UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

JOWANKA AMORIM

AVALIAÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO DAS FLORES DE

ERYTHRINA MULUNGU Benth. NO TRATAMENTO DA ASMA EM UM
MODELO ANIMAL

Ribeirão Preto, SP
2017
 JOWANKA AMORIM

AVALIAÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO DAS FLORES DE

ERYTHRINA MULUNGU BENTH. NO TRATAMENTO DA ASMA EM
UM MODELO ANIMAL

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina

de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
para obtenção do título de Mestre em Ciências.

Área de concentração: Puericultura e Pediatria

Orientador: Prof. Dr. Fabio Carmona.

Co-orientador: Prof. Dr. Marcos de Carvalho
Borges.

Ribeirão Preto, SP
2017
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR
QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA,
DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Amorim, Jowanka

Avaliação do extrato etanólico das flores de Erythrina mulungu Benth.

no tratamento da asma em um modelo animal.

74f.;30cm

Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto / USP – Área de concentração: Puericultura e Pediatria

Orientador: Fabio Carmona

1. Asma. 2. Fitoterápico. 3. Inflamação
 FOLHA DE APROVAÇÃO

Jowanka Amorim

Avaliação do extrato etanólico das flores de Erythrina mulungu Benth. no tratamento da asma
em um modelo animal

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto – USP para obtenção do título de Mestre
em Ciências.

Aprovado em: _____/_____/_____

Banca Examinadora:

Prof(a). Dr(a) ___________________________________________________________

Instituição: ________________________________Assinatura: ___________________

Prof(a). Dr(a) ___________________________________________________________

Instituição: ________________________________Assinatura: ___________________

Prof(a). Dr(a) ___________________________________________________________

Instituição: ________________________________Assinatura: ___________________
 Aos meus pais Luiz Gonzaga Amorim, Maria do Carmo
Gomes Amorim; e irmão, Wellington Luiz Amorim dedico
este trabalho, com profunda gratidão.
 AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pela vida, pelos dons concedidos e por Ele ser guia na minha
jornada.
Agradeço aos meus pais pela dedicação que tiveram e pela oportunidade que deram à
educação dos filhos; agradeço o incentivo em todas as minhas escolhas, encorajando-me e
sendo o solo firme para eu poder pisar e ir em busca dos sonhos. Vocês serão para sempre
meu lar, onde quer que eu vá.
Agradeço ao meu irmão Wellington pelo incentivo, pelo exercício da escuta, por me
ensinar muito sobre a vida, muito além de livros.
Ao professor orientador, Fabio Carmona, por ter concedido a oportunidade de
ingressar na pós-graduação; por ter confiado no meu trabalho para a execução deste projeto
e ter redirecionado os caminhos quando o projeto inicial não se efetivou. Eu não ia desistir,
mas você soube lidar de um modo muito tranquilo, transmitindo-me confiança, e foi daí que
novas possibilidades surgiram.
Ao meu professor co-orientador, Marcos de Carvalho Borges, pelo acolhimento
dentro do seu grupo de pesquisa, pela condução dos trabalhos durante o percurso de 2 anos,
mantendo-se constante, paciente, dedicado, acessível e incentivando-nos ao desenvolvimento
pleno das nossas aptidões.
A minha co-orientadora Profª Dra. Ana Maria Soares Pereira por ser referência de
pessoa e profissional, pela atenção, pelo carinho e prontidão em dar todas as condições para
o desenvolvimento do trabalho.
Aos três professores agradeço por acreditarem no estudo científico com plantas
medicinais e por hoje se tornarem minhas referências em pesquisa. Agradeço também pelo
exemplo de trabalho em equipe; embora ele exija mais e se torne cansativo, os fazem vencer
obstáculos e colher frutos mais fecundos junto aos seus alunos.
Aos dedicados colegas de laboratório, Bruna Cestari, Camila Carla Guimarães,
Lucas Junqueira, Camila Sandy, Vanessa Maciel, Andiamira Balestra e Leandra Zanetti, pelo
comprometimento, pela determinação e persistência; pelo espírito de companheirismo,
humildade e empatia.
Aos professores do Curso de Nutrição, Rosa Wanda Diez Garcia, Paula Garcia
Chiarello pela oportunidade que tive em me aproximar da prática da nutrição através do
estágio docência. Ao Professor Júlio Sergio Marchini também meus agradecimentos, pela
referência e pelas muitas oportunidades construtivas.
Agradeço aos meus amigos também, aos de longe e aos de perto, porque não
desistiram de mim, preencheram espaços, trouxeram alegrias e suavizaram a saudade. Em
especial, às amigas Elaine Hillesheim, Débora Marcos Rubim e Regina Helena Carmo.
Ao laboratório de Fisiopatologia Pulmonar Experimental, em nome do Prof. Dr.
Marcos Borges de Carvalho pela concessão do espaço e dos aparelhos para o
desenvolvimento desta pesquisa.
Ao laboratório de Fitoquímica da Universidade de Ribeirão Preto, em nome da Prof.
Dra. Ana Maria Soares Pereira, pela concessão do espaço e equipamentos para o preparo do
extrato da planta medicinal.
Ao Laboratório de Patologia Celular e Molecular de Doenças do Fígado, no nome do
Prof. Dr. Fernando Silva Ramalho e da técnica Deisy Mara da Silva pelo preparo das
lâminas de histologia.
Ao Laboratório de Neurologia Experimental, no nome do Prof. Dr. Amilton Antunes
Barreira, e ao Antônio Renato Meirelles e Silva pela concessão do uso dos microscópios para
que as lâminas de histologia fossem fotografadas e pela edição das mesmas.
A Universidade de São Paulo, pela estrutura e pelas condições de trabalho aos pós-
graduandos.
A CAPES pela concessão da bolsa; à CNPq e FAPESP pelo apoio financeiro.
“Quando amamos e acreditamos do fundo da nossa
alma, em algo, nos sentimos mais fortes que o
mundo, e somos tomados de uma serenidade que
vem da certeza de que nada poderá vencer a nossa
fé. Essa força estranha faz com que sempre tomemos
a decisão certa, na hora exata e, quando atingimos
nossos objetivos, ficamos surpresos com a nossa
própria capacidade”.
(Paulo Coelho)
 RESUMO

AMORIM, J. Avaliação do extrato etanólico das flores de Erythrina mulungu Benth. no

tratamento da asma em um modelo animal. 2017. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto/USP – Ribeirão Preto, 2017

Introdução: Estima-se que 300 milhões de pessoas no mundo possuam asma e há expectativa
de aumentar o número de mortes pela doença nos próximos 10 anos. Parte disto deve-se à
limitação na eficácia dos tratamentos atuais e à heterogeneidade da doença. Erythrina
mulungu Benth. (Leguminosae, mulungu) é uma planta nativa brasileira de interesse do
Sistema Único de Saúde para ser estudada e que apresenta potenciais efeitos anti-
inflamatórios. Objetivo: Avaliar os efeitos da administração do extrato etanólico das flores de
E. mulungu no tratamento da asma em um modelo experimental, e os mecanismos envolvidos.
Métodos: Camundongos Balb/c sensibilizados com ovalbumina (OVA) foram tratados por
via intraperitoneal com 4 doses (200, 400, 600 e 800 mg/kg) do extrato de E. mulungu, ou
dexametasona (2 mg/kg) – controle positivo – durante 7 dias consecutivos e foram
paralelamente desafiados com ovalbumina intranasal. A hiper-responsividade brônquica foi
avaliada in vivo, 24 h após o último desafio; o lavado broncoalveolar (LBA) foi coletado para
avaliação do número de células totais e diferencial por citômetro e contagem microscópica,
respectivamente. O sangue foi coletado para dosagem de anconticorpos IgE para ovalbumina.
Níveis de citocinas IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 e INF-γ foram dosados no homogenato pulmonar
através do ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA); e o recrutamento de células
inflamatórias no tecido foi avaliado coloração Hematoxilina-Eosina (H&E). O perfil
cromatográfico da planta foi analisado por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC),
seguido de espectrofotometria de massas (MS). Resultados: O tratamento com E. mulungu
diminuiu significativamente o aumento da hiper-responsividade brônquica nos animais em
todas as doses testadas. Diminuiu o número de células totais, eosinófilos e linfócitos no LBA,
significativamente na dose de 600 mg/kg e suprimiu significativamente a concentração de IL-
4 e IL-5. Além disso, E. mulungu diminuiu significativamente o recrutamento de células
inflamatórias no tecido dos animais asmáticos. Erisotrina, N-óxido-erisotrina e hipaforina
foram os constituintes majoritários encontrados. Conclusão: Coletivamente esses resultados
sugerem que E. mulungu tem potencial para uso no tratamento da asma, através da modulação
da resposta inflamatória, apresentando efeitos imunomodulador e anti-inflamatório.
Palavras-chave: Asma, planta medicinal, inflamação, Leguminosae
 ABSTRACT

AMORIM, J. Evaluation of ethanolic extract from the Brazilian medicinal plant

Erythrina mulungu Benth. in the treatment of asthma in an animal model. 2017.
Dissertation (Master’s degree) – Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo,
Ribeirão Preto, 2017.

Background: Asthma affects 300 million people worldwide and the number of victims of the
disease is expected to increase in the next 10 years. Part of this may be a result of the limited
efficacy of current treatments and disease heterogeneity. Erythrina mulungu Benth.
(Leguminosae, mulungu) is a Brazilian native species which is listed by the Brazilian
National Program of Medicinal Plants and Herbal Medicines to be studied and that has
potential anti-inflammatory effects. Objective: To evaluate the effects of E. mulungu flowers
ethanolic extract in ovalbumin (OVA)-induced asthma in mice, and to study the mechanisms
involved. Methods: OVA-sensitized mice were intraperitoneally treated with four doses (200,
400, 600 e 800 mg/kg) of the E. mulungu extract or dexamethasone (2 mg/kg) – positive
control – during seven consecutive days and simultaneously challenged with intranasal
ovalbumin. Airway hyperresponsiveness was evaluated in vivo, 24 h after the last OVA
challenge; broncoalveolar lavage fluids (BAL) was collected for counting the number of total
and differential inflammatory cells. Blood was collected for measurement of anti-OVA IgE
levels. Levels of cytokines IL-4, IL-5, IL-10 IL-13 and INF-γ were measured in pulmonary
homogenate by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA); and the inflammatory cells
recruitment to the lung tissue were determined using hematoxylin and eosin staining (H&E).
The species’ chromatographic profile was evaluated by Ultra Performance Liquid
Chromatography – Tandem Mass Spectrometer. Results: The treatment with E. mulungu
extract significantilly reduced the airway hyperresponsiveness in all doses evaluated. It
significantly reduced the number of total cells, eosinophils and lymphocytes in BAL, at 600
mg/kg and significantly decresead the levels of IL-4 and IL-5. In addition, E. mulungu
significantly decreased the cellular inflammatory infiltration in the lung tissue of allergic
mice. Erysothrine, erysothrine-N-oxide and hypaphorine were the major constituents in the
extract. Conclusions: Collectively, these results suggest the potential of E. mulungu for
asthma treatment, through modulation of inflammatory response.

Key-words: Asthma, herbal medicine, inflammation, Leguminosae

 LISTA DE ABREVIATURAS

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

CBA Compostos bioativos
E. mulungu Erythrina mulungu Benth.
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Ensaio de Imunoabsorção
Enzimática)
GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating fator (Fator estimulador de
colônias de granulócitos-macrófagos)

H&E Hematoxilina-Eosina
Ig Imunoglobulina
IL Interleucina
ILC Innate lymphoid cells (Células linfóide inata)
IMC Índice de Massa Corporal
INF Interferon
LB Linfócito B
LBA Lavado broncoalveolar
Mch Metacolina
NF- kB Fator de transcrição nuclear NF-KB
OMS Organização Mundial da Saúde
OVA Ovalbulina (proteína)
PA Princípio ativo
RENAFITO Relação Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos
RENISUS Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS
RR Risco relativo
SUS Sistema Único de Saúde
TH Linfócito T helper (auxiliar)
TSLP Thymic Stromal Lymphopoietin (Citocina linfopoetina do estroma tímico)
UPLC-MS/MS Ultra Performance Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectrometer
Cromatografia Líquida de Ultra-alta Pressão Acoplado a Espectro de
Massas
VCAM-1 Vascular cell adhesion molecule 1 (molécula de adesão celular-vascular-1)
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Publicações encontradas com os descritores “Erythrina mulungu” e “Erythrina

verna” em base de dados. ......................................................................................................... 28

Tabela 2. Evidências científicas dos efeitos terapêuticos da Erythrina mulungu Benth., parte
da planta, tipo de extrato, características do tratamento, dose e via de administração. ............ 29

Tabela 3. Evidências clínicas científicas dos efeitos terapêuticos da Erythrina mulungu

Benth. ........................................................................................................................................ 31

Tabela 4. Escore para a quantificação da severidade da inflamação peribrônquica. ............... 42

 LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Erythrina mulungu Benth. ....................................................................................... 26

Figura 2. Fluxograma da busca dos estudos científicos com Erythrina mulungu Benth. ....... 27

Figura 3. Flores secas (esquerda) e o pó (direita) obtidos da Erythrina mulungu Benth. ....... 35

Figura 4. Modelo experimental de asma e tratamento com o extrato etanólico das flores de
Erythrina mulungu Benth. (EV). .............................................................................................. 37

Figura 5. Efeitos do tratamento de 7 dias com as doses de 200, 400, 600 e 800mg/kg do
extrato etanólico das flores de Erythrina mulungu Benth (EV) e de dexametasona (DEXA) na
hiper-responsividade brônquica................................................................................................ 45

Figura 6. Efeitos do tratamento de 7 dias com as doses de 200, 400, 600 e 800 mg/kg do
extrato etanólico das flores de Erythrina mulungu Benth. (EV) no número de células totais
(A) e na contagem diferencial absoluta de células (B) no lavado bronquio-alveolar (LBA). .. 47

Figura 7. Efeito do tratamento de 7 dias com as doses de 200, 400, 600 mg/kg do extrato
etanólico das flores de Erythrina mulungu (EV) e de dexametasona (DEXA) sobre os níveis
de IgE sérico. ............................................................................................................................ 48

Figura 8. Efeito do tratamento de 7 dias com as doses de 200, 400, 600 e 800 mg/kg do
extrato etanólico das flores de Erythrina mulungu (EV) e de dexametasona (DEXA) sobre os
níveis de IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 e INF-γ ............................................................................... 50

Figura 9. Efeito do tratamento com Erythrina mulungu Benth. sobre a infiltração de células
inflamatórias no tecido pulmonar ............................................................................................. 51

Figura 10. Perfis cromatográficos obtidos por UPLC-MS ...................................................... 53

Figura 11. Desenho da estrutura química dos constituintes majoritários da Erythrina mulungu
Benth. ........................................................................................................................................ 54
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 16

1.1 Asma: definição, epidemiologia, diagnóstico, fisiopatologia e tratamento .................... 16

1.2 A prática da Fitoterapia: perspectivas históricas, atuais e justificativas para uso ........... 23

1.3 Erythrina mulungu Benth................................................................................................ 25

1.4 Justificativa ..................................................................................................................... 32

1.5 Hipótese........................................................................................................................... 32

2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 33

2.1 Objetivo geral ................................................................................................................. 33

2.2 Objetivos específicos ...................................................................................................... 33

3. MÉTODO ............................................................................................................................ 34

3.1 Delineamento do estudo.................................................................................................. 34

3.2 Condução do estudo ........................................................................................................ 34

3.3 Obtenção da planta medicinal ......................................................................................... 34

3.4 Preparo da droga vegetal................................................................................................. 35

3.5 Preparo do extrato etanólico da droga vegetal ................................................................ 35

3.6 Controle de qualidade ..................................................................................................... 36

3.7 Escolha da dose administrada aos camundongos............................................................ 36

3.8 Preparo da solução administrada e definição da dose ..................................................... 36

3.9 Camundongos ................................................................................................................. 36

3.10 Protocolo de sensibilização e desafio ........................................................................... 37

3.11 Intervenção .................................................................................................................... 37

3.12 Avaliação da hiper-responsividade brônquica em resposta à metacolina ..................... 38

3.13 Coleta do lavado broncoalveolar, sangue e pulmões .................................................... 39

3.14 Avaliação de celularidade total e diferencial ................................................................ 40

3.15 Dosagem sérica de anticorpos IgE para ovalbumina. ................................................... 40

 3.16 Dosagem de citocinas inflamatórias TH1 e TH2 no homogenato pulmonar .................. 41

3.17 Análise histológica pulmonar ....................................................................................... 41

3.18 Análise fitoquímica do extrato etanólico das flores de Erythrina mulungu ................. 42

3.19 Análise estatística ......................................................................................................... 43

4. RESULTADOS ................................................................................................................... 44

4.1 Efeito de E. mulungu sobre hiper-responsividade brônquica em resposta à metacolina 44

4.2 Efeito de E. mulungu sobre a celularidade total e diferencial ........................................ 46

4.3 Efeito de E. mulungu sobre os níveis de IgE sérico........................................................ 48

4.4 Efeito de E. mulungu sobre os níveis de citocinas do tecido pulmonar.......................... 49

4.5 Efeito de E. mulungu sobre a infiltração por células inflamatórias no tecido ................ 51

4.6 Identificação dos componentes de E. mulungu ............................................................... 52

5. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 55

6. CONCLUSÃO..................................................................................................................... 61

7. REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 62

ANEXO A - Aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal da FMRP-USP .... 72

ANEXO B - Protocolo utilizado no preparo do homogenato pulmonar .................................. 73

1. INTRODUÇÃO

1.1 Asma: definição, epidemiologia, diagnóstico, fisiopatologia e tratamento

A asma é a doença inflamatória mais comum dos pulmões e é umas das doenças
imunológicas crônica de maior ocorrência em humanos, que afeta pessoas da infância à fase
adulta (1, 2). Segundo a Iniciativa Global da Asma, é uma doença heterogênea, definida pelo
histórico de sintomas respiratórios, que variam ao longo do tempo e em intensidade,
juntamente com um padrão variável de obstrução das vias aéreas 3.
A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que aproximadamente 300 milhões
pessoas no mundo possuam asma, sendo esta prevalente em 1 a 18 % da população em
diferentes países; e que esta prevalência está aumentando, especialmente entre crianças 4.
Estima-se que aproximadamente 1000 pessoas morrem por dia devido à doença 5.
No Brasil, estima-se que existam 20 milhões de asmáticos se considerada a
prevalência global de 10 %. Dados de 2011 mostram que no país, a asma é a 4ª causa de
hospitalizações e que a taxa de mortalidade, entre 1998 e 2007, foi de 1,52/100.000 habitantes
(variação 0,85 – 1,72/100.000 habitantes) 6.
A resposta inflamatória nos pulmões frequentemente inicia-se na infância quando os
estímulos ambientais - tais como infecções virais do trato respiratório, exposição à alérgenos,
fumaça de cigarro e outros poluentes oxidantes - ativam a produção de citocinas pelo epitélio
das vias aéreas - entre as principais estão as interleucinas (IL) 25, IL-33 e/ou TSLP (Thymic
Stromal Lymphopoietin) - desencadeando uma série de reações patológicas subsequentes que
levam ao desenvolvimento da asma em crianças suscetíveis por apresentarem atopia pré-
existente e/ou fatores de risco genéticos específicos em reguladores da resposta inflamatória
2, 7
e/ou outras vulnerabilidades menos compreendidas . O desenvolvimento da asma sofre
influência, portanto, de fatores de risco genéticos e ambientais.
Tem sido amplamente investigada, mais recentemente, a influência da microbiota
intestinal na maturação e no funcionamento do sistema imunológico. O estudo de coorte de
Fujimura, et al (2016), publicado na revista Nature, investigou se a composição da microbiota
de neonatos com 1 mês de vida influenciaria a população de linfócitos T CD4+, de modo a
aumentar ou diminuir o risco relativo (RR) para o desenvolvimento de atopia aos 24 meses e
de asma aos 48 meses de idade. Em conclusão, verificou-se a susceptibilidade para asma
16
alérgica nas crianças com um padrão de microbiota menos abundante de bactérias
Bifidobacterium, Akkermansia e Faecalibacterium; e com maior proporção de Candida e
Rhodotorula. Assim, estuda-se que alteração no microambiente intestinal é uma via potencial
para alterar função de células T CD4+. O estudo sugere que a intervenção na primeira
infância para manipular a composição e a função do microbiota intestinal pode ser uma
estratégia viável para prevenção da doença 8.
Não são bem conhecidas as razões pelas quais as respostas imunes iniciadas na
infância se tornam persistentes na vida adulta. Talvez se possa atribuir à “memória” das
reações pela fixação de programações imunológicas aberrantes estabelecidas durante a janela
metabólica na primeira infância, quando o sistema imunológico ainda tem plasticidade.
Durante esse período do desenvolvimento, tanto as células da resposta imune inata, quanto da
resposta imune adaptativa são susceptíveis às mudanças epigenéticas que levam a mudanças
persistentes no comportamento celular das mesmas 2.
Uma vez manifestada, o diagnóstico da asma é baseado na história clínica de sintomas
respiratórios como tosse, sibilância, dispneia e/ou desconforto torácico, e na obstrução da via
aérea (limitação variável ao fluxo aéreo expiratório). Como critério diagnóstico diferencial às
demais doenças respiratórias crônicas, esses sintomas geralmente se apresentam com piora
característica no início da manhã e à noite e se exacerbam na presença de gatilhos, tais como
atividade física, contato com alérgenos/irritantes de mucosa (cheiro fortes de perfumes,
fumaça de cigarro), mudanças climáticas e infecções virais. Os sintomas também variam ao
longo do tempo e em intensidade e podem apresentar melhora espontânea ou com tratamento
medicamentoso 3.
A obstrução da via aérea e a condição de variabilidade da função pulmonar podem ser
confirmadas por espirometria, onde a resposta de constrição brônquica é induzida por
exercício físico, metacolina (Mch) ou histamina e medida sua reversibilidade com
broncodilatores ou anti-inflamatórios 3. Este teste avalia também a característica intrínseca e
diagnóstica da asma, chamada de hiper-responsividade brônquica, um estado patológico no
qual o estreitamento das vias aéreas podem ser rapidamente disparado 9.
A asma é frequentemente caracterizada por períodos assintomáticos pontuados com
2, 9
manifestações clínicas que podem variar de moderadas a graves . Um subgrupo
considerável de indivíduos com asma sofre do tipo mais grave da doença que é caracterizado
por sintomas mais frequentes e exacerbações. As exacerbações são fenômenos clínicos
complexos que envolvem a perda do controle da asma e o aparecimento dos sintomas citados

17
anteriormente. O resultado desse processo é o estreitamento da via aérea, que resulta não
apenas da contração do músculo liso, mas também do edema de mucosa e da formação
exacerbada de muco intraluminal 2. Os episódios de exacerbação podem também variar de
moderados a graves e até mesmo serem fatais por falência respiratória.
Na última década, métodos de detecção viral baseada em ácidos nucleicos demonstram
que a infecção por rinovírus é o gatilho mais comum de exacerbação da doença. Cerca de
90% das exacerbações da asma na infância estão associadas a viroses. As explicações do por
que a infecção por rinovírus tem consequências tão graves em pacientes asmáticos, e não em
saudáveis, ainda têm sido estudadas. Evidências mostraram que as células epiteliais
brônquicas de pacientes asmáticos produzem menos interferon (INF) tipo I e tipo III,
comparados aos controles saudáveis, quando induzidas por rinovírus. Ainda não se sabe se
esse defeito é uma causa ou um efeito da patogenia da asma 9.
Como visto, as manifestações clínicas variáveis tornam a asma uma doença
heterogênea. Com base nas características comuns dos pacientes asmáticos, têm sido
propostos diferentes fenótipos para a asma. Os indivíduos podem ser agrupados em 4-5
“clusters” de acordo com idade, gênero, atopia, função pulmonar, cuidado com a saúde e o
índice de massa corporal (IMC). Por essa divisão, por exemplo, o maior grupo é caracterizado
por obstrução média da via aérea e relativamente resistente às exacerbações. O outro grupo é
caracterizado por obstrução grave e mais propenso a exacerbações. Nesse cluster de pacientes
com asma mais grave incluem-se os indivíduos mais velhos e indivíduos obesos. Pesquisas
mais atuais buscam esclarecer se a heterogeneidade de fenótipos pode ser explicada por
mecanismos celulares ou moleculares em comum 2. Alguns dos fenótipos mais comuns
incluem:
 Asma alérgica: é o fenótipo mais facilmente reconhecido, que frequentemente
tem início na infância e está associado ao passado ou história familiar de
doença alérgica (rinite, eczema etc). O exame de escarro desses pacientes
geralmente revela uma inflamação eosinofílica nas vias aéreas. Os pacientes
com este fenótipo de asma são bons respondedores ao tratamento com
corticosteroides inalados.
 Asma não alérgica: alguns adultos que desenvolvem asma não associada com
alergias. O perfil celular do escarro pode ser neutrofílico, eosinofílico ou
conter poucas células inflamatórias. Pacientes com este fenótico geralmente
respondem menos com corticosteroides inalados.

18
  Asma tardia: asma apresentada pela primeira vez na vida adulta,
particularmente em mulheres. Esses pacientes tendem a não ser alérgicos e a
necessitar de doses extremamente altas de corticosteroides, ou mesmo serem
refratários ao tratamento.
 Asma com limitação fixa ao fluxo aéreo: são pacientes que já apresentam
mudanças estruturais no epitélio pulmonar, chamado remodelamento
brônquico, decorrente da inflamação crônica; cursam com limitação
permanente ao fluxo aéreo.
 Asma e obesidade: pacientes com excesso de peso apresentam sintomas
respiratórios proeminentes e pouca inflamação eosinofílica na via aérea 3.
Outro termo proposto para asma e atualmente discutido é baseado no mecanismo
imunopatológico da doença. Por ele, foi proposto o endotipo de asma, chamado “TH2- alto”
que é caracterizado por níveis aumentados de inflamação do tipo 2 nas vias aéreas. O termo
“endotipo” foi proposto em 2008 para direcionar os estudos na heterogeneidade molecular da
asma. Assim, um endotipo é um subtipo da doença definido por um mecanismo funcional ou
patológico distinto, diferentemente de fenótipo, que são características observacionais. A
vantagem dessa divisão consiste que um endotipo pode ser alvo de um tipo de tratamento
específico para um mecanismo molecular causador 2.
A base da fisiopatologia da asma envolve a quebra da homeostasia imunológica no
trato respiratório e a liberação de citocinas que ativam um processo inflamatório que garantem
1, 10
a manutenção crônica, característica da doença . É importante salientar que a resposta
inflamatória é um processo agudo, fisiológico e necessário para manutenção da integridade do
organismo, e que se encerra após a remoção do estímulo desencadeante. No entanto, pode
haver doenças com inflamação inapropriada, em que a resposta inflamatória progride para
11
uma fase crônica, em resposta a determinado estímulo, como alergia, transplantes, etc. .
Nesse mesmo contexto, a asma é uma doença crônica, na qual uma resposta inflamatória
anormal é ativada contra substâncias ambientais comuns, a que a maioria indivíduos
saudáveis não responde.
Quando um antígeno entra em contato com a via aérea, sua detecção imunológica
inicial se dá por células sensoras no local da infecção ou do dano tecidual. As células sensoras
são células epiteliais, macrófagos, células dentríticas e mastócitos que promovem a resposta
imune inata, como primeira linha de defesa, para remover o estímulo, reparar o tecido e cessar
a resposta inflamatória. As células sensoras, bem como boa parte das células do sistema

19
imunológico, atuam liberando citocinas de primeira ordem (tais como IL-1α, IL-1β, IL-23,
IL-25) capazes de ativar e recrutar células efetoras (monócitos, neutrófilos, eosinófilos,
basófilos, mastócitos) para o local da infecção/dano e ativar linfócitos residentes no tecido 9.
A produção de IL-25, IL-33 e TSLP pelas células epiteliais estão vinculadas à ativação de
resposta inflamatória tipo 2, discutida a seguir 1, 2, 9.
Os linfócitos T auxiliares (T helper/ CD4+) desencadeiam e reforçam a resposta imune
11
através de um determinado conjunto de citocinas , que descrevem as distintas respostas do
tipo 1 e tipo 2, principalmente reguladas por subpopulações de T helper 1 e (TH1) e T helper 2
(TH2), respectivamente 2.
Uma das possíveis explicações para a inflamação observada na asma é o desequilíbrio
12
entre as respostas imunológicas TH1 e TH2, com um desvio para TH2 . Este último tipo de
inflamação ocorre em cerca de 80% das crianças e na maioria dos adultos com asma
sensibilizada a alérgenos ambientais (pelo de animais de estimação, pólen, ácaros, fungos). É
bem estabelecido o papel central dos linfócitos TH2 na asma alérgica clássica, ou asma
eosinofílica (este último termo não é mais utilizado), mas não explica todas as variações
fenotípicas encontradas. Portanto, uma variedade de outras células T em diferentes subtipos
de asma, incluindo a associação de linfócitos TH1 e TH17 com a asma neutrofílica também
têm sido investigadas 1, ampliando o conhecimento sobre a fisiologia dessas células no
contexto da asma.
Após terem sido ativadas, as células TH2, na asma alérgica e, potencialmente, na asma
não alérgica, secretam citocinas do tipo 2, tais como IL-3, IL-4, IL-5, IL-13 e fator
estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), conhecidas como citocinas
de segunda ordem, que vão ativar uma série de respostas sobre as células efetoras (neutrófilos,
eosinófilos, mastócitos, basófilos, macrófagos), além de ativarem a resposta imune adaptativa
humoral com produção de anticorpos por linfócitos B (LB) e formação de LB de memória 13.
Tais citocinas se caracterizam por ativar um resposta mediada principalmente por eosinófilos,
1,9
mastócitos, basófilos e imunoglobulina E (IgE), característica da asma alérgica . Trabalhos
em ratos Rag2-/- que não possuem células T e B mostraram que o tratamento por IL-25
(citocina de primeira ordem liberada pelas células epiteliais em resposta à alérgenos)
provocou a liberação de IL-5 e IL-13 e a indução de resposta imunológica tipo 2. Tais
achados levaram a acreditar que não haveria somente a produção de citocinas do tipo 2 por
TH; foi então que se identificou congêneres de células linfoides inatas (conhecidas por uma
variedade de nomes na literatura: células naturais auxiliadoras, nuócitos e células inatas

20
auxiliadoras 2), e que recentemente foi proposto que todas as ILCs (innate lymphoid cells)
que produzem citocinas do tipo 2, fossem determinadas ILC2.
Na sequência dos eventos, algumas células TH2 ativas migram para folículos de
células B (localizados nos órgão linfoides secundários - baço, linfonodos e tecidos linfoides
associado à mucosa) para ativar as células B virgens (naive) e dar início à proliferação e
diferenciação das mesmas, culminando com troca de isótipo (classe) da cadeia pesada das
imunoglobulinas de IgM para IgE, produção aumentada de IgE pelos plasmócitos e formação
de células B de memória. O evento de troca e maturação da afinidade das imunoglobulinas é
mediada pelas citocinas produzidas pelos TH – no caso, IL-4 que induz a mudança de classe
para IgE; maturação da afinidade decorre da exposição continuada ao alérgeno, gerando
anticorpos com capacidade aumentada de ligação ao antígeno, de modo que ao se ligar,
neutraliza-o com maior eficiência. Os linfócitos B de memória são células capazes de
sobreviver a longos períodos e montam respostas rápidas à introdução de um antígeno
subsequente. Elas permanecem nos órgãos linfoides ou circulam no sangue. A ativação gera
anticorpos de alta afinidade e produção de grandes quantidades após a segunda exposição aos
antígenos 13.
Dessa forma, a resposta imune adaptativa mediada por TH2 na asma envolve tanto a
resposta celular, para atração e expansão clonal de células T, quanto a resposta humoral
1,9,11
(produção de anticorpos e de células de memória) . A consequência da cascata
inflamatória desencadeada, é a hipersensibilidade mediada por IgE a aeroalérgenos, a ativação
de células epiteliais da via aérea, a quimioatração de células efetoras (mastócitos, eosinófilos
9
e basófilos) e o remodelamento do epitélio e da matrix subepitelial . O termo
“hipersensibilidade” nada mais é do que uma definição clínica de imunidade como
“sensibilidade”, que se baseia no fato de o indivíduo ter sido exposto a um antígeno e
apresentar uma reação detectável, ou seja, é “sensível” ao antígeno em contato subsequente 13.
O remodelamento da via aérea é, portanto, uma consequência da inflamação crônica
que acomete o tecido, em que mudanças estruturais são vistas tanto no epitélio, quanto na
submucosa. No epitélio, há metaplasia de células de goblet ou caliciformes (células
produtoras de muco e mucinas, componentes chaves da barreira protetora que impede a
entrada de patógenos pelo epitélio). Na mucosa, observam-se mudanças de fibrose
subepitelial (aumento da deposição de colágeno tipo I, III e V, fibronectina e tenascin C na
lâmina reticular na zona basal da membrana basal), aumento do volume das glândulas
submucosas, hiperplasia e hiperplasia das células do músculo liso, aumento do número de

21
vasos sanguíneos. Tais mudanças tornam o indivíduo mais susceptível a exageradas respostas
a alérgenos ambientais inalados e a exacerbação mais proeminente pelo estreitamento basal
do calibre da via aérea 2.
O tratamento da asma envolve as medidas educacionais sobre a exposição a
desencadeantes alérgenos e o tratamento farmacológico. Este último tem por finalidade
intervir na resposta inflamatória através da modificação dos mediadores de sinalização ou
supressão dos componentes do sistema imune 11. Entre os mediadores de sinalização estão os
fármacos que agem sobre os eicosanoides, a histamina e as células do sistema imune. Os
agonistas de receptor ß2-adrenérgicos e os glicocorticoides continuam sendo o principal
2
tratamento para os indivíduos asmáticos . Os glicocorticoides têm eficácia sobre a
imunossupressão do tipo 2. No entanto, são conhecidos seus efeitos colaterais, locais e
sistêmicos, como disfonia, candidíase, catarata, osteoporose e supressão da glândula adrenal,
particularmente quando utilizado em altas doses e por prolongados períodos de tempo.
Tipicamente os regimes de tratamento atuais incluem a combinação de diferentes drogas.
Além das citadas, incluem-se anticolinérgicos, antagonistas de receptores de leucotrienos e
terapias direcionadas a IgE (estes dois últimos mais recentemente). Além deles, inibidores
específicos da inflamação do tipo 2, tais como anticorpos monoclonais anti-IgE
(Omalizumab®), IL-5, IL-13 e TSLP, estão sendo estudados como novos recursos
terapêuticos e adjuvantes ao tratamento com corticosteroides 2.
Como visto, a asma é uma doença de amplo espectro, desencadeada por muitos
fatores, que induz respostas imunológicas e inflamatórias diversas, envolvendo mediadores
não somente mediados por TH2, mas também por TH1 e TH17, e tem seus mecanismos ainda
sendo estudados. Esse amplo espectro faz com que um grupo de pacientes permaneça sem
controle ou com controle inadequado da doença. Dada a complexidade envolvendo a resposta
imunológica na asma, a limitação do tratamento farmacológico, seja pelos efeitos colaterais
dos medicamentos existentes, seja pelo difícil controle da doença, faz-se necessário que se
busquem potenciais agentes anti-inflamatórios para o manejo e tratamento da doença. Neste
ínterim, o uso de plantas medicinais e medicamentos fitoterápicos surgem como uma fonte
promissora de novas substâncias para o estudo em asma.

22
 1.2 A prática da Fitoterapia: perspectivas históricas, atuais e justificativas para uso

A utilização de plantas como medicamento remonta às origens da humanidade, com

registros mais antigos datando da era paleolítica, e é extensamente difundida em diversos
países como, por exemplo, China, Índia, Alemanha e Estados Unidos 14, 15.
O uso de plantas medicinais para o tratamento de doenças já foi utilizado
majoritariamente no Brasil no século passado, fato ilustrado pelo amplo número de espécies
botânicas nacionais e estrangeiras (mais de 280) descritas na primeira Farmacopeia Brasileira,
16
de 1929 . Antes da “era sintética”, 80% dos medicamentos eram obtidos a partir raízes,
cascas e folhas 17. Atualmente, um grande número de moléculas usadas como fármacos, como
digoxina, efedrina, atropina, escopolamina, taxol, vincristina, artemisinina, entre outras, são
derivadas de plantas e a indústria farmacêutica se interessa pelo estudo de produtos naturais
devido aos diversos efeitos colaterais dos medicamentos sintéticos e pelo alto custo de
produção destes, que ultrapassa de 800 milhões de dólares 18.
As etapas necessárias ao estudo de plantas medicinais e ao desenvolvimento de
produtos derivados podem levar muitos anos. No entanto, o advento da robótica,
bioinformática, biotecnologia molecular, química e de outras ciências contribuiu
significativamente para a prospecção de pesquisas na área de produtos naturais 16, 17.
A utilização de medicamentos fitoterápicos vem sendo estimulada pela OMS desde
1978 (Declaração de Alma-Ata), e também pelo governo brasileiro através da Política
Nacional de Práticas Integrativas e Complementares no SUS (Portaria GM nº 971, de
02/05/2006), e da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (Decreto
Presidencial 5.813 de 22 de junho de 2006), que completou 10 anos no ano passado (2016) 19.
No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), por meio da RDC
20
Nº 26 de 13 de maio de 2014 , vigente, descreve os medicamentos fitoterápicos como
produtos obtidos com o emprego exclusivo de matérias-primas ativas vegetais, caracterizado
pelo conhecimento da segurança e eficácia/efetividade do uso, assim como pela
reprodutibilidade e a constância da sua qualidade.
Sobre a comprovação da segurança e eficácia, a RDC dispõe que estas devem ser
baseadas em (a) ensaios não clínicos e clínicos de segurança e eficácia (por documentação
tecno-científica) ou através do (b) registro simplificado. A comprovação da segurança e
eficácia por meio deste último refere-se à presença da planta na lista de medicamentos
fitoterápicos de registro simplificado (Instrução Normativa nº 2 de 13 de maio de 2014 –

23
atualmente vigente) ou nas monografias de fitoterápicos de uso bem estabelecido da
Comunidade Europeia (Community herbal monographs with well-estabilish use) elaborada
pelo Comitê de Produtos Medicinais Fitoterápicos (Committe on Herbal Medicinal Products)
da Eurepean Medicines Agency.
Os benefícios à saúde atribuídos ao uso de fitoterápicos são devido à presença de
diversos compostos bioativos (CBAs) ou princípios ativos (PAs) encontrados nas folhas,
flores, cascas, caules ou raízes das plantas 21.
Os PAs são substâncias orgânicas produzidas pelo metabolismo secundário das
plantas, isto é, o conjunto de reações químicas da célula vegetal nas quais se transformam
carboidratos, aminoácidos e lipídios (produtos da reação de fotossíntese, chamado de
22
metabolismo primário) em uma rica e vasta diversidade de substâncias . Mas por que razão
as plantas produzem uma vasta diversidade de substâncias? Entre as teorias levantadas, a mais
aceita é que, evolutivamente, as plantas passaram a produzi-las para conferir vantagem na
capacidade de sobrevivência, garantindo assim o afastamento de predadores (animais, insetos,
micro-organismos patogênicos) e à perpetuação da espécie pela atração de polinizadores
(abelhas, pássaros, etc.) 23.
Uma vez ingeridas, na forma de chás, tinturas, extratos, xaropes ou medicamentos
industrializados, tais substâncias são responsáveis por diversos efeitos farmacológicos no
organismo.
Ao conjunto de todas as substâncias originadas do metabolismo secundário de uma
planta, que são responsáveis, conjuntamente, pelos efeitos biológicos observados, dá-se o
nome de fitocomplexo 20.
O fitocomplexo caracteriza-se, por sua vez, como a principal vantagem dos
fitoterápicos em relação à terapia convencional. O isolamento de um único PA pode ser
vantajoso em algumas situações, mas não em outras, onde a atuação do fitocomplexo é
superior à de quaisquer dos componentes isoladamente 15. Um exemplo disto é o fato de que,
no tratamento da malária, o extrato bruto de Artemisia annua L. (“artemísia”, Compositae) é
mais eficaz e induz menos resistência do que do que a substância isolada artemisinina (24,
25).
Inúmeros estudos têm sido publicados sobre o efeito de diversos extratos vegetais com
26–28
propriedades anti-inflamatórias e broncodilatadoras . Em um estudo experimental, foi
proposto tratamento para asma através da curcumina, um polifenol presente no rizoma da
espécie Curcuma longa L. (“açafrão-da-terra”, Zingiberaceae), que tem sido usado há séculos

24
como remédio anti-inflamatório na medicina asiática. Neste trabalho, foi demonstrado que a
curcumina pode ter um efeito benéfico no tratamento da asma através da inibição do fator de
29
transcrição nuclear kappa B (NF-kB) . Outros estudos realizados com Mikania glomerata
Spreng. (“guaco”, Asteraceae) e Mikania laevigata Sch. Bip. ex Baker (“guaco”, Asteraceae)
demonstraram que estas plantas também apresentam ação anti-inflamatória nas vias aéreas
30,31
.
Atualmente, no Brasil, a ANVISA regulamenta o uso de algumas espécies vegetais
32
como anti-inflamatórias e outras como broncodilatadoras . Porém, ainda existem outras
espécies que necessitam de investigação quanto a sua eficácia no tratamento da asma. Dentre
as espécies com ação anti-inflamatória e com potencial para o tratamento da asma, destaca-se
a Erythrina mulungu Benth (E. mulungu) (“mulungu”, Fabaceae)
Esta planta consta na Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse do SUS
33
(RENISUS) , na qual se tem interesse em ser investigada para futuramente compor a
RENAFITO (Relação Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos), aplicada na prática de
prescrição do SUS.

1.3 Erythrina mulungu Benth

A espécie Erythrina mulungu Benth (Família Fabaceae-Faboideae), popularmente

conhecida como suinã ou mulungu, é uma árvore nativa, encontrada na região centro-leste do
país, especificamente nas florestas do sul da Bahia, Zona da Mata de Minas Gerais, Espírito
Santo, Rio de Janeiro e São Paulo (Vale do Paraíba), na floresta pluvial atlântica 34.
Na ordem evolucionária, a planta é uma angiosperma. Morfologicamente é
caracterizada de copa pequena e alta, espinhenta de 10 a 25 m de altura, com tronco de 50 a
70 cm diâmetro, revestido por casca acinzentada com ritidoma estriado (Figura 1). Folhas
compostas trifoliadas, folíolos ovalados, glabros de 8-11 cm de largura e pouco maior no
comprimento. A árvore floresce a partir do final do mês de agosto até final de setembro, em
ramacetos axilares e terminais, com flores vermelhas (motivo pelo qual também é chamada de
árvore-coral). Os frutos são em vagem curta, com 1-4 sementes e amadurecem em
outubro/novembro 34.
A espécie já foi chamada de Corallodendron mulungu (Martius) Kuntze, Erythrina
35
flammea Herzog tendo sido alterado recentemente para Erythrina verna Vell. Neste
trabalho adotamos a nomenclatura de Erythrina mulungu Benth. devido à identificação

25
botânica. Tais sinônimos são frequentemente substituídos, e o nome científico pode ser
consultado na base de dados http://www.theplantlist.org/.
O nome Erythrina vem do grego erythros, que significa vermelho, em referência à cor
das flores 36.

Figura 1. Erythrina mulungu Benth.

Fonte: LORENZI, H. Árvores Brasileiras. Nova Odessa: Instituto Plantarum, 2015

Na medicina popular há relato do uso centenário da casca de E. mulungu por

populações indígenas com finalidade sedativa 14. Encontram-se também relatos de usos contra
febre intermitente, insônia, gengivite, hepatite, inflamações esplênicas, bronquite e asma (14,
34) além de uso como anti-inflamatório, tranquilizante 38, em convulsões e na menopausa 39.
O estudo de Albuquerque et al, (2007), analisou 21 publicações sobre plantas medicinais de
uso tradicional da vegetação caatinga (semiárido), nordeste brasileiro. Foi descrito pela
população local o uso terapêutico como ansiolítico e para insônia 40.
A casca e as folhas de E. mulungu são as partes da planta tradicionalmente utilizadas
41
com fins terapêuticos. No entanto, também há relatos do uso popular das flores . Vários

26
 41–45
trabalhos científicos utilizaram as flores para testar a eficácia e segurança terapêutica ,e
dentre as justificativas para o uso, foi por se colocar em risco a conservação da biodiversidade
e do uso sustentável da espécie devido ao dano causado à planta pela raspagem da casca do
caule 41.
Há cerca de trinta e cinco anos (na década de 80), pesquisas científicas passaram a ser
desenvolvidas com E. mulungu, objetivando-se avaliar a segurança e a eficácia terapêutica
alegada pela medicina popular tradicional, até então descrito em trabalhos
etnofarmacológicos, bem como caracterizar os PAs possivelmente envolvidos em seus efeitos.
A Figura 2 mostra o resultado da busca sistemática conduzida no dia 22/03/2017 nas
bases de dados Science Direct, Pubmed, Clinical trials, Web of Science and Cochrane Library
com os descritores “Erythrina mulungu” e “Erythrina verna” (separadamente):

Resultado encontrado para Resultado encontrado para

“Erythrina mulungu” “Erythrina verna”
(n = 132) (n = 43)

Resultado após exclusão de duplicatas, respectivamente:

(n= 89) e (n = 29)

n = 55 e 21, respectivamente,
excluídos por utilizarem outra
espécie do gênero ou por não
estarem relacionados ao conteúdo
da pesquisa.

Publicações científicas sobre E. mulungu / E. verna

(n = 34) / (n=8) = 42 trabalhos

Figura 2. Fluxograma da busca dos estudos científicos com Erythrina mulungu Benth.

Foram levantados os trabalhos etnofarmacológicos e de revisão em que a planta era

citada, estudos fitoquímicos, estudos in vitro, experimentais e clínicos em que o extrato da
planta/medicamento constituiu a intervenção do ensaio, além de capítulos de livros. Na
Tabela 1 há o resumo das publicações de acordo com tipo de estudo com a planta.
27
 A Tabela 2 mostra uma síntese das evidências científicas dos efeitos terapêuticos
estatisticamente significativos de E. mulungu, parte da planta, tipo do extrato, características
do tratamento, doses de efeito terapêutico e via de administração utilizada. Foram
referenciados apenas os trabalhos originais, excluindo-se àqueles citados em revisão e
capítulos de livros.
Observa-se que a planta apresenta efeitos terapêuticos ansiolítico, sedativo,
anticonvulsivante, analgésico, antimicrobiano (in vitro) e anti-inflamatório comprovados em
animais. A planta apresenta-se ainda em preparações fitoterápicas, tais como Maracugina® e
Ritmoneuran®, atualmente comercializadas com indicação tranquilizante, além de o extrato
46
ser disponível em farmácias magistrais para manipulação e comercialização . Estudos
clínicos também já foram conduzidos com a planta (Tabela 3) (47, 48).
Nenhum estudo, entretanto, testou os efeitos da administração de E. mulungu no
tratamento da asma.

Tabela 1. Publicações encontradas com os descritores “Erythrina mulungu” e “Erythrina

verna” em base de dados.
Tipo de Estudo nº de Referências
publicações
40,49
Estudo etnofarmacológico (uso popular) 2
50–55
Estudos fitoquímicos 6
38,53,56–61
Estudos in vitro 8
35,41–45,51,62–69
Estudos experimentais (toxicidade e farmacológicos) 15
47,48
Estudos clínicos 2
37,46,70–74
Estudo de revisão (citação de uso terapêutico) 7
54,75–78
Estudo de aplicabilidade em agronomia e botânica 5
Capítulo de livro 1 (36)
Total: 45*
44,51 53
* apresentam estudo fitoquímico e experimental; * apresenta estudo fitoquímico e in
vitro; *54 apresenta estudo fitoquímico e botânico

28
Tabela 2. Evidências científicas dos efeitos terapêuticos da Erythrina mulungu Benth., parte da planta, tipo de extrato, características do tratamento, dose e via de administração.
Via de
Autor/Referência Efeito Extrato Tipo de tratamento Doses com efeito terapêutico
adm
Flores
Onusic et al, 2002 41 ansiolítico EHA 30% água e 70% etanol Agudo, 30 minutos pré-teste. 200 mg/kg v.o.
maceração por 10 dias
Onusic et al, 2003 42 ansiolítico EHA 30% água e 70% etanol Crônico, de 9 a 14 dias. 50, 100 e 200 mg/kg v.o.
maceração por 10 dias
Ribeiro et al, 2006 43 sedativo EHA 70% água e 30% etanol Agudo, 1 hora anterior pré-teste e 100, 200 e 400 mg/kg (agudo) v.o.
Não há informações sobre o tempo de Crônico, por 21 dias. 50, 100 e 200 mg/kg (crônico)
maceração
44
Flausino Jr., et al, 2007 ansiolítico EHA 30% água e 70% etanol Agudo, 30 minutos pré-teste. 200 e 400 mg/kg v.o.
maceração por 10 dias
45
Flausino Jr., et al, 2007 ansiolítico EHA 30% água e 70% etanol Agudo, 30 minutos pré-teste. 100 e 200 mg/kg v.o.
maceração por 10 dias
De Bona, et al, 2012 / 51 DL50 de 1, 37 g/kg, EHA 30% água e 70% etanol Agudo, avaliado nº de óbitos 250, 500 e 1000 mg/kg (para i.p
ausência de Maceração por 3 dias após 48h determinar a DL50)
citotoxicidade, 200 e 400 mg/kg (teste de
micronúcleo)
Casca do caule
Vasconcelos, et al, 2004 63 atividade EHA 70% água e 30% etanol Agudo, 30 minutos pré-teste; i.p. 200 e 400 mg/kg (i.p) i.p. e
depressora do SNC Mistura aquecida à 60ºC por 2h Agudo, 1 hora pré-teste; v.o. 800 (v.o.) v.o.
Vasconcelos, et al, 2007 64 anticonvulsivante EHA 70% água e 30% etanol Agudo, 30 minutos pré-teste 400 mg/kg i.p
Mistura aquecida à 60ºC por 2h
Vasconcelos, et al, 2003 62 nociceptivo EHA 70% água e 30% etanol Agudo, 30 minutos pré-teste. 200 e 400 mg/kg i.p.
Mistura aquecida à 60ºC por 2h
Oliveira, et al, 2012 66 anti-inflamatório e EHA 10% água e 90% etanol Agudo, 30 a 40 minutos pré- 100 mg/kg v.o.
antinociceptivo Maceração por 3 dias teste.

Vasconcelos, et al, 2011 65 anti-inflamatório EHA 70% água e 30% etanol Agudo, 1 hora pré-teste. 200 e 400 mg/kg v.o
Mistura aquecida 60ºC por 2h à
Lima, et al, 2006 38 bactericida - - Concentração de 100 mg/mL in vitro
Omena, et al, 2007 56 larvicida EHA 95% etanol - < 200 µg/mL in vitro
Percolação por 3 dias ou Soxhlet por
2 dias
Mazzari et al, 2016 59 Não inibe: Infusão por 20 minutos - 100 µg/mL in vitro
expressão de
CYP3A4; níveis de
GSH; atividade Gp
Legenda: adm administração; EHA extrato hidroalcoólico; DL dose letal; Gp glicoproteína P; SNC sistema nervoso central; v.o. via oral; i.p. intraperitoneal
29
Tabela 2 (Continuação)
Via de
Autor/Referência Efeito Extrato Tipo de tratamento Doses com efeito terapêutico
adm
Folhas
Mateus et al, 201357 Nematocida Aquoso, 100mL de extrato em contato 10, 20, 30, 40 e 50 g/L in vitro
Maceração por 24 horas com 100mL de uma solução com
ovos de Meloidogyne incognita
Proença, et al, 2012 68 Mudanças no HAE 70% etanol Crônico, 1-19 dias gestacionais 1,5 mg/kg v.o
desenvolvimento Percolação
gestacional

Raiz
Oliveira, et al, 2012 66 Anti-inflamatório EHA 10% água e 90% etanol Agudo, 30 a 40 minutos pré- 100 mg/kg v.o.
e nociceptivo Maceração por 3 dias teste.

Frações e PA isolados
Flausino Jr., et al, 2007a 44 Ansiolítico (+)-11a-hydroxy-erythravine, (+)- Agudo, 30 minutos pré-teste. 3 e 10 mg/kg v.o.
erythravine e (+)-a-hydroxyerysotrine
(flores)
Flausino Jr., et al, 2007b 45 ansiolítico (+)-11a-hydroxy-erythravine e (+)- Agudo, 30 minutos pré-teste. 3 e 10 mg/kg v.o.
erythravine (flores)
Faggion, et al, 2011 35 Anticonvulsivante (+)-erythravine e (+)-11a-hydroxy- Agudo, 10 minutos pré-teste 0,25 a 3,0 µg/µL i.c.v.
erythravine (flores)
Santos Rosa, et al, 2012 67 Anticonvulsivante (+)erysothrine Agudo 0,5, 2,0 e 3,0 µg/µL i.c.v.
e ansiolítico
Oliveira, et al, 2012 66 Anti-inflamatório Fração clorofórmio (raiz) Agudo, 30 a 40 minutos pré- 100 mg/kg v.o.
e nociceptivo teste.

Setti-Perdigao, et al, 2013 58 Inibidor dos (+)-11a-hydroxy-erythravine, (+)- - 100 µM in vitro

receptores de Ach erythravine e (flores)
nicotínicos
Guaratini, et al, 2014 60 Atividade 8-oxo-eritraline e erisotrina - 0.016 - 5 μg/mL in vitro
citotóxica contra
células tumorais
Callejon et al, 2014 53 Baixa atividade à Erythraline; 8-oxoerythraline; 8- - 40, 20 e 10 μg/mL in vitro
Leishmania Oxoerythraline; epoxide; crystamidine;
amazonensis erythrinine;erysovinee rythratidinone
(casca do caule)
Legenda: adm administração; Ach acetilcolina; PA princípio ativo EHA extrato hidroalcoólico; v.o. via oral; i.p. intraperitoneal; i.c.v. intracerebroventricular
30
Tabela 3. Evidências clínicas científicas dos efeitos terapêuticos da Erythrina mulungu Benth.
Autores Efeito Característica do estudo Descrição do estudo Observações
Fiss et al, 2006 48 Insônia e clínico multicêntrico, n=96 pacientes tratados por 30 dias com Não há informações sobre a concentração de
ansiedade fase IV, mascarado, Maracugina® (Passiflora alata, Erythrina cada uma das plantas na preparação
*em combinação
com outras plantas
randomizado mulungu, Crataegus oxyacantha) comparado fitoterápica, a parte da planta utilizada, bem
com Passiflorine®, (Passiflora incarnata, como marcadores químicos constituintes.
Crataegus oxyacantha, Salix alba) em
comprimido e solução oral.
Silveira-Souto, et Ansiolítico Clínico, randomizado, n=30 pacientes tratados 1 hora antes do Não há informações sobre a composição do
al, 2014 47 duplo-cego, crossover procedimento cirúrgico para extração de fitoterápico.
molares com 500mg (Mulungu Matura®), v.o.
Legenda: v.o. via oral

31
1.4 Justificativa

A demonstração de atividade anti-inflamatória do extrato das flores de E. mulungu em

modelos animais de asma pode ser o início de uma alternativa para o tratamento da asma, bem
como futuramente, levar ao desenvolvimento de novos medicamentos.

1.5 Hipótese

O extrato etanólico das flores de E. mulungu apresenta atividade anti-inflamatória e

reduz a inflamação e a hiper-responsividade brônquica em modelo experimental de asma.

32
2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar os efeitos da administração do extrato etanólico das flores de Erythrina

mulungu Benth. no tratamento da asma em um modelo experimental, bem como propor os
mecanismos envolvidos.

2.2 Objetivos específicos

Serão avaliados como objetivos específicos:

 Obtenção do extrato etanólico das flores de E. mulungu

 Análise fitoquímica do extrato etanólico das flores de E. mulungu
 Alterações na responsividade brônquica in vivo;
 Alterações celulares (contagem celular total e diferencial) no lavado
broncoalveolar;
 Dosagem sérica de anticorpos IgE para ovalbumina
 Produção de citocinas no homogenato pulmonar;
 Avaliação da infiltração celular no tecido pulmonar.

33
3. MÉTODO

3.1 Delineamento do estudo

Estudo experimental in vivo, longitudinal, com 4 semanas de intervenção, realizado no

Laboratório de Fisiopatologia Pulmonar Experimental da FMRP-USP, no período de outubro
de 2015 a março de 2017. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação
Animal da FMRP-USP (CONCEA), sob o protocolo nº 072/2013 (ANEXO A).

3.2 Condução do estudo

O estudo foi dividido em duas etapas:

1. Verificação da atividade terapêutica do extrato etanólico da flor de E. mulungu
nas doses de 200, 400, 600 e 800 mg/kg sobre a hiper-responsividade
brônquica.
2. Verificação da atividade terapêutica na resposta inflamatória celular, na
concentração de IgE, na concentração de citocinas e nas alterações do tecido
pulmonar.

3.3 Obtenção da planta medicinal

A espécie foi cultivada na instituição Casa Espírita Terra de Ismael (Farmacêutico

Responsável: Anne Cristina Ferreira, CRF-SP 34.696, CNPJ: 01.824.056/0001-23,
localização: latitude 21˚4’33’’ sul, longitude 47˚44’48’’ oeste) com autorização do governo
brasileiro. As flores de E. mulungu foram coletadas às 10 horas da manhã, e uma exsicata foi
depositada no Herbário da Universidade de Ribeirão Preto (UNAERP). O voucher é 3168,
especialista Milena Ventrichi Martins.

34
 3.4 Preparo da droga vegetal

Os extratos da droga vegetal foram preparados no Laboratório de Biotecnologia da

UNAERP, sob supervisão da Prof.ª Dr.ª Ana Maria Soares Pereira. As flores de E. mulungu
foram lavadas e o excesso de água foi removido com folhas de papel. Em seguida, as flores
foram secas em estufa de ar circulante a 45 ̊C por 48 horas. Depois, trituradas em moinho de
facas até a granulometria de 40 mesh, obtendo-se um pó resultante chamado de droga vegetal
(Figura 3).

Figura 3. Flores secas (esquerda) e o pó (direita) obtidos da Erythrina mulungu Benth.

3.5 Preparo do extrato etanólico da droga vegetal

Para extração dos princípios ativos presente nas flores de E. mulungu, utilizaram-se
5,6 L de etanol e 1020 g de droga vegetal. Ambos, foram acondicionados em um bécker (6 L),
misturados, e mantidos em maceração por 7 dias, com agitação diária, na ausência de luz, e
em temperatura ambiente. Transcorrido o período, o extrato etanólico das flores obtido foi
filtrado em papel de filtro e rota-evaporado. Em seguida, o líquido remanescente foi
congelado e liofilizado, resultando em um resíduo seco final de 32,4316 g. O extrato etanólico
das flores obtido foi armazenado em tubo Falcon fechado, na ausência de luz e em
temperatura ambiente, até o momento do uso.

35
 3.6 Controle de qualidade

As drogas vegetais e os extratos foram submetidos a controle de qualidade de acordo

79
com a legislação brasileira vigente . O controle de qualidade dos extratos foi feito no
Laboratório de Biotecnologia Vegetal da UNAERP, sob responsabilidade da Prof.ª Dr.ª Ana
Maria Soares Pereira.

3.7 Escolha da dose administrada aos camundongos

Baseando-se nos resultados da revisão sistemática, pretendeu-se iniciar os testes com a

dose de 200 mg/kg. Após primeira análise da dose e verificado o efeito, a hipótese do estudo
foi extrapolada para se testarem as doses de 400, 600 e 800 mg/kg.

3.8 Preparo da solução administrada e definição da dose

O extrato etanólico de E. mulungu foi ressuspenso em solução salina 0,9 % e Tween80

na proporção 98:2 para ser administrado aos animais. A administração das doses foi
determinada em 200, 400, 600 e 800 mg/kg do animal, sendo o volume administrado de 300
µL para as doses 200, 400 e 600 mg/kg (respectivas concentrações 20, 40 e 60 mg/mL). Para
a dose de 800 mg/kg, foi administrado o volume de 600 µL da solução na concentração de 40
mg/mL. Como controle negativo, os animais receberam 300 µL da solução salina 0,9 % e
Tween80 (98:2) O controle positivo recebeu 2 mg/kg de dexametasona, administrado em um
volume de 300 µL por animal. Os dados apresentados consideram o peso para um
camundongo de 30 g.

3.9 Camundongos

Foram utilizados camundongos machos Balb/c, com idade entre 6 e 8 semanas. Os

animais foram obtidos no Biotério Central da FMRP-USP e mantidos em isoladores no
Biotério do Departamento de Clínica Médica, com livre acesso a água e alimento.
36
 3.10 Protocolo de sensibilização e desafio

O protocolo de sensibilização e desafio encontra-se abaixo, na Figura 4.

Camundongos Balb/c foram sensibilizados duas vezes (em D1 e D8), com 10 g de
ovalbumina (OVA) diluídos em 0,2 mL de solução salina isotônica estéril, por via
intraperitoneal (ip). Após uma semana da última sensibilização, os camundongos foram
submetidos a quatro desafios (D15, D17, D19, D21) por via intra-nasal, com 10 µg de OVA
diluídos em 50 µL de solução salina isotônica estéril, sob leve sedação com isoflurano 100 %
(1 mL/mL), administrado por inalação.

Sensibilização (i.p.) Desafio (intranasal)

Ovalbumina + Al(OH)3 Ovalbumina

D1 D8 D15 D16 D17 D18 D19 D20 D21 D22

Tratamento com EV (i.p) análise in vivo

200, 400, 600, 800 mg/kg Coleta de material

Figura 4. Modelo experimental de asma e tratamento com o extrato etanólico das flores de
Erythrina mulungu Benth. (EV); i.p. intraperitoneal

3.11 Intervenção

Os animais foram tratados diariamente, por sete dias consecutivos via ip. com uma das
doses citadas. Os grupos controles – negativo e positivo – receberam respectivamente,
solução salina-solvente e dexametasona (2 mg/kg), seguindo o mesmo protocolo de
tratamento. Ao total, 7 grupos (contendo de 5 a 10 animais cada) foram estudados, sendo
estes:

Grupos OVA/EV200, OVA/EV400, OVA/EV600, OVA/EV800: os camundongos foram

sensibilizados e desafiados com OVA. Receberam 200, 400, 600 ou 800 mg/kg de extrato
etanólico da flor de E. mulungu durante o período de tratamento.
37
Grupo SAL/SAL (controle saudável): os camundongos foram sensibilizados e desafiados
com solução salina. Os camundongos receberam solução salina durante o período de
tratamento.

Grupo OVA/SAL (controle negativo): os camundongos foram sensibilizados e desafiados

com OVA. Os camundongos receberam solução salina durante o período de tratamento.

Grupo OVA/DEXA (controle positivo): os camundongos foram sensibilizados e desafiados

com OVA. Os camundongos receberam dexametasona (DEXA) durante o período de
tratamento. Trata-se de um anti-inflamatório de referência.

3.12 Avaliação da hiper-responsividade brônquica em resposta à metacolina

No D22, ou 24h após último desafio, os animais foram anestesiados i.p. com xilazina
(10 mg/kg) e quetamina (80 mg/kg), e sedados, submetidos a uma traqueostomia e à
colocação de uma cânula traqueal (Precision Tips – Engenered fluid Dispensing – Nordon
EFD, Tip 20 GA PP 0,19 x 1,5 PNK 50P). Imediatamente após a finalização desse
procedimento, o animal foi conectado através da cânula a um ventilador mecânico para
animais FlexiVent® (Scireq, Montreal, QC, Canadá) com frequência respiratória de 150
respirações/minuto e pressão expiratória final positiva (PEEP) de 3 cm H2O para medir os
parâmetros in vivo da função pulmonar.
Antes de iniciar as medidas respiratórias no respirador mecânico FlexiVent® os
animais foram paralisados com 1,2 mg/kg de brometo de pancurônio, via i.p. Este ventilador
permite a realização de medidas in vivo de diversos parâmetros fisiológicos através da técnica
de oscilação forçada, com o modelo de compartimento simples e o modelo de impedância
complexo. Estes dois modelos permitem a separação das alterações nos diferentes
compartimentos pulmonares, como vias aéreas e parênquima.
Para analisar a hiper-responsividade brônquica foram feitas medidas na condição basal
e após a provocação com a administração de aerossóis com concentrações crescentes de
metacolina (6,25; 12,5; e 25 mg/dL) por 10 segundos cada, através de um nebulizador
ultrassônico (Hudson RCI, Teleflex Medical, Temecula, CA, USA). Os parâmetros
respiratórios foram selecionados das curvas que apresentarem um coeficiente de determinação

38
maior ou igual a 0,9 (COD  0,9). Foram avaliados e comparados os seguintes parâmetros:
resistência total (RRS), elastância total (ERS), resistência tecidual (G) e elastância tecidual
(H).
Ao final desse procedimento, os animais foram desconectados do ventilador para
análises descritas a seguir.

3.13 Coleta do lavado broncoalveolar, sangue e pulmões

Foi coletado o lavado broncoalveolar (LBA) a fim de quantificar o grau de inflamação

das vias aéreas. Ao final da ventilação, o LBA foi coletado duas vezes pela infusão e
aspiração de 1 mL de solução salina pela cânula traqueal, obtendo LBA 1 e LBA 2. As duas
amostras do LBA foram centrifugadas (Eppendorf 5804R) a 3000 rpm por 5 minutos com
temperatura de 4ºC. O sobrenadante do LBA1 foi separado e armazenado a -80 oC para
análises posteriores; do LBA2, foi descartado. Os precipitados remanescentes do LBA1 e do
LBA2 foram agrupados e ressuspendidos em 500 µL de salina para contagem do número total
e diferencial de células.
Após a coleta do LBA, o sangue foi retirado através do ventrículo direito; centrifugado
(Eppendorf 5804R) a 3300 rpm por 22 minutos com temperatura de 4 ºC e o plasma
armazenado a -80 ºC para dosagem de IgE anti-ovalbumina.
Na sequência, a caixa torácica foi aberta e foram infundidos 5 mL de solução salina no
ventrículo direito para retirada do sangue residual dos pulmões. O pulmão direito foi retirado
e armazenado em RNAlater (Qiagen, Austin, Texas, USA) em um freezer a -80 °C para
posterior preparo do homogenato pulmonar para dosagem de citocinas. O pulmão esquerdo
foi retirado e insuflado com 10 mL de formol tamponado a 10 %. Após, foi colocado em
imerso em formol tamponado a 10 % por até 72 horas; após esse período, foi preservado em
álcool etílico 70 % até o momento de serem incluídos em blocos de parafina e cortados em
micrótomo convencional com espessura de 5 μm. Os cortes foram utilizados para análise
histológica.

39
 3.14 Avaliação de celularidade total e diferencial

Para contagem de célula total foi utilizado o aparelho Countess® Automated Cell
Counter (Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA). Foram adicionados 10 µL da
amostra com 10 µL de azul de Trypan e o valor absoluto fornecido pelo aparelho.
Para a contagem e diferenciação das células inflamatórias, as lâminas foram
inicialmente preparadas. Para isso, 100 µL da amostra foram centrifugadas a 400 rpm por 3
minutos em centrífuga tipo Citospin (Centrífuga Citológica, ThermoFisher Scientific,
Shandon Cytopin), em lâminas de microscopia fosca lapidada (26,0 x 76,0 mm – Espessura 1
a 1,2 mm) e coradas pela técnica de Diff-Quick. Foram contadas manualmente 300 células
inflamatórias de cada amostra.

3.15 Dosagem sérica de anticorpos IgE para ovalbumina.

Para a quantificação de IgE, incialmente preencheu-se uma placa de 96 poços com 50

μL de solução OVA (10 μg/mL) sendo esta incubada por 12 horas a 4 °C. Os poços foram
então lavados com solução PBS contendo 0,05 % de Tween 20. Na sequência, foram
pipetados 200 μL de solução PBS adicionado de 10 % de soro fetal bovino para bloqueio das
reações inespecíficas, e a placa foi incubada por mais 1 hora a 37 °C. Os poços foram lavados
e as amostras de soro foram adicionadas em duplicata, utilizando-se a diluição 1:2 (25 μL de
amostra). Após 2 horas a 37 °C, os poços foram lavados e 50 μL dos anticorpos biotinilados
foram adicionados. Decorrido 1 hora a 37 ºC, os poços foram lavados e 50 μL de
estreptavidina HRP (diluída 1:10.000; BD Bioscience, EUA) foi adicionado e a placa
incubada por 30 minutos no escuro e em temperatura ambiente. Os poços foram então lavados
e a reação foi revelada decorrido 30 minutos da incubação com 50 μL de TMB (BD
Bioscience, EUA). A reação foi interrompida com adição de 25 μL de ácido sulfúrico (16 %).
A leitura da absorbância foi lida com auxílio do espectrofotômetro Versa Max (Molecular
Devices, EUA), no comprimento de onda de 450 nm e os resultados foram expressos como
unidades de densidade óptica. Somente o grupo 800 mg/kg não foi submetido a esta análise
devido à falta de amostra.

40
 3.16 Dosagem de citocinas inflamatórias TH1 e TH2 no homogenato pulmonar

O homogenato foi preparado a partir do pulmão armazenado em RNAlater (Qiagen,

Austin, Texas, EUA) a -80 °C. Para isso, 50 mg de pulmão de cada amostra foi pesado em
uma balança de precisão e 1 mL de uma solução contendo inibidor de proteases (Complete
EDTA-free, ROCHE) foi adicionado. O órgão foi processado utilizando um homogeneizador
de tecido (OMNI(TH)-International-Kennesaw, GA, EUA) e após foi centrifugado a 3.500
rpm por 15 minutos e o sobrenadante foi coletado e armazenado a -80 °C para dosagem de
citocinas. No ANEXO B, encontra-se o protocolo utilizado no preparo do homogenato. Foram
quantificadas as citocinas IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 e IFN-γ no sobrenadante do homogenato
pulmonar pelo método ELISA (Enzime Linked Immunosorbent Assay), de acordo com as
instruções do fabricante (BD Biosciences BD OptEIA™, SanDiego, CA e eBioscience, San
Diego, CA, EUA). Algumas amostras foram diluídas para a realização do ensaio (de 1:2, até
1:20). O resultado final é o valor da concentração obtida, multiplicado pelo número de vezes
da diluição. Apresenta-se assim como resultado final a concentração da citocina em
picograma/mL.

3.17 Análise histológica pulmonar

Foram realizados cortes histológicos no pulmão com espessura de 5 μm e realizada

coloração de Hematoxilina-Eosina (H&E). Para análise morfológica, foram selecionadas 4 a 5
vias aéreas de cada camundongo que apresentavam epitélio íntegro e relação do maior
diâmetro/menor diâmetro maior ou igual a 0,5. Antes de serem analisadas, as lâminas foram
visualizadas no microscópico LeicaDM500 (Leica, Alemanha) e as imagens foram
fotografadas com um aumento de 400 vezes e transferidas para um computador. Para
quantificar a inflamação do tecido, delimitou-se a área após a membrana da via aérea
(membrana basal), identificando a quantidade de células inflamatórias, através de método
80
semi-quantitativo, estabelecendo um escore de inflamação , de acordo com a Tabela 4. A
atribuição do escore foi realizada por duas pessoas, sendo que em uma das análises a
identificação dos grupos foi ocultada (cego).
41
Tabela 4. Escore para a quantificação da gravidade da inflamação peribrônquica.

Escore Células inflamatórias

0 Normal
1 Poucas células inflamatórias
2 1 anel de células inflamatórias
3 Anel de células inflamatórias de 2 a 4 camadas
4 Anel de células inflamatórias com mais de 4 camadas

3.18 Análise fitoquímica do extrato etanólico das flores de Erythrina mulungu

Os alcaloides erisotrina, N-oxido erisotrina e hipaforina presentes no extrato etanólico

de flor de Erythrina mulungu foram identificados usando padrões autênticos desses
compostos. A análise foi realizada em sistema de Cromatografia Líquida de Ultra-alta Pressão
acoplada a detector de massas (UPLC H-Class -Waters Corporation- Xevo TQ-S tandem
quádrupolo -Waters Corporation, Milford, MA), operando com uma fonte Atmospheric
Pressure Chemical Ionization (APCI) em modo positivo de análise. O volume de injeção de
amostras foi de 5 µL em uma coluna Zorbax Eclipese XDB-coluna C18 (150 x 4,6 mm I.D .;
3,5 µm de tamanho de partícula) de Agilent. A fase móvel utilizada consistiu de um gradiente
de eluição de 0,1 % de ácido fórmico (solvente A) e acetonitrila contendo 0,1 % de ácido
fórmico (solvente B) em um fluxo de 0,5 mL/min. O programa de gradiente de eluição
começou com 15 % de B, posteriormente B foi elevada para 60% nos 25 minutos seguintes,
manteve-se em 90 % de B durante 5 min, depois foi elevada para 95 % por 5 min e no final a
condição de analise retornou para 15 % de B, nos últimos 5 min da análise. Os parâmetros de
origem e de funcionamento foram optimizadas como se segue: voltagem de corona = 0,3 kV,
temperatura da fonte = 150 ° C, temperatura de dessolvatação (N2) = 350 ° C, fluxo de gás de
dessolvatação = 600 L/h, e a gama de massa de m/Z 100 e 500 no modo de varrimento total
(Full-scan).

42
 3.19 Análise estatística

Os resultados da responsividade brônquica foram avaliados através do teste ANOVA

de duas vias para medidas repetidas, e todos os demais resultados foram avaliados através do
teste ANOVA de uma via e pós teste de Bonferroni’s post-hoc para expressar a diferença
entre os grupos. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes
(GraphPad Prism versão 5).

43
4. RESULTADOS

4.1 Efeito de E. mulungu sobre hiper-responsividade brônquica em resposta à

metacolina

Os parâmetros de resistência total (RRS), elastância total (ERS), resistência tecidual

(G) e elastância tecidual (H), que caracterizam a medida de função pulmonar dos animais
após o tratamento com as doses de 200, 400, 600 e 800 mg/kg do extrato etanólico das flores
de E. mulungu podem ser visualizados na Figura 5.
O grupo OVA/SALTW comparado ao grupo SAL/SAL (controle) apresentou aumento
significativo em RRS (p<0,001), ERS (p<0,001), G (p<0,001) e H (p<0,001) nas
concentrações de 12,5 e 25 mg/mL de metacolina, confirmando a hiper-responsividade
brônquica esperada no modelo. Todos os grupos tratados com extrato etanólico das flores E.
mulungu, nas doses de 200 a 800 mg/kg, tiveram redução significativa da hiper-
responsividade brônquica, comparado ao grupo OVA/SALTW (p<0,001). Tal efeito foi
significativo nas concentrações de 12,5 e 25 mg/mL de metacolina, para todos os parâmetros
testados RRS (p<0,001), ERS (p<0,001) G (p=0,001), H (p<0,001), nas doses de 200, 400,
600 e 800 mg/kg. A única exceção foi a resposta à dose de 25 mg/dL de metacolina do
parâmetro G, no tratamento com 200 mg/kg, em que não houve redução significativa. A
administração de dexametasona reduziu significativamente a hiper-responsividade brônquica
em relação ao grupo OVA/SALTW, demonstrada por redução em RRS (p<0,001), ERS
(p<0,001), G (p<0,001) e H (p<0,001).

44
Figura 5. Efeitos do tratamento de 7 dias com as doses de 200, 400, 600 e 800 mg/kg do extrato etanólico das
flores de Erythrina mulungu Benth (EV) e de dexametasona (DEXA) na hiper-responsividade brônquica medida
na condição basal e após teste de provocação com metacolina (Mch) (6,25, 12,5 e 25 mg/dL). Os dados estão
expressos em média e erro padrão da média. n=7 SAL/SAL, OVA/SALTW, OVA/EV200, OVA/EV400 e
OVA/DEXA; n=11 OVA/EV600; n=5 OVA/EV800. Um símbolo único significa p<0,05; dois símbolos
repetidos, p<0,01; três símbolos, p<0,001.

45
 4.2 Efeito de E. mulungu sobre a celularidade total e diferencial

O número de células totais e a contagem celular diferencial do lavado broncoalveolar

(LBA) são apresentados na Figura (a – e).
O modelo de asma resultou em aumento significativo no número total de leucócitos no
LBA (OVA/SALTW x SAL/SAL, p<0,001), confirmando novamente a resposta inflamatória
induzida pela ovalbumina. No grupo asmático, a média foi de 2,0 x 106 células/animal.
A administração do extrato etanólico das flores de E. mulungu resultou na redução do
número total de células, obtendo-se com a dose de 600 mg/kg um efeito significativo
(OVA/SALTW x OVA/EV600, p<0,001). Nenhuma outra redução significativa foi
encontrada após o tratamento de 7 dias, nas doses de 200, 400 e 800 mg/kg comparados ao
grupo OVA/SALTW (Figura 6 a). O tratamento com dexametasona (2 mg/kg) resultou na
diminuição significativa da celularidade total, comparado ao controle asmático (OVA/DEXA
x OVA/SALTW, p<0,001) como era esperado. Nenhuma diferença estatística foi encontrada
entre o tratamento com a DEXA e as doses de E. mulungu testadas.
Na análise diferencial de células, a resposta inflamatória do modelo de asma utilizado,
mediado pela resposta TH2, resultou no aumento significativo do número de eosinófilos e
linfócitos no LBA do grupo OVA/SALTW comparado com o controle (em ambos,
OVA/SALTW x SAL/SAL, p<0,001), como era esperado (Figura 6 b e 6 c). O número de
eosinófilos foi reduzido nos tratamentos com E. mulungu, sendo significativa a diminuição
nas doses de 600 e 800 mg/kg (OVA/SALTW x OVA/EV600, p<0,001 e OVA/SALTW x
OVA/EV800, p<0,05, respectivamente). O tratamento com a planta também inibiu
significativamente o aumento do número de linfócitos nas doses de 200, 400 e 600 mg/kg
(Figura 6 c) comparado grupo asmático (OVA/SALTW x OVA/EV200 e OVA/EV400,
p<0,05; (OVA/SALTW x OVA/EV600, p< 0,001). O número de macrófagos e neutrófilos
não diferiu entre os grupos. A dexametasona demonstrou efeito semelhante à E. mulungu na
inibição do aumento do número de eosinófilos e linfócitos no LBA (em ambos,
OVA/SALTW x OVA/DEXA, p<0,001) (Figura 6 b e 6 c).

46
 a 2.5 10 6 SAL/ SAL
OVA/SALTW
OVA/EV200
2.0 10 6 OVA/EV400

Número de células/animal
OVA/EV600
OVA/EV800
1.5 10 6 OVA/DEXA

1.0 10 6
***
***
5.0 10 5

***
0

b c
Eosinófilos Linfócitos
2.0 10 6 2.0 10 5

1.5 10 6 1.5 10 5

Número de células/ml

Número de células/ml

1.0 10 6 1.0 10 5

*
***
5.0 10 5
* *
5.0 10 4
***

*** ***
*** ***
0 0

Neutrófilos
d e 1.5 
10 5

Macrófagos
Número de células/ml

5.0 10 5 1.0 10 5

4.0 10 5
Número de células/ml

3.0 10 5
5.0 10 4
2.0 10 5

1.0 10 5

0 0

Figura 6. Efeitos do tratamento de 7 dias com as doses de 200, 400, 600 e 800 mg/kg do extrato etanólico das
flores de Erythrina mulungu Benth. (EV) no número de células totais (A) e na contagem diferencial absoluta de
células (B) no lavado bronquio-alveolar (LBA) de camundongos asmáticos. Os dados estão expressos em média
e erro padrão da média. n=7 SAL/SAL, OVA/SALTW, OVA/EV200, OVA/EV400 e OVA/DEXA; n=11
OVA/EV600; n=5 OVA/EV800. Um símbolo único significa p<0,05; dois símbolos repetidos, p<0,01; três
símbolos, p<0,001. *diferença de OVA/SALTW.
47
 4.3 Efeito de E. mulungu sobre os níveis de IgE sérico

Na Figura 7 pode ser visualizado o efeito de E. mulungu sobre a concentração sérica de

IgE para ovalbumina. A indução da resposta alérgica com ovalbumina elevou a concentração
no grupo OVA/SAL, comparado ao grupo SAL/SAL (p<0,05) como era esperado.

Houve uma aparente diminuição da produção de IgE nos grupos de tratados com 200,
400 e 600 mg/kg do extrato etanólico de E. mulungu, porém essa diminuição não foi
confirmada estatisticamente. O tratamento com a dexametasona não demonstrou efeito sobre
a diminuição da produção de IgE.

Figura 7. Efeito do tratamento de 7 dias com as doses de 200, 400, 600 mg/kg do extrato etanólico das flores de
Erythrina mulungu (EV) e de dexametasona (DEXA) sobre os níveis de IgE sérico. Os dados estão expressos em
média e erro padrão da média. n=5 SAL/SAL; n=4 OVA/SALTW; n=6 EV200, OVA/EV400, OVA/EV600 e
OVA/DEXA. Um símbolo único significa p<0,05; dois símbolos repetidos, p<0,01; três símbolos, p<0,001.
*diferença de OVA/SALTW.

48
 4.4 Efeito de E. mulungu sobre os níveis de citocinas do tecido pulmonar

O efeito de E. mulungu sobre as citocinas inflamatórias mediadas pelas respostas do

tipo TH1 e TH2 pode ser observado na Figura 8.
Como observado, a indução da resposta alérgica com ovalbumina levou ao aumento da
expressão proteica por células inflamatórias de IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 e INF-γ), o que era
esperado; entretanto, o aumento foi significativo somente para IL-13 (OVA/SALTW x
SAL/SAL, p<0,01.
A administração intraperitoneal do extrato etanólico das flores de E. mulungu na dose
de 600 mg/kg, durante 7 dias concomitantemente aos desafios, resultou em uma diminuição
significativa do aumento de IL-4 e IL-5 comparado ao grupo asmático (IL-4 OVA/SALTW x
EV600, p<0,01; IL-5 OVA/SALTW x EV600, p<0,05) (Figura 8 a e b). Os níveis de IL-10 e
INF-γ diminuíram com o tratamento de 600 mg/kg, porém sem diferença estatística (Figura 8
c e e).
Curiosamente, a administração de E. mulungu induziu, em uma concentração dose-
dependente, a maior expressão proteica de IL-13 no tecido pulmonar asmático (OVA/SALTW
x EV400, p<0,05; OVA/SALTW x EV600, p<0,001; OVA/SALTW x EV800, p<0,001)
(Figura 8 d). O mesmo estímulo à expressão de maior concentração de citocinas foi
observado em IL-4, IL-5, IL10 e INF-γ, porém nas concentrações de 200 e 400 mg/kg,
sugerindo que, para E. mulungu, talvez haja uma dose ideal para ser considerada anti-
inflamatória ou pró-inflamatória (IL-10, OVA/SALTW x EV400, p<0,05; INF-γ,
OVA/SALTW x EV200, p<0,05; OVA/SALTW x EV400, p<0,001).
Como esperado, a dexametasona diminuiu a expressão de proteína comparado ao grupo
asmático, sendo esta significativa para IL-4 e IL-13 (OVA/SALTW x DEXA, p<0,01 e
p<0,05, respectivamente).

49
 a b
500 1000

400 800

300 600
pg/mL

pg/mL
** **
200 400 *

100 200

0 0
Concentração de IL-4 (pg/mL) Concentração de IL-5 (pg/mL)

500
c d ***
***
400 *

1500
300
pg/mL

* *

1000
200
pg/mL

500 100 **

0 0
Concentração de IL-10 (pg/mL) Concentração de IL-13 (pg/mL)

e
800
SAL/ SAL
OVA/SALTW
** OVA/EV200

600 * OVA/EV400
OVA/EV600
OVA/EV800
OVA/DEXA
pg/mL

400

200

0
Concentração de INF-gama (pg/mL)

Figura 8. Efeito do tratamento de 7 dias com as doses de 200, 400, 600 e 800 mg/kg do extrato etanólico das
flores de Erythrina mulungu (EV) e de dexametasona (DEXA) sobre os níveis de IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 e INF-
γ. Os dados estão expressos em média e erro padrão da média. n=5 SAL/SAL, OVA/EV800; n=6 OVA/SALTW,
EV200, OVA/EV400, OVA/EV600 e OVA/DEXA. Um símbolo único significa p<0,05; dois símbolos
repetidos, p<0,01; três símbolos, p<0,001. *diferença de OVA/SALTW .

50
4.5 Efeito de E. mulungu sobre a infiltração por células inflamatórias no tecido

O escore da avaliação das lâminas histológicas para quantificação da infiltração de

células inflamatórias é apresentado na Figura 9.
A infiltração de células inflamatórias foi significativamente maior no grupo OVA/SAL
comparado ao grupo controle SAL/SAL (OVA/SAL x SAL/SAL, p<0,001). Este aumento foi
significativamente atenuado pela administração do extrato etanólico das flores de E. mulungu
nas doses de 400, 600 e 800 mg/kg comparado ao grupo OVA/SALTW (OVA/SALTW x EV
400, p<0,001; EV600 p<0,001; EV800 p< 0,001). Como esperado, a dexametasona também
diminuiu significativamente o infiltrado celular (OVA/SAL x OVA/DEXA, p<0,001). Fotos
das lâminas histológicas podem ser observadas na Figura 9.

Figura 9. Efeito do tratamento com Erythrina mulungu Benth. sobre a infiltração de células inflamatórias no
tecido pulmonar: 0 normal; 1 poucas células; 2 um anel de células inflamatórias; 3 um anel de células
inflamatórias de 2 a 4 camadas; 4 um anel de células inflamatórias com mais de 4 camadas. Valores representam
a média do escore e o EPM de 7 animais por grupo. ***p<0,001. *diferença de OVA/SALTW. a SAL/SAL; b
OVA/SALTW; c OVA/DEXA; d OVA/EV200; e OVA/EV400; f OVA/EV600; g OVA/EV800.

51
 4.6 Identificação dos componentes de E. mulungu

A partir do extrato etanólico foi obtido um cromatograma (Figura 10 d) e espectros de

massa dos constituintes majoritários de E. mulungu utilizando a técnica de UPLC/MS-MS. A
substância com tempo de retenção de 9,22 min foi identificada como sendo o alcaloide
erisotrina, através da comparação com o tempo de retenção do padrão de 9,30 min e o
espectro de massas do íon apresentou m/z 314 (Figura 10 a). O alcaloide N-óxido erisotrina,
está presente no cromatograma do extrato com tempo de retenção de 9,75 min, o tempo de
retenção do padrão foi de 9,78 min e do espectro de massas do íon apresentou m/z 330
(Figura 10 b). No extrato também foi identificado o alcaloide hipaforina, com tempo de
retenção de 6,87 min, o padrão apresentou tempo de retenção de 6,85 min, e espectro de
massas do íon m/z de 247 (Figura 10 c). A estrutura química destes compostos está
apresentada na Figura 11.

52
 1: MS2 ES+
a) 9.30 TIC
100 314.2
100 1.02e1 0

%
%

266.1 352.3
0 m/z
100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500

0
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
1: MS2 ES+
9.78 TIC
100 b) 330.1
100 1.59e1 0
%
%

280.1 346.1
0 m/z
100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500

0
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
1: MS2 ES+
6.85 TIC
100 c) 247.0
100 1.63e1 0
%
%

279.2
0 m/z
100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500

0
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
1: MS2 ES+
9.22 TIC
100 d)
1.14e1 0

9.75
%

6.87
8.13 16.68
13.49
19.66
0 Time
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00

Figura 10. Perfis cromatográficos obtidos por UPLC-MS. a) Padrão de erisotrina, b) Padrão de N-Oxido
Erisotrina, c) Padrão de hipaforina e d) Extrato bruto etanólico de flor de Erythrina mulungu Benth.

53
Figura 11. Desenho da estrutura química dos constituintes majoritários da Erythrina mulungu Benth. a)
Erisotrina, b) N-Oxido Erisotrina, c) Hipaforina

54
5. DISCUSSÃO

Conjuntamente, nossos resultados demostraram um potencial efeito anti-inflamatório

(AI) de E. mulungu sobre a hiper-responsividade e a inflamação brônquica em um modelo
animal de asma induzido por alérgeno, confirmando-se a hipótese do estudo. Até onde
sabemos, essa foi a primeira vez em que se investigaram os efeitos de E. mulungu sobre esta
doença.
Em trabalhos anteriores, a atividade AI da E. mulungu já havia sido demonstrada em
66
modelos animais de peritonite aguda induzida por zymozan e de edema de pata induzida
por carragenina e dextran 65. Naquele trabalho, a administração por via oral de 100 mg/kg do
extrato hidroetanólico da casca e da raiz de E. mulungu, 30 minutos antes da injeção de
zymozan, reduziu significativamente o número de células recrutadas na cavidade peritoneal
comparado com os controles não tratados, sugerindo a presença de componentes que
interfiram na resposta inflamatória. Neste último trabalho, o pré-tratamento por via oral, com
as doses de 200 e 400 mg/kg do extrato hidroalcoólico da casca de E. mulungu reduziu
significativamente o edema de pata dos animais. Os autores sugeriram que E. mulungu possa
influenciar na atividade dos leucócitos polimorfonucleares, por exemplo, modulando síntese,
liberação e atividade de mediadores, tais como prostaglandinas, óxido nítrico e citocinas
(TNF-alfa, IL-1 etc.). Não foram encontrados trabalhos avaliaram a atividade anti-
inflamatória das flores, tampouco outros trabalhos sobre a atividade anti-inflamatória desta
espécie com qualquer parte da planta.
A hiper-responsividade brônquica é um estado patológico no qual o estreitamento da
via aérea é rapidamente disparado por estímulos diversos e reflete uma das principais
características in vivo da asma 9. Neste trabalho a administração do extrato etanólico de E.
mulungu nas doses de 200, 400, 600 e 800 mg/kg resultou na diminuição do aumento da
hiper-responsividade do animal durante o teste de provocação brônquica com metacolina.
Ainda não são bem esclarecidos todos os mecanismos que modulam a hiper-responsividade
brônquica, mas sugere-se uma atividade importante de eosinófilos e mastócitos na
81
exacerbação do processo . Sabe-se, por exemplo, que pacientes com asma grave possuem
maior número de eosinófilos nas vias aéreas do que indivíduos com asma leve 2. Os linfócitos
T parecem exercer efeitos sobre a hiper-responsividade brônquica tendo em vista um estudo
in vivo, de 1994, que demonstrou que a depleção de linfócitos CD4+ em modelo animal de
55
hiper-reatividade e inflamação induzida por antígenos preveniu completamente a hiper-
responsividade e a infiltração por eosinófilos, evidenciando a dependência da hiper-
responsividade sob linfócitos T CD4+; os resultados foram consistentes também com o fato de
82
os eosinófilos serem as células efetoras dessa resposta . Além disso, dentre as citocinas
produzidas por linfócitos T CD4+, referências mais recentes mostram que a IL-13 tem um
importante papel na fase efetora da resposta alérgica, estando envolvida nas principais
manifestações clínicas da doença, como a hiper-responsividade, hipersecreção de muco,
alteração de músculo liso da via aérea e a fibrose subepitelial. O mecanismo preciso pelo qual
a IL-13 regula a hiperesponsividade não está completamente esclarecido, mas está associado à
ativação do seu receptor tipo 2 (IL-4R/IL-13R1) e a ativação do fator de transcrição STAT-
6, o qual tem se mostrado essencial para as principais características da asma 83.
Neste trabalho, E. mulungu diminuiu o número de células totais e o número de
eosinófilos no LBA, com diferença significativa na dose de 600 mg/kg. Assim, sugere-se que
o extrato de E. mulungu possa ter diminuído a exacerbação da hiper-responsividade brônquica
nos animais através da menor maturação e migração dos eosinófilos. Além disso, neste
trabalho observou-se um efeito supressivo do extrato na infiltração de células inflamatórias no
tecido pulmonar, reforçando o resultado.
Os eosinófilos são provenientes da medula óssea e a sua maturação de percursores
mieloides é induzida por GM-CSF, IL-3 e IL-5 13; por sua vez, o recrutamento de eosinófilos
do sangue para o tecido é aumentado em condições inflamatórias mediadas por IL-4 e IL-5 84.
Sabe-se que a IL-4 promove a expressão de moléculas de adesão VCAM-1 (molécula de
adesão celular-vascular-1) pelo endotélio vascular; e por meio da interação VCAM-1, a IL-4
direciona as células para o local inflamado. Nesse trabalho, o tratamento com E. mulungu
atenuou o aumento da concentração de IL-4 e IL-5 em tecido pulmonar de animais ova-
sensibilizados, principalmente na dose de 600 mg/kg, bem como reduziu o número de
eosinófilos no LBA. Observados os dados, sugere-se que a redução do recrutamento de
eosinófilos pode ter ocorrido, em parte, pela inibição da expressão de IL-4 e IL-5, semelhante
à resposta observada com a dexametasona. A dosagem de citocinas pró-inflamatórias no
homogenato pulmonar mostra que E. mulungu suprimiu a expressão de IL-4 e IL-5,
significativamente, e de IL-10, sugerindo que a atividade anti-inflamatória da planta na asma
possa ser associada à menor produção de citocinas por linfócitos TH2. Mecanismos
moleculares da ação do extrato sobre a sinalização intracelular de linfócitos T não foram

56
estudados e precisam ser aprofundados para se elucidar o mecanismo de ação para inibir a
expressão proteica. Mais recentemente, estudos em camundongos Rag2-/-, deficientes de
linfócitos T e B, quando estimulados com IL-25 (citocina indutora de resposta TH2)
produziram IL-5 e IL-13. Em outros modelos, de populações de células não-T e não-B,
também foi encontrada a produção de citocinas TH2, mediante o tratamento com IL-25. Esses
achados mostraram que outros tipos celulares, nesse caso, as ILC-2 (Innate Lymphoid Cell 2),
são igualmente capazes de promover funções pró-inflamatórias, semelhantes aos linfócitos
85
TH2 . Assim, questiona-se este tipo celular como outro possível local de atuação de E.
mulungu.
As citocinas IL-4 e IL-13 têm um papel chave na estimulação de linfócitos B para a
produção de IgE. Dentre os efeitos da IL-4 está a indução da mudança da cadeia pesada da
13
IgM para IgE . A produção aumentada de ambas citocinas por células T-específicas é
responsável pela síntese de IgE e o desenvolvimento de doenças alérgicas em certos
86
indivíduos . Neste trabalho, E. mulungu reduziu a expressão de IL-4, porém aumentou
gradativamente a expressão de IL-13 de acordo com as doses testadas. A menor expressão de
IL-4 pode ser considerada aspecto positivo na melhora da resposta inflamatória na asma.
Observou-se que houve uma diminuição de IgE anti-ova sérico nos grupos tratados com E.
mulungu, embora não confirmado pela estatística, sugerindo que a inibição de IL-4 possa ter
influenciado nesta menor produção de IgE, contribuindo para melhora da asma. Outras
repetições da análise poderiam ser feitas para comprovar esta afirmação.
Foi demonstrado também a influência da IL-4 no recrutamento de células TH2 para os
pulmões e na indução da inflamação 7. Fisiologicamente, há uma baixa produção de muco
pelas células de goblet (caliciformes) e o aumento na produção deste é reflexo de
hiperestimulação. A IL-13 compartilha muitas atividades biológicas com a IL-4; em modelos
animais geneticamente modificados para superexpressar IL-13 nas vias aéreas, uma
87
importante inflamação e hiperplasia foram observadas . Como já foi apresentado, poucos
trabalhos estudaram o papel imunomodulador de E. mulungu, e pouco se sabe sobre a via de
resposta preferencial, se seria TH1 ou TH2. Neste modelo de inflamação das vias aéreas houve
um aumento de IL-13, podendo assim favorecer o desenvolvimento da inflamação do tipo
TH2. Análises histológicas poderiam auxiliar em um maior esclarecimento deste efeito.
IFN-γ é uma das principais citocinas produzidas pelas células TH1 e característica da
resposta imunológica tipo 1 9. O desequilíbrio entre a produção das citocinas efetoras TH1/TH2

57
é característico na asma, e a ação de citocinas TH1 exerce ação moduladora negativa na
27
inflamação alérgica . Neste trabalho, o modelo alérgico de indução com ovalbumina
aumentou a concentração de IFN-γ nos animais asmáticos, comparado ao grupo controle
negativo. Este comportamento difere do trabalho de Shen et al (2008) com animais C57BL6,
no qual obtiveram-se menores concentrações de IFN-γ nos animais asmáticos, também em um
modelo induzido com ovalbumina. Segundo o autor, camundongos Balb/c têm uma resposta
TH2 superior do que C57BL6 27. Neste trabalho E. mulungu aumentou a expressão proteica de
IFN-γ nas doses de 200 e 400 mg/kg, parecendo potencializar a resposta TH1, e diminuiu na
dose de 600 mg/kg. Podemos especular que o desvio da inflamação para um padrão TH1 e,
consequentemente, redução do padrão TH2, tenha sido responsável, ao menos em parte, pelos
resultados que obtivemos.
Estudos que utilizaram modelos animais de asma induzida por ovalbumina observaram
com outras plantas efeitos semelhantes à modulação da E mulungu neste trabalho. Entre essas
plantas estão:
Saururus chinenesa (planta nativa da China/Coreia): Quan, et al (2010) utilizaram o
extrato etanólico das partes aéreas da planta, nas doses de 10 à 100 mg/kg (v.o.) e obtiveram
diminuição da expressão proteica de IL-4, IL-5 e IL-13; IgE; menor infiltrado de células
inflamatórias no tecido e hiperplasia de células caliciformes; e diminuição nos níveis de PGE2
e LTC4, potentes mediadores lipídios inflamatórios 26.
Astragalus Membranaceus (planta nativa da China): Shen, et al (2008) utilizaram o
extrato aquoso das raízes da planta fervida por 1 hora, na dose de 10g/kg/d (i.p.) por 28 dias.
Observaram diminuição da expressão proteica de IL-5, IL-13, (nenhum efeito sobre IL-4) e
aumento de IFN- γ; redução no número de leucócitos totais e eosinófilos no LBA; menor
infiltrado de células inflamatórias no tecido e hiperplasia de células caliciformes; diminuição
ao aumento da hiper-responsividade brônquica 27.
Scropularia striata (planta nativa do Irã): Azadmerh et al (2013) utilizaram o extrato
hidroetanólico das partes aéreas da planta, macerada por 3 dias, nas doses de 100 e 200mg/kg
(i.p) por 7 dias e obtiveram diminuição da expressão proteica de IL-4 e IL-5; IgE total e IgE
ova específica; redução no número de leucócitos totais e eosinófilos no LBA; redução da
infiltração de células inflamatórias no tecido 28.
Em nosso estudo, inicialmente, observamos a morte de 45% dos animais que
receberem o tratamento com a dose 800 mg/kg do extrato de E. mulungu seguido da anestesia.

58
Esta dose pode ter causado depressão do sistema nervoso central (SNC), possivelmente
interagindo ou potencializando os efeitos do anestésico inalatório, o que é indesejável. A
observação corrobora com dados da literatura em que são comprovados os efeitos desta planta
sobre o SNC 41– 44. Quanto à toxicidade salienta-se que apesar da morte dos animais, De Bona
et al (2012) estabeleceu a dose letal média (DL50) da inflorescência de E. mulungu em 1,37
g/kg, portanto segura ao uso em doses inferiores.
O perfil cromatográfico do extrato de E. mulungu revelou a presença de erisotrina, N-
óxido erisotrina e hipaforina. Essas substâncias são alcaloides e se destacam pela presença nas
88
plantas da família Fabaceae . Ao total, são conhecidos mais de 110 alcaloides eritrinianos,
sendo que nas flores também são encontrados: (+)-11a-hidroxi-erithravina, (+)-eritravina e
(+)-a-hidroxierisotrina, eritartrina e eritristemina 44, 50.
A literatura mostra a presença também de flavanonas, flavonois, chalconas, estilbenos,
isoflavonas, isoflavanois, isoflavanoides, pterocarpanos, coumestamos, 3-fenil-coumarinas,
lignanas, triterpenos e sesquiterpenos em E. mulungu. Alguns destes compostos têm,
documentadas, atividade antimicrobiana, antiinflamatória, inibição da tirosinase, da
37
fosfolipase A2 e da enzima ciclooxigenase (COX) . É possível, portanto, que o extrato
vegetal possa ter atuado por diferentes mecanismos, causando efeitos sinérgicos para a
melhora da asma, e o fitocomplexo é até onde os estudos mostram, a principal vantagem
atribuída ao uso de fitoterápicos, comparado aos medicamentos alopáticos 89.
Coletivamente esses resultados sugerem que E. mulungu tem potencial para uso na
asma, através da modulação da resposta inflamatória, apresentando efeitos de
imunomodulador e anti-inflamatório.
O estudo da asma em modelos murinos apresenta grandes críticas na literatura. Entre
os motivos estão a evidente diferença na composição celular da via aérea humana com a dos
animais e por se utilizarem dosagens de compostos, até mesmo adjuvantes, que extrapolam a
realidade na indução da asma. No entanto, este modelo é largamente utilizado na literatura,
inclusive foi utilizado no estudo para o desenvolvimento de broncodilatores, garantindo a
viabilidade dos resultados nesse trabalho.
Além desta, outras limitações deste estudo incluem:
 Um período de tratamento mais prolongado poderia mostrar resultados mais
expressivos sobre a produção de IgE e sobre os marcadores inflamatórios.

59
 A utilização da ovalbumina (uma proteína) para indução da inflamação gerou
um padrão de resposta característico de asma alérgica. No entanto, o uso de E.
mulungu em outros subtipos de asma, marcado pela ativação de outros tipos
celulares, precisa ser estudado.
 A via de administração para testar o extrato foi intraperitoneal. Ou seja, não
houve a interferência da barreira intestinal, bem como do metabolismo de
primeira passagem do fígado sobre os compostos; o que pode levar à ativação
ou desativação dos mesmos. Assim é necessário ser avaliado pela
administração oral, que se assemelha ao uso tradicional em humanos.

60
6. CONCLUSÃO

Em conclusão, os animais asmáticos tratados com E. mulungu apresentaram melhora

na hiper-responsividade brônquica, melhora na inflamação tecidual e melhora no perfil de
produção de citocinas TH2, principalmente na dose de 600 mg/kg.

61
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71
ANEXO A - Aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal da FMRP-USP

72
ANEXO B - Protocolo utilizado no preparo do homogenato pulmonar

1. Preparar o Inibidor de Protease:

a. Ligar o fluxo por 30 minutos (com UV)
b. Colocar 50 mL de PBS 1X estéril GELADO em um tubo falcon ou garrafa estéril
c. Retirar cuidadosamente um comprimido do inibidor de protease (complete, EDTA-
free) que fica acondicionado na geladeira e colocar no PBS 1X
d. Deixar dissolver totalmente o comprimido e guardar na geladeira até o uso.

PONTOS CRÍTICOS:

*Cuidado para não contaminar os comprimidos. Retirar com uma pinça ESTERILIZADA
(passar álcool 70 %, deixar na UV por 30 minutos e flambar no fogo antes do uso).

2. Preparar o PBS 1x a partir do 10x

a. Solução 10X:
80 g de NaCl (cloreto de sódio)
11,5 g de Na2PO4 (fosfato ...)
2,0 g de KCl (cloreto de potássio)
2,0 g de KH2PO4 (fosfato monopotássico)

Quantidade suficiente de água destilada ou Milli-Q® para 1,0 L.

Verificar pH (7,2 – 7,4).

b. Solução 1X:
10mL de PBS 10X+ 90mL de água destilada.

*Não utilizar o PBS 10X se este estiver cristalizado. Caso isso ocorra, deixar chegar a
temperatura ambiente, homogeneizar no agitador magnético e checar o pH (deve ser de 7,2-
7,4) até que a solução esteja homogênea.

*Após autoclavar o PBS 1X, deixa-lo esfriar totalmente.

3. Preparar o Homogenato
a. Retirar as amostras do pulmão do freezer e deixar no gelo.
b. Pipetar 1 mL do inibidor em eppendorfs de 2mL (manter no gelo).
c. Secar bem o pulmão em papel filtro. Só utilizar quando o mesmo não umedecer o papel.
d. Pesar 50 mg do pulmão e colocar em 1mL do inibidor de protease. Manter o eppendorf
no gelo durante o uso do homogeneizador, para não esquentar.
e. Limpar o homogeneizador antes do uso:
- Separar 3 falcons de 50 mL: no 1º e no 3º, adicionar água destilada; no 2º, álcool 70 %

73
- Proceder limpando o homogeneizador sempre na seguinte ordem: água destilada, álcool,
água destilada.
- Secar o homogeneizador com lenço de papel.
f. Colocar o eppendorf pulmão + protease (inserido com gelo) no homogeneizador devagar
para que o líquido não vaze. Proceder até que este esteja totalmente diluído.
g. Limpar o homogeneizador como descrito antes do processamento de cada amostra.
h. Colocar as amostras já homogeneizadas na centrífuga (1900 rpm – 10 minutos – 4 ºC).
i. Coletar o sobrenadante e acondicionar em novos eppendorfs (1,5mL).
j. Manter no freezer a -80 ºC (Dica: para garantir que o processo descongelamento-
congelamento não deteriore as amostras, fazer alíquotas de cerca de 200 μL/eppendorf).

74