
controle foram eutanasiados para exame Chromogen, cat n°. K3464, INVITROGEN,
anatomopatológico nos dias 7, 14, 21 e 28 pós- Carpinteria, USA.

47
imunomarcação do antígeno de L. U de Taq DNA Polimerase24. Um microlitro (1
intracellularis. µl) do DNA extraído foi acrescentado à reação.
A primeira amplificação foi realizada com 35
3.3.7 Detecção de L. intracellularis nas ciclos, sendo que cada ciclo consistia de 94°C
fezes dos camundongos por 40 s, 55°C por 40 s e 72°C por 40 s. A
segunda amplificação foi executada utilizando-
3.3.7.1 Extração de DNA se 2,5 µl do produto da primeira PCR como
A extração de DNA de amostras fecais template, em um volume total de 25 µl de
foi realizada de acordo com Boom et al. (1990) solução, sob as mesmas condições de
utilizando-se pedra diatomácea. concentração e temperatura. Os dois pares de
Resumidamente, 0,2 g de fezes eram pesadas e primers foram acrescentados à reação numa
incubadas em solução de lise por 15 min, concentração e 1pmol µl-1. Amostras de controle
centrifugadas a 14.000g por 2 min, seguido por negativo foram adicionadas a todas as reações.
10 min de incubação com solução de pedra Os produtos da PCR foram separados em gel de
diatomacea23. Posteriormente, a solução foi agarose a 1% corado com brometo de etídio.
centrifugada (14.000g por 2 min) novamente e o
sedimento obtido foi lavado com solução de 3.3.8 Analise Estatística
lavagem (duas vezes), etanol PA(2 vezes), e Para análise estatística utilizou-se o
acetona PA (1 vez) sendo seco a 56°C por 10 teste exato de Fischer, através do programa
min. O DNA extraído foi resuspendido em água SAS25.
miliQ estéril e estocado a -20°C.
3.4 RESULTADOS

3.3.7.2 Pares de Primers Nested PCR Com relação ao bioensaio realizado em

As seguintes seqüências de primers Hamsters um dos hamsters do grupo inoculado
foram utilizadas para a detecção do DNA da L. apresentou 10 cm de alteração intestinal
intracellularis através da Nested PCR: LIA macroscópica sugestiva de EP, posteriormente
FWD(5’ – TATGGCTGTCAAACACTCCG - confirmadas por HE e IHQ. Os outros quatro
3’), LIB (5’ – TGAAGGTATTGGTATTCTCC hamsters inoculados com cultura pura de L.
– 3’), LIC (5’ – intracellularis apresentaram hiperplasia de
TTACAGGTGAAGTTATTGGG – 3’) e LID enterócitos e infecção dos mesmos, detectada
REV (5’ – CTTTCTCATGTCCCATAAGC – pela IHQ, comprovando a patogenicidade do
3’). Os primers externos LIA e LIB amplificam inóculo. Nenhum sinal de infecção por L.
um fragmento de 319 pb, enquanto que os intracellularis foi observado nos animais
primers internos LIC e LID amplificam um controle.
fragmento com 270 pb (Jones et al., 1993)
Não foi observada diarreia ou outros
sinais clínicos nos camundongos inoculados
3.3.7.3 Nested PCR com homogeneizado de mucosa, cultura pura ou
nos animais inoculados com placebo.
A Nested PCR foi executada com o
Macroscopicamente, somente dois
objetivo de aumentar a sensibilidade de
camundongos da linhagem DB-A, inoculados
detecção do DNA de L. intracellularis nas
com cultura pura, apresentaram lesões
fezes. A técnica foi realizada de acordo com
sugestivas de EP caracterizadas por um
Friedman et al. (2008). As reações foram
espessamento das alças intestinais do ceco e do
executadas em 25 µl de volume total, íleo no 14° dia pós infecção (Figura 15).
utilizando-se no tampão da PCR [10mmol l-1 de Nenhum dos camundongos do grupo controle
Tris HCl (pH 8,3), 50 mmol l-1 de KCl e 1,5
apresentou qualquer alteração histológica ou
mmol l-1 de MgCl2], 0,2 mmol l-1 de dNTP e 1
24
Cenbiot, Taq. DNA polymerase, Ludwig
Biotec, Porto Alegre, RS, Brasil.
23 25
Sigma-Aldrich, Diathomaceous earth, St SAS Institute, Cary, North Caroline, USA
Louis, MO, EUA. 1999

48
imuno-histoquímica e todos foram negativos na criptas isoladas ou em grandes segmentos do
PCR. intestino grosso e/ou delgado, especialmente,
naqueles animais que foram inoculados com
cultura pura e menos frequentemente nos
animais inoculados com homogeneizado de
mucosa. Não foi observada reação inflamatória
no intestino dos camundongos inoculados com
L. intracelullaris.

Os camundongos da linhagem Swiss

apresentaram lesões leves no 7 dia pós-
inoculação (Figura 16A) e lesões graves em 14
dia pós infecção (Figura 16B) e nenhuma
alteração foi detectada após este período
Camundongos BALB/C apresentaram lesões
leves no dia 7 e no dia 14 pós infecção. As
alterações proliferativas eram mais frequentes
nas criptas localizadas próximas as placas de
Peyer do ceco. A linhagem dos camundongos
Figura 15 – Lesão macroscópica de L.
C-57 Black 6 demonstrou lesões histológicas
intracellularis (Enteropatia
leves até no 21 dia após inoculação. Sendo que
Proliferativa) em um camundongo
essas foram mais facilmente detectadas no 14
da linhagem DB-A 14 dias após a
dia pós inoculação (Figura 17A), onde todos os
inoculação. Observa-se
animais inoculados com cultura pura analisados
espessamento da alça intestinal
apresentavam lesões. Os camundongos DB-A
(Íleo) com rugosidade acentuada
apresentaram lesões até o último dia do
na serosa (setas).
experimento (28 dias pós infecção). As lesões
nessa linhagem foram mais intensas nos dias 14
3.4.1 Histopatologia e IHQ e 21 pós-inoculação (Figura 18A e 18B). Nos
Todas as linhagens de camundongos dias 7 e 28 pós-inoculação as lesões eram leves
analisadas apresentaram lesões histopatológicas e observadas em criptas isoladas (Tabela 4).
sugestivas de infecção por L. intracellularis,
mas a gravidade das lesões variou de acordo Marcação IHQ positiva foi observada
com a linhagem do camundongo, tipo de nos locais de lesão e a intensidade de marcação
inoculo utilizado e do período pós-inoculação. variou de acordo com a intensidade da lesão
As principais lesões histológicas observadas (leve a acentuada) (Tabela 4) (Figura 16C, 16D,
consistiam de proliferação (hiperplasia) 17B, 18C, 18D). A imunomarcação foi
multifocal de células epiteliais das criptas de observada no ápice de algumas vilosidades no 7
Lieberkühn no intestino delgado e glândulas dia pós-inoculação, nos locais onde havia
mucosas do intestino grosso essa lesão variava tumefação do citoplasma das células epiteliais
de leve a acentuada e predominando no ileo e no (Figura 19). À medida que a lesão diminuía de
ceco. No ápice de algumas vilosidades intensidade encaminhando-se para a resolução,
intestinais, observou-se uma proliferação focal a marcação IHQ evidenciou-se em maior
de células epiteliais, essas células possuíam um intensidade próximo das placas de Peyer (Figura
citoplasma amplo e abundante. Esta lesão foi 20A e 20B) e no interior de macrófagos
comumente observada no 7° dia pós-inoculação. localizados na lâmina própria.
As criptas intestinais estavam alongadas e
hiperplásicas, havia grande quantidade de
enterócitos imaturos e ausência de células
caliciformes. Esta lesão foi observada em

49
Figura 16 – Enteropatia proliferativa. A) Camundongo Swiss, ileo, 7 dias pós inoculação. Observa-se
proliferação multifocal leve multifocal das criptas intestinais com ausência de células
caliciformes e grande quantidade de enterócitos jovens (seta), HE, 4X. B) Camundongo,
Swiss, íleo, 14 dias pós inoculação. Há hiperplasia difusa acentuada das criptas intestinais
(setas) com ausência de células caliciformes, espessamento da mucosa e enterócitos jovens,
HE, 20X. C) Camundongo, Swiss, ceco, 7 dias pós inoculação. Observa-se marcação
imuno-histoquímica focal leve (seta), IHQ, 40X. D) Camundongo, Swiss, ileo, 14 dias pós
inoculação. Há marcação difusa acentuada para o antígeno de Lawsonia intracellulares, nas
criptas (seta) e na superfície da mucosa intestinal, IHQ, 4X.

50
 observadas. Os camundongos Swiss inoculados
com cultura pura eliminaram L. intracellularis
nas fezes no dia 7 e 14. O grupo inoculado com
homogeneizado de mucosa eliminou a bactéria
nas fezes somente no dia 14. Os camundongos
da linhagem BALB/c apresentaram resultados
da PCR positivo para L. intracellularis somente
no dia 14 em ambos os grupos inoculados
(cultura pura e homogeneizado de mucosa). A
linhagem C-57 BLACK 6 eliminou a bactéria
nas fezes nos dias 7 e 14 pós- inoculação. Os
camundongos inoculados com homogeneizado
de mucosa apresentaram resultados de PCR
positivo nas duas ocasiões enquanto aqueles
inoculados com cultura pura foram positivos
somente no dia 7 pós-inoculação. Os
camundongos DB-A foram positivos na PCR
nos dias 7, 14 e 21 em ambos os grupos
inoculados (Tabela 4) (Figura 21A, 21B, 22A,
22B).

3.4.3 Resultados da Analise Estatística

A analise pelo teste exato de Fischer

demostrou que há associação significatica entre
o inóculo utilizado (cultura pura e
homogeneizado de mucosa) e a ocorrência de
lesões histopatológicas (Pr <= P = 1.100E-05)
(5% de significância), e entre o inoculo e a
presença de marcação IHQ (Pr <= P = 4.926E-
Figura 17 – Enteropatia proliferativa. A) 04) (5% de significância), ou seja, as lesões
Camundongo C-57 Black 6, ileo, histológicas e a marcação IHQ foram mais
14 dias pós inoculação. Há intensas nos camundongos inoculados com
hiperplasia focal leve das criptas cultura pura do que naqueles inoculados com
intestinais (seta) com ausência de homogeneizado de mucosa (ANEXO 4).
células caliciformes e grande
quantidade de enterocitos jovens, Associação significativa também foi
HE, 4X. B) Camundongo, C-57 demonstrada entre as linhagens analisadas e a
BLACK 6, ileo, 14 dias pós intensidade de lesões histopatológicas (Pr <= P
inoculação. Há marcação imuno- = 2.778E-04) (5% de significância), e entre as
histoquímica leve para o antígeno linhagens analisadas e a intensidade da
da Lawsonia intracellularis, IHQ, marcação IHQ (Pr <= P = 4.926E-04) (5% de
40X. significância). Infere-se que as linhagens Swiss
e DB-A apresentaram lesões e imunomarcação
3.4.2 Resultados Nested PCR mais intensas do que as linhagens C-57 Black 6
Os resultados da PCR das fezes foram e Balb/C (ANEXO 5).
compatíveis com as lesões histológicas
Figura 18 – Enteropatia proliferativa. A) Camundongo DB-A, ileo, 14 dias pós inoculação. Observa-se
espessamento difuso acentuado da mucosa intestinal com hiperplasia das criptas intestinais
(seta), HE, 4X. B) Lesão histológica de enteropatia proliferativa em um camundongo, DB-
A, ileo, 21 dias pós inoculação. Há hiperplasia difusa moderada das criptas intestinais
(setas), HE, 20X. C) Camundongo, DB-A, ceco, 14 dias pós inoculação. Observa-se
marcação imunoístoquimica difusa acentuada, no ápice das células das criptas intestinais
(seta), IHQ, 4X. D) Camundongo, DB-A, ileo, 21 dias pós inoculação. Há marcação
imunoístoquimica multifocal moderada, no ápice das células da cripta intestinal (seta), IHQ,
40X.
Tabela 5 – Resultados individuais das lesões histopatológicas, marcação imunistoquímica e resultados da PCR do pool de fezes das diferentes
linhagens de camundongos inoculadas com homogeneizado de mucosa e cultura pura, contendo L. intracellularis, nos dias 7, 14, 21 e 28
pós inoculação (dpi).
Linhagem Histopatologia Imuno-histoquímica PCR
dpi dpi dpi
Inóculo 7 14 21 28 7 14 21 28 7 14 21 28

Swiss
0/0/0/0* 1/1/1/0 0/0/0/0 0/0/0/0 0/0/0/0 1/1/1/0 0/0/0/0 0/0/0/0 - + - -
Homogeneizado
de mucosa
1/2/1/1 3/3/2/3 0/0/0/0 0/0/0/0 1/1/1/1 3/3/2/2 0/0/0/0 0/0/0/0 + + - -
Cultura Pura
BALB/c
0/0/0/0 1/1/0/0 0/0/0/0 0/0/0/0 0/0/0/0 1/0/0/0 0/0/0/0 0/0/0/0 - + - -
Homogeneizado
de mucosa
1/1/1/1 1/1/0/0 0/0/0/0 0/0/0/0 1/1/1/1 1/1/0/0 0/0/0/0 0/0/0/0 - + - -
Cultura Pura
C-57 BLACK6

Homogeneizado 0/0/0/0 0/0/0/0 0/0/0/0 0/0/0/0 0/0/0/0 1(LP)/0/0/ 0/0/0/0 0/0/0/0 - - - -

de mucosa 0
1/1/1/1 1/2/1/1 1/1/0/0 0/0/0/0 1/1/1/0 1/1/1/1 1/0/0/0 0/0/0/0 + + - -
Cultura Pura
DB-A

Homogeneizado 1/1/1/0 1/1/1/0 1/1/1/1 0/0/0/0 1/1/1/0 1/1/0/0 1/1/1/1 0/0/0/0 + + + -

de mucosa
1/1/2/1 3/3/2/1 2/2/2/1 1/1/0/0 1/2/1/1 3/3/2/1 1/2/2/1 1/1/0/0 + + + -
Cultura Pura
* Lesões histopatologicas e marcação imuno-histoquímica de L. intracellularis: 0, ausente; 1, leve; 2, moderada; 3, severa.Para resultados da PCR; +,
positivo; - , negativo. LP (lâmina propria)

53
Figura 19 – Enteropatia proliferartiva.
Camundongo, Swiss, ileo, 7
dias pós inoculação com
cultura pura de L.
intracellularis. Observa-se
marcação imuno-histoquímica
multifocal acentuada no ápice
das vilosidades intestinais
(enterócitos maduros) (setas),
IHQ, 40X.
Figura 20 – Enteropatia proliferativa. A)
Camundongo DB-A, ceco, 28 dias
pós inoculação. Observa-se
hiperplasia difusa acentuada das
criptas intestinais próximas as placa
de Peyer (seta), HE, 20X. B)
Camundongo, DB-A, ileo, 28 dias
pós inoculação. Há marcação
imuno-histoquímica multifocal leve
nos enterócitos que recobrem a
placa de Peyer (setas), IHQ, 20X.

54
Figura 21 – A) Gel de agarose a 1%, Nested Figura 22 - A) Gel de agarose a 1%, Nested
PCR, 7 dias após a inoculação. Da PCR, 21 dias após a inoculação. Da
esquerda para direita: Kb, marcador esquerda para direita: Kb, marcador
de peso molecular; C-, controle de peso molecular; C-, controle
negativo; C+, controle positivo negativo; C+, controle positivo
Lawsonia intracellularis (218 pb); 1, Lawsonia intracellularis (218 pb); 1,
controle negativo Swiss; 2, Swiss controle negativo Swiss; 2, Swiss
inoculado com homogeneizado de inoculado com homogeneizado de
mucosa; 3, Swiss inoculado com mucosa; 3, Swiss inoculado com
cultura pura; 4, controle negativo cultura pura; 4, controle negativo
BALB/C; 5, BALB/C inoculado com BALB/C; 5, BALB/C inoculado com
homogeneizado de mucosa; 6, homogeneizado de mucosa; 6,
BALB/C inoculado com cultura pura; BALB/C inoculado com cultura pura;
7, controle negativo C-57 BLACK 6; 7, controle negativo C-57 BLACK 6;
8, C-57 BLACK 6 inoculado com 8, C-57 BLACK 6 inoculado com
homogeneizado de mucosa; 9, C-57 homogeneizado de mucosa; 9, C-57
BLACK 6 inoculado com cultura BLACK 6 inoculado com cultura
pura; 10, controle negativo DB-A; 11, pura; 10, controle negativo DB-A; 11,
DB-A inoculado com homogeneizado DB-A inoculado com homogeneizado
de mucosa; 12, DB-A inoculado com de mucosa; 12, DB-A inoculado com
cultura pura. Observe as bandas cultura pura. Observe as bandas
positivas nas linhas 3, 9, 11 e 12. B) positivas nas linhas 11 e 12. B) Gel
Gel de agarose, Nested PCR, 14 dias de agarose, Nested PCR, 28 dias após
após a inoculação. Numeração a inoculação. Numeração idêntica à
idêntica à figura 21A. Observe as figura 22A. Nenhuma banda positiva
bandas positivas nas linhas 2, 3, 5, 6, foi detectada.
9, 11 e 12.

55
 3.5 DISCUSSÃO que nunca fora antes descrita como susceptível a
EP ou candidata a infecção. Adicionalmente,
Este estudo demonstra a camundongos da linhagem DB-A também
susceptibilidade de diferentes linhagens de apresentaram lesões histológicas significativas
camundongos à infecção por L. intracellularis. de EP, sendo que essas foram presentes até o 28
A relação entre o patógeno, o hospedeiro e o dpi com um pico de lesão no 14 e 21 dpi. Esse
estabelecimento da doença obedece a um padrão de infecção se assemelha muito ao que é
mecanismo intrínseco de correlação. Um descrito em suínos infectados
patógeno pode apresentar diferentes níveis de experimentalmente (MacIntyre et al., 2003).
infecção que varia de acordo com a Camundongos são excelentes modelos
especificidade do agente. Para infectar a célula experimentais para o estudo de doenças
hospedeira, a bactéria intracelular precisa se infecciosas (Fortier et al, 2005), a presença de
aderir e penetrar nas células, o que exige um lesões acentuadas de EP em camundongos
mecanismo complexo de invasão celular. Em Swiss e DB-A, demonstra o grande potencial
seguida, as bactérias precisam evadir do sistema dessas duas linhagens para o desenvolvimento
lisossomal intracelular e multiplicar-se a fim de de um modelo experimental de infecção para L.
progredir com a infecção (Olsen et al., 2004). intracellularis e também para testes de vacina.

Os resultados demonstraram uma Nenhum animal inoculado apresentou

variação significante no estabalecimento das diarreia ou outra sintomatologia clinica durante
lesões de L. intracellularis entre as quatro a realização do experimento. A diarreia, comum
linhagens de camundongos estudadas. em suínos (Jacobson et al., 2009), não é descrita
Camundongos DB-A e Swiss foram os mais em camundongos e hamsters, tanto naqueles
suceptiveis a infecção, enquanto as lesões nos animais inoculados experimentalmente como
camundongos BALB/C e C-57 Black6 foram nos animais infectados de forma natural (Collins
menos intensas. Estas diferenças na et al., 1999; Kroll et al., 2005; Friedman et al.,
suscetibilidade a agentes infecciosos vêm sendo 2009;).
descritas há muito tempo na literatura, e as
bases genéticas para essas diferenças ainda não A infecção por L. intracellularis é
foram determinadas (Collins et al., 1999; Fortier caracterizada macroscopicamente pelo
et al., 2005, Murakata et al., 2008). espessamento da mucosa intestinal e
histopatologicamente por hiperplasia das criptas
Um estudo comparativo das cepas de L. intestinais (Lawson e Gebhart 2000). Ambas as
intracellularis isoladas de diferentes espécies lesões foram observadas em camundongos no
animais, baseado no seqüenciamento do DNA estudo comprovando a infecção pelo agente.
ribossomal 16S da bactéria, não mostrou Camundongos inoculados com cultura pura
nenhuma diferença entre os isolados, embora apresentaram lesões histológicas e IHQ mais
diferenças de proteínas externas possam existir acentuadas do que aqueles inoculados com
(Cooper et al., 1999; Murakata et al. 2008). homogeneizado de mucosa. Estudos anteriores
Guedes e Gebhart (2003c), trabalhando com em suínos comparando cultura pura e
anticorpos monoclonais (AcM 2001 e IG4 homogeneizado intestinal não mostraram
MAbs) e um anticorpo policlonal (1999 PABs) diferenças na gravidade das lesões ou no nível
para L. intracellularis, demonstraram através da de infecção (Guedes e Gebhart, 2003a), o
análise de Western blot que todos os isolados de contrário do que ocorreu em nosso trabalho
L. intracellularis, exceto um isolado de hamster, onde a cultura pura foi mais eficiente. A maior
apresentavam reatividade para os anticorpos, o vantagem da utilização da cultura pura em
que pode indicar alguma diferença em proteínas relação ao homogeneizado é o controle rígido da
de membrana externa da cepa isolada de bactéria infectante e a ausência de bactérias ou
hamsters. outros fatores de tecido (Guedes et al., 2002b).

Foi interessante observar a O exame imuno-histoquímico nos

suscetibilidade da linhagem de camundongos camundongos demostrou que a imunomarcação
Swiss, uma linhagem comum em laboratórios, do antígeno variou de acordo com a intensidade
da lesão. Em suínos, há uma relação entre o

56
aumento do número de bactérias e a acentuação (1) O presente estudo demonstrou que
da lesão de hiperplasia (Lawson e Gebhart camundongos inoculados intragastricamente
2000; Guedes et al., 2003; Kroll et al., 2005) e o com L. intracellularis desenvolveram
mesmo parece acontecer em camundongos. hiperplasia epitelial das criptas com marcação
Boutrup (2008) observou que a L. IHQ positiva para o antígeno no citoplasma das
intracellularis pode ser encontrada no interior células epiteliais da mucosa. (2) Os
das células epiteliais presentes no ápice das camundongos inoculados com cultura pura
vilosidades, indicando infecção nos enterócitos apresentaram lesões mais acentuadas e
maduros, o que implica que estas células são frequentes de EP, do que aqueles inoculados
também um ponto de ataque para a L. com homogeneizado de mucosa. (3)
intracellularis. Esta pode ser uma possível Camundongos Swiss e DB-A foram as
explicação para a presença de antígenos no linhagens com maior ocorrência de lesão, estas
ápice das vilosidades no 7° dia pós-inoculação. se acentuavam principalmente no D14 (Swiss),
e D14 e D21 (DB-A) pós infecção. (4) A
Nos casos onde a infecção se tornava eliminação nas fezes de L. intracellularis foi
menos intensa, tendendo a resolução, a observada em todas as linhagens variando de
marcação era frequentemente observada nas acordo com o inoculo utilizado e a linhagem do
criptas próximo das placas de Peyer ou camundongo.
localizada na lâmina própria ou no citoplasma
de macrófagos. Sabe-se que bactérias 4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
localizadas no citoplasma dos enterócitos
passam através da membrana para a lâmina ABIPECS Relatório 2008. Disponível
basal, são internalizadas pelas células em:<http://www.abipecs.org.br/relatorios/rela20
apresentadoras de antígenos e drenadas para os 08_P.pdf.>. Acesso em: 1 set 2009.
linfonodos e fígado. A ocorrência de antígenos
de L. intracellularis foi relatada nos linfonodos ABSHIER, J. M.; BESH-WILLIFORD, C. L.;
mesentéricos dos animais afetados antes FRANKLIN, C. L.; RUSSELL, S. P.
(Segalés et al., 2001; Guedes e Gebhart, 2003a). Spontaneous infection of Lawsonia
Essas alterações contribuem para a eliminação intracellularis-like bacteria in the mouse.
dos organismos patogénicos e para a Anais… Conference of Research Workers in
reestruturação da arquitetura normal do epitélio Animal Diseases, 82, 2001, Saint Louis, p. 49.
intestinal (Smith e Lawson, 2001).
AFIP Contributor Manual. Disponivel em:<
A PCR é um dos métodos mais eficazes para a http://www.afip.org/consultation/resources/AFI
detecção de L.intracellularis (Kroll et al., 2005). PManual40-40.pdf>. Acesso em: 02 mar 2010.
Segundo Jones et al. (1993), a PCR pode
detectar até 103 bacterias por grama de fezes. ALMEIDA, M. N. Fatores que contribuem para
Com esta técnica demonstramos que os a falta de uniformidade em suínos de
camundongos apresentaram um padrão de terminação. 2008. 38f. Dissertação (Mestrado
eliminação de L. intracellularis diferente dos em Medicina Veterinária Preventiva) –
suínos. Suínos podem eliminar a bactéria a Faculdade de Veterinária, Universidade Federal
partir da primeira até a décima segunda semana do Rio Grande do Sul, Porto Alegre.
pós-inoculação (Kroll et al., 2005), enquanto
que a linhagem de camundongos DB-A elimina ARGENZIO, R. A. Glucose-Stimulated Fluid
a bactéria por 21 dias. As lesões histológicas absortion in the pig small intestine during the
mais pronunciadas e a eliminação de L. early stage of swine dysentery. Am. J. Vet. Res.,
intracellularis mais frequente ocorreram no v. 41, n. 12, p. 2000-2006, 1980.
décimo quarto dia pós-inoculação, semelhante
ao que é descrito em suínos (MacIntyre et al., BACCARO, M. R.; MORENO, A. M.,
2003). SHINYA, L. T. et al. Identification of bacterial
3.6 CONCLUSÃO agents of enteric diseases by multiplex PCR in
growing-finishing pigs. Braz. J. of Microbiol.,
v. 34, p. 225-229, 2003.

57
 Nucleic Acids. J. Clin. Microbiol., v.28, n. 3, p.
BANDEIRA, R. Presenta de Salmonella sp. em 495-503, 1990.
suínos ao abate em em cortes de pernil
processados em frigoríficos no Rio Grande do BOYE, M; BALODA, S. B.; LESER, T. D. et
Sul. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de al. Survival of Brachyspira hyodysenteriae and
veterinária da Universidade do Rio Grande do B. pilosicoli in terrestrial microcosms. Vet.
Sul, Porto Alegre, 2003. Microbiol., v. 81, p. 33-40, 2001.

BARCELLOS, D. E. S. N.; MATHIESEN, M.; BOYE, M.; JENSEN, T. K.; MOLLER, K. et al.
UZEDA, M. et al. Prevalence of Brachyspira Specific detection of Lawsonia intracellularis in
species isolated from diarrheic pigs in Brazil. porcine proliferative enteropathy inferred from
Vet. Rec., v. 146, p. 398-403, 2000. fluorescent rRNA in situ hybridization. Vet.
Pathology., v. 35, p.153-156, 1998.
BARCELLOS, D. E. S. N. 2000. 163f. Tese
(Doutorado em ciências Microbiológicas) – BOUTRUP, T. S. (2008). Studies of the
Instituto de Microbiologia, Universidade pathogenesis of porcine proliferative
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro. enteropathy caused by Lawsonia intracellularis.
Target cells and progression of lesions.
BARCELLOS, D. E. S. N. Colite espiroquetal University of Copenhagen, 63p. (PhD Thesis).
em suínos: uma doença emergente. Bolt. Inst.
Pesq. Vet. Desidério Ramos, v. 3, p. 1-8, 2001. BURDEN, D. J.; HAMMET, N. C.;
BROOKES, P. A. Field observation on the
BARCELLOS, D. E.; RAZIA, L. E.; longevity of Trichuris suis ova. Vet. Rec., v. 11,
BOROWSKI, S. M. Ocorrencia e identificação p. 43, 1987.
de espiroquetas intestinais em suínos em granjas
de porte industrial de duas regiões criatórias do BURCH, D. G. S. Controlling diarrhoea in
estado do Rio Grande do Sul, em relação a growing pigs – the grey scour syndrome. Pig
medicação da ração. Cien. Rur., v. 33, p. 725- Journal, Inglaterra, v.45, p.131-149, 2000.
729, 2003
CAMPOS, L. C. Salmonella sp. In:
BATTE, E. G., MCLAMB, R. D., MUSE, K. E. TRABULSI, L. R. et al. Microbiologia. 3. ed.
et al. Pathophysiology of Swine Trichuriasis. J. São Paulo: Atheneu, p. 229-238, 1999.
Vet. Res., v. 38, p. 1075-1079, 1977.
CASTAGNA, S. M. F. Presença de Salmonella
BERTSCHINGER, H. U.; FAIRBROTHER, J. sp. no trato intestinal e em tonsilas e linfonodos
M. Escherichia coli Infections. In: STRAW, submandibulares de suínos ao abate. Arq. Brás.
B.E. et al. (Eds.). Diseases of Swine. 8.ed. Vet. e Zootc., v.56,n.3, p. 300-306, 2004.
Ames, Iowa: Iowa State University, 1999.
Cap.32, p.431-457. CHIRIBOGA, A. E.; GUIRAES, W. V.;
VANETTI, M. C. et al. Detection of Lawsonia
BESSA, M. C.; COSTA, M.; CARDOSO, M. intracelularis in feces of swine from the main
Prevalência de Salmonella sp. em suínos producing regions in Brazil. Can. J. Microbiol.,
abatidos em frigoríficos abatidos no Rio Grande v.45, p. 230-234, 1999.
do Sul, Brasil. Pesq. Vet. Brasil., v. 24, n. 2, p.
80-84, 2004. CIACCI-ZANELLA, J. R.; MORÉS, N.;
SIMON, N. L. ET AL. Identificação do
BIKSI, I, LORINCZ, M., MOLNÁR, B. et al. circovírus suíno tipo 2 por reação em cadeia da
Prevalence of selected enteropathogenic bacteria polimerase e por imuno-histoquímica em
in Hungarian finishing pigs. Acta Vet.Hungar, tecidos suínos arquivados desde 1988 no Brasil.
v. 55, p. 219-127, 2007 Cien. Rur., v. 36. n. 5, p. 1480-1485, 2006.

BOOM, R.; SOL, C. J. A.; SALIMANS, M. M. CLARKE, R. C.; GYLES, C. L. Salmonella. In:
M. Rapid and Simple Method for Purification of GYLES, C. L.; CHARLES, O. T. Pathogenesis

58
of bacterial infections in animals. 2. ed. Ames:
Iowa State University, p. 133-153, 1993. DUHAMEL, G. E.; WHEELDON, E. B.
Intestinal adenomatosis in a foal. Vet. Pathol., v.
COLLINS, A. M.; LOVE, R. J.; POZO, J. et al. 19, p. 447-450, 1982.
Studies on the ex vivo survival of Lawsonia
intracellularis. Swine Health Prod., v. 8, p. 211- DUHAMEL, G. E.; CARVAJAL A.; DE
215, 2000. ARRIBA, M. L. et al. Prevalence of
Brachyspira species in pigs with diarrhoea in
COLLINS, A. M.; DIJK, M. V.; VU, N.Q. et al. Spain. Vet. Rec., v. 158, p. 700-701, 2006.
Immunity to Lawsonia intracellularis. In: Allen
D. Leman Conference, 28, 2001, Minneapolis. DUHAMEL, G. E. Colonic spirochetosis caused
Anais…Saint Paul: Veterinary Outreach by Serpulina pilosicoli. Larg. Ani. Pract., v. 19,
Programs/UMN, 2001, 115-120p. p.14-22, 1998.

COLLINS A. M.; LOVE, R. J.; JASNI, S. et al. DUHAMEL, G. E.; KINYON, J. M.;
Attempted infection of mice, rats and chickens MATHIESEN, M. R. et al. Prevalence of
by porcine strains of Lawsonia intracellularis. porcine colonic spirochetosis in a multiple-site
Aust. Vet., v. 77, p. 120-122, 1999. production system and microbial sensitivity
patterns of Serpulina pilosicoli. Anais… 39th
COOPER, D. M.; GEBHART, C. J. American Association of Veterinary Laboratory
Comparative aspects of proliferative enteritis. J. Diagnosticians Meeting, Arkansas, p.45. 1996
Am. Vet. Med. Assoc., v. 212, p. 1446-1451,
1998.
DUHAMEL, G. E. Comparative pathology and
COOPER, D. M.; SWANSON, D. L.; BARNS, pathogenesis of naturally acquired and
S. M.; GEBHART, C. J. Comparison of the 16S esperimentally induced colonic spirochetosis.
ribosomal DNA sequence from the intracellular An. H. Res. Rew., v. 2, p. 3-17, 2001.
agent of proliferative enteritis in a hamster,
deer, and ostrich with the sequence of a porcine EKPERIGIN, H. E.; NAGARAJA, K. V.
isolate of Lawsonia intracellularis. Int. J. Syst. Salmonella. Vet. Clin. North. Am., v. 28, n. 2, p.
Bacteriol., v. 47, p. 635-639, 1997a. 17-29, 1998.

COOPER, D. M.; SWANSON, D. L.; ELDER, R. O.; DUHAMEL, G. E.; SCHAFER,

GEBHART, C. J. Diagnosis of proliferative R. W. et al. Rapid detection of Serpulina
enteritis in frozen and formalin-fixed, paraffin- hyodysenteriae in diagnostic specimens by
embedded tissues from a hamster, horse, deer, PCR. J. Clin. Microbiol., v. 32, p. 1497-1502,
and ostrich using a Lawsonia intracellularis- 1994.
specific multiplex PCR assay. Vet. Microbiol.,
v. 54, p. 47-62, 1997b. ELWELL, M. R.; CHAPMAN, A. L.;
FRENKEL, J. K. Duodenal hyperplasia in a
CÔTÉ, S.; LETELLIER, A.; LESSARD, L. et guinea pig. Vet. Pathol., v. 18, p. 136-139,
al. Distribution of Salmonella in tissues 1981.
following natural and experimental infection in
pigs. Can. J. Vet. Res., v. 68, p. 241-248, 2004. ERICKSEN; LANDSVERK, K. T.;
BRATBERG, B. Morphology and
DAVIES, P. R.; NICHOLS, M. A. Longitudinal immunoperoxidase studies of intestinal
study of Salmonella enterica in growing pigs adenomatosis in the blue fox, Alopex lagopus. J.
reared in multiple-site swine production Comp. Pathol., v. 102, p. 265-278, 1990.
systems. Vet. Microbiol. , v. 83, n. 1, p. 45-60,
2001. FÁVERO, J. A. Produção de Suínos (2003).
Disponível
DUBREUIL, J. D. Escherichia coli STb toxin em:<http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.
and colibacillosis: Knowing is half the battle. br/FontesHTML/Suinos/SPSuinos/importancia.
Microbiol. Lett., v. 278, p. 137-145, 2008. html.> Acesso em: 05 out 2009.

59
 study of eleven cases. Can. Vet. J., v. 36, p.
FELLSTROM, C. B.; PETTERSON, K. E.; 291-294, 1995.
JOHANSSON, N. et al. Prevalence of Serpulina
species in relation to diarrhea and feed GUEDES, R. M. C. Porcine proliferative
medication in pig-rearing hers in Sweden. Am. enteropathy: diagnosis, immune response and
J. Vet. Res., v. 57, p. 807-811, 1996. pathogenesis. St. Paul: University of Minnesota,
2002. 261 p. (PhD Thesis).
FRANCIS, D. H.; GRANGE, P. A.; ZEMAN,
D. H. et al. Expression of mucin-type GUEDES, R. M. C.; GEBHART, C. J.;
glycoprotein K88 receptors strongly correlates ARMBRUSTER, G. A. et al. Serologic follow-
with piglet susceptibility to K88+ up of a repopulated swine herd after an outbreak
enterotoxigenic Escherichia coli, but adhesion of proliferative enteropathy. Can. J. Vet. Res., v.
of this bacterium to brush borders does not. 66, p. 258-263, 2002a.
Infect. Immun., v. 66, p. 4050-4055, 1998.
GUEDES, R. M. C.; GEBHART, C. J.;
FRANCIS, D.H. Enterotoxigenic Escherichia WINKELMAN, N. A. et. al. Comparison of
coli infection in pigs and its diagnosis. J. Swine different methods for diagnosis of Porcine
Health Prod., v. 10, p. 171-175, 2002. Proliferative Enteropathy. Can. J. Vet. Res., v.
66, p. 99-107, 2002b.
FRANCO, D. B. G. M.; LANDGRAF, M.
Microbiologia Alimentar, São Paulo: Ateneu, GUEDES, R. M. C.; WINKELMAN, N. L.;
1996, 108p. GEBHART, C. J. Relationship between the
severity of porcine proliferative enterophaty and
FRIEDMAN, M.; BEDNAR, V.; KLIMES J. et the infectious dose of Lawsonia intracellularis.
al. Lawsonia intracellularis in rodents from pig Vet. Rec., v. 153, p. 432-433, 2003.
farms with the occurrence of porcine
proliferative enteropathy. Letters in A. GUEDES, R. M. C. Enteropatia proliferativa
Microbiol., v. 47, p. 117-121, 2008. suína (ileíte). Cadernos técnicos de Veterinária
e Zootecnia, n. 42, p. 45-56, 2003.
FORTIER, A.; MIN-OO, G.; FORBES, J. et al.
Single effects in moue models of host: pathogen GUEDES, R. M. C.; GEBHART, C. J.
interactions. J. Leukoc. Biol.,v. 77, p. 868-877, Comparation of intestinal mucosal homogenate
2005. and pure culture of the homologous Lawsonia
intracellularis Isolate in reproducing
FOX, J. G.; LAWSON, G. H. K. proliferative enteropathy in swine. Vet.
Campylobacter-like omega intracellular antigen Microbiol., v. 93, p. 159-166, 2003a.
in proliferative colitis in ferrets. Lab. Anim. Sci.,
v. 38, p. 34-36, 1988. GUEDES, R. M. C.; GEBHART, C. J. Onset
and duration of fecal shedding, cell-mediated
GARCIA, S. K. Suinocultura mineira (III): and humoral immune responses in pigs after
Densidade de suínos nos pólos regionais. In: challenge with a pathogenic isolate or
Congresso Brasileiro de Veterinários attenuated vaccine strain of Lawsonia
Especialistas em Suínos, 12, 2006. Anais... intracellularis. Vet. Microbiol., v. 91, p. 135-
Fortaleza, 2006, p. 545-546. 145, 2003b.

GEBHART, C.; GUEDES, R. M. C. Lawsonia GUEDES, R. M. C.; GEBHART, C. J.

intracellularis. In: GYLES, C. L.; PRESCOTT, Preparation and characterization of polyclonal
J. F., SONGER, J. G; et al. Ed. Pathogenesis of and monoclonal antibodies against Lawsonia
bacterial infections in animals.Oxford: intracellularis. J. Vet. Diag. Invest., v. 15, n. 5,
Blackwell Publishing, p. 363-372, 2004. p. 438-446, 2003c.

GIRARD, C.; LEMARCHAND, T.; HIGGINS, GUEDES, R. M. C. Diarreia em suínos de recria

R. Porcine colonic spirochetosis: a retropective e terminação principais enfermidades. Suíno
Cia., n. 11, p. 11-18, 2005.

60
 chain reaction (PCR) in pigs with and without
GUEDES, R. M. C. Known facts about the diarrhea and other animal species. Dtsch.
epidemiology of porcine proliferative Tierarzti. Wochenschr., v. 110, p. 361-364,
enteropathy. Thai J. Vet. Med, v.38, n. 2, p. 9- 2003.
17, 2008.
HIRSH, D. C. Swine Salmonelosis In:
GO, Y.Y.; LEE, J. K.; YE, J. Y. et al.. BIBERTEIN, E. L.; ZEE, Y. C. (Orgs)
Experimental reproduction of proliferative Salmonella Review of Veterinary microbiology.
enteropathy and the role of IFN-gamma in Orlando: Blackwell, p. 110-115, 1990.
protective immunity against Lawsonia
intracellularis in mice. J. Vet. Sci., v. 6, p. 357- HOFFMANN, R. P. Diagnóstico de parasitismo
359, 2005 veterinário. Porto Alegre: Sulina, 1987. 156p.

HAUGEGAARD, J. Prevalence of nematodes in HOLAND, R. E. Some infectious causes of

Danish industrialized sow farms with loose diarrhea in young farm animals. Clin.
housed sows in dynamic groups. Vet. Parasitol., Microbiol. Rev., v. 3, p. 345-375, 1990.
v. 6, 2009.
HOLYOAKE, P. K, CUTTER, R. S, CAPLE, I.
HAMPSON., D. J. Evaluation of a novel W. A diagnostic dilemma: detecting
antimicrobial polymer for the control of porcine proliferative enteritis in pigs at slaughter. Aus.
postweaning colibacillosis. Aust Vet J., v. 78, p. Vet. J., v. 71, p. 308-309, 1994.
117-120, 2000.
HOTCHKISS, C. H. E.; SHAMES, B.;
HAMPSON, D. J.; FELLSTROM, D. J.; PERKINS, S. E. et al. Proliferative enteropathy
THOMSON, J. R. Swine Dysentery. In: of rabbits: The intracellular Campylobacter-like
STRAW, B.; ZIMMERMAN, J. A. S.; organism is closely related to Lawsonia
TAYLOR, D. J. (Eds) Diseases of Swine. intracellularis. Lab. Anim. Sci., v. 46, p. 623-
Oxford: Blackwell, p. 785-805, 2006. 627, 1996.

HAMPSON, D. J.; TROTT, D. J. A review - HUERTA, B.; ARENAS, A.; CARRASCO, L.

Intestinal spirochetal infections of pigs: an et al. Comparison of diagnostic techniques for
overview with an Australian perspective. In: porcine proliferative enteropathy (Lawsonia
HENESSY, V.; CRANWELL, P. D (eds), intracellularis infection). J. Compar. Pathol., v.
Manipulating Pig Production, Iowa: Werribee, 129, p. 179-185, 2003.
p.139-169, 1995.
IMA Instituto Mineiro de Agropecuária -
HAMPSON, D. J.; TROTT, D. J. Spirochetal Programa Nacional de Sanidade Suídea,
diarrhea/porcine intestinal Spirochetosis. In: Disponívelem:<http://www.ima.mg.gov.br/inde
STRAW, B.E. et al. (Eds.). Diseases of swine. x.php?option=com_content&task=view&id=42
8.ed. Ames, Iowa: Iowa State University, 1999. 0&Itemid=353>. Acesso em: 05 out 2009.
Cap.40, p.553-562, 1999.
JACOBSON, M.; HÅRD A. F.; SEGERSTAD,
HARRISSON, L. R.; GOSSER, H. S. C.; GUNNARSSON, A. et al. Diarrhoea in the
Demonstration of spirochaetes in formalized growing pig – a comparison of clinical,
tissues using Dieteler’s silver stain. In: Annual morphological and microbial findings between
meeting of the americam association of animals from good and poor performance herds.
veterinary laboratory diagnosticians, 22, 1979, Ress in Vet. Sci., v. 74, p. 163-169, 2003.
Columbia, Anais… Columbia: Americam
association of veterinary laboratory JACOBSON, M.; ASPAN, A.; KÖNIGSSON,
diagnosticians (AAVLD), 1979, p. 373-378. M. H. et al. Routine diagnostics of Lawsonia
intracellularis performed by PCR, serological
HERBST, W.; HERTRAMPF, B.; SCHMITT, and post mortem examination, with special
T.; WEISS, R.; BALJER, G. Diagnosis of emphasis on sample preparation methods for
Lawsonia intracellularis using the polymerase

61
PCR. Vet. Microbiol., v. 102, n. 3-4, p. 189-201, JOHNSTON, T. et al. Recents advances in
2004. diagnosing and controlling porcine colonic
spirochetosis caused by Serpulina pilosicoli.
JACOBSON, M. GERTH LÖFSTEDT, M.; Compend. Con. Edu. Pract. Vet., v. 21, p. 198-
HOLMGREN N.; et al. The prevalences of 209, 1999.
Brachyspira spp and Lawsonia intracellularis in
Swedish piglet producing herds and wild board KICH, J. D. Desenvolvimento de um teste de
population. J. Vet. Med., v. 52, p. 386-391, ELISA – LPS para Salmonella e sua aplicação
2005. em rebanhos suínos na identificação de fatores
de risco associados a infecção. 2007. 68f.
JACOBSON, M.; FELLSTRÖM, C.; JENSEN- Dissertação (dissertação de mestrado). Medicina
WAERN, M. (2009) Porcine Proliferative Veterinária Preventiva, Universidade Federal do
enteropathy: An important disease with Rio Grande do Sul, Porto Alegre
questions remaining to be solved. The
Veterinary Journal, doi: KLEIN, E. C.; GEBHART, C.J.; DUHAMEL,
10.1016/j.tvjl.2009.05.010 (Article in Press) G. E. Fatal outbreaks of proliferative enteritis
caused by Lawsonia intracellularis in young
JASNI, S.; McORIST, S.; LAWSON, G. H. K. colony-raised rhesus macaques. J. Med.
Experimental induced proliferative enteritis in Primatol., v. 28, p. 11-18, 1999.
hamsters: an ultrstructural study. Rec. Vet. Sci.,
v. 56, p. 186-192, 1994. KOMAREK, V.; MADERNER, A.;
SPERGSER, J. et al. Infections with weakly
JENSEN, T. K.; MOLLER, K.; SESER, T. D. haemolitic Brachyspira species in pig with
Comparison of histology, miscellaneous chronic diseases. Vet. Microbiol.,
immunohistochemistry and polymerase chain v. 134. p. 311-317, 2009.
reaction for detection of Lawsonia
intracellularis in natural porcine proliferative KRINGEL, H.; ROEPSTORFF, A. Trichuris
enteropathy. Eur. J. Vet. Pathol., v. 3, p. 115- suis population dynamics following a primary
123, 1997. experimental infection. Vet. Parasitol., v. 139,
p. 132-139, 2006.
JANSSON, D. S.; RASBACK, T.;
FELLSTROM, C. et al. Experimental Challenge KROLL. J. J.; ROOF, M. B.; HOFFMAN, L. J.
of Mallards (Anas platyrhynchos) with et al. Proliferative enteropathy: a global enteric
Brachyspira hyodysenteriae and ‘‘Brachyspira disease of pigs caused by Lawsonia
suanatina’’ Isolated from Pigs and Mallards. J. intracellularis. Anim Health Res Rev., v. 6, n. 2,
Comp. Pathol., v. 141, p. 211-222, 2009. p. 173-197, 2005.

JOENS, L. A.; MARQUEZ. R. HALTER, M. LA, T., PHILLIPS, N. D., HAMPSON, D. J.

Comparison of outer membrane fractions of Development of a duplex PCR assay for
Serpulina (Treponema) hyodysenteriae. Vet. detection of Brachyspira hyodysenteriae and
Microb., v, 35, p. 119-132, 1993. Brachyspira pilosicoli in pig faeces. J. Clin.
Microbiol., v. 41, p. 3372-3375, 2003.
JOHNSON, E. A.; JACOBY, R. O.
Transmissible ileal hyperplasia of hamsters. Am. LA, T., COLLINS, A. M., PHILLIPS, N. D. et
J. Pathol., v. 91, n. 3, p. 451-459, 1978. al. Development of a multiplex-PCR for rapid
detection of the enteric pathogens Lawsonia
JONES, G. F.; WARD, G. E.; MURTAUGH, G. intracellularis, Brachyspira hyodysenteriae, and
et al. Enhanced detection of intracellular Brachyspira pilosicoli in porcine faeces. Letters
organism of swine proliferative enteritis, Ileal in A. Microbiol., v. 42, p. 284-288, 2006.
symbiont intracellularis, in feces by polymerase
chain reaction. J. Clin. Microbiol., v. 31, p. LAWSON, G. H. K., McORIST, S.,
2611-2615, 1993. ROWLAND, A. C. et al. Serological diagnosis
of the porcine proliferative enteropathies:

62
implications for etiology and epidemiology. Vet.
Rec., v. 122, p. 554-557, 1988. MACÊDO, N. R.; MENEZES, C. P. L.; LAGE,
A. P. et al. Detecção de cepas patogênicas pela
PCR multiplex e avaliação da sensibilidade a
LAWSON, G. H. K.; McORIST, S. The enigma antimicrobianos de Escherichia coli isoladas em
of the proliferative enteropathies: a review. J. leitões diarréicos. Arq. Brás. Méd. Vet. Zoot., v.
Comp. Pathol., v. 108, p. 41-46, 1993. 59, p. 1117-1123, 2007.

LAWSON, G. H. K.;MACKIE, R. A.; SMITH, MANSFIELD, L. S.; URBAN, J. F. The

D. G. E. et al. Infection of cultured rat pathogenesis of necrotic proliferativecolitis in
enterocytes by ileal symbiont intracellularis swineis linked to whipworm induced
depends on host-cell function and actin suppression of mucosal immunity to resident
polymerization. Vet. Microbiol., v. 45, p. 339- bacteria. Vet. Imm. Immunopath., v. 50, p. 1-17,
350, 1995. 1996.

LAWSON, G. H. K.; GEBHART, C. J. MARQUES, A. C. A produção de suínos e a

Proliferative enteropathy: review. J. Comp. preservação do meio ambiente 9o Seminário
Pathol., v. 122, p. 77-100, 2000. Nacional de Desenvolvimento da Suinocultura.
Anais… 2001, p 5-7.
LEBLANC, B.; FOX, J. G.; LE NET, J. L. et al.
Hyperplastic gastritis with intraepitelial MACINTYRE, N.; SMITH, D. G. E.; SHAW,
Campylobacter-like organism in a beagle dog. D. J et al. Immunopathogenesis of
Vet. Pathol., v. 30, p. 391-194, 1993. Experimentally Induced Proliferative
Enteropathy in Pigs. Vet. Pathol., v. 40, p. 421-
LEE, J. I. et al., Human intestinal spirochetes 432, 2003.
are distinct of Serpulina hyodysenteriae. J. Clin.
Microbiol., v. 31, p. 16-21, 1993. McCLUSKEY, J.; HANNIGAN, J.; HARRIS, J.
D. et al. LsaA, an antigen involved in cell
LEMARCHAND, T. X.; TULLY, T. N.; attachment and invasion, is expressed by
SHANE, S. M. et al. Intracellular Lawsonia intracellularis during infection in
Campylobacter-like organisms associated with vitro and in vivo. Infect. Immun., v. 70, p. 2899-
rectal prolapse and proliferative enteroproctitis 2907, 2002.
in emus (Dromaius novaehollandiae). Vet.
Pathol., v. 34, p. 152-156, 1997. McORIST, S.; BOID, R.; LAWSON, G. H. K.
Et al. Monoclonal antibodies to intracellular
LIGNON, G. B; FORMIGA, D. N.; FREITAS, Campylobacter-like organisms of the porcine
A. R. et al. Prevalência e aspectos do controle proliferative enteropathies. Vet. Rec., v. 121, p.
de Nematódeos gastrintestinais em suínos. CT / 421-422, 1987.
17 /EMBRAPA–CNPSA, v. Jan., p. 1-3, 1981.
McORIST, S.; LAWSON, G. H. K. Possible
LINDECRONA, R. H.; JENSEN, T. K.; relationship of proliferative enteritis in pigs and
ANDERSEN, P. H. et al. Application of a 5’ hamsters. Vet. Microbiol., v. 15, p. 293-302,
nuclease assay for detection of Lawsonia 1987.
intracellularis in fecal samples from pigs. J.
Clin. Microbiol., v. 40, n. 3, p. 984-987, 2002. McORIST, S.; GEBHART, C. J.; BOID, R. et
al. Characterization of Lawsonia intracellularis
LINTON, A. H. Salmonellosis in pigs. Brith. gen. nov, sp nov, the obligately intracellular
Vet. J., v. 135, n. 2, p. 109-112, 1979. bacterium of porcine proliferative enteropathy.
Int. J. Syst. Bacteriol., v. 45, p. 520-525, 1995.
LUNA, L. G. Routine Staining Procedures. In:
LUNA, L. G. (Ed). Manual of Histologic McORIST, S.; ROBERTS, L.; JASNI, S. E. T
Staining Methods of The Armed Forces Institute AL. Developed and resolving lesions in porcine
of Pathology. New York: McGraw- Hill Book proliferative enteropathy: possible pathogenic
Co, 1968, p. 24-58.

63
mechanisms. J. Comp. Path., v. 115, p. 35-45, BARCELLOS, D. (Eds) Doenças de Suínos,
1996. Canone Editorial: Goiânia, 2007, p. 770.

McORIST, S.; MACKIE, R. A.; LAWSON, G. MФLLER, K., JENSEN, T. K., JORSAL, S.E.
H. K. Et al. In vitro interactions of Lawsonia et al. Detection of Lawsonia intracellularis,
intracellularis with cultured enterocytes. Vet. weakly beta-haemolytic intestinal spirochaetes,
Microbiol. v. 54, p. 385-392, 1997. Salmonella enterica, and haemolitic Escherichia
coli from swine herds with and without diarrhea
McORIST, S.; GEBHART, C. J. Porcine among growing pigs. Vet. Microbiol., v. 62, p.
proliferative enteropathies. In: STRAW B.E.; 59-72, 1998.
D’ALLAIRE, S.; MENGELING, W. L. et al.
(Eds) Diseases of swine. Ames: Iowa State MULLANEY, C. D.; FRANCIS, K. H.;
University Press, 1999, p.521-534. WILLGOHS, J. A. Comparison of
seroagglutination, ELISA, and indirect
McORIST, S.; GEBHART, C. J.; BOSWORTH, fluorescent antibody staining for the detection
B. T. Evaluation of porcine ileum models of of K99, K88, and 987P pilus antigens of
enterocyte infection by Lawsonia Escherichia coli. J. Vet. Diagn. Invest., v. 3, p.
intracellularis. Can. J. Vet. Res., v. 70, p. 155- 115-118, 1991.
159, 2006.
MUNIAPPA, N. et al. Light and ultraestructural
MENIN, A.; RECK, C.; SOUZA, D. et al. changes in the ceca of chickens inoculated with
Agentes bacterianos enteropatogênicos em human and canine Serpulina pilosicoli. Vet.
suínos de diferentes faixas etárias e perfil de Pathol., v. 33, p. 542-550, 1996.
resistência a antimicrobianos de cepas de
Escherichia coli e Salmonella spp. Cien. Rur., v. MURAKATA, K.; SATO, A.; YOSHIYA, M.
38. n. 6, p. 1687-1683, 2008. et al. Infection of different strains of mice with
Lawsonia intracellularis derived from rabbit or
MOESER, A. J.; BLIKSLAGER, A. T. porcine proliferative enteropathy. J. Comp.
Mechanisms of porcine diarrheal disease. J. Am. Pathol, v. 139,p. 8-15, 2008
Vet. Med. Assoc., v. 231, p. 56-67, 2007.
NADVORNY, Y. A. et al. Ocorrência de
MOREHOUSE, L. G. Salmonelosis in swine Salmonella sp. em surtos de doenças
and its control. J. Am. Vet. Med. Assoc., v. 160, transmitidas por alimentos no RSem 2000. Act.
p. 595-601, 1972. Sci. Vet., v, 32, n. 1, p. 47-51, 2004.

MORENO, A. M., BACCARO, M. R., NATARO, J. P.; KAPER, J. B. Diarrheagenic

COUTINHO, L. L. Lawsonia intracellularis Escherichia coli. Lin. Microbiol. Rev., v. 11, n.
detection in swine feces from important 1, p. 142-201, 1998.
production regions in Brazil. Arq. Inst. Biol., v.
69, p. 5-8, 2002. NEEF, N. A.; LYSONS, R. J. Pathogenicity of
porcine intestinal spirochetes in gnotobiotic
MORÉS, N; NOGUEIRA, R. H. G.; NEVES, pigs. Infec. Immun., v. 62, p. 2395-2403, 1994.
O. S. et al. (1985) Diagnóstico clínico e
anatomohistopatológico de casos espontâneos NIBBELINK, S. K.; SACCO, R. E.;
de enterite proliferativa hemorrágica dos suínos WANNEMUEHLER, M. J. Pathogenenicity of
(EPH). Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v. 37, n. 1, Serpulina hyodysenteriae: In vivo induction of
p. 29-37, 1985. tumor necrosis fsctor and interleukin -6 by a
Serpulina butanol/water extract (endotoxin).
MORES, N. Perfil Sanitário da suinocultur no Microb. Pathogen., v. 23, n. 3, p. 181-187,
Brasil. Suin. Indus., p. 36 – 40, 1994 1990.

MORES, N.; MORENO, A. M. Colibacilose NOORDHUIZEN, J.P.T.M.; FRANKENA, K.;

Neonatal. In: SOBESTIANSKY, J.; THRUSFIELD, M.V., GRAAT, E.A.M
Application of quantitative methods in

64
veterinary epidemiology. Wageningen: from equine farms with documented occurrence
Wageningen Press, 1997. 445p. of equine proliferative enteropathy. J. Wildl.
Dis., v. 44, n. 4, p. 992-998, 2008.
OHL, M. E.; MILLER, S. I. Salmonella: A
model for bacteria pathogenesis. Annual Rev. RÅSBÄCK, T.; JANSSON, D. S.
Med., v. 52, p. 259-274, 2001. JOHANSSON, K. E. et al. A novel
enteropathogenic, strongly haemolytic
OLIVEIRA, C. J. B.; GARCIA, T. B.; spirochaete isolated from pig and mallard,
CARVALHO, L. F. O. S. et al. Nose-to-nose provisionally designated ‘Brachyspira
transmission of Salmonella enterica sorotipo suanatina’sp. nov. En. Microbiol., v. 9, n. 4, p.
Typhimurium between weaned pigs. Vet. 983-981, 2007.
Microbiol., v. 125, p. 355-362, 2007.
REED, W. M.; OLANDER, H. J. THACKER,
OLIVEIRA, S. Detecção e identificação de H. L. Studies on the pathogenesis of Salmonella
Salmonella sp., Salmonella typhimurium, S. Heidelberg infection in weanling pigs. Am. J.
enterititis, S. galinarum e S. pulorum através da Vet. Res., v. 46, p. 2300-2310, 1986.
reação em cadeia pela polimerase (PCR) em
materiais de origem avícola. 2000. 104f. RISTOW, L. E.; ZICA, K. G. B.; BOTELHO,
Dissertação (mestrado). Ceincias Veterinárias, R. G. A et al. Evaluation of indirect
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, immunofluorescent test and frequency of
Porto Alegre. antibody detection for Lawsonia intracellularis
against this bacteria in the state of Minas Gerais.
OLSEN, S. C.; THOEN, C. O.; CHEVILLE, N. In: INTERNATIONAL PIG VETERINARY
F. Brucella. In: Pathogenesis of bacterial SOCIETY CONGRESS, Melbourne,
infections in animals. Gyles, C.L.; Prescott, J.F.; Anais…Melbourne: IPVS, 2000. p. 78.
Songer, J.G. et al. Ed. Oxford: Blackwell
Publishing, p. 309-320, 2004. ROWLAND, A. C.; LAWSON, G. H. K.;
MAXWELL, A. Intestinal adenomatosis in the
OPRIESSNIG, T.; ROOF, M.; LAYTON, S.M. pig: ocurrence of a bacterium in affected cells.
Experimental co-infection with porcine Nature, v. 247, p. 417, 1974.
circovirus type 2 and Salmonella Typhimurium
or Law sonia intracellularis. In: The 20th SAMBROOK, J., FRITSCH, E. F., MANIATIS,
INTERNATIONAL PIG VETERINARY T. Molecular Cloning: a laboratory manual. 2
SOCIETY CONGRESS, Durban, 22-26 Junho ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory
2008, Anais… South Africa: IPVS, 2000. p. 48. Press, 1989, 309p.

PEARCE, G.P. Epidemiology of enteric SANTOS, R. L. et al. Phages types of

diseases in growerfinisher pigs: a postal survey Salmonella sp. enterititis isolated from clinical
of pig producers in England. Vet. Rec., and food samples and from broiler carcasses in
Inglaterra. v.27, n.144, p. 338-342, 1999. southern Brazil. Rev. Inst. Med. Trop. de São
Paulo, v. 5, n. 1, p. 1-4, 2003.
PITTMAN, J.S.Enteritis in grower-finisher pigs
caused by F18-positive Escherichia coli. J. S. SCHWARTZ, K. J. Salmonellosis. In: STRAW,
Health Prod., v.18, p. 81-86, 2010. et al. Diseases of Swine. 8. ed. Ames: Iowa:
University Press, p. 535-551, 2000.
PHILLIPS, N. D.; LA, T,; ADAMS, P. J. et al.
Detection of Brachyspira hyodysenteriae, SEGALÉS, J.; FERNÁNDEZ-SALGUERO, J.
Lawsonia intracellularis and Brachyspira M.; FRUCTUOSO, G. et al. Granulomatous
pilosicoli in feral pigs. Vet. Microbiol., v. 134, enteritis and lymphadenitis in iberian pigs
p. 294-299, 2009. naturally infected with Lawsonia intracellularis.
Vet. Pathol., v. 38, p. 343-346, 2001.
PUSTERLA, N.; MAPES. S.; REJMANEK, D.
et al. Detection of Lawsonia intracellularis by SMITH, D. G. E.; LAWSON, G. H. K.
real-time PCR in the feces of free-living animals Lawsonia intracellularis: getting inside the

65
pathogenesis of proliferative enterophaty. Vet. In: HAMPSON, D. J., STATON, T. B. (Eds.)
Microbiol. v. 82, p. 331-345, 2001. Intestinal Spirochaetes in domestic animals and
man. Canbridged: CAB International, 1997, cap.
SMITH, D. G. E.; MITCHELL, S. C.; NASH, 8, p. 211-241.
T. et al. Gamma interferon influences intestinal
epithelial hyperplasia caused by Lawsonia THOMSON, J. R.; SMITH, W. J.; MURRAY,
intracellularis infection in mice. Inf. Immun., v. B. P. Investigations into field cases of porcine
68, n. 12, p. 6737-6743, 2000. colitis with particular reference to infection with
Serpulina pilosicoli. Vet. Rec., v. 142, p. 235-
SMITH, S. H.; McORIST, S. Development of 239, 1998.
persistent intestinal infection and excretion of
Lawsonia intracellularis by piglets. Res. Vet. THOMAS, W.; SELWOOD, R. Monoclonal
Sci., v. 62, p. 6-10, 1997. antibodies to a 16 kDA antigen of Serpulina
(Brachyspira) hyodysenteriae. J Med.
SORDEN, S. D. Basic pathophysiology of Microbiol., v. 37, p. 214-220, 1992.
enteric disease. In: ANNUAL MEETING,
Nashville, Anais… Nashville: AASV, 2001. TROTT, D. J., McLAREN, A. J. HAMPSON,
p.345-348. D. J. Pathogenicity of human or porcine
intestinal spirochetes inday old specific
STEGE, H.; JENSEN, T. K.; MOLLER, K. et pathogen free chicks: an animal model for
al. Prevalence of intestinal pathogens in Danish animal spirochetosis. Infec. Imun., v. 63, n. 9, p.
finishing pig herds. Prev. Vet. Med., v. 46, p. 3705-3710, 1995.
279-292, 2000.
TROTT, D. J. ALT, D. P.; ZUERNER, R. L. et
SOBESTIANSKY, J. Clínica e Patologia Suína. al. The search for Brachyspira outer membrane
Goiânia: Gráfica Art3,1999, 464p. proteins that interact with the host. An. H. Res.
Rev., v. 2, n. 1, p. 19-30, 2001.
SOBESTIANSKY, J. et al. Clinica Veterinaria
em sistemas intensivos de produção de suínos e VAN DER GAAG, M. A.. A state transition
relatos de casos clínicos. Goiânia: Art 3, 2001, simulation model for the spreadof Salmonella in
103p. the pig Suplly Chain. Eur. J. Operat, Res., 2003.
Disponivel em: <http://www.scirus. com>.
SOBESTIANSKY, J.; BARCELLOS, D. E. S. Acesso em 09 set. 2009.
N. (Eds) Doenças de Suínos. Cânone editorial:
Goiânia, 2007, 770p. VANDENBERGHE, J.; MARSBOOM, R.
Campylobacter-like bacteria in
STEWART, T. B.; HOYT, P. G. Internal adenocarcinomas of colon in two Wistar rats.
Parasites. In: STRAW Diseases of Swine. 8. ed. Vet. Rec. v. 111, p. 416-417, 1982.
Ames: Iowa: University Press, 2006, p. 535-
551. VANDENBERGHE, J.; VERHEYEN, A.;
LAUWERS, S. et al. Spontaneous
SUH, D. K.; SONG, J. C. Prevalence of adenocarcinoma of the ascending colon in
Lawsonia intracellularis, Brachyspira Wister rats: the intracytoplasmic presence of a
hyodysenteriae and Salmonella em Swine herds. Campylobacter-like bacterium. J. Comp.
J. Vet. Sci., v. 6, n. 4, p. 289-293, 2005. Pathol., v. 95, p. 45-55, 1985.

TAYLOR, D. J.; SIMMONS, J. R.; LAIRD, H. WARD, G. E.; WINKELMAN, N. L.

M. Production of diarrhoea and dysentery in Recognizing the three forms of proliferative
pigs by feeding pure cultures of a spirochaete enteritis in swine. Vet. Med., v. 85, p. 197-203,
difering from Treponema hyodysenteriae. Vet. 1990.
Rec., n. 106, p. 326-332, 1980.
WEISS, L. H. N.; NONNIG, R.; CARDOSO,
TAYLOR, D. J.; TROTT, D. J. Porcine M. R. I. et al. Occurnce of Salmonella in
intestinal spirochaetosis and spirochaetal colitis. finishing pigs in south Brazil. In: International

66
symposium on epidemiology and control of 5. ANEXOS
Salmonella in pork, 3, 1999, Washington.
Anais… Washington: (S. n.), 1999, p. 184.
Anexo 1- Protocolo de imuno-histoquímica –
WEGENER, H. C.; BAGER, F.; ARESTRUP, Lawsonia intracellulares
F. M.; Vigilância da resistência aos
antimicrobianos no homem, nos produtos 1. Xilol – 5 min
alimentares e no gado da Dinamarca. 2. Xilol – 5 min
Surviellance report. Dinamarca, v.2, n° 3. p 17 - 3. Xilol – 5 min
19, 1997. Disponível em: < 4. Álcool 100% (anidro) – 5 min
http://www.eurosurveillance.org/em/v02n03/02 5. Álcool 96% - 3 min
03-421.asp> Acesso em: 13 de out. de 2009. 6. Álcool 70% - 3 min
7. Água destilada – 3 min
WILCOCK, B. P.; SCHWARTZ, K. J. 8. H2O2 3% - 30 min (100ml – 97ml PBS
Salmonelosis. In:Leman, A. D. et al. (Org) e 3ml de H2O2)
Diseases of swine (7 ed) Ames: Iowa University 9. Água destilada – 3 min
Press, p. 570-583, 1993. 10. Proteinase K (0,05%)(incubar em
câmara úmida a 37°C) – 5 min
WINKELMAN, N. L.; CRANE, J. P.; 11. Água de torneira – 10 min
ELFRING, G. D. Lincomycin-medicated feed 12. PBS Tween 0,05% – 5 min
for the control of porcine proliferative 13. Leite em pó Molico (0,5g de leite e
enteropathy (ileitis) in swine. J. Swine Health 20ml de água destilada) – incubar em câmara
Prod., v. 10, p. 107-111, 2002. úmida em temperatura ambiente – 40 min.
14. Anticorpo policlonal – 1:30.000
WINKELMAN, N. L.; DEE, S. D. Ileitis: an (incubar em câmara úmida a 37ºC) – 30 min
update. Comp. Cont. Educ., v. 19, p. 519-525, 15. PBS Tween 0,05% – 5 min
1996. 16. Anticorpo Biotinilado® (incubar em
câmara úmida em temperatira ambiente) – 30
WINKELMAN, N. L.; TASKER, J. B. Efficacy min
of Aivlosin for therapy of porcine proliferative 17. PBS Tween 0,05% – 5 min
enteropathy (PPE). Anais… 17° IPVS Congress, 18. Streptavidina® (incubar em câmara
2002. p.145. úmida em temperatura ambiente) – 25 min
19. PBS Tween 0,05% – 5 min
YEH, J. Y.; KIM, T. J.; PARK, S. Y. et al. 20. Solução AEC (incubar em câmara
Isolation of Lawsonia intracellularis in Korea úmida em temperatura ambiente) – 10 min
and reproduction of proliferative enterophaty in 21. Água destilada – 5 min
pigs and hamsters. J. Vet. Med. Sci., v. 68, p. 22. Água de torneira – 5 min
499-501, 2006. 23. Hematoxilina de Mayer – 3 a 5 min
24. Água de torneira corrente – 5/10 min
ZHANG, P.; WITTERS, N. A.; DUHAMEL, G. 25. Montar lamínula usando meio aquoso
E. Identification of Serpulina pilosicoli outer
membrane antigens (SPOMA) by western blot Anexo 2 - Protocolo de imuno-histoquímica -
analysis of human isolate SP 16 with Brachyspira sp
convalescente and hyperimmune swine soro. In:
PAUL, P. S., FRANCIS, D. H., BENFIELD, D. 1) Xilol I e II por 20 min cada,
(Eds). Mechanisms in the pathogenesis of 2) Álcool 100% 2 min,
enteric diseases. Washington: Plenum, 1998, p. 3) Álcool 96% 2 min,
39-57. 4) Álcool 80% 2 min
5) Álcool 70% 2 min
ZLOTOWSKI, P.; DRIEMEIER, D.; 6) Água Destilada
BARCELLOS, D. E. S. N. Patogenia das 7) Peróxido de Hidrogênio 3% por 5 min
diarreias dos suínos: modelos e exemplos. Acta (diluir em água destilada até uma uma
Sci. Vet., v. 36, n. 1, p. 81-86, 2008. concentração final de 3% = 3 ml H2O2 em
97 ml de água destilada),

67
8) Lavar com TBS • 1 litro de água destilada
9) Recuperação antigênica: tripsina 0,1% • 1.3 gramas de tris base (Sigma tris base
(diluída em PBS) por 10 min a 37º C, T-1503)
escorrer e colocar a lâmina em tampão • 8.7 gramas de NaCl
citrato (pH 6). Deixar por 2 min em • 6.0 gramas de tris HCL (sigma T-3253)
microondas na potencia máxima, evitar
evaporar, controlar colocando TBS sem Anexo 3 – Protocolo de imuno - histoquímica
Tween quando ferver. Deixar esfriar para circovírus suíno tipo II (PCV-
(colocar TBS sem tween para completar o II)
tampão que evaporou); 1) Xilol 10 min
10) Bloqueio de reações inespecíficas: leite 2) Xilol 10min
desnatado 5% (diluir em PBS) por 15 min 3) Álcool 100 3 min
(alternativa: usar Power Block caseína 4) Álcool 90 3 min
pronta por 15 min). 5) Álcool 80 3 min
11) Lavar com TBS 6) Álcool 70 3 min
12) Anticorpo primário policlonal: 1/75 diluído 7) Água destilada 3 min
em PBS, por 45 min a 37º C em estufa, 8) Água oxigenada (25 ml de água
13) Lavar com TBS oxigenada e 225 ml de PBS) por 30min
14) Gotas amarelas (anticorpo secundário) 2º 9) PBS 30 min
min em temperatura ambiente (suficiente 10) Proteinase K 0,05%, 5 min em câmara
para cobrir o corte) úmida em estufa a 37º C
15) Lavar com TBS 11) PBS 5 min
16) Gotas vermelhas (estreptoavidina) por 20 12) Leite em pó (0,5g em 20ml de PBS)
min em temperatura ambiente (suficiente por 30min em câmara úmida a 37º C
para cobrir o corte), 13) Anticorpo primario (PCV-2 1:800) 45
17) Lavar com TBS min em câmara úmida,
18) Cobrir com DAB (0,6 ml de DAB+ 0,4 ml 14) Lavar PBS - 5min.
PBS+ 25 micro litros de per[óxido de 15) Anticorpo Biotinilado® (incubar em
hidrogênio). Deixar por 5-10 min ou até câmara úmida a 37°C) – 30 min
ficar marron 16) Lavar PBS – 5 min
19) Lavar com TBS e enxaguar em água 17) Streptavidina® (incubar em câmara
destilada úmida em temperatura ambiente) – 25
20) Contra corrar com hematoxilina (até 1 min) min
21) Desidratar em álcool 80%, 96%, e 100% 18) Lavar PBS por 5 min.
por 2 min cada 19) Solução AEC (incubar em câmara
22) Xilol III e IV úmida em temperatura ambiente) – 10
23) Montar a lâmina min
20) Água destilada – 5 min
TAMPÃO CITRATO 21) Água de torneira – 5 min
• 1 litro de água destilada 22) Hematoxilina de Mayer – 3 a 5 min
• 2,1 gramas de ácido cítrico 23) Água de torneira corrente – 5/10 min
• Ajustar o pH 6,0 com NaOH a 0,5% 24) Montar lamínula usando meio aquoso

TBS

Anexo 4 – Tabela de contingência comparando inoculo utilizado cultura pura (C) e homogeneizado de
mucosa (H) com a intensidade da lesão histológica e imuno-histoquímica (ausente, leve,
moderada e severa).
INÓCULO vs HISTOPATOLOGIA

Table of INOCULO by HISTO

INOCULO HISTO
Frequency‚

68
Percent ‚
Row Pct ‚
Col Pct ‚ausente ‚leve ‚moderada‚severa ‚ Total
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆ
C ‚ 26 ‚ 25 ‚ 8 ‚ 5 ‚ 64
‚ 20.31 ‚ 19.53 ‚ 6.25 ‚ 3.91 ‚ 50.00
‚ 40.63 ‚ 39.06 ‚ 12.50 ‚ 7.81 ‚
‚ 34.67 ‚ 62.50 ‚ 100.00 ‚ 100.00 ‚
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆ
H ‚ 49 ‚ 15 ‚ 0 ‚ 0 ‚ 64
‚ 38.28 ‚ 11.72 ‚ 0.00 ‚ 0.00 ‚ 50.00
‚ 76.56 ‚ 23.44 ‚ 0.00 ‚ 0.00 ‚
‚ 65.33 ‚ 37.50 ‚ 0.00 ‚ 0.00 ‚
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆ
Total 75 40 8 5 128
58.59 31.25 6.25 3.91 100.00

Statistics for Table of INOCULO by HISTO

Statistic DF Value Prob
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲ
Chi-Square 3 22.5533 <.0001
Likelihood Ratio Chi-Square 3 27.7168 <.0001
Mantel-Haenszel Chi-Square 1 21.4884 <.0001
Phi Coefficient 0.4198
Contingency Coefficient 0.3870
Cramer's V 0.4198
WARNING: 50% of the cells have expected counts less
than 5. Chi-Square may not be a valid test.

Fisher's Exact Test

ŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲ
Table Probability (P) 1.698E-07
Pr <= P 1.100E-05
Sample Size = 128

INOCULO vs Imunoistoquímica

The FREQ Procedure

Table of INOCULO by IHQ

INOCULO IHQ
Frequency‚
Percent ‚
Row Pct ‚
Col Pct ‚ausente ‚leve ‚moderada‚severa ‚ Total
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆ
C ‚ 28 ‚ 26 ‚ 6 ‚ 4 ‚ 64
‚ 21.88 ‚ 20.31 ‚ 4.69 ‚ 3.13 ‚ 50.00
‚ 43.75 ‚ 40.63 ‚ 9.38 ‚ 6.25 ‚
‚ 35.90 ‚ 65.00 ‚ 100.00 ‚ 100.00 ‚
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆ
H ‚ 50 ‚ 14 ‚ 0 ‚ 0 ‚ 64
‚ 39.06 ‚ 10.94 ‚ 0.00 ‚ 0.00 ‚ 50.00
‚ 78.13 ‚ 21.88 ‚ 0.00 ‚ 0.00 ‚
‚ 64.10 ‚ 35.00 ‚ 0.00 ‚ 0.00 ‚
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆ
Total 78 40 6 4 128
60.94 31.25 4.69 3.13 100.00

Statistics for Table of INOCULO by IHQ

Statistic DF Value Prob
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲ
Chi-Square 3 19.8051 0.0002
Likelihood Ratio Chi-Square 3 23.8091 <.0001
Mantel-Haenszel Chi-Square 1 18.9099 <.0001
Phi Coefficient 0.3934
Contingency Coefficient 0.3661

69
 Cramer's V 0.3934
WARNING: 50% of the cells have expected counts less
than 5. Chi-Square may not be a valid test.

Fisher's Exact Test

ŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲ
Table Probability (P) 1.183E-06
Pr <= P 4.961E-05
Sample Size = 128

Anexo 5 - Tabela de contingência comparando as linhagens utilizadas (Balb/C, C-57 Black 6, DB-A e
Swiss) com a intensidade da lesão histológica e imuno-histoquímica (ausente, leve,
moderada e severa).

LINHAGEM vs HISTOPATOLOGIA
The FREQ Procedure
Table of LINHA by HISTO
LINHA HISTO
Frequency‚
Percent ‚
Row Pct ‚
Col Pct ‚ausente ‚leve ‚moderada‚severa ‚ Total
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆ
Balb ‚ 24 ‚ 8 ‚ 0 ‚ 0 ‚ 32
‚ 18.75 ‚ 6.25 ‚ 0.00 ‚ 0.00 ‚ 25.00
‚ 75.00 ‚ 25.00 ‚ 0.00 ‚ 0.00 ‚
‚ 32.00 ‚ 20.00 ‚ 0.00 ‚ 0.00 ‚
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆ
C 57 ‚ 22 ‚ 9 ‚ 1 ‚ 0 ‚ 32
‚ 17.19 ‚ 7.03 ‚ 0.78 ‚ 0.00 ‚ 25.00
‚ 68.75 ‚ 28.13 ‚ 3.13 ‚ 0.00 ‚
‚ 29.33 ‚ 22.50 ‚ 12.50 ‚ 0.00 ‚
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆ
DBA ‚ 8 ‚ 17 ‚ 5 ‚ 2 ‚ 32
‚ 6.25 ‚ 13.28 ‚ 3.91 ‚ 1.56 ‚ 25.00
‚ 25.00 ‚ 53.13 ‚ 15.63 ‚ 6.25 ‚
‚ 10.67 ‚ 42.50 ‚ 62.50 ‚ 40.00 ‚
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆ
Swiss ‚ 21 ‚ 6 ‚ 2 ‚ 3 ‚ 32
‚ 16.41 ‚ 4.69 ‚ 1.56 ‚ 2.34 ‚ 25.00
‚ 65.63 ‚ 18.75 ‚ 6.25 ‚ 9.38 ‚
‚ 28.00 ‚ 15.00 ‚ 25.00 ‚ 60.00 ‚
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆ
Total 75 40 8 5 128
58.59 31.25 6.25 3.91 100.00

Statistics for Table of LINHA by HISTO

Statistic DF Value Prob
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲ
Chi-Square 9 27.8667 0.0010
Likelihood Ratio Chi-Square 9 31.3685 0.0003
Mantel-Haenszel Chi-Square 1 7.7338 0.0054
Phi Coefficient 0.4666
Contingency Coefficient 0.4228
Cramer's V 0.2694
WARNING: 50% of the cells have expected counts less
than 5. Chi-Square may not be a valid test.

Statistics for Table of LINHA by HISTO

Fisher's Exact Test
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲ
Table Probability (P) 7.854E-11
Pr <= P 2.778E-04

70
 Sample Size = 128

LINHAGEM vs Imunoistoquímica
The FREQ Procedure
Table of LINHA by IHQ
LINHA IHQ
Frequency‚
Percent ‚
Row Pct ‚
Col Pct ‚ausente ‚leve ‚moderada‚severa ‚ Total
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆ
Balb ‚ 25 ‚ 7 ‚ 0 ‚ 0 ‚ 32
‚ 19.53 ‚ 5.47 ‚ 0.00 ‚ 0.00 ‚ 25.00
‚ 78.13 ‚ 21.88 ‚ 0.00 ‚ 0.00 ‚
‚ 32.05 ‚ 17.50 ‚ 0.00 ‚ 0.00 ‚
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆ
C 57 ‚ 23 ‚ 9 ‚ 0 ‚ 0 ‚ 32
‚ 17.97 ‚ 7.03 ‚ 0.00 ‚ 0.00 ‚ 25.00
‚ 71.88 ‚ 28.13 ‚ 0.00 ‚ 0.00 ‚
‚ 29.49 ‚ 22.50 ‚ 0.00 ‚ 0.00 ‚
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆ
DBA ‚ 9 ‚ 17 ‚ 4 ‚ 2 ‚ 32
‚ 7.03 ‚ 13.28 ‚ 3.13 ‚ 1.56 ‚ 25.00
‚ 28.13 ‚ 53.13 ‚ 12.50 ‚ 6.25 ‚
‚ 11.54 ‚ 42.50 ‚ 66.67 ‚ 50.00 ‚
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆ
Swiss ‚ 21 ‚ 7 ‚ 2 ‚ 2 ‚ 32
‚ 16.41 ‚ 5.47 ‚ 1.56 ‚ 1.56 ‚ 25.00
‚ 65.63 ‚ 21.88 ‚ 6.25 ‚ 6.25 ‚
‚ 26.92 ‚ 17.50 ‚ 33.33 ‚ 50.00 ‚
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆŲŲŲŲŲŲŲŲˆ
Total 78 40 6 4 128
60.94 31.25 4.69 3.13 100.00

Statistics for Table of LINHA by IHQ

Statistic DF Value Prob
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲ
Chi-Square 9 26.0821 0.0020
Likelihood Ratio Chi-Square 9 29.9124 0.0005
Mantel-Haenszel Chi-Square 1 7.8908 0.0050
Phi Coefficient 0.4514
Contingency Coefficient 0.4114
Cramer's V 0.2606
WARNING: 50% of the cells have expected counts less
than 5. Chi-Square may not be a valid test.
LINHAGEM vs Imunoistoquímica
The FREQ Procedure
Statistics for Table of LINHA by IHQ
Fisher's Exact Test
ŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲŲ
Table Probability (P) 4.241E-10
Pr <= P 4.926E-04
Sample Size = 128

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