TCC Erasmoguilhermedossantosneto

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA E FISIOLOGIA ANIMAL
CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ERASMO GUILHERME DOS SANTOS NETO
FOLHAS DE Syzygium malaccense Linnaeus (MYRTACEAE):

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E EFEITOS SOBRE Plutella xylostella
Linnaeus (LEPIDOPTERA: PLUTELLIDAE)
Recife, 2019

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado

para o cumprimento parcial das exigências
para obtenção do título de Bacharelado em
Ciências Biológicas pela Universidade
Federal Rural de Pernambuco.
Orientador: Prof. Dr. Emmanuel V. Pontual
Coorientadora: Msc. Isabella C. Vila Nova
Recife, 2019

Área de concentração: Ciências Biológicas
Data de defesa: 28/06/2019
Resultado: ___________________________________________________________
BANCA EXAMINADORA:
_______________________________________________________________
Prof. Dr. Emmanuel Viana Pontual (Presidente)
Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, UFRPE
_______________________________________________________________
Prof. Dr. Ardilles Juan Carlos Alves dos Santos (1° Titular)
Departamento de Nutrição, Universidade Federal do Piauí (UFPI)
_______________________________________________________________
Msc. Eva Luana Almeida da Silva (2° Titular)
_______________________________________________________________
Msc. Welton Aaron de Almeida (3° Titular)
_______________________________________________________________
Msc. Hanna Gracie Inez de Freitas Lima (Suplente)

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal Rural de Pernambuco
Sistema Integrado de Bibliotecas
Gerada automaticamente, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
E55f Santos Neto, Erasmo Guilherme dos Santos Neto

FOLHAS DE Syzygium malaccense Linnaeus (MYRTACEAE): CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E EFEITOS
SOBRE Plutella xylostella Linnaeus (LEPIDOPTERA: PLUTELLIDAE) / Erasmo Guilherme dos Santos Neto Santos
Neto . - 2019.
50 f. : il.
Orientador: Emmanuel Viana Pontual.

Coorientadora: Isabella Coimbra Vila Nova.
Inclui referências e apêndice(s).
Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação) - Universidade Federal Rural de Pernambuco, , Recife, 2020.
1. Jambeiro. 2. lectinas. 3. inibidores de tripsina. 4. metabólitos secundários. 5. atividade lagarticida. I. , Emmanuel

Viana, orient. II. Nova, Isabella Coimbra Vila, coorient. III. Título
CDD
DEDICATÓRIA
Dedico esta monografia aos meus pais e família,

sem o amor, carinho e paciência deles não teria
conseguido chegar até aqui.
AGRADECIMENTOS
A Deus primeiramente, por Ele ter me conduzido até aqui, pois foi uma luta enorme
entre medos e incertezas, sorrisos e lágrimas, por Ele ter me dado paciência, sabedoria e
humildade.
Aos meus pais, que mesmo distantes incentivaram sempre minha educação e me
fizeram o que sou hoje.
A minha irmã, que sempre me deu apoio em tudo o que eu faço, me dando conselhos,
onde a cada dia a gente se fortaleceu juntos, mesmo com todas as dificuldades.
Aos meus primos-irmãos, Manu, Bel, Lu, Rafa, Flávia, Dário, Gabi, Germando,
Dada, Lucas e Léo, só tenho a agradecer pela infância maravilhosa regada de trelas, risadas e
praias com Tia Márcia.
Aos meus avós maternos Maria de Lourdes e Floriano Paulo (In memoriam) e
paternos Maria Campelo e Erasmo Santos, vocês são os meus amores, obrigado pela família
linda que vocês formaram.
Aos meus tios e tias, sem o apoio de vocês não teria conseguido chegar até aqui, o
meu obrigado a cada um.
Aos meus amigos do Colégio Adventista, Pedro, Landerson e Thamires, obrigado

pela amizade sincera de vocês e que possamos nos reunir mais vezes, amo cada um.
As amigas do Ginásio Pernambucano, Débora, Jan Jan, Day, Rosa, Rayssa, Mayara,
Maristella e Stela. Só tenho a agradecer a Deus por vocês estarem em minha vida, sei que
cada uma seguiu caminhos diferentes, mas a amizade da gente vai durar por anos.
Aos meus químicos preferidos que a Rural me deu, Eliada, Faby, Rodrigo, Naida e
Manu, obrigado por vocês existirem em minha vida. Agradeço a Deus por Ele ter colocado
vocês no meu caminho. Os sofrimentos que nós tivemos, a cada prova e seminário, só
fortaleceram mais nossas amizades, mas também houve momentos incríveis ao lado de
vocês, em que até o Casa Amarela (Cabugá) tem histórias nossas, amo vocês!
Aos meus Ruralindos mais lindos e futuros biólogos, Mari, Camila, Ana, Gio, Carol,
Gleice, Luis e Lívia. Obrigado por fazer parte desses anos que passei pela UFRPE, vocês
fizeram um grande diferencial, os sorrisos, lágrimas, aflições, as calouradas e conselhos tudo
isso vou levar comigo. Agradeço por me aguentarem com minhas ansiedades, choros e
nervosismos por causa das provas e seminários. Amo cada um de vocês e sei que posso
contar com cada um de vocês.
Ao meu orientador/amigo, por ter confiado a mim essa grande responsabilidade,

agradeço a Deus por ter colocado em minha vida. Obrigado pelas reclamações, incentivos e
sorrisos por cada vitória nossa. Só tenho a agradecer!
Aos meus cientistas favoritos Welton, Isabella, Camila e Pedro, obrigado por ter
paciência comigo, pelas ajudas nos laboratórios e escritas de resumos.
Aos meus amigos das Paróquia São Judas Tadeu, São Vicente de Paulo, vocês só me
fortaleceram a cada conselho e orações.
A Carlos Lima, que é uma das pessoas mais incríveis que conheci, agradeço a Deus
por Ele ter colocado você em meu caminho, obrigado pela paciência e companheirismo, por
ser essa pessoa tão amável e ao mesmo tempo bruto, obrigado meu sertanejo.
Ao LABTEC, por ter pessoas maravilhosas que me acolheu quando precisei.
Ao BIOPROT, em especial ao professor Thiago e a Robson, por ter me ajudado em

alguns experimentos e dúvidas.
Às meninas Elaine e Francielle, que ajudaram e me acolheram no Laboratório de

Biologia de Insetos na Fitossanidade do Departamento de Agronomia da UFRPE.
Todo mundo da minha turma SB3 (Biofalos), cada um vai estar no meu coração.
Agradeço a banca examinadora, por aceitar meu convite.
A Universidade Federal Rural de Pernambuco, pela minha formação como pessoa e

como profissional, também oferecendo a bolsa auxílio, o PIC e o PIBIC, e ao MELHOR
R.U de todo o planeta, pelas comidas magníficas.
Ao CNPq (UNIVERSAL MCTI/CNPq 01/2016; Processo: 408789/2016-6) pelo

fomento a esta pesquisa.
Agradeço a todos que fizeram parte de minha trajetória!

EPÍGRAFE
“Sê humilde para evitar o orgulho, mas voa alto

para alcançar a sabedoria.” (Santo Agostinho)
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor,

mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou
o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o
que era antes”. (Marthin Luther King)
RESUMO
Plutella xylostella (Plutellidae) é uma importante praga que ataca culturas de brassicas
mundialmente. Syzygium malaccense (Myrtaceae), o jambeiro, é utilizada na medicina
popular e seus frutos são consumidos como artigo alimentício. Lectinas (proteínas ligadoras
de carboidratos) e inibidores de tripsina podem ter ação inseticida. Este trabalho caracterizou
o extrato aquoso de folhas de S. malaccense quanto à presença de metabólitos secundários,
lectinas e inibidor de tripsina e quanto à atividade inseticida contra P. xylostella. Análise por
cromatografia em camada delgada revelou a presença de polifenóis (taninos hidrolisáveis),
flavonóides, esteróides, saponinas e açúcares redutores no extrato de folhas, o qual também
conteve lectinas (Atividade hemaglutinante de 64) e inibidor de tripsina. A lectina do extrato
foi inibida pelos monossacarídeos glicose e N-acetilglicosamina e neutralizada pelas
glicoproteínas fetuína e ovoalbumina. O extrato de folhas apresentou efeito deterrente
alimentar e causou mortalidade de lagartas de P. xylostella. Foi registrada a taxa de
mortalidade de 80±15% para o extrato a 1%. Efeito deterrente de oviposição foi também
determinado para o extrato de folhas, uma vez que nos discos tratados foi detectada a
presença de cerca de 37 ovos, contra 80 ovos registrados no controle. O aquecimento
exaustivo do extrato de folhas alterou as atividades hemaglutinante e deterrente alimentar de
forma semelhante, sugerindo que estas podem ser atribuídas à mesma proteína. A exposição
do extrato de folhas às condições ambientais por 192 h neutralizou seu efeito deterrente
alimentar. Em conclusão, o extrato de folhas de S. malaccense é fonte de metabólitos
secundários, lectina e inibidor de tripsina, e constitui um agente inseticida contra P.
xylostella por causar mortalidade das lagartas e alterar seus comportamentos de alimentação
e oviposição.
Palavra – Chave: Jambeiro, lectinas, inibidores de tripsina, metabólitos secundários,

atividade lagarticida, deterrente alimentar, deterrente de oviposição.
ABSTRACT
Plutella xylostella (Plutellidae) is an important pest that attacks Brassicas cultures

worldwide. Syzygium malaccense (Myrtaceae), or jambeiro, is used in popular medicine and
its fruits are consumed as foodstuff. Lectins (carbohydrate-binding proteins) and trypsin
inhibitors can be insecticidal agents. This work characterized the aqueous extract of S.
malaccense for the presence of secondary metabolites, lectins and trypsin inhibitors, as well
as for insidicidal activity against P. xylostella. Analysis by thin layer chromatography
revealed the presence of polyphenols (hydrolyzed tannins), flavonoids, steroids, saponins
and reducing sugars in the leaf extract, which also contained lectins (hemagglutinating
activity of 64) and trypsin inhibitor. was inhibited by monosaccharides glucose and N-
acetylglucosamine and neutralized by the glycoproteins fetuin and ovalbumin. The leaf
extract exerted a detergent feed effect and induced mortality of P. xylostella caterpillars. The
mortality rate of 80 ± 15% for the 1% leaf extract was recorded. The oviposition detergent
effect was also determined for the leaf extract, since the presence of about 37 eggs was
detected in the treated discs against 80 eggs recorded in the control. Exhaustive heating of
the leaf extract altered the hemagglutinating and detergent food activities in a similar
manner, suggesting that these can be attributed to the same protein. Exposure of leaf extract
to environmental conditions for 192 h neutralized its food-producing effect. In conclusion,
leaf extract of S. malaccense is a source of secondary metabolites, lectin and trypsin
inhibitor, and constitutes an insecticidal agent against P. xylostella for causing mortality of
caterpillars and altering their feeding and oviposition behaviors.
Keywords: Malay apple, lectins, trypsin inhibitors, secondary metabolites, larvicidal

activity, feeding deterrent, oviposition deterrent.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Ciclo de vida de P. xylostella. (A) Ovos, (B) Lagartas alimentando-se, (C) pupas e (D)
inseto adulto. ............................................................................................................................... 16
Figura 2 - Representação esquemática do aspecto microscópico do ensaio de atividade

hemaglutinante para detecção de lectinas em determinada amostra. (A) Rede de hemaglutinação,
onde a lectina liga os carboidratos da superfície dos eritrócitos. (B) Inibição da atividade
hemaglutinante e não formação da rede de hemaglutinação. Fonte: O autor. ............................. 20
Figura 3 - Efeito da lectina inseticida no intestino do inseto. (A) entrada da lectina no intestino do
inseto. (B) lectinas se ligando ao sítio de reconhecimento. (C) degradação das células que a lectina se
ligou. Autor: Napoleão et al., 2018. .......................................................................................... 211
Figura 4 - Morfologia externa da arvore de S. malaccense. (A) Arvore de S. malaccense, com sua
forma piramidal. (B) Flor de S. malaccense (C) Fruto de S. malaccense, com forma oval e preso
sobre os ramo......................................................................................................................232
Figura 5 - Análise fitoquímica do extrato de folhas de Syzygium malaccense por cromatografia em

camada delgada.......................................................................................................................32
Figura 6 - Atividade inibidora de tripsina do extrato de folhas de Syzygium malaccense.

Concentrações do extrato de folhas: m/v. Controle: água destilada. Os asteriscos indicam diferença
significativa entre os tratamentos com o extrato de folhas e o controle..............33
Figura 7 - Efeito do extrato de folhas de S. malaccense (1%, m/v) sobre o comportamento de

oviposição de P. xylostella. ......................................................................................................... 35
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Classificação taxonômica de P. xylostella. Fonte: DIBELLI, 2014. ........................ 14
Tabela 2 - Nomenclatura vernácula de P. xylostella em diferentes países. Fonte: DIBELLI, 2014.

..................................................................................................................................................... 15
Tabela 3 - Sistemas de desenvolvimento e reveladores e padrões utilizados para análise fitoquímica

por cromatografia em camada delgada........................................................................................ 27
Tabela 4 - Atividade hemaglutinante do extrato de folhas de S. malaccense na presença de

carboidratos e glicoproteinas. ...................................................................................................... 33
Tabela 5 - Taxa de consumo das folhas de couve por larvas de Plutella xylostella tratadas com o
extrato de folhas de Syzygium malaccense submetido ou não ao aquecimento (100 ºC). Letras
diferentes indicam diferenças significativas entre os tratamentos determinadas pelo teste T de
Student (p < 0,05)........................................................................................................................ 34
Tabela 6 - Atividade hemaglutinante do extrato de folhas de Syzygium malaccense submetido ou não

ao aquecimento a 100 ºC. ............................................................................................................ 36
SUMÁRIO
1-INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 12
2-FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................................................... 14
2.1 – Plutella xylostella ......................................................................................................... 224
2.2 - Inseticidas naturais .......................................................................................................... 14
2.3 - Proteínas inseticidas ........................................................................................................ 19
2.4 - Syzygium malaccense.......................................................................................................22

3 - OBJETIVOS .......................................................................................................................... 26
3.1– Geral ................................................................................................................................ 26
3.2- Objetivos Específicos....................................................................................................... 26
4 - METODOLOGIA .................................................................................................................. 26
4.1 - Material vegetal e obtenção do extrato de folhas ............................................................ 26
4.2- Análise do perfil fitoquímico...........................................................................................27

4.3 - Ensaio da atividade hemaglutinante................................................................................ 28
4.4-Ensaio da Inibição da Atividade Hemaglutinante ............................................................. 29
4.5-Investigação da presença de Inibidores de Proteases ........................................................ 29
4.6-Bioensaios ......................................................................................................................... 30
4.6.1-Avaliação do Efeito deterrente alimentar e ensaio lagarticida ...................................... 29
4.6.2 – Efeito do extrato de folhas de S. malaccense sobre comportamento de oviposição de

fêmeas de P. xylostella ............................................................................................................ 27
4.6.3 – Avaliação da resitência do extrato de folhas de S. malaccense ao aquecimentoe às

condições ambientais .............................................................................................................. 30
4.7 – Análise estatística ........................................................................................................... 30
5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................... 31
6 - CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 38
7 - REFERÊNCIAS..................................................................................................................... 39
12
1. INTRODUÇÃO
Plutella xylostella, L. 1758 (Lepidoptera: Plutellidae), comumente conhecida

como traça-das-crussíferas ou, mais atualmente, traça-das-brássicas, é originária
provavelmente da região do Mediterrâneo, centro de origem das brássicas (FURLONG
et al., 2013; GRZYWACZ et al., 2010). É considerada a principal praga de plantas da
família Brassicaceae no Brasil e no mundo (MONNERAT et al., 2004). Essa espécie se
encontra disseminada em todos os continentes acompanhando a disseminação das
culturas da família vegetal (GRZYWACZ et al., 2010).
O ciclo de vida de P. xylostella compreende as fases de ovo, lagarta (quatro
instares larvais), pupa e adulto. As lagartas possuem coloração verde, enquanto o inseto
adulto possui uma cor parda, cada fêmea pode ovipositar, em média, 160 ovos durante
seu ciclo biológico, o qual pode variar de 15 a 35 dias, dependendo da temperatura que
é de 25 °C e os meses mais vistos são os da seca que fica entre Julho e Setembro.
(VACARI et al., 2012; CASTELO BRANCO et al., 1997).
Os inseticidas sintéticos são muito utilizados em vários países, inclusive para
controlar populações de P. xylostella, mas diversos problemas estão associados a esses
compostos, tais como alta toxicidade para organismos não alvos e surgimento de
populações de insetos resistentes, nesse sentido, a busca por novas fontes de agentes
inseticidas tem crescido com o objetivo de amenizar os efeitos dos inseticidas sintéticos
(DE BORTOLI et al., 2013; OLIVEIRA et al., 2011; YU & NGUYEN, 1992)
Dentre os agentes inseticidas alternativos, os extratos vegetais têm se destacado
devido à diversidade de compostos bioativos, muitos dos quais estão envolvidos em
mecanismos de defesa contra insetos e herbívoros, a utilização dos extratos vegetais tem
como vantagem principal a atuação através de diferentes mecanismos de ação, o que
pode minimizar a seleção de populações resistentes (GUIMARÃES et al., 2014;
RIBEIRO et al., 2009). Os extratos vegetais podem conter proteínas cujo potencial
inseticida tem sido relatado, dentre elas destacamos as lectinas e os inibidores de
proteases.
As lectinas são proteínas capazes de se ligar reversivelmente a carboidratos. Elas
estão presentes em todos os tipos de organismos, como seres humanos, plantas e até os
mais basais, como os vírus. Podem atuar como sítios de reconhecimento celular em
13
muitos processos biológicos. Assim apresentam diversas atividades biológicas,

incluindo ação inseticida (PAIVA et al., 2013).
A tripsina é uma protease digestiva, ubiquamente produzida no reino animal,
inclusive no grupo dos insetos. Essa enzima tem sido relatada como um interessante
alvo para ação de novos inseticidas (CAMAROTI et al., 2018; SOUZA et al., 2018). Os
inibidores de tripsina bloqueiam o sítio ativo da enzima, prejudicando a digestão de
proteínas e levando o inseto à morte por inanição (PONTUAL et al, 2014)
Syzygium malaccense (L.) Merr. & L.M. Perry, pertence à família Myrtaceae,
sendo conhecida como jambo vermelho, jambo-roxo ou jambo-encarnado. É uma árvore
que possui forma piramidal, podendo atingir entre 15 e 16 m de altura. Suas folhas
possuem coloração verde brilhante e as flores róseo-purpúrea. Seu fruto é carnoso,
indeiscente, do tipo bacóide, com forma ovoide, cor roxa e polpa suculenta (MELO et
al, 2009; CRUZ et al., 2004; COSTA et al., 2006). Este fruto é considerado um alimento
nutritivo por conter vitaminas A, B1 e B2 (MELO et al., 2009).
Nativa da Índia, S. malaccense foi inserida no Brasil, onde se adaptou e pode ser
encontrada em estados das regiões Norte e Nordeste, bem como nos locais mais quentes
da região Sudeste. Em várias partes do mundo, S. malaccense é empregada na medicina
popular para tratamento de processos inflamatórios, febre, coceira, diabetes, secreção no
pulmão, tosse, dores de cabeça, disenteria e como diurético (OLIVEIRA et al., 2006). A
sua safra acontece na maioria das vezes em estações mais chuvosas, três meses após a
floração, ocorrendo a coleta entre os meses de janeiro a maio (CRUZ et al., 2004;
FARIA et al., 2011).
O desenho experimental descrito neste Trabalho de Conclusão de Curso foi
motivado pelos prejuízos econômicos atrelados ao ciclo de P. xylostella, bem como pela
importância popular de S. malaccense. Aqui, a caracterização do extrato de folhas de S.
malaccense quanto à presença de metabólitos secundários, lectinas e inibidores de
tripsina e quanto aos efeitos sobre embriões e lagartas de P. xylostella são relatados.
14
2-FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 - Plutella xylostella
Plutella xylostella (L. 1758), mais conhecida como traça-das-brássicas, tem sua
taxonomia apresentada na (Tabela 1). Esta praga causa grandes prejuízos à agricultura
no âmbito internacional, sendo os danos principais causados pelas lagartas jovens, que
com o seu aparelho bucal do tipo mastigador atingem o tecido foliar deixando apenas a
epiderme superior os prejuízos sobre as brássicas cultivadas são proporcionais à
severidade do ataque, podendo ocasionar até mesmo a morte das plantas (FURLONG et
al., 2013; CARDOSO et al., 2010). P. xylostella tem facilidade em se espalhar por
grandes extensões territoriais, por isso ocorre em diferentes países do mundo, onde
apresenta nomenclatura vernácula variada (Tabela 2) (CARPINEIRA et al., 2001).
Categoria Classificação taxonômica

Reino Animalia
Infra-reino Protostomia
Superfilo Ecdysozoa
Filo Arthropoda
Subfilo Hexapoda
Classe Insecta
Subclasse Pterygota
Superordem Holometabola
Ordem Lepidoptera
Subordem Glossata
Infraordem Heteroneura
Superfamilia Yponomeutoidea
Família Plutellidae
Gênero Plutella
Espécie P. xylostella
Tabela 1 - Classificação taxonômica de P. xylostella. Fonte: DIBELLI, 2014.

15
País Nome popular

Brasil Traça das brássicas
Portugal Traça das couves
Estados Unidos da América e Inglaterra Diamondback moth
México Palomilla dorso de diamante
Itália Tignola delle crucifere e tignola dei covali
Japão Konaga
Holanda Koolmotje
Turquia Lahana guvesi
Israel Ash hakruv
Finlândia Kaalokoi
Dinamarca Kalmoel
Noruega Kalmoll
China Syau tsai
Suécia Kalmal
Tabela 2 - Nomenclatura vernácula de P. xylostella em diferentes países. Fonte: DIBELLI, 2014.
P. xylostella apresenta um ciclo de vida rápido, possuindo alta fecundidade e

aptidão para se adaptar aos mais variados climas e temperaturas. Essas características
levaram a este inseto ser considerada praga principal do grupo das Brássicas. Esse grupo
compreende vegetais como repolho (Brassica oleracea var. capitata Linnaeus), couve-
de-bruxelas (Brassica oleracea var. gemmifera (DC.) Zenker), couve-flor (Brassica
oleracea var. botrytis Linnaeus), brócolis (Brassica oleracea var. italica Plenck) e
couve-manteiga (Brassica oleracea var. acephala DC.) (ULMER et al., 2002; AHMAD
et al., 2005; DE OLIVEIRA et al., 2011; WARWICK et al., 2011).
O ciclo de vida de P. xylostella compreende as fases de ovo, lagartas (quatro
instares larvais), pupa e adulto (DE BORTOLI, 2009). Os ovos medem menos de 1 mm,
possuem forma oval e são encontrados geralmente isolados ou em grupos na parte
superior ou inferior das folhas, possuindo uma cor amarelada (CASTELO BRANCO et
al., 1997; THULER, 2009) (Figura 1A). O tempo estimado entre oviposição e eclosão
das larvas é entre 3-5 dias (UJAGIR; BYRNE, 2009). Quando as lagartas eclodem,
apresentam uma coloração esbranquiçada, logo após, se tornam verde-claras no instar
dois (MOREIRA et al., 2011). As lagartas (Figura 2B) adquirem uma coloração verde-
16
escura instar quatro quando se alimentam em folhas de repolho, brócolos, couve-

manteiga ou couve-flor. As lagartas são classificadas de acordo com o tamanho da
cápsula cefálica, em que até 0, 154 mm satisfaz ao primeiro instar, 0,250 mm ao
segundo; 0,388 mm ao terceiro e 0,590 mm ao quarto instar (FERNÁNDEZ e
ALVAREZ et al., 1988). Para alcançar o estágio de pupa, as lagartas de quarto instar
constroem um casulo (Figura 2C) que irá abrigar as pupas. As pupas são do tipo obtecta
e são inicialmente claras e, próximo à emergência dos adultos, escurecem (GALLO et
al., 2002; THULER, 2009). Já os adultos são microlepidópteros e possuem uma cor
marrom (Figura 2D). Os machos em pouso sobre as folhas exibem uma listra clara na
parte dorsal (GALLO et al., 2002; VACARI et al., 2009). As fêmeas são bastante
férteis e podem depositar até 350 ovos durante o seu ciclo de vida e o período de
desenvolvimento de ovo a adulto com uma temperatura ambiental de 25 °C
(EMBRAPA, 1997; CASTELO BRANCO et al., 1997; GALLO et al., 2002; THULE,
2009)
Figura 1 - Ciclo de vida de P. xylostella. (A) Ovos, (B) Lagartas alimentando-se, (C) pupas e (D) inseto
adulto.
https://sites.google.com/site/defesafitossanitaria/pragas-exoticas/plutella-xylostella. Acesso em 28/02/18

(A); Disponível em: https://www.flickr.com/photos/66212368@N04/galleries/72157627429391332 (B).
Acesso em 02/05/18. Fonte: Disponível em: http://bugguide.net/node/view/1172048. Acesso em
02/05/18. Fonte: Disponível em: http://www.naturespot.org.uk/species/diamond-back-moth. Acesso em
02/05/18.
17
As lagartas recém-eclodidas penetram a folha e ficam por alguns dias, até passar
para outro instar. Quando saem dos túneis, ferem o tecido da superfície foliar deixando
apenas a epiderme superior transparente, onde, depois, aparecem furos (CARDOSO et
al., 2010).
O controle de P. xylostella é principalmente realizado com o uso de inseticidas
sintéticos (ZHANG et al., 2016), contudo, o uso abusivo ou não planejado desses
produtos tem acarretado na seleção de populações resistentes (CASTELO BRANCO;
GATEHOUSE 1997; CASTELO BRANCO et al., 2001). Alguns inseticidas causam
danos ao meio ambiente, pois devido a sua baixa seletividade, afetam não somente P.
xylostella, mas também a fauna e outros organismos, incluindo plantas, vertebrados,
invertebrados e o agricultor, que aplica o agrotóxico (CASTELO BRANCO et al., 2003;
PEREIRA et al., 2004).
O elevado uso destes inseticidas tem colocado a couve entre os produtos
agrícolas com maior residual de pesticida (ANVISA 2016). Dentre os inseticidas
sintéticos utilizados em larga escala para o controle de P. xylostella, destacam-se os
teflubenzuron, chlorfenapyr, piretróides e fosforados (CZEPAK et al., 2005;
VASQUEZ et al., 1995; CASTELO BRANCO & GATEHOUSE, 1997) e também
organofosforados (MIYATA et al., 1982), cartap (proveniente do tiocarbamato),
abamectin (derivado da Avermectina) (CASTELO BRANCO e MELO, 2002), a
espinosinas (TROCZKA et al., 2012; LIN et al., 2013) e o Clorantraniliprole (WANG &
WU 2012, RIBEIRO et al., 2013). No Brasil, foram descritas populações de P.
xylostella com resistência aos inseticidas piretroides e as avermectinas no Espírito Santo
e Pernambuco (OLIVEIRA et al., 2011).
Para reduzir a contaminação por esses inseticidas sintéticos seja no solo, lençol
freático ou nos organismos, muitos agricultores utilizam controle biológico como uma
medida alternativa. Fungos e bactérias entomopatogênicas estão sendo utilizados nesse
sentido para amenizar a propagação de P. xylostella; são exemplos os fungos Beauveria
bassiana (Bals.) Vuill., Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. e Zoophthora
radicans (Brefeld) (VALDA et al., 2003). B. bassiana já foi confirmada contra
diferentes lepidópteros, como Plutella xylostella L. (VANDENBERG et al., 1998),
Chilo partellus Swinhoe (TEFERA & PRINGLE, 2003) e Castnia licus Drury (VILAS
BÔAS & ALVES, 1988), ocorre no ambiente infectando insetos de diversas famílias e
gêneros, como a broca-do-café (NEVES & HIROSE, 2005), Atta sexdens sexdens L.
18
(Hymenoptera: Formicidae) (LOREIRO & MONTEIRO, 2004) e mosca mexicana das

frutas (Anastrepha ludens Loew) (Diptera: Tephritidae) (DE LA ROSA et al., 2002). Já
o fungo Zoophthora radicans (Brefeld) Batko é um dos entomopatógenos mais
promissores para o controle de insetos pragas, merecendo destaque no que se refere ao
seu elevado potencial epizoótico e no Brasil, o patógeno tem sido avaliado para o
controle de Empoasca sp., revelando alta eficiência (LEITE et al., 1996).
O fungo Metarhizium anisopliae, que causa a doença-verde em diversas espécies

de insetos, é um dos mais ativos controladores biológicos das diferentes espécies de
cigarrinhas que ocorrem na agricultura (Disponível em:
http://www.biocontrol.com.br/produtos-metarriz.php Acesso em 27/02/19). Além dos
fungos, a bactéria Bacillus thuringiensis é um forte agente para controle biológico de
insetos praga, ela é gram-positiva, e normalmente habita os solos, mas também pode ser
localizada no intestino de lagartas de espécies de borboletas ou ainda na superfície de
um vegetal (MONNERAT et al., 2004; MEDEIROS et al., 2005; MEDEIROS et al.,
2007). Em nosso país, são destacados alguns dos principais predadores contra a P.
xylostella, incluindo Discondon sp. (Coleoptera: Cantharidae), Lasiochilus sp.
(Hemiptera: Anthocoridae), Pheidole sp. (Hymenoptera: Formicidae), Cheiracanthium
inclusum (Hentz, 1847) (Araneae: Miturgidae), e Podisus nigrispinus (Dallas, 1851)
(Hemiptera: Pentatomidae) (BACCI et al., 2009; SILVA-TORRES et al., 2010).
2.2 – Inseticidas naturais
Existem mais de 2.000 espécies de plantas que têm características inseticidas, as

famílias botânicas que mais têm sido pesquisadas incluem Meliaceae, Euphorbiaceae,
Annonaceae, Apiaceae, Asteraceae, Lamiaceae Flacourtiaceae, Liliaceae, Solanaceae,
Amaranthaceae, Rubiaceae e Fabaceae (GARCEZ et al. 2013; MORAIS & MARINHO-
PRADO, 2014; HUSSAIN et al., 2017; PERES et al., 2017).
Os inseticidas naturais constituem uma alternativa interessante ao uso de

compostos sintéticos, e as plantas destacam-se como fonte de compostos que podem ser
utilizados como material de partida para o desenvolvimento de novos bioinseticidas
(SPARKS et al., 2017), pois podem ser mais seletivos, menos nocivos ao ambiente e
mais competentes (MAGALHÃES et al., 2014). Há relatos de espécies vegetais
19
produtoras de compostos que afetam o comportamento de oviposição ou alimentação

dos insetos, atraindo ou afastando, ou causam mortalidade de fases imaturas ou de
adultos (GALLO et al., 2002; KRINSKI et al., 2014). Azadirachta indica A. Juss (Nim),
por exemplo, está sendo mais utilizada no controle caseiro de pragas e, na Índia, está
sendo utilizado em culturas de arroz onde ocorrem mais de 400 espécies de insetos
praga (MARTINEZ, 2002; VIDIGAL et al., 2007; MORDUE et al., 2010).
Millan et al. (2007) descreveram também a eficácia de algumas substâncias

naturais no combate às pragas de armazenamento, as quais podem ser utilizadas em
armadilhas do tipo de caladores em silos de cevada com os respectivos tratamentos
(terra de diatomácea, deltametrina e fenitrotion). Um inseticida natural feito com
açafrão (Curuma longa L) foi utilizado em grãos de milho mantendo suas propriedades
inseticidas após armazenado por 8 meses (PREVIERO et al., 2006).
2.3 - Proteínas inseticidas
• Lectinas
Uma classe de proteínas que está sendo bastante investigada para atividade
inseticida, é a das lectinas. Essas proteínas são largamente disseminadas na natureza,
sendo descritas em microrganismos, animais e vegetais podendo ser isoladas de diversas
partes da planta como cascas, cladódios, flores, folhas, rizomas, raízes e sementes
(PAIVA et al., 2011). As lectinas se ligam a carboidratos ou glicoconjugados, de forma
específica e reversível, através de pelo menos dois domínios de ligação; as interações
envolvidas são ligações de hidrogênios, força de van der Waals e interações
hidrofóbicas (PAIVA et al., 2010).
Para analisar a presença de lectinas em uma amostra, é realizado o ensaio de
hemaglutinação utilizando eritrócitos humanos ou de coelho. Neste ensaio, é realizada
uma diluição seriada da amostra que possa conter lectina e posteriormente uma
incubação com a solução contendo eritrócitos. Assim, caso haja lectinas na amostra,
uma ligação cruzada entre os eritrócitos e a proteína (rede de hemaglutinação) será
formada (Figura 2A). Essa malha se deve à interação entre as lectinas e carboidratos da
superfície celular dos eritrócitos, através de seus sítios de ligação a carboidratos.
No ensaio de inibição da atividade hemaglutinante (Figura 2B) em presença de
carboidratos livres ou glicoconjugados, as lectinas tem seus sítios de interação a
20
carboidratos bloqueados e, portanto, não ocorre a hemaglutinação (SANTOS et al.,

2005; COELHO & SILVA, 2000). Este ensaio confirma que o padrão interpretado
como hemaglutinação se deve à atividade lectínica da amostra avaliada e não à
dispersão ou lise dos eritrócitos. O fenômeno da dispersão é comum para amostras
vegetais com alto teor de taninos, por exemplo (PAIVA et al., 2010).
Figura 2 - Representação esquemática do aspecto microscópico do ensaio de atividade hemaglutinante

para detecção de lectinas em determinada amostra. (A) Rede de hemaglutinação, onde a lectina liga os
carboidratos da superfície dos eritrócitos. (B) Inibição da atividade hemaglutinante e não formação da
rede de hemaglutinação. Fonte: O autor.
Do ponto de vista biotecnológico, têm sido relatadas como agentes

antitumorais, anti-inflamatórios, antimicrobianos e inseticidas nas plantas a expressão
de lectinas pode ser potencializada por meio de estímulos externos, como o ataque de
fitopatógenos e herbívoros (PROCÓPIO et al., 2017). Algumas lectinas de plantas
apresentam ação inseticida, acarretando em toxicidade aguda principalmente para
larvas, mas também podem ser tóxicas para outros estágios de vida ou prejudicar o
desenvolvimento (efeito crônico) (MACEDO et al., 2007). Segundo Oliveira et al.
(2011), as lectinas podem dificultar a absorção de nutrientes, levando o inseto à morte
por inanição (figura 3). Ao serem ingeridas pelos insetos, as lectinas podem atuar no
21
intestino médio, ligando-se as proteínas glicosiladas levando à intoxicação (PEUMANS

& VAN DAMME, 1995, SAUVION et al., 2004; MICHIELS et al., 2010).
Figura 3 - Efeito da lectina inseticida no intestino do inseto. (A) entrada da lectina no intestino do inseto.
(B) lectinas se ligando ao sítio de reconhecimento. (C) degradação das células que a lectina se ligou.
Autor: Napoleão et al., 2018.
• Inibidor de Tripsina
Os inibidores de proteinases participam de um eficiente mecanismo de

proteção das plantas que, no decorrer da evolução, passaram a fazer parte dos
mecanismos de resistência ao ataque de pragas, herbívoros e/ou patógenos. Neste
sentido, os inibidores foram produzidos em tecidos agredidos, incluindo folhas, frutos e
órgãos de reserva, com a propriedade de bloquear ou reduzir a atividade de enzimas
digestivas dos insetos, acarretando-lhes prejuízos à nutrição, desenvolvimento e até
mesmo sobrevivência (BIRK et al., 2003; JÚNIOR et al., 2006; NAPOLEÃO et al.,
2019). O papel fisiológico desses inibidores no vegetal inclui a regulação de proteases
22
endógenas, mobilização de proteínas de reserva e proteção contra enzimas proteolíticas

de parasitas e insetos (PATRIOTA et al., 2016; HAQ et al., 2004).
A tripsina, junto com as quimotripsinas, são proteases fundamentais do
sistema digestivo de insetos fitófagos, sendo responsáveis por cerca de 95% da
proteólise. Segundo Ryan (1990), o intestino dos insetos das ordens Lepidoptera e
Díptera têm pH entre 8,5 e 10, excelente para atividade desta classe de enzimas
conhecidas como serino-proteinases. A influência mútua entre enzimas e inibidores vai
ocorrer por meio de interações hidrofóbicas e eletrostáticas, bem como as ligações de
hidrogênio que são estabelecidas entre o sítio ativo da protease e o sítio reativo na
molécula inibidora (PAIVA et al., 2013).
É importante ressaltar que processos co-evolutivos entre inseto e planta
podem levar o inseto ao aumento de respostas de defesa às toxinas presentes nos tecidos
vegetais, gerando um processo de adaptação e contra-adaptacão que diminui a eficiência
dos inibidores e outro composto, protéico ou não, produzido pelo vegetal (LAWRENCE
& KOUNDAL, 2002).
2.4 – Syzygium malaccense
A família Myrtaceae é bastante numerosa, pois compreende plantas floríferas

cujas sementes encontram-se abrigadas por um fruto. São registrados cerca de 142
gêneros e 5.500 espécies espalhadas pelo mundo; a grande maioria, lenhosas e
arbustivas. De acordo com Limberger et al., (2004), esta família está dividida em duas
subfamílias: Myrtoideae e Leptospermoideae, no Brasil, todos os representantes
originários ter relação à subfamília Myrtoideae, a qual inclui o gênero Syzygium.
Possui uma grande importância econômica, uma vez que várias espécies desta
família são cultivadas por causa de seus frutos saborosos, para fins ornamentais ou de
comercialização de essências, ou ainda pelas suas propriedades medicinais. As
Myrtaceae possuem uma importância ecológica muito grande, pois seus frutos
suculentos e carnosos são fontes de alimento para fauna silvestre e para seres humanos
(MORAIS et al., 2014) e muitos desses animais que consomem os frutos das Myrtaceae
contribuem para a dispersão das sementes, favorecendo a sobrevivência e propagação
das espécies (PIZZO, 2003; GRESSLER et al., 2006).
23
A família Myrtaceae possui como maiores gêneros: Eucalyptus (500 espécies),

Malaleuca (100 espécies), Eugenia (600 espécies), Myrcia (300 espécies), Syzygium
(200 espécies) e Psidium (100 espécies) (SOBRAL et al., 2015). De acordo com Gibbert
et al., (2017), a família Myrtaceae contém diferentes espécies que são empregadas no
consumo alimentício, sendo as principais: Psidium guajava L. (goiaba), Eugenia
uniflora L. (pitanga), Campomanesia xanthocarpa O. Berg Kausel (gabiroba), Plinia
trunciflora O. Berg Kausel (jabuticaba), Eugenia jambolana Lam (jambolão) e
Syzygium malaccense (L.) Merr. & L. M. Perry (jambo vermelho). Bueno et al. (2005)
afirmam que algumas Myrtaceae também são empregadas como plantas medicinais por
tribos indígenas do Mato Grosso do Sul, a população indígena Kaiowá/Guarani, que
vem encarando o prejuízo de suas terras habituais, faz uso de três espécies da família
(Eugenia uniflora L., Myrcianthes pungens (O.Berg) D. Legrand, e Psidium guajava L.)
com o objetivo de produzir medicamentos.
O gênero Syzygium é considerado um dos mais extensos da família Myrtaceae,
com aproximadamente 500 espécies de árvores e arbustos, onde cerca de 400
distribuem-se no Brasil e adquirem ênfase especial, por sua utilização na medicina
tradicional como antimicrobianos ou contra diabetes, problemas respiratórios,
antiinflamatórios, hipoglicemiante e cardiotônicos (DE OLIVEIRA et al., 2005;
HUSSEIN et al., 2003; VENDRUSCOLO et al., 2005; LAMOTHE et al., 2015).
As plantas do gênero Syzygium são citadas por serem tóxicas para insetos, como
é o caso de Syzygium cumini (L.) Skeels (RANI & MURTHY, 2008) e Syzygium
aromaticum (L.) Merr. & L.M. Perry (SOARES et al. 2011; AFFONSO et al. 2012;
KAFLE & SHIH 2013). A espécie Syzygium malaccense, conhecida popularmente no
território Brasileiro como jambo vermelho, jambo roxo ou jambo encarnado, é um
representante entre plantas medicinais, cujas folhas e frutos são mais utilizados como
adstringentes e instigantes do apetite, como diuréticos e na ação contra as anemias,
principalmente pelas populações de baixa renda (CAMPELO, 1988). Essa planta é
exótica, pois foi originada da Índia e introduzida no Brasil ao longo dos últimos três
séculos (FONSECA, 2012).
Árvore (Figura 4 A) abundante, de copa densa e com um formato piramidal,
medindo aproximadamente entre 7 a 13 metros de altura, suas folhas possuem uma
filotaxia de folhas simples, opostas cruzadas, com nervuras do tipo peninérveas;
morfologia da folha é lanceolada a obovadas de cor verde-escuro brilhante e possuindo
uma textura lisa em sua parte superior. Os frutos (Figura 4 C) que são piriformes,
24
carnosos, indeiscentes, do tipo bacóide, com 5 a 8 cm de comprimento e peso médio de

85g, com epicarpo fino, liso e de coloração que pode mudar de acordo com sua
maturação, podendo ser rosa, vermelho, vermelho-escuro ou roxo. O seu mesocarpo e o
endocarpo são quase brancos e bastante suculentos, constituindo assim a polpa, suas
sementes são poliembriônicas, eurispérmicas, bitegumentadas, que possui uma
coloração castanho-escura. (COSTA et al., 2006; MELO et al., 2009). As flores (Figura
4 B) possuem cor rosa, e ficam localizadas inteiramente sobre os ramos. Possuem de 3 a
4 cm de tamanho e apresentam 4 sépalas e pétalas e abundantes estames com coloração
branca e vermelha, dependendo da espécie (DONADIO et al., 1998).
Figura 4 - Morfologia externa da arvore de S. malaccense. (A) Arvore de S. malaccense, com sua forma
piramidal. (B) Flor de S. malaccense (C) Fruto de S. malaccense, com forma oval e preso sobre os ramos.
Fonte: http://www.aplantadavez.com.br/2016/01/jambo-syzygium-malaccense-l-merr-lm.html (Fotos/
22/10/18 as 10:15).
Em geral, a floração ocorre entre agosto e fevereiro e a sua colheita nos meses
de janeiro a maio. Mundialmente, S. malaccense, é utilizada, na medicina popular, e nos
tratamentos de processos inflamatórios, febre, coceira, diabetes, catarro no pulmão,
tosse, dores de cabeça, disenteria e ainda como diurético (DUNSTAN et al., 1997;
NOREEN et al., 1998).
25
Estudos farmacológicos comprovaram a atividade antiviral seletiva do extrato

aquoso da casca do caule frente aos vírus do Herpes Simplex-1 (HSV-1) e 2 (HSV-2),
da estomatite vesicular e HIV-1 (LOCHER et al., 1995; 1996), enquanto, o extrato
aquoso das folhas revelou forte inibição das bactérias Staphylococcus aureus e do
Streptococcus pyogenes (LOCHER et al., 1995). Noreen e colaboradores (1998)
realizaram diversos estudos fotoquímicos com as folhas de S. malaccense e
conseguiram destacar quatro flavonóides: catequina, mearnsitrina, miricitrina e
quercitrina. Oliveira e colaboradores (2006) analisaram a atividade inibitória de vários
extratos de folhas de S. malaccense sobre o vetor da dengue Aedes aegypti e o
hospedeiro intermediário da esquistossomose Biomphalaria glabrata. Os extratos
etanólicos da casca do caule e das folhas não afetaram as larvas de Aedes aegypti,
contudo, causaram mortalidade dos caramujos adultos da espécie B. glabrata com CL50
(concentração necessária para matar 50% os caramujos) de 42,53 (cascas do caule) e
41,90 (folhas) µg/mL, respectivamente. Uma lectina foi isolada da espécie S.
malaccense com atividade cicatrizante sobre feridas cutâneas em camundongos
(BRUSTEIN et al., 2012; PAIVA et al., 2010).
26
3. OBJETIVOS
3.1– Geral
Este trabalho teve como objetivo caracterizar o extrato de folhas de S.
malaccense quanto à presença de metabólitos secundários, lectinas e inibidor de tripsina
e determinar seu efeito sobre diferentes fases de desenvolvimento de P. xylostella.
3.2- Objetivos Específicos
• Caracterizar o extrato de folhas de S. malaccense quanto ao perfil fitoquímico e

à presença de lectinas e inibidores de tripsina.
• Determinar a especificidade da atividade de lectina presente no extrato de folhas
frente a diferentes carboidratos e glicoproteínas.
• Avaliar o efeito do extrato de folhas na sobrevivência e comportamento
alimentar de larvas de P. xylostella.
• Investigar o efeito do aquecimento exaustivo nas atividades hemaglutinante e
deterrente alimentar do extrato de folhas.
• Determinar a resistência do potencial inseticida do extrato de folhas à exposição
ao ambiente.
• Avaliar o efeito do extrato de folhas sobre o comportamento de oviposição de
fêmeas de P. xylostella.
4. METODOLOGIA
4.1 - Material vegetal e obtenção do extrato de folhas
Folhas de S. malaccense (jambeiro) foram coletadas em Recife e devidamente

acondicionadas em sacos plásticos. O procedimento de coleta e demais avaliações foram
registrados na plataforma SisGen (Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético
e do Conhecimento Tradicional Associado) sob o protocolo AF99882. Em seguida, as
folhas foram cortadas e homogeneizadas (10 min) com água destilada (na proporção
27
40g de folhas para 400 ml de água) utilizando liquidificador. Após filtração em gaze de
algodão e centrifugação (3600 rpm, 5 min, 28 °C), o sobrenadante correspondeu ao
extrato de folhas que foi então armazenado a -20 °C.
4.2 - Análise do perfil fitoquímico
O extrato de folhas foi diluído com 2 mL de metanol e levado ao ultrassom

durante 10 minutos para completa solubilização.Todos os padrões foram utilizados na
concentração de 1 mg/mL.
O extrato de folhas e os padrões foram aplicados de forma manual em placas
cromatográficas de sílica gel 60 - F254 (Macherey-Nagel®, Germany). As placas foram
desenvolvidas em cubas após saturação com a fase móvel (Tabela 3). A cuba foi
saturada durante 15 minutos, aproximadamente, à temperatura ambiente.
Classe de Metabólito Sistema Revelador Padrão

Polifenois (Taninos 90:5:5 Cloreto férrico Ác. Gálico
Hidrolisáveis)
Taninos condensados 90:5:5 Vanilina clorídrica Catequina
Flavonoides 90:5:5 Cloreto de alumínio Quercetina e Rutina
Derivados Cinâmicos 90:5:5 Cloreto de alumínio Ác. Cafeico e Ác.
Clorogênico
Terpenos e Esteroides 70:30 Lieberman-Burchard + ∆ β-Sitosterol
Cumarinas 50:50:50 KOH + ∆ Cumarina
Saponinas 100:11:11:26 Lieberman-Burchard+ ∆ Escina
Açúcares redutores 50:20:10:10 Timol + H2SO4 10% + ∆ D-frutose
Alcaloides 50:6,75:5 Dragendorf Atropina
Antraquinonas 50:6,75:5 HNO3 + KOH10% Senosídeo A
Tabela 3 - Sistemas de desenvolvimento e reveladores e padrões utilizados para análise fitoquímica por
cromatografia em camada delgada. ∆: aquecimento; Sistemas:90:5:5 – Acetato de etila: ácido fórmico:
água; 70:30 –Tolueno: acetato; 50:50:50 – Éter etílico: acetato de etila: ácido acético 10% (saturação);
100:11:11:26 - Acetato de etila: ácido acético: ácido fórmico: água; 50:20:10:10 - Acetato de etila: ácido
acético: ácido fórmico: água; 50:6,75:5 – Acetato de etila: metanol: água.
As bandas foram aplicadas com largura de 5 mm e com uma distância entre elas
e das bordas das placas de 5mm.O tamanho da largura e do comprimento das placas
28
cromatográficas foi de 5 cm. As amostras foram aplicadas a 5 mm da origem e com

término 5 mm do final da placa.
Após a eluição das placas as mesmas foram secas à temperatura ambiente, e
observadas sob luz ultravioleta de 254 e 365 nm e luz visível em seguida foram
digitalizadas. Na seqüência foram reveladas com reagentes específicos para cada
metabólito (Tabela 3). As bandas obtidas foram comparadas às bandas dos padrões
correspondentes.
4.3- Ensaio de atividade hemaglutinante
A presença de lectinas no extrato de folhas foi avaliada em placas de

microtitulação através do ensaio de atividade hemaglutinante, conforme descrito por
Napoleão et al. (2012). O extrato de folhas foi diluído serialmente e colocado em
presença de uma solução de eritrócitos de coelho tratados com glutaraldeído a 2,5%. O
valor da atividade hemaglutinante correspondeu ao inverso da menor diluição da
amostra que causou hemaglutinação. A atividade específica foi definida como a razão
entre o título e a quantidade total de proteínas (mg) utilizadas no ensaio.
4.4 - Ensaio de inibição da atividade hemaglutinante
A especificidade de ligação a carboidratos e glicoproteínas foi investigada

através de ensaio de inibição da atividade hemaglutinante. Para tanto, o extrato de
folhas incubado com solução contendo os monossacarídeos glicose, galactose, Nacetil-
glicosamina ou manose (0,2 M) ou as glicoproteínas, fetuína e ovoalbumina
(0,5mg/mL) por 15 min a 28°C antes da determinação da atividade hemaglutinante
como descrito no item 4.2.
4.5 - Investigação da presença de inibidores de proteases
A atividade inibidora de tripsina do extrato de S. malaccense foi determinada em

placa de microtitulação, de acordo com Pontual et al. (2012) utilizando a enzima
29
tripsina bovina de origem comercial. Solução de tripsina em tampão Tris-HCl0,1 M, pH

8,0, contendo CaCl2 0,02 M (5 µL, 0,1 mg/mL), com isso foi adicionado a 5 µL do
substrato N-α-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (BApNA) e incubados com diferentes
concentrações do extrato de folhas. O volume de cada poço foi ajustado para 200 µL
com tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0 contendo NaCl0,15 M. Controles do substrato
(ausência da enzima e extrato de folhas), da amostra (ausência de tripsina e BApNA) e
controle 100% (ausência do extrato de folhas) foi realizado. Após 30 min de incubação,
a hidrólise do BApNA foi acompanhada pela medida da absorbância a 405 nm. A
inibição da tripsina foi determinada pela atividade residual da enzima e expressa em
relação à hidrólise do substrato promovida no controle 100%.
4.6-Bioensaios
Lagartas de P. xylostella foram obtidas a partir de uma cultura mantida em

folhas de couve, em condições controladas (26 ± 1° C; foto período de 11 ± 0,5 h; 65-
70% de umidade relativa), no Laboratório de Biologia de Insetos da Área de
Fitossanidade do Departamento de Agronomia da Universidade Federal Rural de
Pernambuco
4.6.1-Avaliação do efeito deterrente alimentar e ensaio lagarticida
Para avaliação do efeito deterrente alimentar, discos de folhas de couve frescas

(3 cm de diâmetro) foram perfurados com uma agulha e imersos no extrato de folhas de
S. malaccense (1%, m/v) ou em água destilada (controle). Após secagem ao ar durante
40 min, um disco de folha tratado foi colocado numa placa de Petri e cinco lagartas de
P. xylostella no terceiro instar (sem alimentação por 4 h) foram introduzidas em cada
placa. Foram realizadas quintuplicatas e a taxa de consumo pelas lagartas após 24 h foi
determinada subtraindo-se o peso dos discos antes e depois de oferecidos às lagartas. O
resultado foi expresso como valor percentual, considerando 100% o peso inicial de cada
disco.
O potencial larvicida do extrato de folhas foi investigado de acordo com
Lingathurai et al. (2011). Discos de folhas de couve tratados como descrito
30
anteriormente contendo o extrato de folhas (0,5%, m/v) ou água destilada (controle)

foram oferecidos às lagartas de P. xylostella no primeiro instar, durante 24 h em placas
de Petri. Após esse tempo, as larvas foram continuamente mantidas alimentadas com
folhas de couve não tratadas, trocadas a cada 24h. Cada tratamento recebeu 10 lagartas
por placa e a sobrevivência das lagartas foi acompanhada até a emergência de adultos.
4.6.2- Efeito do extrato de folhas de S. malaccense sobre o comportamento de

oviposição de fêmeas de P. xylostella
Adultos de P. xylostella foram sexados e três casais foram separados para cada
tratamento. Os experimentos foram realizados em gaiolas plásticas (14×11×5 cm), onde
cada uma recebeu, para servir de sítio de oviposição, um disco de folha de couve (5 cm
de diâmetro) previamente imerso no extrato de folhas a 1% (teste) ou em água destilada
(solução controle) por 30 s. Durante o ensaio, os insetos foram alimentados ad libitum
com solução de glicose (10%, p/v). A quantidade de ovos depositados sobre os discos
de folhas foi registrada após 48 h de acordo com Pascual-Villalobos e Robledo (1998).
4.6.3 - Avaliação da resistência do extrato de folhas de S. malaccense ao

aquecimento e às condições ambientais
O extrato de folhas de S. malaccense a 1% foi avaliado quanto às atividades

hemaglutinante (conforme descrito no item 4.2) e deterrente alimentar (conforme
descrito no item 4.5) após o aquecimento a 100 °C por 10, 20, 30, 40 ou 60 minutos.
O extrato de folhas a 1% foi também exposto por 192 h (28 de junho a 05 de julho de
2017, Recife, Pernambuco, Brasil) às condições ambientais (Índice UV variando entre 1
a 14, temperatura variando de 25 a 30 °C e umidade relativa variando de 69 a 92%;
Ministério da Ciência e tecnologia do Brasil – CPTEC/INPE; cada unidade de índice
UV corresponde a 25 mW/m2 de energia). Após essa exposição, a atividade
hemaglutinante e o efeito deterrente alimentar foram novamente avaliados.
4.7-Análise estatística
31
Todos os resultados foram expressos como média entre as replicatas ± desvio

padrão e as diferenças entre os tratamentos foram determinadas utilizando o teste T de
Student, considerando significativos valores de p < 0,05.
5– RESULTADOS E DISCUSSÃO
Este trabalho foi motivado pelos graves prejuízos econômicos causados por P.
xylostella no cenário internacional, bem como pela dificuldade em controlar populações
dessa praga, considerada multirresistente. A escolha de S. malaccense foi baseada na
importância popular dessa espécie e nos relatos prévios da presença de lectinas em seus
tecidos, uma importante classe de proteínas, que pode apresentar atividade inseticida.
Nesse sentido, as avaliações descritas a seguir foram baseadas na hipótese de que o
extrato de folhas de S. malaccense contém metabólitos previamente reportados como
agentes inseticidas e pode ser capaz de afetar o comportamento alimentar e a
sobrevivência de larvas, bem como a oviposição por fêmeas de P. xylostella.
Adicionalmente, foi investigado se os principais efeitos do extrato eram resistentes ao
aquecimento e à exposição às condições ambientais.
A análise fitoquímica do extrato de S. malaccense por cromatografia em camada
delgada revelou a presença dos metabólitos secundários polifenóis (taninos
hidrolisáveis), flavonóides, esteróides, saponinas e açúcares redutores (Figura 4). Por
outro lado, não foram detectados taninos condensados, derivados cinâminos, cumarinas,
alcalóides e antracnonas no extrato de folhas.
O potencial inseticida de metabólitos secundários, incluindo as classes
detectadas no extrato de folhas em nosso estudo, tem sido amplamente reportado. O
extrato metanólico de bulbos de Urginea marítima contendo polifenóis e flavonóides foi
tóxico por contato e por ingestão para o gorgulho do arroz Sitophilus oryzae (L.)
(Coleoptera: Curculionidae). Os autores sugeriram que a toxicidade do extrato pode
estar relacionada à inibição da acetilcolinesterase dos insetos (MAAZOUN et al., 2017).
O extrato de flores de Moringa oleifera contendo flavonóides (quercetina e campferol) e
esteroides (β-amirina) causou mortalidade de larvas de Aedes aegypti, provavelmente
por inibir a tripsina do intestino das larvas (PONTUAL et al., 2012). Dolma et al.
(2017) reportaram que larvas de segundo instar de P. xylostella são sensíveis ao
tratamento com saponina (LC50=2106,32 mg/L) após 96 h de exposição.
32
Figura 5 - Análise fitoquímica do extrato de folhas de Syzygium malaccense por cromatografia em

camada delgada.
1. Banda correspondente à presença de polifenóis revelada utilizando cloreto férrico. 2. Banda

correspondente à presença de flavonóides revelada utilizando cloreto de alumínio. 3. Banda
correspondente à presença de esteróides revelada utilizando solução de Lieberman-Burchard sob
aquecimento. 4. Banda correspondente à presença de saponinas revelada utilizando solução de
Lieberman-Burchard sob aquecimento. 5. Banda correspondente à presença de açúcares redutores
revelada utilizando solução de Timol e H2SO4 (10%) a quente.
O extrato de folhas de S. malaccense foi capaz de aglutinar eritrócitos de coelho

(atividade hemaglutinante = 64), sugerindo a presença de lectinas. Para confirmar se
este resultado refletiu a ligação entre lectinas do extrato de folhas e glicoproteínas ou
glicolipídeos da membrana dos eritrócitos, foi realizado um ensaio de inibição da
atividade hemaglutinante, onde carboidratos ou glicoproteínas livres foram adicionados
ao extrato com o objetivo de ocupar os sítios de ligação presentes na estrutura das
lectinas e impedir sua interação com os eritrócitos.
A atividade hemaglutinante do extrato foi inibida parcialmente por manose e N-
acetilglicosamina e neutralizada na presença das glicoproteínas fetuína e ovoalbumina
(Tabela 4), o que confirma que a aglutinação dos eritrócitos pelo extrato de folhas
resultou da ação de lectinas. Adicionalmente, o ensaio demostrou que as lectinas
presentes no extrato têm maior afinidade por açúcares complexos do que por
monossacarídeos.
33
. Amostra Atividade hemaglutinante

Monossacarídeos
Glicose 64
Galactose 64
Manose 32
N-acetil-glicosamina 32
Glicoproteínas
Fetuína 0
Ovoalbumina 0
Tabela 4 - Atividade hemaglutinante do extrato de folhas de S. malaccense na presença de carboidratos e
glicoproteinas. Atividade hemaglutinante do extrato na ausência de carboidratos: 64
Com o objetivo de investigar outra classe de proteínas que têm sido relatadas
como potenciais agentes tóxicos para insetos, o presente estudo avaliou a presença de
inibidores de proteases no extrato de folhas de S. malaccense. Os resultados indicaram
que o extrato apresenta compostos com atividade inibidora de tripsina, uma vez que a
hidrólise do BApNA foi reduzida na sua presença (Figura 5).
Figura 6. Atividade inibidora de tripsina do extrato de folhas de Syzygium malaccense. Concentrações do

extrato de folhas: m/v. Controle: água destilada. Os asteriscos indicam diferença significativa entre os
tratamentos com o extrato de folhas e o controle.
34
A toxicidade de inibidores de proteases para insetos tem sido relatada e os

efeitos podem incluir prejuízos aos processos digestivos, acarretando na morte por
inanição. O inibidor de tripsina de flores de M. oleifera promoveu mortalidade de larvas
recém-eclodidas de A. aegypti com CL50 de 0,3 mg/mL, inibiu o crescimento (CMI de
0,031 mg/mL) ou causou a morte (CMB de 1,0 mg/mL) de bactérias do intestino de L4
(PONTUAL et al., 2014).
Uma vez que o potencial inseticida de lectinas e inibidores de proteases tem sido
amplamente relatado (DE OLIVEIRA et al., 2016) e que nossos resultados revelaram a
presença de proteínas dessas classes no extrato de folhas, essa preparação foi
investigada quanto ao efeito no comportamento alimentar e na sobrevivência de larvas
de P. xylostella.
A taxa de consumo das folhas de couve pelas larvas foi maior no grupo controle
do que no grupo teste (Tabela 5). Este resultado indicou que o extrato de folhas exerceu
efeito deterrente de alimentação. Este efeito é geralmente devido à ação de compostos
fixos e exige o contato prévio das larvas com as amostras antes que haja a sua rejeição.
Por outro lado, o efeito chamado de repelente, geralmente está associado à ação de
compostos voláteis que as larvas podem detectar sem que haja a ingestão prévia da dieta
contendo o tratamento.
Tratamento Consumo (%)

Controle 45,70 ± 2,51a
Extrato de folhas
1% 34,63 ± 0,02b
1% aquecido por10 min 23,95 ± 0,05c
1% aquecido por 20 min 29,59 ± 0,41d
1% aquecido por 60 min 38,90 ± 0,10e
Tabela 5- Taxa de consumo das folhas de couve por larvas de Plutella xylostella tratadas com o extrato
de folhas de Syzygium malaccense submetido ou não ao aquecimento (100ºC). Letras diferentes indicam
diferenças significativas entre os tratamentos determinadas pelo teste T de Student (p < 0,05).
O extrato de folhas exerceu também toxicidade aguda por ingestão para as

lagartas, causando uma mortalidade de 80 ± 15%, a qual foi considerada significativa (p
35
= 0,007) quando comparada à detectada no grupo controle (30 ± 10%). Para o nosso
conhecimento, este é o primeiro relato de uma amostra vegetal contendo lectinas que
exerceu toxicidade para larvas de P. xylostella.
A investigação do efeito do extrato de folhas de S. malaccense sobre o
comportamento de oviposição das fêmeas de P. xylostella mostrou um efeito também
deterrente, uma vez que nos discos tratados com o extrato de folhas de S. malaccense
foi detectada a presença de cerca de 37 ovos, menos que a metade registrados nos discos
tratados com solução controle (Figura 6), que totalizaram 80 ovos.
Figura 7. Efeito do extrato de folhas de S. malaccense (1%, m/v) sobre o comportamento de oviposição de
P. xylostella.
Tem sido reportado que outras preparações de origem vegetal são capazes de
interferir no comportamento de oviposição dos insetos. A lectina de sementes de M.
oleifera solúvel em água, por exemplo, foi atraente de oviposição para fêmeas de A.
aegypti uma vez que estas colocaram seus ovos preferencialmente (73%) em recipientes
contendo solução da lectina a 0,1 mg/mL, em comparação com recipientes contendo
apenas água destilada (27%). Os autores mostraram que as amostras estavam livres de
compostos voláteis (SANTOS et al., 2012). Selvaraj et al. (2017) reportaram que
extratos de diferentes partes de Strychnos nux-vomica obtidos com diferentes solventes
apresentaram efeito deterrente de oviposição, sendo o efeito máximo detectado
(69,81%) quando sítios de oviposição contendo o extrato de frutos em clorofórmio
foram oferecidos às fêmeas.
36
Com o objetivo de fornecer melhor compreensão sobre o princípio ativo do

extrato, selecionamos o efeito deterrente alimentar e a atividade de lectinas. O
aquecimento (100 ºC) do extrato de folhas durante 10, 20, 30, 40 e 60 min e em seguida
avaliamos as atividades deterrente alimentar e hemaglutinante. Os resultados revelaram
que ao ser aquecido a 100 °C por 10 min, o extrato de folhas apresentou aumento tanto
do efeito deterrente alimentar (Tabela 5), refletido pela redução na taxa de consumo
pelas larvas, quanto da sua atividade hemaglutinante (Tabela 6). Juntos estes dados
sugerem que o efeito deterrente de alimentação detectado pode envolver a participação
da lectina do extrato de folhas.
Amostra Atividade Hemaglutinante

Extrato de folhas
1% 64
1% aquecido por 10 min 1024
Tabela 6 - Atividade hemaglutinante do extrato de folhas de Syzygium malaccense submetido ou não ao
aquecimento a 100ºC.
Este resultado também sugere que o aquecimento do extrato pode ter resultado
em um rearranjo estrutural da lectina potencializando suas atividades biológicas. Um
comportamento semelhante entre as atividades hemaglutinante e deterrente alimentar foi
também detectado após aquecimento do extrato de folhas de 20 a 60 min, corroborando
com a idéia de serem ambas as atividades desenvolvidas pela mesma proteína. Quando
o extrato de folhas foi aquecido a 100 °C durante 20 a 60 min, as atividades
hemaglutinante e deterrente alimentar foram reduzidas em relação ao extrato aquecido
por 10 min, mas ainda maiores que aquelas registradas para o extrato não aquecido,
sugerindo que a lectina pode ter sofrido algum grau de desnaturação. Estudos
empregando o extrato incubado com fetuína ou ovoalbumina, glicoproteínas que melhor
inibiram a atividade hemaglutinante dessa preparação, podem ser realizados na tentativa
de apontar a lectina como princípio ativo do extrato.
37
A resistência do extrato de folhas à exposição ao ambiente foi também avaliada.

Os resultados mostraram que a taxa de consumo (43,53 ± 3,00) das larvas tratadas com
o extrato de folhas exposto ao ambiente não diferiu significativamente (p = 0,09)
daquela determinada para as larvas do grupo controle (45,70 ± 2,51), indicando que o
efeito deterrente alimentar do extrato de folhas foi anulado pela exposição ao ambiente
(Tabela 5). De um ponto de vista ecológico, este resultado parece ser vantajoso para a
aplicação dessa preparação na proteção de culturas de brássicas, uma vez que sugere
que os componentes do extrato não irão persistir ou acumular no ambiente ao contrário
do que acontece com os inseticidas sintéticos, que possuem uma grande persistência no
ambiente, podendo acumular nos níveis tróficos (BRAGA et al., 2007; JUNIOR et al.,
2012). Em resumo, os efeitos deletérios do extrato de folhas de S. malaccense para P.
xylostella incluem até agora os efeitos: lagarticida, deterrente alimentar e deterrente de
oviposição.
38
6- CONCLUSÃO
O extrato aquoso de folhas de S. malaccense contém metabólitos secundários,

lectinas e inibidores de tripsina, bem como representa um agente para controle de
populações de P. xylostella por causar mortalidade de lagartas ou interferir no seu
comportamento alimentar ou de oviposição.
O efeito deterrente de alimentação reportado aqui parece envolver a ação da

lectina presente no extrato. Em adição, a sensibilidade do extrato de folhas às condições
ambientais pode ser vantajosa de um ponto de vista ecológico por garantir que este não
irá acumular no ambiente.
39
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA E FISIOLOGIA ANIMAL

CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ERASMO GUILHERME DOS SANTOS NETO

FOLHAS DE Syzygium malaccense Linnaeus (MYRTACEAE):

FOLHAS DE Syzygium malaccense Linnaeus (MYRTACEAE):

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado

Orientador: Prof. Dr. Emmanuel V. Pontual

Coorientadora: Msc. Isabella C. Vila Nova

FOLHAS DE Syzygium malaccense Linnaeus (MYRTACEAE):

Área de concentração: Ciências Biológicas

Data de defesa: 28/06/2019

Prof. Dr. Emmanuel Viana Pontual (Presidente)

Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, UFRPE

Departamento de Nutrição, Universidade Federal do Piauí (UFPI)

Msc. Eva Luana Almeida da Silva (2° Titular)

Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, UFRPE

Msc. Welton Aaron de Almeida (3° Titular)

Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, UFRPE

Msc. Hanna Gracie Inez de Freitas Lima (Suplente)

Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, UFRPE

E55f Santos Neto, Erasmo Guilherme dos Santos Neto

Orientador: Emmanuel Viana Pontual.

1. Jambeiro. 2. lectinas. 3. inibidores de tripsina. 4. metabólitos secundários. 5. atividade lagarticida. I. , Emmanuel

Dedico esta monografia aos meus pais e família,

Aos meus amigos do Colégio Adventista, Pedro, Landerson e Thamires, obrigado

Ao meu orientador/amigo, por ter confiado a mim essa grande responsabilidade,

Ao LABTEC, por ter pessoas maravilhosas que me acolheu quando precisei.

Ao BIOPROT, em especial ao professor Thiago e a Robson, por ter me ajudado em

Às meninas Elaine e Francielle, que ajudaram e me acolheram no Laboratório de

Agradeço a banca examinadora, por aceitar meu convite.

A Universidade Federal Rural de Pernambuco, pela minha formação como pessoa e

Ao CNPq (UNIVERSAL MCTI/CNPq 01/2016; Processo: 408789/2016-6) pelo

Agradeço a todos que fizeram parte de minha trajetória!

“Sê humilde para evitar o orgulho, mas voa alto

“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor,

Palavra – Chave: Jambeiro, lectinas, inibidores de tripsina, metabólitos secundários,

Plutella xylostella (Plutellidae) is an important pest that attacks Brassicas cultures

Keywords: Malay apple, lectins, trypsin inhibitors, secondary metabolites, larvicidal

Figura 2 - Representação esquemática do aspecto microscópico do ensaio de atividade

Figura 5 - Análise fitoquímica do extrato de folhas de Syzygium malaccense por cromatografia em

Figura 6 - Atividade inibidora de tripsina do extrato de folhas de Syzygium malaccense.

Figura 7 - Efeito do extrato de folhas de S. malaccense (1%, m/v) sobre o comportamento de

Tabela 1 - Classificação taxonômica de P. xylostella. Fonte: DIBELLI, 2014. ........................ 14

Tabela 2 - Nomenclatura vernácula de P. xylostella em diferentes países. Fonte: DIBELLI, 2014.

Tabela 3 - Sistemas de desenvolvimento e reveladores e padrões utilizados para análise fitoquímica

Tabela 4 - Atividade hemaglutinante do extrato de folhas de S. malaccense na presença de

Tabela 6 - Atividade hemaglutinante do extrato de folhas de Syzygium malaccense submetido ou não

2-FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................................................... 14

2.1 – Plutella xylostella ......................................................................................................... 224

2.2 - Inseticidas naturais .......................................................................................................... 14

2.3 - Proteínas inseticidas ........................................................................................................ 19

2.4 - Syzygium malaccense.......................................................................................................22

3.1– Geral ................................................................................................................................ 26

3.2- Objetivos Específicos....................................................................................................... 26

4.1 - Material vegetal e obtenção do extrato de folhas ............................................................ 26

4.2- Análise do perfil fitoquímico...........................................................................................27

4.4-Ensaio da Inibição da Atividade Hemaglutinante ............................................................. 29

4.5-Investigação da presença de Inibidores de Proteases ........................................................ 29