Dissertacao Elis MLZ

ELISANGELA ROSA RIBEIRO
VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA ANÁLISE DE

AGROTÓXICOS EM ÁGUAS RESIDUAIS DE INDÚSTRIA
AGROQUÍMICA POR CLAE-UV/DAD.
Londrina
2022
VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA ANÁLISE DE

AGROTÓXICOS EM ÁGUAS RESIDUAIS DE INDÚSTRIA
AGROQUÍMICA POR CLAE-UV/DAD.
Dissertação apresentada à Universidade

Estadual de Londrina - UEL, como requisito
parcial para a obtenção do título de Mestre em
Química Analítica
Orientadora: Profª. Drª Maria Luiza Zeraik
Londrina
2022
VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA ANÁLISE DE AGRTÓXICOS EM

ÁGUAS RESIDUAIS DE INDÚSTRIA AGROQUÍMICA POR CLAE-
UV/DAD.
Dissertação apresentada à Universidade

Estadual de Londrina - UEL, como requisito
parcial para a obtenção do título de Mestre
em Química Analítica
BANCA EXAMINADORA
Orientadora: Profª. Drª. Maria Luiza Zeraik

Universidade Estadual de Londrina
UEL
Profª. Drª. Diana Nara Ribeiro de Sousa

Universidade Estadual de Londrina
UEL
Prof. Drª. Julliana Izabelle Simionato Stipp

Universidade Tecnológica Federal do Paraná
UTFPR
Londrina, 02 de junho de 2022.

AGRADECIMENTOS
Agradeço a Profª. Drª. Maria Luiza Zeraik, pela orientação e

conhecimentos compartilhados durante o desenvolvimento deste estudo.
Aos membros da banca examinadora, Profª. Drª. Diana Nara Ribeiro

de Souza e a Profª. Drª. Julliana Izabelle Simionato Stipp, que tão gentilmente
aceitaram participar e colaborar com esta dissertação e ao Prof. Dr. Alesandro Bail
também pela contribuição ao trabalho desenvolvido.
Ao Departamento de Química da UEL.
Aos colegas da ADAMA BRASIL que contribuíram com

conhecimentos, disposição e por serem tão solícitos.
RIBEIRO, Elisangela Rosa. Validação de método para análise de
agrotóxicos em águas residuais de indústria agroquímica empregando CLAE-
UV/DAD. 2022. 64f. Dissertação (Mestrado em Química Analítica) – Universidade
Estadual de Londrina, Londrina, 2022.
RESUMO
Nas empresas de proteção de cultivos e produtoras de

agroquímicos, há muitas vezes o revezamento na utilização de equipamentos nas
etapas de síntese, formulação e embalagem de produtos. Com isso se torna
necessário o controle de contaminantes residuais durante o processo produtivo.
Neste projeto visamos desenvolver um método analítico para a determinação dos
agrotóxicos clomazone, diuron e hezaxinona em amostras de águas provenientes da
limpeza dos formuladores e linhas após a produção do produto contendo esses três
princípios ativos. Devido às baixas concentrações dos ativos presentes nas
amostras, o método desenvolvido deve ter um limite de detecção e quantificação em
níveis de traços, além da necessidade de ser um método rápido, devido ao grande
número de análises realizadas por dia no controle de qualidade da empresa. A
análise dos ativos por cromatografia líquida proporcionou uma análise quantitativa
dos compostos, com um método inédito na literatura, possibilitando uma alta
sensibilidade, seletividade e detectabilidade dos três agrotóxicos na mesma análise.
Os coeficientes de correlação das curvas analíticas foram < 0,999, e a faixa de
trabalho foi de 0,050 a 1,690 µg mL-1 para o composto clomazone, de 0,050 a 6,720
µg mL-1 para o composto diuron e de 0,060 a 7,350 µg mL-1 para o composto
hexazinona. O limite de detecção e quantificação se demonstraram aplicáveis
utilizando a relação sinal/ruído obtido. Os valores de recuperação obtidos foram de
85,67 % a 116,76 %, contemplando a faixa estabelecida pelas normas da ABNT. O
método também se mostrou preciso com os desvios-padrão relativos abaixo de 5 %.
Em suma, o método desenvolvido e validado por CLAE-UV/DAD mostrou-se rápido
e eficiente para análise simultânea dos agrotóxicos clomazone, diuron e hexazinona
em amostras de águas residuais.
Palavras-chave: agrotóxicos; cromatografia em fase líquida; validação de método.

RIBEIRO, Elisangela Rosa. Method validation for analysis of clomazone,
pesticides in wastewater from agrochemical industry using HPLC. 2022. 64p.
Dissertation (Master in Analytical Chemistry) – Universidade Estadual de Londrina,
Londrina, 2022.
ABSTRACT
In crop protection companies, producers of agrochemicals, there is

often a rotation in the use of equipment in the stages of synthesis, formulation and
packaging of products. With this, it becomes necessary that during the production
process a control of residual contaminants is carried out, such as active ingredients
previously present in the equipment. In this project we aim to develop an analytical
method for the determination of the pesticides clomazone, diuron and hezaxinone in
water samples from the cleaning of formulators and lines after the production of the
product containing these three active principles. Due to the low concentrations of the
actives present in the samples, the method developed must have a limit of detection
and quantification at trace levels, the method must also be robust considering the
large number of analyzes performed in the quality control of the partner company
where the study was developed, the impacts of lost time on the production schedule
can generate loss of productivity and consequently lower income for the industry.
The analysis of the actives by high performance liquid chromatography with a
UV/DAD detector provided a quantitative analysis of the compounds, in an
unprecedented method in the literature, allowing a high sensitivity, selectivity and
detectability in the studied method. The correlation coefficient for both compounds
was < 0.999, and the working range was from 0.050 to 1.690 µg mL -1 for the
clomazone compound, from 0.050 to 6.720 µg mL -1 for the diuron compound and
from 0.060 to 7.350 µg mL -1 for the hexazinone compound. The detection limit and
quantification proved to be applicable using the signal/noise ratio obtained. The
recovery of the method was greater than 85.0 %, the method was declared accurate
from the relative standard deviation of 96.0% for clomazone, 106 % for diuron and
92.0 % for hexazinone.
Keywords: pesticides; liquid phase chromatography; method validation.

LISTA DE FIGURAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas
UEL Universidade Estadual de Londrina
CLAE
UV
DPR
LD
LQ
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO..........................................................................................14
1.1 Objetivo geral.............................................................................................. 16
1.2 Objetivos Específicos..................................................................................16
2 Revisão bibliográfica.................................................................................17
2.1 Disponibilidade de Água..............................................................................17
2.2 Industria e o uso de água............................................................................19
2.3 Reuso industrial de água.............................................................................20
2.4 Agrotóxicos..................................................................................................21
2.5 Pesticidas selecionados..............................................................................21
2.6 Métodos Analíticos para a determinação de agrotóxicos em água.............23
2.7 Validação de Método Analítico....................................................................27
3 Metodologia ............................................................................................. 33
3.1 Instrumentação, materiais e vidrarias..........................................................33
3.2 Preparo das soluções..................................................................................34
3.3 Condições cromatográficas.........................................................................35
3.4 Análise Quantitativa.....................................................................................35
3.5 Validação.....................................................................................................35
3.5.1 Seletividade..........................................................................................35
3.5.2 Limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ)........................36
3.5.3 Linearidade e curva analítica...............................................................37
3.5.4 Recuperação........................................................................................37
3.5.5 Precisão............................................................................................... 38
3.6 Aplicação do método desenvolvido.............................................................39
4 Resultados e discussão............................................................................45
4.1 Otimização das condições cromatográficas................................................45
4.2 Validação do método...................................................................................47
4.2.1 Seletividade..........................................................................................47
4.2.2 Limite de Detecção e Limite de quantificação......................................50
4.2.3 Linearidade e curva analítica...............................................................51
4.2.4 Recuperação........................................................................................55
4.2.5 Precisão............................................................................................... 56
4.3 Aplicação do método desenvolvido.............................................................57
5 Conclusão.................................................................................................60
Referência ................................................................................................61
14
1 INTRODUÇÃO
Os agrotóxicos são substâncias utilizadas para combater

organismos indesejados (insetos, larvas, fungos e carrapatos) e para controle do
crescimento de vegetação, entre outras funções. (BRASIL, 2002; INCA, 2021).
Outros termos têm sido utilizados para se referir a agrotóxicos, como venenos,
remédios, defensivos ou praguicidas (INCA, 2021).
Esses podem ser classificados a partir de suas finalidades.
Inseticidas possuem a ação de combater insetos, os fungicidas combatem os fungos
que possam atacar as plantações, os herbicidas combatem as plantas daninha e os
acaricidas combatem os ácaros (ANVISA, 2021a).
Há décadas os agrotóxicos são utilizados em diversas culturas
buscando aumentar o rendimento e melhorar a qualidade do plantio. As áreas
plantadas são pulverizadas com produtos para proteger as culturas contra pragas e
ervas daninhas, e com isso gera-se um ganho econômico (VERMA; JASWAL, 2014).
Embora a produção e aplicação de agrotóxicos aumente a
produtividade agrícola, o seu uso intensivo frequentemente gera um efeito negativo,
danos ao meio ambiente e a saúde humana, muito grande. Impactos sobre seres
humanos vão desde simples náuseas, dores de cabeça e irritações na pele até
problemas crônicos, como diabetes, malformações congênitas e vários tipos de
câncer. Impactos ambientais também são vários, incluindo contaminação da água,
plantas e solo, diminuição no número de organismos vivos e aumento da resistência
de pestes (AE, 2013). Isto torna essencial a regulamentação da produção, comércio,
uso e disposição de agrotóxicos, a qual deve equilibrar ao menos três fatores:
performance agronômica, saúde pública e meio ambiente.
A maioria desses compostos são solúveis em água e uma grande
quantidade de agrotóxicos aplicados é perdida, e livres nos ambientes podem ser
absorvidas por organismos e se espalharem no solo, águas e contaminar
diretamente os alimentos e animais marinhos (BERNARDES e SOUZA, 2015). Algo
que já se vem discutindo é a grande preocupação quanto a detecção frequente
desses compostos em águas. Há, portanto, uma maior demanda no controle da
qualidade de águas potáveis, tratamentos de águas residuais e reutilização dessas
águas.
Na busca de equilibrar o desempenho econômica das
15
agroindústrias, a saúde pública e o meio ambiente, deve haver uma rigorosa

regulamentação quanto ao uso e produção de agrotóxicos. Isto torna essencial a
utilização de boas práticas nos processos de produção.
São vários os métodos para determinação de agrotóxicos em água,
em destaque estão os cromatográficos que utilizam os equipamentos com diferentes
tipos de detectores seletivos. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) ou a
cromatografia gasosa (CG) são as técnicas mais utilizadas para a determinação de
agrotóxicos. Para analitos que possuem alta ou média volatilidade e que são
tecnicamente estáveis a técnica de CG acoplada à espectrometria de massas (EM)
é a mais utilizada. Em contrapartida, para os compostos menos voláteis e
termicamente instáveis, mais difíceis de serem identificados por CG, necessitando
tratamento amostrais adicionais (WATANABE et al., 2014).
A CLAE é uma técnica físico-química de separação onde os analitos
se distribuem por duas fases que interagem entre si, a fase estacionária (fe) e a fase
móvel líquida (fm). Na prática, a fase estacionária é o “suporte” contido no interior da
coluna, pela qual passa um fluxo contínuo de fase móvel ou eluente (ANDRADE et
al., 2006). Os componentes da amostra são retidos, seletivamente, na fase
estacionária, resultando em migrações diferenciais, devido ao fato de terem maior ou
menor afinidade com a fase móvel. O grau de migração é determinado pela
magnitude das interações da fase estacionária e da amostra com a fase móvel
(ANDRADE et al., 2006; CASS e DEGANI, 2001).
Na cromatografia líquida de alta eficiência os detectores têm a
função de monitorar o efluente da coluna e fornecer a medida detectada do soluto. O
seu funcionamento é de acordo com diferentes princípios, mas todos geram um sinal
elétrico que é proporcional a alguma propriedade do analito. A resposta do detector
pode ser relacionada com a quantidade de analito (AMORIM, 2019).
Uma variedade de detectores tem sido desenvolvida para CLAE, A
detecção por Ultravioleta e visível (UV-VIS) é geralmente aplicada em compostos
cujas moléculas apresentam características para a absorção na região de UV-VIS
(SKOOG, 2006; SCOTT, 2003).
Detector de Arranjo de Diodos (DAD) faz parte do grupo de
detectores de fótons e constitui a base dos instrumentos multicanais para absorção
UV-VIS (SCOTT, 2003).
O detector DAD permite determinar os espectros das substâncias
16
presentes da amostra no eluente com diferentes comprimentos de onda durante a

análise cromatográfica (SCOTT, 2003).
O presente trabalho apresenta um método cromatográfico para
determinar três moléculas (clomazone, diuron e hexazinona) presentes em águas
residuais provenientes da lavagem dos equipamentos usados na fabricação de um
agrotóxico produzido na indústria Adama Brasil®, onde esse estudo foi desenvolvido
e aplicado. Neste trabalho são apresentados os resultados dos parâmetros
analíticos obtidos do processo de desenvolvimento e validação de método, segundo
os critérios da ABNT (2017).
1.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral deste trabalho compreende desenvolver e validar

um método analítico único para a determinação simultânea das moléculas de diuron,
clomazone e hexazinona em amostras de águas residuais de indústria agroquímica
por cromatografia líquida.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Validar e desenvolver o método empregando análises por

cromatografia liquida para determinação das moléculas de
agrotóxicos em matriz de água.
 Determinar e quantificar clomazone, diuron e hexazinona em
águas residuais do processo de produção de agrotóxicos,
empregando análises por CLAE-UV/DAD.
 Demonstrar a aplicabilidade do método validado na
determinação dos compostos em amostras de água residual de
indústria agroquímica.
17
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 DISPONIBILIDADE DE ÁGUA
O Brasil é o maior depositário natural de águas doces do planeta,

detém 11,6% de toda a água doce superficial do mundo, sendo que 70% da água
disponível está localizada na região Amazônica, onde se encontra a menor
densidade populacional. A região Nordeste, que é a mais pobre e a mais árida,
concentra 30% da população brasileira e possuí apenas 5% da água doce. As
regiões Sul e Sudeste, onde estão concentradas cerca de 60% da população
dispõem de 12,5% da água doce (AUGUSTO et al., 2012).
O aumento da população humana e da urbanização, e a
necessidade cada vez mais premente de aumentar a produção de alimentos para
abastecer bilhões de pessoas, causam pressões na produção e consumo de águas
continentais superficiais e subterrâneas. Por outro lado, há permanente e persistente
degradação da qualidade das águas, deterioração causada por emissões de
poluentes para o ar, solo por efluentes industriais e uso de fertilizantes e agrotóxicos
(TUNDISI et al., 2014).
A água doce no mundo é renovável, no sentido de existir um ciclo de
fluidez das águas na Terra. A água que evapora dos mares e oceanos de forma
cíclica, acaba por fazer o caminho de volta para os oceanos, por meio dos rios,
cursos d’água, dos lagos e aquíferos subterrâneos. Essa renovação da água no
sistema hidrológico fechado da Terra denomina-se ciclo hidrológico (OKAFOR,
2011).
Nesse ciclo a água interage em todos os seus estados físicos
formando as reservas superficiais e subterrâneas sendo o que ocorre com as águas
superficiais é refletido nas águas subterrâneas e vice-versa (FARIAS, 2015). Essa
fluidez da água demonstra que embora as preocupações estejam voltadas para a
poluição das águas superficiais de rios e lagos, a contaminação de águas
subterrâneas agrava o problema como um todo.
Com o crescimento das populações e incremento das atividades
econômicas, muitos países estão atingindo rapidamente condições de escassez de
água ou se defrontando com limites para o desenvolvimento econômico. A demanda
18
por água está aumentando rapidamente com 69% exigidos para a irrigação, menos
de 21% para a indústria e apenas 10% para consumo doméstico (PEREIRA, 2005).
A presença de contaminantes, sejam eles bactérias patogênicas,
parasitas, vírus, contaminantes orgânicos ou inorgânicos são prejudiciais à saúde
humana. Desta forma ações de gestão dos recursos hídricos são de grande
importância para não tornar o acesso à água potável um problema maior para as
gerações futuras (KARAN, 2020).
Figura 1. Tendencias na evolução dos problemas da qualidade da água a partir da

segunda metade do século XIX mostrando o aumento da complexidade dos
processos ao longo do tempo e os problemas metodológicos envolvidos.
Fonte: TUNDISI (2014).
A análise recente (TUNDISI et al., 2014) da evolução dos problemas

referentes à deterioração das águas mostra um quadro preocupante nos últimos 150
anos (Figura 1). Observa-se que, de contaminação fecal e orgânica, passou-se para
situação muito mais complexa, na qual metais pesados, substâncias orgânicas e
toxinas de origem diversa (inclusive de organismos aquáticos) acumularam-se em
águas superficiais e subterrâneas.
19
2.2 INDUSTRIA E O USO DE ÁGUA
Desde a revolução industrial, a economia mundial cresce com uma

dinâmica de exploração imediatista de recursos naturais, seja na indústria de
construção civil, química, de alimentos, automotiva ou em outros segmentos. A
maioria deles demanda grandes volumes de água para abastecer seus processos
produtivos.
Alguns ramos de atividade, como por exemplo, medicamentos,
agroquímicos ou eletrônicos, requerem água de alta qualidade, e
consequentemente, exigem investimentos e tecnologia para seu tratamento, e em
determinadas situações a composição do tratamento adicional (além do tratamento
empregado em águas de abastecimento público) faz-se necessário para que os
requisitos de qualidade sejam atingidos.
Segundo Tsutiya (2006), o uso da água em uma planta industrial
pode ser classificado em 5 categorias principais:
• Consumo humano (banheiros, banho e alimentação, incluindo
lavagem de utensílios, por exemplo), sendo que o consumo humano depende
essencialmente do número de empregados e do regime de trabalho;
• Consumo doméstico (água utilizada em limpeza geral e
manutenção da água do estabelecimento, por exemplo);
• Água incorporada ao produto (produtos de higiene e alimentos,
por exemplo);
• Água utilizada no processo de produção e utilidades (geração de
vapor e sistemas de resfriamento);
• Água perdida ou para usos não rotineiros (é assim denominada a
água para sistemas de proteção contra incêndios, lavagem de reservatórios, água
perdida por vazamentos e para usos não identificados) (FARD, 2021).
O consumo de água na indústria pode sofrer alterações de acordo
com o desenvolvimento e avanço tecnológico, gerando reduções ou mesmo o
aumento das taxas de consumo de água (PADILLA, 2020).
O desenvolvimento e uso dos recursos hídricos já ultrapassaram o
nível de alarme em muitas partes do mundo, resultando em questões ambientais
como: rios com pouca ou nenhuma vazão (Liang et al., 2010); degradação do
ecossistema (Palmer e Ruhi, 2019); declínio do lençol freático (Bierkens e Wada,
20
2019); e encolhimento do lago/pântano (Zhou et al., 2019). Esses problemas

demonstram que o uso insustentável da água se tornou um problema que dificulta o
desenvolvimento sustentável de muitas economias globalmente.
A segurança hídrica, alimentar e energética são elementos centrais
da Agenda 2030 das Nações Unidas para o Desenvolvimento Sustentável Nos
últimos anos, os impactos ambientais ecológicos causados pelo comércio de
produtos têm atraído muita atenção.
2.3 REUSO INDUSTRIAL DE ÁGUA
O controle e conscientização no uso dos recursos hídricos podem

gerar a redução do consumo e reciclagem da água. A diminuição do consumo
relaciona-se ao uso eficiente da água, ou à simples economia, por meio da
eliminação de vazamentos e perdas e da redução da quantidade do consumo em
atividades domiciliares, industriais e agrícolas (TELLES et al., 2010).
O reuso pode ser definida como o uso de água previamente utilizada
para uma determinada função, mesmo que sua qualidade tenha sido alterada
durante o primeiro uso; o reaproveitamento é feito antes que essa água seja
despejada na rede de coleta de esgoto (TELLES et al., 2010; SILVA et al., 2003).
Em determinadas situações, a água para ser reaproveitada exige um
grau elevado de qualidade. Este requisito pode encarecer o tratamento, levando a
custos que não compensam o benefício gerado pelo reuso da água. A importância
de se analisar individualmente as possibilidades de reuso de água decorre
especialmente deste fator.
O reuso de água na indústria, muitas vezes está associado a
iniciativas isoladas, sendo a maioria no setor privado. Na planta industrial a água é
aplicada para diversas finalidades, como matéria-prima, sistema de refrigeração,
limpeza e lavagem de pátios e jardins, consumo humano e higiene pessoal, entre
outras aplicações.
O crescimento econômico acelerado associado à ausência de
alternativas sustentáveis, bem como a exploração de recursos naturais fizeram com
que este assunto adquirisse interesse público e, consequentemente, desencadeou
iniciativas políticas e econômicas (PADILLA, 2020).
21
A implantação de um programa de reuso de água na indústria requer

o conhecimento do processo produtivo, demandas internas e principais usos de
água, tendo em vista a identificação de potenciais reuso de água em processos
industriais para diminuir seu consumo.
A expansão que vem ocorrendo nas indústrias agroquímicas
causada pelo aumento no consumo de agrotóxicos reforça a necessidade de
implementação de reuso de água nos processos produtivos devido à alta toxidade
dos resíduos produzidos por estas indústrias.
2.4 AGROTÓXICOS
Desde a criação dos agrotóxicos seu uso fundamental é na

agricultura, buscando melhoramentos e ganho de produtividade. Seu uso ajuda no
controle de pragas e doenças nas mais variadas culturas, porém o uso
descontrolado e crescente pode acarretar a contaminação do solo, da água e dos
alimentos.
O aumento populacional vem tornando cada vez mais necessário
ampliar as áreas plantadas e com isso a intensificação do uso da terra para fins
agrícolas tem despertado grande preocupação devido, principalmente, aos impactos
que vem causando ao ambiente (RIBEIRO, 2013).
Agrotóxicos são definidos como produtos de agentes de processos
físicos, químicos ou biológico, com uso no beneficiamento de atividades agrícolas,
na pastagem, florestas e em ambientes urbanos com o intuito de modificar a
composição da flora ou fauna (RIBEIRO, 2013).
2.5 PESTICIDAS SELECIONADOS
Os três agrotóxicos alvos deste estudo são herbicidas, que entre os

defensivos agrícolas ou agrotóxicos são produtos utilizados no controle de plantas
invasoras. O clomazone, 2-[(2-clorofenil)metil]-4,4-dimetil-1,2-oxazolidin-3-ona,
Figura 2a, é um herbicida do grupo químico das isoxazolidinonas, amplamente
utilizado no Brasil no controle de plantas daninhas mono e eudicotiledôneas
22
(ANVISA, 2021a).
O registro da molécula de clomazone no Brasil está relacionado ao
uso em cultura de algodão, arroz, batata, cana-de-açúcar, fumo e mandioca
(VERMA; JASWAL, 2014). As isoxazolidinonas possuem ação inibidora da síntese
do caroteno de amplo espectro para o controle em pré e pós-emergência (NORA,
2015).
O diuron (diurom), 3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetilureia, Figura 2b, é
um herbicida de aplicação em pré e pós-emergência das plantas infestantes nas
culturas de abacaxi, alfafa, algodão, banana, cacau, café, cana-de-açúcar, citros,
eucalipto, seringueira, soja e uva, pertence ao grupo químico ureia e possui ação de
inibir a fotossíntese (ANVISA, 2021a; NORA, 2015). Além de ser largamente
utilizado na agricultura, o diuron é utilizado no controle de plantas em áreas urbanas
e como um produto anti-fotossintetizante em tintas para evitar o acúmulo de
organismos marinhos nos cascos de barcos. É comum a combinação de diuron com
outros herbicidas.
A ação do diuron nos organismos alvos interrompe o fluxo normal
dos elétrons que permite a geração do potencial de membrana e o armazenamento
de energia química pelas células. A toxicidade do diuron em organismos não-alvos
se dá pela semelhança entre os sítios de inibição da proteína D1 do fotossistema II e
do complexo bc1 presente na cadeia respiratória dos eucariotos (BRUSSLAN e
HASELKORN, 1989; RANGO; COLSON, 1988).
A hexazinona pertence ao grupo das triazinonas, 3-ciclohexil-6-
(dimetilamino)-1-metil-1,3,5-triazina-2,4(1H,3H)-diona, (Figura 2c), sua utilização é
de herbicida pré e pós-emergente muito utilizada no cultivo de cana-de-açúcar
(ANVISA, 2021a). Sua molécula possui alta solubilidade em água.
Por possuir alta solubilidade em água, não são raros os registros do
herbicida hexazinona no meio ambiente, como em águas superficiais ou
subterrâneas (BAINBRIDGE et al., 2009; ANVISA, 2021b).
23
Figura 2. Fórmula estrutural de a) clomazone b) diuron c) hexazinona.
Fonte: Anvisa, 2021a.
O diuron apresenta baixa solubilidade em água 42 mg L -1, já a

solubilidade em água do hexazinona é de 32 mg L -1, muito inferior à do clomazone
que é de 1100 mg L-1 (RODRIGUES & ALMEIDA, 2005).
2.6 MÉTODOS ANALÍTICOS PARA A DETERMINAÇÃO DE PESTICIDAS EM ÁGUA
O crescente uso de agrotóxicos vem afetando o equilíbrio do meio

ambiente, e a preocupação em monitorar e controlar os resíduos desses compostos
em diversas matrizes como em água, alimentos no solo e no ar. Muitas pesquisas
têm voltado suas atenções em desenvolvimento de metodologias analíticas para a
determinação de agrotóxicos em água.
Para análise de agrotóxicos em água existem duas etapas
importantes: a pré-concentração dos analitos e a determinação destes com um
método cromatográfico e detector apropriado (RIVERSOS, 2012; LANÇAS, 2009).
Dentre as técnicas de extração normalmente utilizadas para isolar e
concentrar analitos, destacam-se: a extração líquido-líquido (LLE, do inglês Liquid-
Liquid Extraction), a micro extração em fase sólida (SPME, do inglês Solid Phase
Microextraction), a extração sortiva em barra magnética (SBSE, do inglês Stir Bar
Sorptive Extraction), a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME, do inglês
24
Dispersive Liquid-Liquid Extraction) e a extração em fase sólida (SPE, do inglês

Solid Phase Extraction) , sendo a SPE a técnica mais utilizada para tal etapa.
A extração em fase sólida (SPE) é atualmente a técnica mais
empregada para amostras líquidas, como matrizes de água (PRATES et al., 2011;
CALDAS et al., 2011; SILVA et al., 2011). Os métodos que envolvem LLE, requer
grandes volumes de solventes orgânicos, são bastante trabalhosos, difíceis de
automação e apresentam alto custo.
A SPME foi introduzida em 1990, nesta técnica, uma fibra de sílica
fundida é coberta com a fase estacionária, geralmente feita de polidimetilsiloxano
(PDMS), que é exposta na amostra aquosa por um determinado tempo, para que o
equilíbrio seja alcançado e posteriormente o analito é dessorvido pela fase móvel ou
por aquecimento direto no injetor do cromatógrafo a gás. A técnica SBSE foi
introduzida em 1999 e baseia-se na extração sortiva sobre uma camada polimérica,
que reveste uma barra de agitação magnética, ou seja, tem como base o mesmo
princípio da SPME, com a diferença de utilizar maior volume de fase extratora.
A DLLME foi desenvolvida em 2006 como avanço das técnicas de
microextração em fase líquida, cujo método baseia-se no sistema ternário de
solventes, que é uma miniaturização da LLE e utiliza microlitros de solvente extrator.
E a SPE, que é uma técnica muito empregada para pré-concentração de
agrotóxicos, onde muitas publicações utilizaram esta técnica em análise de resíduos
de agrotóxicos em matrizes aquosas (SILVA et al., 2011).
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência é um método de
separação de compostos químicos em solução, para realização desta separação
necessitamos no processo cromatográfico da partição dos componentes de nossa
amostra entre a fm e a fe (ANDRADE et al., 2006).
A CLAE passou a ser um dos métodos analíticos mais utilizados
para fins qualitativos e quantitativos. As razões para esse crescimento estão
relacionadas à sua adaptabilidade para determinações quantitativas com boa
sensibilidade e a possibilidade de separar espécies não voláteis e termicamente
instáveis (TONHI et al., 2009).
A representação esquemática de um equipamento de CLAE (Figura
3) é composto por um reservatório de solvente, uma bomba de alta pressão, injetor
da amostra, coluna cromatográfica, detector e registrador de dados, que são
divididos em módulos, que podem ser controlados individualmente ou por
25
computador (CASS e DEGANI, 2001).
Figura 3. Componentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta eficiência,

composto por fase móvel, bomba, injetor, coluna cromatográfica, detector,
computador para aquisição dos dados e resíduos.
Fonte: Laila Cristina GRUBERT, L. C. 2018.
A bomba de alta pressão empregada em CLAE tem a função de

enviar um fluxo constante e reprodutível de fase móvel para a coluna e apresenta
características totalmente especiais.
As principais são: devem operar a pressões de 0,01 a 35 MPa (0,1 a
350 bar), com a mesma precisão e exatidão de operações a pressão quase
ambiente; intervalo de vazões entre 0,01 e 5 mL min -1 para aplicações analíticas,
entre 0,05 e 200 µL min-1 para uso com colunas micropore e capilar, e até 100 mL
min-1 para aplicações preparativas. Repetitividade e constância da vazão de 1%.
Elas não devem ser corroídas pelas fases móveis empregadas. A
bomba deve proporcionar ao sistema uma vazão contínua sem pulsos com alta
reprodutibilidade, possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo adequado
(CIOLA, 2003; COLLINS et al.,2006).
As colunas utilizadas em CLAE são geralmente de aço inoxidável,
com diâmetro interno de cerca de 0,45 cm para separações analíticas e na faixa de
26
2,2 cm para preparativas. O comprimento é variável, sendo comuns colunas

analíticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas colunas são
reaproveitáveis, sendo empacotadas com suportes de alta resolução, não sendo
necessária sua regeneração após cada separação (CASS e DEGANI, 2001).
A classificação da cromatografia líquida de acordo com as
modificações químicas realizadas na fase estacionária (sílica gel) levou a uma
grande variedade de tipos.
A separação em cromatografia líquida pode ser encontrada
explorando a variedade de processos existentes, dos quais os mais importantes são:
cromatografia no modo normal, no modo reverso, de compostos iônicos, de troca
iônica, cromatografia de exclusão e cromatografia quiral (CASS e DEGANI, 2001).
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência no modo reverso constitui
a modalidade cromatográfica na qual a fase móvel é mais polar do que a fase
estacionária. Salienta-se ainda que tal processo é o mais utilizado nos laboratórios
de pesquisas industriais e acadêmicas, além do seu amplo emprego em análises de
rotina (OLSEN, 2001).
Os detectores mais empregados em CLAE são os
espectrofotômetros no UV/VIS. Eles determinam a diferença de absorbância na
região do ultravioleta ou no visível, sendo, assim, um detector seletivo para
moléculas que possuem cromóforos. Os detectores por arranjo de fotodiodos
fornecem espectros de varredura do analito no UV-VIS (CASS e DEGANI, 2001).
O DAD é composto por uma fonte de emissão de luz (lâmpada de
deutério ou xenônio), que é colimada através de um sistema de lentes sobre a
amostra. A luz total que passa através da célula contendo a amostra incide sobre
uma grade holográfica (SkOOG, 2006; SCOTT, 2003).
Essa grade difrata a radiação, separando seus diferentes
comprimentos de onda, onde cada um deles incide sobre um diodo do arranjo. Este
diodo, ao ser irradiado, produz uma corrente elétrica cuja magnitude está
relacionada com a intensidade de emissão. Esta corrente é então transformada em
absorbância nos diferentes comprimentos de onda através de um circuito, resultando
no espectro de absorção da substância (SkOOG, 2006; SCOTT, 2003).
Os diodos são compostos por silício (Si) cristalino, que é um
semicondutor, um material cuja condutividade elétrica é menor que a de um metal,
porém maior que a de um material isolante (SkOOG, 2006; SCOTT, 2003).
27
Com um ou dois arranjos de diodos colocados ao longo da extensão

do plano focal de um monocromador, todos os comprimentos de onda podem ser
monitorados simultaneamente, tornando assim possível a espectroscopia de alta
velocidade (SkOOG, 2006).
A grande utilização desta modalidade cromatográfica dá-se à
existência de uma grande variedade de fases estacionárias disponíveis
comercialmente, que permitem ao usuário alcançar a seletividade desejada (CASS e
DEGANI, 2001).
Ressalta-se ainda que a fase móvel é em grande parte composta por
água, um solvente não tóxico e barato. O princípio da retenção no modo reverso é a
hidrofobia. A separação no modo reverso se deve principalmente a interações entre
a parte não-polar do soluto e a fase estacionária, isto é, à repulsão desta parte do
soluto pela fase móvel aquosa (CASS e DEGANI, 2001).
Dentro da CLAE no modo reverso, a maioria das fases utilizadas
atualmente são baseados em silanos C8 ou C18 quimicamente ligados à superfície
de sílica. Como fase móvel são utilizados solventes com caráter polar, geralmente
uma mistura de água e solventes orgânicos miscíveis com a água (BOTTOLI et al.,
2002).
A força da fase móvel na cromatografia no modo reverso depende
do tipo de solvente orgânico escolhido (solvente B) e sua porcentagem em água
(solvente A). Os solventes orgânicos comumente usados são: acetonitrila (ACN),
metanol (MeOH) e tetraidrofurano (THF) (CASS e DEGANI, 2001).
2.7 VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO
Para a comprovação de que um novo método analítico produza

informações confiáveis e interpretáveis sobre a amostra, o mesmo deve ser
submetido a uma avaliação denominada de validação.
No Brasil dois órgãos regulamentam a validação de métodos
analíticos, que são: a ANVISA, através da Resolução da diretoria (RDC) Nº 166, de
24 de julho de 2017 e o INMETRO através do documento DOQ-CGCRE-008 revisão
9 de junho de 2020. Ambos os órgãos traduzem as guias da Eurachem, que é uma
rede de organizações nacionais europeias, que tem como objetivo o
estabelecimento da rastreabilidade internacional dos resultados de medições
28
químicas, bem como promover as boas práticas laboratoriais (CARBO et al., 2008;
EURACHEM, 1998; LEITE, 2002; ANVISA, 2017; INMETRO, 2020).
A Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT), uma entidade
privada sem fins lucrativos que é responsável pela normatização técnica no Brasil
segue também as guias da Eurachem e as regulamentações do INMETRO. A norma
da ABNT NBR 14029 de 2016 estabelece o procedimento para validação de
métodos para determinação do teor de ingrediente ativo em produto técnico, teor de
ingrediente ativo em formulação e teor de impureza em produtos agrotóxicos e afins.
Os estudos de validação constituem uma ferramenta essencial das
boas práticas de fabricação em sistemas de gestão da qualidade de laboratórios de
diversas áreas analíticas. Tais estudos são estruturados tendo como referência
guias e documentos orientados nacional e internacionalmente (BERNARDES;
SOUZA, 2011).
Os parâmetros para validação de métodos têm sido definidos em
diferentes grupos de trabalho de organizações nacionais ou internacionais.
Infelizmente algumas definições são diferentes entre as diversas organizações. Uma
tentativa para harmonizar estas diferenças foi feita para aplicações farmacêuticas,
através da conferência internacional de harmonização, da cicla em inglês ICH
(International Conference on Harmonization), na qual representantes das indústrias
e agências reguladoras dos EUA, Europa e Japão definiram parâmetros,
requerimentos e, em alguns casos, também metodologias para validação dos
métodos analíticos (RIBANI et al., 2004).
A literatura traz diversos parâmetros empregados para validar um
método analítico (BRITO et al., 2003; CASSIANO et al., 2009; LANÇAS, 2009;
RIBANI et al., 2004; RIBEIRO et al., 2008), onde os principais são definidos abaixo:
a) Seletividade: a capacidade de detectar os analitos de interesse
na presença de outros componentes presentes na matriz. Se a seletividade não for
assegurada, a linearidade, a exatidão e a precisão estarão seriamente
comprometidas (ANVISA, 2017).
b) Linearidade: refere-se à capacidade do método de fornecer
resultados diretamente proporcionais à concentração da substância de interesse,
dentro de uma determinada faixa de aplicação.
A linearidade em métodos quantitativos é determinada pela medição
de amostras, em várias concentrações de analito abrangendo a faixa reivindicada do
29
método (ANVISA, 2017). Ou seja, o quanto os dados se ajustam a equação linear

(Equação 1):
y=ax+ b (1)
Onde:
y corresponde ao sinal analítico;
x concentração do analito de interesse;
a corresponde ao coeficiente angular (Inclinação);
b corresponde ao coeficiente linear (intersecção).
c) Intervalo de trabalho: é a faixa compreendida entre o menor e o

maior valor de concentração que possa ser determinado com precisão e exatidão
usando a linearidade do método.
d) Precisão: representa a dispersão de resultados entre ensaios
independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou
padrões, sob condições definidas (RIBANI et al., 2004).
A precisão é avaliada pelo desvio padrão absoluto (σ) e o desvio
padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV).
e) Exatidão: representa o grau de concordância entre os resultados
individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência aceito
como verdadeiro (RIBANI et al., 2004).
A exatidão de um método pode ser determinada também pela
comparação dos resultados obtidos pelo método sob avaliação e os resultados
obtidos por um método de referência por meio da avaliação do grau de proximidade
entre os resultados obtidos pelos dois métodos, ou seja, o grau de exatidão do
método que está sendo testado em relação ao de referência.
Pode ser determinada também pela análise de um material de
referência, com concentrações conhecidas dos compostos em análise. E, por último,
pode ser determinada por ensaios de recuperação, em que amostras são fortificadas
com concentrações conhecidas dos analitos de interesse e determinadas pelo
método sob análise através da Equação 2:
xi
Exatidão e = x 100(2)
xv
30
Onde:
Xi é valor obtido;
Xv é valor considerado verdadeiro.
f) Limite de detecção (LD): corresponde à menor concentração do

analito que pode ser detectada pelo método analítico sob avaliação, mas não
necessariamente quantificada.
O LD pode ser determinado de três maneiras: método visual, que é a
análise de amostras fortificadas com o analito em concentrações decrescentes com
definição do limite por inspeção visual onde a menor concentração do analito possa
ser diferenciada do ruído do sistema com segurança; método sinal-ruído, que pode
ser aplicado em procedimentos analíticos que apresentam ruído da linha de base e é
estimado a partir da comparação do sinal analítico obtido para uma amostra
contendo baixas concentrações da espécie de interesse com o sinal de uma amostra
do branco (RIBEIRO et al., 2008).
Em gera, é considerado aceitável uma relação sinal-ruído que gera
um sinal três vezes maior do que o ruído do sistema (ABNT, 2016), expresso através
da Equação 3:
3 x ( Cstd )
LD= x 100 ( 3 )
( )
S
R
x Cs
Onde:
LD é o limite de detecção do método expresso como concentração
(% m/m);
Cstd é a concentração da solução de calibração mais diluída;
(S/R) é a razão entre a altura do sinal e a altura do ruído para o
analito no cromatograma da solução de calibração mais diluída;
Cs é a concentração nominal teórica da amostra.
g) Limite de quantificação (LQ): corresponde à menor concentração

do analito que pode ser quantificada utilizando um determinado procedimento
experimental. Os mesmos critérios de LD podem ser adotados para o LQ, utilizando
31
a relação 10:1, ou seja, o LQ pode ser calculado, utilizando o método visual, a

relação sinal-ruído ou baseado em parâmetros da curva analítica, expressa pela
Equação 4:
Cstd
LQ= x 100 (4 )
Cs
Onde:
LQ é o limite de quantificação do método para o analito, expresso

como concentração (% m/m);
Cstd é a concentração da solução padrão (solução LQ) (µg mL-1);
Cs é a concentração nominal teórica da amostra (µg mL-1).
Os parâmetros analíticos devem ser baseados na intenção do uso

do método. Por exemplo, se um método será usado para análise qualitativa em nível
de traços, não há necessidade de testar e validar a linearidade do método sobre
toda a faixa linear dinâmica do equipamento. O objetivo do método pode incluir
também os diferentes tipos de equipamentos e os lugares em que o método será
utilizado, ou seja, se o método é desenvolvido para ser utilizado em instrumento e
laboratório específicos, não há necessidade de usar instrumentos de outras marcas
ou incluir outros laboratórios nos experimentos de validação. Desta forma, os
experimentos podem ser limitados para o que realmente for necessário.
A Tabela 1 apresenta os 3 protocolos (INMETRO, ANVISA e ABNT)
mais utilizados nos processos de validação de métodos nas indústrias agroquímicas
do Brasil, bem como a comparação das suas figuras de mérito. Este trabalho foi
desenvolvido segundo as normas do protocolo da ABNT.
32
Tabela 1. Parâmetros de validação segundo os protocolos do INMETRO, ANVISA e

ABNT.
INMETRO ANVISA ABNT
Especificidade/Seletividade Especificidade/Seletividade Seletividade
Faixa de trabalho e faixa linear Intervalos da curva de -
de trabalho calibração
Linearidade Linearidade Linearidade
- Curva de calibração -
Limite de detecção Limite de detecção Limite de detecção
Limite de quantificação Limite de quantificação Limite de
quantificação
Sensibilidade -
(inclinação da curva)
Exatidão e tendências Exatidão Recuperação
Precisão Precisão Precisão
Repetibilidade Repetibilidade Repetibilidade
(precisão inter-corrida)
Precisão intermediária Precisão intermediária -
(precisão inter-corrida)
Reprodutibilidade Reprodutibilidade -
(precisão inter-laboratorial)
Robustez Robustez -
Incerteza da medição - -
33
Fonte: ANVISA, 2017; INMETRO, 2020; ABNT, 2016.

34
3 METODOLOGIA
3.1 INSTRUMENTAÇÃO, MATERIAIS E VIDRARIAS
As análises foram realizadas utilizando o equipamento de CLAE

Agilent 1260 Infinity II (Figura 4) equipado com bomba binária 1260 Infinity II,
detector de matriz de diodos 1260 Infinity II HS, detecção espectral UV de alta
sensibilidade de 190 a 640 nm, módulo de manipulação de colunas 1260 Infinity II,
injetor manual 1260 Infinity II, amostrador automático, coluna C8 de aço inox com 4,6
mm de diâmetro interno, 150 mm de comprimento e 5 µm de tamanho de partícula,
da marca Agilent (Zorbax Eclipse C8). A aquisição e o tratamento dos dados foram
realizados pelo software OpenLab® CDS.
Figura 4. Instrumento de cromatografia líquida Infinity II 1260 LC composto por

desgaseificador alto desempenho de até 5 mL/min para baixo fluxo, entrega de
solvente binário a pressões de até 600 bar e taxas de fluxo de até 5 mL/min,
detector de arranjos de diodo HS, detecção espectral UV de alta sensibilidade de
190 a 640 nm com amostragem de 120 Hz e amostrador automático.
Fonte: Próprio autor

35
A balança utilizada nas pesagens foi a balança analítica Sartorius

(São Paulo, Brasil) modelo ED224S, com resolução de 0,0001 mg. As balanças
foram verificadas com padrões de massas Toledo (São Paulo, Brasil) certificados
pela RBC (Rede Brasileira de Calibração).
Para a filtração das amostras foram utilizados filtros PVDF
(Whatman) de 0,45 µm e seringas descartáveis do tipo Slip Descarpack de 05
mL sem agulha.
No preparo das soluções utilizou-se vidrarias volumétricas calibradas
e certificadas RBC de volume nominal de 10 e 25 mL. Foram utilizadas micropipetas
de volume variável de 200, 1000 e 5000 µL da marca Brand.
O solvente empregado para eluição dos analitos foi metanol (MeOH)
grau HPLC da marca J. T. Baker e o sistema de purificação utilizado para obtenção
de água ultrapura foi o Milli-Q Direct 16 ultrapurificação de água de 16 L/h com filtros
millipore e lampâda de UV (185-254 nm).
Os padrões de clomazone (98,3%), diuron (98,9%), e hexazinona

(98,8%) foram adquiridos da Sigma Aldrich (São Paulo, Brasil).
3.2 PREPARO DAS SOLUÇÕES
As soluções estoques dos padrões de clomazone, diuron e

hexazinona foram preparadas separadamente em balões de 25,0 mL a partir das
pesagens de 10,8 mg de clomazone (9,3 %), 8,5 mg de diuron (98,9 %) e de 9,3 mg
de hexazinona (98,8 %) em metanol 100 %, foram pipetados 0,2 mL de solução
estoque de clomazone e diuron e 0,22 mL de solução estoque de hexazinona wm
balões de 25,0 mL, estas soluções foram denominadas de soluções diluídas. A
Tabela 2 a seguir apresenta as concentrações para cada padrão nas duas soluções
Tabela 2 – Concentrações das soluções dos padrões (µg mL-1).

Padrão solução estoque solução diluída
clomazone 424,7 3,398
diuron 336,3 2,690
hexazinona 367,5 3,234
36
Fonte: Próprio autor.
3.3 CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS
Para otimizar a separação cromatográfica e identificação do tempo

de retenção dos agrotóxicos estudados, foi preparada uma solução de 10,0 g mL-1
em MeOH 100 %, de cada analito e testada a separação em modo isocrático de
gradiente.
A fase móvel (FM) de composição metanol: água foi testada nas
proporções: 30:70, 40:60 e 50:50 e 55:45, em uma vazão de 1 mL min -1 e coluna em
temperatura ambiente (25 °C).
Com as condições cromatográficas de separação já definidas, foi
realizada a identificação do comprimento de onda ideal para cada composto,
injetando separadamente cada padrão nas concentrações de 400,0 µg mL-1 em
MeOH 100 %, com volume de injeção de 2,0 µL e coluna em temperatura ambiente
(25 °C) por CLAE-UV/DAD com varredura de 190 a 400 nm.
3.4 ANÁLISE QUANTITATIVA
A quantificação dos agrotóxicos foi efetuada utilizando-se o método

de calibração externa por CLAE-UV/DAD, segundo a norma da ABNT (2016) que se
baseia na norma da EURACHEM (2014) e INMETRO DOQ-CGCRE-008 (2011).
3.5 VALIDAÇÃO
3.5.1 Seletividade
O ensaio para averiguar se o método possui a capacidade de medir

exatamente um composto em presença de outros componentes tais como
impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz, examinar se há
alguma interferência no sinal analítico de interesse, a seletividade, foi realizada por
meio de leituras individuais por CLAE-UV dos padrões nas concentrações de 10,0
37
g mL-1 em MeOH 100 %, seguidos das solventes MeOH e água Milli-Q e água da
torneira ( matriz da amostra de descontaminação) (ABNT NBR, 2016).
3.5.2 Limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ)
O limite de detecção e de quantificação foram determinados a partir

da relação sinal/ruído. Para o LD foram considerados 5 injeções da menor
concentração do analito que foi detectado pelo equipamento e que apresentou a
relação sinal/ruído maior do que 3.
Para o preparo da solução de clomazone foram pipetados 80,0 µL
da solução estoque diluída, Tabela 2 do item 3.2, em balão volumétrico de 10,0 mL,
a diluição da solução de diuron foi preparada a partir de 100 µL da solução estoque
diluída em balão volumétrico de 10,0 mL e a diluição de hexazinona para a
determinação do LD foi preparada a partir de 100 µL da solução estoque diluída em
balão volumétrico de 10,0 mL, ambas diluições me MeOH 100 %. Resultando em
soluções nas concentrações de 0,027 µg mL-1 para clomazone e diuron e 0,032 µg
mL-1 para hexazinona.
Para o LQ foram consideradas 5 injeções da solução de calibração
de menor concentração com a relação sinal/ruído maior de que 10, onde o desvio
padrão relativo (DPR) entre as cinco medidas seja menor do que o DPR calculado
pela equação estendida de Hortwitz (ABNT, 2016) Equação 5.
%DPR Horwitz=2
(1−0 , 5 logC)
x 0 , 67 ( 5)
Onde:
C é a concentração do analito (% m/m) dividido por 100.
As Concentração das soluções dos padrões para a determinação do

LD foram de 0,05 µg mL-1 para clomazone e diuron e 0,06 µg mL-1 para hexazinona
ambas preparadas a partir das respectivas soluções diluídas dos padrões em MeOH
100 %.
As mesmas diluições preparadas para determinar o LQ foram
utilizadas como a solução mais diluída no ensaio de linearidade e curva analítica.
38
3.5.3 Linearidade e curva analítica
A faixa linear de trabalho foi avaliada pela proporcionalidade entre a

concentração do analito e sua resposta analítica. A partir das soluções estoques
cada padrão analítico foram diluídos em MeOH 100 %, preparando 7 pontos (níveis)
como descritos na Tabela 3, cada nível foi injetado 2 vezes, para o preparo da
linearidade cada nível dos padrões foi preparado no mesmo balão para diminuir o
número de análises.
Tabela 3. Concentração dos níveis de cada padrão na curva analítica (µg mL-1).
Padrão nível 1 nível 2 nível 3 nível 4 nível 5 nível 6 nível 7
clomazone 0,05 0,17 0,34 0,51 0,68 1,02 1,69
diuron 0,05 0,13 0,27 0,54 0,81 3,36 6,72
hexazinona 0,06 0,16 0,32 0,48 0,90 3,67 7,35
A norma do INMETRO NBR 14029 não menciona a necessidade de

curva analítica, porém para este método foi optado para obter uma curva de
trabalho utilizando 5 pontos dentro da linearidade, mantendo os extremos da
curva, o LQ e o último ponto, considerando a rotina do laboratório de controle de
qualidade da empresa Adama® para o qual o método está sendo desenvolvido.
3.5.4 Recuperação
Amostras de água de torneira (matriz da amostra), do laboratório de

controle de qualidade da empresa foram utilizadas para o preparo das amostras
fortificadas. Foram pesados 1500 mg de água da torneira em balões de 10,0 mL e
adicionados soluções dos padrões dos analitos e o volume foi aferido com MeOH
100% em dois níveis diferentes de fortificação (N1 e N2). Cinco análises foram
realizadas para cada nível.
As concentrações das amostras fortificadas são apresentadas na
Tabela 4.
39
Tabela 4. Concentrações das amostras fortificadas a partir de cada solução padrão

(µg mL-1).
Padrão Fortificada Nível 1 Fortificada Nível 2
clomazone 0,20 0,50
Diuron 0,15 0,50
hexazinona 0,25 0,50
A fortificada N1 foi calculada para que sua concentração seja

intermediária aos níveis um e dois da linearidade, já a fortificada N2 foi calculada
para uma concentração intermediária aos níveis dois e três da linearidade. Que
segundo a norma da ABNT (ABNT NBR, 14029, 2016), através da adição de padrão
analítico do analito de interesse à amostra, em no mínimo dois níveis de fortificação
o método expressa quanto os valores obtidos encontram-se próximo do valor real,
sendo determinada como a precisão do método.
Tabela 5. Tabela com valores toleráveis de recuperação para concentração nominal

de trabalho.
Concentração nominal das Recuperação tolerável
impurezas (%)
(% m/m)
>1 90 – 110
0,1 – 1 80 – 120
< 0,1 75 – 125
Fonte: Adaptada de ABNT NBR, 2016.
A Tabela 5 é também aplicável quando a concentração de analitos

está em baixas concentrações.
3.5.5 Precisão
Para avaliar a dispersão dos resultados entre ensaios

independentes, de uma mesma amostra, foi utilizado os critérios da ABNT (ABNT
40
NBR, 14029, 2016).

A precisão foi determinada por meio do ensaio de repetibilidade. A
repetibilidade do instrumento foi avaliada pela injeção de 7 soluções independentes,
preparadas com adição dos padrões analíticos. As análises ocorreram no mesmo
dia, no mesmo equipamento e foram injetadas sete soluções preparadas de acordo
com a fortificação nível 2 descrita no item 3.5.4 e Tabela 4.
3.6 APLICAÇÃO DO MÉTODO DESENVOLVIDO
O método desenvolvido visa as análises necessárias para

descontaminação dos equipamentos e tubulações utilizados na produção em escala
industrial do produto herbicida contendo como princípio ativo os analitos estudados
nas concentrações de 280,00 g L-1 de clomazone, 250,00 g L-1 de diuron e 70,00 g L-1
de hexazinona.
O herbicida de nome comercial Eldorado® é produzido a partir da
formulação preparada com matéria-prima de cada ativo (síntese dos 3 agrotóxicos
clomazone, diuron, hexazinona), matérias-primas adjuvantes, sendo a base água. A
Figura 5 apresenta uma foto de uma amostra representativa do produto.
Este estudo foi desenvolvido em paralelo com a produção do
herbicida em planta piloto localizada no próprio laboratório da empresa, como etapa
de teste de produção.
O processo de produção seguido em pequena escala na planta
piloto, pode ser resumidamente descrito pela incorporação das matérias-primas dos
produtos ativos com água que ocorre no moinho (MOI) de esferas, Figura 6. Após a
moagem, o volume é transferido por tubulações utilizando bombas automáticas de
pressão para o formulador (FML), Figura 7, onde as demais matérias-primas são
incorporadas ao produto. Ao final do processo, o produto formulado é transferido
para uma envasadora ou enchedeira (ECH) onde o produto é proporcionado nos
volumes para venda (Figura 8).
41
Figura 5. Amostra representativa do produto herbicida de nome comercial Eldorado®

após formulação teste em planta piloto, contendo os três agrotóxicos clomazone,
diuron, hexazinona.
Figura 6. Moinho de esferas da planta piloto onde foi produzido o teste do produto
herbicida.

42
Figura 7. Formulador da planta piloto onde foi produzido o teste do produto

herbicida.
Figura 8. Envasadora da planta piloto onde foi produzido o teste do produto

herbicida.
43
Após a produção, todo o equipamento é lavado com água da

torneira utilizando mangueiras com pressão, e após cada ciclo de limpeza são
levadas amostras para análise no laboratório de controle de qualidade, as amostras
são filtradas utilizando filtro PVDF de 0,45 µm. Os pontos de coleta das amostras
são pré-definidos e depende de cada planta industrial utilizada na produção, como
representado pelo Quadro 1, e Figuras de 6 a 9. Para as amostras de
descontaminação da planta piloto cada ciclo de limpeza foi realizado passando a
água por todos os equipamentos e tubulações para então serem realizadas as
análises quantitativas dos agrotóxicos nesta agua residual.
44
Quadro 1. Descrição dos pontos de coleta de amostras de água provenientes da

descontaminação e seus respectivos locais de amostragem para análise no
laboratório de controle de qualidade.
Ponto de
Coleta Local Local de amostragem
(PC)
01 TQE-201B Coletar amostra na entrada do TQE-223
02 TQE-201ª Coletar amostra na entrada do TQE-223
03 FML-223 Coletar amostra na entrada do MOI-218
04 MOI-218 Coletar amostra na tubulação de entrada do FML-221
06 FML-222 Coletar amostra na tubulação de recirculo do FML-222
08 FML-222 Coletar amostra no fundo do FML-222
10 MOI-210 Coletar amostra na entrada da Peneira Vibratória (PNR-201)
11 PNR-201 Coletar amostra na entrada da Caixa de Passagem (TQE-202)
12 Caixa de Passagem Coletar amostra no dreno de saída da Caixa de Passagem (TQE-202)
13 BH-204 Coletar amostra na tubulação de entrada do FML-210
45

21 FML-210 Coletar amostra no dreno de fundo do FML-210
24 FML-213 Coletar amostra no dreno dos filtros GAF
25 TQE-401 Coletar amostra na sucção da BBH-400 (tubulação do TQE-401)
26 TQE-402 Coletar amostra na sucção da BBH-400 (tubulação do TQE-402)
Linha Envase ECH-
27 Coletar amostra no mangote da ECH-405
405
Linha Envase ECH-
28 Coletar amostra no mangote da ECH-406
406
29 TQE-202ª Coletar amostra no fundo do TQE-202ª
30 TQE-202B Coletar amostra na tubulação de entrada do FML-220
Figura 9. Esquema de planta de produção com sinalização dos pontos de coleta de

amostras de água de descontaminação.
46
Fonte: Setor de engenharia de produção da empresa Adama®.

47
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS
Após a variação de diferentes condições dos parâmetros

cromatográficos em CLAE-UV/DAD, o modo de eluição isocrático na proporção de
55:45 MeOH:água apresentou a melhor separação dos agrotóxicos, como
apresentadas na Figura 10 e descrito na Tabela 5.
Figura 10. Cromatograma dos padrões de clomazone, diuron e hexazinona nas

concentrações de 10,0 µg mL -1 em metanol 100 % nas condições estabelecidas.
A varredura espectral de 190 a 400 nm permite a visualização dos

comprimentos de onda com maior absorção e assim uma melhor resposta de sinal
cromatográfico.
Considerando o espectro UV para o padrão clomazone em MeOH
100 % obtido com o auxílio do detector de arranjo de diodos a banda em 210 nm,
Figura 11a, foi selecionada como melhor comprimento de onda para análise da
molécula.
Na Figura 11b o composto diuron apresenta duas bandas de maior
intensidade em 212 nm e em 250 nm, em 250nm há uma melhor resposta de sinal
cromatográfico, sendo este determinado para análise da molécula do agrotóxico
diuron. Para o composto hexazinona a banda em 246 nm é a de maior intensidade
(Figura11c), e esse comprimento de onda foi selecionado.
48
Figura 11. Espectro de UV dos compostos clomazone (a), diuron (b), hexazinona (c)
obtidos por análise em CLAE-UV/DAD dos padrões nas concentrações de 400,0 µg
mL -1 em MeOH 100 %.

49
Após a otimização das condições cromatográficas, obteve-se a

melhor separação dos compostos em estudo apresentada na Tabela 6.
Tabela 6. Condições cromatográficas para a determinação e quantificação dos

compostos de interesse por CLAE-UV.
Fase móvel
água ultrapura 45 % (v/v)
Metanol 55 % (v/v)
Vazão 1,0 mL min-1
modo de eluição Isocrático
Temperatura:
Coluna 25 °C
Comprimento de onda:
diuron 250 nm
hexazinona 246 nm
Volume de injeção: 10,0 µL
Tempo de retenção:
Clomazone 8,5 min
diuron 7 min
hexazinona 4 min
Tempo de corrida: 15 15 min
4.2 VALIDAÇÃO DO MÉTODO
4.2.1 Seletividade
No teste de seletividade o método mostrou-se apropriado para a

determinação dos compostos em estudo. Não foi identificado nenhum interferente no
tempo de retenção dos compostos de interesse nas análises das soluções
consideradas brancos (amostra e solvente). Desta forma o método proposto não
50
possui interferentes no sinal analítico segundo os critérios normativos (ABNT NBR

14029, 2016).
A seguir nas Figuras de 12 a 17 são mostrados os sinais para cada
amostra do estudo de seletividade sendo respectivamente: branco amostra (água da
torneira), branco solvente (MeOH e água ultrapura), solução padrão de clomazone,
solução padrão de diuron e solução padrão de hexazinona.
Figura 12. Cromatograma obtido no teste de seletividade em amostra de água da

torneira por CLAE-UV.
Figura 13. Cromatograma obtido no teste de seletividade em amostra de água

ultrapura por CLAE-UV.

51
Figura 14. Cromatograma obtido no teste de seletividade em amostra de metanol

por CLAE-UV.
Figura 15. Cromatograma obtido no teste de seletividade em amostra de padrão de

clomazone por CLAE-UV na concentração de 10,0 g mL-1 em MeOH 100 %.

diuron por CLAE-UV na concentração de 10,0 g mL-1 em MeOH 100 %.

52

hexazinona por CLAE-UV na concentração de 30,0 g mL-1 em MeOH 100 %.
Observando os cromatogramas apresentados das Figuras 10 a

17 pode-se avaliar que não há interferência de sinal com intensidade relevante que
possa interferir na quantificação dos compostos de interesse. Demonstrando que o
método pode ser empregado para as análises destes ingredientes ativos na matriz
estudada (água de torneira).
4.2.2 Limite de Detecção e Limite de quantificação
Os limites de detecção e quantificação foram obtidos conforme

descrito no item 3.5.2 e teve como critério o ajuste feito a permitir a obtenção da
relação sinal ruído da linha de base (ABNT NBR 14029, 2016). O limite de
descontaminação será utilizado como critério para liberação das amostras de
descontaminação, ou seja, amostras com concentrações de ingrediente ativo
inferiores ao LQ serão consideradas liberadas, e assim finalizado o ciclo de
lavagem.
Tabela 7. Limite de detecção e limite de quantificação do método, desvio padrão

relativo (DPR), e desvio padrão pela equação de Horwitz.
53
Composto Média DPR LD Média DPR % DPR LQ

S/R S/R (g mL-1) conc. % Horwit (g mL-1)
z
clomazone 6,7 0,19 8,5. 10-8 0,05 8,53 13,88 3,3. 10-5
diuron 3,3 0,15 1,6. 10-5 0,05 1,67 13,88 3,3. 10-5
hexazinona 4,1 0,07 1,6. 10-5 0,06 1,53 12,31 4,0. 10-5
O limite de quantificação do método foi calculado considerando a

pesagem de 1500 mg de água da torneira, amostra de descontaminação, em balão
de 10,0 mL. Assim o valor de limite de quantificação é maior que o ponto mais
diluído da linearidade.
4.2.3 Linearidade e curva analítica
A linearidade da curva foi verificada pelo coeficiente de correlação

(valores de r). Quanto mais próximos de 1,0, menor a dispersão do conjunto de
pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados.
Um coeficiente de correlação maior que 0,999 é considerado como evidência de que
há um ajuste ideal dos dados para o coeficiente de correlação. Segundo os
parâmetros seguidos no estudo, ABNT NBR 14029, 2016, o coeficiente de
correlação deve ser (r) ≥ 0,99.
A partir das curvas analíticas construídas foram obtidas as equações das
retas e avaliadas quanto a proporcionalidade entre a concentração dos analitos e
suas respostas analíticas. Os coeficientes de correlação (r) e o intervalo linear se
encontram descritos na Tabela 8.
Tabela 8. Parâmetros das curvas analíticas obtidos por calibração externa para os
padrões empregando CLAE-UV.
Intervalo linear Coeficiente de
Composto Equação do modelo linear
(g mL-1) correlação (r)
Clomazone 0,050 – 1,690 y = 163065,4 x – 2,40023 0,9999
Diuron 0,050 – 6,720 y = 58049,5 x + 0,16209 0,9998
Hexazinona 0,060 – 7,350 y = 39622,8 x + -0,58280 0,9999
Na Figura 18a-c são apresentados os gráficos de linearidade de resposta

54
analítica pela equação da reta e nas Tabelas de 9 a 11 contém os valores de área e

concentração encontrados em todos os pontos para cada composto.
Figura 18. Gráfico de linearidade da curva analítica de (a) clomazone, (b) diuron e
(c) hexazinona com resposta em mAU e quantidade do composto em µg L -1.
a

55
Tabela 9. Valores de área e concentração obtidos na curva analítica para o

composto clomazone e exatidão dos valores.
Concentração Concentração real Exatidão
Solução Área teórica (µg mL-1) (µg mL-1) (%)
1 9,3648 0,0500 - -
10,0598 0,0500 - -
2 31,3998 0,1700 0,1699 99,9
28,5579 0,1700 0,1616 95,1
3 57,8856 0,3400 0,3395 99,9
60,0362 0,3400 0,3465 101,9
4 88,3986 0,5100 0,5109 100,2
85,7608 0,5100 0,5030 98,6
5 113,5664 0,6800 0,6787 99,8
111,8009 0,6800 0,6673 98,1
6 169,3967 1,0200 0,9928 97,3
164,7869 1,0200 1,002 98,2
7 279,1403 1,6900 1,6950 100,3
277,9921 1,6900 1,690 100

56

composto diuron e exatidão dos valores.
Concentração teórica Concentração real Exatidão
Solução Área (µg mL-1) (µg mL-1) (%)
1 3,8529 0,0500 - -
3,3784 0,5300 - -
2 8,6078 0,1300 0,1300 100
8,4592 0,1300 0,1288 99,1
3 15,3323 0,2700 0,2671 98,9
15,3241 0,2700 0,2670 98,9
4 31,9398 0,5400 0,5452 101
32,3249 0,5400 0,5490 101,7
5 48,3116 0,8100 0,8143 100,5
47,9159 0,8100 0,8100 100
6 191,3941 3,3600 3,356 99,9
189,9757 3,3600 3,343 99,5
7 393,3698 6,7200 6,759 100,6
391,3392 6,7200 6,739 100,3

57

composto hexazinona e exatidão dos valores.
Concentração Concentração real Exatidão
Solução Área teórica (µg mL-1) (µg mL-1) (%)
1 2,3885 0,0500 - -
2,5033 0,0500 - -
2 5,9856 0,1300 0,1300 100
6,5314 0,1300 0,1288 99,1
3 11,9920 0,2700 0,2671 98,9
12,6735 0,2700 0,2670 98,9
4 19,1489 0,5400 0,5452 101
18,2115 0,5400 0,5489 101,6
5 34,5201 0,8100 0,8143 100,5
34,0536 0,8100 0,8100 100
6 143,7249 3,300 3,3550 101,7
142,3598 3,300 3,3430 101,3
7 292,7036 6,7200 6,7590 100,6
290,4842 6,7200 6,7387 100,3

58
4.2.4 Recuperação
O método obteve uma recuperação adequada entre a quantidade do

componente analisado e a quantidade teórica esperada para o ensaio de
fortificação nos níveis 1 e 2 em matriz de água da torneira.
Os testes de recuperação são expressos em termos de porcentagem
da quantidade medida da substância em relação à quantidade adicionada na
matriz, em um determinado número de ensaios (neste caso 7 ensaios). Os
resultados obtidos estão apresentados na Tabela 12 e estiveram entre 86 e 117%
para os três compostos estudados, demonstrando que o método poderá ser
aplicado satisfatoriamente na determinação destas moléculas em água. Todos os
compostos apresentaram valores de recuperação aceitáveis, dentro do estipulado
pela norma da ABNT (ABNT NBR 14029, 2016), que descreve valores de
recuperação de 75 a 125 % para concentração nominal de impurezas < 0,1%.
Tabela 12. Recuperações obtidas a partir das fortificações de nível 1 e nível 2 de

cada composto do estudo.
Nível 1 Nível 2 Média
Composto Rec. Rec.
DPR (%) DPR (%) N1/N2 (%)
(%) (%)
clomazone 90,62 5,35 105,78 8,51 85,67
diuron 109,44 6,29 93,73 1,26 116,76
hexazinona 95,01 0,56 101,38 0,88 93,72
4.2.5 Precisão
Como descrito no item 3.5.5 a precisão foi avaliada no teste de

repetitividade e demonstrou concordância entre os resultados das medições
59
sucessivas do mesmo mensurado, efetuadas sob as mesmas condições, não foi

evidenciado nenhuma dispersão entre os 7 resultados, apresentados na Tabela 13.
Todos os compostos do estudo apresentaram repetitividade e
precisão dentro do recomendado pela ABNT que cita que o desvio padrão relativo
deve ser menor que o desvio padrão relativo calculado pela equação de Horwitz
(ABNT NBR 14029, 2016).
Tabela 13. Teste de Recuperação dos compostos clomazone, diuron e hexazinona.

Padrão Fortificada Nível 2 Recuperação DPR
(µg mL-1) (µg mL-1) (%)
clomazone 5,0 4,8 96,0
diuron 5,0 5,3 106
hexazinona 5,0 4,6 92,0
O cromatograma da amostra de recuperação é apresentado na

Figura 19 e foi preparado como descrito no item 3.5.5 para a fortificada nível 2.
Figura 19. Cromatograma de amostra fortificada com os padrões de clomazone,

diuron e hexazinona nas concentrações de 0,50 µg mL-1 e condições estabelecidas
por CLAE-UV.

60
4.3 APLICAÇÃO DO MÉTODO DESENVOLVIDO
Após o desenvolvimento do método de quantificação de

agrotóxicos em água, o método foi utilizado para análise de amostras
provenientes da lavagem da planta piloto (Figuras 5,6 e 7) onde foi produzido o
herbicida contendo os compostos em estudo. A Tabela 14 apresenta os
resultados de amostras de descontaminação da planta piloto.
Tabela 14. Resultados obtidos para as amostras de limpeza da planta piloto em µg

mL-1.
Amostra clomazone diuron hexazinona
1 0,38 4,92 1,95
2 0,11 3,50 0,23
3 0,03 1,16 0,05
4 < LD 0,02 < LD
5 < LD < LD < LD
Figura 20. Cromatograma de amostra de descontaminação em água.
Na Figura 20 é apresentado o cromatograma proveniente da análise

da amostra de água de descontaminação por CLAE/UV e na Tabela 14 é possível
observar as concentrações dos compostos proveniente da primeira lavagem dos
61
equipamentos da planta piloto estão com as concentrações dos 3 agrotóxicos dentro

da faixa linear de trabalho, certificando que o método é aplicável para as amostras
de descontaminação analisadas.
Figura 21. Distribuição na curva analítica da amostra de descontaminação

proveniente da primeira lavagem da planta piloto para (a) clomazone, (b) diuron e (c)
hexazinona com resposta em mAU e quantidade do composto em µg L -1.
62

63
5 CONCLUSÃO
A seleção dos analitos para este estudo partiu da necessidade de

identificar e quantificar os herbicidas, a fim de evitar a contaminação cruzada no
processo produtivo e controlar a água utilizada nos processos de descontaminação
após a produção de um produto com ação herbicida que contêm clomazone, diuron
e hexazinona como princípios ativos.
Com o método desenvolvido por CLAE-UV/DAD foi possível analisar
amostras de água residuais contendo os agrotóxicos clomazone, diuron e
hexazinona. Ambos os compostos foram determinados e quantificados na mesma
análise em baixas concentrações.
A validação do método se mostrou confiável para determinação dos
compostos por CLAE-UV/DAD, segundo as normas da ABNT, possibilitando a
identificação e quantificação dos três compostos em uma mesma amostra, sem
comprometimento de sobreposição de picos ou componentes co-eluidos. No teste
de seletividade não houve interferentes podendo declarar que o método é específico
e seletivo. O coeficiente de correlação para ambos os compostos foram < 0,999,
podendo ser aplicado dentro dos limites de 0,050 a 1,690 µg mL-1 (faixa de trabalho
da curva analítica) para o composto clomazone, dentro dos limites de 0,050 a 6,720
µg mL-1 para o composto diuron e podendo ser aplicado dentro dos limites de 0,060 a
7,350 µg mL-1 para o composto hexazinona.
O limite de detecção e quantificação se demonstraram aplicáveis
utilizando a relação sinal/ruído obtido. A recuperação do método foi de 85,67 % para
clomazone, 116,76 % para diuron e 93,72 % para hexazinona, estando dentro da
faixa aceitável pela norma de 75 a 125 %. Para o teste de precisão foi obtido um
desvio-padrão relativo de 96,0 % para clomazone, 106 % para diuron e 92,0 % para
hexazinona, portanto o método apresentado mostrou-se exato e preciso.
Assim, o método desenvolvido e validado por CLAE-UV/DAD
mostrou-se eficiente e com rapidez para análise simultânea dos agrotóxicos
clomazone, diuron e hexazinona, contemplando todos os critérios e valores
estipulados recomendados pelas normas da ABNT.
64
REFERÊNCIAS
AE – Associação brasileira de saúde coletiva; Fiocruz – Fundação Oswaldo Cruz;

Inca – Instituto Nacional de Câncer. Uma verdade cientificamente comprovada:
os agrotóxicos fazem mal à saúde das pessoas e ao meio ambiente. Abrasco;
Fiocruz; Inca, 6 set. 2013.
ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária). Guia para qualidade em

química analítica: uma assistência a acreditação. Brasília, DF, 2004.
ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária). Classificação e Rotulagem de

Agrotóxicos, 2021a. Disponível em:
https://www.gov.br/anvisa/pt-br/acessoainformacao. Acessado em: 14 novembro
2021.
ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Agrotóxicos e toxicologia,

notícias da Anvisa: Reavaliação de agrotóxicos: 10 anos de proteção a população.
Disponível em:< http://www.anvisa.gov.br/divulga/noticias.htm > Acessado em 20 de
novembro de 2021b.
Associação Brasileira de Normas Técnicas - ABNT NBR14029:2016, Agrotóxicos e

afins – Validação de métodos analíticos. 3°ed. Versão corrigida 2017.
BAINBRIDGE, K. T.; BRODIE, J. E.; FAITHFUL, J. W.; SYDES, D. A.; LEWIS, S. E.

Identifying the land-based sources os suspended sediments, nutrientes and
pesticides discharged to the Great Barrier Reef from the Tully-Murray Basin,
Queenskand, Australia. Marine and Freshwater Research, Collingwood, v. 60, p.
1081-1090, 2009.
BERNARDES, A. C. M.; SOUZA, S. V. C. de. Análise comparativa do guia para

validação de métodos analíticos propostos pela ANVISA (RE no 899 de 2003)
com o documento orientado do INMETRO e o protocolo internacional
harmonizado pela AOAC International, ISO e IUPAC. Revista Analytica, v. 51, p.
65
66-77, 2011.
BERNARDES, M. F. F., PAZIN, M.; PEREIRA, L. C.; DORTA D. J. Impact of

Pesticides on Environmental and Human Health. In Tech, Londres, p. 195-233,
2015.
BRASIL. Lei n°. 9.433 de 8 de janeiro de 1997. Institui a Política Nacional de

Recursos Hídricos, cria o Sistema de Gerenciamento de Recursos Hídricos. Diário
Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 8 jan. 1997. Disponível
em: http://planalto.gov.br/ccivil_03LEIS/I9433.htm. Acesso em 21 de novembro de
2021.
BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria no 2.914 de 12 de dezembro de 2011.

Dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água
para consumo e seu padrão de potabilidade, 2011.
BRITO, N. M. et al. Validação de métodos analíticos: estratégia e discussão.

Pesticidas: Revista Ecotoxicologia e Meio Ambiente, v. 13, p. 129-146, 2003.
BRUSSLAN, J.; HASELKORN, R. Resistance to the photosystem II herbicide

diurom is dominant to sensitivity in the cyanobacterium Synechococcus sp.
PCC 7942. The EMBO Journal, v. 8, p. 1237-1245, 1989.
CALDAS, S. S.; GONÇALVEZ, F. F.; PRIMEL, E. G.; Principais técnicas de preparo

de amostra para a determinação de resíduos de agrotóxicos em água por
cromatografia líquida com detecção por arranjo de diodos e por espectrometria de
massas, Química Nova, 34:9, 1604-1617, 2011.
CARBO, L.; SOUZA, V.; DORES, E. F. G. C.; RIBEIRO, M. L.; Determination of

pesticides multiresidues in Shallow Groundwater in a cotton-growing region of
Mato Grosso, Brazil. Journal of the Brazilian Chemical Society, 19:6, 1111:1117,
2008.
CASSIANO, N. M. et al. Validação em métodos cromatográficos para análises de

66
pequenas moléculas em matrizes biológicas. Química Nova, v. 32, n. 4, p. 1021-

1030, 2009.
COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S. Fundamentos de cromaografia.

Campinas: Editora da UNICAMP, 2006. 452p.
EURACHEM. The fitness for purpose of analytal methods: a laboratory guide to

method validation and related topics. 1998.
FARD, E. M. G. P. Avaliação da qualidade da água Mineral e do Processo de

Envase em Duas Fontes Comerciais. F. 130. Dissertação (Mestrado em
Tecnologia de Alimentos) – Universidade Federal do Paraná. 2021.
FARIAS. P. J. L. Água: bem jurídico econômico ou ecológico? Brasília: Jurídica,

p. 532, 2015.
FERNANDO, A. L., DUARTE, M. P. Uso de Pesticidas em Portugal. Lisboa:

Faculdade de ciências e tecnologia, 2011.
INMETRO. Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial.

Orientação sobre validação de métodos analíticos, DOQ-CGCRE-008, revisão
04, Brasília, 2011.
KARAN, Leandro. Seminário de Educação Ambiental da Pelotas. 2.,2020,

Pelotas. Anais.
LANÇAS, F. M. Validação de métodos cromatográficos de análise. São Carlos:

RiMa, p. 46, 2009.
LANÇAS, F. M.; Cromatografia líquida moderna: HPLC/CLAE. Campinas: Editora

Átomos, 2009.
LEITE, F., Validação em análise química. 4ª ed. Campinas: Átomo, 2002.

MANCUSO, P. C.; SANTOS, H. F. Reuso de água. 1.ed. Barueri. SP: Manole. 2003.
67
NORA, Daiane Dalla. Grupos químicos e modos de ação dos herbicidas. 2015.
Disponível em: <https://elevagro.com/materiais-didaticos/grupos-quimicos-e-modos-
de-acao-dos-herbicidas-1/>. Data de acesso: 21 de novembro de 2021.
OKAFOR, N. Environmental Microbiology of Aquatic and Waste Systems. 1. Ed.,

Springer: South Carolina, p. 324, 2011.
PADILLA, W. Tecnologías apropiadas y sus estrategias en la perspectiva

social, económica y ambiental, el fertirriego como herramienta alternativa en
ibero-américa. Grupo Clínica Agrícola y Univ.Técnológica Equinoccial, Ecuador,
2020.
PEIXOTO, S. C. Validação e aplicação de método empregando QuEChRES

modificado e GC-ECD para determinação de resíduos de pesticidas em grão e
casca de arroz. 2010. Tese (Doutorado em Química) - Curso de Programa de Pós-
Graduação em Química, Departamento de Centro de Ciências Naturais e Exatas,
Universidade Federal de Santa Maria.
PRATES, C. B.; GEBARA, S. S.; POPPI, N.; Análise de pesticidas

organoclorados em água usando a microextração em fase sólida por
headspace com cromatografia gasosa e espectrometria de massas. Química
Nova, 34:7, 1260-1264, 2011.
RANGO, J. P.; COLSON, A. M. Molecular basis for resistence for Antimycin and
Diuron, Q-cicle inhibitors acting at the Qi site in the mitochondrial
ubiquinolcytochrome c reductase in Saccharomyces cerevisiae. The Journal of
Biological Chemistry, v. 239, p. 12564-12570, 1988.
REBOLÇAS, A. BRAGA, B., TUNDISI, J. G., Águas Doces no Brasil- Capital

Ecológico Uso e Conservação. 3 ed. São Paulo: Escritura Editora, p.748, 2006.
RIBANI, M. et al. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Química

68
Nova, v. 27, n. 5, p. 771-780, 2004.
RIBEIRO, A. C. A. Resíduos de pesticidas em águas superficiais de área de

nascente do rio São Lourenço-MT: validação de método por extração em fase sólida
e cromatografia líquida. Química Nova, v. 36, n. 2, p. 284-290, 2013.
RIBEIRO, F. A. de L. et al. Planilha de validação: uma nova ferramenta para estimar

figuras de mérito na validação de métodos analíticos univariados. Química Nova, v.
31, n. 1, p. 164-171, 2008.
RIVERSOS, A. C. G. Análise de Pesticidas por Espectrometria de Massas

Acoplada a Cromatografia Gasosa (CG-EM). Goiânia, Enciclopédia Biosfera-
Centro Científico Conhecer, v. 8, n. 15 p. 2008-2018, 2012.
SILVA, A. K. FLORES, L. C. GALDEANO, M. M. VAL, P. T. Reuso de água e suas

implicações jurídicas. 1.ed. São Paulo.SP: Navegar. 2003.
SILVA, D. R. O.; AVILA, L. A.; AGOSTINETTO; BUNDT, A. D. C. PRIMEL, E. G.;

CALDAS, S. S. Ocorrência de agrotóxicos em águas subterrâneas de áreas
adjacentes a lavouras de arroz irrigado. Química Nova, 34:5, 748-752, 2011.
SOUZA, V. de. Avaliação da contaminação de águas por resíduos de pesticidas

em área de cultura de algodão: região de Primavera do Leste – MT. 2006. 125 f.
Tese (Doutorado em Química) - Instituto de Química, Universidade Estadual
Paulista, Araraquara, 2006.
SPADOTTO, C. A., GOMES, M. A. F.., LUCHINI, L. C., ANDRÉA, M. M.

Monitoramento do Risco Ambiental de Agrotóxicos: princípios e
recomendações. Jaguaruúna: Embrapa Meio Ambiente, 2004. 29 p. (Embrapa Meio
Ambiente. Documentos, 42).
TELLES, D. A. COSTA, R. H. NUVOLARI, A. TEIXEIRA, E. P. RIBEIRO, F. M.

NASCIMENTO, J. E. STANGE, K. BASSOI, L. J. SOUZA, M. O. PAULA, P. N.
BRESAOLA JR, R. CARRARA, S. M. Reuso de água: conceitos, teorias e
69
práticas. 2.ed. São Paulo.SP: Blucher. 2010.
TSUTIYA, M. T. Abastecimento de água. 3.ed. São Paulo.SP: Departamento de

Engenharia Hidráulica e Sanitária da Escola Politécnica da Universidade de São
Paulo. 2006.
VERMA, J. P.; JASWAL, D. K. Pesticide relevance and their microbial

degradation: a-state-of-art. Rer. Environ. Sci. Biotechonol. V.13, p. 429-466,
2014.
WATANABE, E.; KOBARA, Y.; BABA, K.; EUN, H. Aqueous acetonitrile extraction
for pesticide analysis in agricultural products with HPLC-DAD. Food Chem., v.
154, p. 7-12, 2014.
BRASIL. Decreto nº 4.074, de 4 de janeiro de 2002. Regulamenta a Lei no 7.802,

de 11 de julho de 1989, que dispõe sobre a pesquisa, a experimentação, a
produção, a embalagem e rotulagem, o transporte, o armazenamento, [...] e a
fiscalização de agrotóxicos, seus componentes e afins, e dá outras
providências. Diário Oficial da União: seção 1, Brasília, DF, ano 139, n. 5, p. 1-12, 8
jan. 2002.
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA

SILVA. Ambiente, trabalho e câncer: aspectos epidemiológicos, toxicológicos e
regulatórios / Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva. – Rio de
Janeiro: INCA, 2021.
Skoog, D. A, West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Fundamentos de Química

Analítica. Editora Thomson, tradução da 8ª edição, 2006.
SCOTT, R. P. W. Liquid Chromatography. Chrom-Ed Book Series-library4science,

LLC, 2003.
ANDRADE, L. S.; LAURINDO, E. A.; OLIVEIRA, R. V.; ROCHA-FILHO, R. C.; CASS,

70
Q. B. Development of a HPLC method to follow the degradation of phenol by

electrochemical or photoelectrochemical treatment. Journal of the Brazilian
Chemical Society, vol.17 no.2 São Paulo, Mar./Apr. 2006
CASS, Q. B.; DEGANI, A. L. G. Desenvolvimento de métodos por HPLC,

Fundamentos, Estratégias e Validação. São Carlos: Edufscar, p. 53, 2001.
AMORIM, A. F. V. Métodos Cromatográficos. Editora UAB/UECE, 1ª edição, 2019.
LIANG, S. GE, S. WAN, L. ZHANG, J. Can climate change cause the Yellow River
to dry up? Water Resour. Res., 46 (2) (2010). Disponível em:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666683921000213#bib0040.
Acessado em: 25 de abril de 2022.
M. Palmer, A. Ruhi. Linkages between flow regime, biota, and ecosystem

processes: Implications for river restoration Science, 365 (6459) (2019).
BIERKENS, M.F. WADA, Y. Non-renewable groundwater use and groundwater

depletion: A review Environ. Res. Lett., 14 (6) (2019).
ZHOU, Y. JMA, J.Y. ZHANG, Y. LI, L. FENG, Y. ZHANG, K. SHI, J.D. BROOKES, E.
Jeppesen. Influence of the three Gorges Reservoir on the shrinkage of China’s
two largest freshwater lakes. Glob. Planet. Change, 177 (2019).
TUNDISI, J.G., MATSUMURA-TUNDISI, T., CIMINELLI, V.S. & BARBOSA, F.A.

Water availability, water quality, water governance: the future ahead.
Hydrological Sciences and Water Security: past, present and future. Extended
abstract of the 11th Kovacs Colloquium. UNESCO Publication, Paris, France, 2014.
AUGUSTO, L. G. S.; GURGEL, D. G. I.; CÂMARA NETO, F. H.; MELO, H. C.;

COSTA, M. A. O contexto global e nacional frente aos desafios do acesso adequado
à água para consumo humano. Revista Ciência e saúde coletiva, Rio de Janeiro, v.
17, n. 6, Jun. 2012. Disponível em
71
https://www.scielo.br/j/csc/a/BLQQZSthGK3KMFZdj9zwQKL/abstract/?lang=pt.
Acesso em: 25 de abril de 2022.
RODRIGUES, B. N.; ALMEIDA, F. S. Guia de herbicidas. Londrina: IAPAR, 2005.

592p. Disponível em:
https://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/item/50545/1/salvador.pdf .
Acessado em: 23 de abril de 2022.
GRUBERT, L. C. 2018. Freitag Laboratórios. Acessado em:

https://freitag.com.br/blog/o-que-e-a-cromatografia-liquida-de-alta-eficiencia.
Disponível em: 23 de abril de 2022.
CIOLA, R. Fundamentos de Cromatografia Líquido de alto desempenho: HPLC,

São Paulo: Edgard Blucher, 2003.
TONHI, E.; COLLINS, K. E.; JARDIM, I. C. S. F. e COLLINS, C. H. Fases

estacionárias para cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa
(CLAE-FR) baseadas em superfícies de óxidos inorgânicos funcionalizados.
Quím. Nova, vol.25, no.4, São Paulo, 2002.
BOTTOLI, C. B. G.; CHAUDHRY, Z. F.; FONSECA, D. A.; COLLINS, K. E.;

COLLINS, C. H. Poly(alkymetylsiloxanes) thermally immobilized on silica as
stationary phases for High-performance Liquid Chromatography. Journal
Chromatography A, 948: 121, 2002.
OLSEN, B. A. Hydrophilic interaction Chromatography using amino and silica

columns for the determination of polar pharmaceuticals and impurities. Journal
of Chromatography A, 913: 113, 2001.

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ELISANGELA ROSA RIBEIRO

VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA ANÁLISE DE

VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA ANÁLISE DE

Dissertação apresentada à Universidade

Orientadora: Profª. Drª Maria Luiza Zeraik

VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA ANÁLISE DE AGRTÓXICOS EM

Dissertação apresentada à Universidade

Orientadora: Profª. Drª. Maria Luiza Zeraik

Profª. Drª. Diana Nara Ribeiro de Sousa

Prof. Drª. Julliana Izabelle Simionato Stipp

Londrina, 02 de junho de 2022.

Agradeço a Profª. Drª. Maria Luiza Zeraik, pela orientação e

Aos membros da banca examinadora, Profª. Drª. Diana Nara Ribeiro

Ao Departamento de Química da UEL.

Aos colegas da ADAMA BRASIL que contribuíram com

Nas empresas de proteção de cultivos e produtoras de

Palavras-chave: agrotóxicos; cromatografia em fase líquida; validação de método.

In crop protection companies, producers of agrochemicals, there is

Keywords: pesticides; liquid phase chromatography; method validation.

ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas

UEL Universidade Estadual de Londrina

Os agrotóxicos são substâncias utilizadas para combater

agroindústrias, a saúde pública e o meio ambiente, deve haver uma rigorosa

presentes da amostra no eluente com diferentes comprimentos de onda durante a

1.1 OBJETIVO GERAL

O objetivo geral deste trabalho compreende desenvolver e validar

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Validar e desenvolver o método empregando análises por

2.1 DISPONIBILIDADE DE ÁGUA

O Brasil é o maior depositário natural de águas doces do planeta,

Figura 1. Tendencias na evolução dos problemas da qualidade da água a partir da

Fonte: TUNDISI (2014).

A análise recente (TUNDISI et al., 2014) da evolução dos problemas

2.2 INDUSTRIA E O USO DE ÁGUA

Desde a revolução industrial, a economia mundial cresce com uma

2019); e encolhimento do lago/pântano (Zhou et al., 2019). Esses problemas

2.3 REUSO INDUSTRIAL DE ÁGUA

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Desde a criação dos agrotóxicos seu uso fundamental é na

2.5 PESTICIDAS SELECIONADOS

Os três agrotóxicos alvos deste estudo são herbicidas, que entre os

Figura 2. Fórmula estrutural de a) clomazone b) diuron c) hexazinona.

Fonte: Anvisa, 2021a.

O diuron apresenta baixa solubilidade em água 42 mg L -1, já a

2.6 MÉTODOS ANALÍTICOS PARA A DETERMINAÇÃO DE PESTICIDAS EM ÁGUA

O crescente uso de agrotóxicos vem afetando o equilíbrio do meio

Dispersive Liquid-Liquid Extraction) e a extração em fase sólida (SPE, do inglês

computador (CASS e DEGANI, 2001).

Figura 3. Componentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta eficiência,

Fonte: Laila Cristina GRUBERT, L. C. 2018.

A bomba de alta pressão empregada em CLAE tem a função de

2,2 cm para preparativas. O comprimento é variável, sendo comuns colunas

Com um ou dois arranjos de diodos colocados ao longo da extensão

2.7 VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO

Para a comprovação de que um novo método analítico produza

método (ANVISA, 2017). Ou seja, o quanto os dados se ajustam a equação linear

c) Intervalo de trabalho: é a faixa compreendida entre o menor e o