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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CAMPUS DE CURITIBANOS
CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS
MEDICINA VETERINÁRIA

Letícia Vieira Lipert Pazzim

TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM BOVINOS: REVISÃO DE LITERATURA

Curitibanos

2021
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Letícia Vieira Lipert Pazzim

TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM BOVINOS: REVISÃO DE LITERATURA

Trabalho Conclusão do Curso de Graduação em

Medicina Veterinária do Centro de Ciências Rurais
da Universidade Federal de Santa Catarina como
requisito para a obtenção do título de Bacharel em
Medicina Veterinária.
Orientador: Prof. Dr. Vitor Braga Rissi.

Curitibanos

2021
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Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através do Programa de Geração

Automática da Biblioteca Universitária da UFSC.
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Letícia Vieira Lipert Pazzim

TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM BOVINOS: REVISÃO DE LITERATURA

Este Trabalho Conclusão de Curso foi julgado adequado para obtenção do Título de
“Médico Veterinário” e aprovado em sua forma final pela seguinte banca:

Curitibanos, 29 de setembro de 2021.

Prof. Malcon Andrei Martinez-Pereira, DSc.

Coordenador do Curso

Banca Examinadora:

Prof. Vitor Braga Rissi, Dr.

Orientador
Universidade Federal de Santa Catarina

Médico Veterinário André Lucio Fontana Goetten

Avaliador
Universidade Federal de Santa Catarina

Prof. Giuliano Moraes Figueiró, Dr.

Avaliador
Universidade Federal de Santa Catarina
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Este trabalho é dedicado à minha família, em especial à minha mãe, Evani, e ao

meu pai, Júlio Cezar (in memorian).

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AGRADECIMENTOS

Agradeço, primeiramente, ao meu pai (in memorian), pessoa de quem herdei o

amor pelos animais. Infelizmente não poderemos comemorar está vitória fisicamente,
mas sei que estás orgulhoso. Esta conquista é nossa. Prometo te honrar como pessoa
e profissional. Te amo.
Agradeço aos meus avós, Leda e Antônio (in memorian), por me permitirem
crescer próxima da natureza e dos animais. Vocês foram fundamentais para que eu
me tornasse Médica Veterinária.
Agradeço à minha mãe, minha fonte de inspiração, força e amor. Sem você,
nada disto seria possível. Obrigada por nunca desistir de mim e por sempre acreditar
na minha capacidade. Que tenhamos ainda mais conquistas e vitórias para
comemorarmos juntas. Amo você, além do infinito.
Agradeço à minha irmã, Júlia, minha segunda mãe. Serei eternamente grata
pelo cuidado e amor durante estes anos. Tu foste fundamental para eu vencer as
dificuldades encontradas ao longo deste período.
Agradeço ao meu noivo, Julian. Amor, serei eternamente grata por embarcar
comigo nesta aventura e viver do meu sonho. Apesar de todas as barreiras
encontradas ao longo deste processo, permaneceu ao meu lado. Espero que
tenhamos ainda mais vitórias juntos.
Agradeço às minhas amigas e colegas, Kamila Daniel, Léa Oravec, Maria
Helena Aguiar, Sylvia Brollo e Thais Sasso. Vocês tornaram estes cinco anos mais
leves e alegres. Obrigada por toda a parceria e ajuda.
Agradeço, em especial, à minha melhor amiga, irmã, Bárbara Marçal. Menina
iluminada e de um coração gigante. Obrigada por permanecer ao meu lado durante a
graduação, mesmo nos momentos de ansiedade e estresse. Levarei para sempre
comigo a frase: “Um dia de cada vez”.
Agradeço aos meus professores, por todos os ensinamentos e experiências
vivenciadas ao longo destes anos. Com certeza cada um contribuiu para que me
tornasse uma Médica Veterinária apaixonada pela profissão.
Agradeço ao meu orientador, Prof. Dr. Vitor Braga Rissi. Obrigada por aceitar
o convite de orientador, mas também pelos conselhos e acalento nos momentos de
dificuldade no período de estágio.
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Agradeço a todos os colaboradores da fazenda RAR, pela paciência e

aprendizado. Em especial ao Médico Veterinário Willian Pessoa, seu João, seu Veli,
seu Rubens, Luís, Maicon e Luiz Henrique. Apesar das dificuldades encontradas no
início do estágio, pude me tornar mais forte como pessoa e profissional. Obrigada por
me acolherem e tornarem os meus dias mais alegres. Sentirei saudades desta época.
Agradeço ao meu amor de quatro patas, Aurora. Mesmo que você não entenda,
agradeço por ter sido minha companheira nos momentos de estudo, mas também por
me proporcionar tanto amor e leveza.
Por fim, agradeço a todos que passaram pelo meu caminho e auxiliaram para
me tornar Médica Veterinária. Espero, um dia, retribuir de alguma forma.
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“Somos do tamanho dos nossos sonhos”.

(Fernando Pessoa)
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RESUMO

A transferência de embriões (TE) é uma biotecnologia mundialmente difundida, com

o objetivo principal de produzir um número elevado de descendentes geneticamente
superiores por fêmea. A partir da TE é possível reduzir o intervalo entre gerações e
aumentar a velocidade de melhoramento genético do rebanho, além de permitir que
animais geneticamente superiores e com distúrbios reprodutivos adquiridos se
reproduzam, impedindo o descarte precoce dos mesmos. A técnica consiste em obter
embriões de uma fêmea doadora e transferi-los para receptoras, com a finalidade de
completar o período de gestação. Para tanto, torna-se necessário realizar a seleção e
a sincronização do ciclo estral de fêmeas doadoras e receptoras de embriões, e
protocolo hormonal de superovulação de doadoras, além de colheita, classificação e
transferências dos embriões. O presente trabalho de conclusão de curso em Medicina
Veterinária da Universidade Federal de Santa Catarina apresenta uma revisão
bibliográfica referente a transferência de embriões (TE) em bovinos. Ao decorrer desta
monografia, são descritos os aspectos fisiológicos reprodutivos de fêmeas bovinas,
assim como as principais etapas para a realização da transferência de embriões nesta
espécie.

Palavras-chave: Bovinos, doadoras, transferência de embriões, receptoras.

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ABSTRACT

Embryo transfer (ET) is a globally widespread biotechnology, with the main objective
of producing a high number of genetically superior offspring per female. From TE it is
possible to reduce the interval between generations and increase the speed of genetic
improvement of the herd, in addition to allowing genetically superior animals and those
with acquired reproductive disorders to reproduce, preventing or discarding them early.
The technique consists of obtaining embryos from a donor female and transferring
them to recipients, with a process of completing the gestation period. Therefore, it is
necessary to carry out the selection and synchronization of the estrous cycle of donors
and recipients of embryos, and a hormonal donor superovulation protocol, in addition
to the collection, classification and transfer of the embryos. The present work of
completion of the course in Veterinary Medicine at the Federal University of Santa
Catarina presents a literature review regarding embryo transfer (ET) in bovines. During
this monograph, the physiological reproductive aspects of bovine animals are added,
as well as the main steps for carrying out embryo transfer in this species.

Keywords: Cattle, donors, embryo transfer, recipients.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Estrutura ovariana .................................................................... 18

Figura 2 - Inter-relações no controle da função reprodutiva de uma
fêmea ...................................................................................................... 20
Figura 3 - Esquema da sequência das fases do ciclo estral de fêmeas
bovinas .................................................................................................... 23
Figura 4 - Fases do crescimento folicular ................................................. 24
Figura 5 - Protocolo de SOB de doadoras com Benzoato de Estradiol
(BE) e dispositivo intravaginal de Progesterona ....................................... 30
Figura 6 - Esquema adotado para a coleta de embriões em sistema
fechado .................................................................................................... 32
Figura 7 - Esquema de configuração do sistema fechado de coleta de
embriões .................................................................................................. 33
Figura 8 - Ilustração do desenvolvimento embrionário normal de bovinos 36
Figura 9 - Classificação de embriões bovinos produzidos in vivo, de
acordo com a qualidade morfológica ....................................................... 38
Figura 10 - Esquema de envase de embrião em palheta .......................... 39
Figura 11 - Protocolo de sincronização OVSYNCH ................................. 43
Figura 12 - Protocolo de sincronização de ovulação com associação de
Progestágeno, BE e GnRH ...................................................................... 43
Figura 13 - Protocolo de TETF, usando Novormon® (eCG) e inovulação
no D17, sem detecção de cio ................................................................... 44
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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Principais funções dos hormônios envolvidos na reprodução

de fêmeas ................................................................................................ 22
Tabela 2 - Protocolo de SOV baseado no cio natural, com associação
de FSH e PGF2α ..................................................................................... 29
Tabela 3 - Protocolo de SOV com associação de FSH, E2, P4, CIDR e
PGF2α ..................................................................................................... 30
Tabela 4 - Protocolo de SOV baseado no cio natural, com associação
de FSH, PGF2α e GnRH/LH para a inseminação em tempo fixo .............. 31
Tabela 5 - Estágio de desenvolvimento e descrição de qualidade de
embriões bovinos .................................................................................... 35
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BE Benzoato de Estradiol
°C Graus Celsius
CL Corpo Lúteo
cm Centímetros
E2 Estrógeno
ECC Escore de Condição Corporal
FD Folículo Dominante
FSH Hormônio Folículo Estimulante
g Gramas
GnRH Hormônio Liberador de Gonadotrofinas
h Hora
ICM Massa Celular Interna
IETS International Embryo Transfer Society
IM Intramuscular
L Litros
LH Hormônio Luteinizante
ml Miligramas
ng Nanogramas
P4 Progesterona
PGF2α Prostaglandina dois alfa
PIVE Produção In Vitro de Embriões
SNC Sistema Nervoso Central
SOV Superovulação
TE Transferência de Embriões
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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................... 15
2. OBJETIVOS ........................................................................................ 17
2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................ 17
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................. 17
3. FISIOLOGIA REPRODUTIVA EM FÊMEAS ....................................... 18
3.1 Estrutura ovariana ............................................................................. 18
3.2 Endocrinologia reprodutiva ................................................................ 20
3.3 Dinâmica folicular .............................................................................. 22
4. TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES .................................................... 26
4.1 Seleção de doadoras ......................................................................... 26
4.2 Protocolos de superovulação de doadoras ........................................ 27
4.3 Coleta de embriões ............................................................................ 31
4.4 Avaliação morfológica de embriões ................................................... 34
4.5 Envase e criopreservação .................................................................. 38
4.6 Seleção e preparo de receptoras ....................................................... 40
5. CONCLUSÃO ..................................................................................... 45
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1. INTRODUÇÃO

A transferência de embriões (TE) é uma biotecnologia mundialmente difundida,

a qual possui o objetivo principal de produzir um número elevado de descendentes
geneticamente superiores por fêmea, diferentemente dos resultados obtidos
fisiologicamente durante uma vida reprodutiva (PASA, 2008). Além disso, a técnica
também permite a evolução no sistema de produção em um curto período de tempo,
geração em escalas industriais, otimização de recursos e aumento de lucros diante
de uma cadeia produtiva (BARUSSELI et al., 2008).

Estudos desenvolvidos sobre o tema mostram que a TE implica na estimulação

da produção de oócitos a partir da aplicação de hormônios para a superovulação de
uma fêmea doadora (BARROS et al., 2007). Após acasalamento ou inseminação
artificial da mesma, os embriões são então coletados através de lavagem do útero
com soluções fisiológicas, prosseguindo-se a transferência das estruturas
embrionárias para fêmeas receptoras, que serão encarregadas de manter a gestação
até o momento do parto (SILVA, 2020B).

Em 1891, Walter Heape, considerado o pai da embriologia moderna,

demonstrou, pela primeira vez, o sucesso da técnica de TE a partir de coelhos.
Naquela época, foram coletados embriões de uma fêmea Angorá e transferidos para
a tuba uterina de uma receptora da raça Belgian Hare, obtendo os produtos desejados
ao final da gestação (RODRIGUES; BERTOLINI, 2019). Na espécie bovina, a primeira
TE foi realizada ainda na metade do último século por Willet. Em termos comerciais,
a TE em bovinos teve início nos Estados Unidos durante a década de 70, sendo
realizada ainda por laparotomia mediana sob anestesia geral inalatório. Nesta época,
a técnica em questão já era considerada comum e importante na área de
bovinocultura, visto que facilitaria a importação de genética para diferentes países
(GONÇALVES et al., 2014; SEIDEL; SEIDEL, 2005).

O Brasil é considerado atualmente um dos grandes responsáveis pela

implantação de tecnologias na reprodução animal no mundo. Em 1980, obteve-se os
primeiros registros de transferência de embriões produzidos in vivo, sendo que uma
década depois o país já se tornava referência mundial e se consolidava na produção
e TE na espécie bovina (SILVA, 2020B).
 16

Contudo, após um vasto e consolidado conhecimento sobre a colheita de

embriões pelo método in vivo, o país passou também a dominar e empregar, em larga
escala, a produção in vitro de embriões bovinos (PIVE). Assim, após 2005, houve
rápida expansão da PIVE, técnica que passou a substituir a múltipla ovulação e TE,
tornando-se o método de eleição para a produção de embriões. Ou seja, a obtenção
in vitro possibilitou a otimização da produção de embriões por doadora, redução de
custos e criação de novas possibilidades de aplicação da transferência de embriões
na produção animal. Apesar da aplicabilidade da PIVE, a TE convencional ainda é
utilizada na produção animal, dependendo dos objetivos a serem atingidos e das suas
vantagens, assim, é de responsabilidade do Médico Veterinário analisar os benefícios
e malefícios de ambas as técnicas para cada situação e determinar qual delas deve
ser empregada (VIANA, 2012).
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2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Descrever, por meio de uma revisão de literatura, a técnica de transferência de

embriões em bovinos, ilustrando os seus principais aspectos.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

➢ Revisar a fisiologia reprodutiva de fêmeas bovinas;

➢ Descrever os métodos de seleção das fêmeas doadoras e receptoras de

embriões, assim como a aplicação dos seus respectivos protocolos hormonais;

➢ Analisar o método de coleta, classificação e destino dos embriões.

 18

3. FISIOLOGIA REPRODUTIVA EM FÊMEAS

3.1 Estrutura ovariana

Os ovários são órgãos pares de natureza endócrina do sistema reprodutor

feminino, com localização e tamanho variado nas diferentes espécies, sendo que em
fêmeas bovinas possuem, em média, entre 3,0 e 4,5 cm de comprimento e 1,5 a 2,0
cm de largura, com coloração rósea clara. Estes órgãos são constituídos por folículos,
estruturas altamente organizadas e responsáveis por proporcionar um ambiente ideal
para o crescimento e maturação oocitária, assim como permitir a produção de
hormônios importantes para a reprodução (SANTOS et al., 2012). A Figura 1 ilustra
uma representação esquemática da anatomia ovariana, contendo estruturas típicas
do ovário em uma fêmea cíclica.

Figura 1 - Estrutura ovariana de uma fêmea cíclica.

Fonte: Konig e Liebich (2004).

A população folicular ovariana é bastante heterogênea, dessa forma, os

folículos podem ser classificados de acordo com os seus aspectos morfológicos, em
folículos pré-antrais ou não cavitários, que abrangem os folículos primordiais,
 19

primários e secundários; e em folículos antrais ou cavitários, compreendendo os

folículos terciários, de Graaf ou pré-ovulatórios (MARTINS et al., 2008). Segundo
Mello et al. (2013), os folículos pré-antrais não são totalmente dependentes de FSH e
LH para o seu desenvolvimento, uma vez que o seu crescimento é estimulado por
fatores intra ovarianos e locais. Em contrapartida, os folículos antrais, são totalmente
dependentes das gonadotrofinas para o seu desenvolvimento e maturação.

Os folículos primordiais se encontram em estádio de repouso e são compostos

por um oócito imaturo, circundado por uma única camada achatada de células
somáticas (pré-granulosa). Os folículos primários, por sua vez, são constituídos por
um oócito em crescimento envolvido por uma camada de células da granulosa de
formato cubóide, porém, não possuem células tecais diferenciadas e podem
apresentar uma zona pelúcida em formação. Os folículos secundários são
caracterizados por um oócito inteiramente circundado por uma zona pelúcida e
apresentam pelo menos duas camadas de células da granulosa com formato cubóide.
Já os folículos terciários são constituídos por um oócito envolto pela corona radiata e
células do cumulus, que conectam o oócito às células da granulosa, mas também
possuem as células tecais e uma cavidade contendo líquido folicular. Por fim, os
folículos de Graaf ou pré-ovulatórios apresentam todos os componentes presentes
nos folículos terciários, contudo, o oócito já estará no estágio final de desenvolvimento
(SANTOS et al., 2012).

Sabe-se que o desenvolvimento folicular bovino tem início ainda na vida fetal a
partir de células germinativas primordiais. Estas células são provenientes do
endoderma do saco embrionário vitelino e são responsáveis pela formação e
manutenção do ovário. A partir de sucessivas mitoses e síntese de DNA, estas células
atingem a fase de oócitos primários, onde adquirem uma camada única de células da
pré-granulosa, formando os folículos primordiais (SANTOS, 2017).

Ao nascimento, os ovários contêm grande quantidade destes folículos

primordiais, que apresentam no seu interior oócitos com o núcleo no estádio de
prófase I da meiose, permanecendo em repouso até que ocorra um pico de LH,
momento em que o folículo já se encontra numa fase pré-ovulatória. Na puberdade, o
eixo-hipotálamo-hipofisário influencia o crescimento folicular a partir da ação de
gonadotrofinas, assim, há proliferação contínua e diferenciação celular, até a
formação de folículos antrais maduros, que já possuem diâmetro necessário para a
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ocorrência de ovulação (SANTOS, 2017; FILHO et al., 2013). Os folículos maduros

são responsáveis por secretar estradiol, hormônio que provoca o pico pré-ovulatório
de LH, resultando na ovulação e no desenvolvimento do corpo lúteo (GONZÁLEZ,
2002).

3.2 Endocrinologia reprodutiva

A fisiologia do ciclo estral é complexa e dependente da interação entre o

sistema nervoso central, sistema endócrino e órgãos genitais (Figura 2). O sistema
nervoso central (SNC) recebe informações externas do ambiente através de estímulos
visuais, olfativos, auditivos e táteis, assim, a partir do estímulo do SNC, os neurônios
endócrinos induzem a secreção pulsátil de GnRH pelo hipotálamo, hormônio que irá
atuar em receptores da hipófise anterior, glândula também encontrada na porção
ventral do cérebro (SANTOS et al., 2012).

Figura 2 - Inter-relações no controle da função reprodutiva de uma fêmea.

Fonte: Intervet Internacional (2007).

Ao ocorrer esta interação, dá-se início a síntese e liberação, também pulsátil,

dos hormônios de natureza glicoproteica, denominados FSH e LH, pela hipófise. Em
 21

seguida, estas gonadotrofinas são liberadas na corrente sanguínea, chegando até os

órgãos-alvo, neste caso, os ovários. O FSH é responsável pelo crescimento e a
maturação dos folículos ovarianos, enquanto o LH tem como função induzir a
ovulação, além de estimular, junto com o FSH, a secreção de hormônios esteroides
(OLIVEIRA A. F. M. et al., 2014).

As células da granulosa, estimuladas pelo FSH, produzem o estradiol,

hormônio responsável pelos sinais e manifestação de estro, com mudanças típicas do
trato genital da fêmea. É importante salientar que, níveis elevados de estrógeno,
inibem a liberação de FSH e estimulam a secreção de LH, realizando um feedback
negativo e positivo, respectivamente (GONZÁLEZ, 2002).

Após a ovulação, há a formação do corpo lúteo (CL), glândula endócrina

temporária presente durante a fase de diestro em fêmeas cíclicas ou durante a
gestação. O CL possui função de secretar progesterona, hormônio responsável pela
preparação do útero para a manutenção da gestação. Assim, a progesterona não só
suprime a resposta imunitária do útero, o que é necessário para tolerar o embrião,
mas também evita as contrações uterinas, fecha o colo do útero e modifica as
características do muco cervical, tornando-o mais viscoso e impedindo a passagem
de agentes estranhos para o seu interior. Ainda, na glândula mamária, este hormônio
estimula o desenvolvimento do sistema alveolar, preparando-o para a síntese e a
secreção de leite (SILVA, 2020A).

Contudo, caso não haja embrião viável no útero da fêmea, ocorre a luteólise no
dia 16 do ciclo reprodutivo da vaca, a partir da ação do hormônio PGF2α, produzido
pelo útero (GONZÁLEZ, 2002). Sabe-se que, após um período de 12 a 14 dias de
exposição à progesterona, as células endometriais e o eixo hipotálamo-hipofisário
tornam-se insensíveis a este hormônio. Em consequência, o estradiol, produzido pelo
folículo dominante, estimula a produção de receptores para ocitocina no endométrio
uterino, mas também induz a liberação do mesmo hormônio pela neurohipófise. Em
decorrência da ação da ocitocina sobre seus receptores endometriais, ocorre a
síntese e secreção de PGF2α, responsável pela luteólise (SILVA, 2020A). A Tabela 1
demonstra os principais hormônios que agem no trato reprodutivo feminino, assim
como suas estruturas de origem e suas respectivas funções.
 22

Tabela 1 - Principais funções dos hormônios envolvidos na reprodução de

fêmeas.
Hormônio Fonte Função
GnRH Hipotálamo Promove a liberação do FSH e LH
FSH Hipófise anterior Estimula o desenvolvimento folicular e a secreção de
estrógenos
LH Hipófise anterior Estimula a ovulação, formação e manutenção do corpo
lúteo
Estradiol Folículo (ovário) Estimula a manifestação do cio e a liberação do LH
Progesterona Corpo lúteo (ovário) Manutenção da gestação
Fonte: Hafez e Hafez (2004).

3.3 Dinâmica folicular

As fêmeas bovinas são consideradas poliéstricas anuais, ou seja, apresentam

vários estros ao longo do ano, com duração de 21 dias, em média. O ciclo estral é
dividido em duas fases: a estrogênica ou folicular, que se estende do proestro ao estro,
resultando na ovulação; e a progesterônica ou luteínica, que envolve o metaestro e o
diestro, encerrando na luteólise (VALLE, 1991).

Sabe-se que o estágio de estro da espécie bovina possui duração de oito a

dezoito horas, momento em que a fêmea aceita a cópula ou a monta de outra vaca.
Isto ocorre devido ao aumento significativo das concentrações de estradiol produzido
pelo folículo pré-ovulatório, mas também por causa da ausência de corpo lúteo. O
metaestro é a etapa posterior ao estro, possuindo duração de quatro a cinco dias.
Durante esta etapa ocorre a ovulação, seguida do desenvolvimento do corpo de lúteo.
Após a ovulação, observa-se uma depressão no lugar ocupado pelo folículo ovulatório
(depressão ovulatória) e, posteriormente, desenvolve-se o corpo hemorrágico (corpo
lúteo em processo de formação). Durante o metaestro, as concentrações de
progesterona começam a aumentar até atingirem níveis superiores a 1 ng/ml, assim,
considera-se que o corpo lúteo atingiu a maturidade. No momento em que as
concentrações de progesterona são superiores a 1 ng/ml, inicia-se o final do metaestro
e o início do diestro (SILVA, 2020A).

O diestro é o estágio de maior duração do ciclo estral de uma fêmea, ocorrendo

entre doze e quatorze dias. Durante este estágio, o corpo lúteo mantém sua plena
funcionalidade, o que se reflete em concentrações sanguíneas de progesterona
maiores do que 1 ng/ml. Além disso, nesta fase, pode-se encontrar folículos de
 23

tamanhos diferentes devido às ondas foliculares. Após 12 a 14 dias de exposição à

progesterona, o endométrio começa, gradualmente, secretar PGF2α em um padrão
pulsátil, ocorrendo a luteólise. Ou seja, o corpo lúteo perde a sua funcionalidade e, em
consequência, as concentrações de progesterona diminuem abaixo de 1 ng/ml,
finalizando o diestro e começando o proestro (SILVA, 2020A).

O proestro, por sua vez, caracteriza-se pela ausência de um corpo lúteo

funcional e pelo desenvolvimento e maturação do folículo ovulatório. Este estágio do
ciclo estral da vaca apresenta duração de dois a três dias, sendo caracterizado pelo
declínio nos níveis de progesterona, pelo desenvolvimento folicular e pelo aumento
dos níveis de estradiol no sangue. Nessa fase, a liberação do GnRH pelo hipotálamo
estimula a secreção de FSH e LH pela glândula pituitária. Os elevados níveis de FSH
sanguíneo induzem o desenvolvimento dos folículos e, em sinergismo com o LH,
estimulam a sua maturação. À medida que os folículos se desenvolvem, aumenta a
produção de estradiol, após uma determinada concentração, este hormônio estimula
a manifestação do cio e a liberação massiva do LH, dando início ao estro (VALLE,
1991). As etapas do ciclo estral de fêmeas bovinas estão ilustradas no esquema
abaixo (Figura 3).

Figura 3 - Esquema da sequência das fases do ciclo estral de fêmeas

bovinas.

Fonte: Furtado et al. (2011).

O desenvolvimento folicular dos bovinos ocorre em um padrão de ondas, sendo

que cada onda de crescimento é caracterizada pelas etapas de recrutamento, seleção
 24

e dominância, ovulação ou atresia (Figura 4). Durante o ciclo estral de fêmeas bovinas,
são apresentadas de duas a três ondas foliculares, sendo que a ovulação irá ocorrer
apenas na última. Em vacas com três ondas foliculares, a fase lútea é mais longa e,
consequentemente, o ciclo estral também é mais comprido, de 22 a 23 dias. No
entanto, as vacas com duas ondas apresentam um ciclo estral de 18 a 21 dias, sendo
que o período de dominância folicular é maior nestes animais, o que influencia no
potencial dos ovócitos para desenvolver um embrião viável. Ou seja, a porcentagem
de concepção é menor quando ovulam folículos que tiveram mais dias de dominância
(SILVA, 2020A).

Figura 4 - Fases do crescimento folicular.

Fonte: Tecnopec (2002).

Basicamente, uma onda de crescimento folicular consiste no recrutamento de

um grupo de pequenos folículos primordiais que passam por um crescimento comum
durante cerca de três dias. Destes folículos recrutados, apenas um é selecionado,
continuando seu desenvolvimento, enquanto os outros sofrem atresia, estabelecendo-
se, então, o fenômeno da divergência folicular (SILVA et al., 2011).

A primeira fase da onda de crescimento folicular corresponde ao recrutamento,

onde há o início do crescimento de vários folículos, desencadeado pelo hormônio
folículo estimulante (FSH). A segunda fase corresponde à seleção e dominância, onde
um folículo cresce mais do que os outros, tornando-se dominante (OLIVEIRA A. F. M.
et al., 2014). De acordo com Alves et al. (2002), o folículo dominante consegue manter
 25

seu crescimento em função do aumento do número de receptores para gonadotrofinas

e aumento do seu aporte sanguíneo. Os hormônios estradiol e inibina, produzidos
pelas células da granulosa do folículo dominante, reduzem a liberação de FSH a
concentrações muito baixas, insuficientes para manter o desenvolvimento dos
folículos subordinados, porém, suficientes para manter o crescimento do folículo
dominante, causando então a regressão dos demais. Dessa forma, o folículo
dominante (FD) é capaz de inibir o crescimento e induzir a atresia dos outros folículos
em desenvolvimento, mas também de bloquear o surgimento de uma nova onda de
crescimento folicular. O FD perdura de quatro a seis dias e, caso não ovule, também
sofre atresia. Após esta regressão do FD, diminuem-se os níveis de estrogênio e
inibina, observando-se um aumento das concentrações de FSH, com início de uma
nova onda de crescimento folicular (SILVA, 2020A).

A terceira fase da onda de crescimento folicular é a ovulação, que é

desencadeada pelo pico de LH liberado pela hipófise. Sabe-se que a ovulação do FD
somente ocorre quando há alta concentração de estrógeno e níveis baixos de
progesterona. Ou seja, caso um corpo lúteo funcional esteja presente, não haverá
liberação de pico de LH e ovulação. Assim, os folículos da onda que não ovularam,
entrarão em um processo de degeneração (OLIVEIRA A. F. M. et al., 2014).

Portanto, durante a fase luteínica do ciclo estral, a frequência de pulsos de LH

é insuficiente para estimular a diferenciação final e ovulação do FD. Ao entrar em
atresia, o FD perde a dominância e ocorre recrutamento de uma nova onda de
crescimento folicular. Na fase folicular do ciclo, com a ausência de P4, há o aumento
na frequência de pulsos de LH, que estimula a liberação de quantidades crescentes
de E2 pelo FD. Este, por sua vez, induz mudanças de comportamento associadas ao
estro, mas também leva a liberação de um pico pré-ovulatório de GnRH e LH, o que
causa a ovulação do FD (BINELLI et al., 2001).
 26

4. TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES

A transferência de embriões é uma biotecnologia da reprodução que consiste

em obter embriões de uma fêmea doadora e transferi-los para fêmeas receptoras,
com a finalidade de completar o período de gestação. O principal objetivo da técnica
é permitir que uma fêmea produza um número de descendentes muito superior ao que
seria possível fisiologicamente, durante sua vida reprodutiva (SANTOS et al., 2012).

A transferência de embriões apresenta um papel importante no melhoramento

zootécnico, já que acelera e confere maior precisão no processo de seleção animal.
A partir da TE é possível aumentar o número de descendentes de animais
geneticamente superiores, reduzir o intervalo entre gerações e aumentar a velocidade
de melhoramento genético do rebanho (ANDRADE et al., 2002). Além disso, a técnica
permite que animais geneticamente superiores e com distúrbios reprodutivos
adquiridos se reproduzam, impedindo o descarte precoce dos mesmos (HONORATO
et al., 2013).

Apesar das suas vantagens, a TE, assim como qualquer outra técnica,
apresenta algumas limitações. Estas podem estar associadas às fêmeas doadoras de
embriões, havendo discrepância nas respostas aos tratamentos hormonais, mas
também relacionadas às receptoras. A seleção e o manejo adequado das receptoras
de embriões são indispensáveis para o sucesso da TE, uma vez que a mortalidade
após a transferência é ainda significativa e limita muito a eficiência desse método
(HONORATO et al., 2013).

4.1 Seleção de doadoras

Desde o início da implantação da técnica de TE, a base para a seleção de

fêmeas doadoras de embrião é a escolha de animais geneticamente ou
fenotipicamente superiores. Contudo, a seleção de doadoras também pode ser
realizada a partir do mercado, classificação da indústria ou simplesmente pelo desejo
do proprietário em produzir mais descendentes de um determinado animal. Além
disso, características como lactação, paridade, dias abertos, fatores endócrinos e
 27

ambientais também devem ser levados em consideração para a seleção do animal

doador de embriões (HOPPER, 2015).

Considerando que o objetivo da técnica de TE nas doadoras de embriões é

efetuar a superovulação delas, é necessário que o seu sistema reprodutivo esteja
saudável, apresentando ciclos estrais regulares. Dessa forma, durante o exame
reprodutivo, é importante descartar animais que apresentam defeitos anatômicos e
distúrbios reprodutivos (origem genética ou adquirida), uma vez que tais condições
impedem a coleta, o desenvolvimento e transporte adequado dos gametas e
embriões, inviabilizando o procedimento de TE (OLIVEIRA C. S. et al., 2014).

Santos (2012) também descreve que é importante realizar o exame

ginecológico das possíveis doadoras, a fim de descartar presença de gestação, mas
também avaliar a ausência de infecções e o histórico de problemas reprodutivos.
Outro critério reprodutivo que deve ser considerado é que a escolha de doadoras para
um programa de TE não deve ser feita antes de 60 dias pós-parto, sendo necessário,
ainda, observar-se dois ciclos estrais consecutivos e regulares (WILLIAMS, 2001).

Além disso, outro aspecto importante para a seleção é analisar o bem-estar das
doadoras, já que, sob situações de estresse, não respondem de maneira eficiente ao
tratamento superovulatório (WILLIAMS, 2001). Também é necessário avaliar o estado
corporal dos animais, onde as doadoras devem estar sadias e com bom escore
corporal (ECC 3, considerando uma escala de 1-5) (SANTOS, 2012).

4.2 Protocolos de superovulação de doadoras

Sabe-se que os protocolos superestimulatórios utilizados na TE apresentam o

objetivo de conseguir um número máximo de oócitos competentes e embriões
transferíveis, obtendo-se, consequentemente, uma alta probabilidade de gestação
das fêmeas receptoras (SANTOS, 2017). Nesta técnica, as doadoras podem ser
superovuladas em um intervalo de 60 dias entre duas coletadas, sendo que o
procedimento pode ser realizado durante um período de 1 a 2 anos, possuindo
resultados satisfatórios (ALVAREZ et al., 2007).
 28

A fêmea bovina é uma espécie monovulatória, portanto, apenas um oócito deve

ser liberado de um folículo durante seu ciclo estral. O princípio da técnica de
superovulação envolve o conceito de induzir a ovulação de vários folículos e
consequente liberação de vários oócitos, permitindo a fertilização e o desenvolvimento
destas estruturas até o estádio de blastocisto (OLIVEIRA C. S. et al., 2014).

Para tanto, a onda folicular pode ser estimulada com FSH, sendo que altas
doses deste hormônio são administradas aos animais antes que se estabeleça a
dominância folicular. Dessa maneira, os efeitos inibitórios do folículo dominante sobre
o crescimento dos demais folículos são bloqueados. Ou seja, o hormônio folículo
estimulante em altas concentrações promove o crescimento simultâneo de vários
folículos com características fisiológicas semelhantes daqueles selecionados para
ovularem. A divergência folicular é impedida, e os folículos terciários, que seriam
fadados a atresia, tornam-se folículos ovulatórios (OLIVEIRA C. S. et al., 2014).

Segundo Santos (2017), na década de 70, utilizava-se a gonadotrofina

coriônica equina (eCG) com a finalidade de superovulação, sozinha ou em
combinação com anti-soro da molécula de eCG. Posteriormente, surgiu o FSH
extraído da pituitária de suínos, equinos e ovinos, além do FSH recombinante bovino.
Tanto o FSH quanto o eCG podem ser utilizados para se obter uma superovulação.
No entanto, o FSH, por ter uma meia vida mais curta do que o eCG, precisa ter a sua
a dose total dividida e em intervalos de 12 horas ao longo de 3 a 4 dias, para estimular
a mesma quantidade de crescimento folicular que resultaria de uma injeção de eCG
(HAFEZ; HAFEZ, 2004).

A dosagem de FSH varia conforme o produto (laboratório), a categoria, estado

fisiológico, escore corporal, a raça e a individualidade da doadora, sendo que para
raças zebuínas utiliza-se uma dose menor e para as raças europeias uma dose maior.
As vantagens da utilização do FSH em SOV são meia vida curta (12h); baixo risco de
reações anafiláticas; melhores resultados em estruturas viáveis por coleta; e facilidade
de aquisição. No entanto, as desvantagens são a necessidade de aplicação a cada
12 horas durante o protocolo, além do elevado custo (PASA, 2008).

Existem diferentes protocolos de SOV em fêmeas doadoras de embrião,

podendo ser utilizados em cio natural ou em qualquer fase do ciclo estral. Em qualquer
protocolo de superovulação, realizam-se oito aplicações decrescentes de FSH via IM
 29

com intervalos de 12 horas. A aplicação de doses decrescentes tem por objetivo

mimetizar a queda fisiológica do FSH durante a fase folicular, melhorando a resposta
superovulatória. No terceiro dia de SOV, faz-se duas aplicações de PGF2α
promovendo a luteólise, a fim de reduzir as concentrações de P4 e permitir a
ocorrência pico de LH e ovulação (PENITENTE FILHO et al., 2014). Contudo, no
protocolo tradicional de superovulação, o tratamento com gonadotrofinas é iniciado na
metade do ciclo estral (8-12 dias após ovulação), sendo necessário também detecção
do estro antes de iniciar o tratamento hormonal (BARUSSELI et al., 2008). A Tabela
2 ilustra este protocolo de SOV baseado em cio natural.

Tabela 2 - Protocolo de SOV baseado no cio natural, com associação de FSH e

PGF2α.
DIA 0 10 11 12 13 14 15
MANHÃ CIO FSH FSH FSH e FSH CIO IA
PGF2α
TARDE FSH FSH FSH e FSH IA
PGF2α
Fonte: Penitente Filho et al. (2014).

Sabe-se que a ausência do folículo dominante e a realização da superovulação

no início da onda de crescimento folicular aumentam a eficiência dos programas de
SOV. Dessa forma, protocolos hormonais são uma alternativa para o controle da
emergência da onda de crescimento folicular em momentos aleatórios do ciclo estral,
sem a necessidade de detecção do estro. Um exemplo de protocolo é a associação
de estradiol (E2) e progesterona (P4), onde há indução da emergência da nova onda
de crescimento folicular (BARUSSELI et al., 2008).

A associação de P4 e E2 na SOV permitiu um grande avanço para a

biotecnologia da reprodução animal (Tabela 3), já que possibilita que o processo seja
iniciado em fases aleatórias do ciclo estral dos bovinos pelo fato de sincronizar o início
da onda folicular, além de descartar a necessidade de observação de estro. Contudo,
ainda requer a detecção do estro para a inseminação artificial das doadoras. O E2,
quando combinado com aplicação intramuscular de P4 e implante intravaginal de P4,
possui a função de suprimir o desenvolvimento folicular, permitindo o início de uma
nova onda de crescimento folicular (PENITENTE FILHO et al., 2014).
 30

Tabela 3 - Protocolo de SOV com associação de FSH, E2, P4, CIDR e PGF2α.
DIA 0 4 5 6 7 8 9
MANHÃ P4 + E2 FSH FSH FSH FSH – CIO IA
+ CIDR CIDR
TARDE FSH FSH FSH e FSH IA
PGF2α
Fonte: Penitente Filho et al. (2014).

Bó et al. (2004) descrevem o protocolo para superovulação de doadoras com

Benzoato de Estradiol (BE) e dispositivo contendo Progesterona, além de aplicação
de P4 IM no dia 0. O tratamento superovulatório com gonadotrofina tem início no dia
4, sendo realizadas duas aplicações diárias de FSH durante 4 dias. Na manhã e na
tarde do dia 6 são feitas duas aplicações de PGF2α e remoção do dispositivo contendo
progesterona. Posteriormente, os animais são inseminados artificialmente 12 e 24 h
após a detecção do cio ou 48 e 60 h após a remoção do dispositivo contendo
progesterona. Por fim, os embriões são colhidos no dia 15. Este esquema de SOV é
ilustrado na Figura 5.

Figura 5 - Protocolo de SOV de doadoras com Benzoato de Estradiol (BE) e

dispositivo intravaginal de Progesterona.

Fonte: Bó et al. (2004)

Contudo, nem sempre a ovulação está sincronizada nos tratamentos de SOV,

assim, há dificuldade no acerto das inseminações realizadas, ocasionando a
recuperação de inúmeras estruturas não fecundadas. Folículos que não ovulam, após
superestimulação com FSH, não se desenvolvem normalmente ou não possuem
quantidade suficiente de receptores de LH, para responderem ao pico pré-ovulatório
deste hormônio. Portanto, estratégias que atrasam o pico pré-ovulatório de LH têm
 31

sido utilizadas na tentativa de aumentar o número de embriões ou, ainda, para

viabilizar a inseminação artificial em tempo fixo (IATF) após a superovulação
(BARROS et al., 2007). Dessa forma, o GnRH ou LH vêm sendo utilizados para
controle da ovulação no final destes protocolos (PENITENTE FILHO et al., 2014),
conforme é demonstrado na Tabela 4, logo abaixo.

Tabela 4 - Protocolo de SOV baseado no cio natural, com associação de FSH,

PGF2α e GnRH/LH para a inseminação em tempo fixo.
DIA 0 10 11 12 13 14 15
MANHÃ CIO FSH FSH FSH e FSH GnRH / IA
PGF2α LH
TARDE FSH FSH FSH e FSH IA
PGF2α
Fonte: Penitente Filho et al. (2014).

4.3 Coleta de embriões

A coleta de embriões deve ser realizada, preferencialmente, entre o sexto e o

oitavo dia após a primeira inseminação das doadoras, já que, neste período, as
estruturas encontram-se flutuando em um filme líquido no lúmen da ponta dos cornos
uterinos (HONORATO et al., 2013). Além do mais, trata-se de um período mais
indicado para a obtenção de embriões nos estádios de mórula ou blastocistos
destinados à transferência imediata, bipartição ou criopreservação (GONÇALVES et
al., 2014).

Segundo Pasa (2008), há dois métodos para a colheita de embriões: o método

aberto e o fechado. No método aberto de colheita, utiliza-se uma seringa de plástico
acoplada diretamente ao cateter posicionado no corno uterino, onde deve ser
realizada a lavagem uterina com frações de 40 a 50 ml de meio de coleta. Quando
obtidas, essas frações são depositadas em um recipiente siliconizado, geralmente um
cilindro de vidro graduado com capacidade para 500 ml. Considerando o grande
número de lavagens por corno uterino com o objetivo de uma maior taxa de
recuperação de embriões, este método de colheita se torna inviável em questão de
tempo e exposição dos embriões às condições de ambiente, o que pode repercutir
negativamente na viabilidade dos mesmos. Através do método fechado (Figura 6),
 32

buscou-se tornar a colheita por via transcervical uma técnica prática, asséptica e
segura para a doadora, com a menor possibilidade de contaminação ou de perda dos
embriões. Além disso, o circuito fechado propicia uma maior pressão no interior do
corno uterino, o que favorece a recuperação do meio de lavagem infundido para o
interior do útero. Neste método de coleta, a sonda utilizada pode ser fixada no corpo
do útero, lavando os dois cornos uterinos de uma só vez, ou na base de cada corno
uterino, onde a lavagem é realizada em um corno por vez (OLIVEIRA C. S. et al.,
2014).

Figura 6 - Esquema adotado para coleta de embriões em sistema fechado.

Legenda: O equipo em Y liga-se à sonda de Foley na extremidade A, ao frasco de PBS, na extremidade

B, e ao filtro coletor, na extremidade C. Através de válvulas, o veterinário controla a direção do fluxo:
primeiramente de B para A, posteriormente de A para C.
Fonte: Oliveira C. S. et al. (2014).

Inicialmente, faz-se palpação transretal com auxílio do aparelho de

ultrassonografia para detectar a presença ou não de corpos lúteos no ovário. Em caso
de resposta positiva, a fim de facilitar a introdução do cateter dentro do útero, pode-
se sedar o animal com Acepromazina 1% e realizar a anestesia epidural caudal baixa
com 5 a 7 ml de a Lidocaína a 2% (GONÇALVES et al., 2014).

Em seguida, com o auxílio de um cateter de borracha ou de plástico flexível

contendo um balão inflável na sua extremidade distal, inicia-se o método de coleta
(HONORATO et al., 2013). De acordo com Demétrio (2003), inicialmente, é
 33

introduzido no interior deste cateter um mandril de metal, para torná-lo rígido. Em

seguida, com auxílio de palpação retal, ambos são colocados e posicionados em um
dos cornos uterinos. Posteriormente, o balão presente na extremidade do cateter, já
dentro de um dos cornos uterinos, é inflado com 10 a 20 ml de ar, logo após o mandril
é retirado do interior do cateter.

Após a retirada do mandril, uma sonda um Y é acoplado à sonda de

Foley/cateter, compondo o sistema fechado de coleta de embriões. Em suas outras
extremidades, são fixados o frasco de meio de coleta, e o copo coletor de embriões.
O sistema contém uma trava em cada extremidade, para controle da entrada e saída
do líquido instilado, formando uma pressão negativa que facilita a retirada do conteúdo
(OLIVEIRA C. S. et al., 2014).

O copo coletor apresenta um filtro que permite a retenção apenas dos

embriões, desprezando o restante do conteúdo recuperado. Instila-se o conteúdo até
encher os cornos, fecha-se a trava da saída do DPBS, e a saída para o copo coletor
é aberta, recolhendo o líquido instilado. A operação é repetida várias vezes, até lavar
o útero com cerca de 1 L de meio. Quando o balão é desinflado, é retirada a sonda do
animal (OLIVEIRA C. S. et al., 2014). Os equipamentos utilizados para a coleta de
embriões pelo sistema fechado estão ilustrados na Figura 7.

Figura 7 - Esquema de configuração do sistema fechado de coleta de embriões.

Fonte: Hopper (2015).

 34

A solução que hoje é utilizada como meio de colheita de embriões é DPBS

(Dulbecco Phosphate Buffered Saline), uma solução salina tamponada, com
osmolaridade e pH fisiológico, que tem o objetivo de manter as características do
embrião (PHILLIPS; JAHNKE, 2016). O DPBS, previamente aquecido entre 25 e 30°C
(PENITENTE FILHO et al., 2014), é suplementado com 250.000 UI de Penicilina e
0,10 g Estreptomicina, além de 10% de soro fetal bovino, o qual é previamente
inativado 56°C durante 30 minutos (GONÇALVES et al., 2014).

Por fim, de acordo com Hopper (2015), após realizar a lavagem uterina na
fêmea doadora de embriões, deve-se aplicar Prostaglandina, a fim causar a luteólise
e impedir o desenvolvimento de uma possível gestação, caso tenha restado algum
embrião remanescente no interior do trato reprodutivo dela.

4.4 Avaliação morfológica de embriões

Logo após a coleta, os embriões são transportados do filtro do copo coletor

para placas de Petri com diâmetro de 12cm. Inicialmente, a fim de retirar sujidades,
este filtro é lavado com DPBS com auxílio de uma seringa agulhada. Posteriormente,
através de um estereomicroscópio se faz a primeira busca por embriões, realizando-
se movimentos circulares suaves. A partir disto, qualquer estrutura encontrada é
retirada com a ajuda de uma seringa e ponteira estéril para uma placa menor
(60x35cm), contendo gotas do meio de manutenção. Os embriões devem ser lavados
em todas as gotas do meio para diminuir a possibilidade de contaminação, de acordo
com as recomendações da International Embryo Transfer Society – IETS (2010). Em
seguida, inicia-se a classificação embrionária (DEMÉTRIO, 2003; OLIVEIRA C. S. et
al., 2014).

Sabe-se que há diversos procedimentos para estimar a viabilidade dos

embriões coletados. Atualmente, utiliza-se principalmente a avaliação morfológica.
Neste método, a partir de microscopia óptica, é observada a qualidade dos embriões,
sendo que existe uma boa correlação entre a qualidade morfológica dos embriões e a
posterior taxa de prenhez (ALVAREZ et al., 2007). Segundo Phillips e Jahnke (2016),
a avaliação morfológica dos embriões é importante para diferenciar oócitos não
 35

fertilizados de embriões, determinar a qualidade do embrião, identificar anormalidades

e determinar se o estágio de desenvolvimento é consistente com a idade do embrião.

Durante a avaliação morfológica de um embrião, consideram-se os seguintes

critérios: forma esferóide; simetria dos blastômeros; aparência clara e nítida dos
blastômeros; tonalidade escura e uniforme; uniformidade da membrana celular;
proporcionalidade entre o embrião e o espaço perivitelíneo; integridade da zona
pelúcia; ausência de vacúolo no embrião e fragmentos celulares no espaço
perivitelíneo; ausência de fragmentos celulares aderidos à zona pelúcida; e
compactação dos blastômeros entre si (GOODHAND et al., 1999).

Os embriões recuperados nos dias 6 a 8 após o início do estro devem ser

classificados em grupos com base em seu estágio de desenvolvimento e grau de
qualidade usando o sistema de classificação IETS, conforme ilustrado na Tabela 5.

Tabela 5 - Estágio de desenvolvimento e descrição de qualidade de embriões

bovinos.
Código Estágio de desenvolvimento Código Qualidade dos embriões
1 Não fertilizado 1 Excelente ou Bom
2 02-12 células 2 Regular
3 Mórula inicial 3 Pobre
4 Mórula 4 Morto ou degenerado
5 Blastocisto inicial
6 Blastocisto
7 Blastocisto expandido
8 Blastocisto eclodido
9 Blastocisto eclodido
expandido
Fonte: International Embryo Transfer Society (2010).

De acordo com Phillips e Jahnke (2016), são utilizados os seguintes estágios

de desenvolvimento para a classificação de embriões (Figura 8):
 36

Figura 8 - Ilustração do desenvolvimento embrionário normal de bovinos.

Fonte: (PHILLIPS; JAHNKE, 2016).

• Uma célula ou não fertilizado (Estágio 1): um oócito coletado por volta do dia
7 é chamado de óvulo não fertilizado. O seu citoplasma parece granular,
contendo uma quantidade razoável de espaço perivitelino. O óvulo não
fertilizado pode estar degenerando no dia 7 e mostrar uma aparência mais
fragmentada.

• Duas células a doze células (Estágio 2): embriões que são recuperados por
volta do dia 7, contendo 2 a 12 células, são considerados atrasados em seu
estágio de desenvolvimento e devem ser considerados mortos ou
degenerados.

• Mórula inicial (Estágio 3): os embriões neste estágio são divididos em 16 ou

mais células e blastômeros individuais. São difíceis de distinguir entre si.

• Mórula (Estágio 4): os blastômeros individuais formam uma massa celular

compacta, contudo, as células ainda não se diferenciaram.

• Blastocisto inicial (Estágio 5): uma cavidade cheia de líquido chamada

blastocele começa a se formar dentro da massa celular. A cavidade de
 37

blastocele permite que os blastômeros se diferenciem nas células trofoblásticas

externas e massa celular interna (ICM).

• Blastocisto (Estágio 6): é um estágio de desenvolvimento em que o embrião

tem uma camada de células do trofoblasto na superfície externa, cavidade da
blastocele e ICM. Nesta fase, o embrião ocupa a maior parte do espaço
perivitelino, e a zona pelúcida ainda possui a mesma espessura.

• Blastocisto expandido (Estágio 7): a característica mais marcante desta fase

é um aumento no diâmetro geral do embrião, além do adelgaçamento da zona
pelúcida.

• Blastocisto eclodido (Estágio 8): nesta fase de desenvolvimento embrionário,

o embrião está começando a eclodir através de uma fenda na zona pelúcida.

• Blastocisto expandido eclodido (Estágio 9): os embriões neste estágio são

eclodidos da zona pelúcida e reexpandidos.

Em contrapartida, Bó e Mapletoft (2013), descrevem da seguinte maneira a

classificação quanto a qualidade morfológica do embrião, sendo a mesma
demonstrada na Figura 9:

1. Excelente ou bom: embriões que possuem simetria esférica, blastômeros

uniformes, coloração homogênea, 85% do material celular deve estar intacto e
zona pelúcida não deve apresentar concavidades. Os embriões de grau 1
podem ser congelados e comercializados.

2. Regular: embriões com irregularidades moderadas de massa (50% da massa

do embrião deve estar intacta), tamanho, cor e densidade. São embriões que
podem ser transferidos, mas não devem ser congelados, com ressalvas de que
a possibilidade de gerar uma gestação será reduzida quando comparada a
embriões de grau 1.

3. Pobre: embriões que possuem maiores irregularidades na sua estrutura,

tamanho, densidade e cor. Neste caso, 25% do embrião deve estar intacto.
Estes embriões não resistem ao processo de congelamento e as taxas de
 38

prenhez são ainda menores com esta qualidade mesmo que transferidos a
fresco.

4. Morto ou degenerado: oócitos não são viáveis, que devem ser descartados.

Figura 9 - Classificação de embriões bovinos produzidos in vivo, de acordo com a

qualidade morfológica.

Fonte: Viana (2009).

4.5 Envase e criopreservação

Após a classificação do embrião, torna-se necessário o envase do mesmo em

palheta, semelhante a utilizada para sêmen. Segundo Penitente Filho et al. (2014), o
embrião deve ser posicionado no centro de uma palheta de 0,25 ml, estando inserido
em um meio de manutenção BSA ou em um meio de congelamento, quando o objetivo
é criopreservar o mesmo. A estrutura é separada por duas colunas de ar e, ainda, as
extremidades da palheta devem conter um lacre e um êmbolo, conforme a ilustração
da Figura 10. Além disso, a palheta deve conter informações mínimas sobre o pai e
mãe do embrião, além da data em que o embrião foi congelado. Informações
adicionais também podem ser incluídas tais como a empresa que realizou o
congelamento, raça de pai, números de registro e o estágio de desenvolvimento e
grau de qualidade do embrião no momento do congelamento (HOPPER, 2015).
 39

Figura 10 - Esquema de envase de embrião em palheta.

Fonte: Hopper (2015).

Uma alternativa para preservar os embriões a longo prazo é método de

criopreservação em botijões de nitrogênio líquido. A criopreservação de embriões, em
conjunto com a transferência de embriões, permite uma utilização eficiente de
receptoras, reduz a necessidade de mover o gado, permite um meio eficiente de
comercialização da genética e, ainda, facilita o movimento internacional da genética
bovina (HOPPER, 2015).

Nesta técnica, basicamente, utiliza-se o congelamento e adição de

crioprotetores aos embriões, tendo como objetivo preservar o metabolismo celular em
estado de quiescência para que este possa ser restabelecido após um período de
estocagem, continuando seu desenvolvimento normal. Isso é obtido por meio do
armazenamento em baixas temperaturas, que induz à parada da atividade enzimática,
do metabolismo e da respiração celular, possibilitando a conservação de células por
tempo indeterminado (DALCIN; LUCCI, 2010).

Sabe-se que a maioria dos embriões mamíferos é congelada pelos métodos

convencionais, utilizando-se baixas concentrações de crioprotetores, com lenta
permeabilidade e refrigeração controlada por equipamento de congelação
programável. No entanto, existe outro método, chamado de vitrificação, que dispensa
a utilização de equipamentos programáveis, proporciona rapidez e menor tempo de
exposição ao crioprotetor, além de prevenir a formação de cristais de gelo pelo uso
de elevadas concentrações do crioprotetor (DALCIN; LUCCI, 2010).

A vitrificação compreende o uso de altas concentrações de crioprotetores e

uma queda muito rápida da temperatura para -196°C, onde o efeito é congelar
estruturas na ausência de formação de cristais de gelo, preservando, assim, a
arquitetura intracelular e as membranas. Os crioprotetores mais utilizados neste
 40

processo são DMSO, Polietilenoglicol e até, mesmo, Glicerol. Há também o

congelamento lento, um segundo procedimento amplamente utilizado hoje. Neste
método, objetiva-se substituir lentamente a água intracelular por crioprotetor (Glicerol
ou Etilenoglicol), com ajuda adicional de açúcares (sacarose ou arabinogalactan),
para fornecer pressão osmótica extracelular, garantindo a formação mínima de cristais
de gelo durante o processo de congelamento (PHILLIPS; JAHNKE, 2016).

Atualmente, os principais crioprotetores utilizados são o Glicerol e o

Etilenoglicol. O Glicerol requer uma desidratação e reidratação gradual do embrião,
assim, necessita de um equipamento adicional para o processo de descongelamento.
Enquanto isso, o Etilenoglicol permite o descongelamento rápido do embrião em água
a 25°C. Este processo é chamado de transferência direta, sendo o método mais
comum usado hoje na indústria bovina de TE (PHILLIPS; JAHNKE, 2016).

Independentemente do método de criopreservação utilizado, a seleção dos

embriões que devem ser criopreservados é sempre um fator importante no sucesso
do procedimento. O estágio de desenvolvimento embrionário pode ser um fator que
influencia ou afeta a eficiência da criopreservação. Oócitos e embriões em estágio
inicial sobrevivem ao ciclo de congelamento e descongelamento da criopreservação
com menos eficiência, quando comparados aos estágios posteriores. O blastocisto,
normalmente recuperado 7 dias após a apresentação de estro da fêmea, é o estágio
utilizado para transferência não cirúrgica de embriões bovinos, sobrevivendo à
criopreservação com alto grau de sucesso (HOPPER, 2015).

4.6 Seleção e preparo de receptoras

Sabe-se que a fase de seleção das receptoras de embriões é considerada

fundamental em um programa de TE, uma vez que, além de manterem a gestação até
o final, também são responsáveis, em determinadas situações, pela alimentação do
bezerro, desde o nascimento até o seu desmame (DANTAS et al., 2018). Segundo
Seidel e Seidel (2005), fêmeas receptoras necessitam de um programa sanitário
rigoroso, nutrição equilibrada e manejo adequado. Os mesmos autores relatam que a
falta de receptoras no momento da transferência pode acarretar em custos
 41

econômicos elevados com a criopreservação ou descarte de embriões que não foram

utilizados.

De acordo com Gonçalves et al. (2014), novilhas e fêmeas primíparas e

pluríparas que apresentam ciclo estral regular, que tenham parido, no mínimo, há 60
dias, que o puerpério decorreu normalmente e que estejam livres de doenças ou
anomalias do trato reprodutivo, podem ser selecionadas como receptoras de
embriões. Contudo, normalmente a utilização de novilhas como receptoras permite
obter melhores taxas de prenhez.

Durante a avaliação da fêmea receptora, é importante que seja feito o exame

clínico geral, avaliando, principalmente, sistema locomotor, digestório e respiratório.
Posteriormente, deve-se realizar o exame específico do aparelho reprodutor,
momento em que deve ser avaliado conformação de vulva, mas também analisar
útero e ovários, através de palpação retal e ultrassonografia (YOUNGS, 2007).
Segundo Filho et al. (2013), é importante a presença de um corpo lúteo funcional no
momento da inovulação, já que há aumento na concentração plasmática de P4,
permitindo um ambiente propício para a manutenção da gestação. Contudo, esta é a
última seleção, usualmente realizada no dia da transferência.

Além disso, de acordo com Youngs (2007), os animais devem ser negativos
para tuberculose, brucelose e leucose enzoótica, além de serem imunizados contra
diarreia viral bovina, rinotraqueíte infecciosa bovina, leptospirose, clostridioses, febre
aftosa e raiva. Ainda, devem receber vermífugos e ectoparasiticidas, a fim de haver o
controle de endoparasitos e ectoparasitos.

Deve-se selecionar as receptoras também a partir do seu estado nutricional.

Contudo, não se pode avaliar apenas escore de condição corporal (ideal é entre 2 e
3, em uma escala até 5), mas também a oferta alimentar adequada. Ou seja,
deficiências vitamínicas e/ou minerais, efeitos deletérios de compostos nitrogenados,
altos níveis energéticos, balanço energético negativo e queda de escore de condição
corporal (ECC) são alguns dos aspectos negativos relacionados à eficiência da
reprodução de bovinos (FILHO et al., 2013). É importante salientar que a receptora
deve apresentar um porte compatível com a raça do embrião a ser transferido, a fim
de garantir uma gestação normal e um parto eutócico, bem como ser capaz de
produzir leite suficiente (GONÇALVES et al., 2014).
 42

Para realizar a transferência de embriões é essencial que haja sincronia do

ciclo estral de doadoras e receptoras, para que o embrião da doadora e o trato
reprodutivo da receptora estejam no mesmo estágio fisiológico de desenvolvimento, o
que garante bons resultados nas taxas de prenhez. Contudo, as taxas começam a
cair quando a assincronia do estro entre doadoras e receptoras é superior a 24 horas
(SPELL et al., 2001).

De acordo com Filho et al. (2013), pode-se descartar a utilização de protocolo

hormonal para a sincronizar o ciclo estral de receptoras, sendo que é possível realizar
este processo apenas a partir do acompanhamento do estro natural. Este manejo
apresenta como vantagem o menor custo, uma vez que não se utiliza protocolos
hormonais, porém, a observação correta da manifestação do estro e o maior número
de animais disponíveis podem se tornar uma desvantagem. Em contrapartida, a opção
pela sincronização de estro através de protocolos hormonais possibilita um maior
aproveitamento das receptoras, desconsiderando a necessidade de detecção de estro
e diminuindo o custo fixo, quando resulta em taxa de prenhez entre 45 e 50% (FILHO
et al., 2013).

Uma das opções de protocolo hormonal para a sincronização de receptoras

consiste na administração de duas doses de PGF2α com intervalos de 11 a 14 dias.
Após a última aplicação deste hormônio, em torno de 5 dias haverá apresentação de
sinais de estro (BÓ et al., 2004). No entanto, o uso da PGF2α possui alguns fatores
limitantes como mão-de-obra capacitada para detectar o cio; variação no tempo da
administração da PGF2α à ocorrência do estro; presença do CL para responder ao
tratamento; e limitada quantidade de receptoras detectadas em cio (CHAVES; ALVES,
2014). Segundo Penitente Filho et al. (2014), este método é facilmente aplicado a um
programa de TE, visto que permite que a primeira dose de PGF2α seja administrada
na receptora no momento em que a doadora estiver em cio, antes da superovulação
(SOV), enquanto que a segunda dose é realizada após 11-12 dias, ou 12 horas antes
da aplicação de PGF2α na doadora.

Uma alternativa de protocolo é o OVSYNCH, que consiste na administração de

GnRH seguido de aplicação de PGF2α, 7 dias após. Em seguida, um segundo
tratamento com GnRH é feito 48 horas após a aplicação de PGF2α, sendo a
transferência de embriões em tempo fixo realizada 7 dias depois. A administração de
GnRH induzirá um pico de LH, resultando na ovulação ou luteinização do folículo
 43

dominante e emergência de uma nova onda de crescimento folicular nos próximos 2

dias, enquanto isso, a administração de PGF2α induz a luteólise (BÓ et al., 2004). A
Figura 11 ilustra o esquema do protocolo OVSYNCH.

Figura 11 - Protocolo de sincronização OVSYNCH.

Fonte: Penitente Filho et al. (2014).

Apesar das opções descritas acima, o tratamento com estrógeno e

progesterona tem sido cada vez mais empregado em programas de sincronização do
estro em bovinos de leite e de corte. Este protocolo consiste na inserção de um
dispositivo intravaginal de progesterona e na administração de estrógeno no dia 0 do
protocolo, a fim de induzir a emergência de uma nova onda de crescimento folicular.
No dia 7, 8 ou 9 do protocolo, ao retirar o dispositivo de P4, aplica-se PGF2α, e
subsequente aplicação de estradiol após 24 h ou de GnRH/LH após 48 a 54 h, para a
sincronização da ovulação (BÓ et al., 2004). A Figura 12 ilustra o esquema de
protocolo de sincronização de fêmeas receptoras utilizando P4, E2 e GnRH.

Figura 12 - Protocolo de sincronização da ovulação com associação de

Progestágeno, BE e GnRH.

Fonte: Penitente Filho et al. (2014).

Também se tem empregado o uso de eCG no dia da retirada do dispositivo

intravaginal de P4 e da aplicação de PGF2α, com o intuito de aumentar o rendimento
dos protocolos hormonais. Devido à sua dupla ação de FSH e LH, o eCG permite uma
melhor maturação folicular e aumento na síntese de progesterona pelo corpo lúteo
 44

formado posteriormente (CHAVES; ALVES, 2014). A Figura 13 esquematiza o

protocolo de sincronização utilizando eCG.

Figura 13 - Protocolo de TETF, usando Novormon® (eCG) e inovulação no D17, sem

detecção de cio.

Fonte: Penitente Filho et al. (2014).

Portanto, a manipulação do ciclo estral das receptoras possibilita melhorar os

resultados da TE, já que se torna possível ter um CL funcional no momento da
inovulação, aumentando a concentração plasmática de P4 e, consequentemente,
consegue-se um ambiente mais propício para manter a gestação (FILHO et al., 2013).
Após a seleção e preparo da fêmea receptora, realiza-se a TE ou inovulação, que
consiste na deposição do embrião no terço médio-final do corno uterino ipsilateral ao
corpo lúteo, através de aplicador, semelhante ao utilizado na inseminação artificial.
Contudo, somente embriões classificados como grau I a III devem ser transferidos
para receptoras (PENITENTE FILHO et al., 2014).
 45

5. CONCLUSÃO

A transferência de embriões é uma biotecnologia aplicada à reprodução animal

amplamente difundida no mundo. A partir desta técnica é possível produzir um número
elevado de descendentes geneticamente superiores por fêmea, além de reduzir o
intervalo entre gerações e aumentar a velocidade de melhoramento genético do
rebanho. A TE ainda permite que animais geneticamente superiores e com distúrbios
reprodutivos adquiridos se reproduzam, impedindo o descarte precoce deles.
Contudo, diversos fatores podem interferir no sucesso da TE, tais como nutrição dos
animais selecionados, manejo sanitário e mão de obra da equipe envolvida no
procedimento, além da habilidade técnica do Médico Veterinário (a). Portanto, é
necessário que todos estes fatores, tanto relacionados aos animais quantos aos
profissionais, sejam apropriados, a fim de obter eficiência na técnica em questão.
 46

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