Herda 2

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
INFLUÊNCIA DA RADIAÇÃO SOLAR NA EXPRESSÃO GÊNICA DE

COLAGENASES NA PELE DE EQUINOS COM ASTENIA DÉRMICA
REGIONAL HEREDITÁRIA
CAMPO AMOR VIEIRA DA CUNHA NETO
BOTUCATU - SP
JANEIRO de 2020
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
INFLUÊNCIA DA RADIAÇÃO SOLAR NA EXPRESSÃO GÊNICA DE

REGIONAL HEREDITÁRIA
CAMPO AMOR VIEIRA DA CUNHA NETO
Tese apresentada junto ao programa de

pós-graduação como requisito para
obtenção do título de Doutor.
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Secorun

Borges
Coorientadores: Prof. Dr. José Paes de
Oliveira Filho e Dr. Peres Ramos Badial
Botucatu
Janeiro de 2020
ii
iii
Nome do autor: Campo Amor Vieira da Cunha Neto
Título: INFLUÊNCIA DA RADIAÇÃO SOLAR NA EXPRESSÃO GÊNICA DE

REGIONAL HEREDITÁRIA EQUINA
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Alexandre Secorun Borges

Presidente e orientador
Departamento de Clínica Veterinária FMVZ – UNESP – Botucatu.
Prof. Dr. Rogério Martins Amorim

Membro
Departamento de Clínica Veterinária FMVZ – UNESP – Botucatu.
Prof. Dr. João Pessoa Araújo Júnior

Membro
Instituto de Biociências, Departamento de Microbiologia e Imunologia – UNESP
– BOTUCATU.
Prof. Luiz Cláudio Nogueira Mendes

Membro
Departamento: Departamento de Clínica, Cirurgia e Reprodução Animal da
Faculdade de Medicina Veterinária da UNESP - Campus de Araçatuba.
Prof. Diego José Zanzarini Delfiol

Membro
Faculdade de Medicina Veterinária – FAMEV da Universidade Federal de
Uberlândia - UFU - Uberlândia, MG.
Data da defesa: 21 de janeiro de 2020.

iv
A Família!
A minha amada esposa, sempre doce, Analice. Pelo amor, paciência, força
e cumplicidade, por trazer em seu ventre a mais bela dádiva que Deus
poderia nos dar, a SOFIA, nosso pinguinho que luz, que ainda à caminho,
já nos enche de alegria e esperança, esperança no amanhã, no ser humano,
no mundo, mundo o qual me empenharei ao máximo, para ajudar a torná-lo
cada dia melhor.
Aos meus pais, Neri Vieira da Cunha e Maria Nicen da Cunha, pela
vida, pelo amor e apoio incondicional, pelos exemplos de honra e dignidade,
os quais me conduzem pelas estradas da vida, tenho certeza que sempre me
guiarão ao caminho correto.
Aos meus irmãos, Vlademir Vieira da Cunha, Edna Vieira da Cunha

(in memoriam) e Neri Hellen Vieira da Cunha, pelo apoio, amor,
incentivo, confiança e compreensão em tantos momentos.
v
Agradecimentos
À Santíssima Trindade, pelo dom da vida, amor e misericórdia, por der me

dado forças nesta caminhada. Também à Maria, Santa Mãe de Deus, intercessora,
na imagem de Nossa Senhora de Aparecida, pois tudo em minha vida está em
suas mãos santas e misericordiosas.
Ao Professor e orientador Alexandre Secorun Borges, pela recepção, pela

amizade, pelos ensinamentos, confiança, conselhos, gentileza, convivência e
principalmente pelo apoio e oportunidades.
Aos coorientadores, professores José Paes de Oliveira Filho e Peres

Ramos Badial, pela imensa ajuda no desenvolvimento deste projeto, pelos
ensinamentos, atenção, cordialidade e respeito, pela amizade e inúmeros
momentos de alegre convivência.
Ao professor João Pessoa Araújo Júnior e toda sua equipe de trabalho do

IBTEC, por sempre disponibilizar um espaço de trabalho na bancada do laboratório
que coordena, pela ajuda e ensinamentos nos vários momentos de dúvidas, pela
amizade e cordialidade e também diversos momentos de excelente convivência.
Ao professor Deilson Elgui de Oliveira e às Dras. Camila Dantas Malossi

e Mariana Vaz Rodrigues do IBETC, pelos ensinamentos, ajuda nos estudos em
biologia molecular e principalmente pela amizade, atenção e carinho.
Aos grandes amigos e colegas, Diego José Zanzarini Delfiol, Giovane

Olivo e César Erineudo Tavares de Araújo, pela amizade, convivência,
ensinamentos e conselhos, pelos incontáveis momentos de alegria e fraternidade,
tanto em casa quanto no ambiente de trabalho.
Aos amigos e colegas de pós graduação, “Galera da Salinha”, Danilo

Andrade, Raissa Leite, Ana Luísa, Anelize Trecenti, Daiane Rodrigues, Larissa
Andrade, Luiza Zakia, Pedro Bernardino, Lukas Garrido, Julia Franco, Amanda
Caceres, Roberta Basso, Natalia Lourenço e Natalia Dias, pela amizade, pelo
apoio e carinho, pela atenção e , principalmente, pela ajuda em todos os momentos
do projeto, sem vocês não teria sido possível executar tantas tarefas.
Aos Professores do setor de cirurgia de grandes animais da UNESP de

Botucatu, professora Ana Liz Garcia Alves, professor Carlos Alberto Hussni,
professor Marcos Jun Watanabe e Celso Antônio Rodrigues, por sempre abrirem
as portas de suas salas e estarem dispostos a ajudar, pelos ensinamentos,
conselhos, pelo carinho e gentileza, pelo apoio em cederem as baias de
experimentação em equinos do Biotério no setor de cirurgia de grandes animais.
Aos amigos e colegas da cirurgia de grandes animais UNESP de Botucatu,

João Pedro, André, Vitor Hugo, Jaqueline, Betsabéia, Gustavo, Juliana Alonso
vi
e Caio Nunes, pela amizade, carinho, vários momentos de muita alegria, pela ajuda,
e principalmente pela gentileza em reprogramar suas atividades nas baias de
experimentação do Biotério no setor de cirurgia afim de que nós pudéssemos utilizá-
las para este projeto.
Aos médicos veterinários residentes e estagiários do setor de cirurgia

de grandes animais e principalmente aos funcionários, Clotilde e Jairo, pela
amizade, pelo carinho e atenção em todos esses anos que estive na UNESP em
Botucatu.
Aos docentes do Departamento de Clínica Veterinária, professores Roberto

Calderon Gonçalves, Simone Biagio Chiacchio, Rogério Martins Amorim, pelo
incentivo inenarrável, pelo apoio, ensinamentos e amizade, por todos os momentos
de convivência que sempre agregam muito na minha vida pessoal e profissional.
Às secretárias do Departamento de Clínica Veterinária, Marlene Dias de

Camargo e Izabel Cristina Castro e aos funcionários da Clínica de Grandes
Animais Cesar Leme e Marco Antônio Simão pela colaboração, amizade e
gentiliza durante o curso de pós-graduação.
Aos médicos veterinários residentes, alunos, estagiários e
funcionários do setor de clínica de grandes animais da UNESP Botucatu pela
amizade e apoio nas atividades acadêmicas.
A CAPES pela concessão da bolsa de doutorado, possibilitando a

execução deste projeto.
Aos membros do conselho de Pós-Graduação em Medicina

Veterinária e aos colaboradores de apoio administrativo da seção de pós-
graduação, que sob a supervisão de Carlos Pazini Junior, sempre estiveram
prontos para resolver as questões burocráticas necessárias a correta condução
do programa, pelo carinho e atenção.
À toda equipe da fazenda São Joaquim do Instituto Butantan, em

especial às pessoas do Sr. Nelson Donizetti Fernandes e aos colegas médicos
veterinários Eduardo Soares Caula, Erica Hermoso Arantes Pereira,
Wellington Nascimento (Zé), Ariela Zanetti e Guilherme Martinez, pelo pleno
apoio, pela amizade, confiança e tantos momentos que tornaram minha vida
melhor e mais fácil.
Aos Cavalos, por me permitir vivenciar um sonho de infância, animais

de nobreza e força inefáveis, que me ensinam, a cada dia, observar, servir e
lutar.
vii
“Há três caminhos para o fracasso: não ensinar o que se sabe, não
praticar o que se ensina e não perguntar o que se ignora.”
São Beda (672-735 d.C.)
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Visão geral de 23 Metaloproteinases de Matriz (MMP)

identificadas em humanos e seus respectivos nomes comuns. Adaptado
de Klein & Bischoff (2011). .......................................................................... 14
Tabela 2. Sequência dos conjuntos de primers dos genes alvo (MMP1,
MMP8 e MMP13 equino) e endógenos (β-actina e GAPDH equina)
utilizados na reação de qPCR. O número de acesso corresponde a
sequência do RNAm para os respectivos genes no banco de dados do
NCBI. ........................................................................................................... 26
Tabela 3. Valores de Slope, coeficiente de correlação (R 2) e eficiência de
reação para cada um dos genes alvo e endógenos ..................................... 34
Tabela 4. Expressão gênica de MMP1 das amostras de dorso do GA, ao
longo do período experimental. Na parte superior da tabela estão
descritos os valores individuais e abaixo estão as médias ± desvios
padrão (DP) da expressão relativa calculada pela equação 2 -(∆∆cT),
segundo LIVAK & SCHMITTGEN (2001). A expressão de M0 foi
considerada como controle e recebeu o valor relativo de 1,0 e todos os
demais foram calculados proporcionalmente. .............................................. 39
Tabela 5. Expressão gênica de MMP1 das amostras de ventre do GA, ao
Tabela 6. Expressão gênica de MMP1 das amostras de dorso do GC, ao
Tabela 7. Expressão gênica de MMP1 das amostras de ventre do GC, ao
padrão (DP) da expressão relativa calculada pela equação 2-(∆∆cT),
Tabela 8. Expressão gênica de MMP1 das amostras de dorso e ventre do
GA, ao longo do período experimental. Na parte superior da tabela estão
segundo LIVAK & SCHMITTGEN (2001).A expressão média de dorso foi
ix
considerada como controle e recebeu o valor relativo de 1,0 e a do ventre

calculada proporcionalmente. ...................................................................... 42
GC, ao longo do período experimental. Na parte superior da tabela estão
Tabela 10. Expressão gênica de MMP1 das amostras de dorso do GA e
segundo LIVAK & SCHMITTGEN (2001).A expressão média do GC
recebeu o valor relativo de 1,0 e a do ventre calculada
proporcionalmente, em cada momento. ....................................................... 45
Tabela 11. Expressão gênica de MMP1 das amostras de ventre do GA e
Tabela 13. Expressão gênica de MMP8 das amostras de ventre do GA, ao
x

GA, ao longo do período experimental. Na parte superior da tabela estão
Tabela 21. Expressão gênica de MMP13 das amostras de ventre do GA,
ao longo do período experimental. Na parte superior da tabela estão
xi

Tabela 23. Expressão gênica de MMP13 das amostras de ventre do GC,
ao longo do período experimental. Na parte superior da tabela estão
Tabela 24. Expressão gênica de MMP13 das amostras de dorso e ventre
do GA, ao longo do período experimental. Na parte superior da tabela
estão descritos os valores individuais e abaixo estão as médias ± desvios
Tabela 25. Expressão gênica de MMP13 das amostras de dorso e ventre
do GC, ao longo do período experimental. Na parte superior da tabela
estão descritos os valores individuais e abaixo estão as médias ± desvios
segundo LIVAK & SCHMITTGEN (2001). A expressão média do GC
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Principais passos pós-traducionais na síntese de colágeno

(MYLLYHARJU; KIVIRIKKO, 2004). .............................................................. 5
Figura 2. Componentes do espectro eletromagnético da radiação solar
total, com potencial de energia e capacidade de penetração na pele
humana. Adaptado de: Wang et al. (2019). ................................................. 16
Figura 3. Desenho experimental demonstrando os pontos determinados
para realização das biópsias em cada momento (0 a 5, no dorso e ventre
de cada animal), o esquema de restrição e exposição à radiação solar
que os grupos de animais foram submetidos, além do esquema de
procedimentos para as análises em laboratório. .......................................... 21
Figura 4. Desenho esquemático demonstrando a posição dos conjuntos de
primers e seus respectivos produtos amplificados em relação ao gene
(vermelho) e a posição das junções exon-exon (degraus em preto).
Primers são representados pelas setas azuis e entre cada seta os
produtos amplificados. ................................................................................. 25
Figura 5. Baias de experimentação durante a fase de restrição à luz solar.
Em A e B um animal controle e um afetado, respectivamente, em C
termômetro demonstrando temperatura dentro do conjunto de baias de
experimentação, em D aferição da radiação solar. ...................................... 31
Figura 6. Aferição da radiação solar na região de dorso (A) e ventre (B) de
um equino afetado por HERDA, a direção da fotocélula do equipamento
está indicada nas setas brancas. Notar, nas imagens de zoom do
equipamento, a diferença de aproximadamente oito vezes entre a
incidência de radiação solar na região dorsal e ventral de um equino
adulto. .......................................................................................................... 31
Figura 7. Boxplots demonstrando as diferenças entre exposição solar da
região dorsal e ventral do GA e GC em M3 e M4. Letras diferentes acima
dos diagramas indicam diferenças estatísticas (P<0,05). ............................ 32
Figura 8. Boxplot demonstrando a variação da concentração de RNA total
bem como a pureza pela análise da absorbância relativa das amostras
de pele de equinos do grupo afetado (GA) e grupo controle (GC). .............. 33
Figura 9. Eletroferograma demonstrando integridade do RNA da amostra
padrão pelo RNA Integrity Number (RIM) realizado no equipamento de
eletroforese capilar 2100 Bioanalyzer. ......................................................... 33
Figura 10. Gráficos demostrando, as curvas padrão com a eficiência de
reação, curvas de dissociação (especificidade) e as curvas de
amplificação das diluições seriadas. Em A, B gráficos são referentes aos
genes alvos MMP1 e MMP8, respectivamente. ........................................... 35
xiii
amplificação das diluições seriadas. Em A e B os gráficos são referentes

aos genes alvo MMP13 e endógeno β-actina, respectivamente. ................. 36
Figura 12. Boxplots demonstrando medidas de tendência central e
dispersão dos coeficientes de variação dos Cts entre os momentos
experimentais dos genes endógenos β-actina e GAPDH, sem diferença
estatística (P>0,05). ..................................................................................... 37
Figura 13. Boxplots demonstrando a variação da expressão gênica da
MMP1 nas amostras de dorso (A, C) e ventre (B, D) dos grupos GA (A,
B) e GC (C, D). Letras diferentes acima dos diagramas indicam
diferenças estatisticas (P<0,05). .................................................................. 41
MMP1 e a comparação entre dorso e ventre ao longo do período
experimental, sendo que em cada momento, as amostras de dorso foram
consideradas controles e as de ventre calculadas proporcionalmente.
Asterisco em cima dos diagramas demonstram diferenças significativas
entre regiões no mesmo momento (P<0,05). ............................................... 44
MMP1 e a comparação entre os grupos, ao longo do período
experimental. Em cada momento, as amostras do GC receberam o valor
relativo de 1,0 e as de ventre foram calculadas proporcionalmente.
Asterisco em cima dos diagramas demonstram diferenças significativas
entre os grupos no mesmo momento, tanto na região dorsal (A) quanto
na região ventral (B) (P<0,05). ..................................................................... 47
Figura 16. Boxplots demonstrando a variação na expressão gênica relativa
de MMP8 na pele das regiões de dorso (A, C) e de ventre (B, D) de
equinos dos grupos GA (A, B) e GC (C, D). Letras diferentes acima dos
diagramas indicam diferenças estatisticas (P<0,05). ................................... 50
MMP8 sem diferenças estatísticas entre dorso e ventre dos grupos de
animais afetados (A) e controle normais (B). ............................................... 53
relativo de 1,0 e as de ventre foram calculadas proporcionalmente. Não
houveram diferenças significativas entre os grupos no mesmo momento,
tanto na região dorsal (A) quanto na região ventral (B) (P>0,05). ................ 56
MMP13 nas amostras de dorso (A, C) e ventre (B, D) dos grupos GA (A,
B) e GC (C, D). Não houveram diferenças significativas entre os
momentos avaliados (P>0,05) em nenhuma das regiões de ambos os
grupos. ........................................................................................................ 59
MMP13 nas amostras de dorso e ventre do GA (A) e GC (B). não
houveram diferenças estatísticas em nenhum dos grupos estudados
(P>0,05)....................................................................................................... 62
xiv
Figura 21. Boxplots demonstrando a comparação da expressão gênica da

MMP13 na pele de dorso e ventre (A e B, respectivamente) entre os
grupos GA e GC ao longo do período experimental. Não houveram
diferenças estatísticas entre os grupos em nenhuma das regiões
avaliadas (P>0,05). Em B, o valor de P acima dos diagramas do M4,
indica tendência a diferença estatística entre grupos (P=0,057). ................. 65
xv
SUMÁRIO
RESUMO ............................................................................................................... 1
ABSTRACT ............................................................................................................ 2
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 3
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 5
2.1 Estrutura, biossíntese e metabolismo do colágeno ...................................... 5
2.2 Doenças genéticas do colágeno .................................................................. 7
2.3 Astenia cutânea regional hereditária em equinos (HERDA) ......................... 8

2.3.1 Etiopatogenia ........................................................................................ 9
2.3.2 Sinais clínicos e diagnóstico ................................................................ 10
2.3.3 Tratamento, prognóstico e manejo ...................................................... 12
2.4 Metaloproteinases de matriz (MMP) ........................................................... 13
2.5 Ação da radiação solar na matriz extracelular cutânea .............................. 15
2.5 Justificativa ................................................................................................ 18
3. OBJETIVO ....................................................................................................... 18
3.1 Objetivos específicos ................................................................................. 18
4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 19
4.1 Animais ...................................................................................................... 19
4.2 Delineamento experimental........................................................................ 19
4.3 Colheita das amostras ............................................................................... 20

4.3.1 Biópsias de pele .................................................................................. 20
4.4 Análise da expressão gênica das Metaloproteinases MMP1, MMP8 e

MMP13 por Reação em Cadeia de Polimerase quantitativo em Tempo
Real (qPCR) ................................................................................................ 22
4.4.1 Extração e purificação de RNA total .................................................... 22
4.4.2 Reação da Transcriptase Reversa e produção de cDNA ..................... 24
4.4.3 Desenho dos iniciadores (primers) ...................................................... 24
xvi
4.4.4 Avaliação dos conjuntos de primers por PCR convencional e

sequenciamento
Sanger...................................................................................................
.................................................26
4.4.5 Análise especificidade e concentração dos primers e eficiência da
reação qPCR ........................................................................................... 27
4.4.6 Reação de PCR quantitativo em tempo real (qPCR) ........................... 28
4.5 Análise estatística ...................................................................................... 28
5 RESULTADOS .................................................................................................. 29
5.1 Tratamento dos grupos: restrição e exposição à radiação solar. ................ 29
5.2 Análise da expressão gênica pela técnica de qPCR .................................. 32

5.2.1 Concentração e qualidade do RNA total das amostras ........................ 32
5.2.2 Curvas padrão e análise da eficiência da reação de qPCR e análise
de variação do gene endógeno utilizado como normalizador ................... 34
5.3 Expressão gênica relativa das Metaloproteinases MMP1, MMP8 e

MMP13 da pele de dorso e ventre de equinos afetados (HERDA) e
normais ........................................................................................................ 37
5.3.1 MMP1 .................................................................................................. 38
5.3.2 MMP8 .................................................................................................. 48
5.3.3 MMP13 ................................................................................................ 57
6. DISCUSSÃO .................................................................................................... 66
7. CONCLUSÃO .................................................................................................. 70
8 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 71
9 ARTIGO CIENTÍFICO ....................................................................................... 82
10 ANEXOS ....................................................................................................... 104
ANEXO 1 - Normas da Revista Veterinary Dermatology. ............................... 104

1
CUNHA NETO, C.A.V. Influência da radiação solar na expressão gênica de

colagenases na pele de equinos com Astenia Dérmica Regional Hereditária.
Botucatu, 2020. 133 pag. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina Veterinária
e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
RESUMO
Com a hipótese do aumento da degradação cutânea de equinos com HERDA

quando expostos a radiação solar, este trabalho teve por objetivo avaliar a
influência do sol na expressão gênica das colagenases (MMP1, MMP8 e
MMP13) na pele de animais afetados e normais. Foram utilizados 12 equinos,
seis no grupo afetados (GA) e seis normais para o grupo controle (GC). Todos
os animais viviam à campo e foram submetidos a restrição de radiação solar e
posteriormente expostos ao sol. Foram realizadas biópsias de pele da região
dorsal e ventral dos animais em seis momentos: M0, antes da fase de restrição
ao sol; M1 e M2, aos 15 e 30 dias de restrição ao sol, respectivamente; M3, M4
e M5 ao final do 1º, 3º e 15º dia de exposição ao sol, respectivamente. Com a
técnica de qPCR, observou-se influência da radiação solar na expressão gênica
de colagenases na pele dos equinos do GA e GC, sendo que: no M4 houve
aumento significativo (P<0,05) da expressão relativa de MMP1 na pele dorsal de
ambos os grupos, todavia o GA expressou mais MMP1 na região dorsal que o
GC; houve uma maior expressão da MMP1 na região dorsal do que ventral em
M4 no dois grupos; aumento na expressão de MMP8 em ventre do GA e
nenhuma mudança significativa na expressão gênica de MMP13 em nenhum dos
grupos. Assim, conclui-se que se deve evitar que os animais afetados fiquem
expostos ao sol, pelo menos nos períodos de maior incidência de radiação solar.
Palavras chave: MMP1, MMP8, MMP13, expressão gênica, qPCR.

2
CUNHA NETO, C.A.V. Influence of solar radiation on gene expression of

collagenases in the skin of horses with Hereditary Regional Dermal Asthenia.
Botucatu, 2020. 133 pag. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina Veterinária
e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
ABSTRACT
With the hypothesis of increased skin degradation in horses with HERDA when
exposed to solar radiation, this study aimed to evaluate the influence of the sun
on the gene expression of collagenases (MMP1, MMP8 and MMP13) on the skin
of affected and normal animals. Twelve horses were used, six in the affected
group (GA) and six normal in the control group (CG). All animals lived in the field
and were submitted to solar radiation restriction and later exposed to the sun.
Skin biopsies of the dorsal and ventral regions of the animals were performed in
six moments: M0, before the sun restriction phase; M1 and M2, at 15 and 30 days
of sun restriction, respectively; M3, M4 and M5 at the end of the 1st, 3rd and 15th
day of exposure to the sun, respectively. With the qPCR technique, the influence
of solar radiation on the gene expression of collagenases in the GA and GC
horses was observed, being that: in M4 there was a significant increase (P <0.05)
in the relative expression of MMP1 in the dorsal skin from both groups, however,
GA expressed more MMP1 in the dorsal region than CG; there was a greater
expression of MMP1 in the dorsal than ventral region in M4 in the two groups;
increased expression of MMP8 in the womb of GA and no significant change in
gene expression of MMP13 in either group. Thus, it is concluded that the affected
animals should be avoided from being exposed to the sun, at least during periods
of higher incidence of solar radiation.
Key words: MMP1, MMP8, MMP13, gene expression, qPCR.

3
1 INTRODUÇÃO
A Astenia dérmica regional hereditária equina (HERDA) é uma

enfermidade que acomete principalmente a pele possuindo caráter autossômico
recessivo em equinos (TRYON et al., 2005). A HERDA acomete cavalos da raça
Quarto de Milha (QM) e raças compostas pelo QM (WHITE et al., 2004; TRYON;
WHITE; BANNASCH, 2007). Clinicamente é observado animais com pele fina,
frouxa e hiperextensível que lacera facilmente ao menor trauma causando
extensas cicatrizes, de difícil reparação, (SOLOMONS, 1984; WHITE et al.,
2004; BORGES et al., 2005). A afecção ocorre devido mutação no gene que
codifica a proteína Ciclofilina B (CypB), ocasionando efeitos deletérios na síntese
do colágeno (TRYON; WHITE; BANNASCH, 2007; ISHIKAWA et al., 2012;
RASHMIR-RAVEN, 2013). Além da pele, esta anormalidade na síntese de
colágeno faz com que ocorram diferenças na espessura e angulação de córnea
(MOCHAL et al., 2010; BADIAL et al., 2015) e na composição de tendões e
ligamentos nos animais com a mutação em homozigose (GRADY et al., 2009;
BOWSER et al., 2014;).
Embora os animais afetados apresentem feridas em todo o corpo, existe
uma maior frequência na região dorsal, isto contribuiu para que a denominação
de astenia dérmica regional fosse adotada (WHITE et al., 2004). Todavia,
trabalhos demonstram que a pele é mais fina e hiperextensível em quase todo o
corpo dos animais afetados (GRADY et al., 2009; BADIAL et al., 2014a). A maior
ocorrência de feridas localizadas na região dorsal dos animais afetados também
é atribuída a maior exposição a luz solar desta região (RASHMIR-RAVEN et al.,
2004; GRADY et al., 2009; RASHMIR-RAVEN, 2013; RASHMIR-RAVEN;
SPIER, 2015). Estudos anteriores mostraram que a produção de colagenase
induzida pela radiação de raios ultravioleta (solar) resultou em degradação das
fibras de colágeno na pele de humanos (FISHER et al., 1996; FISHER et al.,
1997; BRENNEISEN et al., 2002).
Rashmir-Raven e colaboradores demonstraram que a pele de cavalos
com HERDA é mais hiperextensível quando exposta a colagenase bacteriana do
que a pele de cavalos normais. Tais achados deram suporte a hipótese de que
a microestrutura das fibras dos animais afetados provê uma superfície de contato
mais ampla para ação enzimática devido a desorganização histológica e
4
estrutural (RASHMIR-RAVEN; HOPPER, R; RYAN, 2004; WHITE et al., 2004;

BADIAL et al., 2014).
Considerando que a HERDA é uma das principais enfermidades
genéticas de equinos da raça QM, que o rebanho desta raça é o mais numeroso
no território nacional com percentuais de carreadores semelhante ao plantel
americano (TRYON et al., 2009; ABQM, 2017; BADIAL et al., 2014b), que casos
clínicos tem sido observados no Brasil (BORGES et al., 2005), e que a incidência
de luz solar em países tropicais é maior que na América do Norte, tal pesquisa
nos fornece dados clínicos e moleculares úteis para melhor compreender alguns
dos eventos metabólicos que podem contribuir para o aparecimento dos sinais
clínicos nos animais afetados. Além de auxiliar na tomada de medidas de manejo
dos animais acometidos, este estudo pode servir como modelo para pesquisas
voltadas às doenças do colágeno em outras espécies.
5
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Estrutura, biossíntese e metabolismo do colágeno
O colágeno é a proteína mais abundante do organismo animal e o

principal constituinte da matriz extracelular (KUCHARZ, 1992; KOIDE; NAGATA,
2005). Sua principal característica molecular é a forma helicoidal tripla (Figura 1)
devido as três cadeias polipeptídicas formada por múltiplas sequências de três
aminoácidos cujo a formula é (Glicina-X-Y)n (BRINCKMANN, 2005). Já foram
identificados 28 tipos diferentes de colágeno constituídos por pelo menos 46
cadeias polipeptídicas distintas em vertebrados (BRINCKMANN, 2005; VEIT et
al., 2006), sendo que em humanos foram descritos 42 genes, em 23 destes já
foram caracterizadas mais de 1300 mutações (MYLLYHARJU; KIVIRIKKO,
2004).
Figura 1. Principais passos pós-traducionais na síntese de colágeno

(MYLLYHARJU; KIVIRIKKO, 2004).
A molécula de colágeno possui dois aminoácidos exclusivos, a

hidroxiprolina e hidroxilisina, que são formados pela hidroxilação dos resíduos
de prolina e lisina, respectivamente (MINOR, 1980; KOIDE; NAGATA, 2005). As
posições X e Y da formula (Glicina-X-Y) são frequentemente ocupadas pelos
6
aminoácidos (2S)-prolina (Pro, 28%) e (2S, 4R)-4-hidroxiprolina (Hyp, 38%),

respectivamente, embora qualquer aminoácido possa ocupar estas posições
(SHOULDERS; RAINES, 2010). A trinca Glicina-Hyp-Pro é a mais comum em
todos os tipos de colágeno (RAMSHAW; SHAH; BRODSKY, 1998). No animais,
as unidades de tripla hélice de colágeno (procolágeno) se reúnem de forma
hierárquica e complexa formando as fibras e redes macroscópicas observadas
em tecidos, ossos e membranas basais (SHOULDERS; RAINES, 2010).
O colágeno é inicialmente sintetizado e secretado como proteína
precursora maior, chamada procolágeno que possui um domínio helicoidal triplo
central e não-colágeno em ambas as suas extremidades N- e C-terminais que
são clivados no passo final da biossíntese do colágeno (KOIDE; NAGATA, 2005).
A cadeia polipeptídica procolágeno (cadeias pro-α) encontra seus parceiros
corretos formando diferentes tipos de procolágeno, em tripla hélice, num passo
que envolve modificações pós-traducionais específicas, incluindo a isomerização
cis-trans de muitas ligações peptídicas de prolil e hidroxiprolil (KOIDE;
NAGATA, 2005; MYLLYHARJU, 2005).
O resultado deste complexo e coordenado processo é a síntese de
diferentes subtipos de colágeno envolvendo transcrição de diferentes genes
(BYERS, 2001). Dentre os subtipos de colágenos, os chamados formadores de
fibrila, tipo I, II e III são os mais abundantes no organismo e estão presentes na
pele, derme, ossos, tendões e ligamentos, córnea, vasos e órgãos cavitários
(GELSE; PÖSCHL; AIGNER, 2003).
A natureza heteropolímera das macroestruturas de colágeno
proporcionam mecanismos para uma diversidade ainda maior na construção da
matriz extracelular, tornando desafiador a elucidação de alterações progressivas
durante o desenvolvimento normal, reparação e regeneração de tecidos (BIRK;
BRUCKNER, 2005), bem como na produção de biomateriais de colágeno, tanto
para fins de estudos biológicos quanto terapêuticos (WALTERS; STEGEMANN,
2014).
Durante o desenvolvimento e regeneração tecidual, as moléculas de
colágeno fornecem um dos caminhos que direcionam a organização tecidual,
pois ligando-se a moléculas transmembranas, principalmente as integrinas,
formam importantes sítios de adesão celular (BYERS, 2001).
7
2.2 Doenças genéticas do colágeno
Alterações congênitas no colágeno ou seus componentes na derme ou

outros tecidos que se manifestam clinicamente em afecções no tecido conjuntivo
estão compreendidas em várias doenças hereditárias (HOLBROOK; BYERS,
1982). Estas doenças podem se originar de mutações pontuais, deleções ou
inserções nos genes responsáveis pela biossíntese das cadeias alfa e proteínas
envolvidas nas modificações pós-traducionais (BYERS, 1989; BURROWS,
1999) e tem sido descritas em humanos (HOLBROOK; BYERS, 1982;
BEIGHTON et al., 1998; BURROWS, 1999) e em animais domésticos (COUNTS
et al., 1980; SOLOMONS, 1984; BROWN; YOUNG; CRIPPS, 1993; PACIELLO
et al., 2003; WHITE et al., 2004).
Na medicina humana a afecção mais comumente descrita é a síndrome
de Ehlers-Danlos (EDS), composta por um grupo de diferentes distúrbios que
tem como característica em comum a fragilidade do tecido conjuntivo na pele
(principalmente), e também em ligamentos, articulações, vasos sanguíneos e
órgãos internos, com as variações dependentes do padrão de herança e
alterações moleculares (BEIGHTON et al., 1998; BURROWS, 1999; DE PAEPE;
MALFAIT, 2012; GHARBIYA et al., 2012).
Em animais este tipo de enfermidade é similar a mais de um subtipo de
EDS e tem sido descrita como dermatoparaxis, EDS, hiperelastose cutânea e
astenia cutânea (BECKER et al., 1976; NUSGENS et al., 1992; SEQUEIRA et
al., 1999; WHITE et al., 2004).
A astenia cutânea em equinos foi identificada pela primeira vez no fim
da década de 70 (LERNER & MCCRAKEN, 1978), mas só a partir do início do
século 21 que foi demostrado o padrão de herança e identificação da mutação
genética (RASHMIR-RAVEN et al., 2004; TRYON et al., 2005; TRYON; WHITE;
BANNASCH, 2007). Por ter um forte impacto na indústria do cavalo a
enfermidade é amplamente estudada a fim de diagnóstico para direcionamento
dos acasalamentos (RASHMIR-RAVEN; HOPPER, R; RYAN, 2004; TRYON et
al., 2007; BADIAL et al., 2014) e compreensão das alterações estruturais e
metabólicas (GRADY et al., 2009; ISHIKAWA et al., 2012; RASHMIR-RAVEN et
al., 2015).
8
2.3 Astenia cutânea regional hereditária em equinos (HERDA)
Após o primeiro relato da astenia cutânea em dois equinos da raça QM

em 1978 (LERNER & MCCRAKEN, 1978) foram identificados equinos de outras
raças com enfermidades semelhantes e que também apresentavam pele frágil e
hiperextensível, sendo na década de 80 um cavalo da raça Puro Sangue Inglês
(SOLOMONS, 1984), uma potra de dois anos de idade meio sangue Árabe
(GUNSON, 1984), um potro Hanover (WITZIG et al., 1984), além de mais dois
cavalos da raça QM (HARDY et al., 1988).
Em 2001 um novo relato descreveu lesões dérmicas profundas em
padrão diferente numa potra QM de 1 ano de idade com hiperelastose cutânea
e sugeriram o termo “separação dérmica zonaria” para os achados
histopatológicos (BROUNTS; RASHMIR-RAVEN; BLACK, 2001).
Em 2004 pesquisadores avaliaram as alterações clínicas e
imunohistológicas e os pedigrees, reforçando a hipótese do modelo de herança
autossômica recessiva e sugeriram o nome de Astenia Dérmica Regional
Hereditária Equina (HERDA) devido ao padrão de localização das lesões
cutâneas (WHITE et al., 2004). Neste mesmo ano outros pesquisadores fizeram
um estudo caso-controle, onde foram reunidos pedigrees de 90 animais QM
afetados para hiperelastose cutânea e foi verificado um ancestral comum
chamado “Poco Bueno” ou seu progenitor “King (AQHA 234)”, os pesquisadores
observaram que animais que possuem qualquer um dos progenitores em sua
genealogia possuem 58 vezes mais chance de desenvolver a doença
(RASHMIR-RAVEN et al., 2004). Estes pesquisadores também verificaram que
todos os 14 animais QM mais bem ranqueados na modalidade de apartação
naquela época, são carreadores de uma cópia do gene mutado e como
produziram grande número de descendentes com alto valor zootécnico e
excelentes índices esportivos é possível que a frequência de novos casos de
animais afetados aumentasse nas gerações futuras (RASHMIR-RAVEN et al.,
2004).
Existem relatos de afecções de pele em equinos, semelhantes a
HERDA, em animais das raças Paint Horse e Apaloosa (WHITE et al., 2004),
meio sangue Árabe (GUNSON, 1984) e Warmblood (MARSHALL; SECOMBE;
NICHOLLS, 2011). Todavia, a maior parte dos trabalhos descrevem os aspectos
9
clínicos, histopatológicos e moleculares na raça QM, principalmente nas

linhagens utilizadas para as competições de rédeas e apartação, as chamadas
“linhagens de trabalho” (WHITE et al., 2004; FINNO; SPIER; VALBERG, 2009;
BADIAL et al., 2014b; RASHMIR-RAVEN; SPIER, 2015).
O primeiro relato de equinos com herda no Brasil foi em 2005, onde os
autores descreveram três cavalos QM, com pele frágil que era facilmente
esticada formando pregas que retornavam a posição anatômica de forma
gradual e lacerava com facilidade, dois dos animais eram irmãos próprios e o
terceiro era filho da mesma égua que os demais (BORGES et al., 2005). Além
dos EUA e Brasil (WHITE et al., 2004; BORGES et al., 2005), enfermidade já foi
descrita no Reino Unido (RENDLE; DURHAM; SMITH, 2008), Áustria
(LITSCHAUER et al., 2010) e França (WHITE; BOURDEAU, 2011).
A frequência estimada de heterozigotos para a população de QM norte
americana é de 3,5 %, sendo que para linhagens de apartação chega a 28,3%
(TRYON et al., 2009). No Brasil foi investigado a frequência do alelo mutante em
690 animais QM, utilizados em quatro diferentes modalidades, e os autores
observaram maior frequência de indivíduos carreadores na modalidade de
Rédeas (9,8%), em seguida Apartação (7,5%), Corrida (0,9%), Tambor e baliza
(0,8%), respectivamente (BADIAL et al., 2014b), sendo a frequência de
carreadores para a população de QM no Brasil de 5,8% (BADIAL et al., 2014b).
Segundo dados do Stud Book da ABQM, o plantel brasileiro até
janeiro/2017 era de 514.316 animais registrados com movimento em leilões da
raça em todo o país, nos últimos cinco anos, de cerca de R$ 1 bilhão com a
comercialização de aproximadamente 27 mil animais, pela média geral de R$ 37
mil (ABQM, 2017). Assim, pode-se estimar que existam mais de 29 mil animais
carreadores, e consequentemente a possibilidade de vários animais afetados,
refletindo em perdas diretas com animais afetados dentro do plantel nacional.
2.3.1 Etiopatogenia
A Herda em equinos é causada por uma mutação pontual (c.115G>A),

no gene que codifica a Ciclofilina B (CypB), uma proteína da famílias das
peptidilprolil isomerases (PPI) (KOIDE; NAGATA, 2005), ocasionando a troca de
um resíduo de glicina por um de arginina no domínio N-terminal da CypB
10
(TRYON; WHITE; BANNASCH, 2007), que por sua vez, leva a um efeito deletério
no metabolismo do colágeno (BÄCHINGER, 1987; STEINMANN; BRUCKNER;
SUPERTI-FURGA, 1991).
Uma das várias funções da CypB é a de isomerização cis-trans dos
resíduos de prolina e estruturação da tripla hélice da molécula de colágeno
(KOIDE; NAGATA, 2005). Foi demonstrado (in vitro) que a atividade PPI da CypB
mutante é normal em células de cavalos afetados, porém a sua interação com
outras proteínas (por exemplo: domínio P da Calreticulina e lisil-hidroxilase I),
que são essenciais para o dobramento e secreção da molécula de colágeno tipo
I, fica diminuída, além de apresentarem menores quantidades de modificações
pós-traducionais dos resíduos de lisina (ISHIKAWA et al., 2012), evento que
supostamente altera a organização do colágeno (KOZLOV et al., 2010).
As fibras de colágeno de áreas afetadas são mais finas, com
fragmentação dos feixes de fibras, separados e com espaços entre os feixes
(WHITE et al., 2004, 2007; BORGES et al., 2005).
Este desarranjo estrutural pode favorecer a ação de metaloproteinases
de matriz (MMP), principalmente as colagenases, sobre o colágeno dérmico. Um
estudo demostrou que a pele de animais afetados por HERDA é mais susceptível
a ação de colagenase que a pele de cavalos normais (RASHMIR-RAVEN et al.,
2015), o que reforça a hipótese de aumento na degradação da matriz extracelular
dérmica por ação de MMP´s. Sabe-se que em humanos a exposição à radiação
solar ocasiona ruptura da matriz extracelular da derme por MMP´s (RITTIÉ;
FISHER, 2002).
2.3.2 Sinais clínicos e diagnóstico
Normalmente os primeiros sinais nos animais afetados aparecem a partir

de um ano e meio de idade, quando são iniciados os trabalhos de doma e
treinamento (HARDY et al., 1988; RASHMIR-RAVEN et al., 2004; WHITE et al.,
2004; TRYON; WHITE; BANNASCH, 2007), porém podem ser observados em
animais antes dos seis meses de idade que se traumatizam (RASHMIR-RAVEN
et al., 2004; TRYON et al., 2005).
A enfermidade é caracterizada clinicamente pela presença de pele
frouxa, hiperextensível, frágil e que lacera facilmente resultando em feridas
11
atróficas, hipertróficas ou ambas (LERNER, D. J.; MCCRAKEN, 1978; HARDY

et al., 1988; BROUNTS; RASHMIR-RAVEN; BLACK, 2001; WHITE et al., 2004;
BORGES et al., 2005). Ocasionalmente podem ocorrer animais afetados de
forma mais branda que apresentam pele solta e hiperextensível que, mesmo não
desenvolvendo lesões, podem apresentar sinais de dor e mudança de
comportamento ao serem selados, tornando o diagnóstico clinico insidioso
(RASHMIR-RAVEN, 2013).
Estudos demostraram que a pele de animais afetados possui maior
quantidade de colágeno solúvel que cavalos normais (HARDY et al., 1988;
GRADY et al., 2009) e menor módulo de elasticidade e resistência a tração em
comparação com animais normais (GRADY et al., 2009; BOWSER et al., 2014).
Além de ser mais solúvel, o colágeno da pele de animais afetados é
desorganizado e menos unido que de animais normais (WHITE et al., 2004;
GRADY et al., 2009; BADIAL et al., 2014a) e com isso mais susceptível aos efeito
da degradação de colagenase (RASHMIR-RAVEN et al., 2015).
Embora a HERDA seja relatada inicialmente como uma doença de pele
(WHITE et al., 2004), a enfermidade pode acometer outros tecidos do corpo dos
cavalos afetados, incluindo a córnea, ligamentos e tendões, grandes vasos e
estruturas cardíacas (GRADY et al., 2009; MOCHAL et al., 2010; BOWSER et
al., 2014; BADIAL et al., 2015).
O diagnóstico presuntivo pode ser feito com base no histórico, sinais
clínicos, avaliação do pedigree e avaliação dermatológica observando as
alterações histopatológicas (RASHMIR-RAVEN et al., 2004).
Achados histopatológicos e alterações ultraestruturais da pele de
animais com HERDA podem ser úteis no diagnóstico (RASHMIR-RAVEN et al.,
2004; WHITE et al., 2004; BORGES et al., 2005), porém, não devem ser
utilizados de maneira isolada, uma vez que podem ser de difícil interpretação e
não conclusivos (BROUNTS; RASHMIR-RAVEN; BLACK, 2001; BORGES et al.,
2005; WHITE et al., 2007). Estudos demonstraram que a habilidade dos
patologistas difere na capacidade de identificação de alterações, confirmando
que a interpretação das biópsias deve ser feita por profissionais experientes
(WHITE et al., 2004; BADIAL et al., 2014a; RASHMIR-RAVEN; SPIER, 2015).
Para o diagnóstico definitivo é necessário a presença da mutação
pontual em homozigose no gene codificante da CypB (c.115G>A) (TRYON;
12
WHITE; BANNASCH, 2007). O diagnóstico diferencial deve realizado, pois

traumas em animais não afetados podem gerar feridas com características
parecidas com as observadas em animais afetados, todavia, sem a presença de
pele hiperextensível, frouxa e cicatrizes anormais (RASHMIR-RAVEN; SPIER,
2015). Doenças similares também entram na lista de diagnósticos diferenciais,
como por exemplo a Síndrome da Fragilidade Cutânea Equina (MONTHOUX et
al., 2015), que é uma variação da EDS, porém, não foi relatado em cavalos da
raça QM. Do mesmo modo, a epidermólise bulhosa juncional relatada em
neonatos de raça Belga (KOHN et al., 1989) e Sela Americana (LIETO;
SWERCZEK; COTHRAN, 2002; GRAVES; HENNEY; ENNIS, 2009).
2.3.3 Tratamento, prognóstico e manejo
Devido ser um problema hereditário não existe cura, até o momento,

para a enfermidade e, sendo assim, o tratamento baseia-se no princípio de
manutenção da qualidade de vida de animais acometidos (RASHMIR-RAVEN et
al., 2004; BADIAL et al., 2013). É necessário evitar agentes cáusticos na limpeza
das feridas, drenar hematomas e ter cautela com padrões de suturas, uma vez
que estas normalmente não são bem sucedidas na pele de animais afetados
(RASHMIR-RAVEN, 2013). Suplementos podem ser utilizados como adjuvantes
metabólicos. Em uma recente revisão, os autores sugerem o uso de vitamina C,
pois esta é um cofator na produção de colágeno, além de nutracêuticos a base
de lisina, condroitina e glicosamina (RASHMIR-RAVEN; SPIER, 2015), com
base em estudos em humanos com EDS (CASTORI, 2012).
O prognóstico depende da condição clínica em que o animal se encontra.
Animais ligeiramente afetados podem ser montados e se bem cuidados podem
viver durante anos (RASHMIR-RAVEN; SPIER, 2015). Todavia, animais
acometidos que apresentam extensas lesões não podem ser montados e muitos
são sacrificados devido a gravidade das lesões e problemas secundários que
levam ao sofrimento (BROUNTS; RASHMIR-RAVEN; BLACK, 2001; WHITE et
al., 2007; GRADY et al., 2009).
Animais afetados devem ser afastados da reprodução para diminuir a
ocorrência da enfermidade, no entanto fêmeas podem ser utilizadas com
13
receptoras de embrião, pois animais afetados não apresentam problemas no

sistema reprodutivo (WHITE et al., 2007).
Fatores ambientais como incidência e radiação solar e temperatura
podem contribuir para piora do quadro clinico. Devido as lesões serem mais
comuns na região dorsal (BROUNTS; RASHMIR-RAVEN; BLACK, 2001;
RASHMIR-RAVEN et al., 2004; WHITE et al., 2004), onde a incidência de
radiação e o calor são mais intensos, os animais afetados devem ser mantidos
protegidos do sol, pois sugere-se uma melhora na condição clínica de diminuição
da severidade das feridas cutâneas (RASHMIR-RAVEN, 2013).
Os danos causados pela radiação da luz solar na pele de equinos com
HERDA é atribuído como fator de risco a incidência de feridas na região dorsal
nos animais afetados, área supostamente mais exposta ao sol (RASHMIR-
RAVEN et al., 2015), hipótese que estes pesquisadores sugeriram com base em
trabalhos que demonstram aumento da atividade de metaloproteinases de matriz
em pele humana exposta a radiação solar simulada (LAHMANN et al., 2001;
BRENNAN et al., 2003).
2.4 Metaloproteinases de matriz (MMP)
A primeira MMP foi descrita na década de 60, onde foi demonstrado a

ação enzimática da colagenase intersticial (MMP-1) na degradação da tripla
hélice de colágeno durante o fenômeno da metamorfose da cauda de um girino
(GROSS; LAPIERE, 1962).
As MMP´s constituem uma grande família de enzimas que tem a
finalidade de degradar vários componentes da matriz extracelular (MEC)
(NELSON; FINGLETON; ROTHENBERG, 2000; CAWSTON; WILSON, 2006),
possuindo 23 proteases distintas em humanos, conforme demonstrado na
Tabela 1 (KLEIN & BISCHOFF, 2011). São proteinases zinco/cálcio
dependentes que tem fundamental importância na degradação da MEC, tanto
em processos fisiológicos quanto patológicos da remodelação tecidual
(STERNLICHT; WERB, 2001; MOTT; WERB, 2004). Todavia, em condições
inflamatórias ou malignas destrutivas dos tecidos, a síntese, secreção e
14
atividade de MMP´s são reguladas anormalmente, conduzindo a danos não

controlados nos tecidos (KÄHÄRI; SAARIALHO-KERE, 1999).
Embora várias MMP’s estejam expressas na pele de mamíferos, apenas
três tem atividade colagenolítica (colagenases), a MMP1 (colagenase
intersticial), MMP8 (colagenase neutrofílica) e MMP13 (colagenase 3), podendo
degradar colágeno fibrilar tipo I e III (BRENNAN et al., 2003).
Tabela 1. Visão geral de 23 Metaloproteinases de Matriz (MMP) identificadas em

humanos e seus respectivos nomes comuns. Adaptado de Klein & Bischoff
(2011).
MMP Nome alternativo

1 Colagenase 1, Colagenase Intersticial
2 Gelatinase A, colagenase tipo IV 72-kDa
3 Estromelisina 1, Transina 1
7 Matrilisina, PUMP 1
8 Colagenase 2, Colagenase Neutrofílica
9 Gelatinase B
10 Estromelisina 2
11 Estromelisina 3
12 Metalo-elastase Macrofágica
13 Colagenase 3
14 MMP de membrana tipo 1
19 Nenhum
20 Enamelisina
21 Nenhum
23 MMP Matriz de Cisteína, Femalisina, MMP22
25 MMP de membrana tipo 6, Leucolisina
26 Matrilisina 2/endometase
27 Nenhum
28 Epilisina
15
Mesmo que estudos tenham demonstrado aumento da expressão de

outras MMP´s, além das colagenolíticas, induzido pela radiação ultravioleta (UV)
na pele de humanos (KAWAGUCHI et al., 1996; FISHER et al., 1997; FISHER;
VOORHEES, 1998) a MMP1 parece ser a protease que causa maior dano ao
colágeno cutâneo no processo de fotoenvelhecimento (BRENNAN et al., 2003),
tendo sua máxima expressão com 24 horas de exposição da pele à radiação
solar (LAHMANN et al., 2001). Todavia, a MMP1 é pouco expressa na pele de
tecido cicatricial hipertrófico em humanos (ETO et al., 2012).
Tanto em humanos quanto em ratos as MMP1 e MMP13 são
encontrados em diversos tecidos e tem fundamental importância na migração de
queratinócitos basais da derme (MADLENER; PARKS; WERNER, 1998;
GRENACHE et al., 2007; HATTORI et al., 2009). A MMP-8 é uma colagenase
expressa predominantemente por neutrófilos e sugere-se que tenha papel no
processo de reepitelização da pele em modelos murinos (GUTIÉRREZ-
FERNÁNDEZ et al., 2007), porém sem atuação no processo de migração dos
queratinócitos (PIRILÄ et al., 2003).
Em equinos, foi observado que a MMP13 é mais expressa em casos de
tendinite dos flexores digitais quando comparado a animais normais (NOMURA
et al., 2007) e também em tecido laminar de equinos com laminite induzida por
sobrecarga de carboidratos (WANG et al., 2014).
2.5 Ação da radiação solar na matriz extracelular cutânea
A radiação solar total é a quantidade de energia emitida pelo Sol,

transmitida na forma de radiação eletromagnética, que durante vários anos foi
considerada uma constante (1.365 W/m2), entretanto, após várias observações,
desde o final da década de 70, foi demonstrado que existe variação em escalas
de tempo (FROHLICH, 2006).
Radiação eletromagnética ocorre em diferentes faixas espectrais
classificadas em diferentes regiões do espectro luminoso: Raios-𝛾, Raios-X,
Ultravioleta (UV), Visível, Infravermelho, Micro-ondas ou Ondas de rádio
(GÓMEZ et al., 2018). A radiação UV é composta por comprimentos de onda
consideradas longas, UVA com 320-400nm, e curtas, UVB com 290-320nm e
16
UVC com 100-290nm. No entanto, os espectros capazes de atingir a superfície

terrestre e causar danos a pele são UVA e UVB (Figura 2), sendo que
aproximadamente 95% da radiação UV que atinge a superfície terrestre é
composta por UVA e 5 % UVB, a radiação UVC é absorvida pelas camadas
atmosféricas (WANG et al., 2019).
Figura 2. Componentes do espectro eletromagnético

da radiação solar total, com potencial de energia e
capacidade de penetração na pele humana.
Adaptado de: Wang et al. (2019).
O envelhecimento da pele é um evento complexo, altamente

coordenados por eventos fisiológicos naturais e pelo fotoenvelhecimento
mediado pela radiação solar (WANG et al., 2019). Uma vez iniciado o
fotoenvelhecimento, as fibras colagens começam a ser degradadas, a pele
consequentemente começa ficar enrugada, a pigmentação cutânea ocorre por
proliferação anormal de melanócitos, aumento da atividade de MMP e
degradação da matriz extracelular, além de infiltrados inflamatórios e ectasia
vascular (YAAR & GILCHREST, 2007).
Na década de 90 pesquisadores observaram, em humanos, que a
radiação solar afeta colágenos tipo I e tipo III na derme (TALWAR et al., 1995) e
que raios ultravioletas do tipo B (UVB) interferem na expressão de MMP1 da pele
(FISHER et al., 1996).
Fisher e colaboradores (1997) investigaram os efeitos da radiação
ultravioleta na pele de humanos hígidos, aonde foi determinado a quantidade de
1,49 X 10-3 W/cm2 de luz ultravioleta artificial, necessária para causar uma reação
eritematosa mínima (MED – Minimal Erythema Doses) 24 horas após a
17
exposição. Segundo estes autores, essa dose corresponde à uma exposição de

5 a 15 minutos ao sol do meio dia, e foi o suficiente para aumentar a expressão
gênica de MMP1 na epiderme e derme em até quatro vezes, e degradação de
colágeno tipo I, 24 horas após exposição e se mantendo até 72 horas.
Outro estudo de expressão gênica, pesquisadores utilizaram PCR em
tempo real para avaliar os efeitos da radiação solar simulada (SSR – Solar
Simulated Radiation) na regulação de MMP1 e também de inibidor tecidual de
MMP´s (TIMP – Tissue Inhibitors of Metalloproteinases) na epiderme e derme,
separadamente. Para tal, utilizaram biópsias de pele de humanos 24 horas após
terem sidos irradiados por SSR e observaram que foram necessárias as
quantidades de 1 MED para induzir e 2 MED para que houvesse o pico de
expressão de MMP1, respectivamente, não havendo diferenças entre epiderme
e derme, já TIMP-1 foi expressa apenas na derme (LAHMANN et al., 2001).
Fisher e colaboradores (2001) avaliaram expressão gênica e proteica,
além de atividade enzimática de MMP1 e MMP8 na pele de humanos irradiada
com UV e verificaram maior quantidade relativa de mRNA e proforma proteica
de MMP1 em amostras irradiadas com 2 MED de UV até 24 horas pós
tratamento, além disto, apesar de não detectarem expressão gênica de MMP8,
observaram, em testes de imunofluorêscencia, um aumento na expressão
proteica de uma proforma da enzima em tecido com infiltração neutrofílica de
quatro a oito horas pós radiação UV na derme e até 24 horas pós radiação em
epiderme.
Já em um estudo de expressão proteica e atividade enzimática das
MMP´s 1 e 13, utilizando as técnicas de Western blotting e Zimografia,
respectivamente, Brennan e colaboradores (2003) observaram um aumento de
10 vezes na expressão de MMP1 em cultura de celulas de pele tratada com 2
MED de SSR (UVB) e que pelo menos 50% da enzima MMP1 estava na forma
ativa em cultura de células de pele, 72 horas após exposição. Estes autores
também verificaram que não houve influência da radiação solar na expressão de
MMP13, confirmando a maior importância da MMP1 no processo de degradação
da matriz extracelular dérmica.
18
2.5 Justificativa
Diante da hipótese que a pele de equinos acometidos por HERDA é mais

susceptível a ação de colagenase (RASHMIR-RAVEN et al., 2015) e que a
radiação solar pode aumentar a ação de MMP´s no colágeno dérmico descrita
em humanos (RITTIÉ; FISHER, 2002; BRENNAN et al., 2003) houve a pretensão
de investigar a expressão gênica de colagenases endógenas na matriz
extracelular da derme de equinos acometidos por HERDA, conhecimento que
pode contribuir com o manejo dos animais afetados e melhor compreensão da
enfermidade.
3. OBJETIVO
Avaliar a influência da radiação solar na expressão gênica de

colagenases na pele de equinos afetados por HERDA de acordo com o grau de
exposição à radiação solar.
3.1 Objetivos específicos
Observar se ocorrem diferenças entre a expressão gênica das MMP´s 1,

8 e 13 na pele de cavalos afetados por HERDA e normais, ao longo do tempo,
quando protegidos e expostos a radiação solar.
Comparar a expressão gênica das MMP´s em regiões da pele que são
mais e menos expostas à radiação solar (região dorsal e ventral,
respectivamente), bem como se existem diferenças entre os grupos de equinos
afetados e normais.
19
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Animais
Esta pesquisa foi previamente aprovada pela Comissão de Ética no Uso de

Animais (CEUA) da FMVZ, UNESP – Campus de Botucatu sob o protocolo n°
0026/2017.
Foram utilizados 12 equinos da raça quarto de milha, quatro fêmeas e
oito machos, pesando em média 331,4±51,3 Kg, divididos e dois grupos
experimentais: Grupo afetado (GA) contendo seis animais positivos para o teste
genético (TRYON et al., 2007), sendo quatro machos e duas fêmeas (três
animais com pelagem Alazão, dois Baios e um Castanho) com média de peso e
idade para o GA de 333,17±53,49Kg 9±5,4 anos, respectivamente; Grupo
Controle (GC) com seis animais hígidos, sendo quatro machos e duas fêmeas
(três animais com pelagem Alazão, dois Baios e um Castanho), com média de
peso e idade para o GC de 329,67±54,20Kg e 10,3±5,5 anos, respectivamente.
4.2 Delineamento experimental
Esse trabalho foi baseado em um experimento casualizado do tipo

caso/controle, onde os dois grupos experimentais foram submetidos ao mesmo
tratamento e momentos de colheita das amostras.
O tratamento consistiu em submeter ambos os grupos de animais a uma
fase de restrição e posteriormente uma fase de exposição à luz solar (Figura 3),
todo período do experimento ocorreu entre os meses de dezembro/2017 e
janeiro/2018.
No período de restrição, todos os animais foram mantidos em baias
individuais, protegidos integralmente da luz solar, durante 30 dias. Após o
período de restrição, todos os animais foram mantidos em piquetes abertos, aos
pares (afetado e normal), sem qualquer proteção contra radiação solar, em
período integral. Em todas as etapas, a radiação solar foi aferida com aparelho
portátil1, segundo as instruções do fabricante. Em ambas as etapas todos
receberam feno de gramínea Coast cross e água ad libidum, além de
suplementação com concentrado e sal mineral.
1
MES-100. INSTRUTHERM Instrumentos de Medição Ltda. São Paulo - SP.
20
As colheitas das amostras ocorreram em seis momentos, ao longo do

período de tratamento: M0, previamente a fase de restrição ao sol; M1, aos 15
dias de restrição à radiação solar; M2, 30 dias de restrição à radiação solar; M3,
ao fim do primeiro dia de exposição à radiação solar; M4, final do terceiro dia de
exposição à radiação solar; M5, ao 15º dia de exposição solar (Figura 3).
Em M3 e M4 a radiação solar foi aferida no dorso e no ventre dos
animais, para observar uma provável diferença na quantidade de radiação que
cada região é exposta.
4.3 Colheita das amostras
Foram realizadas biopsias de pele de regiões do dorso e do ventre de

todos os animais, mantendo a lateralidade para todos os momentos de colheita,
sendo que foi utilizado o lado com região de pele mais integra nos animais
afetados, pois alguns animais apresentavam cicatrizes de pele, e mantido o
mesmo lado nos respectivos animais controles. Foi mantida uma distância de,
pelo menos, 20 cm entre os pontos de biópsia nas seguintes regiões:
paramediana à coluna vertebral, 10 cm da linha média dorsal, das regiões da
cernelha e 15ª vertebra torácica para amostras de dorso; paramediana, cinco cm
da linha média ventral, das regiões external, umbilical e púbica. Foram
determinadas essas regiões devido a espessura da pele ter menor variância
(BADIAL et al., 2014a).
4.3.1 Biópsias de pele
Foi utilizada biópsia incisional para colheita de pele íntegra (2,0 cm X 1,0
cm) realizadas após sedação dos animais com cloridrato de detomidina2 na dose
de 0,02 mg.kg-1 IV e anestesia local SC com lidocaína 2%3 , em padrão L
invertido, com distancia de cinco cm do ponto de biopsia, foi realizada limpeza
da pele com solução salina, afim de diminuir possíveis contaminantes da
amostras. Todas as amostras foram congeladas imediatamente pós colheita em
2
DormiunV® - AGENER UNIÃO Saúde Animal - São Paulo, SP.
3
Xylestesin®; Cristália, São Paulo, SP.
21
nitrogênio líquido e, em seguida, armazenadas a - 80 ºC para os testes

moleculares.
Figura 3. Desenho experimental demonstrando os pontos determinados para

realização das biópsias em cada momento (0 a 5, no dorso e ventre de cada
animal), o esquema de restrição e exposição à radiação solar que os grupos de
animais foram submetidos, além do esquema de procedimentos para as
análises em laboratório.
22
4.4 Análise da expressão gênica das Metaloproteinases MMP1, MMP8 e

MMP13 por Reação em Cadeia de Polimerase quantitativo em Tempo Real
(qPCR)
Todas as análises de qPCR foram realizadas nos laboratórios de biologia

molecular da clínica veterinária da FMVZ/UNESP de Botucatu e do Instituto de
Biotecnologia (IBTEC) da UNESP de Botucatu.
4.4.1 Extração e purificação de RNA total
Para extração e purificação do RNA das amostras de pele foi utilizado

kit comercial 4. As amostras congeladas foram fracionadas em alíquotas pesando
50 mg de pele, seccionadas de forma transversal, contendo todas as camadas
(epiderme e derme). Para maceração do tecido foram utilizados tubos plásticos
de 2 mL com esferas de cerâmica5 onde foram acondicionados os fragmentos
de pele juntamente com 300 µL de tampão de lise contendo 2-mercaptoetanol4
e a maceração ocorreu em homogeneizador automático (Precellys® 24)6 à 6.500
RPM em três ciclos de 30 segundos de agitação com intervalos de 30 segundos.
Após essa etapa, as amostras foram transferidas para tubos com 350 µL de
solução tampão de diluição (Blue)4, homogeneizadas gentilmente de forma
manual e incubadas a 70ºC durante três minutos, após foram centrifugadas por
10 minutos à 12.000 x g em temperatura ambiente.
O conteúdo lisado foi transferido para tubo plástico de 2 mL, adicionado
200 µL de etanol 95% e homogeneizado gentilmente por pipetagem, o conteúdo
foi transferido para colunas acondicionadas em tubos coletores e centrifugadas
à 12000 x g durante 60 segundos. O conteúdo do tubo foi desprezado, a coluna
foi novamente acondicionada no tubo coletor e 600 µL de solução de lavagem4
foi adicionada a coluna, uma nova etapa de centrifugação foi realizada à 12.000
x g durante 60 segundos.
Nesta etapa as amostras (ainda nas respectivas colunas de purificação)
foram submetidas a tratamento com 50 µL do mix de DNase (fornecido no kit),
adicionadas diretamente na membrana das colunas, e incubadas durante 15
4
SV total RNA Isolation System – PROMEGA Corporation Madison, WI 53711-5399 USA
5
Tissue grinding CKMix50-R - Bertin-technologies, Rockville, MD 20850, USA.
6
Precellys® 24 - Bertin-technologies, Rockville, MD 20850, USA. ,
23
minutos a temperatura ambiente, em seguida foi adicionado 200 µL de solução

de bloqueio da reação. Esta etapa é imprescindível para eliminar qualquer
molécula de DNA que possa contaminar as amostras e produzir reações
inespecíficas na etapa de qPCR.
Após tratamento com DNase as colunas receberam 600 µL de solução
de lavagem e centrifugadas a 12000 x g durante 60 segundos, uma segunda
etapa de lavagem das colunas foi realizada com 250 µL de solução de lavagem
e centrifugadas a máxima velocidade (16.000 x g) durante 120 segundos. A fim
de garantir que o todos os restos de tampões fossem eliminados uma nova etapa
de centrifugação a 12.000 x g durante 60 segundos foi realizada com as colunas
em novos tubos coletores.
Para a eluição do RNA purificado, as colunas foram então transferidas
para novos tubos plásticos de 1,5 mL, foi adicionado 100 µL de H2O NF (água
ultrapura livre de nucleases) diretamente na membrana das colunas e uma nova
etapa de centrifugação foi realizada a 14000 x g durante 60 minutos.
A pureza e quantificação do RNA extraído foi realizado em
espectrofotômetro (NanoDrop™ 2000)7, com base na relação de absorbância
A260nm: A280nm e da leitura a A230nm. O grau de pureza relativo à presença
de contaminantes proteicos foi obtido pelo cálculo do quociente A260nm:
A280nm, onde uma razão compreendida entre 1,8 e 2,0 foi o indicador de
qualidade. Após as amostras foram armazenadas à -80ºC para posterior reação
de transcriptase reversa e confecção do DNA complementar (cDNA).
Uma amostra de pele de um equino foi utilizada como padrão, tanto na
fase de testes e padronização das concentrações dos primers quanto na
construção das curvas padrão para análise da eficiência na reação de qPCR, o
RNA extraído desta amostra padrão foi analisada quanto a sua pureza no
equipamento 2100 Bioanalyzer8, onde a amostra foi aplicada em um chip com
uma matriz de gel, contendo uma mistura de fluoróforo e marcador de peso
molecular. A ligação do fluoróforo ao marcador e ao RNA resulta em
fluorescência que é quantificada, permitindo a separação do RNA ribossômico
7
Thermo Scientific NanoDrop™ 2000 Spectrophotometer, NanoDrop Technologies, Delaware,
EUA
8
2100 Bioanalyzer Instrument – Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA 95051, USA.
24
18S e 28S e a atribuição de m score de integridade (RIN, do inglês, RNA integrity

number), que varia de 1 a 10, sendo considerado íntegro amostra com score ≥7.
4.4.2 Reação da Transcriptase Reversa e produção de cDNA
A reação de transcrição reversa do RNA para confecção do cDNA foi

realizada utilizando o RNA purificado e tratado com DNase e o sistema de
transcriptase reversa ImProm-II™9, segundo recomendações do fabricante. Para
tal, foram utilizados 800ng de RNA total, 1,5µg de random primers e H2O NF qsp
para 15 µL, esse mix foi submetido a incubação à 70ºC durante cinco minutos e
em seguida inserido em gelo por mais cinco minutos, esse choque térmico
garante que os random primers não se anelem entre si até o momento em que
o mix contendo a enzima transcriptase reversa seja adicionado.
Para o preparo do mix da enzima foram utilizados 12µL de tampão da
enzima, 12µL de MgcL2, 3µL mix dNTP´s, 1,5µL de RNAsin, 3µL de transcriptase
reversa e H2O NF qsp para volume de 45µL. O mix da enzima foi adicionado ao
mix da amostra totalizando um volume final para a reação de 60µL. a reação da
Transcriptase reversa ocorreu em termociclador, sob as seguintes condições:
anelamento a 25ºC durante 5 minutos, extensão à 42ºC durante 60 minutos,
inativação da enzima à 85ºC durante 3 minutos e resfriamento à 4ºC. Em seguida
os produtos da reação foram armazenados à -20°C.
4.4.3 Desenho dos iniciadores (primers)
A sequência genômica dos primers para os genes alvos (MMP1, MMP8

e MMP13 equinos) e normalizadores (β-actina e GAPDH equinos) foram obtidas
com auxílio de ferramenta disponível na internet (www.ncbi.nlm.nih.gov) e as
sequências dos primers específicos para genes alvo e normalizadores foram
gerados por meio da utilização da ferramenta online PRIMER-BLAST disponível
na plataforma do NCBI. As sequências dos iniciadores dos genes alvo e
endógeno utilizados possuíam entre 20 e 23 pares de base (pb) e temperatura
de hibridização entre 59 e 64ºC e estão dispostos na Tabela 2 2. A especificidade
de cada conjunto de primers, para ambos os genes, foi verificado com o auxílio
9
ImProm-II™ Reverse Transcription System - Promega Corporation. Madison, WI 53711-5399
USA.
25
do programa BLAST disponível no website do NCBI. Todos os conjuntos de

primers utilizados foram desenhados em posições exon-exon (Figura 4), ou seja,
os produtos amplificados ocupam posições de um exon a outro, isso faz com que
diminua a chance de amplificação de moléculas de DNA, pois estas são
compostas por exons e introns.
Figura 4. Desenho esquemático demonstrando a posição dos conjuntos de

primers e seus respectivos produtos amplificados em relação ao gene
(vermelho) e a posição das junções exon-exon (degraus em preto). Primers
são representados pelas setas azuis e entre cada seta os produtos
amplificados.
26
Tabela 2. Sequência dos conjuntos de primers dos genes alvo (MMP1, MMP8 e
MMP13 equino) e endógenos (β-actina e GAPDH equina) utilizados na reação
de qPCR. O número de acesso corresponde a sequência do RNAm para os
respectivos genes no banco de dados do NCBI.
Nº acesso NCBI Nome do primer Sequência gênica (5'->3') Produto
(pb)
NM_001081847.2 MMP1 Foward GAACACACACCTGACCTACAG 108
MMP1 Reverse GGTGAGACATTACTCCAGAGTTG
XM_005611538.2 (x1) e MMP8 Foward CCTTTCCAGTACCTCCTGAATC 121
XM_001498836.3 (x2) MMP8 Reverse CTAGTGCTGTTCTTCCTTGC
NM_001081804.1 MMP13 Foward GGAGATGAAGACCCGAACCC 207
MMP13 Reverse GGCAGCATCAATACGGTTGG
NM_001081838.1 β-actina Foward GCACCACACCTTCTACAACG 113
β-actina Reverse ACATGATCTGGGTCATCTTC
NM_001163856.1 GAPDH Foward ACATCATCCCTGCTTCTACTG 180
GAPDH Reverse CCTGCTTCACCACCTTCTTG
4.4.4 Avaliação dos conjuntos de primers por PCR convencional e

sequenciamento Sanger
Os conjuntos de primers utilizados foram avaliados, quanto sua

especificidade, pela técnica de PCR convencional onde foram utilizados 2µL de
cDNA, 400nM de primer foward e reverse, 10µL de GoTaq® Master Mixes10 e
H2O NF qsp para 25µL de volume final para reação. Após, foi utilizado 10µL do
produto da reação, onde as amostras amplificadas foram analisadas por
eletroforese11 gel de agarose 1,5% corado com GelRedTM12 quanto ao
posicionamento das bandas e comparados com um marcador de peso
molecular13. As amostras amplificadas foram purificadas com um kit comercial 14,
segundo recomendações do fabricante, e após 10µL de produto de PCR
purificado juntamente com 5µL de cada respectivo iniciador (foward e reverse)
foram submetidos ao sequenciamento usando kit comercial 15 e o sequenciador
ABI 3500 Genetic Analyzer 16. Após o sequenciamento, o controle de qualidade
10
Gotaq® PCR Master Mix - Promega Corporation, Madison, WI 53711 USA.
11
Major Science, Saratoga, CA, USA.
12
Biotium, Halward, CA, USA.
13
Mini Sizer 50BP DNA Ladder – NORGEN Biotek Corp. Thorold, ON, Canada.
14
NucleoSpin® Gel and PCR clean-up - Macherey-Nagel®, Duren, Alemanha.
15
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit - Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA.
16
ABI 3500 Applied Biosystems - Foster City, Califórnia, EUA.
27
das sequencias e dos eletroferogramas obtidos foi realizado utilizando o software

MEGA-X 1.0117.
4.4.5 Análise especificidade e concentração dos primers e eficiência da

reação qPCR
Mesmo após ter sido realizada a análise de especificidade dos

iniciadores pelas técnicas de PCR convencional e sequenciamento Sanger, os
primers foram testados quanto a sua especificidade e concentração ideal para a
reação no equipamento de qPCR, onde a concentração que produziu uma curva
de dissociação (melting) com pico único foi utilizada nas reações de expressão
gênica. A curva de dissociação consiste em aumentar a temperatura de forma a
quebrar as pontes de hidrogênio que ligam as duas fitas do cDNA e liberar o
fluoróforo responsável pelo sinal de fluorescência, diminuindo este sinal à
medida que aumenta a temperatura. Assim, quando se observa somente um pico
de fluorescência em determinada temperatura significa que o primer amplificou
um produto específico.
Para determinar a concentração ideal de cada conjunto de primers foram
realizadas reações de qPCR utilizando 02 µL de cDNA produzido a partir de RNA
total extraído da pele de um equino (sob as mesmas condições de colheita e
extração supracitadas), concentração de cada iniciador que variou de 100 nM
até 400 nM, 10 µL do master mix da enzima de qPCR e H2O NF qsp para 20 µL
de volume final para reação. Foi escolhida a concentração que produziu menor
sinal inespecífico na curva de dissociação.
Uma vez escolhida a melhor concentração para os conjuntos de primers
foi realizada a análise da eficiência da reação de qPCR, para cada gene foi
utilizado uma diluição seriada (10 x) de 10-0 até 10-5 de cDNA construído a partir
de RNA extraído de uma amostra de pele inflamada de equino para construção
de curvas padrão a partir de: 02µL de cDNA (cada diluição); 300nM de primers
foward e reverse do gene alvo MMP1 e dos genes endógenos β-actina e
GAPDH; 400nM de cada iniciador (foward e reverse) para os genes alvos MMP8
e MMP13; 10µL de Gotaq® qPCR master mix19 e H2O NF qsp para 20µL de
17
MEGA - Molecular Evolutionary Genetics Analysis. Institute of Molecular Evolutionary Genetics
The Pennsylvania State University University Park, PA 16802 USA.
28
volume final para reação. Para todos os alvos e cada diluição utilizou-se três
replicas técnicas. As condições das reações foram: 95ºC por 10 minutos para
desnaturação inicial seguido de 40 ciclos de: 95ºC por 15 segundos, 60ºC
durante 60 segundos para amplificação, seguido da curva de dissociação.
4.4.6 Reação de PCR quantitativo em tempo real (qPCR)
A expressão gênica das colagenases foi realizada utilizando o método

de quantificação relativa, onde foi utilizado o ∆cT (cTgene alvo – cTgene endógeno) das
amostras de dorso no M0 como referência para se obter o ∆∆cT utilizado na
equação 2-ΔΔCt (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001).
A escolha do gene endógeno (normalizador ou housekeeping) foi
realizada com base no método 2-cT (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001), o coeficiente
de variação, para cada momento, foi a medida utilizada na escolha do gene
endógeno mais adequado para o cálculo do ∆cT, ou seja, o que sofreu menor
variação ao longo do período de tratamento (restrição/exposição à radiação
solar). As amostras foram analisadas em três réplicas técnicas em placas de 96
poços no equipamento 7500 FAST Real Time System18 e foi utilizado kit
comercial Gotaq® qPCR Master Mix19.
Para cada animal, foram construídas duas placas (uma para cada região
– dorso/ventre) contendo todos os três genes alvos e os dois endógenos, em
todos os momentos, além disso foi adicionado em cada placa um controle
negativo (no template) para cada gene e um controle positivo (cDNA utilizado
nas curvas padrão de eficiência) para avaliar a variação interplacas.
4.5 Análise estatística
Na análise da concentração de RNA total e qualidade (relações de

absorbâncias 260/280 e 260/230) de todas as amostras foi utilizado teste T de
Stundent para identificar diferença entres os grupos afetado e controle.
Para a escolha do gene normalizador, as médias dos valores dos CV´s
dos valores de 2-cT, de cada momento, para ambos os genes endógenos (β-
18
Applied BiosystemsTM - California 94404, USA.
19
Gotaq® qPCR Master Mix - Promega Corporation, Madison, WI 53711 USA.
29
actina e GAPDH), foram comparados utilizando teste dos postos sinalizados de

Wilcoxon.
Os dados referentes a radiação solar nos momentos M3 e M4, foram
submetidos a análise de variância - ANOVA e teste a posteriori de Tukey.
Segundo Yuan e colaboradores (2006) para se avaliar as diferenças de
expressão gênica, das três colagenases, foram utilizados os seguintes testes
estatísticos: entre os momentos estudados, em cada região dentro de cada
grupo foi utilizado ANOVA de medidas repetidas e Tukey a posteriori;
comparações entre regiões (dorso e ventre) dentro de cada grupo, ao longo do
período experimental, foi utilizado ANOVA e teste de múltiplas comparações de
Sidák; diferenças entre grupos, tanto amostras de dorso quanto de ventre, foram
avaliadas com teste T de Stundent para amostras independentes.
Todas as análises foram realizadas no software estatístico GraphPad
Prism 7.0020 e as medidas de tendência central e dispersão apresentadas em
tabelas e gráficos boxplots, as diferenças foram consideradas significativas
quando P<0,05 e demonstradas nos gráficos.
5 RESULTADOS
5.1 Tratamento dos grupos: restrição e exposição à radiação solar.
Foi possível manter os 12 animais em baias individuais sem qualquer

incidência de radiação solar durante o período proposto, sem prejuízo a saúde
dos animais, exceto um animal do grupo afetado e um do grupo controle, que
tiveram discreto edema de membros na altura dos metatarsianos. Ambos os
animais foram submetidos a passeios diários de 5 a 10 minutos no corredor
central do grupo de baias de experimentação ou do lado de fora no período
noturno, o que foi suficiente para normalização do retorno venoso e
desaparecimento dos sinais de edema.
Com fechamento total das aberturas nas janelas e portas do prédio das
baias de experimentação (Figuras 5-A e 5-B), foi possível reduzir a incidência de
radiação solar a níveis não detectáveis pelo equipamento de aferição, conforme
20
GraphPad Prism® 7.00 - GraphPad Software, Inc. San Diego, CA 92108, USA.
30
demonstrado na Figura 5-D, e manter o ambiente com uma temperatura e

umidade consideradas como adequadas (Figura 5-C), pois, durante todo o
período de restrição dos animais, as baias de experimentação eram limpas de
duas a três vezes ao dia, a cama resposta diariamente e nenhum odor ou
sensação de desconforto térmico foi considerado inadequado pelas pessoas que
fizeram o manejo dos animais.
No segundo dia da fase de exposição (após M3) o animal n°05, do GA,
sofreu um acidente no piquete, desta forma necessitou de cuidados veterinários
e precisou ser retirado do experimento. Afim de manter a amostragem
balanceada entre os grupos, optou-se por não analisar as amostras do animal
nº05 até o momento em que participou do experimento, bem como o animal n°06
do GC, pois o mesmo era o controle do equino n°05 do GA.
Com o equipamento portátil de aferição da radiação, foi possível
demonstrar a diferença significativa (P<0,05) na quantidade de radiação solar, a
qual as regiões de dorso e ventre dos animais é exposta (Figura 6), sendo que
região dorsal no GA recebeu oito vezes mais radiação que a região ventral
(P<0,05) em M3 e 11 vezes mais (P<0,01) em M4. No GC também houve
exposição oito vezes maior da região dorsal em M3 (p<0,05) e 10 vezes maior
em M4 (P<0,001) (Figura 7).
Com a técnica de biópsia incisional de pele foi possível extrair fragmento
com todas as camadas (epiderme até o extrato basal da derme) para que análise
pudesse ser mais homogênea possível.
Durante a fase de restrição houveram deiscências de sutura das biópsias
em dois animais, um do grupo controle, macho na região ventral em M0, outro
do grupo afetado, fêmea, na região ventral em M1. Já na fase de exposição solar,
onde os animais se encontravam em piquetes de terra, ocorreram deiscências
em suturas das biopsias de M2 e M3 de quatro animais do GC, em dois destes
ocorreram deiscências em suturas de biópsias do M4. Nenhuma das suturas
apresentaram qualquer tipo de supuração.
31
Figura 5. Baias de experimentação durante a fase de restrição à luz solar. Em A

e B um animal controle e um afetado, respectivamente, em C termômetro
demonstrando temperatura dentro do conjunto de baias de experimentação, em
D aferição da radiação solar.
Figura 6. Aferição da radiação solar na região de dorso (A) e ventre (B)

de um equino afetado por HERDA, a direção da fotocélula do
equipamento está indicada nas setas brancas. Notar, nas imagens de
zoom do equipamento, a diferença de aproximadamente oito vezes entre
a incidência de radiação solar na região dorsal e ventral de um equino
adulto.
32
Figura 7. Boxplots demonstrando as diferenças entre exposição solar

da região dorsal e ventral do GA e GC em M3 e M4. Letras diferentes
acima dos diagramas indicam diferenças estatísticas (P<0,05).
5.2 Análise da expressão gênica pela técnica de qPCR
5.2.1 Concentração e qualidade do RNA total das amostras
Com a padronização da fragmentação e pesagem das amostras de pele

foi possível obter amostras com concentrações de RNA total que não diferiram
estatisticamente entre os grupos (P>0,05), além disto a qualidade do RNA total
em ambos os grupos se manteve dentro do considerado como ideal (relação
absorbância 1,8-2,2) e também não diferiram (P>0,05) entre os grupos (Figura
8).
Amostra utilizada nos testes dos conjuntos de primers, bem como na
construção das curvas de eficiência foi submetida a análise de RIM (RNA
integrity number) e foi considerada como íntegra, pois possuía score 8,2 (Figura
9). Segundo o fabricante do kit utilizado, é considerado com integridade
adequada amostras com score >7,0.
33
Essa análise de integridade do RNA é imprescindível para minimizar os

problemas na padronização das reações de transcriptase reversa e de qPCR,
pois amostras com baixo grau de qualidade do RNA podem levar a
subquantificação do RNAm.
Figura 8. Boxplot demonstrando a variação da concentração de RNA

total bem como a pureza pela análise da absorbância relativa das
amostras de pele de equinos do grupo afetado (GA) e grupo controle
(GC).
Figura 9. Eletroferograma demonstrando integridade do RNA

da amostra padrão pelo RNA Integrity Number (RIM) realizado
no equipamento de eletroforese capilar 2100 Bioanalyzer.
34
5.2.2 Curvas padrão e análise da eficiência da reação de qPCR e análise de

variação do gene endógeno utilizado como normalizador
As eficiências das reações foram obtidas através da análise no

equipamento 7500 FAST Real Time System (Applied BiosystemsTM) conforme
descrito na Tabela 3 e demonstrados nas Figuras 10 e 11, onde os valores de
cT das triplicatas de cada diluição foram utilizadas no cálculo da eficiência. Para
o cálculo da eficiência foi utilizada a equação E=10 (-1/slope), onde E corresponde
à eficiência e “slope” corresponde ao coeficiente de angulação da curva. Para
cada sequência de primers o programa criou um gráfico (standart curve) onde o
valor do slope foi utilizado para determinar a eficiência dos primers para cada
gene de interesse. O gráfico da eficiência foi construído com base no valor
logaritmo das diluições seriadas (eixo X), e pelos valores da média de Ct (eixo
Y). Já a curva de dissociação consiste na monitorização da fluorescência das
amostras em relação ao aumento de temperatura. A fluorescência decresce com
o aumento da temperatura e as pontes de hidrogênio que mantem as duplas fitas
unidas se rompem, o SYBR-Green é liberado. A fluorescência só é emitida
quando o DNA está em dupla fita, assim, quando observamos um único pico de
fluorescência em determinada temperatura significa que o conjunto de primers
amplificou um produto especifico.
Tabela 3. Valores de Slope, coeficiente de correlação (R2) e eficiência de reação

para cada um dos genes alvo e endógenos
Gene Slope R2 Eficiência (%)

MMP1 -3,443 0,99 95,195
MMP8 -3,444 0,99 95,154
MMP13 -3,333 0,99 99,523
β-ACTINA -3,434 0,99 95,511
GAPDH -3,436 0,99 95,45
35

amplificação das diluições seriadas. Em A, B gráficos são referentes aos
genes alvos MMP1 e MMP8, respectivamente.
36

amplificação das diluições seriadas. Em A e B os gráficos são referentes
aos genes alvo MMP13 e endógeno β-actina, respectivamente.
37
Não houve diferença estatística (P>0,05) na comparação entre os CV

médios dos genes endógenos, conforme demonstrado na Figura 12, ambos
apresentaram mesma variação ao longo do período experimental, dessa forma
optou-se pelo gene da β-actina equina como normalizador endógeno.
Figura 12. Boxplots demonstrando medidas de

tendência central e dispersão dos coeficientes de
variação dos Cts entre os momentos
experimentais dos genes endógenos β-actina e
GAPDH, sem diferença estatística (P>0,05).
5.3 Expressão gênica relativa das Metaloproteinases MMP1, MMP8 e

MMP13 da pele de dorso e ventre de equinos afetados (HERDA) e normais
Os valores individuais e as medidas de tendência central e dispersão da

expressão de cada colagenase, bem como as diferenças estatísticas da
expressão calculada, em cada comparação, estão representadas em tabelas e
gráficos Boxplots nas figuras inseridas imediatamente após as respectivas
tabelas.
38
5.3.1 MMP1
Conforme os valores descritos na Tabela 4 e 6 e as diferenças

estatísticas demonstradas na Figura 13-A e C, comparando os momentos
experimentais tendo o M0 como normalizador, não houve diferença estatística
(P>0.05) da expressão de MMP1 na pele de dorso de ambos os grupos até o
primeiro dia de exposição à radiação solar (M3). No GA a expressão de dorso
aumentou aproximadamente 50 vezes no 3⁰ dia (M4) de exposição à radiação
solar quando comparado ao 30° dia (M2) do período de restrição (P<0.05),
diminuindo significativamente à níveis basais no 15⁰ dia de restrição (Figura 13-
A). No GC a expressão de MMP1 na pele do dorso foi 13 vezes maior no 3° dia
(M4) de exposição ao sol quando comparado aos dois momentos do período de
restrição (P>0,05), diminuindo a níveis basais em M5 (P<0,05) (Figura 13-C). Foi
observado aumento significativo da expressão de MMP1 no ventre dos animais
do GA em M5 em relação ao período de pré restrição e também da primeira
semana de restrição (Tabela 5 e Figura 13-B). Nas amostras de ventre do GC
não foram observadas diferenças estatísticas ao longo do período experimental
conforme valores da Tabela 7 demonstrados na Figura 13-D.
Quando comparada a expressão de MMP1 das amostras de pele das
regiões de dorso e do ventre de ambos os grupos (Tabelas 8 e 9), observou-se
que no M4 a expressão de MMP1 na pele do dorso foi significativamente maior
(P<0,05) que na pele ventral (Figura 14), sendo que no GA foi 20 vezes maior
(Tabela 8), enquanto que no GC foi sete vezes mais expressa (Tabela 9).
Quando comparadas as diferenças entre os grupos experimentais, notou-se que
em M4 pele de dorso dos animais do GA sofreu maior influência da radiação
solar que a pele dorsal dos animais do GC (Tabelas 10 e 11), pois a expressão
de MMP1 foi quase duas vezes maior na pele de dorso do GA em relação ao GC
(P<0,05), conforme demonstrado na Figura 15-A.
Deste modo observou-se que a radiação solar teve influência na
expressão gênica de MMP1, com maiores níveis de expressão no 3º dia de
exposição solar, após trinta dias de restrição, nas amostras de dorso de ambos
os grupos experimentais e até o 15° dia de exposição nas amostras de ventre
do GA. Também se evidenciou que a pele do dorso dos animais do GA expressa
mais MMP1 quando expostos ao sol do que animais normais.
39
Tabela 4. Expressão gênica de MMP1 das amostras de dorso do GA, ao longo

do período experimental. Na parte superior da tabela estão descritos os valores
individuais e abaixo estão as médias ± desvios padrão (DP) da expressão
relativa calculada pela equação 2-(∆∆cT), segundo LIVAK & SCHMITTGEN (2001).
A expressão de M0 foi considerada como controle e recebeu o valor relativo de
1,0 e todos os demais foram calculados proporcionalmente.
Momentos M0 M1 M2 M3 M4 M5
1,0 3,67 1,02 28,42 149,23 3,48
1,0 0,48 0,33 2,51 16,56 1,31
2-(∆∆cT)
1,0 2,12 0,1 15,21 63,4 1,89
(valores individuais)
1,0 0,7 0,57 3,4 14,64 0,97
1,0 8,79 9,01 1,29 29,48 4,52
Média 1,0a 3,152a 2,206a 10,17a 54,66b 2,434a
DP 0 3,40 3,81 11,64 56,36 1,51
_____________________
ab
Letras sobrescritas nas médias representam diferenças estatísticas entre os momentos
(P<0,05).
Tabela 5. Expressão gênica de MMP1 das amostras de ventre do GA, ao longo

1,0 0,107 0,078 3,785 0,973 3,189
1,0 0,673 2,428 19,534 1,187 4,785
2-(∆∆cT)
1,0 0,321 3,562 7,107 0,722 2,333
1,0 0,45 1,541 0,319 1,381 1,497
1,0 0,189 15,415 0,763 3,453 4,884
Média 1,0a 0,348a 4,605ab 6,302ab 1,543ab 3,338b
DP 0 0,22 6,17 7,88 1,09 1,49
_____________________
ab
(P<0,05).
40
Tabela 6. Expressão gênica de MMP1 das amostras de dorso do GC, ao longo

1,0 0,11 0,055 0,526 7,175 2,713
1,0 2,905 0,813 2,047 13,887 1,986
2-(∆∆cT)
1,0 2,305 3,509 1,47 43,491 4,119
1,0 0,103 0,371 0,72 1,395 0,201
1,0 12,721 14,699 35,577 82,661 9,618
Média 1,0ab 3,629a 3,889a 8,068ab 29,72b 3,727a
DP 0 5,238 6,19 15,39 33,74 3,58
_____________________
ab
(P<0,05).
Tabela 7. Expressão gênica de MMP1 das amostras de ventre do GC, ao longo

1,0 3,334 5,031 5,751 7,51 23,111
1,0 2,91 1,382 9,871 4,006 12,199
2-(∆∆cT)
1,0 1,024 7,715 5,629 8,4 33,804
1,0 0,381 2,17 0,187 0,905 0,873
1,0 3,461 54,544 30,062 5,422 3,238
Média 1,0 2,222 14,17 10,3 5,249 14,65
DP 0 1,42 22,71 11,57 2,979 13,82
_____________________
ab
(P<0,05).
41
Figura 13. Boxplots demonstrando a variação da expressão gênica da MMP1

nas amostras de dorso (A, C) e ventre (B, D) dos grupos GA (A, B) e GC (C,
D). Letras diferentes acima dos diagramas indicam diferenças estatisticas
(P<0,05).
42
Tabela 8. Expressão gênica de MMP1 das amostras de dorso e ventre do GA, ao longo do período experimental. Na parte
superior da tabela estão descritos os valores individuais e abaixo estão as médias ± desvios padrão (DP) da expressão relativa
calculada pela equação 2-(∆∆cT), segundo LIVAK & SCHMITTGEN (2001).A expressão média de dorso foi considerada como
controle e recebeu o valor relativo de 1,0 e a do ventre calculada proporcionalmente.
Momento M0 M0 M1 M1 M2 M2 M3 M3 M4 M4 M5 M5
Região Dorso Ventre Dorso Ventre Dorso Ventre Dorso Ventre Dorso Ventre Dorso Ventre
1,0 15,143 1,0 0,442 1,0 1,16 1,0 2,017 1,0 0,099 1,0 13,886
1,0 0,175 1,0 0,245 1,0 1,308 1,0 1,366 1,0 0,013 1,0 0,639
2-(∆∆cT)
1,0 1,713 1,0 0,259 1,0 58,489 1,0 0,801 1,0 0,02 1,0 2,117
1,0 1,763 1,0 1,13 1,0 4,778 1,0 0,165 1,0 0,166 1,0 2,707
1,0 0,746 1,0 0,016 1,0 1,275 1,0 0,441 1,0 0,087 1,0 0,805
a b
Média 1,0 3,908 1,0 0,418 1,0 13,4 1,0 0,958 1,0 0,077 1,0 4,031
DP 0 6,31 0 0,42 0 25,25 0 0,74 0 0,062 0 5,57
_____________________
ab
Letras sobrescritas nas médias representam diferenças estatísticas entre as regiões, em cada momento (P<0,05).
43
Tabela 9. Expressão gênica de MMP1 das amostras de dorso e ventre do GC, ao longo do período experimental. Na parte
1,0 0,057 1,0 1,724 1,0 5,152 1,0 0,619 1,0 0,059 1,0 0,483
1,0 1,196 1,0 1,198 1,0 2,033 1,0 5,769 1,0 0,345 1,0 7,349
2-(∆∆cT)
1,0 0,484 1,0 0,215 1,0 1,064 1,0 1,853 1,0 0,093 1,0 3,971
1,0 0,574 1,0 2,132 1,0 3,353 1,0 0,149 1,0 0,372 1,0 2,49
1,0 1,097 1,0 0,299 1,0 4,07 1,0 0,927 1,0 0,072 1,0 0,369
Média 1,0 0,681 1,0 1,114 1,0 3,134 1,0 1,863 1,0a 0,1882b 1,0 2,932
DP 0 0,46 0 0,84 0 1,62 0 2,27 0 0,15 0 2,88
_____________________
ab
Letras sobrescritas nas médias representam diferenças estatísticas entre as regiões, em cada momento (P<0,05).
44

e a comparação entre dorso e ventre ao longo do período experimental,
sendo que em cada momento, as amostras de dorso foram consideradas
controles e as de ventre calculadas proporcionalmente. Asterisco em cima
dos diagramas demonstram diferenças significativas entre regiões no mesmo
momento (P<0,05).
45
Tabela 10. Expressão gênica de MMP1 das amostras de dorso do GA e GC, ao longo do período experimental. Na parte
calculada pela equação 2-(∆∆cT), segundo LIVAK & SCHMITTGEN (2001).A expressão média do GC recebeu o valor relativo de
1,0 e a do ventre calculada proporcionalmente, em cada momento.
Grupo GC GA GC GA GC GA GC GA GC GA GC GA
1,0 0,097 1,0 3,233 1,0 1,784 1,0 5,209 1,0 2,007 1,0 0,124
1,0 2,704 1,0 0,448 1,0 1,083 1,0 3,315 1,0 3,224 1,0 1,788
2-(∆∆cT)
1,0 0,871 1,0 0,802 1,0 0,026 1,0 9,009 1,0 1,269 1,0 0,399
1,0 0,143 1,0 0,975 1,0 0,218 1,0 0,673 1,0 1,495 1,0 0,691
1,0 5,039 1,0 3,483 1,0 3,089 1,0 0,183 1,0 1,797 1,0 2,369
Média 1,0 1,771 1,0 1,788 1,0 1,24 1,0 3,678 1,0a 1,958b 1,0 1,074
DP 0 2,11 0 1,44 0 1,25 0 3,61 0 0,76 0 0,96
_____________________
ab
Letras sobrescritas nas médias representam diferenças estatísticas entre os grupos, em cada momento (P<0,05).
46
Tabela 11. Expressão gênica de MMP1 das amostras de ventre do GA e GC, ao longo do período experimental. Na parte
1,0 25,785 1,0 0,83 1,0 0,402 1,0 16,971 1,0 3,339 1,0 3,558
1,0 0,397 1,0 0,092 1,0 0,697 1,0 0,785 1,0 0,117 1,0 0,156
2-(∆∆cT)
1,0 3,084 1,0 0,967 1,0 1,424 1,0 3,893 1,0 0,265 1,0 0,213
1,0 0,438 1,0 0,517 1,0 0,311 1,0 0,749 1,0 0,668 1,0 0,751
1,0 3,425 1,0 0,187 1,0 0,968 1,0 0,087 1,0 2,181 1,0 5,166
Média 1,0 6,626 1,0 0,518 1,0 0,760 1,0 4,497 1,0 1,314 1,0 1,969
DP 0 10,8 0 0,38 0 0,45 0 7,12 0 1,39 0 2,26
_____________________
Não houveram diferenças estatísticas entre os grupos, em nenhum dos momentos (P>0,05).
47

e a comparação entre os grupos, ao longo do período experimental. Em cada
momento, as amostras do GC receberam o valor relativo de 1,0 e as de ventre
foram calculadas proporcionalmente. Asterisco em cima dos diagramas
demonstram diferenças significativas entre os grupos no mesmo momento,
tanto na região dorsal (A) quanto na região ventral (B) (P<0,05).
48
5.3.2 MMP8
Não foram observadas diferenças estatísticas nas expressões de MMP8

da pele de dorso em nenhum dos grupos estudados (P>0,05), bem como na pele
do ventre do GC conforme demonstrado nos diagramas da Figura 16 (A,C e D,
respectivamente) talvez devido a dispersão no valores individuais, que é possível
observar nas tabelas 12, 14 e 15. Houve influência da radiação solar na
expressão desta colagenase nas amostras de pele do ventre do GA, pois houve
uma subexpressão nos primeiros 15 dias de restrição (M1) em relação ao M0
(P<0,05) e já no primeiro dia de exposição (M3) houve um aumento significativo
de cinco vezes (tabela 13) na quantidade de transcritos de MMP8 (P<0,05)
(Figura 16-B). Não foram observadas diferenças significativas nas expressões
de MMP8 entre a pele de dorso e ventre dentro de cada grupo (Figura 17), bem
como quando comparadas e expressão entre cada região de grupos diferentes
(Figura 18), conforme análises descritas nas tabelas 16-17 e 18-19,
respectivamente.
1,0 1,078 1,044 6,444 7,875 0,416
2-(∆∆cT) 1,0 0,795 1,256 0,406 2,659 0,662
(valores individuais) 1,0 0,209 0,06 0,179 0,489 0,44
1,0 0,031 1,116 0,232 0,719 0,515
1,0 1,802 1,195 3,974 18,388 3,31
Média 1,0 0,783 0,934 2,247 6,026 1,069
DP 0 0,71 0,49 2,84 7,52 1,25
_____________________
Não houveram diferenças estatísticas entre os momentos (P>0,05).
49
1,0 0,368 0,054 0,809 31,661 0,09
1,0 0,28 0,628 2,196 2,602 0,608
2-(∆∆cT) 1,0 0,085 0,194 1,521 1,126 0,545
1,0 0,206 0,969 3,145 0,427 2,04
1,0 0,386 2,431 6,441 1,304 2,959
Média 1,0ac 0,265b 0,855ab 2,822c 7,424abc
1,248abc
DP 0 0,12 0,95 2,19 13,57 1,20
_____________________
ab
(P<0,05).
1,0 2,531 0,806 1,084 0,154 0,076
1,0 0,916 1,196 3,437 5,372 2,686
2-(∆∆cT)
1,0 1,412 0,315 7,031 3,431 2,427
1,0 0,427 0,199 2,152 0,346 0,436
1,0 10,998 2,546 3,448 10,926 1,257
Média 1,0 3,257 1,012 3,43 4,046 1,376
DP 0 4,39 0,94 2,24 4,42 1,16
_____________________
50
Tabela 15. Expressão gênica de MMP8 das amostras de ventre do GC, ao longo
1,0 1,003 0,602 0,404 0,547 0,917
1,0 1,167 1,316 5,314 15,57 0,584
2-(∆∆cT)
1,0 0,494 0,095 1,319 1,722 1,662
1,0 0,706 2,082 6,292 0,635 1,009
1,0 1,382 0,411 1,648 3,922 0,294
Média 1,0 0,950 0,901 2,995 4,479 0,893
DP 0 0,35 0,79 2,62 6,34 0,51
_____________________
Figura 16. Boxplots demonstrando a variação na expressão gênica relativa de

MMP8 na pele das regiões de dorso (A, C) e de ventre (B, D) de equinos dos
grupos GA (A, B) e GC (C, D). Letras diferentes acima dos diagramas indicam
diferenças estatisticas (P<0,05).
51
1,0 5,289 1,0 1,807 1,0 0,276 1,0 0,664 1,0 21,265 1,0 1,14
1,0 1,62 1,0 0,571 1,0 0,811 1,0 8,768 1,0 1,585 1,0 1,489
2-(∆∆cT)
1,0 1,106 1,0 0,448 1,0 3,587 1,0 9,386 1,0 2,544 1,0 1,368
1,0 0,843 1,0 5,657 1,0 0,732 1,0 11,427 1,0 0,5 1,0 3,337
1,0 1,379 1,0 0,296 1,0 2,804 1,0 2,235 1,0 0,098 1,0 1,232
Média 1,0 2,047 1,0 1,756 1,0 1,642 1,0 6,496 1,0 5,198 1,0 1,713
DP 0 1,83 0 2,26 0 1,45 0 4,74 0 9,03 0 0,91
_____________________
Não houveram diferenças estatísticas entre as regiões, em cada momento (P>0,05).
52
1,0 0,825 1,0 0,327 1,0 0,616 1,0 0,307 1,0 2,926 1,0 9,929
1,0 1,969 1,0 2,51 1,0 2,166 1,0 3,045 1,0 5,708 1,0 0,428
2-(∆∆cT)
1,0 1,761 1,0 0,616 1,0 0,531 1,0 0,33 1,0 0,884 1,0 1,206
1,0 0,637 1,0 1,051 1,0 6,646 1,0 1,862 1,0 1,168 1,0 1,472
1,0 3,688 1,0 0,463 1,0 0,595 1,0 1,763 1,0 1,324 1,0 0,863
Média 1,0 1,776 1,0 0,993 1,0 2,111 1,0 1,461 1,0 2,402 1,0 2,78
DP 0 1,21 0 0,89 0 2,62 0 1,15 0 2,01 0 4,01
_____________________
Não houveram diferenças estatísticas entre as regiões, em cada momento (P>0,05).
53
Figura 17. Boxplots demonstrando a variação da expressão

gênica da MMP8 sem diferenças estatísticas entre dorso e ventre
dos grupos de animais afetados (A) e controle normais (B).
54
1,0 0,463 1,0 0,197 1,0 0,599 1,0 2,749 1,0 23,616 1,0 2,525
1,0 2,298 1,0 1,996 1,0 2,412 1,0 0,271 1,0 1,137 1,0 0,566
2-(∆∆cT)
1,0 8,461 1,0 1,253 1,0 1,61 1,0 0,216 1,0 1,207 1,0 1,535
1,0 1,251 1,0 0,09 1,0 7 1,0 0,135 1,0 2,6 1,0 1,477
1,0 0,965 1,0 0,158 1,0 0,453 1,0 1,112 1,0 1,624 1,0 2,541
Média 1,0 2,688 1,0 0,738 1,0 2,415 1,0 0,896 1,0 6,037 1,0 1,729
DP 0 3,29 0 0,85 0 2,68 0 1,10 0 9,84 0 0,82
_____________________
Não houveram diferenças estatísticas entre os grupos, em cada momento (P>0,05).
55
1,0 2,967 1,0 1,09 1,0 0,269 1,0 5,937 1,0 171,631 1,0 0,29
1,0 1,89 1,0 0,454 1,0 0,903 1,0 0,781 1,0 0,316 1,0 1,968
2-(∆∆cT)
1,0 5,312 1,0 0,911 1,0 10,868 1,0 6,127 1,0 3,472 1,0 1,741
1,0 1,656 1,0 0,484 1,0 0,771 1,0 0,828 1,0 1,112 1,0 3,346
1,0 0,361 1,0 0,101 1,0 2,134 1,0 1,41 1,0 0,12 1,0 3,628
Média 1,0 2,437 1,0 0,608 1,0 2,989 1,0 3,017 1,0 35,33 1,0 2,195
DP 0 1,85 0 0,39 0 4,45 0 2,76 0 76,21 0 1,34
_____________________
Não houveram diferenças estatísticas entre os grupos, em cada momento (P>0,05).
56

relativo de 1,0 e as de ventre foram calculadas proporcionalmente. Não
houveram diferenças significativas entre os grupos no mesmo
momento, tanto na região dorsal (A) quanto na região ventral (B)
(P>0,05).
57
5.3.3 MMP13
Conforme dados descritos nas tabelas 20 a 23, não houve a influência

da radiação solar na expressão gênica de MMP13 na pele dos animais
estudados, pois não foi observado diferença estatística (P>0,05) nas amostras
de dorso e ventre de ambos os grupos, ao longo do período experimental (Figura
19 19).
Nas tabelas 24 e 25 estão os dados de expressão das amostras de dorso
e ventre de ambos os grupos. Não houveram diferenças significativas (P>0,05)
na expressão gênica da MMP13 entre regiões em nenhum dos grupos estudados
(Figura 20).
Conforme dados descritos nas tabelas 26 e 27 e demonstrado na Figura
21, não foi observado diferença estatística (P>0,05) na expressão de MMP13
nas amostras de pele de dorso entre GA e GC, em nenhum dos momentos
experimentais.
1,0 3,187 1,282 0,851 1,878 0,742
1,0 1,266 1,61 0,992 1,12 1,059
2-(∆∆cT) 1,0 7,408 1,331 1,898 4,107 14,715
1,0 1,495 1,901 0,926 0,549 4,11
1,0 2,842 1,042 0,962 2,187 2,211
Média 1,0 3,24 1,433 1,126 1,968 4,567
DP 0 2,47 0,33 0,43 1,35 5,82
_____________________
Não houveram diferenças estatísticas da expressão média entre os momentos (P>0,05).
58
1,0 0,214 0,172 0,04 0,032 5,339
1,0 0,316 1,111 6,232 0,544 1,987
2-(∆∆cT)
1,0 0,421 8,555 0,06 0,018 0,247
1,0 0,198 5,477 0,252 0,175 0,169
1,0 1,09 2,512 0,618 1,12 26,285
Média 1,0 0,447 3,565 1,44 0,377 6,805
DP 0 0,37 3,45 2,68 0,46 11,09
_____________________
1,0 1,637 2,332 0,908 1,116 11,828
1,0 0,483 0,135 0,065 0,156 0,286
2-(∆∆cT) 1,0 18,217 2,919 2,901 9,413 2,945
1,0 0,655 0,022 0,081 0,044 0,092
1,0 0,748 1,107 2,251 1,734 1,349
Média 1,0 4,348 1,303 1,241 2,493 3,3
DP 0 7,76 1,29 1,28 3,93 4,9
_____________________
59

longo do período experimental. Na parte superior da tabela estão descritos os
valores individuais e abaixo estão as médias ± desvios padrão (DP) da
expressão relativa calculada pela equação 2-(∆∆cT), segundo LIVAK &
SCHMITTGEN (2001). A expressão de M0 foi considerada como controle e
recebeu o valor relativo de 1,0 e todos os demais foram calculados
proporcionalmente.
1,0 0,522 0,574 0,363 0,219 5,466
1,0 0,756 0,603 0,249 0,9 0,22
2-(∆∆cT)
1,0 11,791 7,645 16,092 12,762 10,538
1,0 1,785 0,014 0,158 0,21 1,002
1,0 0,454 0,782 1,342 2,215 5,434
Média 1,0 3,062 1,924 3,641 3,261 4,532
DP 0 4,99 3,21 6,97 5,37 4,14
_____________________

nas amostras de dorso (A, C) e ventre (B, D) dos grupos GA (A, B) e GC (C,
D). Não houveram diferenças significativas entre os momentos avaliados
(P>0,05) em nenhuma das regiões de ambos os grupos.
60
1,0 21,562 1,0 1,449 1,0 2,886 1,0 1,009 1,0 0,372 1,0 155,072
1,0 0,261 1,0 0,065 1,0 0,18 1,0 1,642 1,0 0,127 1,0 0,49
2-(∆∆cT)
1,0 8,711 1,0 0,495 1,0 55,978 1,0 0,275 1,0 0,038 1,0 0,146
1,0 2,925 1,0 0,387 1,0 8,425 1,0 0,797 1,0 0,934 1,0 0,12
1,0 0,341 1,0 0,131 1,0 0,823 1,0 0,219 1,0 0,175 1,0 4,058
Média 1,0 6,76 1,0 0,505 1,0 13,66 1,0 0,788 1,0 0,329 1,0 31,98
DP 0 8,95 0 0,55 0 23,88 0 0,58 0 0,35 0 68,83
_____________________
Não houveram diferenças estatísticas na expressão média entre as regiões, em cada momento (P>0,05).
61
1,0 2,011 1,0 0,641 1,0 0,495 1,0 0,804 1,0 0,395 1,0 0,929
1,0 0,437 1,0 0,684 1,0 1,957 1,0 1,68 1,0 2,522 1,0 0,337
2-(∆∆cT)
1,0 0,3 1,0 0,194 1,0 0,787 1,0 1,667 1,0 0,407 1,0 1,075
1,0 0,589 1,0 1,605 1,0 0,361 1,0 1,15 1,0 2,799 1,0 6,397
1,0 1,904 1,0 1,154 1,0 1,345 1,0 1,135 1,0 2,432 1,0 7,667
Média 1,0 1,048 1,0 0,855 1,0 0,989 1,0 1,287 1,0 1,711 1,0 3,281
DP 0 0,83 0 0,53 0 0,66 0 0,37 0 1,20 0 3,46
_____________________
Não houveram diferenças estatísticas na expressão média entre as regiões, em cada momento (P>0,05).
62
Figura 20. Boxplots demonstrando a variação da expressão

gênica da MMP13 nas amostras de dorso e ventre do GA (A) e
GC (B). não houveram diferenças estatísticas em nenhum dos
grupos estudados (P>0,05).
63
calculada pela equação 2-(∆∆cT), segundo LIVAK & SCHMITTGEN (2001). A expressão média do GC recebeu o valor relativo de
1,0 0,895 1,0 1,742 1,0 0,492 1,0 0,838 1,0 1,505 1,0 0,056
1,0 0,451 1,0 1,183 1,0 5,4 1,0 6,903 1,0 3,24 1,0 1,673
2-(∆∆cT)
1,0 0,605 1,0 0,246 1,0 0,276 1,0 0,396 1,0 0,264 1,0 3,024
1,0 0,143 1,0 0,327 1,0 12,122 1,0 1,646 1,0 1,779 1,0 6,385
1,0 1,507 1,0 5,727 1,0 1,419 1,0 0,644 1,0 1,902 1,0 2,47
Média 1,0 0,720 1,0 1,845 1,0 3,942 1,0 2,085 1,0 1,738 1,0 2,722
DP 0 0,51 0 2,25 0 5,01 0 2,73 0 1,06 0 2,33
_____________________
Não houveram diferenças estatísticas na expressão média entre os grupos, em cada momento (P>0,05).
64
1,0 9,591 1,0 3,94 1,0 2,868 1,0 1,053 1,0 1,416 1,0 9,369
1,0 0,27 1,0 0,113 1,0 0,498 1,0 6,746 1,0 0,163 1,0 2,433
2-(∆∆cT)
1,0 17,544 1,0 0,626 1,0 19,631 1,0 0,065 1,0 0,025 1,0 0,411
1,0 0,712 1,0 0,079 1,0 283,005 1,0 1,14 1,0 0,593 1,0 0,12
1,0 0,27 1,0 0,649 1,0 0,868 1,0 0,124 1,0 0,137 1,0 1,308
Média 1,0 5,677 1,0 1,081 1,0 61,37 1,0 1,826 1,0 0,466 1,0 2,728
DP 0 7,73 0 1,62 0 124,1 0 2,79 0 0,57 0 3,82
_____________________
Não houveram diferenças estatísticas na expressão média entre os grupos, em cada momento (P>0,05).
65
Figura 21. Boxplots demonstrando a comparação da expressão gênica

da MMP13 na pele de dorso e ventre (A e B, respectivamente) entre os
grupos GA e GC ao longo do período experimental. Não houveram
diferenças estatísticas entre os grupos em nenhuma das regiões
avaliadas (P>0,05). Em B, o valor de P acima dos diagramas do M4,
indica tendência a diferença estatística entre grupos (P=0,057).
66
6. DISCUSSÃO
A qPCR é uma excelente ferramenta para se analisar diferenças de

expressão genica, pois é altamente sensível e específica (BUSTIN et al., 2005),
todavia necessita de uma série de cuidados para a normalização dos resultados
afim de se evitar erros de interpretação, como por exemplo a escolha do gene
normalizador, ou gene endógeno. Preferencialmente o gene ou genes
endógenos escolhidos para normalização devem ser aqueles que que foram
expressos constitutivamente sem sofrer influência do tratamento experimental
realizado (KUBISTA et al., 2006; SMITS et al., 2009). Corroborando com estes
pesquisadores, neste estudo observamos que ambos os genes endógenos
permaneceram estáveis durante os tratamentos, pois não houve diferença
estatística (P<0,05) entre o coeficiente de variação dos genes endógenos B-
actina e GAPDH equina ao longo do período experimental, o mesmo foi
observado por pesquisadores que investigaram a estabilidade de genes
candidatos a serem utilizados como genes normalizadores em pesquisas de
expressão genica em blastocistos de equinos (SMITS et al., 2009), todavia,
outros observaram melhor estabilidade do gene B-actina em linfócitos de cavalos
submetidos a estresse de enduro (CAPPELLI et al., 2008).
Não foi encontrado, na literatura consultada, trabalhos que tenham
demostrado a influência da radiação solar na estabilidade de genes endógenos
(B-actina ou GAPDH) na pele de equinos, embora não seja o objetivo deste
trabalho fazer tal análise, optou-se por utilizar a B-actina como gene
normalizador, pois corroborando com as observações aqui realizadas, já foi
demostrado que a B-actina é um gene estável, tanto na pele de equinos normais
quanto animais com doença de pele (BOGAERT et al., 2006).
A radiação solar interferiu diretamente na expressão gênica de
Metaloproteinases de Matriz na pele de equinos do grupo afetado e também
grupo controle, pois houve aumento da expressão de MMP1 e também da MMP8
(P<0,05) na fase de exposição ao sol, após um período de 30 dias protegidos da
radiação solar, sendo que os picos de expressão foram, respectivamente, em
M4 e M3. O mesmo não foi observado na expressão de MMP13, todavia, houve
uma tendência a subexpressão na pele do ventre do GA em relação ao GC, pois
67
o GA expressou quatro vezes menos MMP13 no M4 em relação a pele ventral

do GC, todavia sem diferença significativa (P>0,05).
Neste estudo, utilizamos amostras que continham tecido de epiderme e
derme de equinos, foi observado influência da radiação solar na regulação da
expressão de MMP1, corroborando com os achados de Fisher et al. (1996),
Lahmann et al. (2001) e Brennan et al. (2003), pois da mesma forma que a
radiação solar simulada interfere na expressão de MMP´s na pele de humanos,
a radiação solar natural interfere na expressão de MMP´s na pele de equinos in
vivo, o que sugere um padrão de degradoma cutâneo semelhante entres estas
espécies e que o processo de degradação da matriz extracelular dérmica pode
ocorrer em equinos em um processo semelhante ao fotoenvelhecimento cutâneo
em humanos, ocasionado pela radiação solar (LAHMANN et al., 2001).
Em outro estudo, pesquisadores observando a atividade enzimática de
MMP1 e MMP8 na pele de humanos irradiada com UV, verificaram maior
quantidade relativa de mRNA e proforma proteica de MMP1 em amostras
irradiadas com 2 MED de UV até 24 horas pós tratamento, além disto, apesar de
não detectarem expressão gênica de MMP8, observaram, em testes de
imunofluorêscencia, um aumento na expressão proteica de uma proforma da
enzima em tecido com infiltração neutrofílica de quatro a oito horas pós radiação
UV na derme e até 24 horas pós radiação em epiderme (FISHER et al., 2001).
Neste trabalho observamos um comportamento da MMP8 que corrobora com
tais achado de Fisher e colaboradores (2001), pois a expressão gênica da MMP8
na pele ventral dos equinos do GA também variou ao longo do periodo de
exposição a radiação solar, o que é interessante, uma vez que esta enzima fica
contida em grânulos citoplasmáticos de neutrófilos, e esta célula normalmente
está presente, predominantemente, em tecidos inflamados (GUTIÉRREZ-
FERNÁNDEZ et al., 2007; SCHUBERT-UNKMEIR et al., 2010).
Brennan e colaboradores (2003) não obsevaram diferença na expressão
de MMP13 entre amostras de pele expostas a radiação e amostras controle não
expostas, o mesmo ocorreu neste estudo, pois não houveram diferenças
significativas (P>0,05) na expressão de MMP13 na pele da região dorsal e
ventral dos equinos de ambos os grupos, em nenhum dos momentos estudados.
Todavia, foi observado uma tendência a subexpressão desta MMP na pele do
ventre do GA em comparação ao GC no M4. Seguindo a comparação entre
68
grupos, a MMP1 também diferiu entre GA e GC no M4, sendo mais expressa na

pele de dorso do GA em relação ao GC. Embora pesquisadores já tenham
evidenciado um padrão de expressão oposto entre MMP1 e MMP13 (URÍA et al.,
1998) não podemos afirmar que esse padrão existiu neste trabalho, pois a
analise não alcançou o nivel de significancia de P<0,05. Além disto, na análise
seriada, ou seja ao longo do tempo, não observou-se diminuição significativa na
expressão de MMP13 no mesmo grupo de amostras em que foi observado
aumento da MMP1.
O fato de que a expressão de MMP1 na pele dorsal do GA ter sido maior
que no GC (P<0,05) no M4 pode ter ocorrido devido a conformação
ultraestrutural desorganizada, que torna a pele dos afetados mais fina e menos
densa (RASHMIR-RAVEN et al., 2015), e consequentemente, com uma maior
área de exposição de fibloblastos dérmicos à radiação solar, influenciando na
expressão gênica de colagenases, além de maior área de contato molecular para
atuação enzimática.
São necessários mais trabalhos, principalmente de expressão proteica e
de zimologia, para identificar, tanto o(s) extrato(s) celular(es) que pode(m) sofrer
uma mudança em seu metabolismo devido a influência da radiação solar, quanto
a atividade enzimática envolvida no processo de degradoma cutâneo em
equinos com HERDA, pois sabe-se que nem todo RNAm é traduzido em proteína
(LEPHART, 2017).
Segundo a literatura consultada, equinos afetados por HERDA devem
ser mantidos protegidos do sol para que ocorra melhora clínica e diminuição da
severidade das feridas cutâneas (RASHMIR-RAVEN, 2013), pois acredita-se
que a incidência de radiação solar pode contribuir para piora do quadro clinico
devido as lesões serem mais comuns na região dorsal, onde a incidência de
radiação e o calor são mais intensos, (BROUNTS; RASHMIR-RAVEN; BLACK,
2001; RASHMIR-RAVEN et al., 2004; WHITE et al., 2004). Concordando com
esses autores, ficou evidenciado aqui, que a radiação solar na região dorsal é
significativamente maior (P<0,001) que a região ventral, todavia a expressão
gênica das colagenases, aqui estudadas, durante o período de restrição
mantiveram-se em níveis basais, semelhantes ao M0, onde os animais estavam
em condições à campo, expostos ao sol, e mesmo tendo aumentando de
maneira significativa no período de exposição imediato, voltou a níveis basais
69
aos 15 dias de exposição. Desta forma, um manejo onde os animais afetados

ficariam sendo protegidos por um tempo e novamente expostos posteriormente,
pode gerar uma condição de reativação constante da expressão de enzimas que
atuam no degradoma cutâneo.
Desta forma, fica evidente que a região dorsal dos equinos recebe mais
radiação solar que a ventral e, apesar de parecer algo óbvio, não se tinham
dados que comprovassem cientificamente essa afirmação. Outra questão é que
animais que passam um longo período protegidos do sol, quando expostos
novamente, tem um estimulo ao aumento na expressão de colagenase cutânea,
e como ficou evidenciado neste trabalho que animais afetados tem essa
expressão aumentada em relação à animais normais, também foi possível
comprovar a maior susceptibilidade ao estimulo físico causado pela radiação
solar à expressão de colagenase intersticial dos animais afetados, conforme
sugerido por Rashmir-Raven e colaboradores (2015) que comprovaram a
susceptibilidade da pele dos animais afetados à ação de colagenase exógena,
em seus estudos. Ademais, os animais afetados devem ser então protegidos da
radiação solar, pelo menos nos períodos do dia de maior incidência de
temperatura e radiação solar.
70
7. CONCLUSÃO
A radiação solar influencia na expressão gênica da MMP1, na pele de

equinos com HERDA e animais normais, com pico de expressão às 72 horas de
exposição ao sol na pele do dorso, e no ventre aos 15 dias de exposição à
radiação solar natural, após um periodo de 30 dias de restrição total de luz solar.
A pele da região dorsal dos animais com HERDA é mais suscetível a
ação da radiação solar, na expressão de colagenase cutânea, do que animais
normais, sendo indicado um manejo que permita a proteção desses animais aos
periodos de mair incidencia de radiação solar.
71
8 REFERÊNCIAS
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82
9 ARTIGO CIENTÍFICO
Trabalho a ser enviado para a revista " Veterinary Dermatology ", cujas
normas estão no ANEXO 1.

83
INFLUÊNCIA DA RADIAÇÃO SOLAR NA EXPRESSÃO GÊNICA DA

MMPP1, MMP8 E MMP13 NA PELE DE CAVALOS COM ASTENIA DÉRMICA
REGIONAL HEREDITÁRIA EQUINA (HERDA)
RESUMO
Introdução: Astenia cutânea regional hereditária equina é uma afecção genética,
autossômica recessiva em cavalos da raça quarto de milha, caracterizada por
animais de pele frágil, hiperextensivel que lacera facilmente, os animais
apresentam feridas cutâneas, principalmente na região dorsal do corpo. É
causada por uma mutação no gene que codifica a Ciclofilina B, ocasionando
anormalidades na síntese de colágeno nos animais afetados.
Hipótese/objetivo: A derme dos animais afetados é mais sensível a ação de

colagenases e podem ter uma atividade aumentada quando expostos a radiação
solar o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da radiação solar na
expressão gênica de colagenases pele de equinos afetados e comparar com
animais normais.
Animais: Foram utilizados seis equinos no grupo afetados (GA), positivos no

teste molecular para HERDA, e seis equinos normais para o grupo controle (GC),
ambos os grupos com idade, porte e cor de pelagens semelhantes.
Métodos: Todos os animais viviam em condições à campo e foram submetidos

a restrição de radiação solar e posteriormente expostos ao sol novamente.
Foram colhidas amostras de pele por biópsias incisionais da região torácica
dorsal e ventral de todos os animais em seis momentos: M0, antes da fase de
restrição à luz solar; M1, 15 dias de restrição ao sol; M2, 30 dias de restrição ao
sol; M3, final do 1º dia de exposição ao sol; M4, 3º dia de exposição; M5, 15º dia
de exposição. A expressão gênica relativa foi realizada através de qPCR em
tempo real.
Resultados: No M4 houve aumento significativo (P<0,05) da expressão de MMP1

na pele dorsal no GA e no GC e ventral no GC; aumento na expressão de MMP8
em ventre do GA e nenhuma mudança significativa na expressão gênica de
MMP13 em nenhum dos grupos. A pele de dorso expressou mais MMP1 que a
ventral em GA e GC e o dorso do GA apresentou quantidade maior de transcritos
de MMP1 que no dorso do GC.
Conclusão e importância clínica: Houve influência da radiação solar na

expressão de transcritos de colagenases na pele de equinos com HERDA e
normais. Todavia, houve maior expressão no dorso de animais afetados o que é
importante, pois comprova a hipótese inicial, aonde fica indicado que no manejo
dos animais acometidos deve-se evitar a exposição a radiação solar, pelo menos
nos períodos de maior incidência, além de demonstrar um padrão de degradoma
cutâneo semelhante aos humanos.
Palavras chave: HERDA, equinos, metaloproteinases de matriz, qPCR
84
INTRODUÇÃO
A Astenia cutânea regional dérmica hereditária (HERDA) é uma doença

genética de caráter autossômico recessivo em equinos da raça Quarto de Milha
(QM) (TRYON et al., 2005) e raças compostas pelo QM (WHITE et al., 2004;
TRYON; WHITE; BANNASCH, 2007). Caracteriza-se clinicamente por animais
com pele fina, frouxa e hiperextensível que lacera facilmente ao menor trauma
causando extensas cicatrizes, de difícil reparação, (SOLOMONS, 1984; WHITE
et al., 2004; BORGES et al., 2005).
A HERDA ocorre devido mutação no gene que codifica a Ciclofilina B
(CypB), uma proteína da famílias das peptidilprolil isomerases (PPI) responsável
pela estruturação da tripla hélice da molécula de colágeno (KOIDE; NAGATA,
2005) e portanto, ocasiona efeitos deletérios nesta proteína estrutural (TRYON;
WHITE; BANNASCH, 2007; ISHIKAWA et al., 2012; RASHMIR-RAVEN, 2013).
Além de comprometer a estrutura dérmica, os animais afetados podem
apresentar alterações oculares e na composição de tendões e ligamentos
(GRADY et al., 2009; MOCHAL et al., 2010; BOWSER et al., 2014; BADIAL et
al., 2015).
A denominação de astenia dérmica regional foi adotada devido uma
maior frequência das lesões na região dorsal (WHITE et al., 2004), todavia outros
trabalhos demonstram que, em animais afetados, a pele é mais fina e
hiperextensível com presença de lesões em quase todo o corpo (GRADY et al.,
2009; BADIAL et al., 2014). A maior ocorrência de feridas na região dorsal
também foi atribuída a uma maior exposição a luz solar desta região (RASHMIR-
RAVEN et al., 2004; GRADY et al., 2009; RASHMIR-RAVEN, 2013; RASHMIR-
RAVEN; SPIER, 2015). Esta hipótese foi baseada em pesquisas anteriores,
onde pesquisadores demostraram que a produção de colagenase induzida pela
radiação de raios ultravioleta (solar) resultou em degradação das fibras de
colágeno na pele de humanos (FISHER et al., 1996; FISHER et al., 1997;
BRENNEISEN et al., 2002).
As colagenases são enzimas conhecidas como Metaloproteinases de
Matriz (MMP), que constituem uma grande família de enzimas que tem a
finalidade de degradar vários componentes da matriz extracelular (MEC)
(NELSON; FINGLETON; ROTHENBERG, 2000; CAWSTON; WILSON, 2006).
85
São proteinases zinco/cálcio dependentes que tem fundamental importância na

degradação da MEC, tanto em processos fisiológicos quanto patológicos da
remodelação tecidual (STERNLICHT; WERB, 2001; MOTT; WERB, 2004).
Embora várias MMP’s estejam expressas na pele de mamíferos, apenas três tem
atividade colagenolítica (colagenases), a MMP1 (colagenase intersticial), MMP8
(colagenase neutrofílica) e MMP13 (colagenase 3), podendo degradar colágeno
fibrilar tipo I e III (BRENNAN et al., 2003).
Um trabalho mais recente demonstrou que a pele de cavalos com
HERDA é mais hiperextensível quando exposta a colagenase bacteriana do que
a pele de cavalos normais (RASHMIR-RAVEN et al., 2015). Tais achados deram
suporte a hipótese de que a microestrutura das fibras dos animais afetados provê
uma superfície de contato mais ampla para ação enzimática, devido a
desorganização histológica e estrutural (RASHMIR-RAVEN; HOPPER, R;
RYAN, 2004; WHITE et al., 2004; BADIAL et al., 2014).
Diante da hipótese que a pele de equinos acometidos por HERDA é mais
susceptível a ação de colagenase (RASHMIR-RAVEN et al., 2015) e que a
radiação solar pode aumentar a ação de MMP´s no colágeno dérmico, conforme
descrito em humanos (RITTIÉ; FISHER, 2002; BRENNAN et al., 2003), este
trabalho teve como objetivo realizar um estudo caso controle, casualizado, para
avaliar a influência da radiação solar na expressão gênica das colagenases
MMP1, MMP8 e MMP13 na pele de equinos afetados por HERDA de acordo com
o grau e exposição dos animais à radiação solar.
MATERIAIS E MÉTODOS
Animais e delineamento experimental
Esta pesquisa foi previamente aprovada pela Comissão de Ética no Uso de
Animais (CEUA) da FMVZ, UNESP – Campus de Botucatu sob o protocolo n°
0026/2017.
Foram utilizados 10 equinos da raça Quarto de Milha (QM), duas fêmeas
e oito machos, com peso médio de 331,4±51,3 Kg, divididos e dois grupos
experimentais: Grupo afetado (GA) contendo cinco animais (quatro machos e
uma fêmea) com peso médio de 333,17±53,49Kg, clinicamente afetados e
positivos para o teste genético ( TRYON; WHITE; BANNASCH, 2007); Grupo
Controle (GC) com cinco animais (quatro machos e uma fêmea) hígidos, não
86
afetados pesando em média 329,67±54,20Kg, com idade e cor da pelagem

relacionadas ao GA.
Os dois grupos de animais foram submetidos a uma fase de restrição e
posteriormente a uma fase de exposição à luz solar (Figura 1), todo o período do
experimento ocorreu entre os meses de dezembro/2017 e janeiro/2018. No
período de restrição, todos os animais foram mantidos em baias individuais,
protegidos integralmente da luz solar, durante 30 dias. Após o período de
restrição, todos os animais foram mantidos em piquetes abertos, aos pares
(afetado e normal), sem qualquer proteção contra radiação solar, em período
integral. Em todas as etapas, a radiação solar foi aferida com aparelho portátil
MES-100 (INSTRUTHERM Instrumentos de Medição Ltda. São Paulo – SP),
segundo as instruções do fabricante. Em ambas as etapas todos receberam feno
de gramínea Coast cross e água ad libidum, além de suplementação com
concentrado e sal mineral.
A colheita das amostras ocorreu em seis momentos, ao longo do período
de tratamento: M0, previamente a fase de restrição ao sol; M1, aos 15 dias de
restrição à radiação solar; M2, 30 dias de restrição à radiação solar; M3, ao fim
do primeiro dia de exposição à radiação solar; M4, final do terceiro dia de
exposição à radiação solar; M5, ao 15º dia de exposição solar (Figura 1).
Em M3 e M4 a radiação solar foi aferida no dorso e no ventre dos
animais, para observar a quantidade de radiação que cada região foi exposta.
87
Figura 1. Desenho experimental demonstrando os pontos determinados para

realização das biópsias em cada momento, o esquema de restrição e exposição
à radiação solar que os grupos de animais foram submetidos, além do esquema
de procedimentos para as análises em laboratório.
Colheita das amostras

Foram realizadas biopsias de pele de regiões do dorso e do ventre de
todos os animais, mantendo uma distância mínima de 15 cm entre os pontos de
biópsia nas seguintes regiões: paramediana à coluna vertebral, 10 cm da linha
média dorsal, das regiões da cernelha e 15ª vertebra torácica para amostras de
dorso; paramediana, cinco cm da linha média ventral, das regiões external,
umbilical e púbica. Foram determinadas essas regiões devido a espessura da
pele ter menor variância (BADIAL et al., 2014).
Foi utilizada biópsia incisional para colheita de pele íntegra (2cm X 1cm)
realizadas após sedação dos animais com cloridrato de detomidina (DormiunV®
88
- AGENER UNIÃO Saúde Animal - São Paulo, SP.) na dose de 0,02 mg.kg-1 IV
e anestesia local da pele com lidocaína 2%( Xylestesin®; Cristália, São Paulo,
SP ). Todas as amostras foram congeladas imediatamente pós colheita em
nitrogênio líquido e, em seguida, armazenadas a - 80 ºC para os testes
moleculares.
Extração RNA total e produção cDNA

Foram utilizados 50mg de pele contendo epiderme e derme, o tecido foi
fracionado e macerado em tubos plásticos com esferas de cerâmica Tissue
Grinding CKMix50-R (Bertin-technologies, Rockville, MD 20850, USA) em
homogeneizador automático Precellys® 24 (Bertin-technologies, Rockville, MD
20850, USA) à 6.500 RPM em três ciclos de 30 segundos de agitação com
intervalos de 30 segundos. Para as demais etapas de extração e purificação,
bem como tratamento com DNase, foi utilizado kit comercial SV total RNA
Isolation System (PROMEGA Corporation Madison, WI 53711-5399 USA),
segundo recomendações do fabricante.
Após a remoção do DNA genômico foi realizada a quantificação do RNA
de todas as amostras em espectrofotômetro NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher
ScientificTM; Wilmington, DE, USA) a 260nm, a relação 260/280nm foi utilizada
para avaliar a pureza e qualidade relativa das amostras (1,8 a 2,2). Uma amostra
de pele de um equino foi utilizada como padrão, tanto na fase de testes e
padronização das concentrações dos primers quanto na construção das curvas
padrão para análise da eficiência na reação de qPCR, o RNA extraído desta
amostra padrão foi analisada quanto a sua pureza no equipamento 2100
Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA 95051, USA).
Para a confecção do cDNA foi utilizado sistema de transcriptase reversa
ImProm-II™ (Reverse Transcription System - Promega Corporation. Madison, WI
53711-5399 USA), segundo recomendações do fabricante. Para tal, foram
utilizados 800ng de RNA total, 1,5µg de random primers e H2O livre de nucleases
(NF) qsp para 15 µL, esse mix foi submetido a incubação à 70ºC durante cinco
minutos e em seguida a 4ºC por mais cinco minutos. Para o preparo do mix da
enzima foram utilizados 12µL de tampão da enzima, 12µL de MgcL2, 3µL mix
dNTP´s, 1,5µL de RNAsin, 3µL de transcriptase reversa e H2O NF qsp para
volume de 45µL. O mix da enzima foi adicionado ao mix da amostra totalizando
89
um volume final para a reação de 60µL. A reação da transcriptase reversa

ocorreu em termociclador, sob as seguintes condições: Anelamento a 25ºC
durante 5 minutos, extensão à 42ºC durante 60 minutos, inativação da enzima à
85ºC durante 3 minutos e resfriamento à 4ºC. Em seguida os produtos da reação
foram armazenados à -20°C.
Expressão gênica de MMP1, MMP8 e MMP13 da pele de equinos
A expressão gênica relativa das colagenases e do gene endógeno da β-

actina equina da pele de equinos de ambos os grupos foi realizada pela técnica
de qPCR. A sequência genômica dos primers para os genes alvos (MMP1,
MMP8 e MMP13 equinos) e normalizador (β-actina) foram obtidas com auxílio
de ferramenta disponível na internet (www.ncbi.nlm.nih.gov) e as sequências dos
primers específicos para genes alvo e normalizador foram gerados por meio da
utilização da ferramenta online PRIMER-BLAST disponível na plataforma do
NCBI. As sequências dos iniciadores dos genes alvo e endógeno utilizados,
dispostos na Tabela 1, com tamanho entre 20 e 23 bases e temperatura de
hibridização entre 59 e 64ºC, e seus respectivos produtos com tamanhos entre
108 e 207 pares de bases (pb) ocupando posições exon-exon. A especificidade
de cada conjunto de primers, para ambos os genes, foi verificado com o auxílio
do programa BLAST disponível no website do NCBI.
Tabela 1. Sequência dos conjuntos de primers dos genes alvo (MMP1, MMP8 e
MMP13 equino) e endógeno (β-actina equina) utilizados na reação de qPCR. O
número de acesso corresponde a sequência do RNAm para os respectivos
genes no banco de dados do NCBI.
Nº acesso NCBI Nome do primer Sequência gênica (5'->3') Produto (pb)

MMP1 Foward GAACACACACCTGACCTACAG
NM_001081847.2 108
MMP1 Reverse GGTGAGACATTACTCCAGAGTTG
XM_005611538.2 (x1) e MMP8 Foward CCTTTCCAGTACCTCCTGAATC
121
XM_001498836.3 (x2) MMP8 Reverse CTAGTGCTGTTCTTCCTTGC
NM_001081804.1 MMP13 Foward GGAGATGAAGACCCGAACCC 207
MMP13 Reverse GGCAGCATCAATACGGTTGG
NM_001081838.1 β-actina Foward GCACCACACCTTCTACAACG
113
β-actina Reverse ACATGATCTGGGTCATCTTC
A expressão gênica das colagenases foi realizada utilizando o método

de quantificação relativa (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001), onde o gene da β-actina
90
equina foi utilizado como gene endógeno e o ∆cT das amostras de dorso no M0
como referência para se obter o ∆∆cT utilizado na equação 2-ΔΔCt. Todas as
amostras foram analisadas em triplicatas no equipamento 7500 FAST Real Time
System (Applied BiosystemsTM - California 94404, USA), em cada placa utilizou-
se amostra positiva (cDNA utilizado nas curvas padrão de eficiência) e um
controle negativo sem cDNA (no template) para cada conjunto de primers.
Para as reações de qPCR foi utilizado kit comercial Gotaq® qPCR Master
Mix (Promega Corporation, Madison, WI 53711 USA). Para tal, foram utilizados
02µL de cDNA, 300nM de primers foward e reverse do gene alvo MMP1 e
endógeno β-actina, 400nM de cada iniciador (foward e reverse) para os genes
alvos MMP8 e MMP13; 10µL de Gotaq® qPCR master mix e H2O NF qsp para
20µL de volume final para reação. As condições das reações foram: 95ºC por 10
minutos para desnaturação inicial seguido de 40 ciclos de: 95ºC por 15
segundos, 60ºC durante 60 segundos para amplificação, seguido da curva de
dissociação.
Análise estatística
Para avaliar as diferenças de concentração e de qualidade (relações de

absorbâncias 260/280 e 260/230) do RNA total das amostras entre os grupos
GA e GC, foi utilizado teste T de Stundent.
Os dados referentes a radiação solar nos momentos M3 e M4, após
passarem pelo teste de normalidade Shapiro-Wilk, foram submetidos a análise
de variância - ANOVA e teste a posteriori de Tukey.
Para se avaliar as diferenças de expressão relativa, de cada colagenase,
entre os momentos estudados dentro de cada grupo foi utilizado ANOVA de
medidas repetidas e Tukey a posteriori. Já as comparações entre regiões (dorso
e ventre) dentro de cada grupo, ao longo do período experimental, foi utilizado
ANOVA e teste de múltiplas comparações de Sidák. As diferenças entre grupos,
tanto amostras de dorso quanto de ventre, foram avaliadas com teste T de
Stundent para amostras independentes (YUAN et al., 2006).
Todas as análises foram realizadas no software estatístico GraphPad
Prism 7.00® (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA 92108, USA) e as medidas
91
de tendência central e dispersão apresentadas em gráficos boxplots, as

diferenças foram consideradas significativas quando P<0,05.
RESULTADOS
Durante a fase de restrição foi possível manter os animais em ambiente
fechado, totalmente protegidos de radiação solar, monitorada constantemente,
e na fase de exposição foi possível observar diferença de significativa (P<0,05)
na quantidade de radiação solar que as regiões de dorso e ventre dos animais
foram expostas, conforme demonstrado na Figura 2, sendo que região dorsal no
GA recebeu oito vezes mais radiação que a região ventral (P<0,05) em M3, e 11
vezes mais (P<0,01) em M4. No GC também houve exposição oito vezes maior
da região dorsal em M3 (p<0,05) e 10 vezes maior em M4 (P<0,001).
As técnicas de colheita, preparação e extração do RNA das amostras de
pele permitiu amostragem homogênea entre os grupos, pois não houve diferença
significativa (P>0,05) entre as concentrações de RNA total e relações de
absorbância das amostras entre GA e GC (Figura 3).
Figura 2. Boxplots demonstrando as diferenças entre

exposição solar da região dorsal e ventral do GA e GC em
M3 e M4. Letras diferentes acima dos diagramas indicam
diferenças estatísticas (P<0,05).
92
Figura 3. Boxplot demonstrando a variação da concentração

de RNA total bem como a pureza pela análise da absorbância
relativa das amostras de pele de equinos do grupo afetado
(GA) e grupo controle (GC).
Nas análises de qPCR, observou-se que a radiação solar induziu

variações significativas (P<0,05) na expressão gênica das colagenases MMP1 e
MMP8, nos animais de ambos os grupos, quando expostos ao sol após um
período de restrição a radiação solar. Foi evidenciado uma tendência a
subexpressão de MMP13 na pele ventral dos animais do GA em relação a pele
da mesma região nos animais do GC, durante a fase de exposição ao sol
(P=0,057).
Conforme demonstrado na Figura 4-A, a expressão média de MMP1 na
pele de dorso do GA foi de aproximadamente 50 vezes maior em M4 quando
comparado ao M2 (P<0.05), e diminuiu a níveis basais no M5 (P<0,05), quando
comparado a M4. Na Figura 4-B é possível observar que no ventre do GA, foi
observado diferença entre a expressão média de MMP1 no M5 em relação a M1
(P<0,05).
No GC a quantidade média de transcritos de mRNA de MMP1 na pele
do dorso foi 13 vezes maior (P<0,05) em M4 quando comparado ao M2 na
mesma região, e também diminuiu a níveis basais em M5 (P<0,05) (Figura 4-C).
Não houveram diferenças significativas na expressão de MMP1 nas amostras de
ventre do GC (Figura 4-D).
A média da expressão gênica da MMP8 no dorso do GA fase de
exposição ao sol também foi maior que no período de restrição, todavia, devido
93
a variância dos dados não foram observadas diferenças significativas (P>0,05),

conforme demonstrado na Figura 3-E. Entretanto, na Figura 4-F é possível
observar que nas amostras de ventre do mesmo grupo, a expressão aumentou
significativamente (P<,0,05) no primeiro dia de exposição ao sol (M3), após um
período de 30 dias de restrição (M2). Não houveram diferenças significativas na
expressão de MMP8 nas amostras de dorso e ventre do GC, ao longo do período
experimental, bem como não houveram diferenças na expressão média da
MMP13 em nenhuma das regiões de ambos os grupos.
A expressão gênica da MMP13 na pele do dorso e ventre do GA e GC
não diferiu significativamente (P>0,05) ao longo do período experimental.
Houveram diferenças significativas (P<0,05) na expressão da MMP1
entre amostras de pele das regiões dorso e ventre tanto no GA quanto no GC.
Foi observado que em M4, no GA, a expressão média de MMP1 na pele do dorso
foi 20 vezes maior que a de ventre (Figura 5-A) e no GC a expressão na região
de dorso foi sete vezes maior que a de ventre (Figura 5-B). Não foram
observadas diferenças significativas na expressão das demais colagenases
entre regiões em ambos os grupos (Figura 5-C a F).
Na comparação entre grupos, a expressão de MMP1 na pele de dorso,
em M4, foi significativamente (P<0,05) maior no GA do que no GC (Figura 6-A).
Não houveram diferenças significativas (P>0,05) entre GA e GC, na expressão
desta colagenase na pele de ventre, em nenhum momento estudado (Figura 6-
B).
Não foram observadas diferenças significativas na expressão de MMP8
e MMP13, tanto em dorso quanto ventre, entre GA e GC. Entretanto, quando
analisadas as diferenças entre a expressão média de MMP13 na pele de ventre,
foi observado uma tendência (P=0,057) a subexpressão no GA em relação ao
GC no M4 (Figura 66-F).
94
Figura 4. Expressão gênica das colagenases MMP1 e MM8, ao longo do

período experimental. Letras acima dos diagramas em A, B e C indicam
diferenças estatísticas (P<0,05) da expressão gênica da MMP1 entre os
momentos avaliados. Letras acima dos diagramas em F indicam diferenças
significativas (P<0,05) da expressão gênica de MMP8 em dorso e ventre do
GA, entre os momentos avaliados.
95
Figura 5. Gráficos demonstrando a expressão gênica das colagenases

MMP1 (A e B), MMP8 (C e D) e MMP13 (E e F) entre as regiões de dorso e
ventre no GA e GC. Amostras de dorso receberam valor relativo de 1,0 e as
amostras de ventre foram calculadas proporcionalmente. Boxplots ligado por
barra com asterisco diferem significativamente entre si (P<0,05).
96
Figura 6. Gráficos demonstrando variação na expressão gênica das

colagenases MMP1 (A e B), MMP8 (C e D) e MMP13 (E e F) das amostras
de dorso a esquerda e de ventre a direita, comparando as diferenças entre
GC e GA. Barra com asterisco ligando diagramas no M4 em A, indicam
diferenças significativas (P<0,05) da média de expressão gênica de MMP1
entre amostras de pele dorsal entre os grupos avaliados. Em F, o valor de P
acima dos diagramas do M4, indica tendência a diferença estatística entre
grupos (P=0,057).
97
DISCUSSÃO
Não foi encontrado na literatura consultada, até o momento, trabalhos
que avaliassem os efeitos da radiação solar natural na pele de equinos. Desde
a década de 90, pesquisadores avaliam os efeitos da radiação ultra violeta (UV)
artificial na pele de humanos, e já foi caracterizado que quantidades de raios UV
equivalentes a uma exposição de 5 a 15 minutos ao sol do meio dia foram
suficientes para causar uma MED (Minimal Erythema Doses) e aumentar a
expressão gênica de MMP1 em até quatro vezes, além de degradar colágeno
tipo I na pele de humanos, 24 horas após a exposição (FISHER et al., 1997).
Outros pesquisadores observaram que um MED foi necessário para induzir a
expressão de MMP1 na pele de humanos, todavia, foram necessários dois MED
para que a expressão desta colagenase chegasse ao pico (LAHMANN et al.,
2001). Neste trabalho, observamos que o pico da expressão da MMP1 na pele
de equinos ocorreu no terceiro dia de exposição à radiação solar natural, após
um periodo de 30 dias de restrição ao sol.
Fisher e colaboradores (2001) avaliando expressão gênica e proteica da
colagenases MMP1 e MMP8 na pele de humanos irradiada com dois MED de
raios UV, observaram uma maior quantidade relativa de mRNA e proforma
proteica de MMP1 e não detectaram interferências na expressão da MMP8.
Entretanto, neste trabalho ficou evidenciado que a expressão gênica da MMP8,
da mesma forma que a MMP1, também foi influenciada pela radiação solar, o
que é interessante, uma vez que esta enzima fica contida em grânulos
citoplasmáticos em neutrófilos e esta célula normalmente está presente,
predominantemente, em tecidos inflamados (GUTIÉRREZ-FERNÁNDEZ et al.,
2007; SCHUBERT-UNKMEIR et al., 2010).
Em outro estudo de expressão proteica e atividade enzimática de MMP1
e MMP13, pesquisadores observaram um aumento de 10 vezes na expressão
de MMP1 em cultura de celulas de pele tratada com dois MED de raios UVB e,
que pelo menos, 50% da enzima MMP1 estava na forma ativa em cultura de
células de pele, 72 horas após exposição (BRENNAN et al., 2003). Estes autores
também verificaram que não houve influência da radiação solar na expressão de
MMP13, confirmando a maior importância da MMP1 no processo de degradação
da matriz extracelular dérmica. Neste estudo, observamos a influência da
radiação solar na regulação da expressão de MMP1, corroborando com os
98
achados de Fisher et al. (1996), Lahmann et al. (2001) e Brennan et al. (2003),
pois da mesma forma que a radiação solar simulada interfere na expressão de
MMP´s na pele de humanos, a radiação solar natural interfere na expressão de
MMP´s na pele de equinos in vivo, o que sugere um padrão de degradoma
cutâneo semelhante entres estas espécies e que o processo de degradação da
matriz extracelular dérmica pode ocorrer em equinos em um processo
semelhante ao fotoenvelhecimento cutâneo em humanos, ocasionado pela
radiação solar (LAHMANN et al., 2001; BRENNAN et al., 2003).
Brennan e colaboradores (2003) não obsevaram diferença na expressão
de MMP13 entre amostras de pele expostas a radiação e amostras controle não
expostas o mesmo ocorreu aqui, pois não houveram diferenças significativas
(P>0,05) na expressão de MMP13 na pele da região dorsal e ventral dos equinos
de ambos os grupos, em nenhum dos momentos estudados. Todavia, foi
observado uma tendência a subexpressão desta MMP na pele do ventre do GA
em comparação ao GC no M4. Seguindo a comparação entre grupos, a MMP1
também diferiu entre GA e GC no M4, sendo mais expressa na pele de dorso do
GA em relação ao GC. Embora pesquisadores já tenham evidenciado um padrão
de expressão oposto entre MMP1 e MMP13 (URÍA et al., 1998) não podemos
afirmar que esse padrão existiu neste trabalho, pois a análise não alcançou o
nivel de significância de P<0,05. Além disto, na análise seriada, ou seja ao longo
do tempo, não observou-se diminuição significativa na expressão de MMP13 no
mesmo grupo de amostras em que foi observado aumento da MMP1.
O fato de que a expressão de MMP1 na pele dorsal do GA ter sido maior
que no GC (P<0,05) no M4 pode ter ocorrido devido a conformação
ultraestrutural desorganizada, que torna a pele dos afetados mais fina e menos
densa (RASHMIR-RAVEN et al., 2015), e consequentemente, com uma maior
área de exposição de fibloblastos dérmicos à radiação solar, influenciando na
expressão gênica de colagenases, além de maior área de contato molecular para
atuação enzimática.
É interessante que mais estudos sejam realizados, principalmente de
expressão proteica e de zimologia, para identificar, tanto o(s) extrato(s)
celular(es) que pode(m) sofrer uma mudança em seu metabolismo devido a
influência da radiação solar, quanto a atividade enzimática envolvida no
processo de degradoma cutâneo em equinos com HERDA.
99
Segundo Rashmir-Raven (2013) equinos afetados por HERDA devem

ser mantidos protegidos do sol para que que ocorra melhora clínica e diminuição
da severidade das feridas cutâneas, pois a incidência de radiação solar pode
contribuir para piora do quadro clinico devido as lesões serem mais comuns na
região dorsal, onde a incidência de radiação e o calor são mais intensos,
(BROUNTS; RASHMIR-RAVEN; BLACK, 2001; RASHMIR-RAVEN et al., 2004;
WHITE et al., 2004). Concordando com esses autores, ficou evidenciado aqui,
que a radiação solar na região dorsal é significativamente maior (P<0,001) que
a região ventral, todavia a expressão gênica das colagenases, aqui estudadas,
durante o período de restrição mantiveram-se em níveis basais, semelhantes ao
M0, onde os animais estavam em condições à campo, expostos ao sol, e mesmo
tendo aumentado de maneira significativa no período de exposição imediato,
voltou a níveis basais aos 15 dias de exposição. Desta forma, um manejo onde
os animais afetados ficariam sendo protegidos por longos períodos, e
posteriormente expostos outra vez, poderia gerar uma condição de reativação
constante da expressão de enzimas que atuam no degradoma cutâneo. Assim,
fica indicado que os animais sejam protegidos do sol, pelo menos nos períodos
do dia com maior incidência de radiação solar.
CONCLUSÃO
A expressão gênica da MMP1 aumenta com HERDA e normais, com

pico de expressão de 72 horas no dorso, e no ventre em até 15 dias de exposição
à radiação solar natural, após um periodo de 30 dias de restrição ao sol.
A radiação solar, nas condições aqui avaliadas, não influenciaram as
expressões de MMP8 e MMP13, na pele de animais afetados e normais, tal qual
a MMP1, demonstrando a importancia desta colagenase no processo de
degradoma cutâneo nos animas.
Os animais afetados necessitam de proteção da radiação solar, pelo
menos nos periodos de maior incidência diária de radiação solar.
100
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104
10 ANEXOS
ANEXO 1 - Normas da Revista Veterinary Dermatology.
Author Guidelines
Abstract Author Guidelines
Content of Author Guidelines:
1. General,
2. Ethical Guidelines,
3. Submission of Manuscripts ,
4. Manuscript Types Accepted,
5. Manuscript Format and Structure,
6. After Acceptance.
Relevant Documents: Copyright Transfer Agreement

Useful Websites: Submission Site, Articles published in Veterinary
Dermatology , Digital Photography Guidelines , Kudos
1. GENERAL
Veterinary Dermatology is a bi-monthly, peer-reviewed, international journal

which publishes papers on all aspects of the skin of mammals, birds, reptiles,
amphibians and fish. Scientific research papers, clinical case reports and
reviews covering the following aspects of dermatology will be considered for
publication:
• Skin structure (anatomy, histology, ultrastructure)

• Skin function (physiology, biochemistry, pharmacology, immunology,
genetics)
• Skin microbiology and parasitology
• Dermatopathology
• Pathogenesis, diagnosis and treatment, including prophylaxis, of skin
diseases
• New disease entities
Please carefully read the instructions below for details on the submission of
manuscripts, the journal's requirements and standards as well as information
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in Veterinary Dermatology. Authors are encouraged to visit the Blackwell
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2. ETHICAL GUIDELINES
Veterinary Dermatology adheres to ethical guidelines given below for
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105
2.1. Authorship and Acknowledgements

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Acknowledgements, e.g. statisticians hired to analyse data; this may also
include clinicians who recruit cases for multi-centre clinical trials.
Note to NIH Grantees: Pursuant to NIH mandate, Wiley-Blackwell will post the
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2.2. Ethical Approvals
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that adequate measures were taken to minimize pain or discomfort.
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Council Directive of 24 November 1986 (86/609/EEC) and in accordance with
local laws and regulations.
The Journal reserves the right to reject any paper where there is reason to
believe that animals have been subjected to unnecessary or avoidable pain or
distress. Where animals have been used in a study, the relevant research
ethical or animal welfare or institutional review authority, under which the work
was conducted, must be stated. Furthermore, manuscripts describing
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2.3 Clinical Trials
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with due regard for the REFLECT guidelines available at http://www.reflect-
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2.4 DNA Sequences and Crystallographic Structure Determinations
Papers reporting protein or DNA sequences will not be accepted without a
Genbank accession number. Other supporting data sets must be made
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106
2.5 Conflict of Interest and Source of Funding

Conflict of Interest: Authors are required to disclose any possible conflict of
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Communications, Case Reports, Letters to the Editor and Book Reviews (by
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108
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the abstract to several key points.
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text and not counting the words in the title, abstract and references) and up to
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publication primarily if they add new and useful information for the discipline of
veterinary dermatology; consideration will be given to:
a. Reports of new diseases or conditions, or variations on recently described
diseases.
b. Reports of diseases that are of zoonotic importance or are highly contagious.
c. Reports that will make a significant change in how a disease is diagnosed or
treated.
Supporting information containing additional text and figures may be allowed.
The editors may require that a case report is reduced to less than 750 words;
two figures and six references; the abstract will be reduced to several key points
by the editor.
5. Letters to the Editor: will be limited to 750 words, including references, and
two (usually one) image / figure / table which may include one clinical image
and one of histopathology; letters may cover a variety of topics and these may
include but are not restricted to:
a. Briefly highlighting an issue with a previously published paper.
b. Seeking to generate discussion or awareness of a developing area.
6. Books for review should be sent to the Veterinary Dermatology Editorial
Office at:
Veterinary Dermatology, Wiley-Blackwell, 9600 Garsington Road, Oxford, OX4
2DQ, UK
5. MANUSCRIPT FORMAT AND STRUCTURE

5.1. Format
Veterinary Dermatology operates a system of double-blinded review and the
names of the authors will not be disclosed to the reviewers. Authors should
therefore avoid including anything that could identify them within the text. This,
for example, includes: the name of the institution at which the work was
performed; initials of the authors; acknowledgements and names of institutions
on illustrations, etc. To enable double-blinded review, contributors (including
acknowledgements) should only be named on the title page or uploaded
separately as a supplementary file, and not on the manuscript. Authors should
also avoid statements that could identify them through references (e.g. instead
of 'we have previously shown that black is white’, authors should write 'previous
studies have shown that black is white').
109
The manuscript (including references and figure legends) must be A4 or 8.5 x

11 inch format with 2.5 cm margins, single-spaced typed (please do not submit
double line spaced), align text left, 12 point font using sans serif typeface such
as Helvetica (Swiss), Arial or Verdana style (please do not use Times New
Roman). Each line and page of the manuscript text should be numbered
consecutively from the title page.
Authors are requested to write with the minimum of formatting and NOT to write
over previous versions, which may contain hidden formatting. Do not enhance
text and tables with unnecessary formatting (e.g. small capitals, headers).
Software programmes that automatically create endnotes and footnotes should
not be used.
Review Articles
In general, review articles are only by invitation and by approval of the Editor in
Chief. The structure will vary depending on content. Authors should study the
format used in previous issues of the journal for further guidance. Authors
wanting to submit a review article should contact the Editor in Chief
(via [email protected]) with a brief description of the article and outline.
Scientific Papers and Brief Communications
Manuscripts should be arranged as follows: title; acknowledgements; abstract;
text with subdivisions as given below; references; legends for illustrations.
Case Reports
These are usually a chronological description of the case describing the history,
physical findings, differential diagnoses, diagnostic tests, specialist diagnostic
procedures, diagnoses, treatments and outcome.
Title Page
The title of the article should be concise but informative. Drug trade names will
not be included in the title. The first name, middle initial(s), and last name of
each author must be given. Professional affiliations of the authors at the time of
the study should be indicated using the symbols *, †, ‡, §, ¶, then **, †† etc., in
this order; these are not superscripts. Titles (e.g. professor) and qualifications
(e.g. DipACVD) are not required.
Please provide full address details for all of the authors. If an author's affiliation
has changed since the study was performed, the author's new affiliation should
be identified. The name of the corresponding author, any conflicts of interest
and sources of funding (see section 2.5) should be stated. If information in the
text has been presented at a scientific meeting, this should be indicated. A short
running title of no more than 40 characters (counting letters and spaces) should
also be included. The short running title will be used in the journal at the top of
the page, see current publications. Keywords are NOT required.
Abstract
The abstract should be no more than 250 words and must be constructed using
the subheadings given below. While this format is most appropriate for scientific
studies, the authors of reviews, brief communications and case reports are
encouraged to also provide a structured abstract using the following:
• Background – A brief explanation of why the study was performed.

110
• Hypothesis/Objectives – A statement of the principal hypothesis tested in

the study, a brief statement of the major objectives, or both.
• Animals – A concise description of the number of animals used in the
study including the population from which they were drawn (e.g. research
colony, hospital population) and any special characteristics of the
animals (e.g. disease status).
• Methods – A statement of overall study design (e.g. randomized, blinded,
placebo-controlled clinical trial; retrospective study) and principal
interventions or methods.
• Results – Concise statement of important results including numerical
description of critical variables and statement of statistical significance.
• Conclusions and clinical importance – A summary of conclusions based
on results of the study and statement of clinical importance of these
conclusions. The results should not be restated.
Drug trade names will not usually be included in the abstracts

Introduction
State the purpose of the article. Summarize the rationale for the study or
observation. Give only strictly pertinent references and do not review the
subject extensively.
Materials and Methods
These should be described in sufficient detail to allow other workers to
reproduce the results. References for study design and statistical methods
should be to standard works (with pages stated) when possible rather than to
papers where designs or methods were originally reported. Specify any
statistics computer programs used. Report losses to observation (such as
dropouts from a clinical trial).
The methods of data collection and use of statistical analysis will be checked by
the referees, editors and, if necessary, a statistician. It is highly recommended
that authors consult a professional statistician for advice on complex statistical
analyses. It is also recommended that authors provide details of which
statistical methods and the P-value, if relevant, have been used for each
component of the data set (e.g. P = 0.08; ANOVA).
Drugs and therapeutic agents should be given in the format: drug ingredient
(trade name; manufacturer name, city, (state), country), e.g. fenbendazole
(Panacur; Intervet-Schering Plough, Milton Keynes, UK).
Drug names should follow the recommended International Non-Proprietary
Names (rINN). Common examples include cefalexin, ciclosporin, meticillin and
rifampicin.
Products such as equipment or methods should be given as: Product name
(Company name; town or city, (state) and country); e.g. Datex CD 200-02
(Datex; Hatfield, UK); or SuperScript® III First-Strand Synthesis kit (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA). The detailed information about drugs, therapeutic agents
and products need only be given once.
Results
Present your results in a logical sequence in the text, tables and illustrations. Do
not repeat in the text data in the tables or illustrations. In manuscripts describing
more than one animal, all animals should be assigned a case number.
111
Discussion
The discussion should emphasize the new and important aspects of the study
and the conclusions that follow from them. Include the implications of the
findings and their limitations, including implications for future research. Relate
the observations to other relevant studies. Link the conclusions with the goals of
the study but avoid unqualified statements and conclusions not completely
supported by your data. Avoid claiming priority and alluding to work that has not
been completed. State new hypotheses when warranted, but clearly indicate
them as such.
Recommendations , when appropriate, may be included.
Acknowledgements (should be made on the title page or as a separate
supplementary file and not included on the manuscript). These are to indicate
support, advice or technical help that does not justify authorship. Please use
first and second (family) names, e.g. The authors would like to thank Fred
Flintstone for assistance with statistical analysis.
Funding sources should be included in the declared sources of funding (see
section 2.5).
Language and style
The language of publication is English. Authors for whom English is a second
language must have their manuscript thoroughly, and preferably professionally,
edited by an English speaking person before submission to make sure that the
English is of high quality. A list of independent suppliers of editing services can
be found
at http://authorservices.wiley.com/bauthor/english_language.asp . All
services are paid for and arranged by the author; use of one of these services
does not guarantee acceptance or preference for publication.
5.2. Units, Abbreviations and Nomenclature
All units of measurement must follow the SI system. Concentrations of solutions
should be given as molar concentrations (e.g. mmol/L). All other concentrations
should be expressed as percentages. Drug dosages should be given as: e.g.
mg/kg; μg/kg; also use ‘once daily’, ‘twice daily’ etc. Spell out numbers one to
nine, keep 10 onwards as numerals. However, use Arabic numerals for
numbers used with units of measure (e.g. 9 kg, 5 h, 10 mmol/L). Use h, min, s,
for hour, minute, second, respectively. Abbreviations of biological, medical,
chemical and other terms should be used only when such abbreviations are
both internationally recognized and unambiguous. The first use of an
abbreviation must be explained by also giving the unabbreviated term.
All biological, medical, chemical and other names should be given in keeping
with the latest international nomenclature. If an animal or micro-organism is
being mentioned in the text for the first time, the binomial name should be
given, e.g. carp (Cyprinus carpio). Thereafter, this can be abbreviated to C.
carpio. Please check recent articles for information about the spelling of dog
and cat breeds.
5.3. Figures (illustrations): Graphs, Tables, Clinical Photographs and
Photomicrographs
Figure legends must be given at the end of the manuscript. Sufficient
information should be included to allow the figure to be understood without
reference to the text. Authors wishing to use any previously published figures
112
must submit written permission from the copyright holder. Figure legends
should be written in the following style:
1. Organ or tissue; animal identification, Case No. A sentence describing the
change that is visible in the print. (For photomicrographs add: staining method
with names of stains and counter stains and magnification, e.g. avidin–biotin–
peroxidase complex method, Mayer's Haematoxylin counter stain, x40).
2. Graph or Table: statement of how data is expressed. Identification of symbols

in table, graph, or photo: e.g. N, nucleus.
Examples:
1. Photomicrograph: Intra-epidermal, intact sub-corneal pustule showing small
numbers of acantholytic cells and numerous neutrophils. H&E.
2. Table: Comparison of eosinophil counts over time between the control and
treatment groups. Error bars indicate the mean ± SD.
5.3.1. Graphs
To ensure high-quality reproduction, symbols should be clear and even
throughout and of sufficient size, that when reduced for publication, each item
will still be legible. Graph axes should be labelled in sans serif (Helvetica or
Arial) font. Letters, Numbers and Titles belong in the legends for illustrations,
not on the illustrations themselves.
Software programmes such as GraphPad can be used to download graphs into
a word document for submission as an image/figure file.
5.3.2. Tables should be limited to those containing data important to
understanding and interpreting results and reducing or clarifying the text. Tables
may be include within the word file containing the main text, placed after the
figure legends; alternatively, large tables should be submitted as separate table
files (e.g. in Word or Excel). Number tables consecutively in the order of the first
citation in the text and supply a brief title for each. Give each column a short or
abbreviated heading. Place explanatory material in footnotes, not in the
heading. Explain in the footnotes all non-standard abbreviations that are used in
each table. Identify statistical measures of variations such as standard
deviation. Ensure that each table is cited in the text. If you use data from
another published or unpublished source, obtain written permission and
acknowledge fully.
5.3.3. Figures; Clinical Photographs & Photomicrographs (histopathology)
Such figures should be ideally be originally captured and submitted in a neutral
data format such as TIFF or EPS. There is no requirement to convert an original
uncompressed JPEG file to TIFF or EPS format. (JPEG format will be
accommodated but must fulfil the format criteria given below and should be
uncompressed). PowerPoint, PDFs and Word graphics are usually unsuitable
for reproduction.
Figures should have a minimum resolution of 300 dpi; grey tone and line
drawings require 600–1200 dpi. Photographic material should be of such quality
that high-contrast that reproductions can be made. Poor-quality images may be
removed from a manuscript and where critical to the content may lead to
rejection of a manuscript.
Graphics created in the CMYK colour palette (print colours) are preferable to
those created in RGB (screen colours) to maximize the consistency of print
113
reproduction. Images supplied in RGB will be converted to CMYK for printing;

this may lead to some variations in colour representation. Immunofluorescence
images may be submitted in RGB.
When symbols, arrows, numbers or letters are used to identify parts of the
illustrations, identify and explain each one clearly in the legend.
Clinical and histopathology (photomicrograph) figures must be no more than 19
cm in width and must be submitted at a resolution of 300 dpi.
Limit figures to those that reduce or clarify the text. These should be free of
extraneous material and, where possible, if portions of the handler such as
fingers or hands are to be included, particularly adjacent to lesions, they should
be gloved.
Montage (composite plates) figures are allowed and should have no tooling
(space bars) to separate the individual images. Each part should be labelled in
the top left-hand corner in black, (or if appropriate for clarity in white) in Arial, in
lower case, with no brackets, starting with a, b, c, etc.
5.3.3.1 Photomicrographs
The microscope must be set up for Koehler illumination, so that the light is
evenly dispersed in the image.
The epidermis should be at the top of the image and horizontal; the background
above the epidermis should be bright and white.
Authors are not obliged to use length or scale bars, reviewers/editors may
recommend their use because it is deemed to be critical to the understanding of
photomicrograph; they are required for electron micrograph images.
Magnification (scale) bars should be black, approximately 1 cm long and placed
in the lower right corner, 5 mm above the lower margin and with the right end 5
mm from the right margin. The overall magnification can be specified as, for
example, (x40) where x10 eye lens x x4 lens = x40 overall.
For more information about the preparation of images please see the guidelines
as attached here . While these guidelines were written some time ago and
technology has moved on the general principles are still applicable. Please
ensure that individual figures files are no larger than 5 MB. If your file is
substantially bigger than this, please contact the Editorial
Office: [email protected]; to discuss file saving and submission
options.
5.4. References (Please note that EndNote™ and Refman™ software for the
Journal of the American Veterinary Medical Association can be used for
Veterinary Dermatology; please adapt to Vancouver style).
Software programs for creating reference lists may be used but they should be
set up so that they generate in-text citations and reference lists according to the
instructions and examples given below. Authors bear primary responsibility for
the accuracy of all references. References must be limited to those that are
necessary and must be cited in the text by superscript numbers in order of
citation. Journal titles in the Reference section should be abbreviated in
accordance with the National Library of Medicine (NLM website) and
Index Medicus. For references with more than 3 authors, only the first 3 authors
should be listed, followed by ‘ et al.’ The following is the style used for common
types of references:
114
Article in journal
1. Müntener T, Doherr MG, Guscetti F et al. The canine hair cycle – a guide for
the assessment of morphological and immunohistochemical criteria. Vet
Dermatol 2011; 22: 383-395.
Book
2. Scott DW. Large Animal Dermatology. Philadelphia, PA: Saunders, 1988;
457–458.
Book chapter
3. Muir P, Johnson KA, Manley PA. Fractures of the pelvis. In: Birchard SJ,
Sherding RG, eds. Saunders Manual of Small Animal Practice. 2nd edition.
Philadelphia: W.B. Saunders Co., 2000; 1126–1132.
Proceedings
4. Kunkle G, Hillier A, Beale K et al. Steroid effects on intradermal skin testing in
sensitized dogs. In: Proceedings of the American Academy of Veterinary
Dermatology & American College of Veterinary Dermatology . Charleston, SC,
USA: 1994; 54–55.
Electronic Material
5. Animal and Plant Health Inspection Service website. Bovine spongiform
encephalopathy (BSE). Available at:
www.aphis.usda.gov/lpa/issues/bse/bse.html. Accessed Feb 18, 2003.
5.5. Supporting Information
Supporting information, such as data sets, additional figures, tables, video or
audio files that will not be published in the print edition of the journal, but will be
available via the online edition, may be submitted. Supporting information must
be important ancillary information that is relevant to the parent article but which
does not or cannot appear in the printed edition of the Journal. Supporting
information will be published as submitted, and will not be corrected or checked
for scientific content, typographical errors or functionality.
Supporting information should be uploaded at the time of manuscript
submission using the file designation 'Supporting information'. It should be
clearly stated at the time of submission that the Supporting Information is
intended to be made available through the online edition. The content of the
Supporting information must not be altered after the paper has been accepted
for publication. Authors should note that the publishers will not be held
responsible for the content or functionality of any supporting materials supplied
by the authors. Any queries (other than missing material) will be directed to the
corresponding author of the article.
The availability of Supporting information should be indicated in the main
manuscript by a paragraph, to appear after the References, headed "Supporting
information" and providing titles of figures, tables etc. In order to protect
reviewer anonymity, material posted on the author’s website cannot be
reviewed.
5.6. Animal Experiments
Animal experiments are to be undertaken only with the purpose of advancing
knowledge and in a manner that avoids unnecessary discomfort to the animals
by the use of proper management and laboratory techniques. They shall be
conducted in compliance with federal, state and local laws and regulations, and
in accordance with the internationally accepted principles and guidelines for the
115
care and use of agricultural, laboratory or experimental animals. In the interests

of the reproducibility of results, accurate information about any test animals
used in the experiments (origin, inbreeding etc.), as well as information about
the housing conditions (diet, environment etc.), should be given. For further
information and guidance on how to report on animal experiments see: ARRIVE
guidelines for reporting animal research see: ARRIVE guidelines for reporting
animal research
6. AFTER ACCEPTANCE
Upon acceptance of a paper for publication, the manuscript will be forwarded to
the Production Editor who is responsible for the production of the journal.
6.1 Proof Corrections
The corresponding author will receive an e-mail alert containing a link to a
website. A working e-mail address must therefore be provided for the
corresponding author. The proof can be downloaded as a PDF (portable
document format) file from this site; the file should be opened, read on screen,
and printed out in order for any corrections to be added. Further instructions will
be sent with the proof. Hard copy proofs will be posted if no e-mail address is
available; in your absence, please arrange for a colleague to access your e-mail
to retrieve the proofs. Proofs must be returned to the Production Editor within
one week of receipt.
As changes to proofs are costly, we ask that you only correct typesetting errors.
Other than in exceptional circumstances, all illustrations are retained by the
publisher. Please note that the author is responsible for all statements made in
their work, including changes made by the copy editor.
6.2 EarlyView
(Publication Prior to Print) Veterinary Dermatology is covered by Wiley-
Blackwell's EarlyView service. EarlyView articles are complete full-text articles
published online in advance of their publication in a printed issue. EarlyView
articles are complete and final. They have been fully reviewed, revised and
edited for publication, and the authors' final corrections have been incorporated.
Because they are in final form, no changes can be made after online
publication. The nature of EarlyView articles means that they do not yet have
volume, issue or page numbers, so EarlyView articles cannot be cited in the
traditional way. They are therefore given a Digital Object Identifier (DOI), which
allows the article to be cited and tracked before it is allocated to an issue. After
print publication, the DOI remains valid and can continue to be used to cite and
access the article.
6.3 Author Services
Online production tracking is available for your article through Wiley-Blackwell's
Author Services. Author Services enables authors to track their article – once it
has been accepted – through the production process to publication online and
in print. Authors can check the status of their articles online and choose to
receive automated e-mails at key stages of production. The author will receive
an e-mail with a unique link that enables them to register and have their article
automatically added to the system. Please ensure that a complete e-mail
116
address is provided when submitting the manuscript.

Visit authorservices.wiley.com/bauthor/default.asp for more details about
online production tracking and for a wealth of resources including FAQs and tips
on article preparation, submission and more.
6.4 OnlineOpen
Available to authors of primary research articles who wish to make their article
available to non-subscribers upon publication in Veterinary Dermatology, or
whose funding agency requires grantees to archive the final version of their
article. With OnlineOpen the author, the author’s funding agency, or the author’s
institution pays a fee (currently $3000) to ensure that the article is made
available to non-subscribers upon publication via Wiley Online Library, as well
as deposited in the funding agency’s preferred archive. In addition to publication
online via Wiley Online Library, authors of OnlineOpen articles are permitted to
post the final, published PDF of their article on a website, institutional repository
or other free public server. For more information, please
visit: http://olabout.wiley.com/WileyCDA/Section/id-406241.html . Any
authors wishing to send their paper OnlineOpen will be required to complete the
payment form available from our website
at: https://authorservices.wiley.com/bauthor/onlineopen_order.asp .
6.5 Author Material Archive Policy
Please note that unless specifically requested, Blackwell Publishing will dispose
of all hard copy or electronic material submitted 2 months after publication. If
you require the return of any material submitted, please inform the editorial
office or production editor as soon as possible.
6.6 Offprints and Extra Copies
Free access to the final PDF offprint of your article will be available via Author
Services only. Please therefore sign up for author services if you would like to
access your article PDF offprint and enjoy the many other benefits the service
offers. Additional paper offprints may be ordered online. Please click on the
following link, fill in the necessary details and ensure that you type information
in all of the required
fields: offprint.cosprinters.com/cos/bw/main.jsp?SITE_ID=bw&FID=USER_
HOME_PG .
If you have queries about offprints please e-mail: [email protected].
6.7 Kudos: New Author Benefit to Increase Readership and Impact
Kudos is a web-based service that helps authors explain, enrich, and share
their published work for greater readership and impact. It also provides direct
access to a publication dashboard so authors can measure the effect of their
actions across a wide range of metrics.
Wiley’s partnership with Kudos makes the service free for all Wiley authors.
However, those who have registered with Wiley Author Services and opted
into the mailing list will receive the most streamlined experience. The
notification emails sent to those who are registered with Wiley Author Services
contain a direct link to claim their article in Kudos. Authors who are unregistered
or published prior to 2014 can claim authorship in Kudos by searching for
articles by DOI, article title, or author name.
Once authors have claimed their articles, they are led through the following
steps:
117
• Explain articles by adding lay summaries and highlighting what makes

the work important.
• Enrich articles by adding links to related resources that put the research
into context.
• Share via email and social media, while Kudos links across search
engines and subject indexes.
• Access the dashboard area to view usage, citations, and altmetrics for
the publications.
What are the benefits for authors?
• Discoverability and Impact – Increases the likelihood of their articles

being found, read, and cited.
• Publication Metrics – Provides direct access to usage, citations, and
altmetrics for their articles.
• Networking – Encourages interactions that build relationships and
visibility within their communities.
Please also see this introductory video and blog post on Wiley Exchanges
for more information.

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

INFLUÊNCIA DA RADIAÇÃO SOLAR NA EXPRESSÃO GÊNICA DE

CAMPO AMOR VIEIRA DA CUNHA NETO

INFLUÊNCIA DA RADIAÇÃO SOLAR NA EXPRESSÃO GÊNICA DE

CAMPO AMOR VIEIRA DA CUNHA NETO

Tese apresentada junto ao programa de

Orientador: Prof. Dr. Alexandre Secorun

Nome do autor: Campo Amor Vieira da Cunha Neto

Título: INFLUÊNCIA DA RADIAÇÃO SOLAR NA EXPRESSÃO GÊNICA DE

Prof. Dr. Alexandre Secorun Borges

Prof. Dr. Rogério Martins Amorim

Prof. Dr. João Pessoa Araújo Júnior

Prof. Luiz Cláudio Nogueira Mendes

Prof. Diego José Zanzarini Delfiol

Data da defesa: 21 de janeiro de 2020.

Aos meus irmãos, Vlademir Vieira da Cunha, Edna Vieira da Cunha

À Santíssima Trindade, pelo dom da vida, amor e misericórdia, por der me

Ao Professor e orientador Alexandre Secorun Borges, pela recepção, pela

Aos coorientadores, professores José Paes de Oliveira Filho e Peres

Ao professor João Pessoa Araújo Júnior e toda sua equipe de trabalho do

Ao professor Deilson Elgui de Oliveira e às Dras. Camila Dantas Malossi

Aos grandes amigos e colegas, Diego José Zanzarini Delfiol, Giovane

Aos amigos e colegas de pós graduação, “Galera da Salinha”, Danilo

Aos Professores do setor de cirurgia de grandes animais da UNESP de

Aos amigos e colegas da cirurgia de grandes animais UNESP de Botucatu,

Aos médicos veterinários residentes e estagiários do setor de cirurgia

Aos docentes do Departamento de Clínica Veterinária, professores Roberto

Às secretárias do Departamento de Clínica Veterinária, Marlene Dias de

A CAPES pela concessão da bolsa de doutorado, possibilitando a

Aos membros do conselho de Pós-Graduação em Medicina

À toda equipe da fazenda São Joaquim do Instituto Butantan, em

Aos Cavalos, por me permitir vivenciar um sonho de infância, animais

Tabela 1. Visão geral de 23 Metaloproteinases de Matriz (MMP)

considerada como controle e recebeu o valor relativo de 1,0 e a do ventre

descritos os valores individuais e abaixo estão as médias ± desvios

Tabela 22. Expressão gênica de MMP13 das amostras de dorso do GC, ao

Figura 1. Principais passos pós-traducionais na síntese de colágeno

amplificação das diluições seriadas. Em A e B os gráficos são referentes

Figura 21. Boxplots demonstrando a comparação da expressão gênica da

2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 5

2.1 Estrutura, biossíntese e metabolismo do colágeno ...................................... 5

2.2 Doenças genéticas do colágeno .................................................................. 7

2.3 Astenia cutânea regional hereditária em equinos (HERDA) ......................... 8

2.4 Metaloproteinases de matriz (MMP) ........................................................... 13

2.5 Ação da radiação solar na matriz extracelular cutânea .............................. 15

2.5 Justificativa ................................................................................................ 18

3.1 Objetivos específicos ................................................................................. 18

4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 19

4.1 Animais ...................................................................................................... 19

4.2 Delineamento experimental........................................................................ 19

4.3 Colheita das amostras ............................................................................... 20

4.4 Análise da expressão gênica das Metaloproteinases MMP1, MMP8 e

4.4.4 Avaliação dos conjuntos de primers por PCR convencional e

4.5 Análise estatística ...................................................................................... 28

5.1 Tratamento dos grupos: restrição e exposição à radiação solar. ................ 29

5.2 Análise da expressão gênica pela técnica de qPCR .................................. 32