Cromatografia

A cromatografia é um método que permite ao analista separar compostos semelhantes de

misturas complexas. A amostra é transportada por uma fase móvel, que pode ser um gás,
líquido ou um fluído supercrítico. A fase móvel é forçada através de uma fase estacionária
imiscível fixa, colocada na coluna ou em superfície sólida. Os componentes que são mais
fortemente retidos na fase estacionária movem-se muito lentamente no fluxo da fase móvel. A
o contrário, os componentes que se ligam mais fracamente à fase estacionária, movem-se
mais rapidamente. Como consequência dessas diferenças na mobilidade, os componentes da
amostra separam-se em bandas ou zonas discretas que podem ser analisadas qualitativa e/ou
quantitativamente.

Fase móvel:
Solvente que se move através da coluna pela fase estacionária

Fase estacionária:
Aquela que fica fixa dentro da coluna. Sendo que a separação depende da distribuição dos
solutos entre as duas fases.

Eluente e eluato:
Correspondem, respetivamente, ao fluído que entra na coluna e ao fluido que emerge no final
da coluna.

Eluição:
Processo de passagem de um líquido ou de um gás pela coluna cromatográfica.

coluna cromatográfica

Empacotada capilar

A fase estcaionária cobre as

A fase estacionária da as
paredes internas do tubo
partículas
capilar
Existem vários tipos de cromatografia, com base no mecanismo de interação entre o soluto e a
fase estacionária.

Adsorção (adesão das moléculas):

Ocorre quando a fase estacionária é um sólido (fase móvel fé gás ou liquido). Adsorvem mais
umas partículas que outras e há separação na coluna. Separação para a cromatografia gasosa.

Cromatografia de partilha ou distribuição.

Fase estacionaria e líquida (fase móvel fé gás ou liquido).

Há interação(partilha) da fase estacionaria com a fase móvel.

O que tem mais afinidade com a fase móvel sai primeiro do que o que tem mais afinidade com
a fase estacionaria. Na cromatografia gasosa isto não acontece, pois, o gás é inerte, não
interage, só tem função de transportar. Separação para cromatografia líquida.

Cromatografia de troca iónica.

A fase estacionaria é solida e a fase móvel é líquida pois num gás não há troca iónica.

Tem mais aptidões para uns iões que para outros. Utilizada para a analise de iões inorgânicos
maioritariamente

Os aniões mantem perto de si catiões que estão covalentemente ligados à fase estacionaria.

Acontece em colunas de resina de troca iónica e apenas alguns aniões são atraídos por ela.

Cromatografia de exclusão molecular.

A fase estacionaria é um solido ou liquido e a movel é um líquido. A fase estacionaria só retém
as moléculas mais pequenas e deixa passar as maiores que chegam 1ro ao detetor. A
separação acontece tendo por base o tamanho da molécula. As partículas mais pequenas
penetram na fase estacionaria e uma das maiores dificuldades é a temperatura.

Cromatografia de afinidade
A fase estacionaria é solida e a fase movel é líquida.

Para cada antigene há um anticorpo- chave e fechadura. Enzimas em que só um substrato

encaixa numa dada enzima, tudo o resto avança.

Um tipo de molécula na mistura complexa liga-se à molécula que esta covalentemente ligada à
fase estacionaria. Método muito seletivo.

Cromatografia líquida de fase normal.

Caracteriza-se por separar os compostos tendo por base a sua polaridade. Esta técnica utiliza
uma fase estacionária muito polar e uma fase móvel apolar, e utiliza-se quando o composto de
interesse é bastante polar. O composto polar associa-se e é retido pela fase estacionária. A
força de absorção aumenta à medida que aumenta a polaridade do composto e a interação
entre o composto polar e a fase estacionária polar (em comparação à fase móvel) aumenta o
tempo de retenção.

A utilização de solventes mais polares na fase móvel diminui o tempo de retenção dos
compostos enquanto os solventes mais hidrofóbicos tendem a aumentar o tempo de retenção.

Técnica que entrou em desuso devido à falta de reprodutibilidade dos tempos de retenção.
Cromatografia líquida de fase reversa
A HPLC de fase reversa consiste em numa fase estacionária apolar e uma fase móvel de
polaridade moderada. Uma das fases estacionárias mais comuns deste tipo de cromatografia é
a sílica tratada, C18H37ou C8H17. O tempo de retenção é maior para as moléculas de natureza
apolar, enquanto as moléculas de carácter polar eluem mais rapidamente.

O tempo de retenção aumenta com a adição de solvente apolar à fase móvel e diminui com a
introdução de solventes mais hidrofóbicos. A cromatografia de fase reversa é tão utilizada que
com frequência é denominada por HPLC sem nenhuma especificação adicional. A
cromatografia de fase reversa baseia-se no princípio das interações hidrofóbicas que resultam
das forças de repulsão entre um solvente relativamente polar, um composto relativamente
apolar, e uma fase estacionária apolar. A força condutora na união do composto à fase
estacionária é a diminuição da área do segmento apolar do analito exposto ao solvente. Este
efeito hidrofóbico está dominado pela diminuição da energia livre. O efeito hidrofóbico
diminui com a adição de solvente apolar à fase móvel. Isto modifica o coeficiente de partição
de forma que o composto se move pela coluna e elue.

Cromatograma
Um Cromatograma é o gráfico que mostra a resposta do detetor em função do tempo de
eluição.

Tempo morto: tempo que o composto que não é retido na coluna (solvente) demora a
atravessar a coluna.

Tempo de retenção: tempo necessário para o composto atingir o detetor desde a injeção.
Tempo de retenção ajustado:
𝑡𝑟 ′ = 𝑡𝑟 − 𝑡𝑚

Fator de seletividade:
Depende do fator de retenção, dos tipos de fases e da temperatura

Alfa é sempre maior que 1 e quanto maior, melhor a resolução.

Quando alfa se aproxima de 1, otimizar K’ e aumentar N pode não ser suficiente para uma boa
separação.

Assim, é necessário mexer alfa mantendo k’ entre 1e 10

• Mudar a composição da fase móvel

• Mudar o pH da fase móvel
• Mudar a temperatura

Este fator é importante para sabermos se conseguimos separar os analitos. Se alfa=1, não
conseguimos separar, pois, k’s vão ser iguais.
𝑡𝑟𝑎 − 𝑡𝑚 𝑡 ′ 𝑟𝑎
𝑘′𝑎 = =
𝑡𝑚 𝑡𝑚
É igual ao tempo de permanência do soluto na fase estacionária a dividir pelo tempo de
permanência do soluto na fase móvel.

Tempo de analise ideal é [1-5]

Se o soluto permanecer todo o tempo na fase móvel e nenhum na fase estacionária, tr=tm e
k=0 pois o soluto não permanece tempo nenhum na fase estacionária.

Eficiência de separação:
Fatores que contribuem para a eficiência:

Tempos de retenção- quanto mais afastados, melhor é a separação.

Largura dos picos- quanto menor a largura, melhor a separação.

Podemos quantificar a concentração dos analitos pela área ou pela altura do pico, no entanto,
o melhor resultado é o da área porque mantem-se sempre constante enquanto a altura pode
variar.

Não pode existir uma co-eluição, ou seja, dois analitos a saírem ao mesmo tempo. Se isso
acontecer, no Cromatograma vai apenas haver um pico correspondente à sobreposição dos
dois componentes. Não pode haver sobreposição de bandas, quanto mais estreitos os picos,
melhor a separação.

Resolução:
Idealmente, entre os picos, deve haver sempre a linha de base.

Fornece uma medida quantitativa da habilidade da coluna em separar 2 analitos. Diz-nos

quando duas bandas se distanciam uma da outra em comparação com as suas larguras

2(𝑡𝑟𝑏 − 𝑡𝑟𝑎)
𝑅𝑠 =
𝑤𝑎 + 𝑤𝑏
Numa analise quantitativa, Rs é >1.5
Como melhorar a separação:

Afastar tempos de retenção Diminuir largura do pico (w)

entre compostos

Aumentar o comprimento da Uniformizar enchimento da

coluna (L) * coluna

Alterar/Aumentar a Aumentar a área de contacto

quantidade da fase entre as fases (diminuindo o
estacionária * tamanho das partículas) -
melhora a resolução.
Alterar a fase móvel, jogando Aumentar a velocidade do
com as polaridades dos fluxo
solventes (só em HPLC)
Diminuir a temperatura (só em Reduzir o caudal de amostra
CG)

*’ Não é usada porque é Diminuir diâmetro da coluna

necessário usar uma coluna *
nova e é mt dispendioso.

Apesar do alargamento das bandas ser inevitável, é possível encontrar condições

experimentais que resultam numa melhor resolução do Cromatograma.

A eficiência de uma coluna cromatográfica em separar dois componentes depende em parte

da velocidade relativa com que as dua espécies são eluídas. Estas velocidades dependem do
equilíbrio de distribuição das várias espécies entre a fase móvel e a fase estacionária.

Quanto maior o valor de Kd, mais tempo o soluto permanece na fase estacionária. A fração de
tempo total que uma molécula passa na fase móvel está diretamente relacionada com a fração
da população presente na fase móvel.

K’ dá-nos uma medida do comportamento do soluto num determinado processo

cromatográfico. O soluto entra no processo cromatográfico e “move-se” da fase móvel para a
fase estacionária.

O aumento de K’ produz um aumento de resolução (com aumento do tempo de eluição)

Para alterar K’, em fase líquida altera-se a composição da fase móvel e em gasosa, aumenta se
T.

A velocidade de eluição pode ser relacionada com a velocidade linear da fase móvel.

A velocidade de eluição depende de:

*velocidade da fase móvel, u

*razão dos volumes da fase estacionaria e fase movel

*coeficiente de distribuição.

A razão por que os solutos são eluídos com velocidades diferentes é devido ao facto de terem
diferentes valores de Kd.

Por convenção utiliza-se muitas vezes o parâmetro de volume de retenção pois é uma
grandeza que indica a quantidade de volume da fase móvel que é necessária para eluir o
soluto.

O tempo de retenção depende do tipo de coluna e condições experimentais. Este efeito de

variáveis operacionais pode ser eliminado se os valores forem referidos a uma substância
padrão (CG)

Número de pratos teóricos

Um prato teórico é o comprimento de coluna que é necessário para se atingir o equilíbrio
entre duas fases.

Quanto maior o número

de pratos teóricos, mais
eficiente é o processo
cromatográfico.
 O número de pratos teóricos não depende so do comprimento da coluna, mas também
de quase todas as variáveis existentes na cromatografia. Para um dado tr, quanto maior o nr
de partos teóricos calculado menor a largura do pico (mais perto do ideal)

Como se aumenta o nr de partos teóricos

• Aumentando o comprimento da coluna. N é diretamente proporcional a L. se
duplicarmos L, duplica-se também N e tr. No entanto, todos os picos ficaram mais
afastados uns dos outros, mas também mais largos.
• Diminuindo a altura de cada prato teórico, ou seja, aumentando o nr de pratos por
unidade de comprimento.
• Diminuindo o tamanho das partículas da fase estacionária.

Altura equivalente a um prato teórico

Como variar o valor de H?

Quanto menor a altura de cada prato teórico, mais estreita é a banda obtida no
Cromatograma.

Equação de Van Deemter

Van Deemter demonstrou que o alargamento de uma banda é devido à soma de vários efeitos-
inter-dependentes:

A, B e C são constantes para uma dada coluna e uma dada fase estacionária.

Os fenómenos que provocam o alargamento nas bandas, uns são proporcionais ao caudal,
outros são inversamente proporcionais ao caudal:
Em colunas empacotadas, os 3 termos da equação contribuem para o alargamento das
bandas.

Em CG, o termo A=0.

A- Difusão de Eddy ou caminhos múltiplos- cada analito passa um caminho diferente,

quanto menor o empacotamento da coluna, mais espaço entre as partículas dando
origem a vários caminhos. O comprimento desses caminhos pode variar
significativamente, sendo que o tempo de residência na coluna de moléculas da
mesma espécie também varia, fazendo o pico aumentar de largura. Depende do
tamanho das partículas e do fator de empacotamento.
B- Difusão longitudinal- Processo de alargamento de uma banda devido a um gradiente
de concentrações, pois aa moléculas tem tendência a difundirem a partir da região de
maior concentração (centro) para a de menor (extremos). Quanto maior o caudal,
menor é o tempo de permanência na coluna e há menos alargamento da banda.

Como a difusão longitudinal em gases é muito mais rápida que em líquidos, B em valores mais
elevados em CG que em HPLC, razão pela qual em CG, o caudal ótimo, é mais elevado que em
HPLC.

C- Transferência de massa- equilíbrio entre a fase movel e a fase estacionaria. Quanto

menor o caudal mais rápido é atingido o equilíbrio e menor alargamento da região-

A transferência de massa diminui com o aumento da Temperatura, devido ao aumento do

coeficiente de difusão do soluto na fase estacionária. O aumento da temperatura permite
aumentar o caudal sem diminuir a resolução.

Resolução
A resolução fornece uma mediada quantitativa da capacidade dessa coluna separar 2 solutos.

relação entre tempo de retenção e resolução

Esta expressão permite saber o tempo necessário para separar um componente com uma
dada resolução.

Otimização de uma coluna

Para otimizar as condições de uma coluna pode alterar-se os parâmetros fundamentais, alfa,
K’, H ou N, de forma independente.

Alfa e K’ podem ser mexidos alterando a temperatura ou a composição da fase móvel.

N pode ser mudado alterando diretamente L ou alterando tamanho das partículas.

H pode ser muado alterando a velocidade do caudal.

Como melhorar resolução sem alterar tr

Conseguimos aumentar a resolução diminuindo o valor de H:

• Reduzir a viscosidade da fase móvel (aumentando a temperatura)

• Reduzir tamanho das partículas
• Reduzir a velocidade de eluição

Análise Qualitativa
A cromatografia é utilizada para conhecer a presença ou a ausência ou a distância de
componentes numa amostra que contém um nr limitado de espécies o tempo de retenção é
característico de um composto e é através deste que podemos ver se o componentes está ou
não presente na amostra. Depende da temperatura da coluna, do caudal da fase movel, do
comprimento da coluna e do tipo de fase estacionária/móvel.

Análise Quantitativa
Comparação entre a área e a altura dos picos dos solutos com os de um ou mais padrões.
Condições cromatográficas constantes: velocidade da injeção, caudal da fase móvel,
temperatura da coluna.

Cromatografia gasosa
O analito é transportado através da coluna por uma fase móvel, gasosa, de arraste, que retira
o analito da fase estacionaria. Separação concebida numa coluna cromatográfica baseada
numa separação a determinada temperatura (no forno)

Na cromatografia de partilha gás sólido a fase estacionaria é um liquido não volátil que recobre
a coluna oi um solido finamente dividido.

Na cromatografia de adsorção gás solido é uma coluna de empacotamento. O analito é

diretamente adsorvido sobre as partículas sólidas da fase estacionária.

Método de analise
O método mais usado em CG é o método da adição padrão. Neste método há adição no
branco, padrões e amostra de uma quantidade fixa de substância padrão interno). Registam-se
os sinais e representação gráfico. A substância escolhida para padrão interno deve ter sinal
semelhante ao do analito, mas suficientemente distinguível e não pode estar presente na
amostra. Minimiza erros aleatórios e sistemáticos.
Analito:
Amostra gasosa ou liquido volátil (tem de ser termo estável, não depender da temperatura)

Se for um líquido não volátil podemos torna-lo volátil e estável.

Gás de amostra:
Fase móvel: depende do detetor utilizado e do que deseja para a eficiência e velocidade de
separação (não interage com o analito).

He é o mais usado sendo compatível com a maioria dos detetores

N2 proporciona um limite de deteção menor que o He num detetor FID

A razão ótima aumenta na ordem N2<He<H2

O H2 e o He dão, em vazões elevadas, uma melhor resolução, pois os solutos difundem-se

melhor/rapidamente através de H2 e do He e quanto mais rápida é a difusão, menor é o termo
da transferência de massa e menor é H.

Fase estacionária:
Líquido não volátil ligado a um suporte sólido inerte, partículas da coluna.

Determina a seletividade e tempo de retenção.

A amostra é injetada através do septo de borracha que se usa para isolar bem a coluna senão
os gases escapam, para dentro da injeção aquecida que se encontra a uma temperatura
elevada para que não haja condensação do gás, ou para caso o líquido for volátil, ocorrer de
imediato a sua vaporização.

O vapor é arrastado através da coluna pelo gás de arraste

Os analitos separados fluem para o detetor.

A coluna deve estar suficientemente aquecida para a pressão de vapor possibilite a eluição dos
analitos num tempo razoável

A temperatura do detetor e do injetor deve ser superior à temperatura da coluna para evitar a
condensação.

Injeção da amostra
Amostra líquida: 0.1-2microL
Amostra gasosa:0.5-2mL

A seringa contem água para garantir a injeção completa, força a que toda a gota entre no
sistema cromatográfico.

Tipos de injeção
em colunas
capilares

1. injeções com 2. injeções sem 3. injeção direta

divisão de fluxo divisão de fluxo na coluna

1.
Utiliza-se quando os analitos de interesse constituem 0.1% da amostra (elevadas
concentrações).
Quantidade de amostra menor que 1microL- maior resolução
Transfere apenas 0.2-2% da amostra para a coluna, o que reduz a introdução de
impurezas não voláteis com o gás de arraste. Assim, purificamos a amostra e
contaminamos menos a coluna.

Desvantagens:
• Grande desperdício de amostra
• Analises quantitativas pouco exatas
• Algum vapor pode regressar de novo ao septo (os componentes com pontos
de ebulição menores podem retornar mais facilmente), deve ter-se uma
temperatura de entrada de injeção bastante elevada para evitar este
problema, no entanto, esta não pode ser demasiado elevada para não causar
destruição da amostra.
• Substituição periódica do revestimento de vidro devido à posição de resíduos
da amostra e de constituintes não voláteis (pode utilizar-se um material
adsorvente dentro do revestimento de vidro)

2.

Utiliza-se para a analise dos analitos que constituem menos e 0.01% da amostra A
região revestida de vidro é apenas um tubo reto, vazio, sem nenhuma camara de mistura. A
Temperatura do injetor para a injeção sem divisão de fluxo é menor do que para a injeção com
divisão porque a amostra permanece mais tempo na entrada, enão queremos que ela se
decomponha. Aplica-se na coluna aproximadamente 30% da amostra.

3.
 É usada para amostra que se decompõem acima dos seus pontos de ebulição e é a
preferida para a analise quantitativa (analitos que se degradam com a temperatura). Não
passa no injetor aquecido. A temperatura inicial da coluna é baixa o suficiente para condensar
os solutos numa zona estreita.

Vantagens:
• Amostras sujeitas a menores temperaturas e há pouca perda de solutos.

Desvantagens:
• Todas as impurezas da amostra vão para a coluna o que reduz o seu tempo de vida

NOTA: colunas de 0.25 a 0.32 mm de diâmetro – melhor resolução.

Coluna de Capilares
15-100 m de comprimento e diâmetro interno de 0.10-0.53 mm

• Maior resolução
• Maior sensibilidade para pequenas quantidades de analito
• Menor tempo de analise
• Pequena capacidade de amostra
• Maior região linear

Tubo oco no qual se encontra a fase estacionária.

Não existe fator A da equação de Van Deemter

O valor de H é menor então o nr de partos teóricos é maior: há uma melhor eficiência, a

largura dos picos é mais estreita e há melhor separação dos 2 analitos.

Programação da Temperatura e da pressão

Na maioria das análises por CG, a temperatura é aumentada durante a análise para diminuir o
tempo de retenção e a largura do pico (w) – aumenta a resolução

Não se pode ultrapassar a temperatura limite imposta pela coluna para não a danificar, para
não haver decomposição da fase estacionária, e também para não decompor a amostra.

Desvantagem
Tempo de espera para que a temperatura regresse ao valor inicial. Para evitar o tempo de
espera podemos utilizar um gradiente constante de temperatura.

Objetivo da análise
Teoricamente precisamos sempre de uma separação completa com alta resolução, mas, nem
todos os componentes são necessários separar ou analisar então á possível obter um
Cromatograma com alta resolução para parte dos constituintes.

Preparação da amostra
Devemos isolar os analitos desejados dos interferentes

Se necessário, concentrar os analitos até níveis detetáveis.

Escolha do detetor
• O detetor de ionização de chama é o mais popular, mas só responde a
hidrocarbonetos e não é tão sensível como os detetores de captura de eletrões
nitrogénio-fosfato e necessita de haver +10 ppm de cada analito.
• O detetor de condutividade térmica responde a todos os analitos, mas não é muito
sensível
• O detetor de captura de eletrões é especifica para moléculas que contem halógenos,
nitrilo, nitrocompostos e carbonilos conjugados, deve ter +100 ppb de cada analito na
amostra.
• O FID e o detetor de condutividade térmica não são suficientemente sensíveis para o
uso com colunas capilares estreitas de alta resolução.

Resumo CG
Um líquido volátil ou um gás é transportado por uma fase movel gasosa sobe uma fase
estacionaria que se encontra na parte interna de uma coluna capilar. A fase movel é um gas
inerte em relação à fase estacionaria e aos componentes da mistura, sendo transportados na
forma de gases ou vapores.

Opera-se a altas temperaturas e por isso os tubos de colunas são feitos de aço inoxidável. As
colunas capilares de sílica fundida são longas, estreitas e têm pouca capacidade, mas
proporcionam uma boa separação.

A colunas empacotadas fornecem alta capacidade de separação, mas pequena resolução. A

analise quantitativa é feita geralmente com uso de padrões internos, para minimizar as
incertezas introduzidas pela injeção da amostra, razão e variações nas condições da coluna. A
fase estacionária determina a seletividade e a retenção dos analitos.

A amostra é arrastada pela coluna, pelo gás de arraste. O Analito para ser usado na CG tem de
ser volátil e termo estável, ou seja, quando injetado e evaporado tem de ser estável à
temperatura do mesmo e não se decompor.

Cromatografia Líquida de alta eficiência

A HPLC permite a separação de espécies não voláteis e/ou termicamente frágeis, ou seja, que
se decompõem com a temperatura.

Ela tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande

quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de
poucos minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade.

Usa padrões elevados para forçar a passagem do solvente através de colunas fechadas que
contem partículas muito finas, capazes de proporcionar separações eficientes (com alta
resolução), a difusão em líquidos é 100x mais lenta que em gases. As colunas são
empacotadas.

Vantagens
• Sensibilidade elevada
• Separação de espécies não voláteis
• Não necessidade de volatizar o analito.
Fatores que influenciam a HPLC
• Velocidade da fase móvel
• Tamanho das partículas da coluna empacotada – quanto menores as partículas, maior
é a eficiência pois torna se mais difícil atravessá-la, logo as partículas ligam-se melhor
• Variação da % de solventes.

Equipamento de HPLC
O equipamento para a realização desse tipo de cromatografia é denominado de cromatógrafo
líquido que é constituído por vários sistemas, sendo eles:

• Sistema de reservatório de fase móvel;

• Sistema de bombeamento de fase móvel;
• Sistema de injeção;
• Sistema analítico que é constituído pela coluna cromatográfica;
• Sistema de deteção (existe deteção por UV, fluorescência, espectrofotometria de
massas, etc.);
• Sistema de aquisição e registo de dados.

Fases da Cromatografia Líquida

Na cromatografia líquida existe um sistema composto por duas fases, uma fase móvel e outra
fase denominada de estacionária.

Na fase estacionária podem ser utilizados compostos sólidos ou líquidos. Os sólidos

normalmente são substâncias absorventes, tais como, sílica, carvão ativo, etc., que se
encontram “empacotadas” numa coluna, que é atravessada pela fase móvel. Nesse caso a
base para a separação de misturas é chamada de absorção.

Já o composto líquido da fase estacionária é denominado de película delgada, sendo que

nesse caso a base de separação de misturas é denominado de partição.

Sistema de injeção da amostra

Um dos fatores limitantes é a reprodutibilidade com a qual as amostras podem ser
introduzidas na coluna. Alem disso, como a coluna opera com pressões elevadas, é necessária
uma técnica especial para a injeção da amostra. A válvula de injeção contém um loop. Na
posição de carregamento, usamos uma microseringa para lavar e preencher e a alça com uma
nova porção de amostra a pressão atmosférica. Quando se gira a válvula, o conteúdo da alça
de amostra é injetado sob alta pressão para dentro da coluna. O loop permite injetar sempre o
mesmo volume definido, sendo que apenas parte do volume injetado com a seringa entra na
coluna.

Solventes
Na fase móvel emprega-se uma mistura de alguns solventes, por exemplo, metanol,
acetonitrila e água, sendo que essa mistura é denominada de Eluente. Normalmente para a
fase móvel existem alguns critérios quanto aos solventes, tais como:

• O grau de pureza dos solventes,

• Baixa viscosidade;
• Dissolução da amostra sem perca dos compostos;
• Polaridade adequada para a realização da separação dos componentes da amostra.
Tipos de eluição
Utilizam-se solventes de elevada pureza porque evitam degradações da coluna e minimizam o
sinal de fundo do detetor, também eliminam eventuais impurezas (filtração e pré-colunas)

Remoção de gases dissolvidos para minimizar dificuldades com as bombas, detetor e coluna.

Quanto a eluição de compostos é importante ressaltar que existem dois tipos de eluições:

Isocrática: a composição da fase móvel (%B) é constante durante todo o processo de análise.
Normalmente utiliza-se um tipo de solvente. PROBLEMA: ou separa adequadamente os
primeiros picos ou os últimos.

Gradiente: a composição da fase móvel (%B) pode ser alternada durante a realização da
análise. Quando o solvente não proporciona uma eluição suficientemente rápida de todos os
componentes é necessária uma força de eluente maior. Adiciona-se quantidades crescentes
do solvente B ao solvente A.

Nota: Em relação à percentagem das eluições, essa denominação é definida de acordo com o
tipo de bomba do cromatógrafo líquido, podendo ser uma bomba binária, quaternária, etc.

Aquisição de dados e resultados

Para a cromatografia normalmente utilizam-se sistemas de computação ou automação. Esses
sistemas têm o intuito de aumentar a capacidade de utilização dos aparelhos, por meio
de injeção de amostra, inserção de dados das amostras e métodos, aquisição e tratamento de
dados.

A aquisição e tratamento de dados irá definir a precisão de um pico gerado no cromatograma,

além de permitir a determinação de tempos e intensidades (áreas e alturas dos picos),
lembrando que normalmente os gráficos gerados apresentam uma relação de tempo e sinal
do detetor para os analitos como pode ser verificado abaixo:

Coluna
A coluna é de aço ou plástico com um comprimento entre 5-30 cm e com diâmetro interno de
1-5 mm.

Tem custos elevados e degradam-se facilmente pela adsorção irreversível de impurezas

provenientes da amostra e do solvente. Portanto a entrada na coluna principal é protegida por
uma pré-coluna contendo a mesma fase estacionária. As substâncias que se ligam
irreversivelmente à coluna principal são então retidas na pré coluna que é substituída
periodicamente. Atua como um filtro.

O uso de uma coluna aquecida melhora a reprodutibilidade dos tempos de retenção e a

precisão, porque

• A viscosidade do solvente diminui

• Reduz a pressão, tornando o fluxo mais rápido

A fase movel é aquecida entre o injetor e a coluna para que o solvente e a coluna fiquem à
mesma temperatura.

A temperatura da coluna não afeta a separação, mas sim a precisão.

Fase normal vs fase reversa

Fase Grupo
Fase móvel estacionária funcional-R

CIANO
Fase normal APOLAR POLAR DIOL
AMINA
N-OCTILO
Fase reversa POLAR APOLAR N-OCTADECILO
FENILO

Detetores
• Sensível a pequenas quantidades de concentração de todos os analitos
• Resposta linear
• Não causa alargamento dos picos eluídos
• Insensível às variações de temperatura e de composição de solvente

Detetor ultravioleta
• Para solutos que absorvem radiação UV (capacidade de adsorção)
• Lâmpada de mercúrio a 254 nm ou outros comprimentos de onda no UV com
lâmpadas de vapor de zinco ou cádmio. Também podem ser usadas lâmpadas de
deutério, xénon, tungsténio e um monocromador
• Conjunto de fotodiodos:
o Regista o espetro de cada soluto assim que é eluído, para todos os
comprimentos de onda.
o Faixas de absorvância de 0.005 a 3 unidades de absorvância, com nível de
ruído próximo da 1% do fundo de escala.
o São bons para eluição com gradiente de concentração de solventes que
absorvem nessa região.

Detetor de fluorescência
• Excitam o eluato com um laser e medem a fluorescência emitida
• Muito sensíveis
• Só respondem a analitos que fluorescem
Detetor evaporativo por espalhamento de luz
• Qualquer analito que seja menos volátil que a fase movel

Detetor de índice de refração

• Sensível a praticamente todos os tipos e soluto
• Sensível a variações de pressão e temperatura
• Baixo limite de deteção
• Não compara a amostra e a referência enquanto a composição varia – não usar no
caso da eluição com gradiente

Perguntas exame:
1. Qual o efeito na separação cromatográfica de um aumento moderado na temperatura
da coluna (20 a 50) em cromatografia gasosa?

Tempos de retenção dos compostos mais curtos

2. Foi utilizada a HPLC para a quantificação do cloridrato de fluoxetina, o princípio ativo

de um produto farmacêutico. Nesta análise o detetor mais apropriado é
espectrometria de fluorescência.
3.

1. cromatografia líquida de fase reversa (fase estacionária apolar)

2. Como a fase estacionaria é apolar os que saem 1ra são compostos com menor
afinidade sendo por isso polares.

5>4>3>2>1

3. Para otimizar a separação cromatográfica poder-se-ia alterar o tipo de eluição para

eluição por gradiente em que a quantidade do solvente A vai aumentando
progressivamente, permitindo que os picos que saem em primeiro apareçam mais
espaçados. Poderíamos aumentar a velocidade de fluxo e diminuir a quantidade de
amostra de modo a obter bandas mais estreitas.

4.

4. O pico com menor tempo de retenção apresenta melhor área pois a coluna é apolar e
aqui o 1ro composto a sair é o menos apolar.
5. O gráfico da relação linear da altura equivalente a um prato teórico em função do
caudal descreve satisfatoriamente o processo cinético do alargamento do pico numa
dada coluna cromatográfica associado à contribuição do efeito da difusão longitudinal

6. o eluente é por definição a fase móvel ou a mistura de solventes usada na

cromatografia. (mistura de solventes em HPLC, gás inerte em CG)