UNIVERSIDADE FEDERAL DE ITAJUBÁ

INSTITUTO DE FÍSICA E QUÍMICA – IFQ

Apostila Disciplina QUI061

2023
EXPERIMENTO 01: TITULAÇÃO POTENCIOMÉTRICA DE UM AMINOÁCIDO

Objetivo: entender o conceito de pK, identificar pelos valores de pK, os grupamentos ionizáveis de
aminoácidos.

As proteínas são macromoléculas abundantes nas células vivas e os aminoácidos são as unidades
fundamentais que compõem todas as proteínas. Eles apresentam em sua constituição dois grupamentos
funcionais característicos, amínico (-NH2) e carboxílico (-COOH). O grupo R, denominado cadeia lateral, é
diferente em cada um dos aminoácidos, contrariamente ao restante da estrutura, que é constante. A estrutura
geral de um aminoácido segue abaixo:

Figura 1. Fórmula geral de um aminoácido.

O conhecimento do comportamento ácido-básico dos aminoacidos é essencial para a compreensão dos

diferentes métodos para separá-los, quantificá-los e identifica-los. Devido ao grupamento das moléculas, os
aminoacidos podem existir em solução aquosa em três formas (Figura 2). Por isso podem agir como ácidos ou
bases.

Figura 2. Formas assumidas pelos aminoácidos em solução aquosa.

Material e Reagentes
• Béquer de 50 mL e 100 mL;
• Pipeta de 5 mL;
 • Agitador;
• Barra magnética;
• Funil;
• Potenciômetro;
• Solução de Glicina 0,1 mol L-1;
• Solução de NaOH 0,5 mol L-1;
• Solução de HCl concentrado;
• Soluções-padrão para calibração do medidor de pH;

Procedimentos
Ajuste do medidor de pH
• Ligar o aparelho;
• Retirar o eletrodo do recipiente contendo solução de KCl 3M e lavá-lo com água destilada;
• Imergir o eletrodo na solução-padrão de pH 7 e calibrar o aparelho;
• Retirar o eletrodo da solução e repetir o procedimento de ajuste, agora para a solução-padrão de pH
4,0;
• Lembrar de sempre colocar o aparelho em “stand by” quando eletrodo não estiver imerso em uma
solução.

TITULAÇÃO DO AMINOÁCIDO
• Em um bécher colocar 50 mL de Glicina 0,1 mol L-1 em béquer de 100 mL;
• Mergulhar uma barra magnética na solução e posicionar o bécher sobre a placa agitadora;
• Inserir o eletrodo limpo e calibrado na solução (cuidado para o bulbo não esbarrar na barra magnética),
manter esta solução sob agitação e adicione ± 0,6 mL de HCl concentrado ou até pH próximo de 1;
• Em uma bureta de 50 mL adicionar solução de NaOH 0,5 mol L-1 e titular adicionando 0,2 mL por vez
e anotando o pH após cada adição (adicionar o NaOH diretamente à solução sem esbarrar no eletrodo
ou na parede interna do bécher);

mL NaOH pH mL NaOH pH
Questões:
1) Construir o gráfico de pH da solução (ordenada) versus volume de NaOH adicionado (abscissa);
2) Assinale na curva os valores de pK e pI contidos na literatura para a glicina e a faixas de pH
tamponante da glicina;
3) Escreva as formulas da glicina nos valores de pH 1; 2,34; 5,97; 9,60 e 12; e determine sua carga
liquida em cada ponto;
EXPERIMENTO 02: CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS

Objetivo: realização de reações que evidenciem a presença de proteínas, peptídeos e aminoácidos em uma
amostra.

Todos os peptídeos e polipeptídios são polímeros de -aminoácidos. Do ponto de vista estrutural, as proteínas
são polipeptídios. As proteínas são constituídas por combinações de aminoácidos. Esses blocos constituintes
da vida se unem entre si para formar longas cadeias e moléculas complexas que configuram a estrutura de
todos os organismos vivos.

Os aminoácidos são -aminoácidos e possuem um grupo carboxil e um grupo amino ligados ao mesmo átomo
de carbono, carbono . Os aminoácidos se diferem uns dos outros em suas cadeias laterais, ou grupos R, os
quais variam em estrutura, tamanho e carga elétrica e influenciam a solubilidade dos aminoácidos em água.

Duas moléculas de aminoácidos podem ser ligadas covalentemente através da formação, de uma ligação
denominada ligação peptídica, formando um dipeptídeo. Essa ligação é formada pela desidratação de um grupo
-carboxil de um aminoácido e o grupo -amino do outro.

Algumas reações de coloração são especificas para aminoácidos encontrados na composição das proteínas.
As reações gerais para caracterização de proteínas, aminoácidos e peptídeos incluem a reação da ninhidrina
e do biureto, que permitem caracterizar grupos comuns a estes compostos incluindo o grupo -amino e as
ligações peptídicas.

REAÇÃO DE BIURETO
A reação do biureto (sulfato de cobre em meio alcalino) é dada por substâncias que contêm no mínimo duas
ligações peptídicas (tripeptídeo). Dessa forma, essa reação é positiva para todas as proteínas, devido as suas
ligações peptídicas. O reativo de biureto também é utilizado identificar a presença de peptídeos.

Reagentes:
Reativo de Biureto
Água destilada ..............................................50 mL
Sulfato Cúprico (5H2O) ..................................150 mg
Tartarato de Sódio e potássio...........................600 mg
NaOH 10%.......................................................30 mL
Água destilada q.s.p. ......................................100 mL

Armazenar em frasco de polietileno e ao abrigo da luz, este reativo é estável indefinidamente, porém deve ser
desprezado se aparecer um precipitado escuro.

Representação da reação do íon cobre com os grupos polarizados presente nos resíduos de
aminoácidos

Materiais e Vidrarias:
· Reativo de Biureto
. 1 pipeta de vidro de 5mL
· 2 pipetas de vidro de 1mL
· 2 Tubos de ensaio
· Estante para tubos de ensaio
· Pêra de borracha ou pipetador
· Papel Toalha
· Descarte para pipetas
. Solução de albumina 2%
. Frasco com água destilada

Procedimento
Colocar 2 mL de reativo de biureto em dois tubos de ensaio.
No tubo número 1 pipetar 1 mL de albumina
No segundo tubo 1 mL de água destilada. Agitar e observar a reação.
Resultado esperado
Tubo 1 (albumina): formação de coloração violácea indicando positivo para proteína
Tubo 2 (Água destilada): Não há mudança de cor, indicando reação negativa

REAÇÃO COM NINHIDRINA

Quando os aminoácidos são aquecidos em solução contendo ninhidrina, todos aqueles que têm grupamento
amino livre produzem um composto púrpura, conhecido como Púrpura de Rüehmann. Essa reação também
pode ser utilizada na detecção de peptídeos e proteínas que apresentem essa característica.

Em condições apropriadas, a intensidade da cor produzida é proporcional à concentração de espécies

(aminoácidos, peptídeos ou proteínas) presente nas amostras.
Observação: Existem exceções a essa reação: prolina e hidroxiprolina reagem com a ninhidrina formando um
composto amarelo.

Reação de com a ninhidrina.

Reagentes:
· Solução de Ninhidrina a 0,2%;
· Solução de glicina a 0,1%
- Solução de albumina

Materiais e Vidrarias:
· 1 pipeta de vidro de 5mL
· 2 pipetas de vidro de 1mL
· 2 Tubos de ensaio
· Estante para tubos de ensaio
· Pêra de borracha ou pipetador
· Papel Toalha
· Descarte para pipetas
· Frasco com água destilada

Procedimento
Em tubo de ensaio pipetar 1 ml da solução de glicina a 0,1%;
Em tubo de ensaio pipetar 1 ml da solução de glicina a 2%;
A cada tubo de ensaio adicionar 0,5 mL da solução de ninhidrina;
Aquecer em banho-maria até que seja desenvolvida coloração.

Resultado esperado
A Ninhidrina reage com o grupo amino livre nos aminoácidos; dando origem produto de cor azul-arroxeada.

REAÇÃO XANTOPROTÉICA
Os aminoácidos podem ser diferenciados entre si devido a seus grupamentos R, ou cadeias laterais, alifática
ou aromáticos. Esta reação resulta da formação de nitrocompostos entre os aminoácidos aromáticos presentes
na amostra e o ácido nítrico em meio alcalino formando compostos coloridos (alaranjado).

Reagentes:
· Ácido Nítrico concentrado
· Hidróxido de sódio 2N
· Solução de albumina 2%
Materiais Vidrarias e Equipamentos
· 1 pipeta de vidro de 5mL
· 2 pipetas de vidro de 1mL
· 1 Tubo de ensaio
· Banho-Maria
· Estante para tubos de ensaio
· Pêra de borracha
· Pinça
· Termômetro
· Papel Toalha
· Descarte para pipetas

Procedimento
Pipetar para um tubo de ensaio 1 mL de albumina e adicionar 10 gotas de ácido nítrico e aquecer até ferver.
Acrescentar 4 mL da solução de hidróxido de sódio. Observar a reação.

Resultado esperado
Reação é positiva quando há a formação de uma solução amarelada/alaranjada.

Questões:
1) Em que se baseia a reação do biureto, explique como o reagente de biureto reage com as proteínas.
2) Em que se baseia a reação com ninhidrina as proteínas?
3) Em que se fundamenta a reação xantoprotéica e que grupos de aminoácidos são responsáveis por
esta reação?
4) O que é proteinúria?
EXPERIMENTO 03: DOSAGEM DE PROTEÍNA DO LEITE PELO MÉTODO DO BIURETO

OBJETIVO
Os alunos deverão ser capazes de aplicar o método do Biureto para a dosagem de proteínas do leite.

FUNDAMENTOS DE FOTOMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO

O termo espectro foi utilizado inicialmente por Newton, quando este descobriu que a luz branca, ao
atravessar um prisma, é dividida em várias cores. Atualmente, sabe-se que o espectro visível é apenas uma
pequena parte do espectro eletromagnético. A luz é, portanto, definida como uma forma de energia
eletromagnética, formada por ondas que apresentam comprimentos diferentes. O comprimento de onda () é
medido em nm onde 1,0 nm equivale a 10 -9 m. A tabela abaixo mostra as regiões do espectro em relação ao
comprimento de onda:

A capacidade que as diversas substâncias químicas têm de absorverem luz em determinados

comprimentos de onda pode ser utilizada para a sua determinação quantitativa e qualitativa, uma vez que o
espectro de absorção é característico para uma determinada substância e a quantidade de absorção
(intensidade) é dependente da concentração do composto. A intensidade da radiação transmitida por uma
solução pode ser determinada em aparelho (fotômetro), que deverá ser constituído de: uma fonte luminosa, um
seletor de  (filtro ou prisma), um compartimento para a amostra, uma célula fotoelétrica (ou fototubo) e um
sistema para amplificação e medida do sinal (corrente elétrica) proveniente da célula fotoelétrica (medidor de
potencial elétrico = potenciômetro).
A fotometria de absorção, portanto, presta-se tanto para a medida da concentração de compostos
naturalmente corados, como daqueles incolores, mas passíveis de adquirirem cor mediante o emprego de
certos reativos, bem como de compostos incolores que absorvem UV ou IV. Esta metodologia, portanto, tem
largo emprego na química analítica quantitativa. Alguns poucos exemplos: na determinação de atividade
enzimática ou nas dosagens de compostos orgânicos em fluidos biológicos, como glicose, uréia, proteínas, etc.,
em que se dosa um produto colorido, obtido por meio de uma reação química, ou um produto incolor que
absorva na região do UV ou do IV. Ensaios imunológicos quantitativos (como o ELISA: Enzyme-Linke
Immunoad Sorbent Assay) também usam a fotometria.
O princípio básico da fotometria é baseado no fato de que: partículas dissolvidas ou dispersas em uma
solução interferem seletivamente com um raio de luz que passa através desta solução. Esta interferência
depende dos seguintes fatores:
a) cor do composto ou do tipo de ligação química presente;
b) tamanho da partícula;
c) transparência da solução;
d) combinação dos fatores acima.

Deste modo, as partículas podem absorver e transmitir parte do espectro, dependendo da sua
concentração, da sua natureza química e/ou da sua cor. Se pudermos medir o total de luz que incide (I0) sobre
a solução de uma determinada substância e o total da luz transmitida (It), podemos avaliar o quanto a
substância absorveu (absorbância: A).
A seguinte formulação pode ser feita: Transmissão = It / Io (luz transmitida / luz incidente). Observe
que o termo transmissão tem aplicação limitada, uma vez que, a It é Io menos a luz que é absorvida não só
pela substância que se deseja medir, mas também pelo solvente, pelo material da cubeta e por outras
substâncias aí existentes. Assim, It é a luz transmitida após as absorções pela substância de interesse mais os
interferentes. Para corrigir tal efeito, admite-se It =1 (100% de Transmitância) a luz transmitida após I0
atravessar a cubeta contendo uma solução denominada branco. Este branco contém todos os componentes
do meio, exceto a substância a ser medida. No escuro, bloqueada a passagem de luz para o fototubo
(fotocélula), a Transmitância = 0, ou seja, não há luz transmitida a ser medida.
Na prática, a transmitância (T), que é medida em uma escala de 0 (no escuro) a 100% (com o branco
na passagem da luz), é pouco utilizada, pois é substituída pelo valor de densidade óptica (D.O.) ou absorbância
(A), termo mais aceito atualmente, que corresponde ao logaritmo do inverso da transmitância:
A = LOG 1/T
A absorbância é, desta forma, medida em uma escala de 0 (log 1/1) a infinito (log 1/0). A relação da A
com a concentração da substância pode ser compreendida pelas Leis de Lambert-Beer: a absorbância de uma
solução é proporcional à concentração da substância na solução e à distância percorrida pelo feixe luminoso
que atravessa a solução (caminho óptico):

A = e. l.c,
onde: e = coeficiente extinção molar, que é constante para cada substância, e definido como a absorbância (A)
de uma solução l molar da substância em um determinado comprimento de onda (l), numa cubeta de caminho
óptico l = l cm (largura da cubeta) e c = à concentração da solução.
Observe, portanto, que a absorbância é uma função linear da concentração. Assim, para uma mesma
substância, considerando-se o caminho óptico constante,
a A é diretamente proporcional à concentração desta substância. No entanto, as Leis de Lambert–Beer nem
sempre são obedecidas.
Algumas desobediências são conhecidas e atribuídas a fatores como: mudança na natureza do soluto,
valores muitos altos ou muitos baixos das concentrações das soluções, etc. Também as presenças de ácidos,
bases e sais na solução podem contribuir para essas desobediências, por estarem mais completamente
dissociados, à medida que aumenta a diluição, visto que absorção da luz pelos íons é diferente daquela
apresentada pelas moléculas não ionizadas. Para se evitar discrepâncias das Leis de Lambert-Beer, deve-se
trabalhar com soluções mais diluídas e construir, previamente, uma curva padrão, em que são usadas
concentrações conhecidas (e crescentes) da substância em análise, e verificar as absorbâncias no
comprimento de onda indicado e na cubeta de caminho óptico adequado. Desta forma, teremos os limites de
concentração nos quais a solução obedece às Leis de Lambert-Beer, ou seja, onde há linearidade. Com o
emprego da curva padrão, podemos, também, determinar a concentração de uma solução problema. O
comprimento de onda (l) usado para a obtenção da curva padrão é obtido pela preparação do espectro de
absorção da substância em estudo e é, normalmente, o  onde a absorvância para a substância apresenta o
valor máximo.

DETERMINAÇÃO ESPECTROFOTOMÉTRICA DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO

MATERIAIS E REAGENTES

Vidrarias e equipamentos
Espectrofotômetro visível;
Tubos de ensaios e estantes para tubos;
Bureta de 25 mL;
Pipetas de 1, 2, 5 e 10 ml;
Papel-filtro;
Proveta de 20 mL;
Funil;
Lenço de papel;
Cubetas para o Espectrofotômetro;
Reagentes
Leite desnatado
Solução padrão de proteína: 1, 2, 3, 4 e 5 mg mL-1 (utilizar albumina)
Ácido clorídrico
Reagente de Biureto

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
O objetivo geral é combinar íons cúpricos com as proteínas do leite (caseína, lactoalbumina e lactoglobina), de
modo que os produtos formados desenvolvam coloração característica. Dessa forma, a concentração das
proteínas pode ser determinada com o auxílio de espectrofotômetro ou fotocolorímetro e das 5 soluções padrão
de proteína.

Preparo da curva padrão

1) Enumere 6 tubos de ensaio e coloque em cada um 4 mL do reagente de Biureto e 1 mL de solução
padrão de proteína, conforme a tabela a seguir:

Soluções Tubo 0 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

Reagente de Biureto 4 mL 4 mL 4 mL 4 mL 4 mL 4 mL
]
Água destilada 1 mL 0 0 0 0 0
Padrão 1 mg mL-1 0 1 mL 0 0 0 0
Padrão 2 mg mL-1 0 0 1 mL 0 0 0
Padrão 3 mg mL-1 0 0 0 1 mL 0 0
Padrão 4 mg mL-1 0 0 0 0 1 mL 0
Padrão 5 mg mL-1 0 0 0 0 0 1 mL

2) Agite os tubos para misturar os reagentes. Em seguida, deixe em repouso por 15 minutos;
3) Ligue o equipamento e ajuste o comprimento de onda em 540 nm;
4) Ajustar os valores de zero de absorbância e 100% de transmitância do equipamento, ajustando que o
branco indique 100% de transmitância;
5) Faça a leitura das soluções padrão (tubo 1-5) e anote os valores;

Preparo das proteínas do leite

Preparo da Amostra I
1) Adicione 10 mL de leite desnatado a 10 mL de água em Erlenmeyer de 100 mL;
 2) Acrescente com auxílio de uma bureta, ácido acético 1 mol. mL-1 até ocorrer à coagulação do leite. Em
pH 4,6 ocorrerá a precipitação isoelétrica;
3) Filtre e descarte o que ficar retido no papel de filtro;
4) O filtrado é a Amostra I e será utilizado, reserve-o.

Preparo da Amostra II
1) Dilua o leite em 1/20 com água destilada (2 mL de leite + 18 mL de água).
2) A amostra contém as proteínas totais do leite;

Ensaio e leitura da absorbância das amostras I e II pelo método do Biureto

Enumere três tubos de ensaio e prepare o teste de determinação de proteínas de acordo com o
volume estabelecido na tabela a seguir:
Soluções Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3
Reagente de Biureto 4 mL 4 mL 4 mL
Água destilada 1 mL 0 0
Amostra I 0 1 mL 0
Amostra II 0 0 1 mL

1) Agite os tubos para misturar os reagentes e em seguida deixe em repouso por 10 minutos;
2) Coloque o tubo branco (tubo1) na cubeta e zere o equipamento;
3) Faça as leituras das amostras e anote os valores de absorbância.

Referências bibliográficas
SKOOG, D. A. HOLLER, F. J. AND NIEMAN, T. A. Princípios de Análise Instrumental. 5thed. Porto Alegre,
Editora Bookman, 2002. (Capítulo 6).
SKOOG, D. A.; WEST, M.D,; HOLLER, F.J.; CROUCH, S.R. Fundamentos de Quimica Analític a, Ed.
PioneiraThomson Learning, São Paulo, 2006. (Capítulo 24).

Questões:
1) Trace o gráfico absorbância X concentração das soluções-padrão;
2) Descreva a lei de Lambert-Beer;
3) Discuta se as soluções-padrão de proteína obedeceram a esta lei nas concentrações avaliadas;
4) Estime o teor de (lactoalbumina +lactoglobina) presentes nas amostras I e II, utilizando a equação da
reta;
EXPERIMENTO 4: DETECÇÃO DE PROTEÍNAS NOS ALIMENTOS COM O USO DO TESTE DO BIURETO

Resumo
Através da realização de um experimento que verifica a presença de proteínas em alimentos,
pretendemos suscitar a discussão sobre síntese de proteínas e a composição proteica dos alimentos.

A síntese dos diferentes tipos de proteínas do organismo exige a disponibilidade de aminoácidos. O

organismo humano não sintetiza alguns desses aminoácidos, que devem ser obtidos por meio das proteínas
dos alimentos ingeridos. O teste do biureto é um método laboratorial, utilizado para a determinação de proteínas
totais numa amostra. Os reagentes do teste formam um complexo com a ligação peptídica, evidenciado pela
coloração violeta. A intensidade da cor é proporcional ao número de ligações peptídicas existentes. Em
laboratório, uma análise quantitativa utiliza aparelhos espectrofotométricos, que possibilitam comparar a
intensidade da coloração. Para o nosso experimento, trabalharemos apenas com a percepção visual,
comparando as amostras com os controles positivo (clara de ovo) e negativo (água) e estimando a
concentração proteica, através da comparação dos resultados com uma escala de concentração proteica feita
previamente em laboratório. Os Alimentos que serão testados nesse experimento são: soja crua em grãos, pão
francês, arroz cozido, feijão cozido, farinha de mandioca torrada, gelatina incolor em pó sem sabor e leite
integral.

Materiais
• 28 tubos de ensaio;
• Liquidificador;
• Reagente de Biureto;
• Solução de hidróxido de sódio (NaOH) a 10% (10 g para 100 mL de água);
• Pipetas volumétricas de vidro ou plástico (ou conta-gotas);
• Água (controle negativo);
• Clara de ovo crua (controle positivo);
• Soja crua em grãos;
1 pão francês;
• Arroz cozido;
• Feijão cozido;
• Farinha de mandioca torrada;
• Gelatina incolor em pó e sem sabor;
• Leite integral.

Figura 1: Materiais necessários

Protocolo Experimental
Preparo dos alimentos:
1) Soja em grãos: bater no liquidificador 1 colher de soja com 100 mL de água;
2) Pão francês: bater no liquidificador 10 g de pão (ou 1/3 do pão francês) com 100 mL de água e filtrar ou coar.
Se a solução apresentar caráter pastoso, ela pode ser coada posteriormente com gaze ou com peneira
3) Arroz cozido: bater no liquidificador 1 colher de sopa de arroz cozido com 100 mL de água.
4) Feijão cozido: bater no liquidificador 1 colher de sopa de feijão cozido com 100 mL de água.
5) Farinha de mandioca torrada: bater no liquidificador 1 colher de sopa de farinha de mandioca com 100 mL
de água.
6) Gelatina: preparar a gelatina de acordo com as instruções do rótulo e usá-la líquida;
7) Leite integral: diluir o leite na proporção de 1:9 (1 mL de leite + 9 mL de água);
8) Clara de ovo crua: bater no liquidificador a clara de 1 ovo com 100 mL de água

Teste do Biureto:
Cada grupo deverá prepara 3 tubos para cada alimento (total de 24 tubos): um com água, um com a solução
do alimento preparado e um com clara de ovo, de acordo com a tabela abaixo:
Tubos Água Alimento Clara de ovo Reagente de
Biureto
1 0,5 mL - - 0,5 mL
2 - 0,5 mL - 0,5 mL
3 - - 0,5 mL 0,5 mL
 A solução do tubo 3, submetida ao teste do Biureto, deve adquirir uma coloração após a adição dos
reagentes, em contraste com a solução do tubo 1, que não sofreu adição dos reagentes do teste.
A coloração do tubo 2 pode ser comparada com o teste com água (tubo 1) e com a clara de ovo (tubo
3), controles negativo e positivo, respectivamente, pois indicam ausência e presença de proteínas.
Para uma análise mais quantitativa, cada grupo poderá comparar a coloração da solução do seu
alimento submetido ao teste do Biureto com uma escala de concentração de proteínas (figuras 2A e 2Bb) para
estimar a quantidade de proteínas na solução de alimento preparada.
A escala abaixo foi preparada em laboratório, realizando-se uma série de diluições da clara de ovo,
sendo que no último tubo não havia clara de ovo.
Tais diluições tiveram seu teor proteico quantificado em testes laboratoriais e foram submetidas
posteriormente ao teste do Biureto, gerando uma escala de cores com as respectivas concentrações proteicas
em mg/mL.
Cada grupo poderá comparar visualmente a coloração da solução do alimento (tubo 2) com a escala
de cores e estimar a concentração de proteínas do alimento testado.
A escala de cores pode apresentar variações em suas tonalidades, devido às condições dos reagentes
utilizados.

Figura 2A: Tubos com as diluições de clara de ovo submetidas ao teste do Biureto. Os números representam
as concentrações de proteínas em mg/mL para as respectivas cores das soluções. Figura 2B: Escala de cores
de concentração de proteínas. Os números representam as concentrações de proteínas em mg/ mL para as
respectivas cores das soluções.

Questões:
1. Descrever a coloração encontrada nos tubos que contêm água, clara do ovo e o alimento testado pelo
seu grupo.

2. Compare o resultado do teste do alimento escolhido pelo grupo com a figura que ilustra a escala de
concentração de proteínas. Estime a concentração de proteínas do alimento que o seu grupo testou.
Deixe o registro dos cálculos indicados.
Exemplo:
No teste com a soja crua em grãos, podemos observar que a soja adquiriu coloração tendendo ao roxo,
semelhante ao tubo 4, que contém clara de ovo sob o teste do Biureto, indicando presença de proteínas.
Comparando o teste com a escala de concentração de proteínas (figura 2B), estima-se que a concentração de
proteínas da soja esteja entre os valores 3,1 e 2,6 mg/mL.
Como 1 colher de sopa de soja foi diluída em 100 mL de água, é necessário calcular o valor de proteínas em 1
colher de sopa de soja. Admitindo o valor aproximado de 3,0 mg/mL de proteínas, de acordo com a escala de
cores, há aproximadamente 3 mg de proteínas em 1 mL de solução submetida ao teste do Biureto, o que lhe
confere essa tonalidade.
Se, em 1 mL há aproximadamente 3 mg de proteínas, em 100mL, há X mg de proteínas:
1mL______3mg
100mL____Xmg
X= 300 mg de proteínas.
Esses 300 mg de proteínas estão contidos em 1 colher de sopa de soja em grãos (1 porção), ou seja, em cada
colher de soja testada há 300 mg de proteínas.

Referências Bibliográficas:
Detecção de proteínas nos alimentos com o uso do teste do Biureto. Laboratório De Tecnologia Educacional
Departamento De Bioquímica. Instituto De Biologia Universidade Estadual De Campinas – Unicamp.
EXPERIMENTO 05: HIDROLISE DO AMIDO

Objetivo: Constatar a ação enzimática da amilase de grãos de trigo germinados e verificar o efeito de diferentes
condições de pH e temperatura sobre a ação da amilase da amilase de grãos de trigo germinados.

O amido é um polissacarídeo encontrado, principalmente em grãos e tubérculos, formado por unidades

de glicose unidas. A polimerização da glicose no amido resulta em dois tipos moléculas, a amilose e a
amilopectina. A amilose é um polímero linear (Figura 1A), formado por unidades de glicose unidas por ligações
glicosídicas α- 1,4. A amilopectina é ramificada (Figura 1B), e é um polímero de maior peso molecular que a
amilose e, além das ligações α- 1,4, encontra-se também ligações α- 1,6 (ponto de ramificação).

A B

O amido nas células vegetais está armazenado na forma de grânulos insolúveis, variando na forma e
na quantidade, conforme a espécie e o estágio de maturação da planta. O granulo de amido é insolúvel em
agua fria e solúvel em agua quente. O amido é uma das mais abundantes fontes de energia renováveis, sendo
amplamente utilizada pelas indústrias farmacêuticas, panificação, fermentação.

Hidrólise do amido
A hidrólise do amido produz glicose, maltose, oligossacarídeos. Em animais, vegetais e microrganismos
(fungos e bactérias), o amido é hidrolisado por um complexo de enzimas hidrolíticas denominadas amilases.
Industrialmente, o amido é hidrolisado com soluções ácidas a quente. As ligações glicosídicas presentes no
amido, (1→4) e (1→6), são hidrolisadas com ácido de maneira não-específica, formando oligossacarídeos
e grande quantidade de glicose se forem conduzidas por muito tempo.
Materiais
7 Tubos de ensaio
1 Estante para tubos de ensaios
Solução de amido à 1% (m/v) em água destilada
Solução-tampão fosfato 0,1 M, pH 6,8
Solução-tampão acetato 0,1 M, pH 4,0
Solução-tampão glicina 0,1 M, pH 9,5
Solução de Lugol
Banho-maria a 37 ºC
Banho fervente
Pote com gelo
1 Pipeta automática de 100 μL (0,1 mL), 1 Pipeta automática de 1000 μL (1,0 mL)
1 Pipeta pasteur
Ponteiras

Procedimentos Experimental 1

1) Prepare 4 tubos de ensaio marcando-os de 1 a 4 e adicione em cada tubo 2 mL de amido a 1% e 1 mL

de tampão fosfato 1 mol L-1, pH 6,8;
2) O tubo 1 colocar no gelo, o tubo 2 deixar à temperatura ambiente, o tubo 3 em banho-maria a 37°C e
o tubo 4 em água fervente por aproximadamente 10 minutos para equilíbrio térmico;
3) Após esse tempo, adicione 1 mL de da solução com grãos germinados em cada tubo, no fundo, e agite
bem, conservando os tubos nas respectivas temperaturas (gelo, água fervente, banho-maria a 37°C e
banho-maria fervente).
4) Aguarde exatamente 10 minutos. Faça o teste do iodo: pipetar com o conta-gotas 1 gota de solução de
Lugol e aguardar a coloração estabilizar. Caso seja necessário pipetar mais 1 ou 2 gotas da solução;

Procedimentos Experimental 2
1) Prepare os seguintes tubos:
Tubo 1: 1,0 mL de tampão acetato 0,1 M, pH 4,0 + 0,5 mL amido 1%
Tubo 2: 1,0 mL de tampão fosfato 0,1 M, pH 6,8 + 0,5 mL amido 1%
Tubo 3: 1,0 mL de tampão glicina 0,1 M, pH 9,5 + 0,5 mL amido 1%
2) Adicione 1 mL de amilase obtida de grãos de trigo germinados (procedimento realizado previamente)
3) Adicione 1 gota de solução de Lugol e aguardar a coloração estabilizar. Caso seja necessário, pipetar
mais 1 ou 2 gotas da solução;
Perguntas
1) Em qual temperatura houve maior degradação do amido? Em qual temperatura houve menor degradação
do amido? Explique.
2) Em qual pH houve maior degradação do amido? Em qual pH houve menor degradação do amido? Explique.

Referências
1. LEHNHNGER, A.L., NELSON, D.L., COX, M.M. Princípios de Bioquímica, 5ª ed., Ed.Sarvier.
EXPERIMENTO 06: CARACTERIZAÇÃO DE CARBOIDRATOS

Os carboidratos estão presentes não apenas no açúcar de mesa ou no mel, mas também na maisena, batata,
pão, macarrão e mandioca. Mesmo o malte usado na fabricação da cerveja é carboidrato. E não é só nos
alimentos que você pode encontrá-los. A madeira e o papel são feitos de um carboidrato chamado celulose, a
casca (exoesqueleto) do caranguejo, do camarão, e de todos os crustáceos, insetos e aracnídeos é feita de
quitina, que também é um carboidrato. Por fim, estamos cercados de carboidratos. Mas como identificar um
carboidrato? Para isso existe uma reação simples denominada de Teste de Molish. Depois de confirmado se a
substância é um carboidrato, podemos diferenciar entre açúcares redutores e não redutores pelos testes de
Fehling, Benedict e Tollens. Os carboidratos também podem ser separados em aldoses e cetoses pelos testes
de bromo e de Seliwanoff.

Objetivos: Identificar se uma substância é ou não um carboidrato e também distinguir entre açúcares redutores
e não redutores, entre aldoses e cetoses e entre mono e polissacarídeos.

TESTE DE MOLISH
O teste de Molish é um teste geral para carboidratos desenvolvido pelo botânico austríaco Hans Molish
(1856-1937). O teste baseia-se na desidratação do carboidrato pelo ácido sulfúrico concentrado, formando
furfural no caso das pentoses, ou 5-(hidroximetil) -furfural para as hexoses (Figura 1). Em seguida o derivado
do furfural condensa com duas moléculas de α-naftol (Figura 2) produzindo um pigmento violeta (Figura 3).
Polissacarídeos, oligossacarídeos ou dissacarídeos reagem mais lentamente, pois primeiramente eles têm
suas ligações glicosídicas hidrolisadas pelo meio ácido e em seguida os monossacarídeos formados
desidratam, dando resultado positivo para o teste.

Materiais:
✓ 5 tubos de ensaio numerados de 1 a 5,
✓ 2 Pipetas graduadas de 10 mL,
✓ Conta-gotas
Reagentes:
✓ Glicose,
✓ Frutose,
✓ Sacarose (açúcar de mesa),
✓ Amido (maizena),
✓ Celulose (papel),
✓ α-Naftol 10% em etanol,
 ✓ Ácido Sulfúrico concentrado.

Figura 1 – Desidratação dos carboidratos.

Procedimento experimental
✓ Numere 05 cinco tubos ensaio, e adicione uma ponta de espátula de cada substância a ser testada:
glicose, frutose, sacarose (açúcar de mesa), amido (maizena) e celulose (papel) e 1,0 mL de água;
✓ Adicione 4 gotas de solução de α-naftol a 10% em etanol em cada tubo e misture;
✓ Incline os tubos e deixe escorrer pela parede 1,0 mL de ácido sulfúrico concentrado de modo a formar
uma camada sobre a solução aquosa sem misturar;
✓ A presença de carboidratos é confirmada pela formação de um anel vermelho entre as camadas, que
rapidamente muda para violeta.
✓ Anote o resultado.
✓ Agite o tubo e deixe em repouso por 2 minuto, dilua então com 5 mL de água, um precipitado violeta-
escuro irá se formar confirmando a presença de carboidrato.
 Figura 2 - Reação de Molish.

Figura 3 - Resultado do Teste de Molish

TESTE DE SELIWANOFF
O teste de Seliwanoff é uma variação do teste de Molish que consegue diferenciar aldoses de cetoses
devido a diferenças na velocidade e intensidade da reação. Como agente desidratante é empregada solução
de HCl 1:1 em água, e como fenol emprega-se o resorcinol. O HCl 1:1 é um agente desidratante menos eficiente
que o H2 SO4 concentrado, e nessas condições as cetoses desidratam mais rapidamente que as aldoses, pois
já se encontram na forma furanosídica propícia para a formação do 5-(hidroximetil)-furfural. Já as aldoses
encontram-se na forma piranosídica, e teriam que rearranjar para a forma furanosídica para desidratar, o que
torna a reação mais lenta e menos eficaz. Em seguida ocorre a adição de duas moléculas de resorcinol, num
mecanismo semelhante a reação de Molish (Figura 12), formando um produto vermelho. Para as aldoses a
reação é mais lenta e o produto em geral é rosa pálido.
Materiais:
✓ 5 tubos de ensaio;
✓ 5 Espátulas;
✓ 2 Pipetas graduadas de 10 mL;
✓ Béquer de 500 m;
✓ Pegador para tubos de ensaio;
✓ Chapa de aquecedora;
✓ Balão volumétrico de 500 mL.

Reagentes:
✓ Glicose;
✓ Frutose;
✓ Sacarose (açúcar de mesa);
✓ Amido (maizena)
✓ Resorcinol
✓ Ácido Clorídrico concentrado.
✓ Reagente de Seliwanoff: Dissolva 0,05g de resorcinol em 50 mL de água e adicione 50 mL de HCl
concentrado.

Procedimento Experimental
✓ Enumere 05 tubos de ensaio e adicione 2,0 mL da solução do carboidrato 10% (0,2g em 2,0 mL) e 1,0
mL do reativo de Seliwanoff;
✓ Agite e coloque em banho-maria fervente por 2 minutos;
✓ Substâncias a serem testadas: glicose, frutose, sacarose (açúcar de mesa), amido (maizena) e celulose
(papel);
✓ Observar e anotar a cor.

EXTRAÇÃO, PREPARO E CARACTERIZAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO DE AMIDO DE BATATA

O amido é o principal polissacarídeo de reserva vegetal. Sua importância na alimentação humana é
evidenciada pelo consumo de arroz, batata, trigo, mandioca, milho, entre outros alimentos, que são as principais
fontes de calorias de nossa dieta. Ele é encontrado na forma de grânulos no interior dos cloroplastos das folhas,
frutas, sementes e raízes (tubérculos). Na batata seu teor pode chegar a 75% do peso seco. Os grânulos de
amido são insolúveis em água, mas o calor pode quebra-los formando uma solução coloidal.
Entretanto, qualquer agente desidratante promove a precipitação do amido, como etanol ou uma
solução saturada de sal. O amido na verdade é formado por dois polímeros da glicose, a amilose e a
amilopectina. A estrutura helicoidal da amilose pode acomodar os íons triiodeto I3- formando um complexo de
transferência de carga.
Esse é o teste mais conhecido para a presença de amido, denominado teste de Lugol. Para acomodar
o triiodeto são necessárias seis voltas da hélice, sendo que cada volta contém seis unidades de glicose num
total de 36 unidades monoméricas, formando um complexo azul. A amilopectina, por ser ramificada possui
hélices menores, formando um complexo marrom-avermelhado. A malto dextrina, por possuir no máximo 20
unidades de glicose forma um complexo vermelho. O aquecimento desfaz a estrutura helicoidal, quebrando o
complexo que perde sua cor, mas ao ser resfriado o complexo retorna.

Materiais:
✓ Béqueres de 100 mL;
✓ Espátula;
✓ Bastão de vidro;
✓ Gaze;
✓ Proveta de 50 mL;
✓ Funil;
✓ Béquer 250 mL;
✓ Chapa de aquecimento;
✓ 6 Tubos de ensaio;
✓ 2 Pipetas graduadas 5 mL;
✓ 2 Conta-gotas;
✓ Bico de Bunsen;
✓ Pegador para tubo de ensaio.

Reagentes:
✓ 1 Batata;
✓ Água destilada;
✓ Iodo;
✓ Iodeto de potássio;
✓ Pão;
✓ Banana verde;
✓ Banana madura;
✓ α-Naftol 10% em etanol;
✓ Ácido Sulfúrico concentrado;
✓ Solução saturada de sulfato de amônio;
 ✓ Reativo de Lugol: Dissolver 1,0 g de iodo e 5,0g de iodeto de potássio em 100mL de água destilada.

Procedimento Experimental
✓ Raspe alguns pedaços da parte interna de uma batata com uma lâmina e transfira para um béquer de
100 mL;
✓ Adicione 50 mL de água destilada e agite vigorosamente com um bastão de vidro;
✓ Filtre o material com gaze recolhendo o filtrado em um béquer de 250 mL, espremendo delicadamente
a gaze;
✓ Deixe em repouso por 10 min;
✓ Decante o líquido sobrenadante;
✓ O depósito sólido no fundo do béquer é o amido que foi extraído da batata e será utilizado nos
procedimentos de caracterização.
✓ Em outro béquer ferva 50 mL de água destilada;
✓ Acrescente 50 mL de água fria ao amido extraído e agite de forma a obter uma suspensão;
✓ Adicione então lentamente e com constante agitação os 50 mL de água fervente;
✓ Aqueça até que se forme uma solução opaca00;
✓ Pipete 1,0 mL da solução e realize o teste de Molish para confirmar a extração de carboidrato
✓ Reserve o restante da solução.

TESTE DE LUGOL
✓ Em um tubo de ensaio pipetar 2,0 mL de solução de amido de batata;
✓ Adicionar 3 gotas de Lugol e observe a coloração;
✓ A presença de amido é confirmada por coloração azul intensa;
✓ Aqueça em seguida o tubo diretamente na chama do bico de bunsen e observe a cor e resfrie em água
corrente e observe a cor.
✓ Também faça o teste de Lugol em um pedaço de pão, uma rodela de banana verde e uma rodela de banana
madura, pingando uma gota sobre elas.

Precipitação:
✓ Em um tubo de ensaio pipetar 5,0 mL da solução de amido
✓ Adicionar 5,0 mL de solução saturada de sulfato de amônio e agitar fortemente;
✓ deixe em repouso por 10 min;
✓ Filtrar e fazer o teste de Lugol no filtrado e no precipitado;
✓ Em outro tudo de ensaio adicione mais 5,0 mL da solução de amido e 5,0 mL de etanol, agitar.
✓ Filtrar e fazer o teste de Lugol no filtrado e no precipitado.
 Comentários sobre as atividades
✓ A solução de amido de batata dá resultado positivo para o teste de Lugol, com uma coloração azul
intensa o que indica predominância de amilose;
✓ O aquecimento desfaz o complexo colorido, mas este é formando novamente após o resfriamento.
✓ Pão e banana verde resultam em teste positivo para a presença de amido, entretanto, quanto mais
madura a banana menos intensa a resposta, pois o amido se converte em glicose durante o
amadurecimento (Figura 19).
✓ Por fim, tanto o etanol quanto o sulfato de amônio precipitam o amido da solução por ação
desidratante.
✓ Ao realizar o teste de Lugol no filtrado e no precipitado, apenas os precipitados darão positivo.

Referências bibliográficas

Questões:
1) Como é pode ser feita a detecção de um carboidrato?
2) Como o teste de Seliwanoff consegue diferenciar aldoses de cetoses?
3) Porque a celulose não reage com o Lugol?
4) Porque a amilose dá coloração azul com Lugol, enquanto a amilopectina dá coloração marrom e a
malto dextrina coloração vermelha?
5) Porque o complexo amido/triiodeto é desfeito ao aquecermos a amostra?
6) Porque o amido precipita com a adição de etanol?
EXPERIMENTO 07: DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE ACIDEZ (lA) DO ÓLEO DE SOJA

O termo lipídio engloba um grupo diversificado de compostos, incluindo óleos, gorduras e componentes
correlatos encontrados nos alimentos e nos seres vivos. Essas biomoléculas são insolúveis em água, porém
solúveis em solventes orgânicos apolares, como éter e clorofórmio. A maioria das gorduras naturais é
constituída por 98 a 99% de triacilgliceróis, que, por sua vez, são constituídos de ácidos graxos e glicerol. O
remanescente, 1 a 2%, inclui traços de monoacilgliceróis, diacilgliceróis, ácidos graxos livres, fosfolipídios e
substâncias não saponificáveis contendo esteróis. Uma vez que óleos e gorduras são ésteres, eles sofrem
reação de hidrólise ácida ou básica. A hidrólise ácida produzirá simplesmente o glicerol e os ácidos graxos
constituintes. Já a hidrólise básica produzirá o glicerol e os sais desses ácidos graxos. Assim, aquecendo
gordura em presença de uma base, realizamos uma reação química que produz sabão. Essa reação, a hidrólise
básica de um triéster de ácidos graxos e glicerol, é chamada de saponificação (Figura 1). Sabões de metais
alcalinos são solúveis, enquanto os que contêm metais alcalinos terrosos e metais pesados são insolúveis.

Figura 1. Reação de saponificação com NaOH e triacilglicerol produzindo glicerol e sais de ácidos graxos.
Os ácidos graxos participam da constituição de mono, di e triglicerídios, principais constituintes dos
óleos e gorduras. Ácidos carboxílicos são moléculas que apresentam o grupo carboxila, ou grupo carboxílico,
assim chamado por incluir os grupos carbonila e hidroxila conforme (Figura 2). Dentre os ácidos carboxílicos
alifáticos, há uma classe especial denominada ácidos graxos, caracterizada por cadeias lineares, com números
pares de átomos de carbono. Por serem ácidos, portanto, os ácidos graxos podem ser neutralizados por ação
de uma base forte, como o hidróxido de sódio (NaOH) e o hidróxido de potássio (KOH).
 Se os ácidos graxos são constituintes dos óleos e gorduras, na forma de mono, di e
triglicerídios, uma grande quantidade de ácidos graxos livres pode indicar que o produto está
em deterioração. A principal consequência disso é que o produto se torna mais ácido. Um
elevado índice de acidez indica, portanto, que o óleo ou gordura está liberando seus
constituintes principais, os ácidos graxos e é por esse motivo que o cálculo desse índice é de
extrema importância na avaliação do estado de deterioração (rancidez hidrolítica) do óleo ou
gordura que consumimos. O índice de acidez corresponde à quantidade (em mg)
de base (KOH ou NaOH) necessária para neutralizar os ácidos graxos livres presentes em 1
g de gordura.

Figura 2. Ácido graxo

Objetivos
Determinar o índice de acidez (lA) do óleo de soja.

Reagentes e soluções
Solução de éter etílico e etanol 95%, na proporção de 2:1
Solução indicadora de fenolftaleína 1%
Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,1 M padronizado
Óleo de soja

Vidraria e instrumental
Três erlenmeyers de 250 mL
Bureta de 25 mL
Suporte para bureta

Procedimento Experimental
1. Pesar, em um erlenmeyer de 250 mL, 1 g de amostra, utilizando balança analítica.
2. Dissolver a amostra em 25 mL da solução de éter etílico:álcool etílico (2:1 v/v).
3. Adicionar 3 gotas do indicador (fenolftaleína).
4. Titular com a solução padronizada de hidróxido de sódio 0,01 N, agitando vigorosamente até o aparecimento
de uma primeira coloração rosa.
5. A cor rosa deve persistir por 30 s.