Aula Prática 05: ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS – TÉCNICAS DE SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO
A. Técnica do esgotamento
1) Com uma caneta, divida em quatro partes iguais a base de uma placa de Petri contendo ágar nutriente
(placa 1) e de outra placa contendo ágar MacConkey (placa 2).
2) Esterilize a alça de inoculação e espere esfriar.
3) Flambe o tubo A, contendo uma suspensão bacteriana.
4) Com a alça de inoculação, remova uma gota do meio líquido.
5) Flambe novamente o tubo e feche-o.
4 6) Semeie o inóculo sobre a superfície do meio sólido baseando-se na figura ao lado:
a. A semeadura deve ser realizada em estrias, por meio de
movimentos em zigue-zague em um quarto da placa, iniciando
da periferia em direção ao centro. Ao final, deve-se flambar a
alça (passo 1);
b. Para iniciar o estriamento no próximo quadrante, passe a alça
de inoculação uma única vez sobre as estrias feitas no primeiro
quadrante e inicie o zigue-zague no segundo quadrante (passo 2).
Ao final, flambe a alça. Repita o mesmo procedimento em todos os
outros 2 quadrantes (passos 3 e 4).
c. A semeadura deve ser realizada com o maior número possível de estrias, sem perfurar ou rasgar
o meio e sem sobrepor as estrias feitas no quadrante.
7) Esterilize a alça de inoculação ao final do estriamento.
8) Repita o procedimento desde o início com a placa 2 (ágar MacConckey).
9) Incube as placas a 37 °C por 24 h.
B.Técnica das diluições em placa (diluições seriadas) e semeadura de espalhamento em superfície
1) Os microtubos sobre a bancada contêm 900 µL de solução salina estéril. Numere-os de 1 a 6.
2) Regule o volume de uma micropipeta automática para 100 µL, e encaixe sua ponta em uma ponteira
estéril, abrindo a caixa de ponteiras próximo ao bico de Bunsen. Mantenha a ponteira próxima à zona
de segurança microbiológica da chama, com a micropipeta, retire uma ponteira do suporte, sem tocá-
la com a mão.
3) Flambe o tubo B, contendo uma suspensão da bactéria .
4) Introduza somente a ponta da ponteira no tubo, colete 100 µL do inóculo e feche o tubo.
5) Abra o microtubo 1 e coloque os 100 µL do inóculo. Misture bem a solução. Esta é a solução 1 (diluição
10-1).
6) Dispense a ponteira no descarte contendo hipoclorito de sódio 3%.
7) A partir da solução 1, repita o procedimento dos itens “4 a 6” para obter as soluções 2 (diluição 10-2), 3
(diluição 10-3), 4 (diluição 10-4), 5 (diluição 10-5), e 6 (diluição 10-6).
8) Nomeie 6 placas contendo ágar nutriente de 1 a 6, sendo cada uma para uma das soluções.
9) Nomeie outra placa como “Tubo B”.
10) Semeie 50 µL de cada diluição e também do meio inicial do tubo B em sua respectiva placa, conforme
descrito abaixo:
Mergulhe a espátula de Drigalski em álcool 70%, esterilize-a e espere esfriar.
Misture bem o conteúdo de cada microtubo e retire 50 µL da diluição dispensando-os no centro da
placa de Petri correspondente.
1
Espalhe o inóculo homogeneamente sobre o meio de cultura com a espátula de Drigalski até secar.
Novamente, mergulhe a espátula de Drigalski em álcool 70% e esterilize-a.
11) Incube as placas a 37 oC por 18 h.
C.Técnica de isolamento em meio seletivo-diferencial
1) Nomeie as placas com meio ágar EMB (Eosina Azul de Metileno) de 1 a 2.
2) Esterilize a alça de inoculação e espere esfriar.
3) Flambe o tubo B e, com a alça, remova uma gota do meio líquido.
4) Flambe novamente o tubo e feche-o.
5) Na placa 1, realize a semeadura em estrias (conforme descrito no item A).
6) Repita os procedimentos de 2 a 5 para a suspensão do tubo C (contendo uma suspensão da bactéria
), semeando na placa 2.
7) Divida a placa de meio ágar nutriente em 2 partes iguais com uma caneta na sua parte posterior e escreva
uma letra em cada parte (B e C).
8) Esterilize a alça de inoculação e espere esfriar.
9) Flambe o tubo B e, com a alça, remova uma gota do meio líquido.
10) Flambe novamente o tubo e feche-o.
11) Semeie em zigue-zague da parte mais externa da placa em direção ao centro na parte denominada B.
12) Repita os itens 9 a 12 para o tubo C inoculando na parte denominada C da placa de Petri.
13) Incube as placas a 37 oC durante 18 h.
