Resumo Das Técnicas

Técnicas
MTT
são o método mais comumente usado para a triagem de alto rendimento
da propriedade antiproliferativa de compostos em células cultivadas 1 . Os
sais de tetrazólio utilizados nesses ensaios medem a taxa metabólica
mitocondrial e refletem indiretamente os números de células
viáveis 2 , 3 , 4 , 5 . O sal de tetrazólio MTT é reduzido a cristal formazan
roxo insolúvel em água nas células metabolicamente ativas por
desidrogenases mitocondriais( catalisa a oxidação de NADH a NAD. Em
eucariotos esta enzima pode ser encontrada como componente do
complexo I transportador mitocondrial de elétrons.) 6 ,
, , ,
predominantemente succinato desidrogenase7 8 9 10 que podem ser
ainda medidos em espectrofotômetros após solubilização. A quantidade
total de formazan produzido após a redução do MTT é diretamente
proporcional ao número de células viáveis na cultura.
um tetrazol amarelo , é reduzido a roxo formazan nas células vivas. [4] É
adicionada uma solução de solubilização (geralmente dimetilsulfóxido ,
uma solução de etanol acidificado ou uma solução do detergente
dodecilsulfato de sódio em ácido clorídrico diluído ) para dissolver o
produto formazan roxo insolúvel em uma solução Quanto maior a
concentração de formazan, mais profunda a cor púrpura e, portanto,
maior a absorvância
anexina V
Nos estágios iniciais da apoptose, ocorrem alterações na superfície celular,
que até agora eram difíceis de reconhecer. Uma dessas alterações da
membrana plasmática é a translocação da fosfatidilserina (PS) do lado
interno da membrana plasmática para a camada externa, pela qual a PS
fica exposta na superfície externa da célula. A anexina V é um
Ca 2+proteína de ligação fosfolipídica dependente com alta afinidade para
PS. Portanto, esta proteína pode ser usada como uma sonda sensível para
exposição ao PS na membrana celular. A translocação do PS para a
superfície celular externa não é exclusiva da apoptose, mas ocorre
também durante a necrose celular. A diferença entre essas duas formas
de morte celular é que, durante os estágios iniciais da apoptose, a
membrana celular permanece intacta, enquanto no momento em que
ocorre a necrose a membrana celular perde sua integridade e fica com
vazamento. Portanto, a medição da ligação da anexina V à superfície
celular como indicativa de apoptose deve ser realizada em conjunto com
um teste de exclusão de corante para estabelecer a integridade da
membrana celular.
A morte celular por apoptose é um fenômeno complexo caracterizado por
condensação cromatínica, fragmentação do DNA e formação dos corpos
apoptóticos, sendo que a morte e proliferação celular estão intimamente
conectadas. Alguns reguladores do ciclo celular podem influenciar tanto a
divisão quanto a morte celular programada. A correlação entre ciclo
cellular e apoptose está comprovada devido às funções de c-Myc, p53,
pRb, Ras, PKA, PKC, Bcl-2, ciclinas e CK1. A fosforilação e desfosforilação
de proteínas controlada por proteínas quinases e proteínas fosfatases
constitui um dos principais mecanismos que regulam uma variedade de
processos celulares incluindo a morte celular. Várias proteases participam
dos processos de indução da morte celular, as mais conhecidas são as
caspases. Caspases são proteases aspartato específicas contendo cisteína,
as quais estão presentes entre as membranas mitocondriais e na matriz
nuclear na forma de zimogênios
O padrão de alterações morfológicas e bioquímicas celulares associadas
com a programação normal de morte celular e certos processos
patológicos in vivo inclui a formação de vacúolos citoplasmáticos,
encolhimento e diminuição do contato entre células vizinhas,
fragmentação da membrana nuclear e condensação cromatínica (WYLLIE;
KERR; CURRIE, 1980; MCCONKEY, 1998; MELO et al., 2000), despolarização
de membrana mitocondrial, fragmentação internucleossomal do DNA e
alterações na assimetria de fosfolipídeos de membrana plasmática
(CURTIN; DONOVAN; COTTER, 2002
Por outro lado, a morte celular por necrose ocorre, geralmente, em
resposta à injúria severa às células e é caracterizada morfologicamente
por inchaço citoplasmático e mitocondrial, ruptura da membrana
plasmática e liberação do conteúdo extracelular.
células moribundas podem ser caracterizadas como células apoptóticas
precoces, nas quais a membrana plasmática permanece intacta, mas
expõe fosfatidilserina (PS) na superfície celular para mediar seu
reconhecimento pelos fagócitos. As células apoptóticas precoces podem
se tornar células apoptóticas tardias, também conhecidas como células
necróticas secundárias, quando a membrana plasmática se torna
permeabilizada.
A fase apoptótica inicial pode ser bastante rápida e muitas vezes pode ser
esquecida, fazendo parecer que as células são vivas ou tardias apoptóticas
/ necróticas. Portanto, muitas vezes é necessário realizar um experimento
ao longo do tempo para provar que as células estão atravessando a
apoptose precoce antes de atingir a apoptose / necrose tardia.
Ciclo celular
A análise do ciclo celular por quantificação do conteúdo de DNA foi uma

das primeiras aplicações da citometria de fluxo. O DNA de células de
mamíferos, leveduras, plantas ou bactérias pode ser corado por uma
variedade de corantes de ligação ao DNA. A premissa desses corantes é
que eles são estequiométricos, ou seja, se ligam na proporção da
quantidade de DNA presente na célula.
Dessa maneira, as células que estão na fase S terão mais DNA que as
células do G1. Eles absorvem proporcionalmente mais corante e
fluorescem mais intensamente até que dobrem seu conteúdo de DNA. As
células no G2 serão aproximadamente duas vezes mais brilhantes que as
células no G1.
Na maioria dos casos, as células devem ser fixadas ou permeabilizadas
para permitir a entrada do corante que é bombeado ativamente pelas
células vivas. Para fixação, álcool ou aldeído são comumente usados. O
álcool é um fixador desidratante que também permeabiliza. Isso permitirá
fácil acesso do corante ao DNA e fornece bons perfis (baixo coeficiente de
variação, CV). A desvantagem é que muitas vezes é incompatível com
proteínas fluorescentes e alguns marcadores de superfície.
Ciclo celular é uma série de eventos coordenados através dos quais a

célula duplica seu conteúdo e se divide. Tradicionalmente o ciclo celular é
dividido em 4 fases (Figura 3): G1, S, G2 e M. As fases G1, G2 e S em
conjunto são chamadas de intérfase, sendo G1 e G2 fases de intervalo,
que fornecem tempo para a célula crescer e averiguar 11 o meio interno e
externo, e S, a fase de síntese onde ocorre a duplicação do DNA
(Malumbres & Barbacid 2001; Li et al., 2006; Hochegger et al., 2008;
Alberts et al., 2004). A fase M corresponde à mitose, quando os
cromossomos são separados e as células divididas (citocinese) (Nurse,
1997; Cooper & Hausman, 2009). Depois que a citocinese é completada, a
nova célula gerada pode continuar a divisão celular ou interromper sua
proliferação. Células que escolhem a última opção entram em um estado
conhecido como “quiescência” ou G0, no qual parâmetros bioquímicos
permanecem pobremente definidos. As células que continuam a proliferar
avançam para a fase G1 de um novo ciclo (Malumbres & Barbacid, 2005. A
intérfase é formada pelas fases G1, S e G2, enquanto M representa a fase
mitótica. Células em repouso permanecem em G0.
Para assegurar a correta progressão do ciclo celular, as células apresentam
uma série de pontos de checagem, os quais previnem que a célula entre
em uma fase até que tenha completado com sucesso a fase anterior.
Desequilíbrios nestes controles resultam em proliferação descontrolada e
possibilitam o crescimento neoplásico (Malumbres & Barbacid, 2001).
Existem 4 pontos de checagem, bem caracterizados, sendo estes
modulados por fatores internos e externos. Ao final da fase G1 existe um
ponto após o qual a célula esta comprometida com o ciclo, chamado
“ponto de restrição”, termo este proposto por Arthur Pardee em 1974. O
ponto de restrição em G1 corresponde ao ponto de checagem onde são
verificados tamanho e estado fisiológico da célula, bem como as
interações com o meio extracelular. Caso haja alguma alteração nesses
parâmetros, as células podem interromper a proliferação e/ou entrar em
morte por apoptose. O ponto de checagem da fase S averigua possíveis
erros na replicação do DNA. Ao final de G2 há busca por DNA danificado
ou não duplicado, além de análise da correta duplicação dos
centrossomos. Na fase M, o ponto de checagem identifica se os
cromossomos foram corretamente alinhados ao fuso mitótico
Migração
A migração celular é um processo crucial em que as células devem ser
capazes de mudar e alcançar sua posição adequada em um determinado
ambiente para executar sua função ( te Boekhorst et al., 2016 ). Nos
organismos multicelulares, esse fenômeno desempenha um papel
importante na gastrulação, morfogênese embrionária, desenvolvimento
do sistema nervoso, homeostase tecidual e tráfico de células imunes. No
entanto, as células em movimento podem ser desreguladas e contribuir
para muitos processos patológicos, como inflamação e metástase do
câncer ( Charras e Sahai, 2014 ; Mayor e Etienne-Manneville, 2016 ; van
Helvert et al., 2018 ).
No desenvolvimento e progressão do câncer, invasão e metástase

ocorrem quando as células tumorais se disseminam do tumor primário
que se espalha pelos sistemas circulatório e linfático, invadem as
membranas basais e as paredes endoteliais e finalmente colonizam órgãos
distantes ( Friedl e Wolf, 2003 ; Friedl e Alexander , 2011 ). A migração,
invasão e adesão celular são etapas fundamentais nesse processo;
portanto, seu estudo e entendimento são cruciais para combater a
doença.
Adesão
Múltiplas e diversas moléculas de adesão celular participam de interações
intercelulares e matriz celular extracelular do câncer. A progressão do
câncer é um processo de várias etapas, no qual algumas moléculas de
adesão desempenham um papel central no desenvolvimento de
metástases recorrentes, invasivas e distantes. Um crescente corpo de
evidências indica que as alterações nas propriedades de adesão das
células neoplásicas desempenham um papel central no desenvolvimento e
progressão do câncer. A perda de adesão intercelular e a descamação das
células da lâmina própria subjacente permitem que as células malignas
escapem do seu local de origem, degradam a matriz extracelular,
adquirem um fenótipo mais móvel e de invasão e, finalmente, invadem e
metastatizam. Além de participar da invasão e metástase de
tumores, moléculas de adesão regulam ou contribuem significativamente
para uma variedade de funções, incluindo transdução de sinal,
crescimento celular, diferenciação, expressão gênica específica do local,
morfogênese, função imunológica, motilidade celular, cicatrização de
feridas e inflamação. A molécula de adesão celular (CAM), um sistema
diversificado de glicoproteínas transmembranares, foi identificado que
medeia a adesão célula-célula e matriz extracelular assim como a E-
caderina .

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