UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS

CAMPUS DE BOTUCATU

BIOATIVIDADE DE EXTRATOS DE ANONÁCEAS E PIPERÁCEAS

SOBRE Tuta absoluta (MEYRICK) (LEPIDOPTERA: GELECHIIDAE)
EM TOMATEIRO

ELAINE FERRARI DE BRITO

Tese apresentada à Faculdade de Ciências

Agronômicas da UNESP – Campus de
Botucatu, para obtenção do título de Doutora
em Agronomia (Proteção de Plantas).

BOTUCATU - SP
Julho - 2014
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CAMPUS DE BOTUCATU

BIOATIVIDADE DE EXTRATOS DE ANONÁCEAS E PIPERÁCEAS

SOBRE Tuta absoluta (MEYRICK) (LEPIDOPTERA: GELECHIIDAE)
EM TOMATEIRO

ELAINE FERRARI DE BRITO

Orientador: Prof. Dr. Edson Luiz Lopes Baldin

Tese apresentada à Faculdade de Ciências

Agronômicas da UNESP – Campus de
Botucatu, para obtenção do título de Doutora
em Agronomia (Proteção de Plantas).

BOTUCATU - SP
Julho - 2014
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO – SERVIÇO TÉCNICO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - UNESP - FCA
- LAGEADO - BOTUCATU (SP)

Brito, Elaine Ferrari de, 1982-

B862b Bioatividade de extratos de anonáceas e piperáceas sobre
Tuta absoluta (Meyrick) (Lepdoptera: Gelechiidae) em toma-
teiro / Elaine Ferrari de Brito. – Botucatu : [s.n.], 2014
xi, 92 f. : fots. color., grafs., tabs.

Tese (Doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Fa-

culdade de Ciências Agronômicas, Botucatu, 2014
Orientador: Edson Luiz Lopes Baldin
Inclui bibliografia

1. Tomate – Doenças e pragas. 2. Inseticidas botânicos.

3. Solanaceae. 4. Pragas agrícolas – Controle biológico. I.
Baldin, Edson Luiz. II. Universidade Estadual Paulista “Jú-
lio de Mesquita Filho” (Campus de Botucatu). Faculdade de
Ciências Agronômicas. III. Título.
 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO"
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CAMPUSDEBOTUCATU

CERTIFICADO DE APROV AÇÃO

TÍTULO: "BIOATIVIDADE DE EXTRATOS DE ANONÁCEAS E PIPERÁCEAS

SOBRE Tuta absoluta (MEYRICK) (LEPIDOPTERA: GELECHIIDAE) EM
TOMATEIRO"

ALUNA: ELAINE FERRARI DE BRITO

ORIENTADOR: PROF. DR. EDSON LUIZ LOPES BALDIN

Aprovado pela Comissão Examinadora

PROF. DR.

PRO~MASSUO R EKATO

Q-----
~f-f{f' --~--.-
PROF. DR. LEANDRO DO PRADO RIBEIRO

PROF. DR. ANDRE LUIZ LOURENÇAO

Data da Realização: 24 de julho de 2014.

 III

À minha irmã Cassiana Ferrari de Brito, que lutou com muita fé pela vida
e nunca perdeu a esperança.

Ofereço

Às mulheres da minha vida, minha filha Julia, minha mãe Neide, minhas
irmãs Cassiana e Shélida e minha tia Rita de Cássia.

Dedico
 IV

AGRADECIMENTOS

A Deus e à Santa Rita de Cássia, pela força e proteção em todos os momentos da minha
vida.
À minha família pelo apoio, amor, alegria e presença.
Agradeço especialmente à minha filha Julia, que todos os dias me ensina a ser uma
pessoa melhor.
Ao meu orientador Prof. Dr. Edson Luiz Lopes Baldin, pela orientação, amizade e
confiança.
A todos os Professores do Programa de Pós-graduação em Agronomia - Proteção de
Plantas, pelas oportunidades de seguir aprendendo.
Ao Prof. Dr. José Djair Vendramim, pela atenção e sugestões dadas durante este
período.
À Faculdade de Ciências Agronômicas e ao Departamento de Proteção Vegetal, pela
oportunidade de desenvolver meu projeto de doutorado.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela
concessão da bolsa de doutorado.
Ao meu amigo Dr. Leandro do Prado Ribeiro, pelas sugestões, envio de materiais,
suporte nas análises estatísticas, auxílio em todas as etapas do meu doutorado e pela
amizade.
Ao meu estagiário e amigo Roney Macedo da Silva, pelo auxílio em todos os
experimentos.
Ao Laboratório de Plantas Inseticidas da ESALQ, pela confecção dos extratos brutos
utilizados nessa pesquisa.
Ao Prof. Dr. João Luis Callegari Lopes da USP de Ribeirão Preto, pela elaboração de
parte das análises químicas dos extratos.
Aos funcionários, Sr. Domingos, Nivaldo, Norberto, Adriana, Samuel e especialmente
às minhas amigas Luciana Aparecida e à Maria Aparecida e do meu amigo Evandro
Fogaça (Zé), pela amizade e carinho.
A todos os meus amigos do Departamento de Proteção Vegetal, Maria de Jesus, Patrícia
Leite, Rafaela Morando, Ivana Fernandes, José Paulo “Cuti”, Luiz Pannuti, Ronelza
Zaché, Efrain Santana, Thiago Fanela, Eunice Schlick-Souza e Camila Souza, pelo
apoio, amizade e carinho.
Agradeço especialmente a Glaucia, Graziela, Eunice, Ivana, Roney e Rodrigo pela
grande amizade e presença na minha vida em Botucatu.
 V

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS...................................................................................................VII
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. .X
1 RESUMO .................................................................................................................. 1
2 SUMMARY............................................................................................................... 3
3 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 5
4 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................... 9
4.1 Descrição geral sobre Tuta absoluta .................................................................... 9
4.2 Aspectos taxonômicos e bioecológicos de T. absoluta ....................................... 11
4.3 Pesquisas envolvendo plantas inseticidas no manejo de T. absoluta ................... 15
4.4 Família Annonaceae .......................................................................................... 17
4.4.1 Gênero Annona ........................................................................................... 18
4.5 Família Piperaceae ............................................................................................. 22
4.5.1 Gênero Piper ............................................................................................... 22
5 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 26
5.1 Criação estoque de T. absoluta e formação de plantas de tomate ........................ 26
5.2 Coleta das espécies estudadas e preparo dos extratos etanólicos ......................... 27
5.3 Avaliação de toxicidade dos solventes orgânicos para T. absoluta...................... 29
5.4 Screening com extratos de anonáceas e piperáceas ............................................. 29
5.5 Bioensaios com os extratos selecionados ........................................................... 30
5.5.1 Curvas de concentração-resposta ................................................................. 30
5.5.2 Efeito dos extratos selecionados sobre aspectos biológicos de T. absoluta ... 31
5.5.3 Avaliação quanto à preferência para oviposição de T. absoluta.................... 32
5.5.4 Avaliação do efeito ovicida ......................................................................... 33
5.5.5 Avaliação do efeito translaminar sobre T. absoluta ...................................... 34
5.6 Fracionamento dos extratos de A. muricata ........................................................ 34
5.6.1 Avaliação da bioatividade das partições obtidas .......................................... 34
5.6.2 Análise cromatográfica em camada delgada (CCD) ..................................... 35
5.6.3 Ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN de 1H) ....................... 36
5.7 Bioensaios de toxicidade comparada .................................................................. 36
5.8 Análise dos dados................................................................................................ 37

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 39

 VI

6.1 Rendimento de extração ..................................................................................... 39

6.2 Avaliação de toxicidade dos solventes orgânicos para T. absoluta...................... 40
6.3 Screening com os extratos de anonáceas e piperáceas ........................................ 40
6.4 Bioensaios com os extratos selecionados ........................................................... 46
6.4.1 Curvas de concentração-resposta ................................................................. 46
6.4.2 Efeito dos extratos selecionados sobre aspectos biológicos de T. absoluta ... 50
6.4.3 Avaliação quanto à preferência para oviposição de T. absoluta.................... 54
6.4.4 Avaliação do efeito ovicida ......................................................................... 56
6.4.5 Avaliação do efeito translaminar sobre T. absoluta ...................................... 57
6.5 Fracionamento dos extratos de A. muricata ........................................................ 59
6.5.1 Avaliação da bioatividade das partições obtidas .......................................... 60
6.5.2 Análise cromatografica em camada delgada (CCD) ..................................... 63
6.5.3 Ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN de 1H) ....................... 66
6.6 Bioensaios de toxicidade comparada .................................................................. 70
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 73
8 CONCLUSÕES ....................................................................................................... 76
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................78
 VII

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Dados de coleta das espécies botânicas avaliadas .................................. ......28

Tabela 2. Rendimento dos extratos brutos de anonáceas e piperáceas, obtidos por meio
do processo de maceração a frio em solvente etanol, na proporção de 1:5 (p/v). .......... 40

Tabela 3. Médias (± EP) de mortalidade e peso (mg) de lagartas de T. absoluta

alimentadas com folíolos de tomateiro tratados com solventes de diferentes polaridades,
isolados ou em diferentes combinações. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.
................................................................................................................................... 41

Tabela 4. Médias (± EP) de mortalidade e peso (mg) de lagartas de T. absoluta

alimentadas com folíolos de tomateiro tratados com extratos etanólicos de diferentes
estruturas e/ou espécies de Annonaceae em três concentrações. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60
± 10%; Fotofase: 14 h. ................................................................................................ 42

Tabela 5. Médias (± EP) de mortalidade e peso (mg) de lagartas de T. absoluta

alimentadas com folíolos de tomateiro tratados com extratos etanólicos de folhas de
diferentes espécies de Piperaceae em duas concentrações. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ±
10%; Fotofase: 14 h. ................................................................................................... 45

Tabela 6. Estimativa da CL50 e CL90 (mg L-1) e intervalo de confiança (IC) dos extratos
etanólicos de folhas e sementes de A. muricata. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%;
Fotofase: 14 h. Período de exposição dos insetos aos extratos (144 horas) ................... 47

Tabela 7. Estimativa da CL50 e CL90 (mg L-1) e intervalo de confiança (IC) do extrato
etanólico de sementes de A. muricata, em diferentes tempos de exposição. T.: 25 ± 2
°C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h. ........................................................................... 47

Tabela 8. Estimativa da CL50 e CL90 (mg L-1) e intervalo de confiança (IC) do extrato
etanólico de folhas A. muricata, em diferentes tempos de exposição. T.: 25 ± 2 °C; U.
R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h. ...................................................................................... 48

Tabela 9. Estimativa da CL50 e CL90 (mg L-1) e intervalo de confiança (IC) do extrato
etanólico de P. amalago var. medium. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.
Período de exposição dos insetos aos extratos (144 horas). .......................................... 49
 VIII

Tabela 10. Estimativa da CL50 e CL90 (mg L-1) e intervalo de confiança (IC) do extrato
etanólico de folhas de P. amalago var. medium, em diferentes tempos de exposição. T.:
25 ± 2°C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h. ................................................................. 49

Tabela 11. Médias (± EP) de mortalidade e duração da fase larval (dias) de T. absoluta
expostas a extratos etanólicos de folhas e sementes de A. muricata nas concentrações de
-1
768,13 mg L e 893,74 mg L-1, respectivamente. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%;
Fotofase: 14 h.. ........................................................................................................... 51

Tabela 12. Médias (± EP) do peso (mg), mortalidade (%) e duração da fase pupal (dias)
de T. absoluta expostas a extratos etanólicos de folhas e sementes de A. muricata nas
concentrações de 768,13 mg L -1 e 893,74 mg L-1, respectivamente. T.: 25 ± 2 °C; U. R.:
60 ± 10%; Fotofase: 14 h. ........................................................................................... 51

Tabela 13. Médias (± EP) do período de L1 (lagarta recém-eclodida) a adulto (dias),

longevidade do adulto (dias) e razão sexual de T. absoluta expostas a extratos etanólicos
de folhas e sementes de A. muricata nas concentrações de 768,13 mg L -1 e 893,74 mg
L-1, respectivamente. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.. ......................... 52

Tabela 14. Médias (± EP) de mortalidade e duração da fase larval (dias) de T. absoluta
expostas ao extrato etanólico de folhas de P. amalago var. medium na concentração de
1.011 mg L-1.T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h. ...................................... 52

Tabela 15. Médias (± EP) do peso (mg), mortalidade e duração da fase pupal (dias) de
T. absoluta expostas ao extrato etanólico de folhas de P. amalago var. medium na
concentração de 1.011 mg L-1. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.. .......... 53

Tabela 16. Médias (± EP) do período de L1 a adulto (dias), longevidade do adulto

(dias) e razão sexual de T. absoluta expostas ao extrato etanólico de folhas de P.
amalago var. medium na concentração de 1.011 mg L-1. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%;
Fotofase: 14 h.. ........................................................................................................... 53

Tabela 17. Médias (± EP) do número de ovos/planta de T. absoluta em teste de

preferência para oviposição com chance de escolha, em plantas tratadas com extratos
etanólicos de folhas e sementes de A. muricata nas concentrações de 768,13 mg L-1 e
893,74 mg L-1, respectivamente e ao extrato de folhas de P. amalago var. medium na
concentração de 1.011 mg L-1. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.............54
 IX

Tabela 18. Médias (± EP) do número de ovos/planta de T. absoluta em teste de

oviposição sem chance de escolha, em plantas tratadas com extratos etanólicos de folhas
e sementes de A. muricata nas concentrações de 768,13 mg L-1 e 893,74 mg L-1,
respectivamente e extratos de folhas de P. amalago var. medium na concentração de
1.011 mg L-1. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.. .................................... 54

Tabela 19. Médias (± EP) de eclosão de lagartas de T. absoluta após pulverização com
os extratos etanólicos de folhas e sementes de A. muricata nas concentrações de 768,13
mg L-1 e 893,74 mg L-1, respectivamente e de folhas de P. amalago var. medium na
concentração de 1.011 mg L-1 sobre ovos do inseto. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%;
Fotofase: 14 h................................................................................................................56

Tabela 20. Médias (± EP) de mortalidade e peso (mg) de T. absoluta expostas a

extratos etanólicos de folhas e sementes de A. muricata nas concentrações de 3.840 mg
L-1 e 4.468 mg L-1, respectivamente e para o extrato de folhas de P. amalago var.
medium na concentração de 5.055 mg L-1, após a penetração no mesófilo foliar. T.: 25 ±
2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h...... .................................................... ................58

Tabela 21. Rendimento das partições dos extratos etanólicos de folhas e sementes de A.
muricata ..................................................................................................................... 60

Tabela 22. Médias (± EP) de mortalidade e peso (mg) de lagartas de T. absoluta

expostas as frações do extrato etanólico de folhas de A. muricata, na concentração de
768,13 mg L-1. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; fotofase: 14 h.. ................................... 61

Tabela 23. Médias (± EP) de mortalidade e peso (mg) de lagartas de T. absoluta

expostas as frações do extrato de sementes de A. muricata, na concentração de 893,74
mg L-1. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; fotofase: 14 h.... ............................................. 62

Tabela 24. Médias (± EP) de mortalidade e peso (mg) de lagartas de T. absoluta

expostas ao extrato de sementes de A. muricata e diferentes formulações comerciais em
condições de laboratório. T.: 25 ± 2°C; U. R.: 60 ± 10%; fotofase: 14 h. ..................... 71

Tabela 25. Médias (± EP) de mortalidade e peso (mg) de lagartas de T. absoluta

expostas ao extrato de sementes de A. muricata e diferentes formulações comerciais em
condições de casa de vegetação. Botucatu, dez./2013. ................................................. 72
 X

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estágios de vida de T. absoluta: (A) ovos, (B) lagarta, (C) pupa, (D) adulto..
................................................................................................................................... 12

Figura 2. Desenho esquemático da pupa de T. absoluta; vista frontal: detalhes do

abdome do macho (A) e da fêmea (B).............................................................................14

Figura 3. (A) Gaiolas utilizadas em ensaios de biologia com lagartas de T. absoluta;

(B) Detalhes do folíolo de tomateiro danificado ao final do estágio larval de T. absoluta
................................................................................................................................... 32

Figura 4. Ensaio de bioatividade comparada em casa de vegetação: (A) Vista geral do

ensaio de toxicidade comparada em casa de vegetação; (B) Detalhe da gaiola em tecido
voil utilizada no ensaio. ............................................................................................... 37

Figura 5. Perfis cromatográficos das frações dos extratos de folhas e sementes de A.

muricata; Amostras: (1) Fração em diclorometano do extrato de folhas de A. muricata;
(2) Fração em acetato de etila do extrato de folhas de A. muricata e (3) Fração
hidroalcóolica do extrato de sementes de A. muricata; em diferentes reveladores (A)
anisaldeído sulfúrico; (B) iodo; (C) Dragendorff e (D) sulfato cérico. ......................... 64

Figura 6. Perfis cromatográficos das frações do extrato de folhas e sementes de A.

muricata; Amostras: (1) Fração em diclorometano do extrato de folhas de A. muricata;
(2) Fração em acetato de etila do extrato de folhas de A. muricata; (3) Fração
hidroalcóolica do extrato de sementes de A. muricata; em diferentes eluentes através de
luz ultravioleta (A) hexano:acetato de etila (7:3 v/v); (B) hexano:acetato de etila 7:3
(v/v) com inversão da polaridade; (C) acetato de etila:metanol (8:2, v/v) aumento na
polaridade. .................................................................................................................. 65

Figura 7. Estrutura geral de acetogeninas ................................................................... 66

Figura 8. Espectro de RMN de 1H da partição hidroalcóolicado extrato bruto de

sementes de A. muricata (DMSO d6, 400 MHz). ......................................................... 67

Figura 9. Espectro de RMN de 1H da partição diclorometânica do extrato bruto de

folhas de A. muricata (CDCl3, 400MHz). .................................................................... 68
 XI

Figura 10. Espectro de RMN de 1H da partição acetato de etilado extrato bruto de

folhas de A. muricata (DMSO-d6, 400MHz)................................................................ 69
 1

BIOATIVIDADE DE EXTRATOS DE ANONÁCEAS E PIPERÁCEAS SOBRE Tuta

absoluta (MEYRICK) (LEPIDOPTERA: GELECHIIDAE) EM TOMATEIRO.
Botucatu, 2014. 92p. Tese (Doutorado em Agronomia/Proteção de Plantas) – Faculdade de
Ciências Agronômicas. Universidade Estadual Paulista (UNESP).

Autor: ELAINE FERRARI DE BRITO

Orientador: EDSON LUIZ LOPES BALDIN

1 RESUMO
A traça-do-tomateiro, Tuta absoluta (Meyrick), ataca severamente
a cultura do tomateiro, podendo comprometer a planta em todas as fases do seu
desenvolvimento. Embora o controle químico seja bastante utilizado no manejo das
populações deste inseto, métodos menos agressivos, vem sendo estudados, como o uso de
plantas com atividade inseticida. Este trabalho teve como objetivo avaliar a bioatividade de
extratos etanólicos de diferentes espécies e estruturas de Annona e Piper, bem como
identificar a classe de compostos dos extratos mais ativos de Annona spp. sobre T.
absoluta. Inicialmente, foi realizado um screening com os extratos etanólicos das espécies
estudadas. Nesse ensaio, os extratos de A. muricata e Piper amalago L. var. medium
(Jacq.) Yunck. Foram selecionados por apresentarem pronunciada atividade inseticida
sobre lagartas de T. absoluta. Em seguida as concentrações letais foram estimadas. Para os
extratos de sementes e folhas de A. muricata a CL50 estimada foi de 893,74 e 768,13 mg L-
1
, respectivamente. Para o extrato de P. amalago var. medium a CL50 foi de 1.011 mg L-1.
Os efeitos subletais dos extratos sobre aspectos biológicos de T. absoluta foram estudados.
Em geral, esses efeitos foram pouco pronunciados. Os extratos promoveram
principalmente alongamento nos estágios de vida do inseto. O efeito dos extratos sobre a
preferência para oviposição de T. absoluta também foi avalido em teste com e sem chance
de escolha. Verificou-se que apenas o extrato de P. amalago var. medium foi classificado
 2

como deterrente à oviposição em teste com chance de escolha. Posteriormente, o efeito

translaminar e a ação ovicida dos extratos foram avaliados. Foi constatado efeito deletério
do extrato de P. amalago var. medium sobre ovos de T. absoluta. Quanto ao efeito
translaminar dos extratos, verificou-se que os extratos de A. muricata são capazes de
penetrar no mesófilo foliar e atingir as lagartas. Os extratos de A. muricata foram
fracionados, a fim de identificar as frações mais ativas sobre T. absoluta. Análises físico-
químicas dessas frações foram feitas através de cromatografia de camada delgada (CCD) e
ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN de 1H) para identificação da classe de
compostos ativos sobre T. absoluta. As frações em diclorometano e acetato de etila do
extrato de folhas de A. muricata ocasionaram as maiores mortalidades, assim como a
fração hidroalcóolica do extrato de sementes. Na análise química dessas frações os
resultados revelam a presença de acetogeninas na partição hidroalcoólica do extrato de
sementes de A. muricata e na fração em diclorometano do extrato de folhas. Em casa de
vegetação e laboratório também avaliou-se a toxicidade comparada entre o extrato de A.
muricata e uma formulação comercial à base de acetogeninas de anonáceas (Anosom®).
Em laboratório, o extrato de A. muricata causou mortalidade semelhante ao Anosom® e ao
controle positivo (Azamax®). Entretanto, em casa de vegetação, a mortalidade de T.
absoluta pelo uso do extrato de A. muricata e das formulações comerciais não se manteve,
e merece novas investigações. Apesar da necessidade de ensaios complementares,
principalmente relativos à toxicidade desses extratos a mamíferos e sua seletividade sobre
organismos não-alvo, este trabalho evidenciou o potencial dos extratos etanólicos de A.
muricata e P. amalago var. medium no manejo de T. absoluta, podendo contribuir como
ferramenta adicional no manejo integrado dessa praga em tomateiro.

Palavras-chave: Plantas inseticidas, Annona muricata L., Piper amalago L. var. medium
(Jacq.) Yunck, Solanum lycopersicum L.
 3

BIOACTIVITY OF ANNONACEOUS AND PIPERACEOUS EXTRACTS ON Tuta

absoluta (MEYRICK) (LEPIDOPTERA: GELECHIIDAE) IN TOMATO. Botucatu,
2014. 92p. Thesis (Ph.D. in Agronomy/Crop Protection) – College of Agricultural
Sciences. Sao Paulo State University (UNESP).

Author: ELAINE FERRARI DE BRITO

Advisor: EDSON LUIZ LOPES BALDIN

2 SUMMARY
The tomato leafminer, Tuta absoluta (Meyrick), attacks the tomato
crop severely, compromising the plant at all development stages. Even though the chemical
control is extensively used on the management of these insect populations, less aggressive
methods such as the use of plants with insecticidal activity have been investigated. This
study aimed to evaluate the bioactivity of ethanolic extracts of different species and
structures of the genus Annona and Piper, as well as characterize the class of compounds
of the most active extracts of Annona spp. against T. absoluta. First, a screening was
performed with the ethanolic extracts of the studied species. The A. muricata and Piper
amalago var. medium (Jacq.) Yunck extracts showed higher activity against T. absoluta
larvae and were selected and then it was determined the lethal concentrations. The effects
of sub lethal doses of the extracts on the T.absoluta biology were studied, as well as the
oviposition preference on the sprayed plants in choice and no-choice tests. The sub lethal
effects of the extracts were not very pronounced. The extracts mainly promoted an
elongation on the insect life cycle. Regarding the effect of the extracts on adults, only the
P. amalago var. medium extract was classified as deterrent to oviposition. In addition, the
translaminar and ovicidal effect of the extracts were also evaluated. . It was observed
deleterious effect of the extracts the P. amalago var. medium on T. absoluta eggs.
Regarding the translaminar effect of the extracts, it was observed that the A. muricata
extracts are able to penetrate the foliar mesophyll and reach the larvae. Afterwards, the A.
 4

muricata L. extracts were fractionated for new assays with T. absoluta larvae, in order to
identify the most active fractions. Chemical analyses of these fractions were performed
through thin layer chromatography (TLC) and nuclear magnetic resonance ( 1H NMR) for
the characterization of the major compounds. In the fractionation tests, the fractions in
dichloromethane and ethyl acetate of A. muricata extracts caused higher mortalities, as
well as the hydroalcoholic fraction of the seed extract. The results of the chemical
analyses revealed that the hydroalcoholic partition of A. muricata seed extract and the
dichloromethane fraction of the leaf extract presented acetogenins as major compounds.
The compared toxicity between the A. muricata extract and a commercial formulation a
basis of annonaceous acetogenins (Anosom®) was also evaluated in greenhouse and
laboratory. For the compared toxicity tests in laboratory, the A. muricata extract caused
similar mortality to Anosom® and the positive control (Azamax®). In greenhouse, the
mortality indexes of T. absoluta through the use of extracts remained under the
expectation, and deserve further investigations. Despite the need of complementary tests,
especially concerning to the toxicity of these extracts to mammals and its selectivity on
non-target organisms, this study showed the potencial of A. muricata and P. amalago var.
medium ethanolic extracts on T. absoluta management, which may contribute as an
additional tool on the integrated management of this pest in tomato.

Keywords: Botanical insecticides, Annona muricata (L.), Piper amalago L. var. medium
(Jacq.) Yunck, Solanum lycopersicum L.
 5

3 INTRODUÇÃO
Nativa da América do Sul, a traça-do-tomateiro Tuta absoluta
(Meyrick) (Lepidoptera: Gelechiidae) está presente nos principais países produtores de
tomate da América Latina e atualmente vem ganhando status como grande ameaça para a
produção mundial deste fruto (OEPP/EPPO, 2005; DESNEUX et al., 2010; USDA, 2011).
Em 2004, T. absoluta passou a fazer parte da lista de pragas quarentenárias da Organização
de Proteção de Plantas da Europa e Mediterrâneo (OEPP/EPPO, 2005). Em pouco tempo,
notificou-se a presença desse inseto em algumas regiões produtoras de tomate na Espanha,
disseminando-se rapidamente para outros países da Europa, Ásia e África (URBANEJA et
al., 2007; DESNEUX et al., 2011). A ocorrência da traça-do-tomateiro limitou-se por
quase 40 anos ao território sul-americano. Durante esse período, apenas 3,1% da superfície
cultivada estavam infestadas com a praga no mundo. No entanto, a partir da sua entrada no
continente Europeu, em 2006 a praga proliferou rapidamente e hoje 21,5% da superfície
cultivada encontram-se sob ataque por T. absoluta (FAOSTAT, 2011). Especialistas
sugerem que até 2016 a traça-do-tomateiro estará presente em importantes países
exportadores de tomate como Canadá, China, Estados Unidos e México (DESNEUX et al.,
2011). Os danos causados pela traça-do-tomateiro à cultura ocorrem durante todo o ano,
em todas as partes da planta e em qualquer estádio de desenvolvimento. Quando em
elevadas infestações, o inseto pode ocasionar perdas significativas à produção (SOUZA et
al., 1992; PICANÇO et al., 1998; TORRES et al., 2001).
 6

O controle de T. absoluta é feito, principalmente, através do uso de

inseticidas sintéticos. No entanto, a baixa eficiência desse método no controle da traça vem
sendo evidenciada desde a década de 90. Naquela época já eram perceptíveis incrementos
tanto no volume de ingrediente ativo por hectare como na frequência de pulverizações, a
fim de se obterem os mesmos níveis de controle (FRANÇA, 1993). O uso intensivo e
quase que exclusivo dessa prática de controle, aliado a características intrínsecas do inseto,
como alto potencial reprodutivo (10-12 gerações/ano) e hábito minador, vêm favorecendo
à seleção de indivíduos resistentes a diferentes ingredientes ativos (SIQUEIRA et al., 2000,
2001; LIETTI et al., 2005; SILVA et al., 2011). Na Europa, já existem populações de T.
absoluta com alta frequência de alelos de resistência a piretroides (RODITAKIS et al.,
2010; HADDI et al., 2012).
Outros problemas frequentemente relacionados à utilização de
pesticidas sintéticos referem-se à elevada toxicidade dos produtos sobre os aplicadores e ao
meio ambiente e à falta de cumprimento dos prazos de carência. A exposição involuntária
da população através do consumo de alimentos com resíduos de agroquímicos também
reforça a inadequação desse sistema de produção. Segundo o Programa de Análise de
Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos, das amostras monitoradas em 2011, 36% foram
consideradas insatisfatórias, apresentando ingredientes ativos (i.a) acima dos limites
máximos permitidos ou não autorizados para a cultura (PARA, 2011). A percepção
negativa da população frente a esses problemas, aliada a estudos científicos que mostram o
potencial danoso do uso desses produtos, vêm fazendo com que diversos países busquem
regras mais rigorosas para a concessão de registro de agroquímicos. Dessa maneira, a
necessidade de desenvolver novos métodos de controle de pragas que visem à
sustentabilidade do sistema agrícola abre novas perspectivas para a área de inseticidas
botânicos, seja para o uso direto pelos produtores ou servindo como modelo químico nas
indústrias, visando à síntese de novos produtos (VENDRAMIM; CASTIGLIONI, 2000;
ISMAN, 2006; CANTRELL et al., 2012)
No passado, o uso de plantas com atividade inseticida para a
proteção de culturas e grãos armazenados ao ataque de pragas e doenças foi bastante
comum, principalmente em países tropicais (THACKER, 2002). Recentemente, diversos
compostos de origem vegetal têm sido apontados como alternativas aos agroquímicos
usados no controle de importantes pragas agrícolas (PHILOGÈNE et al., 2005; KOUL et
al., 2008; SCOTT et al., 2008). Uma das espécies mais estudadas nas últimas décadas é
 7

Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae), comumente conhecida como nim

(SCHMUTTERER, 1990; ISMAN, 2006). Os resultados obtidos com o nim vêm servindo
como estímulo para a pesquisa com espécies de outras famílias botânicas. No Brasil, a
variedade de biomas reflete a enorme riqueza biológica e seu potencial como fonte de
recursos genéticos. A prospecção sustentável de plantas dentro dessa biodiversidade
permitirá não somente a descoberta de novas espécies com potencial inseticida, mas servirá
como uma ferramenta estratégica para sua conservação e proteção.
As piperáceas constituem uma das mais primitivas famílias entre as
angiospermas, com ampla distribuição nas regiões tropicais e subtropicais do mundo
(SOLTIS et al., 1999; FRODIN, 2004). No Brasil, ocorrem cerca de 450 espécies da
família, em sua maioria pertencentes ao gênero Piper (YUNCKER, 1972, 1973, 1974;
JARAMILLO et al., 2004). A enorme variedade de compostos secundários encontrados em
plantas do gênero Piper justifica o grande potencial dessas plantas na busca por novos
inseticidas (BERNARD et al., 1995). As piperamidas, encontradas em espécies desse
gênero, são moléculas que apresentam dupla atividade biológica, incluindo efeitos
neurotóxicos e efeitos sobre o metabolismo de lipídeos nos insetos. Nesse sentido, vale
destacar que a presença de diferentes modos de ação em uma única molécula é uma
característica promissora para o controle de insetos, principalmente aqueles resistentes a
inseticidas (PARMAR et al., 1997; DYER; PALMER, 2004; SCOTT et al., 2004).
Dentro da família Annonaceae, o isolamento de uma classe de
compostos conhecidos como acetogeninas vem estimulando os estudos com suas espécies
(LEBOEUF et al., 1980; BERMEJO et al., 2005). Esses compostos possuem ampla
atividade biológica, incluindo propriedades inseticidas (RATNAYAKE, et al., 1993;
MCLAUGHLIN et al., 1997). As anonáceas também apresentam ampla dispersão em
território nacional, com espécies produtoras de frutos para consumo in natura e para uso na
medicina popular (CHATROU et al., 2004).
Diante dos danos da traça-do-tomateiro sobre essa cultura e da
necessidade no desenvolvimento de práticas de manejo menos agressivas ao meio
ambiente e ao mesmo tempo, mais sustentáveis a longo prazo, o uso de plantas com
atividade inseticida representa uma importante ferramenta no manejo integrado desse
inseto nas lavouras. Como não há estudos disponíveis sobre a bioatividade de derivados de
anonáceas e piperáceas para T. absoluta e tendo em vista potencial de plantas dessas
famílias botânicas, enquanto fonte de inseticidas botânicos, este trabalho teve como
 8

objetivo avaliar a bioatividade de extratos etanólicos de diferentes espécies e estruturas de

Annona e Piper, bem como identificar a classe de compostos ativos de Annona spp. sobre
T. absoluta.
 9

4 REVISÃO DE LITERATURA

4.1 Descrição geral sobre Tuta absoluta

Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae) foi originalmente descrita

em 1917 por Meyrick como Phthorimaea absoluta, com base em indivíduos coletados em
Huancayo no Peru. O gênero foi modificado sucessivamente para Gnorimoschema por
Clarke, em 1962, e para Scrobipalpula por Povolny, em 1975. Mais tarde, em 1987, essa
espécie foi transferida para o gênero Scrobipalpuloides, também por Povolny. O gênero
Tuta somente foi definido por Povolny em 1994 (BARRIENTOS et al., 1998).
A traça-do-tomateiro, como é conhecida popularmente, é uma
praga nativa da América do Sul, e tem como centro de origem o estreito território limitado
pelo Equador, Cordilheira dos Andes, Norte do Chile e litoral do Oceano Pacífico,
incluindo o arquipélago das Ilhas Galápagos (VARGAS, 1970). Na América do Sul, está
presente na Argentina, Bolívia, Brasil, Chile, Colômbia, Equador, Paraguai, Peru, Uruguai
e Venezuela (OEPP/EPPO, 2005). No Brasil, sua ocorrência foi oficialmente constatada
em 1980 em Jaboticabal, SP e já no ano seguinte, no Vale do Salitre em Juazeiro, BA
(MORAES; NORMANHA FILHO, 1982). Em apenas três anos após sua detecção, a traça-
do-tomateiro se dispersou por todas as regiões produtoras de tomate do país (SOUZA;
REIS, 1992). Em 2004, entrou para a lista de pragas quarentenárias da EPPO (Organização
de Proteção de Plantas da Europa e Mediterrâneo) e atualmente encontra-se presente em
 10

diversos países da Europa. A Espanha foi o primeiro país a notificar a presença de T.

absoluta em 2006, seguida da Itália, França, Marrocos, Portugal, Argélia e, mais
recentemente, do Reino Unido (URBANEJA et al., 2007; DESNEUX et al., 2011).
Características intrínsecas do inseto, como, alto potencial reprodutivo, hábito minador e
capacidade de colonização em hospedeiros secundários, contribuem para sua rápida
migração a outros locais. Entretanto, o grande volume de exportações de tomates
infestados com T. absoluta é considerado o principal facilitador dessa disseminação
(TROPEA; GARZIA, 2009a; OEPP/EPPO, 2009a). Especialistas sugerem que até 2016 T.
absoluta poderá estar presente em importantes países exportadores de tomate como os
Estados Unidos e a China (DESNEUX et al., 2011). Nos Estados Unidos, esse minador
tem maior probabilidade de se estabelecer principalmente em torno da costa do Golfo do
México (incluindo Florida), assim como em partes da Califórnia e Arizona, devido as
condições climáticas favoráveis ao desenvolvimento deste inseto (USDA, 2011).
O principal hospedeiro de T. absoluta no Brasil é o tomateiro
(Solanum lycopersicum L.). No entanto, o inseto pode atacar outras solanáceas de
importância econômica como, batata (Solanum tuberosum L.), pepino (Solanum muricatum
L.), fumo (Nicotiana tabacum L.) e berinjela (Solanum melongena L.) (VARGAS, 1970;
CAMPOS, 1976). Outras solanáceas silvestres, como maria-pretinha (Solanum
americanum Mill.), joá-bravo (Solanum aculeatissimum Jacq.) e estramônio (Datura
stramonium L.) são capazes de sustentar populações representativas da traça,
principalmente durante a entressafra (FRANÇA; CASTELO BRANCO, 1992). Na Europa,
a traça foi constatada em hospedeiros alternativos, como Physalis peruviana (L.) em casas
de vegetação na Sicília (TROPEA; GARZIA, 2009b), além de feijão (Phaseolus vulgaris
L.) (OEPP/EPPO, 2009b), Lycium sp. e Malva sp. em outras regiões da Itália
(CAPONERO, 2009). A praga também foi verificada em espécies selvagens de tomate,
como, Solanum lyratum (Trunb.), Solanum elaeagnifolium (Cav.), Datura ferox (L.),
Solanum habrochaites (S. Knapp & D. M. Spooner) e Solanum pennelli em outros países
europeus (Correll.) (OEPP/EPPO, 2005).
Os danos à cultura do tomateiro são causados pelo estágio larval da
traça, a qual se alimenta e se desenvolve do parênquima foliar, ramos, frutos e gemas
apicais, formando minas e galerias. Em folhas de tomateiro, os danos são causados pela
formação de minas no mesófilo, promovidos pela alimentação das lagartas, afetando a
capacidade fotossintética e consequentemente a produção final. Em ataques severos, as
 11

lagartas podem destruir completamente as folhas do tomateiro, causando secamento dos

folíolos e, consequentemente, a morte da planta. Nas hastes, ocorre a formação de galerias,
podendo alterar o desenvolvimento geral da planta. Os frutos podem ser atacados logo no
início da formação. Quando isso ocorre, as galerias formadas depreciam o produto para a
comercialização e favorecem a contaminação por patógenos (COELHO; FRANÇA, 1987).
Geralmente, T. absoluta ocorre durante todo o ano, danificando
todas as partes da planta em qualquer estádio de desenvolvimento. Sua flutuação
populacional é altamente influenciada pelas condições climáticas, sendo que as
combinações de baixa precipitação atmosférica com temperaturas elevadas e veranicos na
época chuvosa, favorecem a proliferação da praga nas principais regiões produtoras de
tomate no Brasil (IMENES et al., 1990; LOPEZ, 1991).

4.2 Aspectos taxonômicos e bioecológicos de T. absoluta

Esse inseto apresenta alto potencial reprodutivo, podendo ocorrer

de 10 a 12 gerações por ano (BARRIENTOS et al., 1998). Os adultos são pequenas
mariposas de coloração cinza-prateada com abdome marron-claro, medindo seis e 10 mm
de comprimento e envergadura, respectivamente (Figura 1). As asas anteriores apresentam
numerosos pontos escuros na parte dorsal e são franjadas apicalmente. As asas posteriores
são trapezoidais e franjadas nos bordos. A ausência de feixes de cerdas longas e rígidas na
margem anterior da asa posterior é a característica externa mais importante, sendo bastante
utilizada para a identificação da espécie (COELHO; FRANÇA, 1987). Entretanto, é
necessário analisar cuidadosamente as estruturas da genitália de um macho adulto para
diferenciar essa espécie de outros minadores da mesma família e que também atacam a
cultura do tomateiro, como por exemplo, Keiferia lycopersicella (Walsingham) e
Phthorimaea operculella (Zeller) (BRAMBILA et al., 2010). A atividade dos adultos se
concentra no início da manhã e ao entardecer, quando voam, acasalam e ovipositam.
Durante o dia, ocultam-se entre as folhas de tomateiro. A cópula ocorre principalmente nas
primeiras horas do dia e cada fêmea copula com apenas um macho. O casal permanece
unido com os corpos em sentido oposto, por um período que varia de alguns minutos a até
quatro horas (COELHO; FRANÇA, 1987).
O período de pré-oviposição varia de algumas horas a até quatro
dias e o de oviposição de três a 22 dias, sendo que em média 60% dos ovos são colocados
 12

Figura 1. Estágios de vida de T. absoluta: (A) ovos, (B) lagarta, (C) pupa, (D) adulto

nos primeiros cinco dias (IMENES et al., 1990; FERNÁNDEZ; MONTAGNE, 1990;
BOGORNI et al., 2003).
A oviposição inicia-se aproximadamente 24 horas após a cópula e
os ovos são distribuídos individualmente ou em pequenos grupos sobre as folhas (73%),
hastes (21%), sépalas (5%) e frutos verdes (1%) (ESTAY, 2000). Os ovos são depositados
principalmente nas folhas no terço superior das plantas (TORRES et al., 2001) e o número
varia de 96,6 a 130 ovos por fêmea podendo atingir até 300 ovos por fêmea (COELHO;
FRANÇA, 1987; UCHOA FERNANDES et al., 1995; BOGORNI et al., 2003). Os ovos
possuem formato elíptico e superfície reticulada, com 0,4 mm de comprimento. A
coloração varia de esbranquiçada a amarelo-claro no início, e amarelo intenso a marrom,
próximo à eclosão das lagartas (COELHO; FRANÇA, 1987) (Figura 1). A incubação dos
ovos dura em média quatro a cinco dias, com viabilidade variando de 78,7% a 95%
(COELHO; FRANÇA, 1987; HAJI et al., 1984; FERNÁNDEZ; MONTAGNE, 1990;
IMENES et al., 1990; BOGORNI et al., 2003). A qualidade do alimento e o tipo de dieta
 13

fornecido a T. absoluta interferem na fecundidade dos ovos. Imenes et al. (1990)

verificaram que fêmeas alimentadas com solução de mel a 10% apresentaram maior
fecundidade (261,71 ovos) do que as que não receberam a solução de mel (147,71 ovos).
Mihsfeldt e Parra (1999) constataram que lagartas alimentadas em dieta artificial
apresentavam alta variabilidade em relação à fecundidade, podendo depositar de 20 a 180
ovos por fêmea.
As lagartas medem cerca de seis a nove mm de comprimento e são
caracterizadas pela placa protoráxica escura em forma de meia lua. Sua coloração varia
conforme o desenvolvimento, sendo amareladas no primeiro ínstar, esverdeadas nos
ínstares intermediários e verde-escuras com o dorso púrpura-avermelhado, nos ínstares
finais (Figura 1). Apresentam quatro ínstares larvais, independentemente do genótipo de
tomateiro fornecido como alimento e da temperatura usada para criação (GIUSTOLIN et
al., 2002; BOGORNI et al., 2003). Logo após a emergência, as lagartas penetram no
parênquima foliar, nos frutos, próximo ao cálice ou nos ápices das hastes, onde
permanecem por um período variável, formando galerias irregulares no mesófilo foliar. A
penetração no tecido da planta ocorre em cerca de 30 minutos após à emergência das
larvas. Em todos os ínstares, o consumo do mesófilo foliar cresce em escala exponencial;
entretanto, no quarto ínstar, cerca de 80% do total de alimento requerido no estágio é
consumido, garantindo reservas para os estágios subsequentes (BOGORNI et al., 2003). A
duração da fase larval varia principalmente em função da temperatura, podendo ser de
aproximadamente 27 dias a 14°C ou de aproximadamente 12 dias a 25°C (QUIROZ, 1976;
COELHO; FRANÇA, 1987; HAJI et al., 1988; IMENES et al., 1990; FERNÁNDEZ;
MONTAGNE, 1990; MIHSFELDT; PARRA, 1999; GIUSTOLIN et al., 2002; BOGORNI
et al., 2003). A viabilidade larval também varia com a temperatura; entretanto, o tipo de
alimento é um fator limitante para essa variável. Mihsfeldt e Parra (1999) forneceram
alimentação artificial e natural e verificaram viabilidades larvais de 29 a 91,6%,
respectivamente, sob temperatura de 25°C. Em geral, sob dieta natural, a traça apresenta
elevados percentuais de viabilidade em todas as fases de desenvolvimento (IMENES et al.,
1990).
As pupas apresentam coloração esverdeada no início e marrom-
escura próximo à emergência dos adultos (COELHO; FRANÇA, 1987). Em condições
naturais, as pupas podem se fixar em qualquer parte da planta; entretanto, isso ocorre mais
frequentemente no solo. No processo de pupação pode ocorrer a formação de um casulo
 14

esbranquiçado, contendo detritos, ou permanecem nuas, quando formadas em galerias ou

no interior de frutos (COELHO; FRANÇA, 1987).
O estágio pupal tem duração média de sete a nove dias à
temperatura de 25°C, com viabilidade superior a 80% (COELHO; FRANÇA, 1987;
FERNÁNDEZ; MONTAGNE, 1990; BOGORNI et al., 2003). Em temperaturas inferiores,
ocorre um prolongamento da fase pupal, que pode se estender por até 19 dias (QUIROZ,
1976). O seu ciclo biológico se completa entre 76,3 dias a 14°C e 23,8 dias a 27°C
(BARRIENTOS et al., 1998).
Quanto à diferença entre os sexos, verificou-se que a duração do
período pupal das fêmeas é menor que a dos machos (FERNÁNDEZ; MONTAGNE, 1990;
BOGORNI et al., 2003). A sexagem da traça é feita através das pupas, sendo que o quinto
e sexto segmentos são móveis nos machos, enquanto que nas fêmeas a mobilidade existe
do quinto ao sétimo segmentos. Nas fêmeas, o cremaster invagina-se, formando dois
lóbulos, e nos machos, ele dá origem ao orifício anal. O poro genital no macho localiza-se
no nono e na fêmea no oitavo e nono segmento (Figura 2). Quanto à razão sexual, diversos
trabalhos mostram a proporção em média de um macho para 1,8 fêmeas (COELHO;
FRANÇA, 1987; HAJI et al., 1988).

Figura 2. Desenho esquemático da pupa de T. absoluta; vista frontal: detalhes do abdome

do macho (A) e da fêmea (B).
 15

4.3 Pesquisas envolvendo plantas inseticidas no manejo de T. absoluta

Nos últimos 30 anos verifica-se um crescente interesse nos estudos

na área de inseticidas botânicos (ISMAN; GRIENEISEN, 2014). Grande parte dos estudos
realizados no mundo concentra-se com a espécie Azadirachta indica, conhecida
popularmente como nim (SCHMUTTERER, 1990; NISBET, 2000; MUSABYIMANA et
al., 2001). O nim pode ser empregado nas formas de óleo (misturado com emulsificantes),
pó seco, extratos aquosos ou orgânicos (metanólico, etanólico, acetônico, clorofórmico,
hexânico), constituindo formulações comerciais ou semi-comerciais (SAXENA, 1989).
Trindade et al. (2000) estudaram o efeito tóxico do extrato
metanólico de amêndoas das sementes de nim sobre ovos e lagartas da traça-do-tomateiro e
obtiveram 100% de mortalidade larval no sexto dia de avaliação, com a menor
concentração testada no estudo (2000 mg L-1). Entretanto, a viabilidade e o período de
incubação de ovos de T. absoluta não foram afetados pelo extrato.
Gonçalves-Gervásio e Vendramim (2007) testaram o efeito de
extratos aquosos de sementes de nim sobre lagartas de T. absoluta em diferentes formas de
aplicação e verificaram que em todas as vias testadas (contato, sistêmico e translaminar) as
mortalidades foram superiores a 90% na maior concentração usada, 10g 100 ml-1 de água.
Boiça Júnior et al. (2007), visando ao controle de pragas tardias do
tomateiro, testaram a eficiência do óleo de nim seguindo os preceitos do Manejo Integrado
de Pragas (MIP) em relação ao controle convencional, com aplicações em intervalos de 3 a
6 dias + o MIP convencional. Os autores verificaram que tanto o MIP convencional como
o MIP-Nim foram eficientes no controle das pragas tardias do tomateiro, quando a pressão
da população era baixa. Além disso, a produção de tomate obteve incrementos de até 74%
e o número de pulverizações foi reduzido em até 77%, em relação ao controle
convencional.
Em trabalho mais recente, Tomé et al. (2013) utilizaram uma
formulação comercial à base de nim (Azamax®, 12 mg i.a./ L) e investigaram a toxicidade
aguda sobre duas populações da traça-do-tomateiro, além de seus efeitos subletais. Os
autores verificaram que esse produto causou elevada mortalidade sobre lagartas de T.
absoluta, afetando também o comportamento de adultos quanto à oviposição e de lagartas
quanto à preferência pelo substrato utilizado para alimentação.
Dentro das perspectivas para desenvolvimento de formulações
estáveis e com alto efeito sobre organismos alvo, a nanotecnologia tem se revelado uma
 16

importante ferramenta, considerando sua aplicação no desenvolvimento de produtos

contendo ingredientes ativos em escala nanométrica (FERREIRA et al., 2012). Esses
autores avaliaram a bioatividade de 22 nanoformulações de nim sobre o desenvolvimento
de T. absoluta e constataram que as nanoformulações NC40 (nanocápsulas de PHB3 +
óleo/extratos de nim + Tween) em suspensão aquosa e NC40 (nanocápsulas de PHB+
óleo/extratos de nim + Tween) na forma de pó afetaram o desenvolvimento do inseto.
Outra espécie botânica pertencente à família das meliáceas e que
vem sendo muito estudada é Melia azedarach (L.), conhecida como cinamomo. Essa
espécie destaca-se pela ampla distribuição geográfica no Brasil, favorecendo sua utilização
como inseticida. Outro fator importante é que esta planta possui composição química
semelhante à do nim, também produzindo azadiractina, além de outros limonoides como,
por exemplo, as azedarachinas, salaninas e meliacarpininas (HUANG et al., 1996). Outros
derivados de M. azedarach podem provocar diferentes reações nos insetos, agindo como
inibidores de alimentação, redutores de crescimento e fecundidade, ou causando alterações
morfogenéticas e comportamentais (BREUER et al., 2003).
Brunherotto e Vendramim (2001) testaram o efeito de extratos
aquosos (0,1%) de diferentes estruturas de M. azedarach sobre o desenvolvimento da
traça-do-tomateiro. De modo geral, todos os extratos afetaram negativamente o
desenvolvimento do inseto; entretanto, o extrato aquoso de folhas se destacou dentre os
demais. Em outro estudo, Brunherotto et al. (2010) avaliaram o efeito de extratos aquosos
de folhas de M. azedarach e de sementes de nim, associados a três genótipos de tomateiro
sobre o desenvolvimento, reprodução e longevidade de T. absoluta. Os autores verificaram
que apenas um genótipo resistente (LA444-1) e os extratos de M. azedarach e de sementes
de A. indica afetaram adversamente o desenvolvimento do inseto. Não foi constatado
sinergismo ou antagonismo com a utilização associada de planta resistente e extrato de
plantas inseticidas, observando-se apenas efeito aditivo. Ainda na família das meliáceas,
vários pesquisadores têm isolado limonoides de diferentes espécies do gênero Trichilia e
demonstrado sua atividade sobre insetos, incluindo efeitos fagodeterrentes e reguladores de
crescimento (NAKATANI et al., 1981; XIE et al., 1994). De acordo com Thomazini et al.
(2000), extratos aquosos das folhas e ramos de T. pallida prejudicam o desenvolvimento de
T. absoluta; entretanto, o extrato das folhas destaca-se como o mais ativo sobre esse inseto.
O modo de ação dos extratos de folhas de T. pallida foram
avaliados por Gonçalves-Gervásio e Vendramim (2004). Os autores avaliaram o efeito
 17

translaminar, sistêmico e tópico de extratos das folhas dessa meliácea, em comparação com
o extrato aquoso das sementes de nim, sobre T. absoluta. Verificou-se que os extratos
aquosos de sementes de nim provocaram alta mortalidade larval, independentemente da
forma de aplicação. Embora em menor intensidade, o extrato clorofórmico de folhas de T.
pallida em concentrações maiores do que 5% também prejudicaram o desenvolvimento
dessa praga, sendo o efeito translaminar mais pronunciado que os demais.
Visando identificar frações promissoras como fontes de substâncias
inseticidas, Cunha et al. (2005) avaliaram extratos aquosos e não aquosos de T. pallida
sobre T. absoluta. Como resultado, a fração em metanol, juntamente com aquela em
acetato de etila, foram consideradas altamente promissoras como fontes de substâncias
inseticidas contra o inseto. Na sequência dos estudos, Cunha et al. (2008) também
avaliaram substâncias isoladas a partir do extrato em diclorometano de T. pallida (0,1 %) e
verificaram que o triterpeno 24-metilenocicloarta-3β-ol e o esteroide 24-metileno-3,22-
diidroxicolesterol, ambos de folhas, juntamente com o limonoide gedunina, de frutos,
apresentaram maior atividade inseticida sobre lagartas de T. absoluta.
O uso de óleos essenciais como inseticidas botânicos vem
ganhando mercado, principalmente nos Estados Unidos e na Europa, devido à
possibilidade de serem usados em rotação ou em combinação com outros protetores de
culturas, incluindo pesticidas convencionais ou de origem microbiana (ISMAN, 2000)
Umpiérrez et al. (2012) avaliaram o efeito inseticida do óleo
essencial extraído de duas espécies da família Asteraceae, Eupatorium buniifolium (Hook.)
e Artemisia absinthium (L.), sobre duas pragas importantes do tomateiro, incluindo T.
absoluta. Os autores verificaram efeito inseticida sobre T. absoluta tanto em contato direto
com o inseto via aplicação em papel filtro, como na forma de liberação de vapores.

4.4 Família Annonaceae

A família Annonaceae é constituida por cerca de 100 gêneros e

aproximadamente 2.300 espécies (CHATROU et al., 2012). As plantas dessa família
possuem características primitivas, como gineceu apocárpico, estames livres e numerosos,
distribuídos em forma de espiral em torno do receptáculo floral. Além disso, o processo de
polinização é realizado predominantemente por besouros (LEBOEUF et al., 1980).
Apresentam-se amplamente distribuídas, principalmente em regiões tropicais. No Brasil,
existem 29 gêneros e 386 espécies de Annonaceae, distribuídas principalmente na
 18

Amazônia, mas também em outros biomas, como a Mata Atlântica e o Cerrado. É uma
importante família de plantas constituintes da flora nacional, com espécies produtoras de
frutos para consumo in natura e para uso na medicina popular (CHATROU et al., 2004)
Nas últimas décadas, os estudos fitoquímicos de espécies da família
Annonaceae vêm se intensificando, devido a descoberta de substâncias com alto potencial
para a medicina, como os alcaloides benzilisoquinolínicos e as acetogeninas. As
acetogeninas constituem uma série de produtos naturais isolados exclusivamente da família
Annonaceae, a partir dos gêneros Annona, Asimina, Xilopia, Goniothalamus, Disepalum,
Polyalthia, Porcelia, Saccopetalum e Uvaria e, mais recentemente, de Artabotrys,
Dasymaschalon, Ophrypetalum e Sassopetalum (BERMEJO et al., 2005; RAINER, 2007).
Atualmente, existem 417 acetogeninas identificadas, com predominância dos compostos
descritos para o gênero Annona. São classificadas com base nas características estruturais
presentes, como a presença de um esqueleto comum contendo uma cadeia longa de
carbonos (C32 ou C34) sustentando um anel γ-lactônico terminal e ácidos graxos não
ramificados. Esses compostos possuem ampla atividade biológica com efeitos citotóxicos,
antitumoral, anti-parasítico, pesticida, antimicrobiano e imunossupressivo (RATNAYAKE
et al., 1993; MCLAUGHLIN et al., 1997; MATSUMOTO et al., 2010; FERREIRA et al.,
2013). Estudos sobre o mecanismo de ação mostram que as acetogeninas são potentes
inibidores respiratórios, superiores àqueles inibidores clássicos, como a rotenona e a
piericidina A. Essas substâncias agem como inibidoras do complexo I (NADH -
ubiquinona oxidoredutase) na cadeia transportadora de elétrons mitocondrial, promovendo
apoptose e levando à redução das taxas respiratórias e cardíaca (GALLARDO et al., 2000;
DEGLI ESPOSTI et al., 1994).

4.4.1 Gênero Annona

O gênero Annona possui 200 espécies neotropicais e quatro

africanas (CHATROU et al., 2012) e no Brasil está representado por 80 espécies
(CHATROU et al., 2004). É considerado muito importante economicamente,
principalmente pela produção de frutos de grande interesse comercial. As espécies de
maior interesse são a cherimóia (Annona cherimola Mill.), a pinha ou fruta-do-conde
(Annona squamosa L.), atemóia (híbrido: A. squamosa x A. cherimola) e a graviola (A.
muricata L.) (LORENZI; MATOS, 2002).
 19

A quantidade de anonáceas comercializadas nas principais centrais

de abastecimento está crescendo e se concentra principalmente no CEAGESP (61%). As
informações coletadas pelo SIEM do CEAGESP mostram que entre 2011 e 2012 houve um
crescimento da oferta de atemóia (35%) e de graviola (32%) (CEAGESP, 2012). No Brasil,
a cherimóia tem sido menos cultivada devido à sua exigência por temperaturas baixas; as
demais apresentam áreas cultivadas em diversas regiões do país, a fim de atender à
demanda dos mercados de frutas frescas (pinha ou atemóia) e processadas (graviola)
(BRAGA SOBRINHO, 2014).
Annona muricata é uma árvore de clima tropical, distribuída nas
Américas, África e Sudeste Asiático. No Brasil, segundo maior produtor de graviola do
mundo, observou-se que, a partir de meados da década de 1990, essa fruta passou a ter
maior destaque entre as frutas tropicais brasileiras, em função da boa aceitação no mercado
nacional, tanto por parte do consumidor como por parte das indústrias de processamento de
polpa (SAO JOSE et al., 2014). Seu cultivo é economicamente relevante nas regiões Norte,
Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste, destacando-se os Estados da Bahia, Alagoas, Ceará,
Paraíba, Pernambuco e Pará (LIMA, 2004). Segundo a Agência de Defesa Agropecuária da
Bahia (ADAB), a produção de graviola para o estado foi estimada em oito mil toneladas,
com perspectivas de crescimento em função do aumento nas áreas plantadas (ADAB,
2010).
A graviola é considerada uma cultura típica de pequenas áreas, com
pomares ao redor de três hectares, com predomínio de agricultores familiares. A planta
pode atingir até 10 metros de altura e possui casca aromática, folhas alternas e pecioladas,
flores axilares, solitárias, sub‐globosas e amareladas ou cor de creme. O fruto é uma baga,
de formato irregular e elipsóide, com aproximadamente 30 cm de comprimento e 12 cm de
largura, com epiderme verde‐escura, espessa e areolada. A polpa é branca sucosa,
lactescente e um pouco fibrosa, com até 500 sementes de coloração castanha ou preta
(SACRAMENTO, 2009). Os frutos podem ser ofertados ao longo de todo o ano. A alta
perecibilidade da graviola é um dos maiores entraves à comercialização da fruta fresca; por
isso é considerada uma fruta típica da industrialização. Pode ser processada na forma de
suco natural, concentrado e néctar. A extração de suas sementes, geralmente consideradas
resíduos na produção de polpa, poderia ser utilizada em preparações inseticidas
potencialmente úteis (MCLAUGHLIN et al., 1997). Sob o ponto de vista econômico, uma
indústria que processa 500 toneladas de polpa consegue extrair 35 toneladas de sementes, o
 20

que representa o fornecimento de matéria-prima a custo zero (GRZYBOWSKI et al.,

2013).
Diversos estudos têm sido realizados com o intuito de avaliar o
efeito inseticida de diversas espécies do gênero (LEATEMIA; ISMAN, 2004a, 2004b;
DHARMASENA et al., 2001; SEFFRIN et al., 2010). Até o momento, aproximadamente
75 acetogeninas foram isoladas de folhas, sementes, casca e raízes de A. muricata
(BERMEJO et al., 2005). Anonacina é um exemplo de acetogenina extraída de sementes
de A. muricata. Testes de campo com extratos padronizados dessa espécie botânica
indicam eficiência contra uma variedade de insetos-praga. Além disso, eles agem de forma
sinérgica quando combinados com outros produtos vegetais à base de piretro, nim e
piperáceas (MCLAUGHLIN et al., 1997; GRZYBOWSKI et al., 2013). González-
Esquinca et al. (2012) avaliaram o efeito de extratos aquosos e etanólicos de folhas e ramos
de três espécies de Annona sp., incluindo A. muricata, sobre a fase larval de Anastrepha
ludens (Loew). Os autores verificaram que os extratos aquosos de folhas de A. muricata
foram mais tóxicos do que os extratos em etanol, com mortalidades de lagartas de 84,3%
na concentração de 2000 µg ml-1. Além disso, com o aumento no tempo de exposição dos
extratos (24h - 72h), maiores foram os índices de mortalidade larval.
A toxicidade de diferentes acetogeninas purificadas também tem
sido estudada (COLOM et al., 2008; BLESSING et al., 2010). Estudos alertam para
elevada toxicidade em testes realizados em laboratório com animais. Entretanto, o seu
efeito emético é um fator de segurança, que diminui os riscos de intoxicação a seres
humanos. Para extratos padronizados contendo acetogeninas, a toxicidade sobre mamíferos
é improvável. González-Coloma et al. (2002) verificaram menor atividade das
acetogeninas esquamosinas e anoninas sobre células extraídas do tecido de mamíferos
comparativamnete a células epiteliais de insetos, devido a diferenças na permeabilidade da
membrana. Entretanto, sua elevada complexidade estrutural dificulta o seu registro frente
aos órgãos responsáveis nos Estados Unidos e outros países. Por outro lado, a grande
quantidade de sementes resultantes da indústria de suco de graviola no sudeste da Ásia
pode ser utilizada para a produção de inseticidas naturais caseiros em pequena escala
(ISMAN, 2003).
Além das acetogeninas, outros compostos como alcalóides são
encontrados em grande quantidade na graviola (LEBOEUF et al., 1981). Diversos estudos
comprovam sua importância medicinal, com efeitos antiviral (PADMA et al., 1998),
 21

antiparasitário (FERREIRA et al., 2013), anti-leishmaniose (JARAMILLO et al., 2000;

VILA-NOVA et al., 2013), anti-inflamatório (HAMID et al., 2012) e anticancerígeno
(TORRES et al., 2012).
Outras espécies pouco conhecidas e endêmicas no Brasil são
Annona sylvatica A. St.-Hil [descrita antes como Rollinia sylvatica (A. St.-Hil) Mart ] e a
falsa-graviola, A. montana Macfad. A. sylvatica é vulgarmente conhecida como araticum,
araticum-do-mato, cortiça ou cortiça-amarela e ocorre desde Pernambuco até o Rio Grande
do Sul. É relativamente frequente na Floresta Atlântica, nas florestas semidecíduas, nas
matas de altitude e nas restingas (LORENZI et al., 2006; MAAS et al., 2012). A falsa-
graviola é originária da América Tropical, compreendendo a América Central, América do
Sul até o sul do Brasil, sendo muito dispersa por todo o território americano tropical e,
devido à sua relativa resistência a temperaturas mais baixas, cultiva-se em condições
subtropicais, onde é fundamentalmente utilizada como porta-enxerto para outras espécies
do mesmo gênero, produzindo frutos de melhor qualidade (FERRÃO, 1999). Na medicina
popular, as sementes de A. montana são utilizadas contra infecções parasitárias do couro
cabeludo e, junto com as folhas em infusão, servem para combater a diarréia e induzir a
menstruação (SANO; ALMEIDA, 1998).
Diversos outros estudos já foram realizados com espécies do
gênero Annona, comprovando a atividade inseticida sobre diferentes insetos-praga. Colom
et al. (2007) avaliaram os efeitos inseticidas e antialimentares de acetogeninas provenientes
do extrato metanólico de sementes de A. cherimolia sobre Spodoptera frugiperda (J.E.
Smith). Os autores concluíram que, das nove acetogeninas incorporadas na dieta artificial e
fornecidas diariamente a lagartas de S. frugiperda, apenas a acetogenina esquamocina
apresentou mortalidade elevada (100%). Para pupas, a mortalidade foi superior a 80%
para todas as acetogeninas. Com relação aos efeitos antialimentares, apenas a acetogenina
esquamocina diferiu do controle, apresentando lagartas com baixo peso, sugerindo ação
redutora na eficiência na conversão de alimento em biomassa.
Colom et al. (2008) avaliaram a toxicidade aguda e crônica de
acetogeninas isoladas de Annona cherimolia e A. montana sobre Oncopeltus fasciatus
(Dallas). No ensaio de aplicação tópica sobre ninfas do inseto, os autores observaram
mortalidades próximas a 100% com as acetogeninas esquamocina e molvizarina nas
concentrações de 0,1 e 0,25 µg ninfa-1, respectivamente. Os efeitos crônicos sobre adultos
 22

foram observados com as anonacinas na concentração de 10µg ninfa -1, com mortalidades
acima de 50%.
Blessing et al. (2010) avaliaram os efeitos tóxicos e anti-
alimentares de acetogeninas extraídas de folhas e ramos frescos de A. montana sobre S.
frugiperda. As acetogeninas cis-anonacina-10-one, densicomacina-1, gigantetronenina
apresentaram forte efeito antialimentar a uma concentração de apenas 100 mg L-1.
Ribeiro et al. (2013) avaliaram a bioatividade de extratos e frações
obtidos de diferentes estruturas (folhas, ramos e sementes) de Annona mucosa Jacq. sobre
Sitophilus zeamais Motsch. Os resultados preliminares mostraram que as frações em
hexano e diclometano apresentaram as maiores médias de mortalidade sobre S. zeamais.
Em seguida, os autores selecionaram a fração em hexano para os particionamentos,
verificando que as frações hidroalcoólicas e em diclorometano foram mais promissoras.
Segundo os autores, os compostos majoritários encontrados nessas frações e que revelaram
maior bioatividade sobre S. zeamais foram as acetogeninas e o alcaloide isoquinolina.

4.5 Família Piperaceae

A família Piperaceae pertence à ordem Piperales e constitui-se

como umas das mais primitivas famílias dentre as angiospermas, com ampla distribuição
nas regiões tropicais e subtropicais do mundo (SOLTIS et al., 1999; FRODIN, 2004).
Plantas dessa família podem apresentar hábito herbáceo, arbustivo ou arbóreo e são
consideradas pioneiras, colonizando principalmente clareiras e bordas da floresta
(YUNCKER, 1974). Atualmente, é composta por quatro gêneros que podem ser divididos
em dois grupos; o mais representativo com Piper e Peperomia, com cerca de 2.000 e 1.700
espécies, respectivamente; com um número menor de espécies, Zippelia e Manekia
(antigamente denominado de Sarcorhachis), formam o outro grupo (WANKE et al.,
2007). No Brasil, ocorrem cerca de 450 espécies da família Piperaceae, sendo 265 espécies
de Piper e 166 de Peperomia (YUNCKER, 1972, 1973, 1974).

4.5.1 Gênero Piper

O gênero Piper apresenta grande importância econômica, sendo

Piper nigrum (L.) a espécie mais conhecida comercialmente, cujos frutos são fonte natural
da pimenta-do-reino (SRINIVASAN, 2007). Essa especiaria é utilizada mundialmente e
seu cultivo comercial é de grande importância para países como Índia, Indonésia, Vietnã,
 23

Malásia e Brasil (SIMPSON; OGORZALY, 1995). Várias espécies dessa família têm sido
utilizadas na medicina popular no tratamento de diversas doenças, principalmente em
países do continente africano e na América do Sul. Atualmente, o gênero Piper possui
aproximadamente 2.000 espécies; entretanto, somente 112 foram investigadas
fitoquimicamente, revelando a presença de 667 metabólitos secundários diferentes (DYER;
PALMER, 2004). A enorme variedade de compostos secundários encontrados em plantas
do gênero Piper justifica o grande potencial dessas plantas na busca por novos inseticidas
(MIYAKADO et al., 1989). O estudo fitoquímico do gênero Piper tem sido bem
documentado por diversos autores (PARMAR et al., 1998; TRIPATHI et al., 1995; DYER;
PALMER, 2004). Segundo Dyer e Palmer (2004), desde as revisões sobre o gênero
elaboradas por Sengupta e Ray (1987) e Parmar et al. (1997), apenas 28 novas espécies
foram investigadas e 69 novos compostos descobertos. Ainda segundo esses autores,
apenas cerca de 10% de todas as espécies de Piper foram fitoquimicamente investigadas.
Entre os compostos mais encontrados, destacam-se os alcalóides, amidas, lignanas,
neolignanas, terpenos, propenilfenol, além de mais de 146 compostos diversos (PARMAR
et al., 1997). Os metabólitos secundários têm sido encontrados em todas as partes da
planta.
O modo de ação desses compostos sobre insetos é variado,
incluindo toxicidade por contato, além de propriedades repelentes e anti-alimentares.
Como espécies consideradas promissoras na busca de compostos com atividade inseticida,
destacam-se P. nigrum, P. guineense Schum., P. tuberculatum Jacq., P. hispidinervum C.
DC. e P. aduncum L. (NAVICKIENE et al., 2000; SCOTT et al., 2004, 2005; FAZOLIM
et al., 2007).
Estudos biomonitorados têm sido realizados por diversos
pesquisadores com o intuito de identificar piperáceas com potencial inseticida
(MIYAKADO et al., 1989; PARMAR et al., 1997; PARK et al., 2002; SCOTT et al.,
2005). O efeito inseticida de extratos botânicos de espécies do gênero Piper tem sido
correlacionado com a concentração de piperamidas. Essas amidas são abundantes nesse
gênero e apresentam grande importância ecológica e econômica. Uma das mais
importantes é a piperina, isolada de mais de 20 espécies de Piper, principalmente das
sementes de P. nigrum (PARMAR et al., 1997).
Park et al. (2002) estudaram as propriedades inseticidas de amidas
extraídas de P. nigrum e encontraram forte efeito larvicida no extrato metanólico de frutos
 24

sobre os mosquitos Culex pipiens pallens (Coquillett), Aedes aegypti (L.) e A. togoi
(Theobald).
Dyer et al. (2003) testaram o efeito inseticida de três amidas
isoladas de P. cenocladum (C. DC) sobre S. frugiperda. Os autores observaram que a
mistura dessas amidas provocaram um decréscimo no peso pupal, na sobrevivência e um
aumento no tempo de desenvolvimento.
A atividade inseticida de plantas desse gênero vem sendo testada
principalmente em pragas de grãos armazenados, onde seu controle se mostrou eficiente
para Callosobruchus chinensis (L.), Sitophilus oryzae (L.), Rhyzopertha dominica (Fabr.),
Acanthoscelides obtectus (Say.) e Callosobruchus maculatus (F.) (MIYAKADO et al.,
1979, 1980; SIGHAMONY et al., 1986; BAIER; WEBSTER, 1992; MBATA et al., 1995;
KÉÏTA et al., 2000).
Piper mollicomum Kunth., conhecida como jaborandi-manso ou
simplemente jaborandi, é um arbusto pequeno de 1,0 e 1,5 m de altura. No território
nacional se encontrado nos estados de São Paulo, Minas Gerais, Rio de Janeiro, Espírito
Santo, Santa Catarina, Ceará, Paraíba, Pernambuco, Mato Grosso e Goiás (GUIMARÃES;
GIORDANO, 2004). Na medicina popular, os frutos dessa espécie são utilizados para o
tratamento de problemas estomacais. A bioatividade de P. mollicomum somente foi
avaliada por Lago et al. (2007) sobre fungos do gênero Cladosporium. Esses autores
realizaram um fracionamento bioguiado do extrato de folhas de P. mollicomum e
verificaram forte inibição do crescimento das espécies estudadas na fração 7-methoxy-5,4'-
dihydroxy-flavanone.
Piper glabratum Kunth., conhecida popularmente como
pariparoba, é uma espécie que contém atividade antiparasítica devido à presença de
derivados de ácido benzoico (FLORES et al., 2008). Assis et al. (2013) avaliaram a
composição fitoquímica do óleo essencial de folhas de P. glabratum, além de sua
toxicidade sobre o microcrustáceo Artemia salina (L.) e verificaram a presença de 27
constituintes, sendo os fenilpropanoides os maiores constituintes, como eugenol (0,6%),
apiole (6,2), β-cariofileno (14,6%) e longiborneol (12%). O óleo de P. glabratum
apresentou elevada toxicidade a A. salina, com CL50= 45,61 µg ml-1.
Para Piper amalago (L.) var. medium (Jacq.) Yunck existe apenas
um trabalho na literatura descrevendo a composição química de seu óleo essencial extraído
a partir de frutos verdes e maduros. A análise do óleo essencial revelou a predominância de
 25

sesquiterpenos oxigenados e 65 compostos foram identificados. Piper amalago (L.) é

utilizada na medicina popular como anti-inflamatório, analgésico, anti-térmico, vermífugo
e diurético (NOVAES et al., 2014). A composição química das raízes dessa espécie mostra
a presença, principalmente, de sesquiterpenos, pirrolidinas e isobutilamidas com efeitos
antileishmanicida (CARRARA et al., 2013).
Lopes et al. (2012) realizaram um estudo neurocomportamental
com ratos para avaliar o efeito de extratos metanólicos de folhas de P. amalago. Os autores
verificaram que o extrato de P. amalago afetou o sistema nervoso central dos ratos,
diminuindo sua locomoção e exploração do ambiente, mas sem induzir toxicidade
genética.
Piper mikanianum (Kunth) Steudel, conhecida popularmente como
pariparoba e jaborandi, nativa do Rio Grande do Sul e cujas folhas são empregadas como
antisséptico, hepatoprotetor e emenagogo (LORENZI, 2000; GARLET; IRGANG, 2001;
MENGUE et al., 2001; SOUZA et al., 2004; DICKEL et al., 2007). Análises dos
compostos químicos levaram a identificação de biciclogermacreno, β-cariofileno, limoneno
e safrol (PARMAR et al., 1997; DICKEL et al., 2007).
 26

5 MATERIAL E MÉTODOS
Os ensaios foram realizados nos Laboratórios de Resistência de
Plantas a Insetos e Plantas Inseticidas – LARESPI, junto ao Departamento de Proteção
Vegetal da Faculdade de Ciências Agronômicas (FCA/UNESP), Botucatu, SP. As
extrações do material vegetal coletado e os fracionamentos foram realizados no
Laboratório de Plantas Inseticidas do Departamento de Entomologia e Acarologia da
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ), em Piracicaba, SP. As
análises cromatográficas e espectroscópicas foram feitas no Departamento de Física e
Química da Universidade de São Paulo (USP), em Ribeirão Preto, SP e no Laboratório de
Química de Produtos Naturais da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), em São
Carlos, SP.

5.1 Criação estoque de T. absoluta e formação de plantas de tomate

A criação de T. absoluta foi iniciada com lagartas coletadas em

áreas de cultivo de tomate, em Botucatu, SP, (22º 40' 31"S, 48º25' 37" W), sendo a espécie
posteriormente identificada pelo Dr. Vitor O. Becker, diretor do Instituto Uiraçu, BA. A
criação foi estabelecida e mantida em condições controladas (T: 25 ± 2°C, U.R: 65 ± 10%
e fotofase de 12 horas), e os insetos alimentados com folhas de tomate, Solanum
lycopersicum (L.), cultivar Santa Clara. Foram utilizadas gaiolas entomológicas de
 27

alumínio (40 x 40 x 60 cm), revestidas com tela antiafídeo nas laterais e acrílico na parte
frontal e no topo, para obtenção de posturas e criação de lagartas. A manutenção da criação
consistiu em fornecer periodicamente folhas de tomateiro para alimentação das lagartas. As
folhas secas (mesófilo totalmente consumido pelas lagartas) contendo lagartas de quarto
ínstar, pré-pupas e pupas foram retiradas das gaiolas e colocadas em potes de acrílico (3,5
L) recobertos com tecido voil para a pupação e produção de adultos. Para os adultos era
fornecido uma solução de mel a 10% (p/v) a cada dois dias e uma folha de tomateiro
imersa em água como substrato para a oviposição, a cada três dias. As folhas com os ovos
eram trasferidos para a gaiola de criação de lagartas.
Para a manutenção da criação e fornecimento de plantas para os
ensaios, mudas de tomateiro foram produzidas continuamente em ambiente protegido, sem
a aplicação de inseticidas. Para a obtenção das plântulas foram utilizadas bandejas de
isopor com 120 células e substrato agrícola Bioplant Plus (Bioplant, Nova Ponte, MG).
Após 20 dias da semeadura, as plântulas eram transferidas para vasos plásticos (2,5 L)
contendo uma mistura de terra; substrato (1:1) e adubação recomendada para a cultura
(FIGUEIRA, 2008). Os tratos culturais foram feitos periodicamente e, a cada bandeja
transplantada uma nova era semeada.

5.2 Coleta das espécies estudadas e preparo dos extratos etanólicos

As coletas foram feitas nos anos de 2011 e 2012 no Campus da

Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, ESALQ/USP, Piracicaba, SP
(22º42‟28,2” S; 47º37‟59.4”) e no município de Erval Seco, RS (27º25‟41,8” S;
53º34‟11,2”). Uma amostra das espécies coletadas foi depositada no Herbário ESA, do
Departamento de Ciências Biológicas da ESALQ/USP (Tabela 1). As espécies de
anonáceas foram identificadas pelo Prof. Renato Mello-Silva, do Instituto de
Biociências da Universidade de São Paulo, USP e as piperáceas pela Pesquisadora Elsie
Franklin Guimarães, do Jardim Botânico do Rio de Janeiro, RJ.
Para a preparação dos extratos, as estruturas coletadas foram
levadas ao laboratório para secagem em estufa de ar circulante a 40 °C por um período de
48 a 72 horas. Após esse processo, os materiais vegetais foram triturados em moinho de
facas, para obtenção de um pó fino e em seguida armazenados em potes de vidro vedados
em câmara fria. As extrações foram feitas pelo processo de maceração, utilizando-se etanol
como solvente, na proporção de 1:5 (p/v). O material vegetal foi mantido por três dias no
 28

Tabela 1. Dados de coleta das espécies botânicas avaliadas

Estruturas Data de Número de

Espécies Local de coleta
coletadas coleta voucher*
Folhas e Campus ESALQ/USP, Piracicaba, SP
Annona montana Macfad. 21/03/11 121203
sementes (22º42‟28,2” S; 47º37‟59.4” O; altitude: 537 m)
Folhas e Campus ESALQ/USP, Piracicaba, SP
Annona muricata L. 12/04/11 123317
sementes (22º42‟25,4” S; 47º37‟43,9” O; altitude: 576 m)
Folhas e Av. Emilio Falcão, Erval Seco, RS
Annona sylvatica A. St.-Hil. 25/04/11 121205
sementes (27º25‟41,8” S; 53º34‟11,2” O; altitude: 466 m)
Piper amalago L. var. medium Campus ESALQ/USP, Piracicaba, SP
Folhas 16/11/2012 121200
(Jacq.) Yunck (22º42‟52,7” S; 47º37‟46” O; altitude: 546 m)
Campus ESALQ/USP, Piracicaba, SP
Piper glabratum Kunth. Folhas 16/11/2012 121206
(22º42‟44,3” S; 47º37‟41” O; altitude: 529 m)
Campus ESALQ/USP, Piracicaba, SP
Piper mikanianum (Kunth.) Steudel Folhas 16/11/2012 121201
(22º42‟45,8” S; 47º37‟36,5” O; altitude: 526 m)
Campus ESALQ/USP, Piracicaba, SP
Piper mollicomum Kunth. Folhas 16/11/2012 121202
(22º42‟45,2” S; 47º37‟39.3” O; altitude: 532 m)
*Depositado no Herbário ESA do Departamento de Ciências Biológicas da ESALQ/USP.
 29

solvente e em seguida filtrado através de papel filtro. Todo o resíduo remanescente foi
colocado novamente no solvente e o processo repetido por quatro vezes. O solvente
presente na solução filtrada foi eliminado em rotaevaporador a 50 °C e à pressão de -600
mmHg. Após a evaporação total do solvente em câmara com circulação de ar, o resíduo
obtido foi pesado para a determinação do rendimento de extração.

5.3 Avaliação de toxicidade dos solventes orgânicos para T. absoluta

Foram realizados ensaios preliminares para a escolha dos solventes

utilizados para a ressuspensão dos extratos etanólicos. Foram testados três solventes, com
diferentes polaridades: água deionizada, metanol e acetona, isoladamente e em diferentes
combinações: metanol e água deionizada (1:1, v/v), metanol e acetona (1:1, v/v), acetona e
água deionizada (1:1, v/v). Os solventes foram aplicados sobre as folhas de tomateiro até o
ponto de escorrimento, por meio de um microatomizador da marca Arprex, modelo 5A
(Arprex, Mogi das Cruzes, SP.) acoplado a um compressor de ar a uma pressão de 0,5
kgf/cm2. Após a secagem dos solventes (15 a 30 minutos), os folíolos foram
individualizados em placas de Petri em poliestireno (96 mm Ø x 21 mm altura) da marca
TPP e infestados com quatro lagartas recém-eclodidas. Cada folíolo teve seu pecíolo
envolvido em algodão hidrófilo umedecido, a fim de manter a turgescência. O ensaio foi
realizado em laboratório em condições controladas (T: 25 ± 2 °C, U. R: 65 ± 10% e
fotofase de 12 horas). A mortalidade foi avaliada diariamente com o auxílio de um
microscópio estereoscópico binocular (aumento de 40 vezes) até o sexto dia. Ao final do
experimento, o peso das lagartas foi avaliado por meio de uma balança de precisão. Foram
avaliados seis tratamentos em delineamento experimental inteiramente casualizado, com
sete repetições. Cada repetição foi constituída por três placas de Petri, contendo quatro
lagartas cada, totalizando 84 lagartas por tratamento.

5.4 Screening com extratos de anonáceas e piperáceas

Para selecionar os extratos com maior atividade inseticida sobre T.

absoluta foram realizados ensaios independentes com as espécies das famílias botânicas
estudadas. Os ensaios foram realizados seguindo os mesmos procedimentos descritos no
item 5.3, com exceção para o número de lagartas, que neste ensaio foi de cinco por placa
de Petri. Para o ensaio com as anonáceas, foram avaliados extratos provenientes de folhas e
 30

sementes de A. montana, de A. muricata e de A. sylvatica, nas concentrações de 250, 1.000

e 5.000 mg L-1. Uma mistura de metanol:acetona (1:1, v/v) foi utilizada como controle.
Para o ensaio com as piperáceas, foram avaliados extratos de folhas de P. amalago var.
medium, de P. glabratum, de P. mikanianum, de P. mollicomum nas concentrações de
2.000 e 5.000 mg L-1, utilizando acetona PA como controle. O delineamento experimental
foi inteiramente casualizado com 19 e nove tratamentos para as espécies de Annona e
Piper, respectivamente. Foram realizados sete repetições por tratamento e cada repetição
foi constituída de quatro placas contendo cinco lagartas cada, totalizando 112 lagartas por
tratamento.

5.5 Bioensaios com os extratos selecionados

5.5.1 Curvas de concentração-resposta

A partir dos extratos selecionados, buscou-se definir a CL50 e CL90
para T. absoluta. As concentrações testadas foram escolhidas através de ensaios
preliminares, utilizando-se concentrações que causaram mortalidades populacionais
próximas a 100% e mortalidades próximas ao controle. Com base nisso, foram
estabelecidas as concentrações testadas através da fórmula de Finney (1975):

q = n + 1 √an/a1

onde q= razão de progressão geométrica (p.g); n= número de concentrações a extrapolar;

an= limite superior da (p.g); a1= limite inferior da (p.g).
Para os extratos de sementes e folhas de A. muricata, o intervalo
das concentrações utilizados variou de 250 a 5.000 mg L-1. Para o extrato de folha de P.
amalago var. medium o intervalo usado variou de 500 a 7.000 mg L-1. O procedimento
experimental utilizado foi o mesmo descrito no item 5.3. O experimento seguiu um
delineamento inteiramente casualizado, com 14 tratamentos para os extratos de A.
muricata e sete tratamentos para o extrato de P. amalago var. medium. Foram realizados
sete repetições por tratamento e cada repetição foi constituída de quatro placas contendo
cinco lagartas cada, totalizando 112 lagartas por tratamento.
 31

5.5.2 Efeito dos extratos sobre aspectos biológicos de T. absoluta

Para avalair os efeitos subletais dos extratos selecionados sobre T.

absoluta foi realizado um ensaio com os extratos nas concentrações respectivas as CL50
definidas no ensaio anterior. Os extratos de folhas e sementes de A. muricata foram
testados nas concenntrações de 768,13 mg L-1 e 893,74 mg L-1, respectivamente. Para o
extrato de P. amalago var. medium a concentração foi de 1.011 mg L-1. No ensaio foram
utilizadas folhas de tomateiro e não apenas folíolos, devido à duração do experimento (> 9
dias). Dessa forma, o uso de folíolos poderia vir a comprometer a qualidade do alimento
fornecido às lagartas (GALDINO et al., 2011). As gaiolas foram compostas por uma base
retangular de isopor (20 x 10 x 3 cm) e uma arena cilíndrica de plástico transparente (11
cm de Ø x 27 cm altura) recoberta com tecido voil (Figura 3). Foram utilizadas folhas de
tomateiro retiradas do terço superior de uma planta com aproximadamente 30 dias de
idade.
A pulverização dos extratos foi feita seguindo os mesmos
procedimentos descritos no item 5.3. Foram utilizados metanol:acetona (1:1, v/v) e acetona
pura como controles para os extratos de A. muricata e P. amalago var. medium,
respectivamente. Após a secagem dos extratos (15 a 30 minutos), o pecíolo das folhas foi
inserido em um tubete de vidro (50 ml) contendo água destilada. Em seguida, as folhas
foram infestadas com seis lagartas recém-eclodidas e colocadas no interior das gaiolas para
impedir sua fuga. A mortalidade das lagartas foi avaliada diariamente até o estádio de pré-
pupa. Nessa fase as pré-pupas foram individualizadas em placas de Petri. Os insetos foram
acompanhados durante todo o ciclo de vida para obtenção das seguintes variáveis: duração
em (dias) dos estágios larval e pupal; peso e mortalidade pupal; mortalidade larval, período
de L1 (lagarta recém-eclodida a adulto), longevidade de adultos e razão sexual. Utilizou-se
um delineamento inteiramente casualisado, com cinco tratamentos e 10 repetições,
totalizando 120 lagartas por tratamento.
 32

Figura 2. (A) Gaiolas utilizadas em ensaios de biologia com lagartas de T.

absoluta; (B) Detalhes do folíolo de tomateiro danificado ao final do estágio larval
de T. absoluta.

5.5.3 Avaliação quanto à preferência para oviposição de T. absoluta

Para o ensaio com chance de escolha, foram utilizadas plantas de

tomate cultivadas em vasos de 0,5 L e com aproximadamente 20 dias de idade. As plantas
foram pulverizadas com os extratos de folhas e sementes de A. muricata e extrato de folhas
de P. amalago var. medium na concentração referente à CL50. As pulverizações foram
feitas conforme descrito anteriormente. Foram utilizados metanol:acetona (1:1, v/v) e
acetona pura como controles para os extratos de A. muricata e P. amalago var. medium,
respectivamente. Após a secagem dos tratamentos (15 a 30 minutos), as plantas foram
acondicionadas aleatoriamente no interior de gaiolas semelhantes às utilizadas na criação
da traça. Em seguida, foram colocados no interior da gaiola dois casais do inseto, os quais
haviam sido previamente isolados por 24 horas. Após 48 horas da liberação dos adultos, as
plantas foram retiradas e os ovos contabilizados com auxílio de microscópio
estereoscópico (aumento de 20 vezes). O delineamento utilizado foi em blocos
casualizados, com cinco tratamentos. Cada gaiola contendo as plantas pulverizadas e os
insetos representaram uma repetição, efetuando-se oito no total.
 33

Um ensaio de oviposição sem chance de escolha também foi

realizado com T. absoluta. Neste ensaio cada vaso contendo a planta foi colocado dentro
de uma gaiola metálica (30 cm Ø x 70 cm altura), recoberta com tecido voil e submetida ao
mesmo tratamento (controle ou extratos). Foram utilizados dois casais do inseto por gaiola,
previamente isolados por 24 horas e, após 48 horas da liberação dos adultos, os ovos foram
contabilizados. O ensaio seguiu um delineamento experimental inteiramente casualizado
com cinco tratamentos e cinco repetições.
Os dados oriundos do teste com chance de escolha foram
comparados entre si por meio do índice de deterrência (ID) para oviposição, adaptado de
Lin et al. (1990), calculado pela fórmula ID = 2G / (G + P), onde G= % de ovos nas plantas
tratadas com o extrato em teste e P= % de ovos no controle. Com base no (ID) e no desvio
padrão obtidos, determinou-se o intervalo de classificação (IClass) para as médias dos
tratamentos, pela fórmula: IClass= 1 ± t (n - 1; α: 0,05) x (DP / √n); onde t= valor de “t”
tabelado; DP= desvio padrão; n= número de repetições. Os extratos foram considerados
neutros quando o valor de (ID) esteve compreendido dentro do (IClass) avaliado;
deterrente à oviposição quando o valor do (ID) foi inferior ao menor valor obtido para o
(IClass); e estimulante à oviposição quando o (ID) foi superior ao maior (IClass) calculado.

5.5.4 Avaliação do efeito ovicida

Para o ensaio de efeito ovicida foram utilizadas folhas de tomateiro

com cinco folíolos, as quais foram retiradas do terço superior de plantas com 30 dias de
idade. O pecíolo das folhas foi inserido em um tubete de vidro (50 ml) contendo água
destilada, o qual foi fixado no centro de uma base de isopor, com 10 cm de diâmetro. Em
seguida, as folhas foram colocadas no interior da gaiola de criação de adultos por 24 horas.
Após esse período, as folhas foram retiradas e os folíolos individualizados em placas de
Petri envoltos com algodão umedecido. O total de ovos em cada folíolo foi determinado e,
em seguida, os mesmos tratamentos utilizados nos ensaios anteriores foram pulverizados
na concentração referente à CL50, estimada para cada extrato selecionado com o auxílio de
um microatomizador. Como controles foram utilizados metanol:acetona (1:1, v/v) e
acetona pura. A viabilidade dos ovos foi avaliada após a emergência das lagartas. O
delineamento foi o inteiramente casualizado com cinco tratamentos e cinco repetições.
 34

5.5.5 Avaliação do efeito translaminar sobre T. absoluta

Para avaliar o efeito dos extratos de folhas e sementes de A.

muricata e do extrato de folhas de P. amalago var. medium após a penetração das lagartas
no mesófiolo foliar, foi realizado um bioensaio utilizando folhas de tomateiro, conforme
descrito no item 5.5.4. As folhas foram infestadas com 20 lagartas recém-eclodidas de T.
absoluta e acondicionadas no interior de gaiolas (Figura 3). Após 24 horas, as folhas
infestadas com as lagartas foram individualizadas em placas de Petri contendo um papel
filtro. A face adaxial das folhas foram pulverizadas por meio de um microatomizador, com
os respectivos extratos e os controles, metanol:acetona (1:1, v/v) e acetona pura. Em
seguida as folhas foram inseridas novamente no interior de gaiolas. A concentração dos
extratos utilizada foi cinco vezes a CL50 encontrada, seguindo a metodologia utilizada por
Ferreira, (2011). As avaliações de mortalidade larval foram realizadas diariamente até o
sexto dia, juntamente com o peso das lagartas sobreviventes. Empregou-se um
delineamento inteiramente casualizado, com cinco tratamentos e cinco repetições,
totalizando 100 lagartas por tratamento.

5.6 Fracionamento dos extratos de A. muricata

Os extratos etanólicos de A. muricata foram submetidos ao

fracionamento inicial pela técnica de partição líquido-líquido. Para isso, os extratos de
folhas e sementes foram ressuspendidos em metanol:água na proporção de (1:3) e (8:2)
(v/v), respectivamente. Em seguida foram particionados em um funil de separação com
solventes orgânicos de polaridades crescentes (hexano, diclorometano e acetato de etila).
Com isso, obtiveram-se as frações em hexano, diclorometano, acetato de etila e
hidroalcóolica para os extratos de folhas de A. muricata e frações em hexano e
hidroalcóolica para o extrato de sementes. As partições foram concentradas em
rotoevaporador à temperatura de 50°C e à pressão de -600 mmHg. A determinação dos
rendimentos foi obtida com base nas massas dos respectivos extratos brutos.

5.6.1 Avaliação da bioatividade das partições obtidas

Para a avaliação da bioatividade sobre lagartas de T. absoluta

foram feitos ensaios de toxicidade aguda. Foram utilizados folíolos de tomate envoltos
com algodão umedecido em placas de Petri. Os folíolos foram pulverizados com os
 35

respectivos tratamentos por meio de pistola tipo gravidade. Como controles foram
empregados acetona:metanol (1:1, v/v) e metanol:água (1:1, v/v). Após a secagem dos
extratos, os folíolos foram infestados com quatro lagartas recém-eclodidas. O delineamento
experimental foi o inteiramente casualizado com seis tratamentos para o extrato de folhas e
três tratamentos para o extrato de sementes de A. muricata. Foram utilizadas sete
repetições por tratamento, cada repetição foi constituída por quatro placas de Petri
contendo cinco lagartas, totalizando 112 lagartas por tratamento.

5.6.2 Análise cromatográfica em camada delgada (CCD)

Para verificar as diferenças qualitativas das classes químicas

presentes em cada extrato, foram realizadas análises de cromatografia em camada delgada
(CCD) das frações mais ativas dos extratos de folhas e de sementes de A. muricata sobre T.
absoluta.
As amostras analisadas por CCD foram aplicadas a
aproximadamente 0,5 cm da base inferior da placa, por meio de um tubo capilar,
permitindo dessa forma, que a amostra fosse adsorvida pela fase estacionária. Em seguida,
a cromatoplaca foi introduzida em uma cuba contendo a fase móvel (eluente), na qual se
utilizou uma solução de hexano:acetato de etila (8:2, v/v), proporção esta definida a partir
de testes preliminares. A cromatoplaca foi deixada na cuba até que o eluente subisse, por
capilaridade, até aproximadamente 0,5 cm da extremidade superior da placa. Na sequência,
as cromatoplacas foram retiradas da cuba e, logo após isso, as mesmas receberam soluções
reveladoras, com o intuito de tornar visíveis os compostos orgânicos dos mais variados
grupos funcionais. Para esse fim, foram usados diferentes reveladores, como anisaldeído
sulfúrico (revelador de compostos como, esteroides e terpenoides), iodo (considerado um
revelador universal, capaz de detectar substâncias com duplas ligações e aromáticas),
Dragendorf (específico para alcaloides) e sulfato cérico (muito usado para identificar
flavonoides e terpenoides). Após a aplicação dos reveladores, as cromatoplacas foram
aquecidas em secador industrial a 100 °C. Além da solução reveladora, a visualização dos
resultados obtidos também foi efetuada por meio de luz ultravioleta (254 e 364 nm),
visando identificar a presença de sistemas conjugados, denominados cromóforos.
 36

5.6.3 Ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN de 1H)

Visando verificar as classes de compostos, bem como as

diferenças e similaridades nos perfis químicos, as frações bioativas dos extratos
selecionados foram submetidas à análise de RMN de 1H em um espectrômetro Bruker
Avance TM III Nanobay 400 MHz, utilizando os solventes deuterados CDCl3 e DMSO-d6.

5.7 Bioensaios de toxicidade comparada

Foram realizados ensaios em laboratório e casa de vegetação, a fim

de avaliar a toxicidade comparada do extrato bruto de sementes de A. muricata em relação
a um produto formulado à base de acetogeninas de anonáceas.
Para o ensaio em laboratório, foram utilizados folíolos de tomateiro
em placas de Petri seguindo os mesmo procedimentos do item 5.3. Foi avaliado o extrato
de sementes de A. muricata na concentração relativa à CL90 em comparação ao produto
comercial Anosom® CE (10 g L-1 de anonina); AgriLife, Andhra Pradesh, Índia, na
concentração de 2.000 mg L-1. Esse biopesticida é formulado à base de extratos de Annona
squamosa L. e Annona reticulata L. e tem a acetogenina anonina como ingrediente ativo,
sendo recomendado para o controle de pragas importantes como Helicoverpa armigera
(Hubner), Helicoverpa zea (Boddie), Spodoptera litura (F.), Spodoptera exigua (Hubner).
Como controle positivo, foi usado o produto Azamax® CE (12 g L-1 de azadiractina + 3-
tigloylazadirachtol); DVA Brasil, Campinas, SP, Brasil, registrado para o controle de T.
absoluta em tomateiro na concentração recomendada (2,5 ml L-1) (AGROFIT, 2013). Os
níveis dos limonoides azadiractina e 3-tigloylazadirachtol (anteriormente azadiractina A e
B) presentes no Azamax® podem ser modificados em decorrência de sua rápida
degradação. Dessa maneira, quantificamos esses compostos seguindo os procedimentos
descritos por Forim et al. (2010), a partir de amostras do produto recolhidas no momento
do uso.
Os extratos de A. muricata formulado com o solvente
metanol:acetona (1:10, v/v) foi substituído por um concentrado emulsionável à base de
água + metanol + tween, para evitar a queima das plantas quando expostas à luz solar, o
que poderia ocorrer no ensaio em casa de vegetação. Assim, como controles negativos
foram utilizados (água destilada + metanol + tween) e água destilada. A mortalidade foi
avaliada diariamente até o sexto dia, juntamente com o peso das lagartas. O delineamento
 37

experimental foi o inteiramente casualizado, composto por cinco tratamentos e sete

repetições. Foram utilizadas quatro placas por repetição, cada uma contendo cinco lagartas,
num total de 140 lagartas por tratamento.
Para avaliar a toxicidade desses produtos em condições
semelhantes às que ocorrem no campo, foi realizado um experimento em casa de
vegetação, utilizando-se plantas de tomate com 30 dias de idade. As plantas foram
formadas em vasos de 2,5 L, contendo solo e substrato (Bioplant Plus) na proporção de
3:1. As plantas foram pulverizadas com os respectivos tratamentos por meio de uma pistola
tipo gravidade (Modelo 5A Arprex), acoplada a um compressor de ar, sob pressão de 0,5
kgf/cm2. Após a secagem dos produtos (15 a 30 min), uma folha do terço superior de cada
planta foi selecionada e infestada com 15 lagartas recém eclodidas. Para evitar a fuga das
lagartas, a folha infestada foi protegida com uma gaiola (25 x 15 cm) confeccionada em
tecido voil (Figura 4). As plantas infestadas foram dispostas aleatoriamente sobre bancadas
de concreto em casa de vegetação e após seis dias da infestação, a mortalidade foi avaliada
juntamente com o peso das lagartas sobreviventes. O experimento seguiu um delineamento
experimental inteiramente casualizado com cinco tratamentos e sete repetições. Cada vaso
foi infestado com 15 lagartas e representou uma repetição, num total de 105 lagartas
avaliadas por tratamento.

Figura 3. Vista geral do ensaio de toxicidade comparada em casa de vegetação (A);

Detalhe da gaiola em tecido voil utilizada no ensaio (B).

5.8 Análise dos dados

As estimativas das concentrações letais (CL50 e CL90) dos extratos
mais promissores sobre T. absoluta foram realizadas utilizando um modelo binomial com
 38

função de ligação complemento log-log (modelo de gompit), através do PROBIT

PROCEDURE do software SAS versão 9.2 (SAS INSTITUTE, 2011).
Os dados dos demais ensaios foram analisados por meio de
Modelos Lineares Generalizados (GLM) pertencentes à família exponencial de
distribuições (NELDER &WEDDERBURN, 1972). A verificação da qualidade do ajuste
dos dados aos modelos foi feita por meio do uso do gráfico meio-normal de probabilidades
com envelope de simulação (HINDE & DEMÉTRIO, 1998). Quando houve diferença
significativa entre os tratamentos, comparações múltiplas (teste pos hoc de Tukey, P <
0,05) foram realizadas por meio da função glht (General Linear Hypothesis Test) do pacote
Multicomp com ajuste dos valores de P. Todas essas análises foram realizadas utilizando-
se o software estatístico “R”, versão 2.15.1 (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2012).
 39

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

6.1 Rendimento de extração

O rendimento dos extratos estudados variou conforme a estrutura e

a espécie vegetal (Tabela 2). Em Annonaceae, os extratos de sementes apresentaram os
maiores rendimentos em comparação aos extratos de folhas, com destaque para Annona
muricata e Annona montana com 21,10 e 20,23%, respectivamente. Para os extratos de
folhas, novamente A. muricata apresentou o melhor rendimento (14,09%), seguido de A.
montana com 11,79%. Para os extratos de Piperaceae o rendimento médio foi de 6,88%,
sem variações pronunciadas entre as espécies.
O rendimento dos extratos pode variar não apenas conforme a
espécie e estrutura vegetal, mas também de acordo com o solvente e o processo escolhido
para a extração. Para a obtenção dos extratos estudados foi utilizado o etanol como
solvente. Segundo Falkenberg et al. (2010), esse solvente permite que praticamente todos
os constituintes de interesse sejam extraídos, já que a grande maioria apresenta alguma
solubilidade em misturas etanólicas. Além disso, a utilização de solventes obtidos de fontes
naturais, que são biodegradáveis e produzidos por fontes renováveis, adequam-se aos
preceitos da química verde (ANASTAS et al., 2000). O elevado rendimento dos extratos de
sementes de Annona spp. pode ser explicado pela presença de óleo, composto
 40

Tabela 2. Rendimentos dos extratos brutos de anonáceas e piperáceas, obtidos por meio
do processo de maceração a frio em solvente etanol, na proporção de 1:5 (p/v).

Material Rendimento
Espécie vegetal Parte vegetal
vegetal (g) (g) (%)
Folha 100 11,79 11,79
Annona montana
Semente 95,6 19,34 20,23
Folha 100 14,09 14,09
Annona muricata
Semente 104,5 22,05 21,10
Folha 100 7,18 7,18
Annona sylvatica
Semente 100 11,00 11,00
Piper amalago var. medium Folha 100 6,10 6,10
Piper glabratum Folha 100 6,46 6,46
Piper mikanianum Folha 100 7,97 7,97
Piper mollicomum Folha 100 6,98 6,98

principalmente por triacilgliceróis, e que podem ser extraídos com etanol (FONTANA, et
al., 1998; ONIMAWO, 2002; BRANCO et al., 2010).

6.2 Avaliação da toxicidade de solventes orgânicos para T. absoluta

Não houve diferença significativa entre os tratamentos isolados

e/ou suas combinações, em relação ao controle (água deionizada) (Tabela 3). Quanto ao
peso das lagartas, verificou-se aumento significativo das médias quando utilizou-se
acetona pura ou em combinação com água e metanol, em relação ao controle. O critério
inicial utilizado para a escolha do solvente baseou-se no menor efeito deletério sobre o
organismo estudado. No entanto, como não houve diferença significativa entre os solventes
com relação à mortalidade de lagartas, selecionou-se aquele que promoveu uma melhor
suspensão dos extratos, ou seja, metanol:acetona (1:1, v/v) para suspensão dos extratos de
Annona spp. e acetona pura para os extratos de Piper spp.

6.3 Screening com os extratos de anonáceas e piperáceas

No ensaio para seleção dos extratos de anonáceas mais ativos frente

a lagartas de T. absoluta, os níveis médios de mortalidade dos extratos variaram de 9,97%
(24 horas) a 19,32% (144 horas) na concentração mais baixa (250 mg L-1) (Tabela 4).
 41

Tabela 3. Médias (± EP) de mortalidade e peso (mg) de lagartas de T. absoluta alimentadas com folíolos de tomateiro tratados com solventes
de diferentes polaridades, isolados ou em diferentes combinações. T.: 25 ± 2° C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.

Tempo de exposição (horas)1 Peso larval

Solvente
24 48 72 96 120 144 (mg)2
Metanol 3,57 ± 2,48 3,57 ± 2,48 3,57 ± 2,48 4,76 ± 3,07 4,76 ± 3,07 5,95 ± 2,99 1,37 ± 0,11 ab
Metanol:água deionizada (1:1, v/v) 3,57 ± 2,48 3,57 ± 2,48 3,57 ± 2,48 3,57 ± 2,48 5,95 ± 2,38 5,95 ± 2,38 1,40 ± 0,07 ab
Metanol:acetona (1:1, v/v) 4,76 ± 3,57 4,76 ± 3,57 9,52 ± 4,61 9,52 ± 4,61 9,52 ± 4,61 13,09 ± 4,01 1,57 ± 0,15 a
Acetona:água deionizada (1:1, v/v) 3,57 ± 1,68 4,76 ± 1,68 5,95 ± 2,38 5,95 ± 2,38 5,95 ± 2,38 5,95 ± 2,38 1,51 ± 0,06 a
Acetona 7,14 ± 2,17 7,14 ± 2,17 8,33 ± 2,57 10,71 ± 2,38 10,71 ± 2,38 14,28 ± 3,51 1,76 ± 0,13 a
Água deionizada 3,57 ± 1,68 5,95 ± 1,54 7,14 ± 2,17 8,33 ± 2,57 8,33 ± 2,57 8,33 ± 2,57 1,04 ± 0,08 b
F 0,3076ns 0,2966ns 0,7337ns 0,8425ns 0,5885ns 1,5000ns 5,2609
P 0,9051 0,9116 0,6030 0,5286 0,7087 0,2142 0,0009
1
Diferença não significativa (GLM com distribuição quase-binomial seguido por teste post hoc de Tukey, P < 0,05);
2
Médias seguidas de letras distintas, nas colunas de cada concentração testada, indicam diferenças significativas entre os tratamentos (GLM com distribuição
Gaussiana seguido por teste post hoc de Tukey, P < 0,05);
ns
: não significativo.
 42

Tabela 4. Médias (± EP) de mortalidade e peso (mg) de lagartas de T. absoluta alimentadas com folíolos de tomateiro tratados com extratos
etanólicos de diferentes estruturas e/ou espécies de Annonaceae em três concentrações. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.

Tempo de exposição (horas)1 Peso larval

Espécie Estrutura
24 48 72 96 120 144 (mg)2
-1
250 mg L

F 11,61 ± 3,46 a 11,61 ± 3,46 a 11,61 ± 3,46 a 13,39 ± 3,71 a 13,39 ± 3,71 14,28 ± 4,05 0,85 ± 0,06 ab
A. montana
S 4,36 ± 1,71 a 8,72 ± 3,42 a 13,07 ± 5,12 a 18,33 ± 7,05 a 26,26 ± 9,97 34,19 ± 13,19 0,90 ± 0,05 ab
F 9,82 ± 5,60 a 9,82 ± 5,60 a 9,82 ± 5,60 a 12,50 ± 7,34 a 12,50 ± 7,34 22,32 ± 7,20 0,99 ± 0,09 a
A. muricata
S 21,22 ± 5,49 a 21,22 ± 5,49 a 21,22 ± 5,49 a 23,00 ± 5,96 a 23,89 ± 6,38 23,89 ± 6,38 0,86 ± 0,06 b
F 7,64 ± 1,17 a 7,64 ± 1,17 a 7,64 ± 1,17 a 7,64 ± 1,17 a 10,02 ± 2,32 11,81 ± 2,52 0,64 ± 0,07 b
A. sylvatica
S 5,16 ± 2,02 a 5,16 ± 2,02 a 5,16 ± 2,02 a 6,05 ± 2,66 a 6,05 ± 2,66 9,42 ± 2,55 0,64 ± 0,06 b
Controle -- 3,41 ± 1,76 a 3,41 ± 1,76 a 3,41 ± 1,76 a 3,41 ± 1,76 a 8,61 ± 2,80 8,61 ± 2,80 0,78 ± 0,04 ab
F 3,1487 2,489 2,3378 2,3557 1,8678ns 2,0286ns 4,3285
P 0,0122 0,0375 0,0488 0,0474 0,1092 0,0830 0,0018
1.000 mg L-1

F 48,21 ± 9,90 a 71,43 ± 7,33 a 72,32 ± 7,20 a 72,32 ± 7,20 a 72,32 ± 7,20 a 72,32 ± 7,20 a 0,24 ± 0,02 b
A. montana
S 55,36 ± 2,87 a 77,68 ± 2,31 a 79,46 ± 2,63 a 79,46 ± 2,63 a 79,46 ± 2,63 a 79,46 ± 2,63 a 0,32 ± 0,05 ab
F 44,64 ± 5,00 a 61,61 ± 6,31 ab 61,61 ± 6,31 ab 61,61 ± 6,31 ab 61,61 ± 6,31 ab 61,61 ± 6,31 ab 0,73 ± 0,29 ab
A. muricata
S 49,11 ± 3,72 a 64,29 ± 5,74 ab 65,18 ± 5,60 ab 65,18 ± 5,60 ab 65,18 ± 5,60 ab 65,18 ± 5,60 ab 0,83 ± 0,09 a
 43

Tabela 4.
Continuação
Tempo de exposição (horas)1
Espécie Estrutura 24 48 72 96 120 144 Peso larval
-1
1.000 mg L (mg)2
F 35,71 ± 6,50 a 45,54 ± 7,68 b 45,54 ± 7,68 b 45,54 ± 7,68 b 45,54 ± 7,68 b 45,54 ± 7,68 b 0,51 ± 0,09 ab
A. sylvatica
S 36,40 ± 6,23 a 44,64 ± 6,16 b 44,64 ± 6,16 b 44,64 ± 6,16 b 44,64 ± 6,16 b 44,64 ± 6,16 b 0,54 ± 0,03 ab
Controle -- 11,45 ± 1,65 b 12,50 ± 2,36 c 12,50 ± 2,36 c 12,50 ± 2,36 c 12,50 ± 2,36 c 12,50 ± 2,36 c 0,39 ± 0,11 ab
F 7,1641 14,019 14,678 14,678 14,678 14,678 2,6433
P < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,0454
5.000 mg L-1
F 99,10 ± 0,89 a 99,10 ± 0,89 a 99,10 ± 0,89 a 100,00 ± 0,00* 100,00 ± 0,00* 100,00 ± 0,00* --**
A. montana
S 78,57 ± 4,06 b 91,96 ± 4,25 a 91,96 ± 4,25 a 92,85 ± 3,45 a 92,85 ± 3,45 a 92,85 ± 3,45 a --**
F 98,21 ± 1,15 a 98,21 ± 1,15 a 98,21 ± 1,15 a 98,21 ± 1,15 a 98,21 ± 1,15 a 98,21 ± 1,15 a --**
A. muricata
S 99,10 ± 0,89 a 99,10 ± 0,89 a 99,10 ± 0,89 a 99,10 ± 0,89 a 99,10 ± 0,89 a 99,10 ± 0,89 a --**
F 94,64 ± 2,12 a 94,64 ± 2,12 a 94,64 ± 2,12 a 96,42 ± 1,26 a 96,42 ± 1,26 a 96,42 ± 1,26 a --**
A. sylvatica
S 99,10 ± 0,89 a 99,10 ± 0,89 a 99,10 ± 0,89 a 99,10 ± 0,89 a 99,10 ± 0,89 a 99,10 ± 0,89 a --**
Controle -- 7,50 ± 1,25 c 10,00 ± 1,53 b 11,25 ± 2,34 b 15,00 ± 1,53 b 18,75 ± 2,79 b 18,75 ± 2,79 b 0,43 ± 0,08
F 66,091 49,169 47,062 104,58 92,828 92,828 --
P < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 --
1
Médias seguidas de letras distintas, nas colunas de cada concentração testada, indicam diferenças significativas entre os tratamentos (GLM com distribuição quase-binomial
seguido pelo teste post hoc de Tukey, P < 0,05);
2
Médias seguidas de letras distintas, nas colunas de cada concentração testada, indicam diferenças significativas entre os tratamentos (GLM com distribuição gaussiana seguido por
teste post hoc de Tukey, P < 0,05);
*Tratamento não incluído na análise (variância nula); ** Não analisado devido à pequena unidade amostral; Ns: Não significativo; F= Folha, S= Sementes.
 44

Não houve diferença significativa entre as médias de mortalidade dos extratos e o controle
em nenhum dos períodos avaliados. O mesmo ocorreu em relação ao efeito dos extratos
sobre o peso das lagartas. Na concentração intermediária (1.000 mg L-1) as mortalidades
com os extratos variaram de 44,91% (24 horas) a 61,46% (144 horas). Houve diferença
significativa entre as médias de mortalidade dos extratos e o controle em todos os períodos.
Entretanto, não houve efeito sobre o peso das lagartas. Na concentração de 5.000 mg L -1 as
mortalidades ocasionadas pelos extratos variaram de 94,79% (24 horas) a 97,61% (144
horas) diferindo do controle em todos os períodos avaliados (Tabela 4). Não foi possível
avaliar a influência dos extratos sobre o peso das lagartas devido ao pequeno número de
indivíduos sobreviventes.
Em geral, todos os extratos das espécies de Annona foram
eficientes no controle de lagartas de T. absoluta nas concentrações de 1.000 e 5.000 mg L-
1
. A toxicidade dos compostos ativos presentes em plantas da família Annonaceae tem sido
reportada sobre diferentes espécies de insetos-praga, como Spodoptera littoralis (Boisd.),
Leptinotarsa decemlineata (Say), Myzus persicae (Sulz.) (GUADAÑO et al., 2000)
Spodoptera frugiperda, Oncopeltus fasciatus (Dallas) (COLOM et al., 2007, 2008),
Sitophilus zeamais Motsch. (LLANOS et al., 2008; RIBEIRO et al., 2013), Callosobruchus
chinensis L. (OHSAWA et al., 1990), Trogoderma granarium Everts (RAO et al., 2005).
Para a avaliação dos efeitos subletais dos extratos de anonáceas sobre T. absoluta
selecionou-se A. muricata, uma vez que os extratos dessa espécie apresentaram elevada
toxicidade aguda sobre a fase larval do inseto e rendimento superior ao dos demais
extratos.
Os extratos de Piper spp. causaram maiores níveis de mortalidade
de lagartas de T. absoluta comparativamente ao controle nas duas concentrações testadas,
exceto P. mollicomum a 2.000 mg L-1 (Tabela 5). Para os extratos na concentração mais
baixa (2.000 mg L-1), os valores de mortalidade variaram de 9,52% a 66,7% no período de
24 horas. Com 5.000 mg L-1, houve variações de 46,66% a 73,33%, nesse mesmo período.
Não houve diferença significativa com relação ao efeito dos extratos sobre o peso das
lagartas, verificou-se não haver diferença entre as médias dos extratos e do controle.
Entretanto, o extrato de P. mollicomum a 5.000 mg L-1 ocasionou a menor média de peso
larval diferindo do extrato de P. glabratum e dele mesmo a 2000 mg L-1. Como as espécies
P. amalago var. medium, P. glabratum e P. mikanianum não diferiram entre si, a seleção
 45

Tabela 5. Médias (± EP) de mortalidade e peso (mg) de lagartas de T. absoluta alimentadas com folíolos de tomateiro tratados com extratos
etanólicos de folhas de diferentes espécies de Piperaceae em duas concentrações. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.

Concentração Tempo de exposição (horas)1 Peso larval

Espécie
(mg L-1) 24 48 72 96 120 144 (mg)2
P. amalago 2.000 66,66 ± 4,36 ab 67,62 ± 4,22 ab 67,62 ± 4,22 ab 67,62 ± 4,22 ab 67,62 ± 4,22 ab 67,62 ± 4,22 ab 0,27 ± 0,02 ab
var. medium 5.000 71,42 ± 3,48 a 75,24 ± 3,77 a 75,24 ± 3,77 a 75,24 ± 3,77 a 75,24 ± 3,77 a 75,24 ± 3,77 a 0,32 ± 0,03 ab
2.000 41,90 ± 6,12 b 43,81 ± 5,41 b 43,81 ± 5,41 b 43,81 ± 5,41 b 43,81 ± 5,41 b 43,81 ± 5,41 b 0,36 ± 0,03 a
P. glabratum
5.000 60,95 ± 9,13 ab 64,76 ± 8,06 ab 64,76 ± 8,06 ab 64,76 ± 8,06 ab 64,76 ± 8,06 ab 64,76 ± 8,06 ab 0,26 ± 0,03 ab
2.000 50,47 ± 7,81ab 50,48 ± 7,82 ab 50,48 ± 7,82 ab 50,48 ± 7,82 ab 50,48 ± 7,82 ab 50,48 ± 7,82 ab 0,24 ± 0,04 ab
P. mikanianum
5.000 46,66 ± 6,34 ab 47,62 ± 5,71 b 47,62 ± 5,71 b 47,62 ± 5,71 b 47,62 ± 5,71 b 47,62 ± 5,71 b 0,26 ± 0,02 ab
2.000 9,52 ± 2,86 c 11,43 ± 2,80 c 11,43 ± 2,80 c 11,43 ± 2,80 c 11,43 ± 2,80 c 11,43 ± 2,80 c 0,36 ± 0,07 a
P. mollicomum
5.000 73,33 ± 5,24 a 74,28 ± 5,13 a 74,28 ± 5,13 a 74,28 ± 5,13 a 74,28 ± 5,13 a 74,28 ± 5,13 a 0,18 ± 0,02 b
Controle -- 9,40 ± 2,87 c 11,25 ± 2,80 c 11,25 ± 2,80 c 11,25 ± 2,80 c 11,25 ± 2,80 c 11,25 ± 2,80 c 0,32 ± 0,03 ab

F 17,339 19,455 19,455 19,455 19,455 19,455 3,0488

P < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,0066
1
Médias seguidas de letras distintas, nas colunas de cada concentração testada, indicam diferenças significativas entre os tratamentos (GLM com distribuição quase-binomial seguido
por teste post hoc de Tukey, P < 0,05);
2
Médias seguidas de letras distintas, nas colunas de cada concentração testada, indicam diferenças significativas entre os tratamentos (GLM com distribuição gaussiana seguido por
teste post hoc de Tukey, P < 0,05).
 46

do extrato mais ativo se baseou naquele que proporcionou as maiores médias na

mortalidade de lagartas de T. absoluta nas duas concentrações testadas, sendo, portanto
selecionado o extrato de folhas de P. amalago var. medium para as etapas seguintes.
Espécies do gênero Piper têm reconhecida atividade inseticida sobre diversos insetos-praga
(MIYAKADO et al., 1979, 1980; SIGHAMONY et al., 1986; BAIER; WEBSTER, 1992;
MBATA et al., 1995; KÉÏTA et al., 2000; DYER et al., 2003; PARK et al., 2002);
entretanto, para T. absoluta este é o primeiro trabalho que investigou a atividade biológica
do gênero.

6.4 Bioensaios com os extratos selecionados

6.4.1 Curvas de concentração-resposta

As concentrações letais estimadas para os extratos de folhas e de

sementes de A. muricata estão detalhados na Tabela 6. Analisando-se as concentrações
letais em diferentes tempos de exposição, verifica-se que não há incrementos na
mortalidade após 24 horas (intervalos de confiança sobrepostos), indicando que a
mortalidade de lagartas de T. absoluta ocorre principalmente no período que antecede a
penetração na folha (Tabelas 7 e 8). Para o extrato de folhas de P. amalago var. medium, as
concentrações letais estimadas estão na Tabela 9. Assim como ocorreu para os extratos de
A. muricata, a mortalidade de lagartas ocorreu principalmente no período de 24 horas
(Tabela 10). Os resultados obtidos sugerem que a toxicidade dos extratos estudados ocorre,
sobretudo por contato das lagartas com os resíduos dos extratos e, em menor grau, por
ingestão dos compostos ativos. Também constatou-se que as lagartas que não penetraram
no mesófilo foliar após o contato com os resíduos apresentaram sintomas de letargia e
baixa mobilidade. Outros autores observaram que insetos tratados com dieta contendo
acetogeninas apresentam inicialmente níveis mais baixos de adenosina trifosfato (ATP),
inibindo o sistema de transporte de elétrons mitocondrial, seguindo-se de apoptose (DEGLI
ESPOSTI et al., 1994; GALLARDO et al., 2000). As piperamidas comumente encontradas
no gênero Piper apresentam dupla atividade biológica, uma amida isobutilica neurotóxica e
um grupamento metilenodioxifenílico, importante inibidor de monoxigenases dependentes
de citocromo P-450, muito utilizadas como sinergistas em inseticidas naturais e sintéticos
(BERNARD et al., 1995). Essas enzimas apresentam um papel importante na
 47

Tabela 6. Estimativa da CL50 e CL90 (mg L-1) e intervalo de confiança (IC) dos extratos etanólicos de folhas e sementes de A. muricata. T.: 25
± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h. Período de exposição dos insetos aos extratos (144 horas).
Slope ± EP CL50 (mg L-1) CL90 (mg L-1)
Extrato χ² (3) GL4 h5
n1 (valor de P) IC2 a 95% IC2 a 95%
Annona muricata (S) 784 3,90 ± 0,41 (P= ns) 893,74 (757,21 – 1019) 1.817 (1.603 – 2.118) 45 6 1,12

Annona muricata (F) 896 2,57 ± 0,25 (P= ns) 768,13 (628,65 – 905,94) 2.251 (1.888 – 2.812) 60 7 1,28
1
número total de indivíduos testados;
2
Intervalo de Confiança a 95% de probabilidade;
3
Teste qui-quadrado;
4
Graus de liberdade;
5
Fator de heterogeneidade.

Tabela 7. Estimativa da CL50 e CL90 (mg L-1) e intervalo de confiança (IC) do extrato etanólico de sementes de A. muricata, em diferentes
tempos de exposição. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.
Tempo de exposição Slope± EP CL50 CL90 χ2 (3)
n1 2 2 h5
(horas) (valor de P) (IC) (IC) (GL4 = 6)
24 784 4,04 ± 0,42 (P= ns) 969,30 (828,60 – 1.098) 1.920 (1.703 – 2.223) 42,2 1,08
48 784 3,90 ± 0,41 (P= ns) 893,74 (757,21 – 1019) 1.817 (1.603 – 2.118) 45 1,12
72 784 3,90 ± 0,41 (P= ns) 893,74 (757,21 – 1019) 1.817 (1.603 – 2.118) 45 1,12
96 784 3,90 ± 0,41 (P= ns) 893,74 (757,21 – 1019) 1.817 (1.603 – 2.118) 45 1,12
120 784 3,90 ± 0,41 (P= ns) 893,74 (757,21 – 1019) 1.817 (1.603 – 2.118) 45 1,12
144 784 3,90 ± 0,41 (P= ns) 893,74 (757,21 – 1019) 1.817 (1.603 – 2.118) 45 1,12
1
número total de indivíduos testados;
2
Intervalo de Confiança a 95% de probabilidade;
3
Teste qui-quadrado;
4
Graus de liberdade;
5
Fator de heterogeneidade.
 48

Tabela 8. Estimativa da CL50 e CL90 (mg L-1) e intervalo de confiança (IC) do extrato etanólico de folhas de A. muricata, em diferentes
tempos de exposição. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.
Tempo de exposição 1 Slope± EP CL50 CL90 χ2 (3)
n h5
(horas) (valor de P) (IC)2 (IC)2 (GL4= 7)
24 896 2,70 ± 0,25 (P= 0,0567) 813,59 (676,25 – 950,81) 2.262 (1.903 – 2.817) 63,3 1,35
48 896 2,57 ± 0,25 (P= ns) 768,13 (628,65 – 905,94) 2.251 (1.888 – 2.812) 60 1,28
72 896 2,57 ± 0,25 (P= ns) 768,13 (628,65 – 905,94) 2.251 (1.888 – 2.812) 60 1,28
96 896 2,57 ± 0,25 (P= ns) 768,13 (628,65 – 905,94) 2.251 (1.888 – 2.812) 60 1,28
120 896 2,57 ± 0,25 (P= ns) 768,13 (628,65 – 905,94) 2.251 (1.888 – 2.812) 60 1,28
144 896 2,57 ± 0,25 (P= ns) 768,13 (628,65 – 905,94) 2.251 (1.888 – 2.812) 60 1,28
1
número total de indivíduos testados
2
Intervalo de Confiança a 95% de probabilidade
3
Teste qui-quadrado;
4
Graus de liberdade;
5
Fator de heterogeneidade.
 49

Tabela 9. Estimativa da CL50 e CL90 (mg L-1) e intervalo de confiança (IC) do extrato etanólico de P. amalago var. medium. T.: 25 ± 2 °C; U.
R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h. Período de exposição dos insetos aos extratos (144 horas).

1 Slope ± EP CL50 (mg L-1) CL90 (mg L-1) χ² (3)

Extrato n h4
(valor de P) IC2 a 95% IC2 a 95% (GL4= 6)

P. amalago var. medium (F) 744 1,87 ± 0,25 (P= 0,0009) 1.011 (688,79 – 1.311) 4.440 (3.475 – 6.303) 73,91 1,84
1
número total de indivíduos testados;
2
Intervalo de Confiança a 95% de probabilidade;
3
Teste qui-quadrado;
4
Graus de liberdade;
5
Fator de heterogeneidade.

Tabela 10. Estimativa da CL50 e CL90 (mg L-1) e intervalo de confiança (IC) do extrato etanólico de folhas de P. amalago var. medium, em
diferentes tempos de exposição. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.
Tempo de exposição Slope± EP CL50 CL90 χ2 (3)
n1 h5
(horas) (valor de P) (IC)2 (IC)2 (GL4= 6)
24 744 1,86 ± 0,24 (P < 0,0001) 1008 (700,24 – 1.295) 4.464 (3.510 – 6.281) 70,8 1,77
48 744 1,87 ± 0,25 (P < 0,0009) 1.011 (688,79 – 1.311) 4.440 (3.475 – 6.303) 73,91 1,84
72 744 1,87 ± 0,25 (P < 0,0009) 1.011 (688,79 – 1.311) 4.440 (3.475 – 6.303) 73,91 1,84
96 744 1,87 ± 0,25 (P < 0,0009) 1.011 (688,79 – 1.311) 4.440 (3.475 – 6.303) 73,91 1,84
120 744 1,87 ± 0,25 (P < 0,0009) 1.011 (688,79 – 1.311) 4.440 (3.475 – 6.303) 73,91 1,84
144 744 1,87 ± 0,25 (P < 0,0009) 1.011 (688,79 – 1.311) 4.440 (3.475 – 6.303) 73,91 1,84
1
número total de indivíduos testados;
2
Intervalo de Confiança a 95% de probabilidade;
3
Teste qui-quadrado;
4
Graus de liberdade;
5
Fator de heterogeneidade.
 50

transformação oxidativa de moléculas endógenas e xenobióticos. A inibição dessa enzima

promovida por extratos de moléculas endógenas e xenobióticos. A inibição dessa enzima
promovida por extratos de plantas do genêro Piper impedem a detoxificação pelo inseto
(MEYER, 2005).

6.4.2 Efeito dos extratos selecionados sobre aspectos biológicos de T. absoluta

O extrato de sementes de A. muricata alongou a fase larval de T.

absoluta, além de causar elevada mortalidade de lagartas, diferindo do controle (Tabela
11). Não houve diferenças significativas quanto ao peso, duração e mortalidade pupal de T.
absoluta assim como para a razão sexual e longevidade de adultos (Tabela 12 e 13). O
extrato de folhas de A. muricata apenas prolongou o período de L1 a adulto (Tabela 13).
Para os extratos de P. amalago var. medium houve um
alongamento significativo da fase larval do inseto (Tabela 14), bem como da fase pupal
(Tabela 15). No entanto as médias de mortalidade, nesses estágios não diferiram do
controle. O extrato de P. amalago var. medium também alongou o período de L1 (lagartas
recém-eclodidas) a adulto e a longevidade do inseto (Tabela 16).
De maneira geral, os efeitos dos extratos sobre a biologia e
desenvolvimento de T. absoluta não foram pronunciados. Vale destacar que o alongamento
dos estágios de vida da traça é um efeito importante, uma vez que isso pode aumentar o
tempo de exposição da praga aos inimigos naturais, bem como o tempo médio de cada
geração, reduzindo a taxa de crescimento populacional. No entanto, o aumento causado
pelo uso dos extratos na duração dos diferentes estágios de T. absoluta foi em média de
apenas um dia. Provavelmente, a utilização de folhas inteiras e não folíolos como substrato
para as lagartas pode ter interferido na qualidade do alimento fornecido. Por se tratar de
uma área foliar de tamanho superior à utilizada nos experimentos anteriores (folíolos) é
possível que níveis mais elevados de nutrientes tenham proporcionado maior tolerância das
lagartas aos extratos. Vários trabalhos mostram os efeitos das acetogeninas de anonáceas
sobre a biologia e desenvolvimento de diversos insetos-praga.
Colom et al. (2007) avaliaram o efeito de acetogeninas purificadas
em dieta artificial de S. frugiperda. Os autores verificaram efeitos subletais pronunciados
em diferentes estágios de desenvolvimento desse inseto, como deficiência na melanização
de pupas, adultos com má formação de asas e abdome. Alterações morfológicas em
 51

Tabela 11. Médias (± EP) de mortalidade e duração da fase larval (dias) de T. absoluta
expostas a extratos etanólicos de folhas e sementes de A. muricata nas concentrações de
768,13 mg L -1 e 893,74 mg L-1, respectivamente. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase:
14 h.

Duração Mortalidade larval

Tratamento
(dias)1 (%)1
Annona muricata (F) 13,89 ± 0,13 ab 17,35±3,26 ab
Annona muricata (S) 14,38 ± 0,25 a 32,73±5,72 a
Controle2 13,54 ± 0,16 b 12,88±3,47 b
F 5,0309 4,9144
P 0,0139 0,0155
1
Médias seguidas de letras distintas, nas colunas, indicam diferenças significativas entre os tratamentos
(GLM com distribuição quasibinomial, P < 0,05);
2
Controle: metanol:acetona (1:1,v/v)
F: folhas; S: sementes.

Tabela 12. Médias (± EP) do peso (mg), mortalidade (%) e duração da fase pupal (dias) de
T. absoluta expostas a extratos etanólicos de folhas e sementes de A. muricata nas
concentrações de 768,13 mg L -1 e 893,74 mg L-1, respectivamente. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60
± 10%; Fotofase: 14 h.

Peso pupal Mortalidade Duração

Tratamento
(mg)1 pupal (%)2 (dias)1
Annona muricata (F) 3,61 ± 0,14 9,80 ± 3,77 8,87 ± 0,23
Annona muricata (S) 3,55 ± 0,13 10,15 ± 3,44 9,26 ± 0,22
Controle3 3,67 ± 0,04 11,74 ± 3,25 9,20 ± 0,09
F 0,2495ns 0,0378ns 1,1679ns
P 0,7809 0,9630 0,3262
1
Diferença não significativa entre os tratamentos (GLM com distribuição gaussiana, P < 0,05);
2
Diferença não significativa entre os tratamentos (GLM com distribuição quasibinomial, P < 0,05);
3
Controle: metanol:acetona (1:1,v/v)
F: folhas; S: sementes.
 52

Tabela 13. Médias (± EP) do período de L1 (lagarta recém-eclodida) a adulto (dias),

longevidade do adulto (dias) e razão sexual de T. absoluta expostas a extratos etanólicos de
folhas e sementes de A. muricata nas concentrações de 768,13 mg L -1 e 893,74 mg L-1,
respectivamente. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.

Período de L1 a adulto Longevidade Razão sexual3

Tratamento
(dias)1 (dias)2
Annona muricata (F) 37,00 ± 0,17 a 11,85 ± 0,42 0,46 ± 0,07
Annona muricata (S) 35,98 ± 0,39 ab 11,24 ± 0,38 0,51 ± 0,04
Controle4 35,54 ± 0,26 b 11,63 ± 0,37 0,52 ± 0,05
F = 3,6917 F = 3, 0127ns 2= 32,073ns
P = 0,03826 P = 0,0659 P = 0,6979
1
Diferença não significativa entre os tratamentos (GLM com distribuição gaussiana, P < 0,05);
2
Médias seguidas de letras distintas, nas colunas, indicam diferenças significativas entre os tratamentos
(GLM com distribuição gaussiana seguido por teste post hoc de Tukey, P < 0,05);
3
Diferença não significativa entre os tratamentos (GLM com distribuição binomial, P < 0,05);
4
Controle= metanol:acetona (1:1, v/v);
F: folhas; S: sementes.

Tabela 14. Médias (± EP) de mortalidade e duração da fase larval (dias) de T. absoluta
expostas ao extrato etanólico de folhas de P. amalago var. medium na concentração de
1.011 mg L-1.T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.

Duração Mortalidade
Tratamento
(dias)1 larval (%)2
Piper amalago var. medium 11,22 ± 0,17 a 32,05 ± 4,88
Controle (acetona) 10,60 ± 0,12 b 19,17 ± 6,09
F 9,0888 2,3645ns
P 0,0074 0,1415
1
Médias seguidas de letras distintas, nas colunas, indicam diferenças significativas entre os tratamentos (GLM
com distribuição gaussiana seguido por teste post hoc de Tukey, P < 0,05);
2
Diferença não significativa entre os tratamentos (GLM com distribuição quasibinomial, P < 0,05).
 53

Tabela 15. Médias (± EP) do peso (mg), mortalidade e duração da fase pupal (dias) de T.
absoluta expostas ao extrato etanólico de folhas de P. amalago var. medium na
concentração de 1.011 mg L-1. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.
Peso pupal Mortalidade Duração (dias)3
Tratamento
(mg)1 pupal (%)2
Piper amalago var. medium 4,47 ± 0,10 5,83 ± 3,30 11,15 ± 0,17 a
Controle 4,42 ± 0,10 12,32 ± 3,46 10,24 ± 0,07 b
F 0,0973ns 0,304ns 23,705
P 0,7587 0,5882 0,00012
1
Diferença não significativa entre os tratamentos (GLM com distribuição gaussiana, P < 0,05);
2
Diferença não significativa entre os tratamentos (GLM com distribuição quasibinomial, P < 0,05);
3
Médias seguidas de letras distintas, nas colunas, indicam diferenças significativas entre os tratamentos (GLM com
distribuição gaussiana seguido por teste post hoc de Tukey, P < 0,05).

Tabela 16. Médias (± EP) do período de L1 a adulto (dias), longevidade do adulto (dias) e
razão sexual de T. absoluta expostas ao extrato etanólico de folhas de P. amalago var.
medium na concentração de 1.011 mg L-1. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.
Período de L1
Longevidade
Tratamento a adulto Razão sexual 2
(dias)1
(dias)1
Piper amalago var. medium 37,88 ± 0,44 a 15,15 ± 0,20 a 0,55 ± 0,07
Controle (acetona) 36,01 ± 0,45 b 14,10 ± 0,13 b 0,51 ± 0,05
F = 8,8147 F = 7,7133 2= 24,751ns
P = 0,00822 P = 0,01243 P = 0,7663
1
Médias seguidas de letras distintas, nas colunas, indicam diferenças significativas entre os tratamentos
(GLM com distribuição gaussiana seguido por teste post hoc de Tukey, P < 0,05);
2
Diferença não significativa entre os tratamentos (GLM com distribuição binomial, P < 0,05).

lagartas e pupas também foram observados por Blessing et al. (2010), utilizando
acetogeninas extraídas de A. montana sobre a lagarta-do-cartucho. Grzybowski (2012)
verificou que os extratos etanólicos de sementes de A. muricata e de frutos de Piper
nigrum causaram modificações morfológicas em larvas do mosquito Aedes aegypti.

6.4.3 Avaliação quanto à preferência para oviposição de T. absoluta

No ensaio em que se avaliou a preferência para oviposição de T.

absoluta em condições de livre escolha, os extratos de folhas e sementes de A. muricata
foram classificados como neutros em relação ao controle (Tabela 17). No entanto, a
 54

Tabela 17. Médias (± EP) do número de ovos/planta de T. absoluta em teste de preferência

para oviposição com chance de escolha, em plantas tratadas com extratos etanólicos de
folhas e sementes de A. muricata nas concentrações de 768,13 mg L-1 e 893,74 mg L-1,
respectivamente e ao extrato de folhas de P. amalago var. medium na concentração de
1.011 mg L-1. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.

N°. Índice de
Intervalo de
Tratamento ovos/planta deterrência Classificação
classificação
(%) (± DP)
Annona muricata (F) 39,60 0,75 ± 0,40 1,00 ± 0,34 Neutro
Controle 60,40
Annona muricata (S) 35,42 0,68 ± 0,51 1,00 ± 0,42 Neutro
Controle 64,58
Piper amalago (F) 26,14 0,58 ± 0,42 1,00 ± 0,35 Deterrente
Controle 73,86
F= Folhas; S= Sementes.

deterrência à oviposição foi verificada nas plantas tratadas com o extrato de P. amalago
var. medium. O número de ovos depositados por T. absoluta foi reduzido pelo extrato de
Piper em cerca de 60% em relação ao controle. No teste sem chance de escolha, não houve
diferença entre os tratamentos avaliados (Tabela 18). Para o extrato de P. amalago var.
medium o padrão de oviposição não se manteve na ausência de escolha. Apesar disso, o
valor absoluto de ovos/planta do extrato de Piper foi o menor em comparação aos outros
tratamentos, com redução em torno de 35% em relação ao controle.
Utilizando extratos de folhas e sementes de meliáceas (Melia
azedarach e Azadiracta indica), respectivamente, Brunherotto et al. (2010) também
verificaram reduções na oviposição de T. absoluta em plantas de tomateiro tratadas com os
respectivos extratos.
A presença de compostos químicos na superfície das folhas
desempenha um papel importante na seleção do hospedeiro por mariposas e borboletas
(RENWICK; CHEW, 1994). Muitos extratos de plantas têm sido testados para avaliar a
atividade deterrente sobre uma variedade de insetos-praga, visando à utilização em
programas de manejo integrado de pragas (MORGAN; MANDAVA, 1990). Os extratos de
Piper apresentam características exclusivas do gênero, como diversificados modos de ação
presentes em um único composto ativo (SCOTT et al., 2004; DYER et al., 2003; PARK et
al., 2002). Bernard et al. (1995) observaram que a associação de compostos presentes no
 55

Tabela 18. Médias (± EP) do número de ovos/planta de T. absoluta em teste de oviposição

sem chance de escolha, em plantas tratadas com extratos etanólicos de folhas e sementes
de A. muricata nas concentrações de 768,13 mg L-1 e 893,74 mg L-1, respectivamente e
extratos de folhas de P. amalago var. medium na concentração de 1.011 mg L-1. T.: 25 ± 2
°C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.

Tratamento N° ovos/planta
Annona muricata (F) 48,60 ± 6,98
Annona muricata (S) 45,20 ± 9,60
Piper amalago var. medium (F) 35,80 ± 12,10
Controle (acetona) 55,40 ± 5,61
Controle (metanol:acetona, 1:1, v/v) 58,40 ± 6,33
F 1,0023ns
P 0,4296
ns
Diferença não significativa entre as médias (GLM com distribuição quase-Poisson, P < 0,05).

gênero Piper como por exemplo, lignanas ligadas ao grupo metilenedioxidofenil,

apresentam efeitos repelentes e deterrentes para várias espécies de insetos. Scott et al.
(2004) avaliaram a oviposição de Ostrinia nubilalis (Hübner) em plantas de Capsicum
annuum L. tratadas com o extrato de Piper guineense L. a 0,5%. Os autores encontraram
diferenças significativas entre o controle (água), e o extrato, o qual inibiu a oviposição do
inseto, comparativamente aos produtos comerciais utilizados (Ropel®, Garlic Barrier®).

6.4.4 Avaliação do efeito ovicida

O extrato de P. amalago var. medium apresentou toxicidade sobre

ovos de T. absoluta, diferindo significativamente do controle (Tabela 19). Entretanto, não
se verificou diferença entre as médias de lagartas eclodidas nos controles e extratos de A.
muricata.
A atividade ovicida de extratos com plantas do gênero Piper sp. foi
verificada por Boff e Almeida (1995) sobre Sitotroga cerealella Oliver. Esses autores
avaliaram o efeito tóxico dos extratos metanólicos e acetônicos de P. nigrum, obtidos por
diferentes métodos sobre ovos de diferentes idades do inseto. Os resultados demonstraram
 56

Tabela 19. Médias (± EP) de eclosão de lagartas de T. absoluta após pulverização com os
extratos etanólicos de folhas e sementes de A. muricata nas concentrações de 768,13 mg L-
1
e 893,74 mg L-1, respectivamente e de folhas de P. amalago var. medium na concentração
de 1.011 mg L-1 sobre ovos do inseto. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.

Tratamento Eclosão de lagartas (%)1

Annona muricata (F) 97,71 ± 0,80 a
Annona muricata (S) 96,85 ± 1,16 a
P. amalago var. medium (F) 84,43 ± 5,47 b
Controle (acetona) 96,85 ± 1,54 a
Controle (metanol:acetona, 1:1, v/v) 97,53 ± 0,96 a
2 54,334
P < 0,0001
1
Médias seguidas de letras distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos (GLM com
distribuição binomial seguido por teste post hoc de Tukey, P < 0,05);
F= Folha; S= sementes

que os extratos apresentaram efeito tóxico dependente da concentração, para todas as

idades de ovos.
Tavares et al. (2011) avaliaram o efeito da amida piperina extraída
de frutos de P. nigrum sobre ovos de diferentes idades de S. frugiperda e Diatraea
saccharalis (Fabr.) nas concentrações de 1 e 2%. Os autores concluíram que, em ovos com
24 horas de idade, a concentração de 1% de piperina foi suficiente para suprimir a eclosão
de lagartas das espécies estudadas em cerca de 90%.
Informações referentes aos efeitos de extratos botânicos sobre ovos
de T. absoluta são restritos na literatura (BRUNHEROTTO et al., 2010; THOMAZINI et
al., 2000; FERREIRA, 2011). Esses autores avaliaram o efeito ovicida de diferentes
meliáceas, incluindo o nim (A. indica) e não observaram efeitos sobre os ovos da traça-do-
tomateiro, semelhantes aos resultados encontrados neste trabalho para os extratos de A.
muricata. Segundo Schmutterer (1988), diversos trabalhos mostram que aplicações de altas
concentrações de extratos de plantas, podem resultar em pequenos efeitos ou mesmo em
nenhum efeito ovicida. Geralmente, ovos de lepidópteros possuem uma camada lipídica ou
cerosa na parte interna do córion do ovo que impede a penetração de inseticidas (SMITH;
SALKELD, 1966). É possível que, os compostos ativos dos extratos de A. muricata não
conseguiram penetrar nessa camada lipídica e afetar o desenvolvimento embrionário de T.
absoluta, ou ainda, que sejam inócuos aos ovos do inseto.
 57

Para outras ordens de insetos, alguns trabalhos mostram o efeito

ovicida de extratos de plantas do gênero Annona. Kempraj e Bhat (2011) encontraram
efeito ovicida de todas as frações avaliadas do extrato etanólico de sementes de Annona
squamosa sobre o díptero Aedes albopitus (Skuse). Com o coleóptero Callosobruchus
maculatus F., Dharmasena et al. (2001) utilizaram extratos acetônicos e etanólicos de
folhas frescas de A. squamosa e encontraram efeitos deletérios sobre ovos recém
ovipositados desse inseto.

6.4.5 Avaliação do efeito translaminar sobre T. absoluta

Os extratos de folhas e de sementes de A. muricata

apresentaram efeito translaminar significativo sobre T. absoluta em todos os períodos de
avaliação (Tabela 20). Com relação ao efeito dos extratos de A. muricata sobre o peso das
lagartas, verificou-se diferença significativa em relação ao controle (metanol:acetona, 1:1,
v/v) reduzindo o valor desse parâmetro. Deve-se ressaltar que o extrato de folhas de A.
muricata diferiu também do controle acetona, solvente utilizado na ressuspensão do extrato
de P. amalago var. medium. Para o extrato de folhas de P. amalago var. medium não
houve difernça significativa com relação a mortalidade de lagartas. Em relação ao peso, P.
amalago var. medium diferiu apenas do controle (acetona:metanol, 1:1, v/v), utilizado para
a ressuspensão dos extratos de A. muricata. De acordo com os resultados, os extratos de A.
muricata são capazes de penetrar no mesófilo foliar e atingir as lagartas. Provavelmente,
esse efeito translaminar seria mais pronunciado se tivessem sido utilizados plantas
cultivadas em vasos e não apenas folhas, já que a translocação do extrato na planta se daria
também por via sistêmica, potencializando os efeitos encontrados.
A ação translaminar dos compostos inseticidas dos extratos de A.
muricata assegura maior proteção dos compostos ativos contra os fatores ambientais, tais
como temperatura e raios ultravioletas, e aumentando a persistência do produto. Essa é
uma característica interessante para produtos de origem botânica que normalmente
apresentam rápida degradação, principalmente quando expostos às condições naturais.
Ainda sobre o peso das lagartas, é possível que a redução do peso
esteja relacionada à pouca ingestão de alimento, devido à presença de compostos
inibidores de alimentação. Outra hipótese seria a de que os extratos de A. muricata
poderiam causar efeitos nocivos às células do intestino, restringindo a digestão e absorção
de alimento. As acetogeninas de anonáceas são bem conhecidas por sua toxicidade aguda,
 58

Tabela 20. Médias (± EP) de mortalidade e peso (mg) de T. absoluta expostas a extratos etanólicos de folhas e sementes de A. muricata nas
concentrações de 3.840 mg L-1 e 4.468 mg L-1, respectivamente e para o extrato de folhas de P. amalago var. medium na concentração de
5.055 mg L-1, após a penetração no mesófilo foliar. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; Fotofase: 14 h.

Tempo de exposição (horas)1 Peso larval

Tratamento
24 48 72 96 120 144 (mg)2
A. muricata (F) 49,00 ± 13,41 a 49,00 ± 13,41 a 49,00 ± 13,41 a 49,00 ± 13,41 a 49,00 ± 13,41 a 50,00 ± 5,70 a 3,62 ± 0,86 c
A. muricata (S) 41,00 ± 6,20 ab 41,00 ± 6,20 ab 41,00 ± 6,20 ab 41,00 ± 6,20 ab 41,00 ± 6,20 ab 43,00 ± 6,04 ab 6,56 ± 1,45 bc
P. amalago (F) 23,00 ± 4,64 bc 23,00 ± 4,64 bc 23,00 ± 4,64 bc 23,00 ± 4,64 bc 24,00 ± 4,58 bc 24,00 ± 4,58 bc 9,06 ± 1,17 b
Controle (acetona) 9,00 ± 2,92 c 9,00 ± 2,92 c 9,00 ± 2,92 c 9,00 ± 2,92 c 9,00 ± 2,91 c 10,00 ± 3,16 c 12,88 ± 2,01 ab
3
Controle 11,00 ± 5,57 c 11,00 ± 5,57 c 11,00 ± 5,57 c 11,00 ± 5,57 c 11,00 ± 5,57 c 11,00 ± 5,57 c 13,10 ± 2,47 a
F 10,001 10,001 10,001 10,001 10,192 10,721 5,8183
P 0,00012 0,00012 0,00012 0,00012 0,000115 < 0,0001 0,00284
1
Médias seguidas de letras distintas, nas colunas, indicam diferenças significativas entre os tratamentos (GLM com distribuição quase-binomial seguido por teste post hoc de Tukey, P
< 0,05);
2
Médias seguidas de letras distintas, na coluna, indicam diferenças significativas entre os tratamentos (GLM com distribuição gaussiana seguido por teste post hoc de Tukey, P < 0,05);
3
Controle= metanol:acetona (1:1, v/v);
F= Folha; S= Semente.
 59

mas raramente pelos seus efeitos anti-alimentares (GUADAÑO et al. 2000). Blessing et al.
(2010) estudaram os efeitos tóxicos e anti-alimentares de acetogeninas isoladas do extrato
de A. montana sobre S. frugiperda. Todas as acetogeninas adicionadas na dieta artificial
do inseto promoveram elevada toxicidade aguda sobre as fases larval e pupal. Entretanto,
apenas algumas acetogeninas inibiram a alimentação das lagartas em cerca de 80%. Os
autores afirmam que os efeitos tóxicos e anti-alimentares observados variam conforme a
presença de grupamentos do tipo tetraidrofurânicos (THF) na cadeia das acetogeninas, e
que são necessários estudos para elucidar os mecanismos e os requerimentos estruturais
necessários para que a atividade deterrente aconteça. Segundo Rupprecht et al. (1990), as
acetogeninas podem ser mono-THF, bis-THF adjacentes, bis-THF não adjacentes, não
conter anéis THF e ainda acetogeninas não clássicas que possuem anel tetraidropirânico.
Colom et al. (2007) também avaliaram os efeitos tóxicos e
deterrentes de alimentação de acetogeninas extraídas de A. cherimólia para S. frugiperda.
A acetogenina esquamocina causou 100% de mortalidade na fase larval do inseto e reduziu
a eficiência na conversão do alimento em biomassa. Portanto, isso pode ser um indicativo
de que a inibição do complexo I mitocondrial, muito estudado em diversos organismos não
seja o único modo de ação das anonáceas que causam toxicidade a insetos.

6.5 Fracionamento dos extratos de A. muricata

O rendimento em frações dos extratos selecionados apresentou

grande variação, de 10,61 a 55,23% (Tabela 21). As frações hexânica e hidroalcóolica do
extrato de sementes de A. muricata apresentaram os maiores rendimentos, com 55,23 e
38,46%, respectivamente. O elevado rendimento da fração hexânica se deve ao elevado
conteúdo lipofílico, normalmente encontrado em sementes do gênero Annona, comumente
extraído com solventes de menor polaridade como o hexano, justificando esse maior
rendimento. Para o extrato de folhas de A. muricata, o maior rendimento foi obtido na
fração em acetato de etila (27,48%), seguido da fração em diclorometano (16,98%) e
hexano (12,38%). Com isso, verifica-se que as frações com polaridade intermediária
(acetato de etila e diclorometano) apresentaram os melhores rendimentos.
 60

Tabela 21. Rendimento das partições dos extratos etanólicos de folhas e sementes de A.
muricata

Espécie vegetal Peso extrato Rendimento1

Frações
(estrutura) (g) (g) (%)
Hexano 1,05 12,38

Diclorometano 1,44 16,98

Annona muricata (F) 8,48
Acetato de etila 2,33 27,48
Hidroálcool 0,90 10,61

Hexano 3,59 55,23

Annona muricata (S) 6,50
Hidroálcool 2,50 38,46
F: folhas; S: sementes

6.5.1 Avaliação da bioatividade das partições obtidas

Verificou-se que as frações em diclorometano e acetato de etila do

extrato de folhas de A. muricata apresentaram as maiores médias de mortalidade, diferindo
do controle [metanol:acetona (1:1, v/v)] após 24 horas de exposição (Tabela 22). A
redução no peso larval foi verificada nas frações citadas anteriormente, além da fração
hidroalcóolica. Para o extrato de sementes de A. muricata, a fração hidroalcoólica causou
maior mortalidade de lagartas quando comparado ao controle, em todos os períodos de
observação (Tabela 23). Ao final do ensaio, o nível de mortalidade foi quatro vezes
superior ao obtido no controle. Em relação ao efeito das frações sobre o peso do inseto, a
fração hidroalccólica reduziu em 32,32% o peso das lagartas, diferindo do controle.
Verifica-se que as frações em diclorometano e acetato de etila do extrato de folhas de A.
muricata e a fração hidroalcóolica do extrato de sementes apresentaram os melhores
resultados. No entanto, os efeitos da fração hexânica do extrato de sementes de A. muricata
sobre a fase larval do inseto foram baixos.
SOUSA et al. (2009) observaram que no fracionamento do extrato
de folhas de A. muricata os solventes polares ou com polaridades intermediárias
apresentaram maior concentração de acetogeninas.
Grzybowski (2012) obteve excelentes resultados sobre o crustáceo
Artemia salina tanto com o extrato bruto de sementes de A. muricata, quanto nas frações
mais polares do extrato. Para as frações hexânica e em clorofórmio não foi verificada
 61

Tabela 22. Médias (± EP) de mortalidade e peso (mg) de lagartas de T. absoluta expostas as frações do extrato etanólico de folhas de A.
muricata, na concentração de 768,13 mg L-1. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; fotofase: 14 h.

Tempo de exposição (horas)1 Peso larval

Frações
24 48 72 96 120 144 (mg)2
Hexânica 18,75 ± 4,31 bc 18,75 ± 4,31 bc 19,64 ± 5,00 bc 21,43 ± 4,69 bc 21,43 ± 4,69 bc 21,43 ± 4,69 bc 0,69 ± 0,10 ab
Diclorometânica 38,39 ± 6.88 a 40,18 ± 7,32 a 41,07 ± 7,82 a 45,54 ± 7,56 a 45,54 ± 7,56 a 45,54 ± 7,56 a 0,58 ± 0,10 b
Acetato de etila 30,36 ± 6,74 ab 31,25 ± 6,82 ab 33,93 ± 5,92 ab 33,93 ± 5,92 ab 33,93 ± 5,92 ab 33,93 ± 5,92 ab 0,65 ± 0,07 b
Hidroalcoólica 1,78 ± 1,15 d 1,78 ± 1,15 d 1,78 ± 1,15 d 4,46 ± 2,63 c 5,36 ± 2,52 c 5,36 ± 2,52 c 0,57 ± 0,04 b
Metanol:acetona(1:1) 6,25 ± 1,92 cd 6,25 ± 1,92 cd 6,25 ± 1,92 cd 8,03 ± 2,63 c 8,03 ± 2,63 c 8,03 ± 2,63 c 0,99 ± 0,09 a
Metanol:água (1:1)3 0,89 ± 0,89 d 2,68 ± 1,26 d 2,68 ± 1,26 d 2,68 ± 1,26 d 2,68 ± 1,26 d 2,68 ± 1,26 d 0,67 ± 0,06 ab
F 15,919 15,539 16,587 14,900 15,165 15,165 3,673
P < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,0086
1
Médias seguidas de letras distintas, nas colunas de cada concentração testada, indicam diferenças significativas entre os tratamentos (GLM com distribuição quase-binomial seguido
por teste post hoc de Tukey, P < 0,05);
2
Médias seguidas de letras distintas, nas colunas de cada concentração testada, indicam diferenças significativas entre os tratamentos (GLM com distribuição gaussiana seguido por
teste post hoc de Tukey, P < 0,05);
3
Controle = utilizado para a suspensão da fração hidroalcoólica do extrato de folhas.
 62

Tabela 23. Médias (± EP) de mortalidade e peso (mg) de lagartas de T. absoluta expostas as frações do extrato de sementes de A. muricata, na
concentração de 893,74 mg L-1. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; fotofase: 14 h.

Tempo de exposição (horas)1 Peso larval

Frações
24 48 72 96 120 144 (mg)2
Hexânica 13,39 ± 3,46 ab 13,39 ± 3,46 ab 14,28 ± 3,26 b 14,28 ± 3,26 b 14,28 ± 3,26 b 14,28 ± 3,26 b 0,99 ± 0,06 a
Hidroalcoólica 21,43 ± 3,00 a 21,43 ± 3,00 a 33,93 ± 3,57 a 36,61 ± 4,19 a 36,61 ± 4,19 a 36,61 ± 4,19 a 0,67 ± 0,05 b
3
Metanol:acetona (1:1) 6,25 ± 1,92 b 6,25 ± 1,92 b 6,25 ± 1,92 b 8,03 ± 2,63 b 8,03 ± 2,63 b 8,03 ± 2,63 b 0,99 ± 0,09 a
F 6,9132 6,9132 19,796 21,250 21,250 21,250 7,641
P 0,0059 0,0059 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,0039
1
Médias seguidas de letras distintas, nas colunas de cada concentração testada, indicam diferenças significativas entre os tratamentos (GLM com distribuição quase-binomial
seguido por teste post hoc de Tukey, P < 0,05);
2
Médias seguidas de letras distintas, nas colunas de cada concentração testada, indicam diferenças significativas entre os tratamentos (GLM com distribuição gaussiana seguido
por teste post hoc de Tukey, P < 0,05);
3
Controle.
 63

atividade sobre A. salina. É possível que a presença de grupos hidroxilas na estrutura de

muitas acetogeninas esteja relacionada com a solubilidade desses compostos em solventes
com maior polaridade (GU et al., 1995).

6.5.2 Análise cromatografica em camada delgada (CCD)

Os perfis cromatográficos, obtidos por cromatografia em camada

delgada (CCD), das frações bioativas sobre lagartas de T. absoluta dos extratos de folhas e
sementes de A. muricata, em diferentes eluentes e reveladores, encontram-se representados
nas Figuras 5 e 6. O revelador anisaldeido sulfúrico (perfil cromatográfico A), capaz de
detectar compostos como esteroides e terpenóides mostraram resultados positivos nas
amostras analisadas (Figura 5), da mesma maneira para o revelador iodo (perfil
cromatográfico B), considerado um reagente universal. Quando se utilizou o revelador
específico para alcaloides, Dragendorff (perfil cromatográfico C) não foi possível detectar
esse tipo de composto nas amostras, assim como para o revelador sulfato cérico (perfil
cromatográfico D). Quando as cromatoplacas foram reveladas com luz UV, apenas a
cromatoplaca C na amostra 1 apresentou compostos que possuem grupos cromóforos. Essa
detecção somente ocorreu com o aumento da polaridade (Figura 6). Uma analise geral das
cromatoplacas indica similaridade entre as frações em diclorometano e acetato de etila do
extrato de folhas de A. muricata e poderá auxiliar na análise dos resultados dos ensaios
com T. absoluta.

6.5.3 Ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN de 1H)

O espectro de RMN de 1H da partição hidroalcoólica do extrato
etanólico de sementes de A. muricata (Figura 8) mostrou a presença majoritária de
acetogeninas (estrutura geral mostrada na Figura 7) na amostra analisada. Isso se deve à
presença dos seguintes sinais: hidrogênios da insaturação do anel lactônico em
deslocamento químico δH 7,40; diversos sinais em torno de δ H 5,2-5,4, característicos de
hidrogênio do carbono insaturado do anel lactônico; sinais entre δ H 3,35-3,84, que são
característicos dos hidrogênios de grupos metínicos (CH) da cadeia alquílica ligados
diretamente a grupos hidroxilas ou a grupos epóxido; sinais na faixa δ H 2,01-2,52 que são
característicos de hidrogênios α-lactônicos e/ou α- carbonílicos, no caso de moléculas com
grupos cetonas nas cadeias alquílicas; sinais na faixa de δ H 1,4-1,7, referentes aos diversos
 64

Figura 4. Perfis cromatográficos das frações dos extratos de folhas e sementes de A. muricata; eluente: hexano:acetato de etila (8:2, v/v);
Amostras: (1) Fração em diclorometano do extrato de folhas de A. muricata; (2) Fração em acetato de etila do extrato de folhas de A. muricata
e (3) Fração hidroalcóolica do extrato de sementes de A. muricata; em diferentes reveladores (A) anisaldeído sulfúrico; (B) iodo; (C)
Dragendorff e (D) sulfato cérico.
 65

Figura 5. Perfis cromatográficos das frações do extrato de folhas e sementes de A. muricata; Amostras: (1) Fração em diclorometano do
extrato de folhas de A. muricata; (2) Fração em acetato de etila do extrato de folhas de A. muricata; (3) Fração hidroalcóolica do extrato de
sementes de A. muricata; em diferentes eluentes através de luz ultravioleta (A) hexano:acetato de etila (7:3 v/v); (B) hexano:acetato de etila
7:3 (v/v) com inversão da polaridade; (C) acetato de etila:metanol (8:2, v/v) aumento na polaridade.
 66

grupos CH2 que ocorrem ao longo das cadeias alquílicas e sinais em δ H 0,9, característicos
de metilas terminais de cadeias alquílicas longas.

OH OH
O O 32/34
n m
OH
O O
35/37

Figura 7. Estrutura geral de acetogeninas

O espectro da fração diclorometânica do extrato etanólico de folhas

de A. muricata também apresentou sinais característicos na região de acetogeninas (Figura
9). Por sua vez, a partição em acetato de etila do extrato etanólico de folhas de A. muricata
(Figura 10) apresentou semelhanças com a anterior, sugerindo a presença de acetogeninas
bastante hidroxiladas, fato que ainda deve ser melhor elucidado em outras análises
complementares ou ao longo das etapas do fracionamento biomonitorado a ser realizado.
 67

Figura 8. Espectro de RMN de 1H da partição hidroalcóolica do extrato bruto de sementes de A. muricata (DMSO d6, 400 MHz).
 68

Figura 9. Espectro de RMN de 1H da partição diclorometânica do extrato bruto de folhas de A. muricata (CDCl3, 400MHz).
 69

Figura 10. Espectro de RMN de 1H da partição acetato de etila do extrato bruto de folhas de A. muricata (DMSO-d6, 400MHz).
 70

6.6 Bioensaios de toxicidade comparada

A análise inical realizada para quantificação dos limonóides

presentes no biopesticida Azamax® os resultados revelaram a presença de 6.220,15 mg L-1
de azadiractina e 2.596 mg L-1 de 3-tigloylazadirachtol.
No ensaio de laboratório que comparou a toxicidade entre o extrato
formulado de sementes de A. muricata e formulações comerciais à base de acetogeninas e
azadiractina + 3-tigloylazadirachtol, verificou-se que todos os tratamentos diferiram
significativamente dos controles (água deionizada e metanol + Tween 80), a partir de 24
horas (Tabela 24). O extrato de sementes de A. muricata causou mortalidade de lagartas
próxima a 92% após 48 horas, semelhante àquelas obtidas para a formulação comercial
(Anosom®) à base de acetogeninas (94,64%) e para Azamax (94,64%). Com relação ao
efeito dos tratamentos sobre o peso de T. absoluta, não foi possível incluir essa variável na
análise estatística devido ao número reduzido de lagartas sobreviventes. No entanto, estes
tratamentos revelaram expressiva redução no peso dos insetos.
No ensaio em casa de vegetação, não houve diferença entre os
tratamentos quanto à mortalidade de lagartas (Tabela 25). A formulação Azamax® reduziu
significativamente o peso larval em relação aos controles em cerca de 60%.
O efeito inseticida dos tratamentos observados em laboratório não
se manteve quando o ensaio foi realizado em casa de vegetação. Apesar disso, verifica-se
que a mortalidade causada pelo extrato de sementes de A. muricata em relação à
mortalidade obtida pelas formulações comerciais foi semelhante. A rápida degradação dos
compostos ativos seria uma justificativa para o baixo efeito inseticida dos tratamentos em
casa de vegetação. A instabilidade de produtos de origem botânica na presença de luz e
outros fatores ambientais é uma característica negativa sob o ponto de vista econômico, já
que sucessivas aplicações são necessárias no decorrer do ciclo da cultura. Novos ensaios
em casa de vegetação (condições ambientais controladas) devem ser realizados, a fim de
melhor esclarecer as diferenças de resultados encontradas nos dois ambientes.
 71

Tabela 24. Médias (± EP) de mortalidade e peso (mg) de lagartas de T. absoluta expostas ao extrato de sementes de A. muricata e diferentes
formulações comerciais em condições de laboratório. T.: 25 ± 2 °C; U. R.: 60 ± 10%; fotofase: 14 h.

Tempo de exposição (horas)1 Peso larval

Tratamento Concentração 24 48 72 96 120 144 (mg)2
(mg L-1)
A. muricata 1.817 88,39 ± 2,52 a 91,96 ± 2,63 a 91,96 ± 2,63 a 91,96 ± 2,63 a 91,96 ± 2,63 a 91,96 ± 2,63 a 0,4 (9)*
Anosom® 2.000 91,96 ± 2,25 a 94,64 ± 1,63 a 94,64 ± 1,63 a 94,64 ± 1,63 a 94,64 ± 1,63 a 94,64 ± 1,63 a 0,2 (6)*
Azamax® 30 93,75 ± 3,05 a 94,64 ± 2,87 a 94,64 ± 2,87 a 94,64 ± 2,87 a 94,64 ± 2,87 a 94,64 ± 2,87 a 0,18 (6)*
Controle3 - 29,46 ± 2,96 b 34,82 ± 3,01 b 34,82 ± 3,01 b 34,82 ± 3,01 b 34,82 ± 3,01 b 34,82 ± 3,01 b 3,33 ± 0,71 b
4
Controle - 14,28 ± 2,25 c 15,18 ± 2,31 c 15,18 ± 2,31 c 15,18 ± 2,31 c 15,18 ± 2,31 c 15,18 ± 2,31 c 6,3 ± 0,68 a
F 93,28 91,616 91,616 91,616 91,616 91,616 9,0948
P < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,0108
1
Médias seguidas de letras distintas, nas colunas, indicam diferenças significativas entre os tratamentos (GLM com distribuição quase-binomial seguido por teste post hoc de
Tukey, P < 0,05);
2
Médias seguidas de letras distintas, na coluna, indicam diferenças significativas entre os tratamentos (GLM com distribuição gaussiana seguido por teste post hoc de Tukey, P < 0,05);
* Não incluído na análise devido ao reduzido número de lagartas sobreviventes (reduzido número de unidade amostral).
3
Controle= Metanol + Tween 80
4
Controle= Água deionizada
 72

Tabela 25. Médias (± EP) de mortalidade e peso (mg) de lagartas de T. absoluta expostas ao extrato de sementes de A. muricata e diferentes
formulações comerciais em condições de casa de vegetação em Botucatu, no período de dez/2013.

Peso larval
Tratamento Mortalidade (%) 1 E.C.2
Total (mg) 3 Relativo4
Extrato A. muricata 26,36 ± 4,04 13,33 0,91 ± 0,00015 ab 61,54
Anosom® 30,25 ± 1,57 22,37 0,84 ± 0,00013 ab 64,13
Azamax® 26,86 ± 3,09 14,47 0,56 ± 0,00019 a 42,39
Controle5 21,62 ± 2,70 -- 1,49 ± 0,00023 b 100,00
Controle6 20,81 ± 3,22 -- 1,31 ± 0,00021 b 100,00
F 1,6536 ns -- 4,0738 --

P 0,1868 -- 0,0094 --
1
Diferença não significativa entre os tratamentos (GLM com distribuição quase-binomial, P < 0,05);
2
E.C.: Eficácia de controle calculada pela formula de Abbott (1925);
3
Médias seguidas de letras distintas indicam diferenças significativas entre os tratamentos (GLM com distribuição Gaussiana seguido por teste post hoc de Tukey, P < 0,05);
4
Calculado com base na comparação relativa do tratamento com o seu respectivo controle;
5
Controle= Metanol + Tween 80;
6
Controle= Água deionizada.
 73

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O extrato etanólico de folhas de P. amalago var. medium ocasionou
elevada toxicidade à lagartas de T. absoluta em baixas concentrações. Além disso, o efeito
deletério do extrato sobre ovos da traça foi um resultado importante, assim como a inibição
da oviposição do inseto.
P. amalago var. medium é uma planta de sub-bosque com ampla
dispersão no território nacional, principalmente em florestas de matas secundárias
(YUNCKER, 1974). Diversos trabalhos mostram a atividade biológica de Piper amalago;
entretanto, este é o primeiro estudo a mostrar sua atividade inseticida. A eficiência dos
extratos de Piper spp. como inseticida botânico tem sido correlacionada com a
concentração de piperamidas (SCOTT et al., 2005). Essas amidas apresentam propriedades
neurotóxicas, responsáveis pela morte imediata do inseto e demanda apenas um efeito
residual curto. Observou-se que a mortalidade de lagartas de T. absoluta quando em
contato com resíduos do extrato de P. amalago var. medium foi rápida e concentrada,
principalmente no primeiro dia de avaliação. Assim, o extrato de folhas de P. amalago var.
medium poderia ser utilizado para o controle de T. absoluta em tomateiro, principalmente
em períodos próximos à colheita com menores riscos de que os resíduos do produto
permaneçam nos alimentos, uma vez que uma das limitações de uso de inseticidas
botânicos à base de piperamidas é o tempo de meia vida curto.
 74

Este estudo também demonstrou a eficiência e o potencial de uso

de Annona muricata no controle de T. absoluta em tomateiro. As análises químicas dos
extratos de A. muricata confirmaram a presença de acetogeninas de anonáceas. Os efeitos
tóxicos dessas acetogeninas vêm sendo reportado para espécies de insetos-praga com
diferentes hábitos alimentares (GUADAÑO et al., 2000; LEATEMIA; ISMAN, 2004a,
2004b; DHARMASENA et al., 2001; COLOM et al., 2007, 2008; BLESSING et al., 2010;
DE CASSIA SEFRIN et al., 2010; RIBEIRO et al., 2013). Para insetos com hábito
minador, como T. absoluta, os presentes resultados indicam que os extratos de A. muricata
são capazes de penetrar no mesófilo foliar e atingir as lagartas, mostrando que as
acetogeninas também atuam em profundidade. Além disso, observou-se elevada toxicidade
aguda dos extratos sobre a fase larval do inseto em baixas concentrações. No teste de
toxicidade comparada, o extrato de sementes de A. muricata causou elevada mortalidade
larval, semelhante às obtidas com formulações comerciais à base de acetogeninas
(Anosom®) e à base de limonóides (Azamax®). Os fracionamentos biomonitorados dos
extratos de A. muricata permitiram caracterizar a classe de compostos mais ativos sobre T.
absoluta. Como ocorrem com outras espécies do gênero, os extratos de A. muricata podem
servir como modelo químico para as indústrias na síntese de produtos socialmente mais
aceitáveis e que podem ser utilizados de forma integrada em programas de manejo de
pragas (VENDRAMIM; CASTIGLIONI, 2000; ISMAN, 2006; RIBEIRO et al., 2013).
Os extratos de A. muricata também são promissores para o controle
da traça-do-tomateiro em pequenas áreas de cultivo. Tradicionalmente, diferentes espécies
de anonáceas têm sido utilizadas como inseticidas botânicos através de preparações
caseiras, especialmente em pequenas propriedades rurais de países em desenvolvimento e
subdesenvolvidos (ISMAN, 2003; OKONKWO, 2005; CASTILLO-SÁNCHEZ et al.,
2010). Para a extração das acetogeninas de anonáceas, a utilização de solventes com maior
polaridade, como o etanol, beneficia a obtenção desses compostos em maiores
concentrações (SOUSA et al., 2009). Além disso, o extrato de sementes de A. muricata
apresenta bom rendimento de extração com solvente etanol, o que traz boas perspectivas de
uso em condições de campo e semi-campo, em razão da maior facilidade de uso e
segurança na obtenção e manipulação dos extratos (ONIMAWO, 2002).
Espécies do gênero Annona são caracterizadas pela elevada
presença de óleo em suas sementes que são passíveis de serem extraídas com etanol
(FONTANA et al., 1998; ONIMAWO, 2002; BRANCO et al., 2010). Esse elevado
 75

rendimento dos extratos, aliado ao potencial inseticida dos mesmos, sugerem um uso
potencial desses materiais, que são normalmente descartados pela indústria no
processamento de frutas (EGYDIO et al., 2011; RIBEIRO et al., 2013).
Para a produção de inseticidas botânicos em escala comercial, é
necessário que a biomassa atenda a demanda de matéria prima em quantidades suficientes
durante o ano. A utilização de resíduos provenientes da indústria alimentícia é uma forma
de produção sustentável de produção de biomassa. A. muricata conhecida popularmente
como graviola, é produzida comercialmente no Brasil e seus frutos são ofertados ao longo
de todo ano. Devido a sua alta perecibilidade, é considerada uma fruta típica da
industrialização. Segundo Mclaughlin et al. (1997), a extração de suas sementes,
geralmente considerados como produtos de resíduos na produção de polpa, poderia ser
utilizada em preparações inseticidas potencialmente úteis. Sob o ponto de vista econômico,
uma indústria que processa 500 toneladas de polpa consegue extrair 35 toneladas de
sementes, o que representa matéria-prima a um custo inicial zero (GRZYBOWSKI et al.,
2013).
Já existem no mercado internacional formulações comerciais à base
de acetogeninas de anonáceas como ANOSOM® CE (10 g i.a/L de anonina). Um estudo
realizado recentemente avaliou o número de novos ingredientes ativos (i.a) registrados pela
Agência de Proteção Ambiental (EPA) nos Estados Unidos desde 1997 e verificou que do
número total de pesticidas registrados, 20% são produtos naturais ou derivados de produtos
naturais (CANTRELL et al., 2012). Isso ressalta ainda mais a importância de pesquisas
como esta na descoberta e desenvolvimento de novos produtos a serem disponibilizados
para os programas de manejo integrado de pragas.
 76

8 CONCLUSÕES

 Os extratos etanólicos de folhas e sementes de A. muricata e o extrato de folhas de

P. amalago var. medium apresentam elevada toxicidade sobre lagartas de T.
absoluta nas concentrações de 0,1% e 0,5%, respectivamente;

 O extrato etanólico de folhas P. amalago var. medium apresenta efeito deterrente à

oviposição de T. absoluta;

 Os extratos etanólicos de folhas e sementes de A. muricata apresentam efeito

translaminar;

 As frações em diclorometano e em acetato de etila do extrato etanólico de folhas de

A. muricata e a fração hidroalcóolica do extrato das sementes da mesma espécie
apresentam maior toxicidade a lagartas de T. absoluta;

 A análise química das frações mais ativas dos extratos de A. muricata sobre T.
absoluta, confirma a presença de acetogeninas.

 Em laboratório, o extrato de sementes de A. muricata apresenta toxicidade a

lagartas de T. absoluta semelhante a de produtos comerciais à base de acetogeninas
 77

[anonina (Anosom®)] e limonóides [azadiractina + 3-tigloylazadirachtol

(Azamax®)].
 78

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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