UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA E BIOLOGIA EVOLUTIVA

ANÁLISE TRANSCRIPTÔMICA DAS GLÂNDULAS DE

VENENO DA MICRURUS CORALLINUS (COBRA-CORAL)

E IDENTIFICAÇÃO DE CANDIDATOS ANTIGÊNICOS

PARA UM ANTI-SORO ALTERNATIVO

LUCIANA IWANAGA LEÃO

SÃO PAULO
2008
 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA E BIOLOGIA EVOLUTIVA

ANÁLISE TRANSCRIPTÔMICA DAS GLÂNDULAS DE

VENENO DA MICRURUS CORALLINUS (COBRA-CORAL)

E IDENTIFICAÇÃO DE CANDIDATOS ANTIGÊNICOS

PARA UM ANTI-SORO ALTERNATIVO

Dissertação apresentada ao Instituto de

Biociências da Universidade de São Paulo,
para a obtenção de Título de Mestre em
Ciências, na Área de Genética e Biologia
Evolutiva.

Orientador: Dr. Inácio de Loiola Meirelles

Junqueira de Azevedo

LUCIANA IWANAGA LEÃO

SÃO PAULO
2008

2
 Leão, Luciana I.
Análise transcriptômica das glândulas de veneno de
Micrurus corallinus (cobra-coral) e identificação de
candidatos antigênicos para um anti-soro alternativo

127 p.

Dissertação (Mestrado) - Instituto de

Biociências da Universidade de São Paulo.
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva.

1. Micrurus corallinus 2. Anti-soro

antielapídico 3. Transcriptoma I. Universidade de
São Paulo. Instituto de Biociências. Departamento
de Genética e Biologia Evolutiva.

Comissão Julgadora:

________________________ _______________________
Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).

________________________ _______________________
Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).

______________________
Prof(a). Dr.(a).
Orientador(a)

3
À minha mãe, Yako, e a meu pai, Luiz
Aos meus irmãos, Cris e Du
E ao meu querido Marcelo

4
 Ever tried. Ever failed.
No matter.
Try again. Fail again.
Fail better.
—Samuel Beckett, Worstward Ho

Non est ad astra mollis e terris via.

—Sêneca, Hercules Furens

Au milieu de l’hiver, j’ai découvert en moi un invincible été.

—Albert Camus, Noces à Tipasa

5
Agradecimentos

Ao Dr. Inácio de L. M. Junqueira de Azevedo, que me ensinou a correr atrás dos

meus objetivos. Sua orientação, neste trabalho, garantiu que eu aprendesse a ser uma
pesquisadora independente. Agradeço a oportunidade de ter trabalhado com toxinas de
animais no Instituto Butantan e ter feito parte desse campo tão promissor.
Ao Dr. Paulo Lee Ho, pela biblioteca de cDNA de Micrurus corallinus. Sem ela,
esse projeto não teria acontecido.
Ao Dr. Geraldo Magalhães, pelo esforço despendido para me ajudar com as
transfecções.
Aos colegas de laboratório e técnicos, que direta ou indiretamente me ajudaram em
algum momento do meu projeto. Agradeço especialmente à Débora e Ágatha, que me
ajudaram muito nesse último ano do projeto, e ao Enéas de Carvalho, por todos os
conselhos metodológicos.
Aos meus grandes amigos Henrique Ramos, Vivian Hashimoto, Patrícia Diniz e
Erika Nakajima, pela amizade incondicional. Ao Rico e Vivis, obrigada também pela
ajuda nas imunizações e nas sangrias.
Ao Giuseppe Puorto, pela grande amizade e pelas aulas sobre serpentes e animais
peçonhentos. Aprendi a ter outro olhar para esse mundo herpetológico. Obrigada.
À minha família, pelo carinho e preocupação em todos os momentos da minha vida.
Ao meu pai, Dr. Luiz Eduardo V. Leão, por me compreender e me aconselhar sempre
com as palavras de quem entende de ciência e pesquisa. À minha mãe, Yasuko, por me
ajudar e ter paciência com a bagunça que ficou a sala de estar dela.
Ao meu querido Marcelo Yamashita Salles, que me ajudou em todos os momentos
desde que estamos juntos. Agradeço seu companheirismo, a tolerância e os ombros para
chorar. Obrigada por estar ao meu lado nos momentos mais difíceis, especialmente
nesse final de projeto. Obrigada por usar grande parte do seu tempo para editar a minha
dissertação e deixá-la mais do que perfeita. Sem você, esse trabalho não se
concretizaria. Obrigada, Má.
Ao Instituto Butantan, que me acolheu e me ajudou nesses quatro anos em que estive
trabalhando nele.
À FAPESP, CNPq e Fundação Butantan pelo suporte financeiro.

6
Sumário

1. INTRODUÇÃO.......................................................................................... 9
1.1 SERPENTES PRODUTORAS DE VENENOS.................................................. 9
1.2 COBRAS-CORAIS (GÊNERO MICRURUS).................................................... 11
1.3 VENENO DE COBRAS-CORAIS.................................................................. 15
1.3.1 Ações do veneno.............................................................................. 15
1.3.2 Ação Neurotóxica e Miotóxica........................................................ 15
1.3.3 Ação Hemorrágica........................................................................... 16
1.3.4 Ação Cardiovascular....................................................................... 16
1.3.5 Componentes do veneno.................................................................. 17
1.3.6 Envenenamento por cobras-corais................................................... 19
1.3.7 Epidemiologia.................................................................................. 21
1.4 SOROS ANTIVENENO DE SERPENTES....................................................... 23
1.4.1 Histórico.......................................................................................... 23
1.4.2 A produção do soro antielapídico.................................................... 24
1.5 IMUNIZAÇÃO GENÉTICA OU VACINA DE DNA.......................................... 26
1.6 TRANSCRIPTOMAS DE GLÂNDULAS DE VENENOS.................................... 27

2. OBJETIVOS............................................................................................... 30

3. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................ 31
3.1 PREPARO DE FAGOS PARA GERAÇÃO DE ESTS......................................... 31
3.1.1 Biblioteca de Micrurus corallinus (fago λgt11D)........................... 31
3.1.2 Preparação da bactéria E. coli Y1088 ............................................. 31
3.1.3 Preparação do fago (λgt11D-GI e λgt11D-GII)............................ 31
3.1.4 Montagem das placas para fagos..................................................... 31
3.1.5 Amplificação do cDNA contido no fago (PCR).............................. 32
3.1.6 Seqüenciamento dos clones............................................................. 32
3.1.7 Análise das seqüências expressas.................................................... 33
3.2 CLONAGEM DOS CANDIDATOS ANTIGÊNICOS PARA IMUNIZAÇÃO
GENÉTICA (VACINA DE DNA)......................................................................... 34
3.2.1 Os candidatos antigênicos............................................................... 34
3.2.2 Estratégia de clonagem.................................................................... 34
3.2.2.1 Desenho de primers.................................................................... 35
3.2.2.2 PCR............................................................................................. 36
3.2.2.3 Clonagens em PGEM-T.............................................................. 36
3.2.2.4 Digestão com BamHI e EcoRI.................................................... 37
3.2.2.5 Subclonagem em pSecTag2A...................................................... 37
3.3 PROCESSO PRÉ-IMUNIZAÇÃO GENÉTICA............................................... 38
3.3.1 Maxiprep dos candidatos antigênicos para imunização genética.. 38
3.3.2 Transfecção de clones em células eucarióticas............................. 38
3.4 IMUNIZAÇÃO DOS CANDIDATOS ANTIGÊNICOS ESCOLHIDOS................ 39
3.5 EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES............ 40
3.6 ANÁLISE DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA ................................................ 42
3.6.1 ELISA............................................................................................ 42
3.6.2 Western Blot.................................................................................. 43

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................... 44

7
 4.1 O TRANSCRIPTOMA.............................................................................. 44
4.1.1 Banco de Seqüências..................................................................... 44
4.1.2 Análise dos cDNAs de toxinas identificados no banco de ESTs.. 49
4.1.2.1 Proteína de três dígitos............................................................ 50
4.1.2.2 Fosfolipase do tipo A2.............................................................. 52
4.1.2.3 Lectinas do tipo C..................................................................... 55
4.1.2.4 Peptídeo Natriurético............................................................... 59
4.1.2.5 L-aminoácido oxidase.............................................................. 61
4.1.2.6 Inibidor do tipo Kunitz............................................................. 61
4.1.2.7 Metaloprotease......................................................................... 62
4.1.2.8 Serinoprotease.......................................................................... 62
4.1.2.9 NGF.......................................................................................... 63
4.1.2.10 WAP....................................................................................... 64
4.2 IMUNIZAÇÃO GENÉTICA....................................................................... 65
4.2.1 Escolha de candidatos antigênicos a partir do transcriptoma de
M. corallinus................................................................................................... 66
4.2.2 Clonagem dos candidatos antigênicos para imunização genética. 69
4.2.2.1 Antígeno 1 (Atg1)..................................................................... 69
4.2.2.2 Antígeno 2 (Atg2)..................................................................... 71
4.2.2.3 Antígeno 3 (Atg3)..................................................................... 72
4.2.2.4 Antígeno 4 (Atg4)..................................................................... 73
4.2.2.5 Antígeno 5 (Atg5)..................................................................... 74
4.2.3 Transfecção preliminar de clones em células eucarióticas e
Western-Blot................................................................................................... 75
4.2.4 Expressão e purificação das proteínas recombinantes................... 78
4.2.4.1 Candidato antigênico Atg1(Proteína V8)................................. 78
4.2.4.2 Candidato antigênico Atg2 (proteína V1)................................ 79
4.2.4.3 Candidato antigênico Atg5 (Proteína V2)................................ 79
4.2.5 A imunização genética (ou vacina de DNA) em camundongos.... 81
4.2.6 Análise da resposta imune............................................................. 82
4.2.7 Imunização tripla com três candidatos antigênicos....................... 87

5. CONCLUSÃO............................................................................................ 91

6. RESUMO................................................................................................... 92

7. ABSTRACT............................................................................................... 93

8. APÊNDICES.............................................................................................. 94
8.1 ABREVIATURAS.................................................................................... 94
8.2 ÍNDICE DE FIGURAS.............................................................................. 96
8.3 ÍNDICE DE TABELAS............................................................................. 98

9. BIBLIOGRAFIA........................................................................................ 99

10. BIOGRAFIA............................................................................................ 110

ANEXO I........................................................................................................ 113

8
1. INTRODUÇÃO

1.1 SERPENTES PRODUTORAS DE VENENOS

Os ofídios, ou as serpentes, compõem a Subordem Serpentes, que atualmente

apresenta cerca de 3.200 espécies. É a segunda subordem mais abundante depois de
Sauria (lagartos e lagartixas), que possui 4.636 espécies. As serpentes fazem parte da
Ordem Squamata, o principal e mais numeroso grupo de répteis existente. Elas são
encontradas em quase todo o mundo e habitam regiões temperadas e tropicais, pela sua
dependência do calor externo para efetuar a termorregulação.
As serpentes usam o veneno para paralisar e matar suas presas ou para se
defender de predadores. Os componentes tóxicos desses venenos têm ações rápidas e
seletivas muito potentes, que interferem em mecanismos fisiológicos, celulares e
moleculares específicos. Cada veneno apresenta uma ação particular característica da
espécie da serpente, decorrente dos tipos de toxinas que o compõem e do tipo específico
de presa a que é dirigido. Entretanto, o veneno também pode agir de forma eficaz em
outros alvos da dieta ou possíveis em predadores da serpente.
Dentre as mais de 3.200 espécies de serpentes existentes, apenas 420 espécies
são peçonhentas, ou seja, utilizam seu veneno para caçar e são capazes de inoculá-lo
(DOWLING & DUELLMAN, 1978) (Figura 1A). Essas serpentes peçonhentas se agrupam
em quatro famílias:

• Família Atractaspididae – composta por duas subfamílias: Aparalactinae (de

dentição opistóglifa) e Atractaspidinae (de aparelho inoculador semelhante à
dentição solenóglifa). A subfamília Atractaspidinae é composta pelo gênero
Atractaspis. O veneno dessas serpentes se caracteriza por conter sarafotoxinas
de potente ação cardiotóxica e vasoconstritora, semelhante à das endotelinas.

• Família Viperidae – abrange as serpentes venenosas que apresentam dentição

solenóglifa, ou seja, dentes inoculadores de veneno frontais e móveis. Estes
dentes são ocos e é por onde passa o tubo inoculador de veneno. Uma
característica principal das serpentes da Família Viperidae é a presença de
fosseta loreal, ou seja, um órgão termorreceptor para captação do calor.

9
 • Família Colubridae – algumas serpentes desta família podem ser consideradas
venenosas, pois apresentam glândula produtora de veneno, apesar de terem
dentição opistóglifa, ou seja, apresentarem um par de dentes posteriores por
onde o veneno escorre e pode vir a ser inoculado. Por causa da posição dos
dentes, essas serpentes raramente causam acidentes.

• Família Elapidae – composta por cerca de 300 espécies, distribuídas em 62

gêneros. Estas serpentes têm dentição denominada proteróglifa. A maxila é fixa
e não permite a mobilidade dos dentes inoculadores. O veneno é caracterizado
por apresentar ações neurotóxicas. Os representantes desta Família não possuem
fosseta loreal (Figura1B). A esta família pertencem as cobras-corais brasileiras
do gênero Micrurus estudadas neste projeto, e por isso ela será mais bem
detalhada adiante.

Todas essas famílias pertencem à Infraordem Caenophidia, ou “serpentes

avançadas”, um clado diverso que contém mais de 80% das espécies de serpentes do
mundo (KEOGH et al., 1998).
A Família Elapidae está amplamente distribuída por toda a faixa intertropical do
planeta (SLOWINSKI et al., 1997) e forma o principal grupo de serpentes venenosas. Elas
apresentam presas e glândulas de veneno e algumas são considerados os animais mais
perigosos e temidos do mundo. Porém a maioria dos elapídeos são serpentes pequenas e
difíceis de serem encontradas, tais como as serpentes do gênero Micrurus, que se acham
por toda a região da América.
Duas subfamílias são reconhecidas: Elapinae e Hydrophiinae (KEOGH et al.,
1998). Os elapines representam aproximadamente 225 espécies de serpentes terrestres
que podem ser encontradas nos trópicos e, eventualmente, nos subtrópicos de algumas
regiões. Nesta subfamília encontram-se as serpentes do Velho Mundo, tais como as
cobras indianas (Naja), a cobra-rei (Ophiophagus), a kraits (Bungarus) e as mambas
(Dendroaspis). Três gêneros ocorrem no Novo Mundo: Leptomicrurus, Micrurus e
Micruroides (também denominadas cobras-corais) (CAMPBELL & LAMAR, 2004). A
maioria dos elapines é ovípara, com exceção de alguns gêneros africanos e australianos
vivíparos.
Os hidrofines são representados pelas serpentes marinhas. A subfamília contém
aproximadamente setenta espécies. As serpentes marinhas podem ser encontradas nas

10
águas tropicais da Índia e do Oceano Pacífico Oeste. Elas apresentam algumas
especializações que caracterizam as serpentes desta subfamília. Todas possuem glândula
de sal ao redor da língua, que funciona como regulador osmótico. O corpo é, em geral,
comprimido lateralmente, tem a cauda bastante desenvolvida, narinas com válvula de
fechamento e uma série de adaptações anatômicas e comportamentais. São vivíparas e
os filhotes nascem dentro da água (CAMPBELL & LAMAR, 2004).

1.2 COBRAS-CORAIS (GÊNERO MICRURUS)

As cobras-corais são os únicos elapídeos em toda a América. Micrurus é o

gênero mais representativo em abundância e diversidade dos elapídeos do Novo Mundo,
amplamente distribuídos e encontrados desde o sudoeste dos Estados Unidos, passando
pela América Central até o centro sul da Argentina (DOWLING & DUELLMAN, 1978).
Muitos dos elapídeos são encontrados na Bacia Amazônica, principalmente em regiões
com baixa densidade populacional (CARDOSO et al., 2003).
Entre as serpentes venenosas, quase todas as espécies de Micrurus dependem de
ambientes florestais. O gênero possui espécies que apresentam atividade diurna e
noturna, e há as predominantemente diurnas, como a M. corallinus da Mata Atlântica.
As serpentes são animais ectotérmicos, isto é, sua temperatura corpórea depende
da temperatura do ambiente externo. Entretanto, por meio do comportamento, são
capazes de manter sua temperatura dentro de amplitudes muito menores que as
variações de temperatura ambiente. Elas conseguem isso pela busca de locais adequados
para se aquecer ou resfriar, e/ou pela posição e postura de seu corpo (MARQUES &
SAZIMA, 1997).
As cobras-corais possuem alimentação especialista, isto é, se alimentam de um
único ou poucos tipos de presas. A maioria das espécies de cobras-corais se alimenta
prioritariamente de serpentes menores (especialmente colubrídeos e tiflopídeos), mas
elas também podem se alimentar de gimnofionas e anfisbenas. Dessa forma, sua
alimentação é denominada dieta ofiófaga e estenofágica, ou seja, alimentam-se de
presas específicas, geralmente animais vermiformes, o que inclui outras serpentes
(CAMPBELL & LAMAR, 2004).
Muitas espécies de serpentes possuem um padrão de cores com faixas
transversais, manchas e outros desenhos. Essa estratégia lhes proporciona camuflagem e
dificulta sua localização por predadores orientados visualmente. As cobras-corais, muito

11
venenosas, se utilizam de tática diferente: em vez de se camuflar, exibem cores vistosas.
Seu colorido vivo alerta o predador para o risco que corre caso ataque a serpente.
Diversas espécies de colubrídeos não venenosos (falsas-corais) imitam (mimetizam) o
padrão de colorido das cobras-corais verdadeiras, uma estratégia para enganar e afastar
o predador (MARQUES & SAZIMA, 1997). Os predadores aprendem, por experiência, a
associar o padrão de coloração apossemática dessas serpentes com uma experiência
desagradável e/ou traumática. Este esforço adaptativo garante às serpentes a proteção
contra predadores que aprendem a evitar esse padrão particular de coloração.
As 61 espécies de cobras-corais atualmente reconhecidas são divididas em três
gêneros: Micrurus (57 espécies), Leptomicrurus (três espécies) e Micruroides (uma
espécie) (Figura 2). O Micrurus pode ser encontrado em habitats terrestres do sul dos
EUA até o sul da América do Sul. A Leptomicrurus é encontrado nas regiões baixas
tropicais e nas florestas úmidas amazônicas. O monotipo Micruroides é encontrado
apenas no Deserto Sonoran no sudoeste dos EUA e no nordeste do México (SLOWINSKI,
1995).
Foram realizados diversos estudos filogenéticos desse grupo. Pesquisas
bioquímicas e morfológicas evidenciaram que as cobras-corais apresentam uma relação
mais próxima com outros elapídeos do que com os colubrídeos (SLOWINSKI, 1995).
ROZE (1987) apresentou uma árvore filogenética de cobras-corais naquele que foi a
primeira publicação sobre relação entre as cobras-corais (Figura 3). A filogenia proposta
por Roze inseriu o Micruroides como um grupo irmão de todas as outras corais,
divididas em Leptomicrurus e Micrurus. O grupo seguinte deu origem a mais uma
divisão: M. mipartitus e as outras Micrurus. Este último grupo foi separado em grupo
Monodal (seqüência de faixas alternadas vermelha-amarela-preta-amarela-vermelha) e o
grupo Triadal da América do Sul, caracterizada por uma seqüência de cores
diferenciadas (vermelha-preta-amarela-preta-amarela-preta-vermelha) (SLOWINKI,
1995).

12
 A
ÁGLIFA

OPISTÓGLIFA

SOLENÓGLIFA

PROTERÓGLIFA

Elapidae (M. corallinus) Viperidae (B. jararaca)

Figura 1: A) Quatro principais tipos de dentições encontradas entre as Famílias de Serpentes

Atractaspididae, Viperidae, Colubridae e Elapidae. B) Ausência da fosseta loreal nos elapídeos
e comparação com os viperídeos.

13
 Micrurus corallinus

Leptomicrurus scutiventris

Micruroides euryxantus

Figura 2: Os três gêneros principais encontrados entre as cobras-corais: Micrurus,

Leptomicrurus e Micruroides.

14
 Monodal Micrurus

S.A. Triadal Micrurus

Micrurus mipartitus Group

Leptomicrurus

Micruroides

Figura 3: Filogenia de cobras-corais de Roze (1987). S.A. = América do Sul.

1.3 VENENO DE COBRAS-CORAIS

1.3.1 Ações do veneno

Os dados clínicos relacionados a acidentes por corais são escassos e sugerem um

grande conjunto de atividades farmacológicas. Os venenos são conhecidos por serem
neurotóxicos, miotóxicos, hemorrágicos e causar efeitos cardiovasculares. Apesar da
demonstração dessas atividades, somente os efeitos neurotóxicos e miotóxicos são
observáveis em acidentes humanos. Além disso, o veneno dessas serpentes possui
toxicidade elevada, se comparado a venenos de serpentes da Família Viperidae, e
apresenta uma atividade proteolítica baixa, mas variável, entre as espécies e populações
naturais (JORGE DA SILVA JR & BUCARETCHI, 2003).

1.3.2 Ação Neurotóxica e Miotóxica

Classicamente, sabe-se que os venenos das serpentes corais possuem

neurotoxinas com dois mecanismos de ação (JORGE DA SILVA JR & BUCARETCHI, 2003):

• Neurotoxicidade pré-sináptica – causada por proteínas com atividade

fosfolipásica. Elas atuam nas terminações axônicas e impedem a liberação de
acetilcolina (ACh) na fenda sináptica da junção neuromuscular de nervos

15
 motores, de maneira similar à β-bungarotoxina do veneno da serpente Bungarus
multicinctus.
• Neurotoxicidade pós-sináptica – causada por proteínas com estrutura em três
dígitos (3FTx) desprovidas de ação enzimática. Atuam por fixação competitiva
nos receptores colinérgicos das membranas pós-sinápticas da junção
neuromuscular de nervos motores (ação semelhante à do curare).

A ação miotóxica pode estar relacionada à ação neurotóxica, ou parcialmente

mascarada por ela. Experimentalmente, a maioria dos venenos de corais é capaz de
provocar mionecrose. Nos envenenamentos em humanos por corais, um quadro de
mialgia pode se instalar, mas sem indicativo claro de mionecrose (JORGE DA SILVA JR &
BUCARETCHI, 2003).
Na mionecrose, o sarcolema é a principal estrutura celular atingida. Uma vez que
o sarcolema é afetado, um influxo de Ca2+ ocorre. Com a elevação do Ca2+ citosólico,
há a hipercontração dos microfilamentos, danos mitocondriais e ativação de fosfolipases
dependentes do Ca2+. A presença de vesículas citoplasmáticas e alterações mitocondriais
são indicadoras da degradação de fosfolipídeos por fosfolipases ativadas pelo Ca2+. A
ação mionecrótica experimental também foi evidenciada no veneno de várias espécies
de Micrurus do Brasil (GUTIERREZ et al., 1992).

1.3.3 Ação Hemorrágica

Os efeitos hemorrágicos foram, inicialmente, demonstrados experimentalmente

(MOUSSATCHÉ et al., 1976), mas nunca evidenciados em acidentes humanos. A presença
de proporções diferentes e a diversidade de proteases nos venenos já estudados também
sugerem uma ação presa-específica. Venenos de M. brasiliensis, M. frontalis e M.
lemniscatus causam hemorragia visceral, pulmonar e subendocárdica em ratos. Uma
fração (fosfolipase A2) do veneno de M. frontalis de ação hemorrágica foi isolada e
parcialmente caracterizada (JORGE DA SILVA JR & BUCARETCHI, 2003).

1.3.4 Ação Cardiovascular

Efeitos hipotensivos foram descritos, experimentalmente, com o veneno de M.

fulvius e, mais recentemente, com o veneno de M. frontalis (FRANCIS et al., 1993).

16
 Os estudos bioquímicos dos venenos são escassos devido à grande dificuldade
de capturar e manter em cativeiro essas serpentes e à pequena quantidade de veneno
obtida na extração. Estudos comparativos iniciais foram realizados com
soroneutralização cruzada. Quando se reage o veneno das principais corais brasileiras
(M. corallinus, M. frontalis, M. spixii e M. ibibiboba) com o soro anti-M. corallinus,
nota-se que ele é capaz de neutralizar o efeito letal da M. corallinus, mas não o das
outras três serpentes. Por outro lado, quando reagidos com o soro anti-M. frontalis, este
é capaz de neutralizar os efeitos letais do veneno da M. frontalis, M. spixii e M.
ibiboboca, mas não o veneno da M. corallinus (HIGASHI et al., 1995). Isso é evidência
de que o mecanismo da ação tóxica do veneno da M. corallinus é causado por
componentes distintos dos presentes no veneno de outras corais, como a M. frontalis
(PRIETO DA SILVA et al., 2001a e PRIETO DA SILVA, 2001b).
Mais recentemente, estudos comparativos enzimáticos, cromatográficos,
mionecróticos e imunoquímicos foram realizados com o veneno de várias espécies de
serpentes corais do Brasil para esclarecer algumas das ações de seu veneno e determinar
padrões de variabilidade intra e interespecífica (AIRD & JORGE DA SILVA, 1991). Frações
neurotóxicas e hemorrágicas também já foram isoladas do veneno de M. surinamensis e
M. frontalis.

1.3.5 Componentes do veneno

Os venenos são misturas biológicas complexas que as serpentes utilizam no ato

de imobilizar e matar presas para se alimentar. Os venenos podem ser transparentes ou
ter variações de coloração amarela, dependendo da quantidade de L-aminoácido oxidase
presente neles, que possui riboflavina (de cor amarelada) como grupo prostético. Os
venenos contêm cerca de 25% de sólidos totais, dos quais cerca de 70 a 90% são
proteínas e polipeptídeos de relativo alto peso molecular. O restante (10-30%)
corresponde a substâncias de baixo peso molecular como carboidratos, aminoácidos,
pequenos peptídeos, aminas, nucleotídeos, compostos inorgânicos e íons (JORGE DA

SILVA JR & BUCARETCHI, 2003).

O veneno de cobras-corais contém um número de substâncias enzimáticas e não-
enzimáticas que parece estar presente em grande quantidade em todas as espécies.
Ocorre, também, a presença de variação individual e geográfica dentre espécies
diferentes do gênero. Sabe-se que os venenos de espécies brasileiras diferentes variam
bastante, mas todos apresentam atividade fosfolipásica (AIRD & JORGE DA SILVA, 1991).

17
As enzimas presentes (13-150kDa) incluem fosfolipases A2, responsáveis pela catálise
da hidrólise lipídica. Outras enzimas encontradas na maioria das cobras-corais são a
hialuronidase, que atua como outro fator espalhador na destruição de certas barreiras
estruturais dos tecidos, e o L-aminoácido oxidase, que tem ação catalítica amplamente
distribuída. Algumas hidrolases, tais como fosfodiesterase e anticolinesterase, foram
reportadas no veneno de M. fulvius e parecem estar presente em venenos de outras
espécies (KOCHOLATY et al., 1971). Dentre as substâncias não-enzimáticas (5-10kDa),
estão as neurotoxinas pós-sinápticas, cardiotoxinas (CTX), inibidores de protease,
dendrotoxinas (inibidores de serinoproteases do tipo Kunitz), inibidores de
acetilcolinesterase e neurotrofinas (NGF) (YEE et al., 2004).
As fosfolipases A2 (PLA2, E.C. 3.1.1.4) são mediadores celulares e estão
envolvidas em várias respostas, tais como inflamação, hemólise, inibição da agregação
plaquetária e outras. Elas estão presentes nos venenos da maioria das serpentes das
Família Viperidae, Elapidae e Hydrophiidae (MÉNEZ et al., 1992). As PLA2 são
formadas, principalmente, por cinco α-hélices e duas folhas-β pregueadas curtas (ARNI
& WARD, 1996). Nem sempre a atividade tóxica das PLA2 está relacionada com
atividade enzimática, já que algumas das toxinas mais potentes desta classe não
apresentam nenhuma atividade enzimática, possivelmente por ter o aminoácido
aspartato da posição 49 (sítio de ligação ao Ca2+) substituído por resíduos de carga
positiva, como a lisina (MORA et al., 2005).
As 3FTx (three finger toxins) não possuem atividade enzimática e contêm de
sessenta a 74 aminoácidos. Essas toxinas podem ter suas seqüências facilmente
alinhadas por oito cisteínas muito conservadas (STRYDOM, 1977), que formam um
núcleo globular da proteína e de onde emergem três alças formadas por cinco folhas-β
pregueadas antiparalelas, duas folhas antiparalelas formadas pela primeira alça, e três
folhas antiparalelas formadas pela segunda alça e parte da terceira alça. (ENDO &
TAMIYA, 1991). Por essa razão são chamadas de toxinas com forma de três dígitos
(“three finger shaped toxins”). Nenhuma estrutura em α-hélice é encontrada nessas
moléculas. A forma é discoidal achatada e apresenta um lado côncavo e um lado
convexo. Tem baixa massa molecular, entre 6 a 14 kDa, e ponto isoelétrico típico entre
pH 8 e 10. São extremamente resistentes às variações físicas ambientais. Devido ao seu
pequeno tamanho, são facilmente absorvidas e se distribuem rapidamente nos tecidos da
presa (PRIETO DA SILVA, 2001b). Também chamadas de α-neurotoxinas ou toxinas

18
curaremiméticas, elas são capazes de bloquear a transmissão nervosa ao competir pelo
receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) localizado na membrana pós-sináptica dos
músculos esqueléticos e neuronais (VITAL BRAZIL, 1980).
Há proteínas fisiológicas em mamíferos que não são toxinas, mas apresentam
semelhanças estruturais com as 3FTx (TSETLIN, 1999). Em mamíferos, essas proteínas
pertencem a dois grupos de proteínas ancoradas à célula via glicofosfatidilinositol
(GPI): proteínas Ly-6 e o receptor de membrana CD59. Essas duas proteínas são
monoméricas. Um terceiro grupo de proteínas, também ancoradas a GPI, porém maior e
com pelo menos três domínios em três dígitos, é o uPAR, receptor para o ativador de
plasminogênio do tipo uroquinase.
Citotoxinas são proteínas básicas, desprovidas de ação enzimática e capazes de
causar hemólise, citólise, despolarização de membranas musculares e cardiotoxicidade
específica. Muitos autores consideram sinônimas as citotoxinas e as cardiotoxinas, em
vista das suas semelhanças estruturais. As cardiotoxinas são componentes que se ligam
a receptores de membrana das fibras musculares cardíacas e produzem despolarização
da fibra e paralisia irreversível, com parada cardíaca. A única serpente da América cujo
veneno contém cardiotoxinas, pelos relatos até hoje, é a M. fulvius (EUA e México),
mas é muito provável que elas estejam presentes nos venenos de outras Micrurus, como
demonstrado por JORGE DA SILVA JR et al. (1991).

1.3.6 Envenenamento por cobras-corais

Envenenamentos humanos causados por cobras-corais são relativamente raros

devido a seus hábitos (semifossoriais) e comportamento não agressivo. Apesar da baixa
incidência, os acidentes causados por serpentes corais são graves.
A característica principal do envenenamento por Micrurus é o choque
neurotóxico (BRAZIL & BRAZIL FILHO, 1933). Sabe-se que a ação dos venenos de M.
corallinus e M. frontalis, as duas espécies usadas na produção do soro antielapídico, é
bastante distinta uma da outra (VITAL BRAZIL, 1987). Ambos atuam na junção
neuromuscular, causa evidente de sua ação letal. No entanto, o que diferencia
basicamente esses dois venenos é a atuação sobre a sinapse, na qual a M. frontalis
apresenta apenas ação pós-sináptica, e a M. corallinus, ação pré-sináptica com aumento
espontâneo da liberação de acetilcolina associado ao bloqueio pós-sináptico da
transmissão elétrica entre o nervo e o músculo (VITAL BRAZIL & FONTANA, 1983/84).
VITAL BRAZIL & FONTANA (1983/84) consideram que, embora exista um bloqueio

19
evidente do receptor nicotínico por α-neurotoxinas, a ação principal do veneno de M.
corallinus é pré-sináptica.
Como os acidentes elapídicos no Brasil, causados pelas serpentes pertencentes
ao gênero Micrurus ou cobras-corais, é pouco freqüente, é possível compreender um
número reduzido de investigações para estudar as repercussões clínicas do
envenenamento causado por esse gênero de serpentes.
Sabe-se que os venenos das cobras-corais são extremamente ativos e de alta
toxicidade, mas a maior parte dos pacientes que procuram os serviços médicos após
acidentes causados por esssa serpentes apresenta manifestações clínicas de
envenenamento discretas, ou mesmo ausência delas, sendo raros os acidentes graves
com manifestações paralíticas. Possivelmente, essas observações clínicas estão
relacionadas com os aspectos biológicos dessas serpentes na natureza. As cobras-corais
são, de maneira geral, animais de pequeno porte e de baixa agressividade, além de ter
presas inoculadoras anteriores e pequenas, o que dificultaria a injeção da peçonha.
Com certa freqüência, o individuo é picado na região digital ao manusear a
serpente de forma inadequada e imprudente. As manifestações clínicas locais costumam
ser discretas. O edema, quando presente, costuma ser leve e, geralmente, se associa ao
uso prévio de torniquetes. Não se observam equimoses ou hemorragias locais, embora
tenha sido demonstrado recentemente que a peçonha da espécie M. avery, da região
amazônica, apresenta atividade hemorrágica em camundongos (BARROS et al., 1994). A
maioria dos pacientes menciona dor no local da picada, de intensidade variável, com
tendência à progressão proximal e geralmente acompanhada de parestesia.
As manifestações sistêmicas são caracterizadas pela atividade neurotóxica pré e
pós-sináptica do veneno na junção neuromuscular, o que desencadeia bloqueio da
liberação de ACh e competição das neurotoxinas com os receptores colinérgicos da
placa terminal da junção neuromuscular e o conseqüente aparecimento de síndrome
miastênica aguda. O início das manifestações paralíticas é muito variável: podem surgir
de minutos a horas após a picada. De maneira geral, essas manifestações se iniciam
depois de várias horas após o acidente. Porém, uma vez iniciadas, tendem a progredir e
a se agravar caso não se institua o tratamento adequado. As seguintes manifestações
paralíticas têm sido relatadas (JORGE DA SILVA JR & BUCARETCHI, 2003):
- ptose palpebral;
- dificuldade de acomodação visual;
- oftalmoplegia e anisocoria;

20
- dificuldade para deglutição e mastigação;
- dificuldade para se manter na posição ereta ou para se levantar;
- dispnéia restritiva e obstrutiva, respectivamente por paralisia da musculatura torácica
intercostal e por acúmulo de secreções, que evoluem para paralisia diafragmática.

1.3.7 Epidemiologia

A apresentação dos dados sobre acidentes por animais peçonhentos no Brasil é

baseada na notificação à CNCZAP (Coordenação Nacional de Controle de Zoonoses e
Animais Peçonhentos) de 81.611 acidentes no período de janeiro de 1990 a dezembro
de 1993, o que representou uma média de 20 mil casos/ano para o país. A maioria dos
acidentes foi registrada nas regiões Sudeste e Sul, as mais populosas e com melhor
organização de serviços de saúde e sistemas de informação. Os coeficientes anuais de
incidência para o Brasil estiveram em torno de 13 acidentes/100 mil habitantes,
distribuídos desigualmente nas diferentes macrorregiões (Tabela 1).
No mesmo período, a distribuição dos acidentes de acordo com o gênero da
serpente indica um predomínio absoluto do envenenamento botrópico, seguidos dos
acidentes crotálico, laquético e elapídico (Tabela 2).

Tabela 1: Coeficientes de incidência anual (por 100 mil habitantes) dos acidentes ofídicos por
região fisiográfica. Brasil, 1990 a 1993. Dados fornecidos pelo CNCZAP.

Região Coeficientes de incidência (x 100 mil) habitantes

1990 1991 1992 1993

Norte 24.4 23.2 23.8 25.9

Nordeste 6.8 6.7 6.2 7.6

Centro-Oeste 34.7 28.4 38 32.1

Sudeste 13.1 13.2 12.9 12.3

Sul 15.3 15.1 17.5 16.8

Brasil 13.8 13.3 14.1 13.9

21
Tabela 2: Diagnóstico dos acidentes ofídicos segundo gênero no Brasil, 1990 a 1993. Dados
fornecidos pelo CNCZAP.

Diagnóstico No de Acidentes %

Bothrops 59.619 73.1

Crotalus 5.072 6.2

Lachesis 939 1.1

Micrurus 281 0.3

Não informados 13.339 16.3

Não peçonhentos 2.361 2.9

Os casos de envenenamento de cobras-corais no Brasil são devidos,

principalmente, à M. corallinus e à M. frontalis, que ocupam áreas altamente povoadas
na região Central, Sul e Sudeste do Brasil. Comparado com os viperídeos, o número de
acidentes provocados pela cobra-coral não é muito grande, já que ela é pouco agressiva
e ataca somente quando ameaçada (CAMPBELL & LAMAR, 2004). Porém, quando o
acidente ocorre, os sintomas costumam ser bastante graves e podem levar à morte por
asfixia após cinco ou seis horas (VITAL BRAZIL, 1980). No Brasil, o número de
acidentes elapídicos nos últimos cinco anos tem permanecido ao redor de 1% ao ano,
como pode ser observado na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3: Comparação entre o número de acidentes elapídicos e o número de acidentes

ofídicos ocorridos entre 2001 e 2005.

Ano Acidentes elapídicos Total de acidentes ofídicos

2001 114 19342

2002 127 24682

2003 143 27196

2004 123 26952

2005 143 27831

Fonte: Sinan-Animais Peçonhentos/SVS/MS, dados atualizados até 24/04/2006.

22
1.4 SOROS ANTIVENENO DE SERPENTES

1.4.1 Histórico

Atualmente, a produção de soros antitoxinas animais ainda é baseada nos

métodos originalmente descritos por Vital Brazil (CARDOSO et al., 2003), que, por meio
de imunização em cavalos com veneno de serpentes, pôde demonstrar as relações de
especificidade entre os soros imunológicos e os venenos que lhes deram origem. A
partir desse momento, a soroterapia foi então introduzida como tratamento para
acidentes ofídicos no Brasil. O soro antiaracnídico e o soro antiescorpiônico também
surgiram posteriormente, produzidos juntamente com o soro antiofídico por algumas
instituições no país, como o Instituto Butantan, em São Paulo, o Instituto Vital Brazil,
no Rio de Janeiro, a Fundação Ezequiel Dias (Funed), em Belo Horizonte e o Centro de
Produção e Pesquisa em Imunobiológicos (CPPI), em Curitiba (CARDOSO et al., 2003).
Do ponto de vista prático, é necessário distinguir a produção de soro para fins
analíticos daquela para fins terapêuticos. Na obtenção de soros policlonais para análise,
o veneno é injetado em animais de pequeno porte para se obter um soro imunoreativo
que permita seu uso em procedimentos imunoquímicos. Entretanto, a produção de soros
voltados à soroterapia é baseada na imunização de animais de grande porte (cavalos,
caprinos etc.) com venenos de uma ou mais espécies de animais peçonhentos de
importância médica, o que por si só apresenta uma diferença marcante quanto à escala
de trabalho. Além disso, por se tratar de um produto para uso interno humano, deve
atender a inúmeras exigências de controle de eficiência e qualidade.
Para que um soro seja eficiente na neutralização dos efeitos tóxicos de veneno
animal, é necessário que ele contenha anticorpos dirigidos contra as principais toxinas
responsáveis por sua ação sistêmica e local (WARREL, 1997). Dessa forma, a escolha da
fonte dos antígenos utilizados na imunização dos animais é um fator primordial para
obtenção dos produtos ativos. Devido à grande variabilidade da glândula de veneno de
serpentes, às diferenças entre as espécies de um mesmo gênero ou ainda entre
indivíduos de uma mesma espécie, vários soros devem ser produzidos com finalidade
específica para cada tipo de acidente (WARREL, 1997).
Dadas as características estruturais de cada toxina, algumas delas são mais
eficientes que outras em induzir resposta imune (CARDOSO et al., 2003). A imunização
de animais com misturas complexas de antígenos pode, então, levar à produção de

23
anticorpos predominantemente contra algumas toxinas e deixar que outras, menos
imunogênicas, não apresentem anticorpos específicos. Outro fenômeno que pode
ocorrer é a redução da resposta imune, devido à presença de proteínas
imunosupressoras, como as descritas nos venenos de Crotalus durissus terrificus
(CARDOSO et al., 1997).
Por outro lado, a mistura de soros monoespecíficos leva, necessariamente, à
diluição do conteúdo total de anticorpos contra o veneno de cada espécie, e por isso sua
eficiência tende a ser reduzida. Outro aspecto relevante na imunização tradicional é a
forma de preparação dos antígenos. O ideal seria a administração de venenos ativos, por
ser mais confiável que o uso de componentes detoxificados, porém os efeitos deletérios
do veneno podem comprometer a saúde do animal. Assim, uma combinação de doses
com frações menos tóxicas seguidas de doses reforço com o veneno total pode ser mais
eficiente (HIGASHI et al., 1989).
Apesar das dificuldades de obtenção desses soros, somada às desvantagens
citadas acima, seu uso é considerado o tratamento mais efetivo na neutralização de
toxinas com ação sistêmica presente na glândula de veneno de serpentes (RAWEERITH et
al., 2005).
Nos últimos anos, a obtenção de soros hiperimunes contra venenos para fins
analíticos vem ganhando outro rumo, já que os avanços alcançados pela biologia
molecular têm tornado possível a obtenção não apenas de toxinas animais
recombinantes, mas também do uso dessas toxinas e de seus cDNAs para fins
imunológicos, como veremos mais adiante.

1.4.2 A produção do soro antielapídico

Do pouco que é sabido sobre veneno da M. corallinus, é possível dizer que ele é
bastante específico, mesmo comparado a outras espécies do gênero. Sabe-se que o
principal tipo de toxina do veneno da M. corallinus é a neurotoxina pré-sináptica, que
inibe a liberação de acetilcolina pelas terminações nervosas motoras, enquanto as
principais toxinas do veneno da M. lemniscatus e M. frontalis são neurotoxinas pós-
sinápticas, curaremiméticas (VITAL BRAZIL, 1987). Tanto as pré-sinápticas como as pós-
sinápticas podem também estar presentes em uma mesma espécie. Por essa razão, o soro
antielapídico monoespecífico pode não surtir o efeito desejado se a vítima for picada
por uma M. corallinus. É por essa razão que o soro antielapídico produzido deve
englobar esses dois tipos diferentes de toxinas presentes no veneno das cobras-corais

24
encontradas no Brasil. Dessa forma, este soro antielapídico apresenta anticorpos
produzidos a partir de imunização em cavalos com veneno de M. corallinus e M.
frontalis na proporção de 1:1, de modo a conter tanto o soro de M. corallinus como o de
M. frontalis.
A M. corallinus possui dieta ofiófaga, hábito fossorial e o padrão mimético
encontrado em várias outras serpentes. Essas características dão indício da dificuldade
de se obter e manter esses animais em cativeiro. Somada à dificuldade de manutenção, o
tamanho reduzido de suas glândulas e, conseqüentemente, a baixa produção de veneno
tem gerado uma problemática na produção de soro antielapídico no Instituto Butantan.
O Instituto Butantan acaba utilizando a quase integralidade do veneno
conseguido para a obtenção de soro antielapídico e pouco ou nada dele acaba restando
para estudos bioquímicos (HO et al., 1995). Na verdade, mesmo a quantidade de veneno
disponibilizada para a obtenção de soro não atende ao que seria o ideal para suprir a
demanda de produção que cobrisse todo o território nacional. Mesmo que o número de
acidentes seja pequeno se comparado ao de outros gêneros, a ampla dispersão
geográfica do gênero Micrurus e a gravidade dos acidentes exigem que o soro seja
distribuído por todo o país, o que aumenta a demanda de produção.

Tabela 4: Quadro geral da disponibilidade dos animais entregues ao Instituto Butantan para
cada gênero de serpentes, a quantidade de veneno e a longevidade em cativeiro (valores
aproximados).

Nº de animais Quantidade de veneno por Longevidade em

Gênero
entregues por ano extração (µL/extração) cativeiro (anos)

Bothrops 2200 400-900 5

Crotalus 1500 300 5

Lachesis 2 800-1000 2

Micrurus 200 5-20 1

Fonte: Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan, dados fornecidos em comunicação pessoal em
2005 (valores aproximados).

25
1.5 IMUNIZAÇÃO GENÉTICA OU VACINA DE DNA

Nos últimos anos, a obtenção de soros hiperimunes contra venenos para fins
analíticos vem tomando outro rumo, já que os avanços alcançados pela biologia
molecular tornaram possível a obtenção não apenas de toxinas animais recombinantes,
mas também o uso dessas toxinas e de seus cDNAs para fins imunológicos. Elas agora
podem ser usadas para a imunização com toxinas recombinantes ou apenas com
fragmentos com epítopos específicos (TANJONI et al., 2003), e ainda há a possibilidade
de imunização genética (vacinas de DNA) (HARRISON et al., 2000; HARRISON, 2004;
HASSETT & WHITTON, 1996; LIU, 2003; WAGSTAFF & HARRISON, 2006). Esse último
campo é recente e pode representar uma alternativa bastante promissora para resolver
situações nas quais a imunização tradicional pode não ser possível devido à falta de
antígenos.
A imunização genética teve início a partir de observações em 1992 de que
plasmídeos poderiam ser utilizados para expressar DNA exógeno em células animais e
estimular a resposta imunológica (TANG et al., 1992). O trabalho de HARRISON et al.
(2000) demonstram que ratos imunizados com DNA que codifica o domínio carboxi-
terminal JD9 da jararagina, a mais importante toxina da jararaca, por meio do método de
biobalística (Gene-Gun), obtiveram altos títulos de anticorpos IgG. Esse foi o primeiro
estudo em que foram aplicados métodos baseados em injeção de DNA para preparações
de antiveneno. O método pode representar uma nova abordagem imunológica mais
específica e com menos efeitos colaterais do que os sistemas convencionais de produção
de antiveneno. HARRISON (2004) conseguiu produzir altos títulos de anticorpos com
potencial para melhoria no tratamento sistêmico de picadas de serpentes da família
Viperidae. Recentemente, WAGSTAFF & HARRISON (2006) imunizaram camundongos
com DNA quimérico sintético contendo sete epítopos de maior significância dentro do
grupo de metaloproteinases (SVMP) expressas em glândulas de veneno de Echis
ocellatus e Cerastes cerastes. Estes epitopos foram escolhidos bioinformaticamente a
partir do transcriptoma dessa espécie, ou seja, após a identificação de alguns milhares
de cDNAs abundantes de suas glândulas de veneno. Como resultado, conseguiram
excelente proteção contra esse veneno e contra o de espécies correlatas.
Alguns trabalhos de imunização por DNA foram muito bem-sucedidos, como
pode ser verificado nos trabalhos citados acima, e pensar em soro antiveneno a partir de

26
vacina de DNA é inovador. No entanto, o maior desafio a ser vencido ainda se refere ao
estabelecimento de estudos mais conclusivos sobre as vantagens de se substituir a forma
tradicional de produção de soros ou de complementar a demanda de soros antivenenos
com a fabricação de soros por tecnologias recombinantes.

1.6 TRANSCRIPTOMAS DE GLÂNDULAS DE VENENOS

Uma abordagem muito utilizada hoje a fim de obter um perfil geral de toxinas
presentes na glândula de veneno tem sido a análise transcriptômica. A geração de ESTs
(Expressed Sequence Tags) é um método bastante interessante, já que se baseia no
seqüenciamento aleatório de clones de uma biblioteca de cDNA e fornece uma amostra
estatisticamente representativa da diversidade da expressão gênica naquele sistema (LEE
et al., 1995). Em termos qualitativos e quantitativos, é uma forma de se representar os
mRNAs expressos no tecido analisado.
Essa técnica parece ser bastante apropriada para o estudo de tecidos raros ou de
caracterização bioquímica difícil – caso das serpentes do gênero Micrurus – pois
permite a análise indireta da composição de proteínas a partir do seqüenciamento parcial
de cDNAs. Uma grande quantidade de clones representados em uma biblioteca pode ser
obtida por meio de pequenas quantidades de RNA e perpetuada sem a necessidade de
muito material biológico (ADAMS et al., 1991). Esse sistema de análise de bibliotecas de
cDNA tem a vantagem de ser mais prático do que o seqüenciamento total do cDNA,
pois utiliza-se de primers universais que permitem a leitura das extremidades 3’ e 5’ dos
cDNAs, suficiente para a sua identificação.
Na área toxinológica, as ESTs vêm tornando possível a identificação das toxinas
já bioquimicamente conhecidas no veneno de uma serpente ou a descrição de novas
toxinas após análise comparativa com bancos de seqüências de DNA e proteínas. Por
ser uma abordagem mais genérica e não focada em componentes específicos, muitas
vezes permite a identificação de novas toxinas que, por abordagens objetivas e
direcionadas, não poderiam ser descobertas (JUNQUEIRA DE AZEVEDO & HO, 2002).
Além disso, com o transcriptoma não são descritas apenas seqüências, mas ainda um
perfil da composição e diversidade das proteínas presentes no veneno da serpente pode
ser levantado de forma simples e abrangente, visto que o seqüenciamento aleatório de
clones de uma biblioteca primária de cDNA fornece amostra representativa da
diversidade da expressão gênica naquele sistema (LEE et al., 1995).

27
 Em 2002, foi realizado em nosso laboratório o primeiro estudo da diversidade
dos componentes presentes no veneno de uma serpente através da geração de ESTs
(JUNQUEIRA DE AZEVEDO & HO, 2002 e JUNQUEIRA DE AZEVEDO, 2003a). Durante a
geração de ESTs da glândula de veneno de B. insularis, uma serpente da família
Viperidae, e sua análise posterior e identificação em banco de dados, puderam ser
identificados alguns cDNAs nunca antes descritos em glândulas de venenos. Esse
trabalho trouxe um perfil do transcriptoma da glândula de veneno da B. insularis, com a
ocorrência, abundância e seqüência completa de diferentes metaloproteinases (SVMP),
serinoproteinases, peptídeos potenciadores de bradicinina, entre outras toxinas. Além
disso, foi possível identificar a seqüência de um suposto fator de crescimento do
endotélio vascular (VEGF), que posteriormente demonstramos ser de fato uma nova
toxina, totalmente diferente de todas já encontradas em venenos (JUNQUEIRA DE

AZEVEDO et al., 2001 e KOMORI et al., 1999). Pudemos identificar ainda a seqüência do
cDNA de uma suposta proteína de ligação com Ca2+ com quatro motivos EF-hand, que
foi denominada calglandulina (JUNQUEIRA DE AZEVEDO et al., 2003b). Uma forma
ortóloga dessa proteína foi detectada em humanos (CHEN et al., 2004) e chamada de
calglandulin-like, por ser a calglandulina de B. insularis a única referência dessa nova
proteína humana.
Um outro relato de transcriptoma de serpentes foi publicado por KASHIMA et al.
(2004). Foram seqüenciados 549 clones de B. jararacussu que se agruparam em 197
clusters. Uma comparação com o banco de dados identificou PLA2, incluindo as formas
Lys49 e Asp49 e outras toxinas. Nenhum precursor dos BPPs (Peptídeo Potenciador de
Bradicinina) foi encontrado, o que mostra diferenças significativas entre exemplares de
espécies distintas. FRANCISCHETTI et al. (2004) também publicaram um trabalho similar
sobre cDNAs expressos de Bitis gabonica.
Ultimamente, vários transcriptomas de glândulas de veneno de serpentes de
espécies da família Viperidae têm sido relatados por nosso e outros grupos. QINGHUA et
al. (2006) identificou toxinas relacionadas à coagulopatia por meio do estudo do
transcriptoma realizado de glândulas de veneno de Agkistrodon acutus. O transcriptoma
de Echis ocellatus foi realizado pelo grupo de WAGSTAFF & HARRISON (2006). No
nosso grupo, analisamos uma biblioteca da serpente Lachesis muta (JUNQUEIRA DE

AZEVEDO et al., 2006), e, recentemente, foi publicado um artigo científico sobre o

transcriptoma de espécies da Família Colubridae (CHING et al., 2006). Em nosso grupo,
realizamos ainda estudos de transcriptomas de outros organismos produtores de

28
venenos, como a aranha Loxosceles laeta (FERNANDES-PEDROSA et al., 2002), a
sanguessuga Haementeria depressa (FARIA et al., 2005) ou o carrapato Amblyoma
cajennensis (BATISTA et al., 2008). É importante enfatizar que não há relatos de
trabalhos sobre transcriptoma dentre a família Elapidae.
No caso de cobras-corais do gênero Micrurus, levando em conta seu hábito
fossorial e alimentar, além da dificuldade de se conseguir quantidade adequada de
veneno para estudos bioquímicos, a obtenção de um banco de ESTs pode ser
extremamente útil por permitir o primeiro estudo sistemático da composição molecular
de suas toxinas. Além de representar uma contribuição para o conhecimento biológico
de seu veneno, também permitirá a seleção de candidatos antigênicos para o
desenvolvimento de um soro antielapídico alternativo. Na verdade, é de grande interesse
do Instituto Butantan, junto ao Centro de Biotecnologia, a déia do desenvolvimento de
metodologias alternativas que permitam a auto-suficiência do Instituto para atender a
demanda de produção de soros antielapídeos para o país. Entendemos que o
transcriptoma, seguido de uma análise da viabilidade da obtenção de formas
recombinantes de toxinas representativas selecionadas, ou sua imunização genética,
sejam etapas iniciais imprescindíveis para se pensar em um processo alternativo de
imunização.

29
2. OBJETIVOS

• Geração de Expressed Sequences Tags (ESTs) das glândulas de veneno de

Micrurus corallinus (cobra-coral)

• Montagem de clusters, anotação e análise qualitativa e quantitativa da

expressão gênica a partir do banco de ESTs

• Escolha de candidatos antigênicos para uma imunização genética

preliminar.

30
3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 PREPARO DE FAGOS PARA GERAÇÃO DE ESTS

3.1.1 Biblioteca de Micrurus corallinus (fago λgt11D)

Foram utilizadas bibliotecas de M. corallinus obtidas pelo Dr. Paulo Lee Ho, do
Centro de Biotecnologia do Instituto Butantan, já validadas em trabalhos anteriores (HO
et al., 1995 e HO et al., 1997), preparadas a partir do RNA poli(A) extraído de dez
espécimes de M. corallinus, como descrito por SOARES (1994). Os cDNAs obtidos
foram divididos em duas frações (400 a 600 pb e >600 pb), visto que as neurotoxinas de
três dígitos e as PLA2 são codificadas por transcritos menores. Foram ligados a fagos
λgt11D pré-digeridos com extremidades EcoRI/NotI (Pharmacia).

3.1.2 Preparação da bactéria E. coli Y1088

Foi feito um pré-inóculo de colônia de E. coli Y1088 em 5mL de meio NZCYM
(SAMBROOK et al., 1989) acrescido de maltose 0,2%. O inóculo cresceu no mesmo meio
de cultura. Após a adição de MgSO4 0,01M, a densidade óptica (DO) foi acompanhada
até cerca de 2,0.

3.1.3 Montagem das placas para fagos

Placas “bottom ágar” foram preparadas com o meio NZCYM citado acima,
acrescido de ágar. Para o plaqueamento dos fagos, 100µL de bactéria E. coli Y1088
foram misturados a 100µL de uma diluição dos fagos (descrita a seguir). O material é
incubado por vinte minutos a 37ºC e a mistura foi acrescida ao meio NZCYM com
agarose (“top agarose” 0,7%). O “top agarose” é, então, distribuído sobre a placa
“bottom ágar”. Após 12-16 horas, as placas estavam preparadas para isolamento das
colônias líticas de fagos.

3.1.4 Diluição do fago (λgt11D-GI e λgt11D-GII)

Foram feitas diluições seriadas de 1:10 a 1:107 em meio SM (SAMBROOK et al.,
1989) a fim de descobrirmos o melhor valor para o trabalho, ou seja, qual proporção era
mais adequada para se observar as colônias líticas devidamente espaçadas. Descoberta a
diluição mais apropriada para a detecção das colônias líticas, o fago λgt11D

31
(Pharmacia) passou a ser diluído na proporção ótima da placa toda vez que fosse
necessário preparar o conteúdo de “top agarose” descrito anteriormente.

3.1.5 Amplificação do cDNA contido no fago (PCR)

Cada placa de lise (colônia lítica) foi aspirada por pipeta Pasteur descartável e
inserida em um tubo contendo meio SM. Após uma hora de incubação sob agitação em
temperatura ambiente, o material genético do fago estava preparado para ser
amplificado. Foram utilizados dois tipos de enzima taq polimerase para a amplificação
do cDNA contido nos fagos: Taq DNA Polymerase Recombinant, da Invitrogen; e
PlatinumTaq DNA Polymerase, da Invitrogen. Os primers utilizados foram λgt11
forward (5´ GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG 3´) e reverse (5´
TTGACACCAGACCAACTGGTAATG 3´) que se ligam ao fago λgt11D
correspondente. Por esse método, não foi necessário purificar os fagos nem a extração
de seu DNA, pois o material genético do fago se expõe durante o PCR (Polymerase
Chain Reaction). O produto de PCR foi purificado para uso posterior no
seqüenciamento, segundo três protocolos distintos que avaliamos para escolha do mais
eficiente pelo menor custo: 1) por separação em gel de agarose seguida de purificação
física em colunas de sílica da banda majoritária, com GFXTM PCR – DNA and Gel
Purification Kit, da Amersham Biosciences; 2) por purificação física direta do produto
de PCR; ou 3) por tratamento químico do produto de PCR, realizado com enzimas
exonuclease I (ExoI) 10U/µL, da Amersham Biosciences, e Shrimp Alcaline
Phosphatase (SAP) 1U/µL, da Amersham Biosciences.
A purificação do produto de PCR por tratamento químico foi baseada no
protocolo usual utilizado no Centro do Genoma Humano, na Universidade de São Paulo
(USP). É feita uma reação com 8µL de produto de PCR, somado a um mix de 0,5µL de
ExoI e 1µL de SAP. A amostra é colocada por uma hora a 37ºC e inativada por 15
minutos a 80ºC.

3.1.6 Seqüenciamento dos clones

Com os plasmídeos ou o cDNA do fago isolados, foi feito o seqüenciamento

deles. Primeiramente foi feita a reação de seqüenciamento, na qual foram colocados o
DNA amplificado (300ng), o primer (3,2pmol), tampão 6 µl (Save Money, 200mM Tris-
HCl pH 9.0 e 5mM MgCl2) e Big Dye (2µl) (Kit Big Dye, Applied Biosystems). As

32
amostras foram precipitadas com isopropanol e ressuspendidas em 20µl formamida
(Applied Biosystems).
Foram produzidas seqüências parciais por meio da utilização do primer λgt11F
para a síntese da cadeia complementar, gerando ESTs 5’. Esse primer se liga ao sítio
promotor do fago utilizado, λgt11, que está presente no produto de PCR. A síntese se
inicia em apenas um sítio onde o primer se anela ao DNA do vetor e termina quando
ocorre a incorporação de um dos nucleotídeos análogos, 2’3’ dideoxinucleotídeos
5’trifosfatos (ddNTPs), pois a polimerase não consegue continuar a elongação do DNA.
A leitura se baseia na separação em polímero de seqüenciamento (POP6) dos diferentes
tamanhos dos DNAs sintetizados nas amostras, contendo os quatro dideoxi-nucleotídeos
fluorescentes que emitem comprimentos de onda diferentes (Kit Big Dye). Foi utilizado
o seqüenciador ABI 3100, da Applied Biosystems, de dezesseis capilares.

3.1.7 Análise das seqüências expressas

Para os processos de análise, foi utilizado um conjunto de programas de

bioinformática desenvolvido no laboratório (pipeline de submissão), otimizado
especialmente para os modelos de seqüências de toxinas com que trabalhamos, pois a
enorme quantidade de isoformas e formas parálogas de toxinas requerem parâmetros
estringentes de análise. Primeiramente, as seqüências tiveram eliminadas as seqüências
do vetor e as regiões de baixa qualidade. Para isso, utiliza-se o programa Phred (HUANG
& MADAN, 1999) e são aceitos somente trechos de seqüência com 75% de bases com
qualidade (valor de phred) igual ou acima de 25, dentro de uma janela de 75 bases. Em
seguida, houve a remoção de adaptadores e vetores com o programa CrossMatch. As
seqüências menores que 150pb foram descartadas. Finalmente, as ESTs foram
agrupadas em clusters (conjuntos de seqüências contíguas). Por meio do programa
CAP3 (LAZO et al., 2001) com parâmetros estringentes e com descarte de clusters com
posições ambíguas em bases de alta qualidade.
Com os clusters montados, foi feita uma comparação com o banco de dados,
primeiramente por Blastx (nucleotídeos x aminoácidos) e, se necessário, por Blastn
(nucleotídeos x nucleotídeos), para uma identificação dos clusters. Para uma melhor
interpretação dessas identificações foi criada uma tabela de anotações, com todos os
dados apresentados no banco (e-value, porcentagem de similaridade, overlap etc.), o
que permite análises quantitativas a respeito da proporção de expressão de cada cluster.

33
3.2 CLONAGEM DOS CANDIDATOS ANTIGÊNICOS PARA IMUNIZAÇÃO GENÉTICA
(VACINA DE DNA)

3.2.1 Os candidatos antigênicos

Foram cinco os cDNAs candidatos selecionados a partir da análise do banco

transcriptômico de Micrurus corallinus, quatro deles representantes das 3FTx e um
representante de PLA2. Estes cinco candidatos foram selecionados por serem as toxinas
mais abundantes na glândula de veneno dessa serpente e por outros critérios descritos
no item 4.2.1. Os representantes desses cinco candidatos antigênicos foram nomeados
Antígeno 1 (Atg1) a Antígeno 5 (Atg5) (Tabela 5).

Tabela 5: Apresentação dos diferentes candidatos, clusters, clones e tamanhos (pb)

respectivos. Para cada clone foi atribuída uma numeração para facilitar sua denominação.

Tamanho
Clones utilizados Clones da
Candidato Cluster da ORF
da biblioteca subclonagem
(pb)
MCAL01H08
Atg1 MCOR0604C MCAL01H08.5 258
MCAL09C06
MCAL07D03
Atg2 MCOR0599C MCAL07D03.2 234
MCAL07H04
MCAH05B08
Atg3 MCOR0039C MCAH05B08.1 246
MCAL06A11
MCAL07E03
Atg4 MCOR0100C MCAL07E03.5 246
MCAL09G04
MCAL09A06
Atg5 MCOR0036C MCAL09A06.1 437
MCAL06A06

3.2.2 Estratégia de clonagem

A primeira etapa é desenhar primers específicos para cada candidato antigênico.

A região referente à proteína madura é amplificada por PCR e clonada, primeiramente,
no vetor pGEM-T. É feita a digestão e o fragmento resultante é ligado a um segundo
vetor, pSecTag2A. Cada uma das etapas será descrita a seguir com mais detalhes. A
Figura 4 apresenta um esquema da estratégia de clonagem utilizada.

34
Figura 4: Esquema da estratégia utilizada para clonagem dos candidatos antigênicos.

3.2.2.1 Desenho de primers

Para os cinco candidatos, foram desenhados primers específicos de acordo com a
Figura 5 abaixo:

BamHI

Figura 5: Esquema do desenho de primers

STOP
específicos para clonagem dos candidatos
ATG
antigênicos.
Peptídeo
EcoRI
Sinal

Os primers contêm sítios de restrição nas duas pontas para ligação posterior no
vetor pSecTag2A. Para cada candidato, foram escolhidos dois clones representantes.
Para cada grupo foram desenhados dois primers (Forward e Reverse). Os primers e seus
respectivos nomes estão descritos a seguir.

35
Atg1
NEURO1F (5´ GGATCCCATAGTATGTTACAAGAGGG 3´ ) e
NEURO1R (5´ GAATTCCACCATTGCATTTGTCTCTCA 3´ )
Atg2
NEURO2F (5´ GGATCCCTTGGAATGTAAGATATGCA 3´ ) e
NEURO2R (5´ GAATTCCGTTGCAATTGTCTGTTTTGC 3´ )
Atg3
NEURO3F (5´ GGATCCCACGAAATGTCTCACAAAGT 3´ ) e
NEURO3R (5´ GAATTCCACGGTTGCAATTGGTTTTT 3´ )
Atg4
NEURO4F (5´ GGATCCACTTGTATGTTACACAAACG 3´ ) e
NEURO4R (5´ GAATTCAGAGCTCTCCGTTGCATTTGTC 3´)
Atg5
PLA2 1F (5´ GGATCCCAACCTCATTAACTTCCAACG 3´ ) e
PLA2 1R (5´ GAATTCTTCGGCAACGATTGGGGTTCAT 3´)

3.2.2.2 PCR
Com os primers específicos, foi realizada uma amplificação por PCR usando
como molde os produtos de PCR dos fagos utilizados na geração das ESTs. As
condições da amplificação foram alteradas no decorrer dos experimentos. A temperatura
de anelamento adequada para a maioria dos PCRs foi de 55ºC, e a temperatura de
extensão foi de 72ºC para a taq polimerase (1min/kb). Os 50µL totais foram aplicados
em gel de agarose 1,5%. A banda resultante foi recortada e purificada com kit GFXTM
PCR (Amersham Biosciences). Esse procedimento foi realizado para cada um dos
cinco candidatos.

3.2.2.3 Clonagens em PGEM-T

O fragmento purificado foi ligado no vetor pGEM-T Easy (Promega), por
complementariedade dos nucleotídeos adenina inseridos pela taq polimerase aos
nucleotídeos T (timina) do vetor. A ligação foi transformada em bactérias DH5α. A fim
de selecionar as colônias que continham o fragmento/clone, foi realizado um screening
por PCR, já que os clones são muito pequenos e muito difíceis de serem detectados por
meio de outros protocolos. No screening por PCR, usamos a própria colônia de bactéria
como amostra para amplificação por PCR. Os primers utilizados são M13F e o primer
reverse do candidato em estudo, seguindo as próprias condições de amplificação
descritas acima. Com os clones positivos foram feitas minipreps com kit GFXTM

36
(Amersham Biosciences). Os clones foram seqüenciados (ABI 3100 Applied
Biosystems) para se conferir a ligação ao vetor.

3.2.2.4 Digestão com BamHI e EcoRI

Os clones ligados ao PGEM-T foram digeridos com as enzimas de restrição
EcoRI (Invitrogen) e BamHI (Invitrogen). O vetor pSecTag2A (Invitrogen) também
foi digerido com as mesmas enzimas para que fosse possível uma ligação entre vetor e
fragmento/clone. A digestão permaneceu a uma temperatura de 37ºC por 2 a 4 horas,
dependendo do clone em estudo, e em seguida o inserto foi isolado em gel de agarose.

3.2.2.5 Subclonagem em pSecTag2A

Para a clonagem final foi escolhido o vetor de secreção extracelular,
pSecTag2A. O “A” é referente à fase de leitura do sítio múltiplo de clonagem escolhido.
O pSecTag2A é um vetor de expressão em células de mamíferos. Ele contém algumas
fusões que ajudam na captura da proteína quando expressa in vitro, tal como cauda de
histidina (His) e epítopo myc. É um vetor que se mantém na forma epissomal e secreta a
proteína para fora da célula, por possuir o sinal de secreção da cadeia kappa das
imunoglobulinas. A Figura 6 apresenta o mapa do vetor com os diferentes sítios de
restrição, os promotores (promotor do tipo CMV e SV40) e as fusões.

Figura 6: Mapa do vetor pSecTag2A utilizado na clonagem final realizada com os candidatos
antigênicos. Nesse mapa estão apresentados os diferentes promotores, sítios de restrição e
fusões.

37
 Os insertos foram, então, ligados ao pSecTag2A e, em seguida, transformados
em bactérias DH5α. A seleção dos clones foi realizada por meio de screening por PCR,
da mesma forma como mencionado na clonagem em pGEM-T, mas o primer forward
utilizado é o T7F. Os clones positivos foram novamente purificados por meio do kit
GFXTM (Amersham Biosciences). O seqüenciamento ocorreu ao final de todas as
clonagens para se conferir a ligação do vetor ao clone e as prováveis mutações
decorrentes de todo o processo.

3.3 PROCESSO DE IMUNIZAÇÃO GENÉTICA

3.3.1 Maxiprep dos candidatos antigênicos para imunização genética

Preparações de DNA em grande quantidade (maxipreps) foram feitas com o kit

QIAGEN Plasmid Purification (Qiagen). Para isso, os clones obtidos a partir da
clonagem são transformados novamente. São realizados pré-inóculos. Após
aproximadamente 12 horas, esses pré-inóculos são expandidos em 300mL (proporção
de 1:30) em meio LB com ampicilina. O inóculo cresce aproximadamente por 15 horas.
No dia seguinte, começa a utilização do kit propriamente dito, segundo o protocolo do
fabricante. A amostra final é eluída em 300µL e deve permanecer na geladeira por dois
dias para uma eluição ótima.
Feitas as maxipreps, o DNA é quantificado espectrofotometricamente.

3.3.2 Transfecção de clones em células eucarióticas

Para a avaliação das construções, foram usadas células COS-07. As células

COS-07, células de rim de macaco verde africano, são as mais utilizadas para
transfecções do tipo transiente e, por esse motivo, optamos pela utilização delas. Nos
ajudou o Dr. Geraldo S. Magalhães, pesquisador do Laboratório de Imunopatologia do
Instituto Butantan.
O primeiro passo em uma transfecção é repicar as células a fim de que elas
cresçam e atinjam uma confluência ao redor de 95%. Feito isso, as células são tratadas
com lipofectamina (Lipofectamine 2000, da Invitrogen). O meio utilizado é o meio
DEMEN (meio Dulbecco High Glucose) com soro bovino. Em um tubo são misturados
250µL de meio DEMEN mais 4µg de plasmídeo. Em outro tubo, 250µL de meio
DEMEN mais 10µL de lipofectamina. Após 5 minutos, o conteúdo dos dois tubos é

38
misturado. Por conseguinte, após 20 minutos este conteúdo é derramado sobre as
células. Dessa forma, tem início a transfecção. A cada 12 horas é necessário observar as
condições fisiológicas das células: meio, formato das células e disposição delas. Nesse
momento, o meio DEMEN com soro bovino é substituído por meio DEMEN sem soro
bovino, pois há indícios de que o soro atrapalha a formação do complexo lipossomo-
DNA na transfecção. Após 24 horas tem início a expressão, portanto, a primeira coleta
de sobrenadante aconteceu após 24 horas. Três coletas são suficientes para verificar a
presença ou não de expressão da proteína. No último dia, são coletados os extratos de
células, já que, apesar de a proteína estar em um vetor de secreção (pSecTag2A), podem
ocorrer falhas e a proteína não ser secretada e continuar dentro da célula.

3.4 IMUNIZAÇÃO DOS CANDIDATOS ANTIGÊNICOS ESCOLHIDOS

A imunização dos candidatos citados acima foi feita em camundongos Balb/c,

fêmeas, peso homogêneo (18-22g), com seis a oito semanas de idade. Cada grupo de
cinco animais representa um candidato antigênico. Como controle, foi realizada uma
sangria inicial antes da imunização, a fim de se obter o soro pré-imune. Foi feita uma
sangria final, após a 3a dose da imunização. As doses ocorreram de quinze em quinze
dias, com três doses para cada grupo (Figura 7).

1 2 17 32 39 Dias

Sangria 1ª dose 2ª dose 3ª dose Sangria

pré-imune imunização imunização imunização final

Figura 7: Esquema das dosagens aplicadas nos camundongos durante processo de

imunização com os candidatos antigênicos selecionados.

Cada animal recebeu 100µg de DNA por dose, sendo no total 300µg/animal.
Para tanto, foi necessária a realização de maxiprep (Plasmid Purification®, Qiagen)
com cada um dos candidatos. As maxipreps foram quantificadas e, para facilitar sua
utilização nas imunizações, todas as concentrações foram acertadas para 1µg/µL, dessa
forma, 100µL seria o equivalente a 100µg. Este acerto foi preparado com PBS 10X
(Phosphate Buffered Saline) estéril e água MilliQ autoclavada (estéril).

39
 Os animais foram anestesiados intraperitonialmente com aproximadamente
200µL de anestésico (ketamina 500µL/10mL + xilazina 1000µL/10mL). A injeção do
DNA foi intramuscular (IM) e cada animal recebeu uma dose de 100µL, divididos em
50µL em cada pata.
O sangue foi coletado em tubos eppendorf e colocado na estufa a 37°C por 1
hora. Depois, por mais 1 hora a 4°C (em geladeira). O sangue é centrifugado por 10
minutos, a 3.000 rpm em 4°C. O soro então é retirado e mantido em freezer a -20°C.

3.5 EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES EM E. COLI

A fim de termos antígenos para o teste dos soros, fizemos a expressão de três
dos cinco antígenos baseadas em construções para expressão em E. coli de que já
dispunhamos no laboratório (PRIETO DA SILVA, 2001b e DE OLIVEIRA et al., 2003).
Primeiramente é feita a transformação em bactéria, no caso a E. coli DE3 starpLys
(resistência a cloranfenicol e ampicilina). Um pré-inóculo em 25mL de meio LB
(SAMBROOK et al., 1989) é preparado e, no dia seguinte, é expandido para 500mL +
15mL de pré-inóculo. É crescido em meio de cultura LB com ampicilina e clorafenicol
até atingir DO ≈ 0,6. Antes da indução, é retirada uma alíquota de 1mL de amostra não-
induzida (NI). É colocado então IPTG (indutor de expressão) por 2 ou 3 horas a 37°C.
Após a indução, uma alíquota de 1mL do induzido é retirada e o restante é
centrifugado a 5.000 rpm em 5°C, por 15 minutos. O pellet é congelado ou
ressuspendido com um tampão, de acordo com o pI da proteína (ponto isoelétrico).
Como todas as proteínas têm pI básico, o tampão utilizado foi o Tris pH 6,8 0,1M (pI
±1,5) (Tabela 6).

Tabela 6: As proteínas Atg1, Atg2 e Atg5 com seus respectivos pontos isoelétricos (pI) e o
nome da proteína de acordo com a similaridade com o banco de dados (Blastx).

Nome Proteína pI

Atg1 Neurotoxina 8 7,97

Atg2 Neurotoxina 7/3/1 8,58

Atg5 PLA2 8,24

40
 As bactérias ressuspendidas são lisadas em FrenchPressure®. O lisado é
centrifugado por 30 minutos em 4°C, a 10.000 rpm. O sobrenadante é coletado e
passado na coluna de cromatografia de anfinidade a metal (sepharose carregada com
Ni2+), com fluxo de cerca de 1ml por minuto. São feitas lavagens com várias
concentrações de imidazol (5mM, 20mM, 40mM e 60mM) no mesmo tampão e, no
final, a proteína é eluída com 1M imidazol (25 alíquotas de 1mL).
O corpúsculo de inclusão é lavado primeiramente com uréia 1M. É centrifugado,
o sobrenadante é coletado e uma alíquota é retirada para o gel de SDS-PAGE
(Eletroforese em Gel de Poliacrilamida). O corpúsculo é ressuspendido depois em uréia
8M. Uma alíquota dela é aplicada no gel para se verificar a presença de proteína no
corpúsculo. O corpúsculo em uréia 8M é passado na coluna e o flow through (material
não adsorvido) é coletado. No decorrer do processo da purificação, a concentração de
uréia é diminuída de 8M para 6M. É feita uma lavagem com imidazol 60mM (cinco
alíquotas de 5mL) e, depois, outra lavagem com imidazol 1M. São retiradas 25 alíquotas
de 1mL, da mesma forma que na purificação do sobrenadante. Todas as alíquotas
coletadas são colocadas no gel para visualização. O gel é corado com Comassie Blue
(coloração azulada) e fixado.
Para utilizar as proteínas purificadas no coating de ELISA (Enzyme-linked
Immunosorbent Assay), é necessário retirar o imidazol presente nas amostras coletadas.
Para tanto, é feita a diálise. Como se tratava de corpúsculo de inclusão, a solução
continha uréia. Para facilitar, as três diálises foram feitas em uma mesma solução de 1L
contendo uréia 6M e tampão NaCl-Tris pH 6,8, porém cada proteína estava em
membrana diferente. A membrana utilizada foi de 3kDa, devido ao tamanho das
proteínas (9kDa-12kDa). Após 3 horas, a solução é trocada e a concentração final de
imidazol passa a ficar ao redor de 0,85mM.

1M 29mM 0,85mM
inicial após 3 horas após 6 horas (final)

Para se fazer a curva de BSA (Albumina Sérica Bovina), a fim de se quantificar

a proteína obtida após a diálise, foram colocadas várias concentrações de BSA em gel
de SDS-PAGE juntamente com a proteína a ser quantificada, conforme descrito na
figura correspondente nos resultados. A intensidade da banda nos mostra a quantidade
de proteína contida naquela alíquota. A curva tem de ser precisa para que seja possível a

41
quantificação sem erros. A quantificação é feita por densitometria de bandas em
fotodigitalizador Eagle Eye, que interpreta a intensidade da banda em valor numérico.

3.6 ANÁLISE DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA

3.6.1 ELISA

A melhor forma de análise da resposta imune proveniente das imunizações é o

método imunoenzimático ou ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay).
Primeiramente, é necessário se fazer o coating de ELISA, ou seja, adicionar a proteína
recombinante que se ligará ao soro (anticorpo) proveniente das imunizações com DNA
em camundongos. A quantificação da proteína é essencial nessa etapa, já que são
colocados 2µg de proteína em cada poço da placa de 96well (96 poços) de ELISA. A
proteína é diluída em tampão de coating NaHCO3 + Na2CO3 0,05M pH9,6. A placa com
o coating é deixada dentro da geladeira, a 4°C, embrulhada com plástico PVC. A
proteína adere à parede da placa. O excesso é removido no dia seguinte.
Após isso, é feito um bloqueio da placa com leite 10% em PBS-T (Phosphate
Buffered Saline + Tween) antes de se iniciar as incubações com os anticorpos primário e
secundário. O anticorpo primário é o soro proveniente da imunização. São feitas
diluições, nesse caso, a partir de 1:20-1:10240. A primeira coluna da placa não possui
coating, apenas o tampão de coating. A segunda coluna é o branco, ou seja, possui
coating, mas não é colocado o soro primário. A partir da terceira coluna, têm início as
diluições. O anticorpo primário é incubado durante 1h30 em uma solução de BSA 1% +
PBS-T 0,1%, a 37°C. O bloqueio de leite é substituído pelo BSA.
Após a incubação e lavagem, a placa é incubada com anticorpo secundário em
todos os poços, inclusive o controle sem coating e o branco. O anticorpo secundário,
neste caso, é o IgG anti-mouse conjugado com peroxidase. A incubação deve ocorrer
por uma hora a 37°C.
É feita uma última lavagem e a placa é revelada. É preparada uma solução de
0,004% OPD (ortofenilenodiamina) + 0,005% H2O2 (água oxigenada) em tampão
citrato-fosfato (ácido cítrico 0.1M. e fosfato de sódio 0.2M) que será colocada na placa.
O OPD reage com a H2O2 na presença da peroxidade. A coloração amarelada passa a
vigorar devido à oxidação do OPD, que garante o reconhecimento da proteína (coating)
com o anticorpo primário (soro da imunização em camundongos). A reação é bloqueada

42
com adição de ácido sulfúrico H2SO4 8N assim que houver titulação aparente (amarelo
mais intenso para menos intenso). Bloqueado, o ELISA pode ser lido. Para o OPD, o
comprimento de onda é 492nm. O branco é a média da coluna sem o soro primário. A
titulação é a diluição onde a Absorbância for próxima de 0,100.

3.6.2 Western Blot

Para o Western blot, as amostras são aplicadas em gel SDS-PAGE (SAMBROOK

et al., 1989). Dá-se início à transferência do gel para uma membrana de nitrocelulose. A
membrana é colocada face-a-face com o gel, e uma corrente elétrica (350mA) é aplicada
para mover as proteínas para a membrana. A ligação das proteínas à membrana é
baseada tanto em interações hidrofóbicas como em interações de cargas entre a
membrana e as proteínas. Após 1h30, o gel é corado com Ponceau S a fim de se
verificar a presença do perfil de proteínas presentes na amostra, documentado e
descorado com água.
O bloqueio da ligação não-específica é feito ao se colocar a membrana em uma
solução diluída de leite seco desnatado (10%), com pequena quantidade de detergente,
como Tween 20 (0,05%).
No dia seguinte, ocorrem as incubações. Primeiramente, a membrana é incubada
com anticorpo primário na presença de leite. A solução permanece em agitação leve por
aproximadamente 1 hora. Depois de se enxaguar a membrana para remover o anticorpo
primário não ligado, ela é exposta a outro anticorpo conjugado com uma enzima,
direcionada a porções espécies-específicas do anticorpo primário. Mais comumente,
uma peroxidase é usada em conjunto com um agente quimioluminescente, e a reação
produz fluorescência proporcionalmente à quantidade de proteína.
Depois das sondas não-ligadas serem lavadas, o Western blot está pronto para
detectar a proteína de interesse. A membrana é, dessa forma, revelada.
Em caso de necessidade de reutilização da membrana para outras incubações, é
necessário lavá-la com um tampão denominado Stripping Buffer (100nM β-mercapto,
2% SDS, 62.5mM Tris HCL pH 6.7). Este tampão permite a reutilização da membrana
(reprobing).

43
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 O TRANSCRIPTOMA

4.1.1 Banco de Seqüências

A descrição de propriedades farmacológicas, ações patológicas, atividades

catalíticas, entre outros, ainda constitui a base fundamental no entendimento do
funcionamento dos venenos animais. Entretanto, nos dias de hoje, a atribuição dessas
propriedades só passa a ter valor reconhecido quando vinculada às suas bases
moleculares. Portanto, o entendimento aprofundado do funcionamento dos venenos de
serpentes requer antes de tudo uma boa compreensão de sua composição em termos
bioquímicos.
O estudo de venenos, baseado no fracionamento cromatográfico de proteínas e
caracterização particularizada de componentes é um processo lento e trabalhoso.
Tecnologias proteômicas, por outro lado, permitem um rápido conhecimento da
diversidade de substâncias presentes no veneno, porém, metodologicamente, a obtenção
de informações extensivas sobre a estrutura primária de proteínas ainda é um desafio. A
disponibilidade de amostra, a existência de equipamentos com funções específicas, a
qualidade da espectrometria de massas, a necessidade de modificações químicas das
amostras são alguns dos requisitos para se obter uma informação estrutural por vias
proteômicas (CALVETE et al., 2007). Por outro lado, ainda que limitada pela natureza
indireta da informação, as abordagens transcriptômicas têm sua vantagem na facilidade
de se obter grandes quantidades de informação sobre seqüências de toxinas e traçar um
perfil da expressão gênica nas glândulas de veneno (JUNQUEIRA DE AZEVEDO & HO,
2002).
A partir desse princípio, alguns trabalhos buscaram realizar a caracterização
transcriptômica de diversas espécies, conforme descrito na Introdução deste trabalho.
Porém nenhum deles abordou sistematicamente uma espécie de elapídeo terrestre e
muito menos espécies de cobras-corais, cujo veneno ainda é pouco conhecido. Essa foi
uma das razões que nos motivou ao presente estudo.
A análise do transcriptoma da serpente Micrurus corallinus foi feita então com
base em bibliotecas pré-existentes construídas em fago λGT11, em 1992, pelo Dr. Paulo
Lee Ho, nosso colaborador nesse projeto (HO et al., 1995). Foram utilizadas duas sub-

44
bibliotecas com faixas de tamanho de cDNAS diferentes, GI (>600pb) e GII (400 a 600
pb), construídas a partir do mRNA de dez espécimes. Dessas bibliotecas, preparamos e
seqüenciamos cerca de 1.500 clones para que fossem observados os transcritos mais
abundantes.
Diferentemente de outros trabalhos de nosso grupo, estas bibliotecas haviam
sido preparadas em fago e foi necessária a padronização de um procedimento de
geração de ESTs a partir de colônias de fagos, tendo em vista que esse projeto utilizava
uma metodologia diferente daquela usualmente utilizada no nosso Laboratório para
geração de ESTs. Muitos testes foram realizados a fim de se padronizar a metodologia,
diminuir os custos e aumentar o rendimento. A primeira padronização foi no PCR de
amplificação dos cDNAs e, posteriormente, na purificação do produto de PCR.
Com relação à padronização do PCR, foram realizados diversos testes-pilotos
para determinar a quantidade mínima necessária de primer e enzima taq polimerase para
que houvesse uma amplificação eficiente, porém com custo não muito alto. Duas
enzimas taq polimerases foram testadas (Taq DNA Polymerase Recombinant, da
Invitrogen, e PlatinumTaq DNA Polymerase, da Invitrogen). Ambas produziram o
mesmo rendimento, porém a taq platinum, apesar de mais cara, apresenta uma
vantagem por estar complexada a um anticorpo que inibe atividade polimerásica em
temperatura ambiente. Dessa forma, pode ser manuseada na bancada e não
obrigatoriamente no gelo – como ocorre com as enzimas taq comuns – além de evitar a
amplificação errônea de DNA. O custo é um ponto que levamos em consideração pelo
fato de estarmos trabalhando em larga escala (placas de 96 poços ou 96well) e não com
clones individuais. As quantidades mínimas determinadas para que houvesse uma
amplificação eficiente avaliada em gel de agarose foram: 10µL de fago λgt11D, 1µL de
primer λgt11F, 1µL de primer λgt11R e 0,5µL de taq polimerase.
Um dos grandes esforços que realizamos foi a padronização da purificação do
produto de PCR. Quando se trabalha com clones individuais, a utilização de kits de
purificação a partir de gel é bastante interessante e vantajosa. Mas quando se trabalha
em larga escala, o trabalho demandado para manipulação individual de cada amostra e o
custo bastante elevado desses kits os tornam menos atraentes. Sistemas de purificação
em larga escala como placas de filtro de 96 poços também têm custo elevado. Dessa
forma, avaliamos três técnicas (separação em gel de agarose 1% seguida de purificação
física por meio da utilização do kit GFXTM PCR, purificação física diretamente na

45
coluna GFX e purificação química com enzimas que removem os excedentes de primers
e nucleotídeos) e comparamos o rendimento juntamente com o custo. A relação custo-
benefício no último caso foi maior e mais favorável. E por essa razão optamos por
utilizar o tratamento químico para purificação do produto de PCR.
Dessa forma, pudemos gerar as ESTs que foram então processadas
bioinformaticamente, incluindo além do agrupamento (clustering) também a anotação e
as análises estatísticas da expressão das toxinas e proteínas celulares encontradas. No
processo bioinformático de agrupamento ou clusterização, realizado com o programa
CAP3, observamos algumas particularidades. Sabe-se que as neurotoxinas presentes
nesses venenos são muito diversas e poucas substituições em alguns resíduos são
capazes de mudar a classe na qual essas proteínas se inserem. Dessa forma, testamos
três estringências diferentes para agrupamento das seqüências (95%, 98% e 99% de
identidade), para avaliar como se comportaria o agrupamento de cDNAs. A idéia era
evitar que diferentes isoformas se reunissem no mesmo cluster. A Tabela 7 ilustra as
quantidades de grupos encontrados.

Tabela 7: Três valores diferentes de identidade testados como parâmetro de estringência no

CAP3 e os resultados obtidos.

VALOR DE IDENTIDADE (%) CONTIGS SINGLETS TOTAL

95 125 420 545

98 120 476 596

99 120 564 684

A seguir, identificamos previamente os clusters codificantes para neurotoxinas

(conforme análise por similaridade, Blastx) e notamos que, com 95% de identidade,
diferentes cDNAs de neurotoxinas não eram separados em grupos diferentes, já com
99% ocorria uma separação exagerada de alguns grupos protéicos que não deveriam ser
divididos. Dessa forma, optamos por utilizar o valor de 98% de identidade como
parâmetro de estringência no CAP3 (valor usado em outros casos, JUNQUEIRA DE

AZEVEDO et al., 2006) e, em seguida, separar manualmente as seqüências de

neurotoxinas que não deveriam pertencer a um mesmo cluster, conforme discutido
adiante. Assim, realinhamos algumas seqüências em novos clusters, que foram
reinseridos na nossa base de dados.

46
 O banco final de ESTs de M. corallinus contém então 1.438 seqüências de
clones que foram agrupadas em 611 clusters, incluindo 483 clusters compostos por
clones individuais (singlets) e 128 clusters com duas ou mais seqüências (contigs). Após
aplicação de filtro contra seqüências de RNA ribossomal, DNA mitocondrial e vetores
ou outros contaminantes, 5% dos clones foram desconsiderados das análises
subseqüentes.
A análise com o banco de dados via Blast revelou que, de 611 clusters, 485
(correspondente a 1.250 clones ou 92% do total) produziram semelhanças significativas
com o banco de dados (e-value < 10-05) e outros 103 clusters (107 clones ou 8% do
total) não puderam ser identificados. Dessa forma, foi possível realizar a anotação,
tabulada em planilha Excel (ilustrada no Anexo I), de onde extraímos as informações
mais relevantes dos resultados que serão apresentados a seguir.
As informações identificadas foram divididas de acordo com as duas funções
gerais esperadas para os transcritos da glândula de veneno: toxinas (funções tóxicas) e
demais transcritos envolvidos nas funções celulares (funções não-tóxicas).
Tanto os transcritos enquadrados na categoria “toxinas” como os “transcritos
celulares” tiveram representação equivalente no perfil geral de proteínas da glândula
(aproximadamente 46% do total de clones cada um). Entretanto, as proteínas celulares
são mais diversificadas (392 clusters). Isso fica mais evidente quando observamos a
redundância (clones/cluster) de cada categoria. As toxinas têm média de 6,7 clones para
cada cluster enquanto os transcritos celulares apresentam valor de 1,6. Isso significa que
cada toxina é, em média, quatro vezes mais expressa do que um dado transcrito celular
(Tabela 8).

Tabela 8: Representação dos clusters obtidos a partir das ESTs da glândula de veneno de M.
corallinus.

Redundância Representação do
Categoria Clusters Clones
(clones/clusters) total de clones (%)
No hit/ genômico/ íntrons 103 107 1,0 7,9
Sequências similares 485 1250 2,6 92,1
Similaridade com
93 625 6,7 45,9
transcritos/proteínas tóxicas
Similaridade com
392 625 1,6 46,2
transcritos/proteínas celulares
Outros (mitocondrial, RNA
23 81 3,5 5,4
ribossomal, vetor)

47
 Ao observar os tipos particulares de toxinas (Figura 8), podemos perceber que as
proteínas de três dígitos (neurotoxinas) são os transcritos mais abundantes, seguidas de
fosfolipases do tipo A2 (PLA2), como era esperado. Depois vêm as lectinas do tipo C e
o precursor do peptídeo natriurético. As outras classes de toxinas encontradas são
menos abundantes (Figura 8). Quando verificamos o perfil das possíveis proteínas
celulares (Figura 9), o padrão apresentado segue o que se espera de uma glândula
secretória, caso da glândula de veneno, na qual as proteínas mais expressas estão
relacionadas à transcrição/tradução.

Possíveis toxinas encontradas na glândula de veneno

de M. corallinus

52.2%

WAP
Serinoproteinase
NGF
L-amino acido oxidase
Kunitz
Metalloproteinase
CNP
Lectins
33.3%
10.4% 0.2% PLA2
2.2%
Three finger-like
0.6% 0.5% 0.2%
0.2%
0.3%

Figura 8: Representação gráfica da proporção dos tipos de toxinas encontradas em glândulas

de veneno de Micrurus corallinus (% do total de clones de toxinas).

48
 Possíveis proteínas celulares encontradas na glândula de veneno
de M. corallinus

Celulares Degradação

4.2% 2.4% 3.6%

0.6% Celulares Estruturais

6.0% Celulares Metabolismo

4.0%

Celulares Processamento e
Endereçamento
Celulares Regulação
2.1%
Celulares Transcrição e Tradução

Outras Funções
5.4%
17.8% RetroTransposon

Função Desconhecida

Figura 9: Representação gráfica da proporção dos tipos de proteínas celulares encontradas

em glândulas de veneno de Micrurus corallinus (% do total de clones de proteínas celulares).

4.1.2 Análise dos cDNAs de toxinas identificados no banco de ESTs

Foi possível identificar dez classes de toxinas, que representam

aproximadamente 46% (625 clones agrupados em 93 clusters) de todas as informações
contidas neste banco transcriptômico (Tabela 9). É um valor esperado quando
comparado com outros viperídeos (JUNQUEIRA DE AZEVEDO et al., 2006; QINGHUA et al.,
2006; WAGSTAFF & HARRISON, 2006), já que esse tecido é especializado na síntese de
proteínas tóxicas, e uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno desse animal deve
representar a composição e a diversidade das toxinas expressas nele. A análise de cada
grupo de toxinas está representada a seguir, de acordo com sua abundância.

49
Tabela 9: Representação dos tipos de toxinas encontradas na glândula de veneno de Micrurus
corallinus, com o respectivo número de clusters e clones.

TOXINAS nº de clusters nº de clones % do total

WAP 1 1 0.1%
NGF 1 1 0.1%
Serinoprotease 1 1 0.1%
L-aminoácido oxidase 2 2 0.1%
Kunitz 2 3 0.2%
Metaloprotease 1 4 0.3%
Peptídeo Natriurético 5 14 1.0%
Lectinas do tipo C 13 65 4.7%
PLA2 12 208 15.3%
Proteína de três dígitos 55 326 24.0%
TOTAL 93 625 45.9%

4.1.2.1 Proteína de três dígitos

Esse grupo de toxinas, as proteínas de estrutura em três dígitos (3FTx), é o que
apresentou maior abundância de seqüências expressas (~52% do total de toxinas) no
padrão obtido da glândula de veneno de M. corallinus. Essas proteínas são pequenas,
com menos de oitenta aminoácidos e geralmente com quatro, às vezes cinco, pontes
dissulfeto. Possuem efeitos farmacológicos muito distintos (PRIETO DA SILVA, 2001b e
ENDO & TAMIYA, 1991).
A análise da montagem dos clusters de 3FTx chegou após uma revisão a um
número final de 326 clones (~24% do total) agrupados em 55 clusters. Ocorre que
muitos desses clusters foram recriados manualmente após a montagem inicial pelo
programa CAP3, pois se notou que alguns dos contigs iniciais estavam agrupando, na
verdade, variantes diferentes. Então, cada contig inicial foi inspecionado visualmente
para identificar os SNPs (single nucleotide polymorphisms) que fossem comuns a mais
de uma seqüência dentro da montagem. Quando tais SNPs eram encontrados, as
respectivas seqüências eram removidas e arranjadas em um novo cluster, após avaliação
da qualidade das bases no ponto. Assim, foram obtidos os 55 clusters.
Quanto às proteínas derivadas desses clusters, em uma análise comparativa não
foi possível agrupá-las em tipos funcionais definidos, baseando-se na seqüência, por
exemplo, pelo número de cisteínas conservadas ou de acordo com o tamanho do C-
terminal (NIRTHANAN & GWEE, 2004), já que a diversidade de neurotoxinas observadas
foi extremamente grande. Além disso, visto que é o primeiro banco transcriptômico de

50
um membro da Família Elapidae, tivemos dificuldade em identificar as possíveis
funções e os possíveis ortólogos em outras espécies por não haver dados suficientes
para sua validação na literatura. Dessa forma, optamos por organizar essas toxinas de
acordo com a semelhança das seqüências entre si. Assim, separamos três lotes diferentes
de cDNAs de 3FTx.
Os dois primeiros lotes contêm seqüências muito similares às quatro possíveis α-
neurotoxinas já descritas na literatura para Micrurus corallinus (HO et al., 1995). O
primeiro foi denominado homolog 7/3/1 (representando os cDNAs das isotoxinas nxh7,
nxh3, nxh1) por serem semelhantes entre si e apresentarem diferenças significativas na
região referente ao peptídeo sinal e em alguns poucos aminoácidos da região referente à
proteína madura. A proteína madura apresenta 57 aminoácidos. O segundo lote refere-se
ao homolog 8 (representando o cDNA nxh8), uma forma peculiar que traz diferenças
significativas na região referente à proteína madura quando comparado ao homolog
7/3/1 (PRIETO DA SILVA, 2001b). Comparando esse dois lotes entre si, nxh8 compartilha
apenas 42% de similaridade com o grupo homolog 7/3/1. A forma madura apresenta 65
aminoácidos. A organização de seu cDNA é similar à descrita para o precursor da
erabutoxina a de Laticauda semifasciata (TAMIYA et al., 1985). A nxh8 apresenta dez
cisteínas que podem formar cinco pontes dissulfeto. Foi constatado que a nxh8 pode se
ligar ao próprio receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) ou compartilhar um epítopo
funcional com as α-neurotoxinas, e que o soro anti-nxh8 (recombinante) pode impedir a
ligação dos componentes pós-sinápticos do veneno de M. corallinus ao nAChR (PRIETO
DA SILVA, 2001b).
O restante das neurotoxinas encontradas (grupo denominado “outras
neurotoxinas”) não é propriamente um grupo de seqüências relacionadas, mas sim novas
3FTx que obtiveram um valor de identidade em torno de 50% com seqüências de 3FTx
do banco de dados. Na Figura 10, estão representadas todas as 3FTx encontradas,
incluindo cada cluster que representa o grupo “outras neurotoxinas”. Estas foram
reagrupadas por semelhança e serão mais bem detalhadas no item 4.2.1.
Ainda com relação à estrutura de três dígitos, um cluster interessante foi
encontrado. O cluster MCOR0226S, com apenas um clone, apresenta semelhança com o
precursor de proteína Ly-6E de linfócitos de Gallus gallus (TOULON et al., 1988). Trata-
se de uma 3FTx, porém provavelmente não-tóxica. As proteínas da família Ly-6
formam um grupo de receptores da superfície celular envolvidos na ativação de

51
leucócitos (TOULON et al., 1988), por isso acreditamos que o cluster MCOR0226S não
deva ser uma toxina.

Possíveis proteínas de três dígitos encontradas na glândula de veneno

de M. corallinus

Neurotoxina homolog 8 MCOR0039C

MCOR0100C
MCOR0035C
MCOR0092C
MCOR0094C
MCOR0109C
MCOR0105C
MCOR0120C
MCOR0103C

Outras neurotoxinas MCOR0091C

MCOR0552S
MCOR0539S
MCOR0555S
MCOR0470S
Neurotoxina homolog 7/3/1
MCOR0482S

o
Figura 10: Proteínas de três dígitos encontradas na glândula de veneno de M. corallinus (n de
o
clones/grupo – gráfico maior e n de clones/cluster – gráfico menor).

4.1.2.2 Fosfolipase do tipo A2

As fosfolipases do tipo A2 (PLA2) são encontradas na maioria dos venenos e
costumam ser classificadas em dois subtipos: tipo I, mais comum em elapídeos, e tipo
II, presente nos venenos de viperídeos (DUFTON & HIDER, 1983). Baseando-se na
ausência ou presença do loop pancreático (resíduos 62-67), as PLA2 tipo I, elapídicas,
podem ainda ser subdivididas em Ia ou Ib. A maioria dos venenos elapídicos apresenta
PLA2 Ia, embora tenha sido reportado o tipo Ib em algumas espécies como Oxyunarus
scutellatus (FOHLMAN et al., 1977), Pseudonaja textilis (PEARSON et al., 1993), Notechis
scutatus (FRANCIS et al., 1995), cobra-rei (HUANG et al., 1996), AAG23963 e
AAG23964 e em cobras-corais (FRANCIS et al., 1997).
Com 120 aminoácidos e seis ou sete pontes dissulfeto, são compostas por alfa
hélices e algumas estruturas em folhas beta (DUFTON & HIDER, 1983). Estas toxinas
apresentam diversas funções e especificidades. Algumas PLA2 são neurotoxinas pré-

52
sinápticas, ou β-neurotoxinas com alvos específicos nas junções neuromusculares
(HARRIS, 1991) para aumentar a liberação de neuromediadores. Algumas atuam como
miotoxinas que despolarizam membranas celulares musculares (MEBS & OWNBY, 1990)
e levam à necrose. Acredita-se que as PLA2 possam desempenhar ações neurotóxicas
por se ligarem à membrana nervosa e catalisar a hidrólise fosfolipídica com a produção
de lisofosfolipídios e ácidos graxos (ROSSETTO et al., 2006).
As PLA2 encontradas aqui apresentam estrutura similar às PLA2 de veneno de
outros elapídeos, ou seja, classificam-se como tipo I, particularmente do tipo Ia, pois
está ausente o loop pancreático. O cluster mais abundante obtido é o MCOR0036C, com
196 clones. Esse cluster apresentou uma identidade de 100% com a seqüência de PLA2
de Micrurus corallinus previamente clonada e caracterizada por nosso grupo (DE
OLIVEIRA et al., 2003). Esta seqüência apresenta na posição 49 um aminoácido aspartato
altamente conservado (Asp49) e envolvido intimamente na ligação com íon metal Ca2+,
que tem função essencial na atividade catalítica dessa enzima.
Realinhamos todos os clusters de PLA2 encontrados no banco, e é interessante
notar que dois deles, MCOR0404S e MCOR0609S (singlets), apresentaram seqüências
bastante peculiares, já que possuem inserções de 114pb na posição 110, dentro do
trecho referente à proteína madura (Figura 11). Uma observação interessante é que essa
inserção corresponde exatamente aos últimos 114pb do íntron 4 do gene das PLA2
(FUJIMI et al., 2002). Isso significa que houve um splicing alternativo no transcrito desse
clone, de forma que o íntron 4 (normalmente com ~500pb) não foi completamente
removido e sua porção 3´ permaneceu no transcrito final. De fato, a inserção se inicia
com o dinucleotídeo GT e se encerra com AG, justamente a seqüência canônica das
junções íntron/éxon (LEWIN, 2000) (Figura 11). Além disso, a inserção de 114pb é
múltipla de 3 e corresponde portanto a 38 códons codificantes (sem códons de parada).
Isso permite que, após a inserção, a fase de leitura se mantenha igual à da molécula
original, apresentando o mesmo C-terminal. A análise da seqüência de aminoácidos
inserida não revela similaridade com domínios conhecidos. Claro que essa inserção
pode ser decorrente de um erro fortuito no processo de splicing, mas o fato de não
conter códons de parada nem resíduos de cisteína (o que poderia desestabilizar a
estrutura) e manter a fase da tradução indicam que pode resultar em um novo produto
protéico.
Sabe-se da relevância da ação fosfolipásica do tipo A2 no veneno de M.
corallinus por ela apresentar efeito pré-sináptico neurotóxico (HARRIS, 1991 e

53
ROSSETTO et al., 2006). E, além disso, é a segunda classe de toxinas mais abundante
encontrada no banco. Por essa razão, as PLA2 são candidatos antigênicos para uma
possível imunização genética.

401 480
MCOR0036C (394) ...TCCCAAACCGGGAGCGTCACCTGCAAAG----------------------------------------------------
MCOR0404S (273) ...TCCCAAACCGGGAGCGTCACCTGCAAAGGTGTGCAACTTCACAACTGGGTATTGAAAAGACACAGGGCTGCGTCTCACAA
MCOR0093C (314) ...TCCCAAACCGGGAGCGTCACCTGCAAAG----------------------------------------------------
MCOR0467S (305) ...TCCCAAACCGGGAGCGTCACCTGCAAAG----------------------------------------------------
MCOR0491S (216) ...TCCCAAACCGGGTTCGTCACCTGCAAGG----------------------------------------------------
MCOR0494S (241) inserção
...TCCCAAACCGGGAGCGTCACCTGCGGGG----------------------------------------------------
MCOR0495S (227) ...TCCCAAACCGGGAGCGTCACCTGCGGGG----------------------------------------------------
MCOR0509S (308) ...TCCCAAACCGGGAGCGTCACCTGCAAAG----------------------------------------------------
MCOR0607S (317) ...TCCCAAACCGGGAGCGTCACCTGCAAAG----------------------------------------------------
MCOR0608S (309) ...TCCCAAACCGGGAGCGTCACCTGCAAA-----------------------------------------------------
MCOR0609S (307) ...TCCCAAACCGGGAGCGTCACCTGCAAAGATGTTGAAGAACTTTCCTGCAGATTCGTGAATCAAGGATTTTATCAATCTCA
481 560
MCOR0036C (422) --------------------------------------------------------------ACAACGGCACTAAATGTA...
MCOR0404S (353) TAGTGCAGCGTTTATTTTGGCCATGCTTTCCCCGAGGTTCACCATTTCCTTCTTCCCTGCAGACAACGGCACTAAATGTA...
MCOR0093C (342) --------------------------------------------------------------ACAACGGCACTAAATGTA...
MCOR0467S (333) --------------------------------------------------------------ACGAGGGCACTAAATGTA...
MCOR0491S (244) -------------------------------------------------------------AGGGGGGGGGGGCCCTGTA...
MCOR0494S (269) inserção
--------------------------------------------------------------ACAACGGCACTAAATGTA...
MCOR0495S (255) --------------------------------------------------------------GGGGCGGCACTAAATGTA...
MCOR0509S (336) --------------------------------------------------------------ACAACGGCACTAAATGTA...
MCOR0607S (345) --------------------------------------------------------------ACAACGGCACTAAATGTA...
MCOR0608S (336) --------------------------------------------------------------------------------...
MCOR0609S (387) GCATGGGTGGATTCCCCAAGTGTGACAGGTTCCTCGACCCGGGGTACTCTGTAGTGATCCAC------------------...

Figura 11: Alinhamento dos clusters de fosfolipase do tipo A2 obtidos por análise do
transcriptoma da glândula de veneno de M. corallinus. Nota-se uma inserção de 114pb
delimitada por GT e AG (seqüência canônica das junções íntron/éxon).

54
4.1.2.3 Lectinas do tipo C
As lectinas do tipo C são proteínas não-enzimáticas presentes em venenos de
serpentes de todas as Famílias. Assim como as lectinas de plantas, algumas das lectinas
de veneno são capazes de se ligar a carboidratos. Na presença de Ca2+, as lectinas tipo C
iniciam uma grande infinidade de processos biológicos, tais como adesão, aglutinação,
endocitose e neutralização do patógeno. Elas podem ser divididas em sete grupos
diferentes de acordo com suas características estruturais (WEIS et al., 1998). As lectinas
tipo C que parecem ter perdido a propriedade de se ligar a carboidratos são chamadas
lectinas-like, por apenas conservarem características estruturais em comum com as
lectinas “verdadeiras”. As lectinas de veneno podem causar agregação de hemáceas de
forma dose-dependente. Recentemente, foram isoladas lectinas-like tipo C, que atuam
como antagonistas e agonistas de agregação plaquetária e afetam a trombose e
hemostase por inibição e ativação de receptores específicos da membrana de plaquetas
(OGAWA et al., 2005). Algumas dessas lectinas podem atuar também como
anticoagulantes. Bioquimicamente, as lectinas tipo C são normalmente proteínas homo
ou heterodiméricas com cadeias alfa e beta relacionadas estruturalmente, e com as
subunidades ligadas por pontes dissulfeto entre as cisteínas conservadas na Família.
Possuem cerca de 130 aminoácidos por subunidade.
As lectinas tipo C têm sido bastante utilizadas como ferramenta para investigar e
estudar receptores plaquetários (DU et al., 2002). Alguns inibem a função plaquetária e
previnem a interação com o ligante, outros ativam as plaquetas também diretamente via
receptores ou indiretamente por meio de proteínas plasmáticas. Como exemplos tem-se
o echicetin, que é utilizado como receptor IgMκ, e o botrocetin, que se liga ao fator von
Willebrand.
A convulxina-like (Ofioluxina) foi a primeira proteína a ser identificada que age
via GPVI (Glicoproteína VI) e ela tem sido bastante utilizada para o isolamento,
caracterização e investigação de mecanismos sinalizadores desse importante receptor.
Essa foi a primeira lectina do tipo C identificada na Família Elapidae (DU et al., 2002).
As lectinas tipo C encontradas aqui também são relativamente abundantes.
Sessenta e cinco clones apresentaram similaridades com essas proteínas e foram
agrupados em treze clusters, o que representa aproximadamente 5% do total de
proteínas expressas nesse tecido. Muitas delas correspondiam à ORFs (Open Reading
Frame) completas, ilustradas na Figura 12A e alinhadas com outras lectinas tipo C de
veneno.

55
 Sendo componentes ubíquos de venenos, porém muito diversificados em termos
de estrutura-função, é interessante compreender como as diferentes lectinas tipo C de M.
corallinus se encaixam na filogenia da Família. Uma análise filogenética Baesiana
revela que as proteínas de veneno de serpentes se isolam num agrupamento único e
distinto das lectinas fisiológicas animais (Figura 12B) Dentro do grande grupo da
lectinas de veneno, nota-se claramente a distinção entre as lectinas tipo C verdadeiras e
seus homólogos estruturais, as lectinas-like (suporte de ramo de 0,81 e 1,0
respectivamente). Todas as lectinas de M. corallinus se enquadram dentro do grupo das
verdadeiras, juntamente com as lectinas de outros elapídeos. A única exceção é o cluster
MCOR0067C (claramente distinto dos demais já no alinhamento), que é mais similar a
proteínas fisiológicas curtas do grupo das litostatinas do que às lectinas de veneno
(verdadeiras ou não). Recentemente, foi observada um seqüência semelhante a essa no
transcriptoma da serpente B. insularis (BINS004C), que nesta filogenia realmente se
agrupa com o MCOR0067C. Dessa forma, o achado de outra lectina com essas
características corrobora a possibilidade de que esse seja um terceiro grupo de lectinas
de veneno.
Quanto à organização dentro do ramo das lectinas verdadeiras, a maioria dos
clusters se agrupa junto com a lectina de Lapemis hardwick, um elapídeo da subfamília
Hydrophiinae (serpentes marinhas). Apenas um cluster, MCOR0090C, se agrupa com
as lectinas verdadeiras de outros elapídeos e de viperídeos. De qualquer forma, esses
componentes parecem estar bem diversificados em M. corallinus.

56
 A

1 100
MCOR0024C (1) MGQFLLVSLGLLLVAFSLNGIGAD----HHCPSDWYSFDK----FCYKFIKQWKSWNDAEASCARLQDSSHLASIHSQAEIFRVQKVIFMNTVL-YDDV-
MCOR0060C (1) MGRFLFVSLCLLVVAFSLNGIGAHR----YCPFDWFSHNA----SCYKLFKHPMTWDRAQRFCTEKQENGQLASIHDAEVSVKLSNHISQRLK--ILDV-
MCOR0067C (1) MGHHAFWGFCLLACLSVTPLVEGIQRG-AKCPEEAIYYRR----YCYQLVDMSLTWDAAETECQHLRPGAHLATLRTTAEERIVSSHIRRSST--ATDA-
MCOR0077C (1) MGQFIIVSFGLVVVALSLRGTGAD----HHCPSSWASYNE----FCYMVSNGSMTWNNAEGFCLKQQPDCHLASIHSKPEAAFIVGLAYHGASS-RSSV-
MCOR0090S (1) MGHFTFISLCLMPIFLSLSGAECY-----TCPIDWLSRNG----LCYKLFDDTKTWPDAEIFCRKHKPGCHLTSIHSEAESADLAEYIYDYLKS-EKNV-
MCOR0095C (1) MGHFTFISLCLMPIFLSLSGAECY-----TCPIDWLSRNG----LCYKLFDDTKTWPDAEIFCRKHKPGCHLTSIHSEAESADLAEYIYDYLKS-EKNV-
MCOR0292S (1) -GKFIIVSFGLVVVAFPLRGTGAD----HHCPSSWASYNE----FCYMVSNGSPTWNNAEGFCLKQQPDCHLASIHSKPEAAFIVGLAYHVASS-RSSV-
MCOR0603Cedit (1) MGHFTFISLCLMPIFLSLSGAECY-----TCPIDWLSRNG----LCYKLFDDTKTWPDAEMFCRKHKPGCHLTSIHSEAESADLAEYIYDYLKS-EKNV-
AAK43584 (1) MGHFTFIGLCLLAMFLSLSGAEC-----YTCPIDWLPKNG----LCYKVFSKHKTWFDAEMYCRKFKPGCHLASLHSNADAVEFSEYISDYLTG-QGHV-
AAK43586 (1) MGHFTFTGLCLLAMFLSLRGAECY-----TCPIDWLPKNG----LCYKVFSKHKTWFDAEKYCRKFKPGCHLASLHSNADAVEFSEYISDYLTG-RGHV-
AAB49518 (1) ----------------------------NNCPQDWLPMNG----LCYKIFDEQKAWEDAEMFCRKYKPGCHLASFHRYGESLEIAEYISDYHKG-QAEV-
ABH05181 (1) MGHFTFTGLCLLAMFLSLRGAECY-----TCPIDWLPKNG----LCYKVFSNPNTWLDAELFCRKFKPGCRLASLHRDADSADLAEYISDYLK-VDGSV-
ABN54808 (1) MGRFLFASLGLLVVAFSLSGTGAN----LYCPFDWLSYNV----SCYKLFYSLVTWDQAQRFCVEQQENSQLASIHDVGESVKLSNYISQRWG--FFDV-
AAQ15153 (1) MGRFIFVSFGLLVVAASLSGTGA------DCLSGWSSYEG----HCYKAFELYKTWEDAESFCMEGVKGGHLVSIESSGEADFVAQLISENMKRLDFFV-
AAQ15155 (1) MGRFIFVSFGLLVVFLSLSGTAA------DCLSGWSSYEG----HCYKPFNELKNWADAENFCTQQQAGGHLVSFQSSEEADFVVKLAFQTFDHSIF---
AAS01426 (1) MGRFIFVSFGLLVVFLSLSGAKGN-----NCPQDWLPMNG----LCYKIFDELKAWKDAEMFCRKYKPGCHLASFHLYGESPEIAEYISDYHKG-QSEV-
BINS0004C (1) MFLITCFIFGLLG-SLTWAGPSVR----TVCPSGTFGYKDGSEWYCYKFYEDQFTFHDAEEECQFKWRG-HLASLTKGKQVKSIAAYVTKENPE-GDLV-
LMUT0078C (1) MGRLIFVSFGLLVVFLSLSGTGA------DCPNGWYSYEG----HCYQIFHLFKTWDDAERFCREQAKGGHLVSIESAEEADFVADLVADNMKRFIPYI-
LMUT0114C (1) MCSWLFICAFLGITFMQDVSAQTCLCAQGFCASGWVQYKS----ACYKVVRQRYTWTEAEISCQRYSPTSHLASIHSTEENNFIFHLMGKPLDYKQGQAY
LMUT0074C (1) MGRFIFVSFGLLVVFLSLSGAAAG------CPSGWSSYKG----HCYKPFNEPKNWADAENFCTQQHTGGHLVSFHSSKEADFVVKLAFQTFG--RDIF-
POLF0063C (1) MGRFILVNLGLLVVAFSLRGSEA------CCPCGWSSYDK----YCYKVFDKRKNWDDAERFCMEQGKGGHLAALGSLEEGKFVGKLAFKKLKEHPTYV-
POLF0083C (1) MGRSIFVNLGLLVVAFSLRGSEA------DCPSGWSSYDK----YCYKVFDERKNWDEAESFCMEQKTGSHLASILSSEEGSYVANLAFKRVK-HPS-M-
WMER0022C (1) MGQFIVVSLGLLAVVFSLTGTGA------HCPCGWTSYEN----FCYKAFNNRKNRDEAEAFCTEQGTGGHLTSIQCTEEADFVATLARRIEIE-PRNI-
WMER0007C (1) MGQF-FLTLGLFVMSVSLKGSAT------LCPSGWSNYTD----YCYKVFYEFKTWDDAEKFCKME-IGRALASIHNSEEESFVHNLTLKSFE--SGSA-
AAU11827 (1) MASVPHFTVFLFLACALGIGANVTRRATSSCPKGWTHHGS----RCFTFHRGSMDWASAEAACIR--KGGNLASIHNRREQNFITHLIHKLSGE-NRRT-
NP_114433 (1) MASRSMRLLLLLSCLAKTGVLG-DIIMRPSCAPGWFYHKS----NCYGYFRKLRNWSDAELECQSYGNGAHLASILSLKEASTIAEYISGYQR--SQPI-

101 197
MCOR0024C (91) WIGLSDPW---ENRTWVWSDGSAYD--YTSWVSEKPSAVDEEQHCVHLS---SSSRYREWEAASCESNNYFICKM----------------------
MCOR0060C (90) WIGLRLSK---RKSIWEWSDGSNLT--YTSWEKGEPNNLMNGEFCAVLS---TGSRYLQWNDKSCWHVHSFVCKFQLQSEAKA--------------
MCOR0067C (93) WIGMHAVR-TPKKLIWEWIDGTTYTPGTLLWDNRAPSTSLSTAECISVTNIHIPGNAARWIQRTCATALPFICKFRSSF------------------
MCOR0077C (91) WIGLNDPE---KRRAWQWSDGSRLI--YKSWMPGEPNNHASMEYCVVLS---AWSRYVGWNDQDCGSRHNFVCKFQPRS------------------
MCOR0090S (90) WIGLNDPQ---KERIWEWTDRSSTN--YTSWNEGEPNNSWNKEYCVHLL---ASQGYLKWNDTPCESLFAFICRCQF--------------------
MCOR0095C (90) WIGLNDPQ---KERIWEWTDRSSTN--YTSWNEGEPNNSWNKEYCVHLL---ASQGYLKWNDTPCESLFAFICR-----------------------
MCOR0292S (90) WIGLNDPE---KRRAWRGSDGSRLI--YKSWMPGEPNNHASMEYCVVLS---AWSRYVGWNDQDCGSRHNFVCKFQ---------------------
MCOR0603Cedit (90) WIGLNDPQ---KERIWEWTDRSSTN--YTSWNEGEPNNSWNKEYCVHLL---ASQGYLKWNDTPCESLFAFICRCQF--------------------
AAK43584 (90) WIGLRDTK---KKYIWEWTDRSRTD--FLPWRKKQPDHFNNNEFCVEIV---NFTGYLQWNDDNCAALRPFLCQCKY--------------------
AAK43586 (90) WIGLRDTK---KKYIWEWTDRSRTD--FLPWRKNQPDHFNNNEFCVEIV---NFTGYLQWNDDNCAALRPFLCQCKY--------------------
AAB49518 (67) WIGLWDKK---KDFSWEWTDRSCTD--YLTWDKNQPDHYEGKEFCVELV---SLTGYRLWNDQVCESKNAFLCQCKF--------------------
ABH05181 (90) WIGLNDPQ---KKRTWVWSDRSSSN--YFSWNQGEPNNSKNKEYCVHLW---APTGYLKWNDAPCESLHPFLCQCKY--------------------
ABN54808 (90) WMGLRLSK---RNGIWEWSDGSNLT--YTSWKEGEPNNLFNMEFCAVLS---AGTRYLQWNDKKCTLLHPFLCQFQPRSEANG--------------
AAQ15153 (90) WIGLRVQGD-EKQCNSEWSDGSSVS--YENWIESES------KTCLGLE---QQTKFRKWVNLYCGQRIPFVCEA----------------------
AAQ15155 (88) WMGLSNVW---NQCNWQWSNAAMLR--YKAWAE-ES-------YCVYFK---STNNK--WRSRSCRMMANFVCEF----------------------
AAS01426 (90) WIGLWDKK---KDFSWEWTDRSCTD--YLSWDKNQPDHYQNKEFCVELV---SDTGYRLWNDQVCESKNAFLCQCKF--------------------
BINS0004C (93) WIGLREVKGSSVKTRWRWTDGTRSM--YKKWSYGEPKIGHYDDPCVGLS---PASGYVEWVARECTNTFPFLCKWKPS-------------------
LMUT0078C (90) WIGLRVQGE-QKKCTSKWSDGSSVS--YENWDESEL------KTCLGLE---QDTNYEKWENVYCGKINPFVCEA----------------------
LMUT0114C (97) WIGAHDTF---KEGTFVWTDGSKFD--FQSFPSEQPDGLTGEHYLGSWF---LRNEKITWNDYNNSWKFGSVCKYSLANGGCSSSCEAK--------
LMUT0074C (88) WMGLSNVW---NKCSWQWSNAAMLK--YEAWAEES--------YCVYFK---STNNK--WKSCACRMEAYFVCEFQA--------------------
POLF0063C (90) WIGLRAQGQ-GQQCSSRWSDGSRIL--YENWHPLQS------KKCIALS---KWTEYLKWYNHICDFTLPFICKFLAEPDDPE--------------
POLF0083C (88) WIGLSNIW---NQCSWQWSDGSSLG--YEAWVEG--------PDCVMMR---LQPGFIDWYSVECKSTLPFTCKFLAKREDPAPE------------
WMER0022C (89) RIGLKAAPQREEQCSRKWSDGSRIG--YKKINTKY------IKKCVTLS---KVTGYQKWHNFNCDDKCPFICKILASEDPVSEAPGGLEKQGSPPA
WMER0007C (86) WIGLSNVW---KKCHWEWSDQSLVD--FEAWVER--------PHCVGMR---VQPKLVSWHDMDCQIKLPFICKSPKEAKAVPR-------------
AAU11827 (93) WIGGNDAV---KEGMWFWSDGSKFN--YKGWKKGQPDKHVPAEHCAETN---FKGAF--WNNALCKVKRSFLCAKNL--------------------
NP_114433 (93) WIGLHDPQ---KRQQWQWIDGAMYL--YRSWS-GKSMG--GNKHCAEMS---SNNNFLTWSSNECNKRQHFLCKYRP--------------------

57
 B

Figura 12: A) Alinhamento das lectinas do tipo C e seus homólogos estruturais, as lectinas-like,
juntamente com as lectinas fisiológicas animais encontradas no transcriptoma de glândulas de
veneno de M. corallinus. B) Análise filogenética Baesiana dessas lectinas tipo C (setas
vermelhas indicam os clusters das lectinas tipo C encontradas no banco transcriptômico de
glândulas de veneno de M. corallinus).

58
4.1.2.4 Peptídeo Natriurético
O precursor do peptídeo natriurético encontrado nos elapídeos é uma forma
diferenciada do precursor dos peptídeos potenciadores de bradicinina (BPP) e do
peptídeo natriurético encontrado nos viperídeos. Os peptídeos natriuréticos estão
presentes em muitos venenos, inclusive nos elapídicos, onde são codificados por outro
tipo de precursor, sem os BPPs (SCHWEITZ et al., 1992 e HO et al., 1997).
Três são os principais tipos de peptídeos natriuréticos encontrados: peptídeo
natriurético atrial (ANP), peptídeo natriurético cerebral (BNP) e peptídeo natriurético
tipo C (CNP). O peptídeo natriurético da serpente do gênero Dendroaspis (DNP)
compartilha propriedades estruturais e funcionais com essas três formas. Todos
apresentam efeito de vasodilatação, assim como efeitos natriuréticos. Os efeitos de
vasodilatação induzido pelas três formas de peptídeos natriuréticos são mediados pela
estimulação de uma guanilato ciclase específica (WOODARD et al., 2002). Um peptídeo
análogo aos CNPs foi sintetizado e perfundido em rim de rato, e apresentou resposta
sobre o volume urinário e excreção de Na2+ dose-depentente (HO et al., 1997).
Encontramos cinco clusters em um total de catorze clones, que representam
aproximadamente 1% de todas as proteínas expressas no banco obtido. O cDNA
representante do cluster MCOR0001C (seis clones) é muito semelhante ao que foi
caracterizado por HO et al. (1995), à exceção da cisteína extra que não foi confirmada
em nossa seqüência. Todos os peptídeos natriuréticos descritos até hoje apresentam uma
estrutural em anel com dezessete aminoácidos atrelado por uma ponte dissulfeto, que se
estende com alguns poucos aminoácidos pelo N-terminal. Já no C-terminal, os
peptídeos natriuréticos do tipo B e C de mamíferos apresentam de quatro a sete
aminoácidos. O peptídeo natriurético de M. corallinus apresenta algumas
peculiaridades: a) ele apresenta uma extensão C-terminal não usual que é mais longa; e
b) essas regiões flanqueadoras apresentam duas regiões homólogas de função
desconhecida.
Ao realinhar os clusters entre si notamos que três clusters (MCOR0019C,
MCOR0193S, MCOR0195S) apresentaram uma grande deleção de 237 pb em relação
ao MCOR0001C resultando na ausência de 79 aminoácidos (Figura 13). Analisando as
montagens e as ESTs individualmente, ao nível de cromatogramas, percebemos que esta
deleção não deriva de artefatos do processo bioinformático e que estão até presentes em
mais clones (sete no total) do que a molécula arquétipa do cluster MCOR0001C (seis
clones). A fase de leitura é mantida após a deleção, de forma que o polipeptídeo

59
codificado possui o peptídeo sinal, parte do prodomínio incluindo, uma parte das
regiões homólogas e o restante do C-terminal. Portanto, o trecho deletado corresponde
ao peptídeo natriurético maduro propriamente dito e um pouco da região flanqueadora.
Diferentemente da inserção no cDNA da PLA2 (descrita na Figura 12), o trecho
deletado não segue a regra GT-AG de splicing e portanto não deve se tratar de um
splicing alternativo. Além disso, alguns clusters ainda apresentam inserções
correspondentes a quatro resíduos (VHPE) próximas ao C-terminal.
É difícil precisar qual o real significado de uma molécula como esta, abundante,
com parte dos elementos do prodomínio e do C-terminal, mas em que está ausente o
CNP. Uma pista pode ser a presença, mesmo na forma deletada, de uma das regiões
repetitivas, que já foi sugerida como possuindo elementos característicos de peptídeos
biologicamente ativos (HO et al., 1997). Assim, talvez esse precursor seja “desenhado”
para produzir um novo peptídeo baseado nesse trecho. É interessante notar que os
precursores dos BPPs/CNPs de venenos, cujas estruturas são conhecidas há algum
tempo, vêm revelando novos peptídeos em suas regiões propeptídicas. GRAHAM et al.,
2005, por exemplo encontraram peptídeos inibidores de bradicinina no mesmo
precursor dos BPPs. Mais recentemente, WAGSTAFF et al., 2008, descreveram que a
região espaçadora conservada (EKW) de alguns precursores gera peptídeos presentes no
veneno capazes de inibir as metaloproteases do próprio veneno, num suposto
mecanismo de proteção contra proteólise na glândula.

Figura 13: Alinhamento entre as seqüências de peptídeo natriurético encontrado em análise do

banco de dados. A região repetitiva está delimitada entre as barras pontilhadas, com a região
mais conservada destacada.

60
4.1.2.5 L-aminoácido oxidase
L-aminoácido oxidases são conhecidas há muito tempo em venenos. São
enzimas grandes, de 58kDa, que atuam basicamente sobre L-aminoácidos convertendo-
os em cetoácidos e gerando H2O2, o que parece contribuir para a inibição da agregação
plaquetária e lesão celular (NATHAN et al., 1982). Não foi obtido nenhum clone
completo, devido provavelmente ao seu cDNA (2,8 kb) ser muito longo (RAIBEKAS &
MASSEY, 1998). Dois clusters, MCOR0200S e MCOR0263S, cada um contendo apenas
um clone (singlet), foram encontrados no banco de M. corallinus (Figura 14). A L-
aminoácido oxidase já foi reportada em elapídeos, pois está depositada no banco de
dados (Accession no AAY89682), mas não em Micrurus. Na análise desses dois
clusters, notamos que os dois se sobrepõem, sendo que o MCOR0200S representa a
parte correspondente a 3’UTR (posição 1368pb-1551pb), enquanto o MCOR0263S
contém a parte C-terminal da região referente à proteína madura (885pb-1386pb).

MCOR0200S: 483 » 1029

MCOR0263S: 1 » 507

1 500 1000

Figura 14: Dois clones encontrados no banco de dados de M. corallinus representando duas
regiões fracamente contíguas da L-aminoácido oxidase.

4.1.2.6 Inibidor do tipo Kunitz

Nos venenos de cobras, a estrutura dos inibidores de serinoprotease do tipo
Kunitz aparece na forma de dois tipos de moléculas funcionalmente distintas: os
inibidores de serinoprotease não-neurotóxicos e os neurotóxicos, também chamados de
dendrotoxinas, que não possuem grande ação inibitória nas proteases. Os não-
neurotóxicos são capazes de inibir a tripsina e quimiotripsina, e são comuns nas
Famílias Viperidae e Elapidae (ZUPUNSKI et al., 2003). As dendrotoxinas estão
presentes nos venenos de alguns elapídeos, como a mamba negra (Dendroaspis) e os
kraits (Bungarus). Sua ação tóxica se dá pelo aumento da liberação de
neurotransmissores, como a acetilcolina, das membranas pré-sinápticas das sinapses
colinérgicas. As dendrotoxinas têm como alvo canais de potássio das membranas das
células nervosas, que são bloqueados.

61
 Dois clusters de baixa expressão, MCOR0110C e MCOR0611S, foram
encontrados no banco de dados. Ambos aparentam ser mais parecidos com os inibidores
que com as neurotoxinas, já que são similares a diversos tipos de inibidores dos
viperídeos, embora o grau de conservação dos dois seja baixo. Entretanto, no contexto
de forte perturbação neurotóxica do veneno de M. corallinus tal atividade é bastante
plausível, portanto mais análises ainda são necessárias para se determinar sua função
exata.

4.1.2.7 Metaloprotease
As metaloproteases de veneno são normalmente agrupadas de acordo com a
presença de domínios específicos. Há um domínio proteolítico caracterizado pela
presença de um sítio catalítico que conserva o motivo HEXXHXXGXXH, responsável
pela ligação de um íon metálico, geralmente Zn2+. Após o domínio catalítico pode haver
um domínio tipo desintegrina, capaz de se ligar às integrinas de plaquetas ou de células
endoteliais. A região responsável pela ligação às integrinas pode apresentar o motivo
RGD (desintegrinas RGD) ou ter esta seqüência substituída por outra, como ECD
(desintegrinas não-RGD), alterando sua especificidade. O carboxi-terminal das
desintegrinas não-RGD pode ter ainda um domínio rico em cisteínas de função pouco
conhecida.
A metaloprotease encontrada aqui é representada apenas por um único cluster
MCOR0063C, de apenas quatro clones (1123pb). É semelhante à cobrina encontrada
em Naja naja, espécie da Família Elapidae do Velho Mundo. Trata-se de um exemplar
de metaloprotease do tipo P-III, ou seja, ela apresenta o domínio tipo desintegrina não-
RGD seguido de um domínio rico em cisteínas.

4.1.2.8 Serinoprotease
As serinoproteases de veneno, especialmente em viperídeos, estão relacionadas à
tripsina. Essas proteínas possuem em torno de 35kDa, apresentam seis pontes dissulfeto
e quantidades variáveis de sítios de glicosilação. Estas enzimas normalmente contém
doze resíduos de cisteína e uma extensão C-terminal, o que é característica das
serinoproteases. As serinoproteases do veneno de cobra devem ocorrer como enzimas
similares à tripsina, amplamente descrita nos viperídeos, ou como as proteínas do tipo
Fator X, mais complexas, encontradas em alguns elapídeos terrestres (KINI, 2005).
Recentemente, algumas enzimas similares à tripsina foram descritas na Família

62
Elapidae, por exemplo, ABN72544, o que mostra que essa não é uma classificação
pragmática.
A variação de substratos das diversas serinoproteases de veneno é bastante
grande e muitas delas atuam sobre os elementos da cascata de coagulação.
As serinoproteases através de evoluções adaptativas aceleradas geram variantes
de diversas funções (FRY et al., 2006), incluindo especificamente componentes
sanguíneos de degradação e ativação que estão envolvidas na coagulação e fibrinólise
(SERRANO & MAROUN, 2005), ativando o sistema kalicreína/kinina (HUNG & CHIOU,
2001) ou afetando agregação plaquetária (LAING et al., 2005).
No transcriptoma de M. corallinus nós não encontramos nenhum dos tipos,
apenas um único cluster parcial (MCOR0160S) que mostra mais similaridade com as
serinoproteases não-venenosas dos mamíferos (~52% de identidade) do que com as
serinoproteases das serpentes (~39%). Os maiores acertos se dão com as prostasinas de
mamíferos basais, como o ornitorrinco (Monotremata) e o gambá (Metatheria). Este é
um canal que ativa a protease envolvida no crescimento de células epiteliais. A porção
semelhante ao MCOR0160S corresponde a uma parte do domínio da Peptidase S1,
indício de que deve ocorrer atividade proteolítica. Mas, como a seqüência é parcial, não
é possível determinar a presença de domínios adicionais, como o C-terminal
transmembrana ou o propeptídeo. Dada a onipresença da serinoprotease nos venenos de
cobra, nós incluímos este cluster entre as possíveis toxinas de M. coralinus, embora uma
confirmação posterior ainda seja necessária.

4.1.2.9 NGF
Assim como seus homólogos de mamíferos que regulam diferenciação neuronal,
os NGFs (Nerve Growth Factor) de veneno atuam como agonistas de baixo potencial de
receptores TrkA (tirosina-quinase), ao competir pela ligação ao receptor com o NGF
endógeno, influenciando no desenvolvimento de neurônios colinérgicos (MCDOWALL,
http://www.ebi.ac.uk/interpro/potm/ 2004_6/Page1.htm).
Os NGFs pertencem à família dos fatores neurotróficos e são polipeptídeos
neurotróficos muito bem caracterizados. Foram os primeiros fatores neurotróficos a ser
identificados como polipeptídeos que regulam manutenção e sobrevivência neuronal
(KOSTIZA & MEIER, 1996). Por definição, os fatores neurotróficos são proteínas solúveis
endógenas que regulam sobrevivência, crescimento, plasticidade morfológica, ou
síntese de proteínas para funções diferenciadas dos neurônios.

63
 Os NGFs apresentam um papel importante na ontogênese e regulam o
desenvolvimento e manutenção de neurônios derivados de neurônios sensoriais
embrionários e de células nervosas do nervo periférico simpático dos vertebrados.
Recentemente, tem surgido evidências de que as NGFs têm efeito similar dentre os
neurônios colinérgicos do sistema nervoso central. Apesar de induzir um típico
crescimento de fibras em cultura celular, veneno de serpente e NGF humano exibem
também efeitos não-neuronais, tal como indução de extravasamento plasmático e
liberação de histamina de todas as células sanguíneas (KASHIMA et al., 2002).
As proteínas do tipo NGF são típicas também de muitos venenos, onde se
apresentam como complexos homodiméricos associados por ligações, geralmente não-
covalentes. Os NGFs de venenos podem ser incluídos dentro do grupo das
vasculotoxinas. O efeito desses fatores no envenenamento é provavelmente deixar o
local da picada mais suscetível aos outros componentes do veneno e levar a uma
distribuição ótima de substâncias que dificilmente poderiam se infiltrar no tecido alvo
(KOSTIZA & MEIER, 1996).
Esse componente também foi encontrado em nosso banco, porém é bem menos
abundante que as demais. Talvez pelo fato de sua seqüência ser bastante longa, o único
cluster obtido (MCOR0149S) é parcial, ou seja, corresponde apenas a parte da região C-
terminal. Sua relevância no veneno de serpentes ainda não é muito clara.

4.1.2.10 WAP
Essa é uma classe nova de toxinas. No banco obtivemos apenas um cluster,
MCOR0526S, com apenas um clone. É uma seqüência parcial, ou seja, não contém a
porção do peptídeo sinal e parte da proteína madura.
A proteína WAP (Whey Acidic Proteins), ou waprina ou nawaprina (assim
denominada por ter sido descrita primeiramente em Naja nigrocollis) apresenta um
possível papel como inibidor de protease. É semelhante à elafina (inibidor de elastase de
leucócito humano), caltrina-like (inibidor de transporte de cálcio) e a outros inibidores
de protease extracelular. Por apresentar diferenças significativas em regiões importantes
da molécula, nawaprina possivelmente não apresenta uma atividade de inibição da
elastase e deve ter uma função diferente em venenos de serpentes (TORRES et al., 2003).
Membros dessa família apresentam quatro pontes dissulfeto, das quais três estão na base
da molécula. Em mamíferos, sua função parece estar relacionada à maturação
espermática no epidídimo.

64
 O domínio WAP geralmente consiste de cinqüenta resíduos de aminoácidos,
com oito resíduos de cisteína conservados formando quatro pontes dissulfeto. Apesar
dos resíduos de cisteína serem conservados, os segmentos intercisteína são totalmente
diferentes dos demais membros da família WAP. Além disso, o domínio WAP é
encontrado em proteínas com funções divergentes, incluindo inibição Na+K+ATPase,
inibidor de proteinase com atividade antimicrobial (elafina), atividade inibitória do
crescimento (ps20) e proteínas antibactericidas. A maioria das proteínas de domínio
WAP reportadas estão envolvidas no sistema imune inato (NAIR et al., 2007).

4.2 IMUNIZAÇÃO GENÉTICA

Como discutido anteriormente, a produção de soro no Instituto Butantan é

limitada, principalmente, pelo tamanho reduzido das glândulas de veneno das cobras-
corais, o que acarreta uma baixa produção de veneno. Por essa razão, há uma
necessidade de buscar formas alternativas para a geração de soro antielapídico. A
escolha mais óbvia seria a produção de toxinas recombinantes em E. coli. Porém as
3FTx, que são as toxinas mais abundantes encontrada no veneno, apresentam muitas
pontes dissulfeto, o que poderia acarretar um dobramento incorreto da proteína que leva
a mudanças funcionais. Há, dessa forma, uma necessidade de se fazer o refolding da
proteína (reestruturação da proteína), o que é bastante complicado, lento e custoso. Essa
alternativa foi bastante explorada em projetos anteriores de nosso laboratório (PRIETO
DA SILVA, 2001b), que confirmaram essas dificuldades metodológicas esperadas. Por
outro lado, sistemas eucariontes como células de mamíferos ou levedura podem não
render a quantidade necessária de proteína a fim de se produzir o soro. Então,
experimentalmente, seria importante determinar a viabilidade de geração de resposta
imune contra toxinas de cobra-coral por meio de uma outra abordagem, tal como a
imunização genética, ou a vacina de DNA. Essa idéia é atual e já foi testada para
venenos africanos de Echis ocellatus e Cerastes cerastes (HARRISON, 2004 e WAGSTAFF
& HARRISON, 2006). O intuito final desse projeto é justamente a imunização em
cavalos, porém antes é necessário definir a prova do princípio, com a escolha dos
candidatos antigênicos e pela avaliação das construções a serem utilizadas.

65
4.2.1 Escolha de candidatos antigênicos a partir do transcriptoma de M. corallinus

Tendo em vista o padrão obtido pela análise transcriptômica, pudemos ratificar

as informações contidas na literatura sobre as toxinas predominantes desse veneno e,
assim, dar continuidade ao projeto.
O passo seguinte foi escolher os candidatos antigênicos para uma possível
imunização alternativa. Vários tipos de toxinas foram analisados dentro do banco de
ESTs (transcriptoma) de Micrurus corallinus. Essas seqüências foram comparadas com
seqüências semelhantes no banco de dados e, com base na literatura, verificamos o
efeito farmacológico esperado e em que contexto esse efeito estava inserido. Entre os
vários critérios que podem ser adotados para orientar nossa escolha, consideramos, por
exemplo:
1) cDNAs que eram abundantes (dado pelo número de clones seqüenciados), pois
podem representar toxinas mais relevantes.
2) Representantes de tipos diferentes de toxinas, pois assim pode-se despertar resposta
imune abrangente para todos os componentes.
3) Toxinas com formas ortólogas presentes em espécies diferentes.
4) Proteínas novas, sem função aparente, mas com peptídeo sinal para secreção.
5) cDNAs de proteínas não descritas como toxinas na literatura, mas que mediam
efeitos deletérios.
Resolvemos escolher inicialmente, como validação, as proteínas sobre as quais
se sabe que têm ação tóxica e são abundantes no veneno, tais como as 3FTx (α-
neurotoxinas) e as PLA2, também conhecidas pela sua ação β-neurotóxica ou pré-
sináptica.
Pela análise das 3FTx encontradas por semelhança com o banco de dados,
fizemos um alinhamento e conseguimos reunir os 37 clusters com seqüências completas
(full-lengths) em diferentes lotes, conforme relatado anteriormente, dos quais
escolhemos representantes de quatro grupos como candidatos a antígenos, conforme
descrito a seguir.
Um grupo (representado pelo cluster MCOR0604C) é semelhante a uma
seqüência peculiar, a homolog 8 (nxh8) (PRIETO DA SILVA, 2001b). Cinco clusters (um
total de 44 clones) compõem o grupo, porém um cluster (MCOR0546S contendo 1
clone) foi excluído, pois apresentava muitos erros de seqüenciamento. O grupo está

66
representado na Figura 15 com enfoque na seqüência escolhida como representante,
pelas mesmas razões descritas acima. Da mesma forma, o clone MCAL01H08,
pertencente ao cluster MCOR0604C, será considerado daqui em diante como nosso
antígeno 1, referido como Atg1.

(1) 1 10 20 30 40 50 60 70 86
MCOR0118C (1) MKTLLLTLVVVTIMCLDLGYTLECKICNFKTCPTDELRRCASGETICYKTFWNTHRGLRIDRGCAATCPTVKPGVNIICCKTDNCN
MCOR0604C (1) MKTLLLTLVVVTIMCLDLGYTLECKICNFKTCPTDELRHCASGETICYKTFWNTHRGLRIDRGCAATCPTVKPGVNIICCKTDNCN
MCOR0605C (1) MKTLLLTLVVVTIMCLDLGYTLECKICNFKTCPTDELRHCASGETICYKTFWNTHRGLRIDRGCAATCPTVKPGVNIICCKTDNCN
MCOR0496S (1) MKRKLLTLVVVTIMFLPLGYTLECKICNFKTCPTDELRHCASGETICYKTFWNTHRGLRIDRGCAATCPTVKPGVNIICCKTDNCN
MCOR0152S (1) -------------MCLVLGYTLNCKICNFKTCPTDELRRCASGETICYKTFWNTHRGLRIDRGCAATCPTVKPGVNIICCKTDNCN
Consensus (1) MKTLLLTLVVVTIMCLDLGYTLECKICNFKTCPTDELRHCASGETICYKTFWNTHRGLRIDRGCAATCPTVKPGVNIICCKTDNCN

Figura 15: Alinhamento dos clusters que representam o grupo homolog 8 (nxh8). O cluster
MCOR0604C (Atg1) foi o escolhido para representar todo o grupo e é idêntico à seqüência
o
nxh8 (Accession n sp|P58370|NXAH8_MICCO).

Um segundo grupo (representado pelo cluster MCOR0599C) é semelhante às

neurotoxinas homólogas nxh1, nxh3 e nxh7 (HO et al., 1995). Os quinze clusters
pertencentes a esse grupo somam 126 clones e foram alinhados, sendo representados na
Figura 16 com enfoque na seqüência do cluster escolhido como representante, por estar
entre os mais abundantes e possuir a seqüência mais consensual do grupo. Dessa forma,
o clone MCAL07D03, pertencente ao cluster MCOR0599C, será considerado daqui em
diante como nosso antígeno 2, referido como Atg2.

(1) 1 10 20 30 40 50 60 79
MCOR0117C (1) -MKTLLLTLVVVTIVCLDFGYTIICYKRHASDSQTKTCLSGICYKKYTRGRYNPEMGCGCPQSGRGVDVDCCMRDKCNG
MCOR0444S (1) -MKTLLLTLVETDIVCLDFGYTIICYKRHASDSQTKTCLSGICYKKYTRGRYNPEMGCGCPQSGRGVDVDCCMRDKCNG
MCOR0543S (1) -MKTLLLTLVVVTIVCLDFGYTIVCYKRHASDSQTTTCLSGICYKKITRGISRPEMGCGCPQSSRGVKVECCMRDKCNG
MCOR0597C (1) -MKTLLLTLVVVTIVCLDFGYTIVCYKRHASDSQTTTCLSGICYKKITRGISRPEMGCGCPQSSRGVKVECCMRDKCNG
MCOR0598C (1) -MKTLLLTLVVVTIVCLDFGYTIVCYKRHASDSQTTTCLSGICYKKITRGSSRPEMGCGCPQSSRGVKVECCMRDKCNG
MCOR0483S (1) MTKTLLLTLVVVTIVCLDFGYTIVCYKRHASDSQTTTCLSGICYKKITRGSSRPEMGCGCPQSSRGVKVDCCMRDKCNG
MCOR0584S (1) -MKTLLLTLVVVTIVCLDFGYTIVCYKRHASDSQTTTCLSGICYKKITRGSSRPEMGCGCPQSSRGVKVDCCMRDKCNG
MCOR0004C (1) -MKTLLLTLVVVTIVCLDFGYTIVCYKRHASDSQTTTCLSGICYKKITRGSSRPEMGCGCPQSSRGVKVDCCMRDKCNG
MCOR0599C (1) -MKTLLLTLVVVTIVCLDFGYTIVCYKRHASDSQTTTCLSGICYKKITRGSSRPEMGCGCPQSSRGVKVDCCMRDKCNG
MCOR0106C (1) -MKTLLLTLVVVTIVCLDFGYTIVCYKRHASDSQTTTCLSGICYKKITRGSSRPEMGCGCPQSSRGVKVDCCMRDKCNG
MCOR0476S (1) -MKTLLLTLVVVTIVCLDFGYTIVCYKRHASDSQTTTCLSGICYKKITRGSSRPEMGCGCPQSSRGVKVDCCMRDKCNG
MCOR0600C (1) -MKTLLLTLVVVTIVCLDFGYTIVCYKRHASDSQTTTCLSGICYKKITRGSSRPEMGCGCPQSSRGVKVDCCMRDKCNG
MCOR0568S (1) -MKTLLLTLVVVTIVCLDFGYTIVCYKRHASDSQTTTCLSGICYKKITRGSSRPEMGCGCPQSSRGVKVDCCMRDKCNG
MCOR0540S (1) -MKTLLLTLVVVTIVCLDFGYTIVCYKRHASDSQTTTCLSGICYKKITRGSSRPEMGCGCPQSSRGVKVDCCMRDKCNG
MCOR0557S (1) -MKTLLLTLVVVTIVCLDFGYTIVCYKRHASDSQTTTCLSGICYKKITRGSSRPEMGCGCPQSSRGVKVDCCMRDKCNG
Consensus (1) MKTLLLTLVVVTIVCLDFGYTIVCYKRHASDSQTTTCLSGICYKKITRGSSRPEMGCGCPQSSRGVKVDCCMRDKCNG

Figura 16: Alinhamento dos clusters que representam o grupo nos quais incluem nxh1, nxh3 e
nxh7. O cluster MCOR0599C (Atg2) foi o escolhido para representar todo o grupo e é idêntico à
o
seqüência nxh7 (Accession n sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO).

67
 Estes dois tipos de neurotoxinas eram os mais abundantes (Figuras 15 e 16) e,
portanto, os candidatos eram mais evidentes. Entretanto, os outros clusters de 3FTx
correspondem a formas bastante diferenciadas e não possuem identidade significativa
com qualquer outra possível neurotoxina elapídica depositada nos bancos de dados
(apresentam apenas um padrão de conservação dos resíduos importantes do grupo). Foi
feito um alinhamento de todas essas seqüências diferentes de neurotoxinas (quinze
clusters), que foram denominadas “outras neurotoxinas”. Deste alinhamento, fomos
excluindo as proteínas que representavam isoformas semelhantes umas das outras até
que ficassem apenas as formas mais diferenciadas. Sete clusters foram então omitidos, e
restou somente um representante de cada tipo (Figura 17). Dentro desse conjunto,
destacam-se dois tipos mais abundantes: um composto por 29 clones (representado pelo
cluster MCOR0039C) e outro com 27 clones (representado pelo cluster MCOR0100C).
Esses dois clusters, destacados na Figura 17, foram selecionados como candidatos
antigênicos por serem abundantes e diferentes das duas seqüências já conhecidas de
Micrurus descritas anteriormente, e foram denominados, respectivamente, Atg3 e Atg4.

(1) 1 10 20 30 40 50 60 70 80 96
MCOR0039C (1) MNTLLLTLVVVTIVCLDFG---YTTKCLTKFSPGLQTSQTCPAG-QKICFKKWKKG-----EKVSRGCAVTCPKPKKDETIQCCTKNNCNR-----
MCOR0120C (1) MKTLLLTLVVVTIMCLDFG---YTLICLTHKSAVFETTETCLPGLHKVCYKRWYMG-----SSVDAGCADTCPRNFPLEIVECCATDKCNR-----
MCOR0092C (1) MKTLLLTLVVVTIVCLDLG---NSLICYNTMMQ----KVTCPEG-KDKCEKYAVPVMR-GKFYFSYQCTSKCHEG---AYDVCCSTDLCNKSSTSG
MCOR0094C (1) MKTLLLTLVVVTIVCLDLGNTANTLFCDNSNVPSIRTRKRCLKN-QKLCYKMTFFTPG-FGWTQIKGCIHRCPESTPNEKYQCCSTDNCI------
MCOR0100C (1) MKTLLLTLVVVTIMCLDLG---YTLVCYTNVLEPPGTLETCPD--DFTCVKKWEGGG----RRVTQYCSHACAIPASYEFVHCCQTDKCNG-----
MCOR0103C (1) MKALLLTLVVVTIVCLDLG---YTRKCYEGEG--TRKSVTCPKG-EKVCYTIFLVGPSHPAKVLKWGCAASCPKVGLGARISCCSKDNCNSHR---
MCOR0105C (1) MKTLLLTLVVVTIMCLDLG---YTRKCRIGKDG--FYSVTCTEK-ENLCFTMFSARS--PTQIIERGCASSCS----SRYMKCCSTDSCNG-----
MCOR0109C (1) MKTLLLTLVVVTIVCLDLG---HTLQCYVGRDG--FKFVTCPEG-ENHCYTTAITAR--PTYVIVRGCISSCS----WYYIKCCTTDKCND-----
Consensus (1) MKTLLLTLVVVTIVCLDLG YTL CY T VTCP G K CYK G GCA CP E CCSTD CN

Figura 17: Alinhamentos dos clusters representantes do grupo “outras neurotoxinas”. Em

destaque estão os clusters escolhidos como candidatos antigênicos (Atg3 e Atg4).

A Figura 18 representa o alinhamento das quatro diferentes 3FTx que foram

selecionadas como candidatos.

(1) 1 10 20 30 40 50 60 70 80 94
MCOR0599C (1) MKTLLLTLVVVTIVCLDFGYTIVC-YKRHAS-DSQ---TT-TCLSG---ICYKK-IT--RGSSRPEMGCG--C--PQSSRGVKVDCCMRDKCNG
MCOR0039C (1) MNTLLLTLVVVTIVCLDFGYTTKC-LTKFSP-GLQ---TSQTC-PAGQKICFKK-WK--KGEK-VSRGCAVTCPKPKKD--ETIQCCTKNNCNR
MCOR0100C (1) MKTLLLTLVVVTIMCLDLGYTLVC-YTN----VLEPPGTLETC-PD-DFTCVKK-WE--GGGRRVTQYCSHACAIPASY--EFVHCCQTDKCNG
MCOR0604C (1) MKTLLLTLVVVTIMCLDLGYTLECKICNFKTCPTD---ELRHCASG-ETICYKTFWNTHRGLR-IDRGCAATC--PTVKPGVNIICCKTDNCN-
Consensus (1) MKTLLLTLVVVTIMCLDLGYTLVC YTNFAS LQ TL TC SG D ICYKK W RG RRVSRGCA TC P S GV I CC TDNCNG

Figura 18: Alinhamento dos principais candidatos de proteínas de três dígitos escolhidos a
partir do transcriptoma de M. corallinus.

68
 O quinto candidato escolhido é o cluster MCOR0036C, representando o cluster
mais abundante obtido com 196 clones de possíveis PLA2. Como mostrado
anteriormente, os outros clusters menos abundantes diferenciam-se deste pela presença
de deleções e inserções. A Figura 19 representa o cluster escolhido como candidato da
PLA2, considerado daqui em diante como Atg5 (Antígeno 5).

1 TGAGGTTGTA GACTGAAAAA GTTTGGGAAC CACTGCTATA AAAGGCTGAA CTCGCCAGGT

M N P A H L L
61 ATCGAAATTC ATCTTACTTG CAGCTTCACC ATGGACAAAA TGAATCCTGC TCACCTTCTG
V L A A V C V S L L G A S S V P P R P L
121 GTCCTGGCAG CAGTTTGTGT CTCCCTCTTA GGAGCCTCCA GCGTTCCTCC CCGACCTCTC
N L I N F Q R M I Q C T T R R S A W D F
181 AACCTCATTA ACTTCCAACG CATGATTCAA TGTACCACGA GGCGATCTGC GTGGGACTTT
T N Y G C Y C G A G G S G T P V D E L D
241 ACGAACTACG GTTGCTACTG CGGCGCCGGA GGTAGCGGGA CACCGGTAGA CGAGTTGGAT
R C C K V H D D C Y G A A E K Y H R C S
301 AGGTGCTGCA AGGTTCATGA CGACTGCTAT GGTGCAGCCG AAAAATATCA CAGATGCTCG
P K L T L Y T S T C S S Q T G S V T C K
361 CCCAAGTTGA CGCTTTATAC ATCCACCTGT TCTTCCCAAA CCGGGAGCGT CACCTGCAAA
D N G T K C K A F V C N C D R T A A L C
421 GACAACGGCA CTAAATGTAA AGCTTTTGTC TGTAATTGTG ACCGCACGGC AGCCCTCTGC
F G R A P Y N K N N E N I N P N R C R
481 TTCGGGAGAG CGCCTTACAA CAAAAACAAC GAAAATATCA ACCCCAATCG TTGCCGATGA
541 TATTTGAGAG GCTTCAGTGC AAGGACTGTG GCAGTTACTC ACCTGCGTGT GGCAATTCTC
601 TGGAGGGCCT CTATAATATA TATCATTTTC AAAAAACAAA AGGAACCATT TCCTGAACAA
661 TAAAGTGAGG CACCGATACC CAAAAAAAAA AA

Figura 19: Candidato selecionado para representar as fosfolipases do tipo A2 (PLA2)

(BINS0036C – 196 clones).

Estes cinco candidatos destacados acima foram preparados para avaliação de

seus potenciais imunogênicos.

4.2.2 Clonagem dos candidatos antigênicos para imunização genética

Seguimos a estratégia apresentada na Figura 4 para clonagem de todos os

candidatos. Entretanto, o andamento das clonagens foi diferenciado em cada caso. A
seguir apresentamos caso a caso o resultado das clonagens.

4.2.2.1 Antígeno 1 (Atg1)

Todas as etapas foram realizadas com sucesso. A Figura 20A abaixo apresenta o
PCR dos dois clones representantes do grupo: MCAL01H08 e MCAL09C06. Os dois
clones foram amplificados com os primers específicos (Neuro1F e Neuro1R). A banda
referente ao clone MCAL01H08 foi recortada e purificada. Esse inserto foi ligado ao
vetor pGEM-T e transformado em bactérias DH5α. A presença de colônias positivas foi

69
verificada pelo screening por PCR com os primers M13F e o Neuro1R. Dessa forma,
dentre os seis testados, quatro foram positivos (MCAL01H08.3, MCAL01H08.4,
MCAL01H08.5 e MCAL01H08.6). Foi escolhido o clone MCAL01H08.5 para ser
inserido no segundo vetor. A etapa seguinte é a digestão com enzimas de restrição
BamHI e EcoRI. A digestão está representada na Figura 20B. O fragmento exposto foi
recortado e purificado.

λHind 1 2
(pb)

A
2027
B λHind D

564

125

Figura 20: A) PCRs dos clones MCAL01H08 e MCAL09C06, os dois clones representantes do
grupo Atg1. B) Digestão do clone MCAL01H08.5 escolhido para representar o Atg1. Nesta
figura está representado apenas o clone digerido (D). A imagem encontra-se superexposta
para facilitar a visualização da banda de baixa massa molecular.

Após a digestão, foi feita uma segunda ligação com o vetor pSecTag2A. A
ligação foi transformada. O screening por PCR é realizado para averiguar a presença de
colônias positivas com o fragmento. Para cada clone positivo foi atribuído um terceiro
número: MCAL01H08.5.1, MCAL01H08.5.2, MCAL01H08.5.3, MCAL01H08.5.3,
MCAL01H08.5.5, como podemos observar na Figura 21. Os clones foram confirmados
por seqüenciamento.

70
 λHind .5.1 .5.2 .5.3 .5.4 .5.5

Figura 21: Screening por PCR (pSecTagA2 + fragmento/clone 1.5). Nessa figura estão
presentes cinco clones do Atg1.

4.2.2.2 Antígeno 2 (Atg2)

Os clones representantes desse grupo de candidatos antigênicos, MCAL07D03 e
MCAL07H04, foram amplificados por PCR. O resultado está apresentado na Figura
22A. A banda referente à amplificação do MCAL07D03 foi recortada, purificada e
ligada ao pGEM-T, que foi transformado. Foi escolhido o clone MCAL07D03.2 para
dar continuidade às clonagens. A digestão do clone MCAL07D03.2 está representada na
Figura 22B. O fragmento produzido foi recortado, purificado e ligado no segundo vetor,
o pSecTag2A. O screening por PCR (clone ligado ao vetor pSecTag2A) está
representado pela Figura 23, e o clone escolhido MCAL07D03.2 foi confirmado por
seqüenciamento.

λHind 1 2 λHind D

A B

Figura 22: A) PCRs dos clones MCAL07D03 (1) e MCAL07H04, (2) os dois clones
representantes do Atg2. Foi escolhido o MCAL07D03 para dar continuidade às clonagens. B)
Digestão do clone MCAL07D03.2 escolhido para representar o Atg2. Nesta figura está
representado apenas o clone digerido (D). O fragmento proveniente da digestão (seta) foi
recortado e purificado.

71
 λHind .2.1 .2.2 .2.3 .2.4 .2.5 .2.6 .2.7 .2.8 .2.9 .2.10

Figura 23: Screening por PCR (pSecTagA2 + fragmento/clone MCAL07D03.2). Nessa figura
estão presentes dez clones do grupo Atg2.

4.2.2.3 Antígeno 3 (Atg3)

Esse grupo, representado pelos clones MCAH05B08 e MCAL06A11, apresentou
algumas dificuldades na amplificação. Foram feitas numerosas tentativas (dados não
mostrados) com ambos os clones, com diferentes condições de PCR e de produto de
amplificação, até que com uma temperatura de anelamento de apenas 40ºC conseguimos
uma amplificação fraca (Figura 24A). A banda referente ao candidato foi recortada,
purificada e ligada ao pGEM-T. A digestão com BamHI e EcoRI resultou na banda
apresentada na Figura 24B. Apesar de a digestão não ter sido muito evidente, foi
possível recortar a banda e purificá-la. O fragmento foi ligado no pSecTag2A e
transformado em DH5α. Um único clone positivo (MCAH05B08.1) foi selecionado por
screening e confirmado por seqüenciamento.

λHind 5
A

B λHind D

Figura 24: A) Amplificação bem sucedida do clone MCAH05B08 (Atg3). B) Digestão do clone
MCAH05B08.1 escolhido para representar o grupo Atg3. Nesta figura está representado
apenas o clone digerido (D). O fragmento proveniente da digestão (seta) foi recortado e
purificado.

72
4.2.2.4 Antígeno 4 (Atg4)
Este grupo, representado pelos clones MCAL07E03 e MCAL09G04, apresentou
um padrão de amplificação inespecífico, com tamanhos não esperados. Testamos os
primers individualmente e verificamos que o problema estava no primer reverse
Neuro4R encomendado, que veio com defeito, pois não era capaz de amplificar nenhum
produto, mesmo quando combinado com primers forward universais ligados ao vetor
(teste não apresentado).
Foi feito um novo desenho do primer Neuro4R. Com o novo primer, a
amplificação ocorreu sem problemas, como pode ser verificado na Figura 25A. A banda
amplificada do clone MCAL07E03 foi ligada ao pGEM-T e transformada em DH5α.
Foi escolhido o clone MCAL07E03.5 para dar continuidade às clonagens. O clone
MCAL07E03.5 foi digerido com as enzimas BamHI e EcoRI, como realizado nos
outros experimentos citados acima. A Figura 25B apresenta a digestão e o fragmento
proveniente dessa digestão.

λHind D
λHind 1 2

A B

Figura 25: A) PCRs dos clones MCAL07E03 (1) e MCAL09G04 (2), os dois clones
representantes do Atg4. Essa figura representa a amplificação bem sucedida com utilização do
novo primer Neuro4R. B) Digestão do clone MCAL07E03.5. Nesta figura está representado
apenas o clone digerido (D). O fragmento proveniente da digestão (seta) foi recortado e
purificado

O fragmento purificado foi ligado no vetor pSecTag2A e transformado em

bactérias DH5α. Após o screening por PCR, os clones foram confirmados por
seqüenciamento.

73
4.2.2.5 Antígeno 5 (Atg5)
No caso do Atg5, os clones que o representam são MCAL09A06 e
MCAL06A06. Os dois clones foram amplificados com os primers específicos (PLA1F e
PLA1R). Na Figura 26A estão representadas, em gel de agarose 1,5%, as duas
amplificações realizadas para esse grupo. A banda referente ao clone MCAL09A06 foi
recortada, purificada, ligada ao vetor pGEM-T, e este transformado em bactérias E. coli
DH5α. A presença de colônias positivas foi ratificada pelo screening por PCR. Para
cada colônia positiva foi atribuído um número. Dessa forma, o clone 9 apresentou
quatro novos subclones (MCAL09A06.1 MCAL09A06.2, MCAL09A06.3,
MCAL09A06.4). Foi escolhido o clone MCAL09A06.1 para ser inserido no segundo
vetor. A etapa seguinte foi a digestão com enzimas de restrição BamHI e EcoRI, a fim
de tornar as extremidades coesivas para encaixe no segundo vetor. A digestão está
representada na Figura 26B.

λHind 1 2
(pb)
A
λHind ND D
2027
B (pb)
2027

564

564
125

125

Figura 26: A) PCRs dos clones MCAL09A06 (1) e MCAL06A06 (2), os dois clones
representantes do Atg5. B) Digestão do clone MCAL09A06.1 escolhido para representar o
Atg5. Estão representados o clone não digerido (ND) e o clone digerido (D) com o fragmento
liberado (seta).

Por conseguinte, foi realizada a ligação com o vetor pSecTag2A e a

transformação em E. coli. O screening por PCR foi realizado para averiguar a presença
de colônias positivas com o fragmento. Para cada clone positivo foi atribuído um
terceiro número, como podemos observar na Figura 27. Os clones positivos foram

74
denominados MCAL09A06.1.1, MCAL09A06.1.2, MCAL09A06.1.3,
MCAL09A06.1.4 e confirmados por seqüenciamento.

λHind .1.1 .1.2 .1.3 .1.4

Figura 27: Screening por PCR (pSecTagA2 + fragmento/clone MCAL09A06.1). Nessa figura
estão presentes quatro clones do Atg5.

A fim de se aumentar consideravelmente a quantidade de DNA dos cinco

candidatos antigênicos, foram feitas maxipreps ou grandes preparações das amostras
dos candidatos obtidos após a clonagem. Esse procedimento é necessário, pois se sabe
que, no caso de vacinas de DNA, grandes quantidades de DNA são utilizadas para se
injetar em animais (camundongos), especialmente em injeções intramusculares.
Após a eluição em 300µL, foram feitas quantificações por meio do
espectrofotômetro e detecção da pureza (DO 260/280).

4.2.3 Transfecção preliminar de clones em células eucarióticas e Western-Blot

Realizamos transfecções de algumas construções com as células do tipo COS-

07, que são mais utilizadas para transfecções do tipo transiente. Essa etapa foi realizada
a fim de se verificar o funcionamento correto do sistema de expressão antes de dar
início às imunizações genéticas.
Primeiramente, testou-se o Atg1. Pelo resultado do Western Blot com o soro
antielapídico, não foi possível verificar bandas imunoreativas nas amostras de extrato
celular e de meio de cultura, indicando que não deveria haver proteína recombinante
sendo expressa/secretada (Figura 28). O controle positivo de veneno bruto de M.
corallinus apresentou marcação.
Foram realizados outros experimentos de transfecção em células eucariontes do
tipo COS-07 que não obtiveram resultados satisfatórios e, dessa forma, não estão
representadas neste trabalho.

75
 Ef Ec S3 S2 S1 Sc c+ LMW

Ef Ec S3 S2 S1 Sc c+ LMW

Figura 28: SDS-PAGE contendo amostras das três coletas de sobrenadante e do extrato de
células. Na primeira figura encontra-se a membrana de transferência, que mostra a proteína
total corada com Ponceau S. A segunda figura é o resultado do Western blot revelado com
antiveneno de Micrurus corallinus (anti-corallinus) extraído de cavalo. c+ - controle positivo (no
caso, veneno de Micrurus corallinus), Sc – Sobrenadante/ controle, S1 –
Sobrenadante/1ªcoleta, S2 – Sobrenadante/2ªcoleta, S3 – Sobrenadante/3ªcoleta, Ec – Extrato
de células/ controle, Ef – Extrato de células/final.

Porém, apesar de as transfecções realizadas em células COS-07 não terem

resultados satisfatórios, mais um experimento foi realizado com o sobrenadante e
extrato de células provenientes da transfecção dos antígenos Atg1 e Atg4. Como não
obtivemos resultados positivos com as transfecções, resolvemos mudar o anticorpo
primário utilizado para um anticorpo mais específico do que o anti-corallinus usado
anteriormente. A membrana foi revelada com anticorpo anti-cmyc. Neste caso, o
controle positivo é uma proteína HEK (80kDa) que contém o epítopo c-myc. O SDS-
PAGE foi realizado com as amostras de sobrenadante de cada um dos antígenos (Atg1 e
Atg4), coletadas 72 horas após a transfecção. Os extratos de células apresentados são os

76
extratos finais de cada uma das transfecções. Estes resultados estão apresentados abaixo
na Figura 29.

E4 E1 Ec C+ LMW S4 S1 Sc
E4 E1 Ec C+ LMW S4 S1 Sc

Figura 29: SDS-PAGE contendo amostras das três coletas de sobrenadante e do extrato de
células. Na primeira figura encontra-se a membrana de transferência, que mostra a proteína
total corada com Ponceau S. A segunda figura é o resultado do Western Blot revelado com
anti-cmyc, c+ – controle positivo (no caso, proteína HEK), Sc – Sobrenadante/ controle, S1 –
Sobrenadante/Atg1, S4 – Sobrenadante/Atg4, Ec – Extrato de células/ controle, E1 – Extrato de
células/final do Atg1, E4 – Extrato de células/final do Atg4, LMW – padrão de peso molecular.

Mesmo não evidente, pode se notar que o controle positivo acendeu e,

juntamente com ele, uma pequena mancha no extrato de células da transfecção do Atg1
pode ser percebida. Esse é o resultado obtido mais próximo do resultado esperado.
Outros tipos de células COS foram utilizadas para as transfecções, pois poderia
ser devido ao tipo celular a ausëncia de expressão em células eucariontes.
Também foi utilizado um controle positivo de GFP (Green Fluorescent Protein)
durante algumas transfecções, a fim de que pudéssemos controlar as condições de
expressão de forma igualitária para todas as células transfectadas. Quando ocorria a
expressão de GFP, as transfecções realizadas estariam sob as mesmas condições. Esse
controle foi bem sucedido em todos os experimentos realizados com ele, pela
observação da coloração esverdeada no microscópio eletrônico.
A partir dos resultados obtidos pode-se concluir que o experimento de avaliação
da expressão em cultura de células não foi bem sucedido. Foram realizadas muitas
tentativas de transfecções em células eucariontes, que apresentaram resultados
inconclusivos, principalmente pelos controles positivos de que dispúnhamos, que em
muitos casos não reagiram. O tipo de células COS utilizadas nas transfecções, assim
como o anticorpo primário utilizado, foi modificado a fim de se tentar abranger o maior
número de condições possíveis para um resultado mais satisfatório.

77
 Tendo em vista que os resultados não foram satisfatórios para assegurar a
expressão ou não dos candidatos antigênicos, decidimos investir diretamente na
imunização em camundongos, o nosso objetivo final.

4.2.4 Expressão e purificação das proteínas recombinantes

Embora a vacina de DNA fosse nosso objetivo, necessitávamos dos antígenos

para avaliar as imunizações. Tendo em vista que a melhor forma de analisar o resultado
da imunização seria o teste de ELISA com o coating feito a partir da proteína purificada
de cada candidato antigênico, optamos por expressar em E. coli e purificar essas
proteínas. Para isso, utilizamos clonagens já feitas anteriormente por pesquisadores que
trabalharam no nosso laboratório (PRIETO DA SILVA, 2001b e DE OLIVEIRA et al., 2003),
uma vez que três dos candidatos antigênicos escolhidos (Atg1, Atg2 e Atg5) já haviam
sido estudados anteriormente, porém, de acordo com a bioquímica tradicional de
clonagem, expressão e purificação das proteínas recombinantes.
Dessa forma, essas clonagens feitas no vetor pRSET foram recuperadas,
transformadas e seqüenciadas novamente. Os antígenos apresentavam denominações
diferentes: Atg1 = V8, Atg2 = V1 e Atg5 = V2. Com as seqüências analisadas,
iniciamos o processo de expressão, em bactéria E. coli DE3 star pLys. Esta bactéria
pareceu ser a melhor opção, já que é a mais utilizada para expressão de proteínas
tóxicas. Diferentemente de outras linhagens, esta não apresenta escape (expressão basal,
antes da indução com IPTG), pois possui o plasmídeo pLys, que confere resistência à
cloranfenicol e codifica a lisozima T7, que reduz a expressão basal da T7 RNA
polymerase e, portanto, só se observa a expressão da proteína após a indução com
IPTG. Com esta cepa é possível que a cultura cresça até uma densidade significativa
para expressão da proteína e, mesmo que as bactérias morram pela ação tóxica da
proteína, uma quantidade considerável de proteína pode ser obtida.

4.2.4.1 Candidato antigênico Atg1(Proteína V8)

Uma alíquota de cada uma das lavagens do corpúsculo foi coletada e a amostra
foi aplicada no gel.
A banda que representa o corpúsculo de inclusão é onde as proteínas estão
aglomeradas. Dessa forma, o corpúsculo de inclusão foi purificado. As lavagens e as
eluições (1M imidazol) estão representadas na Figura 30.

78
(kDa) LMW FT8M L60 L60 L60 L60 L60 E1 E3 E5 LMW E6 E7 E8 E9 E11 E13 E15 E17 E19

97,0
66,0
45,0

30,0

20,1

14,4

Figura 30: SDS-PAGE com amostras da expressão e purificação (corpúsculo de inclusão) da

proteína Atg1 referente ao candidato antigênico Atg1. FT8M – flow thru 8M uréia, L60 –
lavagens do corpúsculo com 60mM imidazol (5 alíquotas), E1-E25 – eluições com 1M imidazol.

Na análise do gel de SDS-PAGE é possível notar uma purificação bem sucedida

do corpúsculo, como pode ser observado da sexta eluição até a nona eluição.

4.2.4.2 Candidato antigênico Atg2 (proteína V1)

O corpúsculo de inclusão pôde ser observado na lavagem 8M uréia. Dessa
forma, foi feita a purificação do corpúsculo sob as mesmas condições realizadas para a
purificação da proteína Atg1. O resultado está apresentado abaixo (Figura 31).

(kDa) LMW L60 L60 L60 L60 L60 E1 E3 E5 E6 LMW E7 E8 E9 E10 E11 E13 E15 E17 E19

97,0
66,0
45,0
30,0

20,1

14,4

Figura 31: SDS-PAGE com amostras da expressão e purificação (corpúsculo de inclusão) da

proteína Atg2 referente ao candidato antigênico Atg2. L60 – lavagens do corpúsculo com 60mM
imidazol (5 alíquotas), E1-E25 – eluições com 1M imidazol.

Nota-se que a proteína começou a sair da coluna com mais intensidade a partir da sexta
eluição e continuou até aproximadamente a décima eluição.

4.2.4.3 Candidato antigênico Atg5 (Proteína V2)

Da mesma forma que a expressão e purificação das proteínas Atg1 e Atg2, a
purificação da proteína Atg5 também predominou no corpúsculo de inclusão, como já

79
 era esperado. O não-induzido e o induzido também não se apresentaram de forma
evidente, porém sabe-se que houve indução pela análise das lavagens.
Da mesma forma, a proteína Atg5 teve o corpúsculo de inclusão purificado,
como pode ser observado na Figura 32 seguinte.

(kDa) LMW FT8M L60 L60 L60 L60 L60 E1 E3 E5 LMW E6 E7 E8 E9 E11 E13 E15 E17 E19

97,0
66,0
45,0

30,0

20,1

14,4

Figura 32: SDS-PAGE com amostras da expressão e purificação (corpúsculo de inclusão) da

proteína Atg5 referente ao candidato antigênico Atg5. L60 – lavagens do corpúsculo com 60mM
imidazol (5 alíquotas), E1-E25 – eluições com 1M imidazol.

Nota-se pelas eluições com 1M imidazol, que a purificação foi bem sucedida e a
proteína passou a ser recuperada com mais intensidade a partir da quarta eluição (E4) e
com maior intensidade na quinta eluição (E5).
Como foi comprovado, a maior parte das proteínas estava contida no corpúsculo
de inclusão. Dessa forma, passamos a trabalhar apenas com as alíquotas da purificação
do corpúsculo.
A diálise é necessária para se retirar o imidazol presente nas amostras coletadas
durante a purificação, já que ele atrapalha o teste de ELISA. A uréia pode permanecer,
por ser responsável pela estruturação da proteína e não influenciar o teste. Sem uréia,
possivelmente a proteína precipitaria.
A diálise decorreu sem que a proteína precipitasse. A solução de 6M uréia foi
diluída com a troca de solução, sem que isso prejudicasse o andamento da diálise.
Para a diálise, foram escolhidas amostras com a proteína mais intensa e mais
evidente, a partir dos géis de SDS-PAGE mostrados anteriormente nas purificações do
corpúsculo de inclusão.
As alíquotas de cada proteína foram colocadas em um mesmo tubo. Cada tubo
foi dialisado individualmente, cada um em uma membrana de 3kDa, colocado dentro de
um béquer com 1L de solução 6M uréia e tampão NaCl-Tris pH 6,8.

80
 As três proteínas foram colocadas no mesmo gel para facilitar o processo. Foi
feita a curva de BSA e o resultado está apresentado na Figura 33 abaixo.

(kDa) LMW Atg2 Atg5 Atg1 6 5 4 3 2 1

97,0
66,0
45,0

30,0

20,1

14,4

Figura 33: SDS-PAGE com amostras das proteínas purificadas e dialisadas juntamente com a
curva de BSA. No gel, a curva de BSA tem início em 3µg – 0,5µg de BSA, de 0,5 em 0,5.

Os valores numéricos da quantificação foram obtidos baseados na curva de

BSA. Os valores numéricos para cada banda de proteína estão apresentados a seguir:

Atg1 – 3,37µg/10µL = 337ng/µL

Atg2 – 4,23µg/10µL = 423ng/µL
Atg5 – 5,04µg/10µL = 504ng/µL

4.2.5 A imunização genética (ou vacina de DNA) em camundongos

As imunizações genéticas requerem uma quantidade considerável de DNA

(candidato antigênico) para se injetar nos animais. Por essa razão, realizamos maxipreps
para cada um dos candidatos antigênicos a fim de aumentar sua quantidade de DNA.
Como há cinco animais em cada grupo, seriam necessários aproximadamente 1500µg
de DNA por grupo (100µg/animal por dose).
Os animais foram anestesiados intraperitonialmente. Para alguns animais foram
necessários mais do que 200µL de anestésico para o adormecimento total. Foi realizada
então a injeção intramuscular dos DNAs antigênicos. O soro foi coletado e mantido no
freezer a -20°C. A maior parte dos soros apresentou cor avermelhada forte, decorrente
da hemólise de algumas hemáceas, especialmente no soro pré-imune. Não foi possível
concluir a razão dessa hemólise.

81
4.2.6 Análise da resposta imune

Dois testes ELISA diferentes foram preparados. No primeiro, usamos as

proteínas recombinantes expressas e purificadas (Atg1, Atg2 e Atg5) a fim de preparar o
coating do ELISA. Os soros primários foram obtidos dos camundongos imunizados com
os respectivos DNAs (Atg1, Atg2 e Atg5).
O resultado está apresentado na Figura 34. Nela é possível notar o
reconhecimento da proteína recombinante do coating com o anticorpo presente no soro
dos camundongos. Títulos mais altos foram obtidos para Atg1 (1:5120) e Atg2
(1:10240). O terceiro candidato a antigênico testado (Atg5) não apresentou um alto
título de anticorpos (1:160).
Este resultado pôde ser confirmado por observação no Western Blot realizado
com as três proteínas recombinantes e os três soros obtidos das respectivas imunizações,
como mostram aas Figuras 35 e 36.

82
 Atg1

0.5

Absorbância 492nm
0.4

0.3 Soro Pré-imune

Soro Final
0.2

0.1
0

0
20

40

80

0
80

60

20
16

32

64

24
12

25

51
1|

1|

1|

10
1|

1|

1|
1|

1|

1|
1|
Diluições

Atg2

0.5
Absorbância 492nm

0.4

0.3 Soro Pré-imune

0.2 Soro Final

0.1
0
0
80

80

60

20
16

32

64

24
12

25

51
1|

10
1|

1|

1|

1|

1|

1|

1|

Diluições

Atg5

0.25
Absorbância 492nm

0.2
Soro Pré-imune
0.15 Soro Final
0.1
0.05
0
0

1| 0
1| 0
1| 0
1| 0
1| 20
20
40
80

0
16
32
64

8
6

24
1|
1|
1|

12
25
51
1|
1|

10

Diluições

Figura 34: Gráfico de ELISA com as diferentes diluições e a absorbância detectada. Cada
ponto no gráfico representa três titulações de uma mesma imunização (desvio padrão).

83
LMW Atg2 Atg5 Atg1 Mcor Mfro Bjar CTX

Figura 35: SDS-PAGE corado com Comassie Blue. Figura representa as três proteínas
recombinantes obtidas (Atg1, Atg2 e Atg5) e venenos de algumas serpentes (M. corallinus –
Mcor, M. frontalis – Mfro, B. jararaca – Bjar e Cardiotoxina – CTX).

LMW Atg2 Atg5 Atg1 Mcor Mfro Bjar CTX

LMW Atg2 Atg5 Atg1 Mcor Mfro Bjar CTX

Figura 36: Resultado da revelação

LMW Atg2 Atg5 Atg1 Mcor Mfro Bjar CTX
de Western Blot. Nota-se a detecção
das proteínas recombinantes quando
incubado com os soros provenientes
da imunização genética em
camundongos com os três
candidatos respectivamente: Atg1,
Atg2 e Atg5.

84
 Pela análise da figura, nota-se que houve reconhecimento de cada proteína
recombinante quando em contato com o soro produzido nas imunizações. Cada soro
reconheceu sua proteína específica, porém não houve reconhecimento dos venenos
representados na figura (M. corallinus, M. frontalis, B. jararaca e Cardiotoxina).
No segundo teste ELISA, o coating foi preparado com as proteínas
recombinantes Atg1 e Atg2, dessa vez contra os soros obtidos com a imunização em
camundongos com os Atg3 e Atg4. Portanto, esta é uma análise cruzada para se
descobrir se esses soros são semelhantes entre si ou se reagem com as proteínas
recombinantes purificadas (Atg1 ou Atg2). Lembrando ainda que não dispúnhamos das
formas recombinantes dos Atg3 e Atg4, produzidas em E. coli.
Neste teste foi possível perceber similaridade entre Atg2 e Atg3/4, mas não com
Atg1 (Figura 37). Este resultado mostrou que estas seqüências sintetizaram proteínas
similares; entretanto, Atg1 parece ter diferenças na estrutura ou na similaridade de
epítopos (proteínas diferentes).

85
 Atg3-protAtg1

0.14
Absorbância 492nm
0.12
0.1
0.08 Soro pré-imune
0.06 Soro final
0.04
0.02
0

0
0

1| 0

1| 0

1| 0
1| 20
0
80

24
16

32

64

6
4

12

25

51
1|

1|

10
1|

1|

1|

Diluições

Atg3-protAtg2

0.25
Absorbância 492nm

0.2
0.15 Soro pré-imune
0.1 Soro final

0.05
0
0
0
0

1| 0
1| 0
1| 0
1| 20
0
0
80

24
16
32
64

8
6

Figura 37: Gráficos de

2
4

12
25
51
1|
1|
1|

10
1|
1|
1|

Diluições ELISA para a análise cruzada

entre os soros contra Atg3 e
Atg4 com relação às
Atg4-protAtg1
proteínas recombinantes
0.08
Absorbância 492nm

0.07 purificadas Atg1 e Atg2.

0.06
0.05 Cada ponto no gráfico
0.04 Soro pré-imune
0.03 Soro Final representa três titulações de
0.02
0.01
uma mesma imunização
0 (desvio padrão).
1| 0
0

1| 0
1| 0
1| 60
1| 20
20
40
80

0
16
32
64

24
1|
1|
1|

12
25
51
1|

1|

10

Diluições

Atg4-protAtg2

0.18
Absorbância 492nm

0.16
0.14
0.12
0.1 Soro pré-imune
0.08 Soro Final
0.06
0.04
0.02
0
0
0
0

1| 0
1| 0
1| 0
1| 20
0
0
80

24
16
32
64

8
6
2
4

12
25
51
1|
1|
1|

10
1|
1|
1|

Diluições

86
4.2.7 Imunização tripla com três candidatos antigênicos

A fim de testar a eficácia dos três candidatos antigênicos mais significativos

contidos no veneno, inclusive em predominância, resolvemos imunizar camundongos
com os três candidatos simultaneamente.
Pela análise dos gráficos de ELISA, é possível verificar o que aconteceu quando
reagimos os três candidatos purificados (Atg1, Atg2 e Atg5) e o veneno puro de M.
corallinus com o soro proveniente da imunização simultânea com DNA de três
candidatos antigênicos (Figura 38).
Foi possível verificar um melhor reconhecimento pelo soro da imunização tripla
para a proteína recombinante Atg2 purificada (1:5120), sendo que para as outras
proteínas e o veneno puro os títulos obtidos foram mais baixos: Atg1 (1:320), Atg5
(1:120) e veneno puro de M. corallinus (1:120). A análise por Western Blot também foi
realizada, porém não foram observadas bandas imunoreativas. Isso decorre,
provavelmente, da maior sensibilidade do teste de ELISA em detectar anticorpos
presentes do que o Western Blot, paralelamente aos baixos títulos apresentados para
cada uma das proteínas e para o veneno puro.

87
 Atg1 - IMZ

0.16

0.14

0.12
Absorbância 492nm

0.1 S1
S2
0.08
S3
0.06 S4
0.04

0.02

0
20

40

80

80

60

20
16

32

64

24
12

25

51
1|

1|

1|

10
1|

1|

1|

1|

1|

1|

1|
diluições

Atg2 - IMZ

0.45
0.4
0.35
Absorbância 492 nm

0.3
S1
0.25 S2
0.2 S3

0.15 S4

0.1
0.05

0
0
20

40

80

80

60

20
16

32

64

24
12

25

51
1|

1|

1|

10
1|

1|

1|

1|

1|

1|

1|

Diluições

Atg5 - IMZ

0.12

0.1
Absorbância 492 nm

0.08
S1
S2
0.06
S3

0.04 S4

0.02

0
0
20

40

80

80

60

20
16

32

64

24
12

25

51
1|

1|

1|

10
1|

1|

1|

1|

1|

1|

1|

Diluições

Veneno corallinus - IMZ

Figura 38: Gráficos de ELISA
0.25
proveniente do resultado de
0.2
imunização com três candidatos
Absorbância 492 nm

S1
0.15
S2 antigênicos (Atg1, Atg2 e Atg5).
S3
0.1
S4 Os gráficos mostram a reação
0.05 entre os coatings (V1, V8 e V2)
0 com o soro proveniente da
0
20

40

80

80

60

20
16

32

64

24

imunização com os três

12

25

51
1|

1|

1|

10
1|

1|

1|

1|

1|

1|

1|

Diluições
candidatos.

88
 Portanto, nossos resultados indicam que a imunização com DNA, via de regra, é
capaz de gerar resposta imune contra as proteínas recombinantes. Entretanto, o veneno
não foi reconhecido por estes soros. Isso indica que, possivelmente, haja algum
problema na configuração estrutural das proteínas geradas nos camundongos como
resultado da transfecção dos cDNAs. Talvez o dobramento incorreto leve à produção de
anticorpos contra determinantes lineares, não capazes de reconhecer as proteínas
nativas. Talvez os esquema de clonagem no vetor pSecTag2A, com vários “tags” para
controle de expressão/purificação, tenha prejudicado o dobramento. Assim, novas
construções e/ou diferentes vetores de expressão podem ajudar a melhorar a expressão
desses antígenos. Diversos protocolos de imunização podem gerar resultados
completamente distintos. Na injeção intramuscular, usada aqui, o DNA costuma ser
injetado nos músculos tibial anterior ou quadríceps de camundongos. Normalmente,
para este protocolo induz-se uma lesão no músculo com uma cardiotoxina antes da
injeção do DNA para estimular o processo de reparo muscular (OLIVEIRA et al., 1999 e
LAI & BENNETT, 1998). Porém a CTX é um componente de venenos elapídicos (Naja
sp.), justamente uma proteína da família das 3FTx e poderia assim induzir resposta
imune correlata à do veneno. Outra forma usada em alguns casos é a injeção por meio
de lipossomos que permitam que a dose tenha um efeito mais prolongado, uma vez que
a liberação do DNA é paulatina. Um protocolo teoricamente mais promissor é o de
biobalística. Nesse procedimento, cerca de 50µg de DNA são adsorvidos a microesferas
de ouro (0,2 a 4mm de diâmetro) e injetados em alta velocidade (1.500km.h-1) na derme
dos animais. O DNA é dissociado das micropartículas pela ação do líquido celular,
ocorrendo ou não a integração do gene exógeno no genoma do organismo (OLIVEIRA et
al., 1999). Esse procedimento já demonstrou em vários casos ser mais eficiente para
indução de resposta imune do tipo Th2 (IL-4, IL-5, IL-10), ou seja, aquela que é mais
indutora de anticorpos, o que é particularmente interessante para a geração de um soro
hiperimune. O fator limitante desse procedimento é a disponibilidade do equipamento
de disparo das biopartículas, tal como o Helius GeneGun (Bio-Rad) ou similar. Este tipo
de protocolo é o que foi o utilizado por WAGSTAFF & HARRISON, 2006, para a geração
de um anti-soro contra toxinas do viperídeo E. oceollatus. Esses mesmos autores
utilizaram o vetor pSecTagB por diferentes vias de imunização com antígenos de um
nematóide, apresentando títulos muito maiores quando injetado por biobalística (Gene
Gun) (HARRISON & BIANCO, 2000).

89
 Outra questão importante a ser testada, é a contribuição de adjuvantes vacinais.
Este campo é amplo e são utilizadas desde construções com plasmídeos codificando
citocinas que aumentem a secreção de anticorpos, como o fator GM-CSF (granulocyte-
macrophage colony-stimulating factor), até adjuvantes mais comuns, como sais de
alumínio, fosfato, monofosforil lipídio A, ou complexos com lipídios catiônicos
(ULMER et al., 1999 e FISCHER et al., 2003). Até mesmo o próprio DNA excedente
usado na imunização tem caráter adjuvante, pois o padrão de metilação do DNA
bacteriano é diferente do de mamífero, o que ativa o sistema imune inato (KLINMAN et
al., 1997 e LIU et al., 2003).
Anos de estudo sobre vacinas de DNA mostraram que, diferentemente das
vacinas inativadas ou de subunidade, as vacinas gênicas resultam em uma apresentação
antigênica via moléculas de MHC de classe I e classe II, o que mimetiza o processo
resultante de infecção natural ao ativar linfócitos T CD4+, CD8+ e a produção de
anticorpos. Os diferentes tipos de resposta imune induzida pela administração de DNA
justificam claramente sua aplicação nos campos das doenças infecciosas. (OLIVEIRA et
al., 1999). A questão é saber derivar essa resposta para o objetivo de gerar soros hiper-
imunes e não apenas proteção. Algumas poucas tentativas de realizar esse objetivo são
encontradas. Além daqueles trabalhos referentes à imunização com DNA de toxinas de
serpentes, citados anteriormente, alguns outros esforços buscaram gerar hipersoros
contra doenças bacterianas ou virais. FISCHER et al., 2003, por exemplo, usando uma
composição lipídica catiônica junco com DNA, geraram títulos razoáveis de anticorpos
contra o vírus da raiva em cavalos. Já HERRMANN et al., 2006, foram capazes de
produzir em coelhos um antisoro contra o antrax capaz de neutralizar os efeitos
deletérios da toxina de Bacillus anthracis.
Dessa forma, citando HARRISON & BIANCO (2000), a aplicação das metodologias
baseadas em DNA para o desenvolvimento de antivenenos terapêuticos representa a
maior mudança conceitual na produção de antivenenos em um século e tem o potencial
de promover uma terapia imunológica específica com melhor custo-benefício e menor
periculosidade do que as atualmente usadas.
De qualquer forma, este nosso resultado, mesmo que ainda longe de uma
aplicação terapêutica, são os primeiros passos para a utilização da imunização genética
para fins de produção do soro anti-coralinus, o que nos encoraja a dar prosseguimento à
pesquisa.

90
5. CONCLUSÃO

1. O transcriptoma de Micrurus corallinus originou 1.438 ESTs que foram

agrupadas em 611 clusters.
2. As proteínas com funções tóxicas representam 46% da expressão gênica das
glândulas de veneno, sendo encontrados dez tipos de toxinas.
3. Proteínas de três dígitos (3FTx) e fosfolipases do tipo A2 (PLA2) são os cDNAs
de toxinas mais representativos das glândulas de veneno.
4. As toxinas de três dígitos são extremamente diversificadas com varias isoformas
de cDNAs de cada subtipo, prevalecendo as α-neurotoxinas.
5. Algumas destas toxinas foram descritas pela primeira vez na Família Elapidae e
outras foram descritas pela primeira vez no gênero Micrurus.
6. O grupo mais representativo de não toxinas são as proteínas com função celular
relacionadas à transcrição e à tradução protéica.
7. A partir da análise do transcriptoma da glândula de veneno de Micrurus
corallinus, cinco candidatos foram selecionados para uma imunização por DNA
em camundongos
8. A análise da resposta imunológica indicou que a injeção com DNA dos
candidatos antigênicos gerou anticorpos, pois houve o reconhecimento da
proteína recombinante purificada pelo soro proveniente dos animais imunizados.

91
6. RESUMO

A partir de uma biblioteca de cDNA de glândulas de veneno de Micrurus

corallinus (cobra-coral), uma serpente da Família Elapidae bastante representada no
Brasil e muito comum em áreas florestais tropicais, foram gerados 1.438 Expressed
Sequences Tags (ESTs), agrupados em 611 clusters. O banco representa os genes mais
expressos na glândula de veneno de M. corallinus. Os transcritos relacionados às
toxinas apresentaram ao redor de 46% de representação nesse banco de seqüências. A
composição geral das toxinas inclui: toxinas de três dígitos (3FTx) (24%), fosfolipases
A2 (PLA2) (16%), lectinas do tipo C (5%), entre outros. O banco permitiu não somente
a identificação de possíveis toxinas, mas também de transcritos celulares, sendo a
maioria envolvida nas funções fisiológicas de células da glândula de veneno. A maior
parte dessas moléculas apresenta um envolvimento na expressão gênica e protéica, o
que reflete uma alta especialização do tecido para a síntese de toxinas. A análise do
transcriptoma de glândulas de veneno de M. corallinus possibilitou a identificação de
alguns candidatos antigênicos para um anti-soro antielapídico alternativo. Cinco
candidatos antigênicos foram selecionados por meio da análise do transcriptoma obtido:
Atg1 (Grupo das neurotoxinas homolog 8), Atg2 (Grupo das neurotoxinas homolog
7/3/1), Atg3 (Outras neurotoxinas 1), Atg4 (Outras neurotoxinas 2) e Atg5 (fosfolipase
do tipo A2). Avaliamos a viabilidade de imunização com o DNA desses candidatos.
Para isso, os cinco grupos de antígenos foram clonados, primeiramente em pGEM-T e,
posteriormente, em pSecTag2A, que é um vetor de expressão em células de mamíferos.
As clonagens foram inicialmente testadas em células do tipo COS (transfecção
transiente), entretanto não ficou clara a capacidade dessas células em expressar os
antígenos. Para a análise da resposta imunológica da vacina de DNA, proteínas
recombinantes produzidas em E. coli foram utilizadas para o coating de ELISA para
detectar anticorpos presentes no soro primário proveniente da imunização com DNA.
Os resultados mostraram que o soro dos animais imunizados foi capaz de reconhecer os
antígenos recombinantes. Isso indica que a imunização por DNA em camundongos
poderia ser uma boa alternativa em relação à imunização do veneno puro de serpente,
que é custosa e muito depende da disponibilidade do veneno. Apesar da necessidade de
testes complementares, esse é um resultado promissor, já que a produção de anticorpos
pode ser alcançada por via de imunização intramuscular, mais prática para objetivos de
produção.

92
7. ABSTRACT

Micrurus corallinus (coral snake) is a tropical forest snake belonging to the

Elapidae Family, and is very common in Brazil. From the cDNA library of its venom
glands, 1.438 Expressed Sequences Tags (ESTs) were generated and grouped into 611
clusters. This database contains the most expressed genes in the M. corallinus venom
glands. The transcripts related to toxins represent approximately 46% of the total genes
in this database. The toxin compound consists of: three finger toxins (24%),
phospholipases A2 (PLA2s) (16%), type-C lectins (5%), among others. This database
allowed not only the identification of possible toxins, but also the identification of
cellular transcripts, most of which seems to be involved in physiological functions of
venom gland cells. The majority of these molecules are involved in gene and protein
expression, revealing the high level of specialization of the tissue for toxin synthesis.
The analysis of the M. corallinus venom gland transcriptome allowed the identification
of some antigenic candidates for an alternative antielapidic antiserum. Five antigenic
candidates were selected after analysing the transcriptome: Atg1 (Homolog group 8),
Atg2 (Homolog group 7/3/1), Atg3 (Other neurotoxins 1), Atg5 (A2-type
phospholipase). These five antigenic groups were used for DNA immunization. Then
they were first cloned in pGEM-T and, after, in pSecTag2A, which is an expression
vector in mammal cells. The cloning was tested in COS-type cells (transient
transfection), without signs of expression. To analyze the immunological response,
recombinant proteins were produced in E. coli and used for ELISA coating to react with
the primary serum deriving from the DNA immunization. The results showed that the
serum from the immunized animals was able to recognize the recombinant antigens,
indicating that the DNA immunization in mice could be a feasible alternative regarding
the traditional immunization with crude snake venom, which is costly and heavily
dependent on the availability of the venom. Regardless the need for additional tests, this
is a promising result, because the antibody production can be achieved by intramuscular
immunization, a more effective method when aiming for downstream production.

93
8. APÊNDICES

8.1 ABREVIATURAS

3FTx - Proteínas com estrutura em três dígitos

ACh - Acetilcolina
ANP - Peptídeo Natriurético Atrial
Atg1 - Antígeno 1 – Neurotoxina homolog 8
Atg2 - Antígeno 2 – Neurotoxina homolog 7/3/1
Atg3 - Antígeno 3 – Outras neurotoxinas 1
Atg4 - Antígeno 4 – Outras neurotoxinas 2
Atg5 - Antígeno 5 – PLA2
BNP - Peptídeo Natriurético Cerebral
BPP - Peptídeo Potenciador de Bradicinina
BSA - Albumina Sérica Bovina
CMV - Citomegalovírus (Promotor de vetor de expressão de células eucariontes)
CNCZAP - Coordenação Nacional de Controle de Zoonoses e Animais Peçonhentos
CNP - Peptídeo natriurético tipo C
CTX - Cardiotoxinas
DEMEN - Meio Dulbecco High Glucose
DNP - Peptídeo Natriurético da serpente do gênero Dendroaspis
DO - Densidade Óptica
ELISA - Enzyme-linked Immunosorbent Assay
EST - Expressed Sequence Tag (Etiquetas de Sequências Expressas)
ExoI - Exonuclease I
GFP - Green Fluorescent Protein
GPI - Glicofosfatidilinositol
IM - intramuscular
IPTG - indução da expressão do promotor lac e seus derivados – isopropil β-
thiogalactoside
LMW - padrão de peso molecular (Low Molecular Weight)
nAChR - receptor nicotínico de acetilcolina
NGF- Nerve Growth Factor (neurotrofinas)

94
nxh1 - neurotoxina homolog 1
nxh3 - neurotoxina homolog 3
nxh7 - neurotoxina homolog 7
nxh8 - neurotoxina homolog 8
OPD - o-dihidrocloreto de fenilenodiamina
ORF - Open Reading Frame
PBS - Phosphate Buffered Saline
PBS-T - Phosphate Buffered Saline + Tween
PCR - Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase)
pI - Ponto Isoelétrico
PLA2 - Fosfolipase do tipo A2
SAP - Shrimp Alcaline Phosphatase
SDS-PAGE - eletroforese em gel de poliacrilamida + sulfato dodecil de sódio
SV40 - Promotor de vetor de expressão de células eucariontes
SVMP - Metaloproteinase de veneno de serpentes
WAP - Whey Acidic Proteins

95
8.2 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: A) Quatro principais tipos de dentições encontradas entre as Famílias de Serpentes

Atractaspididae, Viperidae, Colubridae e Elapidae. B) Ausência da fosseta loreal nos elapídeos
e comparação com os viperídeos................................................................................................13
Figura 2: Três gêneros principais encontrados entre as cobras-corais: Micrurus, Leptomicrurus
e Micruroides...............................................................................................................................14
Figura 3: Filogenia de cobras-corais de Roze (1987). S.A. = América do Sul...........................15
Figura 4: Esquema da estratégia utilizada para clonagem dos candidatos...............................35
Figura 5: Esquema do desenho de primers específicos para clonagem dos candidatos
antigênicos..................................................................................................................................35
Figura 6: Mapa do vetor pSecTag2A utilizado na clonagem final realizada com os candidatos
antigênicos..................................................................................................................................37
Figura 7: Esquema das dosagens aplicadas nos camundongos durante processo de
imunização com os candidatos antigênicos selecionados..........................................................39
Figura 8: Representação gráfica da proporção dos tipos de toxinas encontradas em glândulas
de veneno de Micrurus corallinus)...............................................................................................48
Figura 9: Representação gráfica da proporção dos tipos de proteínas celulares encontradas
em glândulas de veneno de Micrurus corallinus.........................................................................49
o
Figura 10: Proteínas de três dígitos encontradas na glândula de veneno de M. corallinus (n de
o
clones/grupo – gráfico maior e n de clones/cluster – gráfico menor).........................................52
Figura 11: Alinhamento dos clusters de fosfolipase do tipo A2 obtidos por análise do
transcriptoma da glândula de veneno de M. corallinus...............................................................54
Figura 12: A) Alinhamento das lectinas do tipo C e seus homólogos estruturais juntamente com
as lectinas fisiológicas animais. B) Análise filogenética Baesiana dessas lectinas tipo
C.............................................................................................................................................57/58
Figura 13: Alinhamento entre as seqüências de peptídeo natriurético encontrado em análise do
banco de dados...........................................................................................................................60
Figura 14: Dois clones encontrados no banco de dados de M. corallinus representando duas
regiões fracamente contíguas da L-aminoácido oxidase............................................................61
Figura 15: Alinhamento dos clusters que representam o grupo homolog 8 (nxh8)....................67
Figura 16: Alinhamento dos clusters que representam o grupo nos quais incluem nxh1, nxh3 e
nxh7.............................................................................................................................................67
Figura 17: Alinhamentos dos clusters representantes do grupo “outras neurotoxinas”.............68
Figura 18: Alinhamento dos principais candidatos de proteínas de três dígitos escolhidos a
partir do transcriptoma de M. corallinus......................................................................................68
Figura 19: Candidato selecionado para representar as fosfolipases do tipo A2 – PLA2
(BINS0036C – 196 clones)..........................................................................................................69

96
Figura 20: A) PCRs dos clones MCAL01H08 e MCAL09C06, os dois clones representantes do
grupo Atg1. B) Digestão do clone MCAL01H08.5 escolhido para representar o Atg1................70
Figura 21: Screening por PCR (pSecTagA2 + fragmento/clone 1.5).........................................71
Figura 22: A) PCRs dos clones MCAL07D03 (1) e MCAL07H04, (2) os dois clones
representantes do Atg2. B) Digestão do clone MCAL07D03.2 escolhido para representar o
Atg2.............................................................................................................................................71
Figura 23: Screening por PCR (pSecTagA2 + fragmento/clone MCAL07D03.2)......................72
Figura 24: A) Amplificação bem sucedida do clone MCAH05B08 (Atg3). B) Digestão do clone
MCAH05B08.1 escolhido para representar o grupo Atg3...........................................................72
Figura 25: A) PCRs dos clones MCAL07E03 (1) e MCAL09G04 (2), os dois clones
representantes do Atg4. B) Digestão do clone MCAL07E03.5...................................................73
Figura 26: A) PCRs dos clones MCAL09A06 (1) e MCAL06A06 (2), os dois clones
representantes do Atg5. B) Digestão do clone MCAL09A06.1 escolhido para representar o
Atg5.............................................................................................................................................74
Figura 27: Screening por PCR (pSecTagA2 + fragmento/clone MCAL09A06.1).......................75
Figura 28: SDS-PAGE contendo amostras de sobrenadante e do extrato de células...............76
Figura 29: SDS-PAGE contendo amostras de sobrenadante e do extrato de células...............77
Figura 30: SDS-PAGE com amostras da expressão e purificação (corpúsculo de inclusão) da
proteína Atg1 referente ao candidato antigênico Atg1................................................................79
Figura 31: SDS-PAGE com amostras da expressão e purificação (corpúsculo de inclusão) da
proteína Atg2 referente ao candidato antigênico Atg2................................................................79
Figura 32: SDS-PAGE com amostras da expressão e purificação (corpúsculo de inclusão) da
proteína Atg5 referente ao candidato antigênico Atg5................................................................80
Figura 33: SDS-PAGE com amostras das proteínas purificadas e dialisadas juntamente com a
curva de BSA...............................................................................................................................81
Figura 34: Gráfico de ELISA com os diferentes títulos e a absorbância detectada...................83
Figura 35: Figura representa as três proteínas recombinantes obtidas (Atg1, Atg2 e Atg5) e
venenos de algumas serpentes...................................................................................................84
Figura 36: Resultado da revelação de Western Blot..................................................................84
Figura 37: Gráficos de ELISA para a análise cruzada entre Atg3 e Atg4 com relação às
proteínas recombinantes purificadas Atg1 e Atg2.......................................................................86
Figura 38: Gráficos de ELISA proveniente do resultado de imunização com três candidatos
antigênicos (Atg1, Atg2 e Atg5)...................................................................................................88

97
8.3 ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1: Coeficientes de incidência anual (por 100 mil habitantes) dos acidentes ofídicos por
região fisiográfica. Brasil, 1990 a 1993.......................................................................................21
Tabela 2: Diagnóstico dos acidentes ofídicos segundo gênero no Brasil..................................22
Tabela 3: Comparação entre o número de acidentes elapídicos e o número de acidentes
ofídicos ocorridos entre 2001 e 2005..........................................................................................22
Tabela 4: Quadro geral da situação dos animais entregues ao Instituto Butantan para cada
gênero de serpentes, a quantidade de veneno e a longevidade em cativeiro)...........................25
Tabela 5: Apresentação dos diferentes candidatos, clusters, clones e tamanhos (pb)
respectivos..................................................................................................................................34
Tabela 6: As proteínas Atg1, Atg2 e Atg5 com seus respectivos pontos isoelétricos (pI) e o
nome da proteína de acordo com a similaridade com o banco de dados...................................40
Tabela 7: Três valores diferentes de identidade testados como parâmetro de estringência no
CAP3 e os resultados obtidos.....................................................................................................46
Tabela 8: Representação dos clusters obtidos a partir das ESTs da glândula de veneno de M.
corallinus.....................................................................................................................................47
Tabela 9: Representação dos tipos de toxinas encontradas na glândula de veneno de Micrurus
corallinus, com o respectivo número de clusters e clones..........................................................50

98
 9. BIBLIOGRAFIA

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109
10. BIOGRAFIA

LUCIANA IWANAGA LEÃO

Formação Acadêmica

- Bacharel em Ciências Biológicas pela Universidade de São Paulo (2001-2005)

- Licenciatura pela Faculdade de Educação da Universidade de São Paulo (2004-2006)
- Pós-graduação pelo Departamento de Genética e Biologia Evolutiva da Universidade de São
Paulo (2006-2008)

Atuação Profissional

2008
Professora de ensino fundamental I e II, ensino médio e curso pré-vestibular no EMAE do
GRAACC (Grupo de Apoio ao Adolescente e Criança com Câncer)

2006-2008
Mestrado no Centro de Biotecnologia do Instituto Butantan – Geração de um banco
transcriptômico de glândulas de veneno de Micrurus corallinus e identificação de candidatos
antigênicos para um anti-soro antielapídico.

2003-2005
Iniciação Científica no Centro de Biotecnologia do Instituto Butantan – Geração e análise de
um banco representativo de cDNAs de Bothrops insularis.

2001-2003
Iniciação Científica no Departamento de Bioquímica e Fisiologia Animal da UNIFESP –
Estudo sobre a ação de enzimas hepáticas em fígado perfundido de rato.

Trabalhos apresentados em Congressos

LEÃO LI, Ho PL, Junqueira de Azevedo ILM. Identification of putative antigenic candidates to
an antielapidic serum based on the analysis of Micrurus corallinus transcriptome. 2008.
33rd FEBS Congress & 11th IUBMB Conference. Atenas, Grécia.
LEÃO LI, Ho PL, Junqueira de Azevedo ILM. Identification of putative antigenic candidates to
an antielapidic serum based on the analysis of Micrurus corallinus transcriptome. 2008.
XXXVII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular
(SBBq) e XI Reunião da Panamerican Association for Biochemistry and Molecular
Biology (PABMB). Águas de Lindóia, São Paulo.

110
LEÃO LI, Ho PL, Junqueira de Azevedo ILM. The analysis of Micrurus corallinus (coral-
snake) transcriptome. 2007. XXXVI Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Bioquímica e Biologia Molecular - Sbbq e 10th International Union of Biochemistry and
Molecular Biology Conference (IUBMB). Salvador, Bahia.
Ramos-Guimarães, P ; Oliveira-Carvalho, A.L ; Correa-Neto, C ; Aguiar, A. S. ; Melgarejo,
A.R. ; LEÃO, L. I.; Junqueira-de-Azevedo, I. L. M.; Ho, PL ; Soares, MR ; Zingali, R.B.
Predictive proteome of Micrurus frontalis versus Micrurus corallinus venom. 2007. 9th
IST Pan-American Section Meeting, Mexico.
LEÃO LI, Ho PL, Junqueira de Azevedo ILM. Identification of putative antigenic candidates to
an antielapidic serum based on the analysis of Micrurus corallinus transcriptome. 2006.
VIII Reunião Anual Do Instituto Butantan. São Paulo.
LEÃO LI, Ho PL, Junqueira de Azevedo ILM. Identification of putative antigenic candidates to
an antielapidic serum based on the analysis of Micrurus corallinus transcriptome. 2006.
IX Congresso Brasileiro de Toxinologia - SBTx. Fortaleza, Ceará.
LEÃO LI, Ho PL, Junqueira de Azevedo ILM. A full-length set of ORFs from Bothrops
insularis transcriptome and a comparative view of Viperidae envenoming through major
toxin profile. 2005. XXXIV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e
Biologia Molecular – SBBq. Águas de Lindóia, São Paulo.
LEÃO LI, Ho PL, Junqueira de Azevedo ILM. The generation and analysis of a cDNA database
of Bothrops insularis venom glands, focusing on identification of new toxins and the
characterization of the full-lenght sequences of some transcripts. 2005. VII Reunião
Anual Científica do Instituto Butantan. São Paulo.
LEÃO LI, Junqueira de Azevedo ILM, Nishiyama MYJr, Ho PL. The generation and analysis
of a cDNA database of Bothrops insularis venom glands, focusing on identification of new
toxins and the characterization of the full-lenght sequences of some transcripts. 2004. VI
Reunião Científica Anual do Instituto Butantan. São Paulo.
LEÃO LI, Ho PL, Junqueira de Azevedo ILM. The Bothrops insularis Transcriptome Project:
The Generation And Analysis Of An Updated Expressed Sequence Tags (ESTs) Database.
2004. VIII Congresso da Sociedade Brasileira de Toxinologia.VIII Congresso da
Sociedade Brasileira de Toxinologia. Angra dos Reis, Rio de Janeiro.
LEÃO LI, Borges DR. Influência da Idade na Resposta à Agressão Hepática por Diferentes
Agentes. 2003. PIBIC. São Paulo.

Artigos aceitos para publicação

Batista IFC, Chudzinski-Tavassi AM,Faria F, Simons SM, Labruna MB, Barros-Batestti DM;
LEÃO LI, Ho PL, Junqueira de Azevedo ILM. Expressed Sequence Tags (ESTs) from
the salivary glands of the tick Amblyomma cajennense (Acari: Ixodidae). Toxicon.
2007.

111
Outras atividades

Análise das metaloproteases de Bothrops insularis

No projeto de inciação científica, o banco transcriptômico de B. insularis foi ampliado para 2
mil ESTs. Durante o período das pesquisas com M. corallinus, foi realizado o seqüenciamento
completo de metaloproteases e serinoproteases presentes na glândula de veneno de B. insularis,
que correspondia à continuidade do projeto desenvolvido durante a Iniciação Científica (IC
04/10803-4).

Transcriptoma de Amblyomma cajennense

Participação nas etapas técnicas desse projeto, com a geração de 1800 ESTs. Participação
também na anotação e análise do banco de transcriptoma do carrapato Amblyomma cajennense,
projeto em colaboração com o Dr. Paulo Lee Ho (Centro de Biotecnologia) e a Dra. Isabel F.
Batista (Laboratório de Bioquímica). Já havia participado. As seqüências foram depositadas no
dbEST do GenBank.

Projeto Butantan na Amazônia

Participação, no mês de setembro de 2006, do workshop e palestras nas Faculdades Integradas
do Tapajós (FIT), dedicados aos alunos, professores e profissionais da região a fim de iniciar
um primeiro contato do Instituto Butantan com a população local de Santarém. O projeto tem o
intuito de formar mestres e doutores na região de Santarém, criando um programa de pós-
graduação orientado pelo Instituto, que ocorrerá em parceria com as faculdades locais. As
pesquisas serão realizadas na Base Avançada que será construída pelo Instituto Butantan na
cidade de Belterra.
Participação como monitora, por indicação do Dr. Giuseppe Puorto (diretor do Museu do
Instituto Butantan), dos cursos oferecidos às populações ribeirinhas do Rio Tapajós e Rio
Amazonas, assim como às populações locais de Belterra e Alter do Chão.

Proteômica das glândulas de veneno de Bothrops insularis

Colaboração com dados sobre o transcriptoma de glândulas de veneno de B. insularis para
pesquisa proteômica do Dr. Richard Hemmi Valente e Dr. Gilberto Domont, do Rio de Janeiro
(FIOCRUZ). Um artigo científico unindo os dados transcriptômicos e proteômicos está sendo
submetido à publicação no presente momento.

112
Tabela 8: Tabela de anotação - representa todo o perfil transcriptômico de clusters obtidos a partir da geração de ESTs de glândulas de veneno de Micrurus corallinus .

N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0001C 551 6 FF TB natriuretic peptide X >gb|AAC60341.1| 99 4.00E-73 138/139

MCOR0002C 573 2 P UF similar to Hypothetical protein CGI-99 X >ref|XP_217550.2| 81 2.00E-80 146/179
MCOR0003C 868 3 FP CM Eno3-prov protein X >gb|AAH45082.1| 92 E-141 251/271
MCOR0004C 435 35 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 100 4.00E-41 78/78
MCOR0005C 541 2 FP OF II-FBPL precursor X >gb|ABB30003.1| 39 2.00E-22 58/148
MCOR0006C 870 5 P CT 60S acidic ribosomal protein P0 (L10E) X sp|P47826|RLA0_CHICK 94 E-131 240/254
MCOR0007C 1028 21 FF CM (GAPDH) homologue X dbj|BAD74117.1| 91 E-171 294/322
MCOR0008C 876 5 FP CE alpha skeletal actin precursor X ref|NP_776650.1| 100 E-157 275/275
MCOR0009C 952 4 P MT Dinodon mitochondrion, complete genome >ref|NC_001945.1| 88 8.00E-81 256/290
MCOR0010C 524 2 NH no hit
MCOR0011C 671 26 FP CT similar to 60S acidic ribosomal protein P0 X ref|XP_850994.1| 99 E-108 199/201
MCOR0012C 682 2 FP CT Elongation factor 1-gamma (EF-1-gamma) X sp|Q68FR6|EF1G_RAT 84 E-110 190/225
MCOR0013C 602 6 FP CT 40S ribosomal protein S5 X >gb|AAP20199.1| 97 1.00E-94 171/176
MCOR0014C 827 5 FF MT Dinodon mitochondrion, complete genome X sp|O79551|ATP6_DINSE 69 1.00E-83 158/226
MCOR0015C 689 3 P UF 55 kDa erythrocyte membrane protein X dbj|BAD97116.1| 77 4.00E-52 98/127
MCOR0016C 522 2 NH no hit
MCOR0017C 858 6 FP CM ornithine decarboxylase antizyme - human X gb|AAA82155.1| 70 5.00E-64 125/177
MCOR0018C 790 2 P CR Alpi-prov protein X >gb|AAH89726.1| 55 5.00E-15 44/80
MCOR0019C 474 5 FP TB natriuretic peptide X >gb|AAC60341.1| 89 1.00E-21 53/59
MCOR0020C 549 2 FF OF Hemoglobin alpha-A subunit X sp|P0C0U6|HBA_DRYCE 88 6.00E-64 121/137
MCOR0021C 564 7 FP CT Similar to ribosomal protein S3 X >gb|AAH41299.1| 99 2.00E-96 182/183
MCOR0022C 441 2 FP CE similar to Troponin C X dbj|BAD14398.1| 92 2.00E-68 130/140
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0023C 485 2 P CD ubiquitin C X >gb|ABC94632.1| 72 2.00E-46 108/149

MCOR0024C 535 3 FF TL C-type lectin-like protein 2 X gb|AAK43585.1| 40 2.00E-27 64/158
MCOR0025C 477 2 FP CT similar to ribosomal protein L13 X gb|AAH93063.1| 91 1.00E-71 129/141
MCOR0026C 940 3 FF CP signal sequence receptor, beta X >ref|NP_001006561.1| 92 6.00E-92 167/181
MCOR0027C 914 4 FP CT ribosomal protein L4 X ref|NP_001007480.1| 95 E-163 277/289
MCOR0028C 825 4 FP CT 60S ribosomal protein L5 X sp|P22451|RL5_CHICK 96 E-144 249/259
MCOR0029C 538 2 FP CD Proteasome (prosome, macropain) X ref|NP_989113.1| 96 7.00E-80 144/149
MCOR0030C 623 3 FP CP Protein disulfide-isomerase precursor PDI X >gb|AAY33972.1| 93 1.00E-95 174/186
MCOR0031C 986 3 P CE superfast myosin heavy chain X ref|NP_001009221.1| 85 E-148 268/312
MCOR0032C 869 3 FP CD Proteasome activator complex subunit 1 X sp|Q4U5R3|PSME1_BOVIN 63 8.00E-86 156/245
MCOR0033C 577 2 FP CE similar to Actin, cytoplasmic 2 X sp|P63260|ACTG_MOUSE 100 4.00E-92 165/165
MCOR0034C 522 2 FP CT similar to Elongation X >ref|XP_884705.1| 60 1.00E-42 92/151
MCOR0035C 721 20 FF TNtx Short neurotoxin 3 precursor X sp|Q9W7K0|NXS3_PSETE 53 2.00E-15 43/80
MCOR0036C 698 196 FF TP phospholipase A2 X gb|AAN60018.1| 100 2.00E-86 146/146
MCOR0037C 597 2 P MT NADH dehydrogenase subunit 4 X ref|YP_313690.1| 80 2.00E-88 161/199
MCOR0038C 625 2 P CT ribosomal protein L6 X ref|NP_989483.1| 87 7.00E-99 176/202
MCOR0039C 486 29 FF TNtx Short neurotoxin homolog NTL4 X sp|Q9YGI8|NXSH4_BUNMU 61 1.00E-26 53/86
MCOR0040C 611 3 P CT eukaryotic translation initiation factor X ref|XP_213456.2| 86 3.00E-61 118/137
MCOR0041C 559 2 P CM similar to isocitrate dehydrogenase 2 X ref|XP_536192.2| 91 E-102 171/186
MCOR0042C 833 2 P CE Keratin, type I cytoskeletal 15 X sp|Q6IFV3|K1C15_RAT 78 E-122 216/276
MCOR0043C 711 2 NH no hit
MCOR0044C 648 2 P OF similar to selenophosphate synthetase X ref|XP_870912.1| 83 1.00E-48 102/122
MCOR0045C 766 8 P CR similar to guanine nucleotide binding protein X >gb|AAO21313.1| 97 E-132 229/234
MCOR0046C 673 2 FP MT NADH dehydrogenase subunit 1 X >gb|AAL66854.1| 88 E-106 195/220
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0047C 681 2 P CT 40S ribosomal protein S2 X gb|AAZ38987.1| 99 E-125 224/226

MCOR0048S 449 1 P CD ubiquitin X >gb|AAV84266.1| 99 6.00E-77 148/149
MCOR0049C 547 4 FP CT Ribosomal protein S6 X gb|AAH27620.1| 95 7.00E-91 164/172
MCOR0050C 443 2 FP OF Ferritin light chain, oocyte isoform (B-ferritin) X sp|Q7SXA5|FRIL_XENLA 68 3.00E-35 73/106
MCOR0051C 745 2 P CP Coatomer subunit delta (Delta-coat protein) X >emb|CAA57072.1| 86 3.00E-13 38/44
MCOR0052C 491 3 P CT similar to K123 protein X >ref|NP_990350.1| 51 1.00E-15 45/88
MCOR0053C 564 3 FF OF Defender against cell death 1 (DAD-1) X sp|O13113|DAD1_CHICK 90 4.00E-55 112/124
MCOR0054C 544 2 P MT cytochrome oxidase subunit 1 X >ref|YP_313683.1| 81 7.00E-61 105/129
MCOR0055C 537 2 FF UF MGC52838 protein X >gb|AAI06323.1| 76 3.00E-47 87/114
MCOR0056C 559 2 FP CT similar to ribosomal protein S9-like X sp|Q6ZWN5|RS9_MOUSE 99 1.00E-92 172/173
MCOR0057C 757 5 FP CT 40S ribosomal protein S4 X sp|P47836|RS4_CHICK 98 E-142 248/252
MCOR0058C 548 4 FP CE Alpha crystallin B chain (Alpha(B)-crystallin) X sp|P41316|CRYAB_RABIT 62 1.00E-47 100/160
MCOR0059C 581 6 FP CT Eukaryotic translation elongation factor X sp|P24534|EF1B_HUMAN 88 3.00E-81 149/169
MCOR0060C 566 4 FF TL C-type lectin-like protein 2 X >gb|AAK43585.1| 42 1.00E-31 67/156
MCOR0061C 541 2 FP CE tropomyosin alpha striated muscle isoform X >gb|AAT68295.1| 94 1.00E-76 153/162
MCOR0062C 646 2 FF UF SH3 domain binding glutamic acid-rich X ref|XP_216547.1| 86 5.00E-39 80/93
MCOR0063C 1123 4 P TM cobrin precursor X gb|AAF00693.1| 82 0.0 305/370
MCOR0064C 556 2 P CR Breast cancer metastasis-suppressor 1 X sp|Q9HCU9|BRMS1_HUMAN 67 6.00E-69 125/184
MCOR0065C 572 3 FP CT similar to 60S ribosomal protein L8 isoform X sp|P62917|RL8_HUMAN 98 E-101 182/185
MCOR0066C 606 2 P CP hypoxia up-regulated 1 X >ref|NP_001006588.1| 67 2.00E-70 140/207
MCOR0067C 572 3 P TL Lithostathine 2 precursor X sp|Q08731|LIT2_MOUSE 34 8.00E-16 53/155
MCOR0068C 869 4 FP CR similar to CAVP-target protein (CAVPT) X >ref|XP_516109.1| 70 2.00E-88 165/234
MCOR0069C 566 2 P CM similar to ATP synthase, H+ transporting X >ref|XP_858232.1| 81 7.00E-76 143/175
MCOR0070C 540 2 P CT similar to 40S ribosomal protein S8 X >ref|XP_422423.1| 96 8.00E-98 171/177
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0071C 618 2 P CR Actin-related protein 2/3 complex X sp|O15144|ARPC2_HUMAN 97 6.00E-47 91/93

MCOR0072C 897 6 P CR ADP/ATP translocase 2 X sp|P05141|ADT2_HUMAN 96 E-142 245/255
MCOR0073C 2458 39 FF MT Cytochrome c oxidase subunit 1 X sp|O79548|COX1_DINSE 88 0.0 470/530
MCOR0074C 515 2 P CR TRIM5/cyclophilin A V4 fusion protein X >gb|AAT99909.1| 88 2.00E-71 124/140
MCOR0075C 779 7 FF MT Cytochrome c oxidase subunit 3 X sp|O79552|COX3_DINSE 82 E-116 207/251
MCOR0076C 1473 15 FF CM similar to Fructose-bisphosphate aldolase A X >ref|XP_586556.2| 90 0.0 328/364
MCOR0077C 557 4 FF TL stejaggregin-A alpha chain X >gb|AAQ15166.1| 44 2.00E-32 72/163
MCOR0078C 486 2 P CR GNB2L1 protein X gb|AAI02287.1| 99 3.00E-82 147/148
MCOR0079C 614 2 NH no hit
MCOR0080C 528 2 P OF Scaffold attachment factor B X >ref|XP_542146.2| 65 5.00E-62 117/178
MCOR0081C 802 2 P CD similar to X-prolyl aminopeptidase 2 X >ref|XP_420139.1| 61 2.00E-27 64/104
MCOR0082C 669 5 P MT Naja naja 12S ribosomal RNA gene N >gb|AF236683.2|AF236683 91 E-119 315/344
MCOR0083C 484 5 FF CT 60S acidic ribosomal protein P1 X sp|P18660|RLA1_CHICK 92 1.00E-53 106/114
MCOR0084C 515 2 P CD polyubiquitin C X ref|NP_062613.2| 60 2.00E-37 94/155
MCOR0085C 981 5 FF CT 40S ribosomal protein SA (p40) X sp|P50890|RSSA_CHICK 96 E-167 287/296
MCOR0086C 453 3 FF CT 40S ribosomal protein S27 X sp|P42677|RS27_HUMAN 100 8.00E-45 84/84
MCOR0087C 1005 4 P CT eukaryotic translation elongation factor 1 X ref|NP_001013122.1| 68 E-115 219/318
MCOR0088C 463 2 FF CT ubiquitin-like/S30 ribosomal fusion protein X >ref|NP_999102.1| 81 2.00E-56 109/133
MCOR0089C 874 19 FF CT 60S ribosomal protein L7a X sp|P32429|RL7A_CHICK 96 E-146 258/266
MCOR0090C 735 27 FF TL C-type lectin-like protein 2 X >gb|AAK43585.1| 74 2.00E-72 117/158
MCOR0091C 427 2 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 97 2.00E-38 74/76
MCOR0092C 485 18 FF TNtx alpha neurotoxin X >gb|AAF75223.1| 49 3.00E-15 39/79
MCOR0093C 603 2 FF TP phospholipase A2 X >gb|AAN60018.1| 90 5.00E-73 134/148
MCOR0094C 512 12 FF TNtx weak toxin 3 / cardiotoxin 6 X gb|AAL30061.1| 49 3.00E-17 43/87
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0095C 719 11 FF TL C-type lectin-like protein 2 X >gb|AAK43585.1 74 7.00E-71 116/155

MCOR0096C 534 3 FP CR Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase X sp|P24367|PPIB_CHICK 84 1.00E-77 141/166
MCOR0097C 531 5 FF CT ribosomal protein S11 X >ref|NP_001026004.1| 97 1.00E-84 153/157
MCOR0098C 679 6 P CT similar to ubiquitin A-52 X >ref|XP_533870.2| 99 3.00E-69 129/130
MCOR0099C 553 2 FF CR Calpactin I light chain X >ref|XP_533060.2| 62 1.00E-38 76/121
MCOR0100C 488 27 FF TNtx muscarinic toxin precursor X >gb|ABB83639.1| 51 1.00E-15 44/85
MCOR0101C 495 2 P CT similar to ribosomal protein L13a X ref|XP_512821.1| 92 2.00E-84 153/165
MCOR0102C 556 2 FP CT 60S ribosomal protein L15 X sp|P61313|RL15_HUMAN 100 E-100 175/175
MCOR0103C 445 2 FF TNtx long chain neurotoxin LsIII X >dbj|BAC78204.1| 55 1.00E-19 48/86
MCOR0104C 483 2 FF CT 40S ribosomal protein S12 X sp|P84175|RS12_CHICK 98 1.00E-70 130/132
MCOR0105C 471 5 FF TNtx Cardiotoxin 4N precursor (CTX-4N) X sp|Q9W6W9|CTX4N_NAJAT 56 4.00E-15 46/82
MCOR0106C 438 6 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 100 4.00E-41 78/78
MCOR0107C 506 2 P CT similar to ribosomal protein S23 X >ref|XP_424903.1| 97 2.00E-77 143/146
MCOR0108C 606 6 FF CT 60S ribosomal protein L41 (HG12) X sp|P62945|RL41_HUMAN 100 4.00E-06 25/25
MCOR0109C 474 12 FF TNtx Cytotoxin 7 precursor (Cardiotoxin 7) X sp|P49122|CX7_NAJAT 51 5.00E-16 42/82
MCOR0110C 410 2 FF TK trypsin inhibitor preproprotein X >gb|AAP04484.1| 59 2.00E-25 53/89
MCOR0111C 537 2 P CT similar to 40S ribosomal protein X >ref|XP_536549.2| 95 2.00E-65 125/131
MCOR0112C 499 2 P CT similar to ribosomal protein X >ref|XP_424903.1| 96 5.00E-78 144/149
MCOR0113C 453 2 FF CT similar to 40S ribosomal protein X sp|P62273|RS29_HUMAN 100 1.00E-28 56/56
MCOR0114C 459 2 FF CT ribosomal protein L28 X >ref|NP_001016714.1| 88 2.00E-65 121/137
MCOR0115C 596 3 FF CT 40S ribosomal protein X sp|P62277|RS13_HUMAN 100 2.00E-80 151/151
MCOR0116C 497 2 FF CT 40S ribosomal protein S15 X sp|P62841|RS15_HUMAN 100 3.00E-78 145/145
MCOR0117C 415 2 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 89 1.00E-36 70/78
MCOR0118C 495 33 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 8 X sp|P58370|NXAH8_MICCO 98 4.00E-47 85/86
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0119C 473 3 P CT elongation factor 2 X >gb|AAY33974.1| 97 1.00E-71 129/132

MCOR0120C 476 4 FF TNtx muscarinic toxin precursor X >gb|ABB83638.1| 63 1.00E-24 55/86
MCOR0121S 343 1 P CM Glycogen phosphorylase, muscle form X sp|Q9WUB3|PYGM_MOUSE 87 1.00E-53 100/114
MCOR0122S 429 1 P UF similar to Pim1 protein X >ref|XP_690996.1| 41 3.00E-19 54/131
MCOR0123S 444 1 NH no hit
MCOR0124S 465 1 FP CT eukaryotic translation initiation factor X >dbj|BAD92756.1| 83 6.00E-70 126/151
MCOR0125S 231 1 FP CE NEDD4 family-interacting protein X sp|Q6GLN5|NFIP1_XENLA 67 5.00E-07 27/40
MCOR0126S 333 1 NH no hit
MCOR0127S 182 1 FP MT similar to ATPase inhibitor X >ref|XP_691054.1| 82 1.00E-09 28/34
MCOR0128S 507 1 FF CT 40S ribosomal protein S18 X sp|P62269|RS18_HUMAN 100 4.00E-82 152/152
MCOR0129S 413 1 P CT eukaryotic translation elongation factor X >ref|NP_001027570.1| 99 6.00E-51 100/101
MCOR0130S 340 1 NH no hit
MCOR0131S 413 1 P CT elongation factor-1 alpha X >dbj|BAD74118.1| 98 2.00E-72 135/137
MCOR0132S 418 1 NH no hit
MCOR0133S 515 1 P CT similar to 60S ribosomal protein X >ref|NP_001006241.1| 93 5.00E-93 160/171
MCOR0134S 460 1 P CP Valosin-containing protein X >gb|AAH07562.2| 99 8.00E-80 151/152
MCOR0135S 382 1 P CT Transcription elongation factor A X sp|O75764|TCEA3_HUMAN 65 4.00E-30 57/87
MCOR0136S 480 1 P CD autocrine motility factor receptor X sp|Q9UKV5|AMFR2_HUMAN 85 1.00E-76 136/160
MCOR0137S 525 1 P OF Coatomer subunit alpha X >gb|AAH75251.1| 90 5.00E-34 65/72
MCOR0138S 492 1 P CD Ubiquitin-activating enzyme X >sp|P31253|UBE1X_MOUSE 41 4.00E-28 62/150
MCOR0139S 417 1 P CD procollagen (type III) N-endopeptidase X >ref|NP_001020611.1| 90 9.00E-36 79/87
MCOR0140S 503 1 P CP Stress-induced-phosphoprotein 1 X sp|Q60864|STIP1_MOUSE 90 7.00E-83 145/161
MCOR0141S 501 1 P UF hypothetical protein XP_418405 X >ref|XP_418405.1| 81 6.00E-67 117/144
MCOR0142S 445 1 P DT Bungarus flaviceps beta-bgt a2 N >dbj|AB112356.1| 94 2.00E-15 55/58
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0143S 533 1 FF CE myosin alkali light chain X >gb|AAA48979.1| 97 2.00E-81 147/151

MCOR0144S 473 1 NH no hit
MCOR0145S 511 1 FP CT Eukaryotic translation initiation factor X sp|Q9DBZ5|IF3C_MOUSE 89 4.00E-81 146/163
MCOR0146S 424 1 P UF similar to 9530046H09Rik protein X >ref|XP_418182.1| 86 2.00E-36 74/86
MCOR0147S 532 1 P CP xylosylprotein X >ref|NP_001035000.1| 77 4.00E-65 119/153
MCOR0148S 492 1 NH no hit
MCOR0149S 541 1 P TN Venom nerve growth factor 1 X sp|Q3HXY0|NGFV1_HOPST 93 6.00E-89 160/172
MCOR0150S 456 1 P UF Hypothetical protein MGC76288 X >gb|AAH61625.1| 60 3.00E-41 89/146
MCOR0151S 501 1 FP OF CD2 antigen cytoplasmic tail-binding X sp|O95400|CD2B2_HUMAN 71 4.00E-54 100/140
MCOR0152S 498 1 P TNtx Alpha-neurotoxin homolog 8 precursor X sp|P58370|NXAH8_MICCO 95 2.00E-39 71/74
MCOR0153S 484 1 NH no hit
MCOR0154S 360 1 NH no hit
MCOR0155S 418 1 P OF MHC class I protein X >gb|AAA48519.1| 50 1.00E-26 55/108
MCOR0156S 486 1 P CM glucose-6-phosphate dehydrogenase X >sp|O55044|G6PD_CRIGR 77 2.00E-73 125/161
MCOR0157S 428 1 FP OF MHC class I protein X >gb|AAA49389.1| 76 2.00E-53 96/126
MCOR0158S 462 1 FF CP Signal recognition particle 19 kDa protein X sp|Q5RBR1|SRP19_PONPY 80 9.00E-62 113/140
MCOR0159S 508 1 P UF Protein C20orf116 precursor X sp|Q96HY6|CT116_HUMAN 75 2.00E-64 123/164
MCOR0160S 452 1 P TS Prostasin precursor X sp|Q9ES87|PRSS8_RAT 53 4.00E-42 79/148
MCOR0161S 382 1 P UF similar to NG37 protein X >ref|XP_849170.1| 32 1.00E-10 40/125
MCOR0162S 475 1 NH no hit
MCOR0163S 398 1 P CR Intestinal alkaline phosphatase X >gb|AAF36717.1| 68 9.00E-39 82/120
MCOR0164S 332 1 CM malate dehydrogenase 2, NAD
MCOR0165S 377 1 P CP similar to SEC14-like protein 1 X >ref|XP_415614.1| 94 1.00E-65 118/125
MCOR0166S 443 1 P UF hypothetical protein XP_845157 X >ref|XP_850250.1| 68 3.00E-51 96/141
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0167S 429 1 P OF integral membrane glycoprotein X >gb|AAA30859.1| 45 2.00E-32 63/139

MCOR0168S 342 1 P CE similar to myosin, heavy polypeptide 7 X >ref|XP_546980.2| 81 8.00E-46 91/112
MCOR0169S 164 1 P OF MHC class I protein X >gb|AAA49389.1| 78 5.00E-18 40/51
MCOR0170S 446 1 P CM similar to Probable cation-transporting X >ref|XP_423767.1| 80 1.00E-58 115/142
MCOR0171S 424 1 P CP similar to alpha-1,3-mannosyltransferase X >ref|XP_859208.1| 75 4.00E-33 63/83
MCOR0172S 473 1 P RT predicted CDS, reverse transcriptase X >ref|XP_780819.1| 47 2.00E-34 72/153
MCOR0173S 402 1 P CT heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3 X >ref|NP_001026424.1| 78 3.00E-58 105/133
MCOR0174S 403 1 P UF similar to OCIA domain containing 1 X >ref|XP_707712.1| 51 2.00E-24 59/115
MCOR0175S 370 1 P CT ribosomal protein S3 X gb|AAQ94564.1| 96 1.00E-19 50/52
MCOR0176S 393 1 P TNtx Weak neurotoxin 10 precursor X sp|Q802B2|TW10_NAJSP 41 4.00E-09 26/63
MCOR0177S 449 1 P CR similar to SH3 domain protein X >ref|XP_534577.2| 66 2.00E-55 105/158
MCOR0178S 471 1 NH no hit
MCOR0179S 359 1 P UF similar to hypothetical protein FLJ22662 X >ref|XP_416206.1| 59 6.00E-37 71/119
MCOR0180S 377 1 P CM fructose-1,6-bisphosphate aldolase A X >gb|AAA37210.2| 88 8.00E-59 111/125
MCOR0181S 456 1 FF CR Fatty acid-binding protein, heart X sp|P10790|FABPH_BOVIN 75 2.00E-52 98/129
MCOR0182S 383 1 P OF MHC class I protein X >gb|AAA49389.1| 74 3.00E-43 77/104
MCOR0183S 425 1 P CR StAR-related lipid transfer protein 7 X sp|Q8R1R3|STAR7_MOUSE 91 9.00E-71 125/136
MCOR0184S 392 1 P CP Protein transport protein Sec61 X sp|P38377|S61A1_CANFA 97 6.00E-64 123/126
MCOR0185S 426 1 P OF MHC class I protein X >gb|AAA48518.1| 58 2.00E-43 79/135
MCOR0186S 494 1 P CE similar to Tubulin alpha-6 chain X >ref|XP_862226.1| 98 2.00E-83 150/153
MCOR0187S 600 1 P UF hypothetical protein LOC394935 X ref|NP_989311.1| 56 2.00E-50 104/184
MCOR0188S 205 1 P CM Ca2+-transporting ATPase X >gb|AAY67989.1| 95 1.00E-30 65/68
MCOR0189S 459 1 FP CE actin related protein 2/3 X >ref|NP_001025803.1| 85 8.00E-64 108/126
MCOR0190S 457 1 P MT Cytochrome c oxidase subunit 1 X sp|O79548|COX1_DINSE 83 2.00E-40 89/106
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0191S 299 1 P CT elongation factor 2 X >gb|AAY33974.1| 98 3.00E-43 85/86

MCOR0192S 556 1 NH no hit
MCOR0193S 391 1 FP TB natriuretic peptide X >gb|AAC60341.1| 88 1.00E-20 52/59
MCOR0194S 493 1 P CR bromodomain and PHD finger X >ref|NP_001026635.1| 95 5.00E-39 78/82
MCOR0195S 464 1 FP TB natriuretic peptide X >gb|AAC60341.1| 86 1.00E-24 57/66
MCOR0196S 493 1 FF OF galectin-1 X gb|AAT37622.1| 51 1.00E-32 68/132
MCOR0197S 287 1 P CT eukaryotic translation inititation X >gb|AAL54908.1| 98 4.00E-48 94/95
MCOR0198S 472 1 FP CP Translocation-associated membrane X >ref|NP_989731.1| 85 5.00E-51 96/112
MCOR0199S 437 1 P CT Thyroid hormone receptor-associated X >ref|XP_417769.1| 80 2.00E-58 108/134
MCOR0200S 546 1 P TA L-amino acid oxidase precursor X >gb|AAY89682.1| 75 5.00E-20 47/62
MCOR0201S 435 1 P CM nicotinamide N-methyltransferase X sp|P40261|NNMT_HUMAN 61 9.00E-44 81/131
MCOR0202S 224 1 NH no hit
MCOR0203S 474 1 FP TL C-type lectin-like protein 2 X >gb|AAK43585.1| 77 6.00E-38 68/88
MCOR0204S 290 1 P CE putative collagen alpha-2 (XI) chain X >gb|AAA67751.1| 54 6.00E-16 42/77
MCOR0205S 426 1 NH no hit
MCOR0206S 559 1 NH no hit
MCOR0207S 490 1 FP CT Protein FAM50A (XAP-5 protein) X >ref|XP_215220.3| 88 1.00E-60 121/136
MCOR0208S 189 1 P CR serine/threonine kinase 19 X >emb|CAI41867.1| 58 7.00E-10 29/50
MCOR0209S 528 1 NH no hit
MCOR0210S 565 1 NH no hit
MCOR0211S 579 1 P CM NADPH dependent diflavin oxidoreductase 1 X >ref|XP_415553.1| 81 1.00E-74 129/158
MCOR0212S 522 1 P CT splicing factor 3B subunit 2 X >gb|AAH14125.2| 97 E-101 170/174
MCOR0213S 374 1 NH no hit
MCOR0214S 560 1 P CT similar to initiation factor eIF-2Be X >ref|XP_422755.1| 68 5.00E-68 126/183
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0215S 552 1 FP CM ATP synthase, H+ transporting X ref|NP_001011021.1| 72 4.00E-51 97/155

MCOR0216S 570 1 P CM Dolichyl-diphosphooligosaccharide X >sp|P48440|OST48_CHICK 93 2.00E-98 177/190
MCOR0217S 559 1 P UF LOC383103 protein X >ref|NP_001013800.1| 81 6.00E-75 132/162
MCOR0218S 572 1 FP CD Cysteine protease ATG4A X sp|Q5ZIW7|ATG4A_CHICK 83 4.00E-93 156/187
MCOR0219S 609 1 P UF N-myc downstream-regulated gene 2 X ref|NP_001030381.1| 87 5.00E-58 114/131
MCOR0220S 272 1 P UF similar to KIAA0265 protein X >ref|XP_425257.1| 67 7.00E-10 29/43
MCOR0221S 577 1 P UF similar to RIKEN cDNA 4921536I21 X >ref|XP_422374.1| 63 5.00E-10 33/52
MCOR0222S 527 1 FP UF similar to COMM domain containing 7 X >ref|XP_852352.1| 77 1.00E-65 127/164
MCOR0223S 515 1 NH no hit
MCOR0224S 551 1 P CE tropomyosin X >gb|AAA49112.1| 94 2.00E-88 173/183
MCOR0225S 509 1 P CR similar to programmed cell death X ref|NP_001006815.1| 84 5.00E-39 80/95
MCOR0226S 532 1 FF OF Lymphocyte antigen Ly-6E precursor X sp|Q90986|LY6E_CHICK 56 8.00E-36 70/125
MCOR0227S 535 1 FP CR similar to death-associated protein 3 X >ref|XP_514436.1| 40 7.00E-11 35/86
MCOR0228S 558 1 P CM NAD kinase X ref|NP_001026041.1| 91 1.00E-90 169/185
MCOR0229S 557 1 P RT predicted CDS, reverse transcriptase X >ref|XP_780819.1| 45 2.00E-21 45/98
MCOR0230S 458 1 P CM Succinate dehydrogenase [ubiquinone] X sp|Q9CQA3|DHSB_MOUSE 88 1.00E-77 130/147
MCOR0231S 500 1 P CD similar to Xaa-Pro aminopeptidase 2 X >ref|XP_580998.2| 60 2.00E-50 97/160
MCOR0232S 545 1 P CD Calpain small subunit 1 X sp|P04574|CPNS1_PIG 67 4.00E-64 122/180
MCOR0233S 490 1 FP CP Signal peptidase complex subunit 3 X sp|P28687|SPCS3_CHICK 91 1.00E-51 102/111
MCOR0234S 548 1 P MT NADH dehydrogenase subunit 5 X >ref|YP_313678.1| 68 3.00E-61 127/186
MCOR0235S 486 1 P CD Ubiquinol-cytochrome c reductase core X gb|AAI06253.1| 64 1.00E-53 105/162
MCOR0236S 493 1 FP CE similar to microtubule-associated protein X ref|XP_592416.2| 96 1.00E-57 109/113
MCOR0237S 559 1 NH no hit
MCOR0238S 412 1 P DT Ohanin precursor, gene, complete cds N >gb|DQ103590.1| 87 1.00E-06 55/63
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0239S 527 1 FP OF Ferritin, higher subunit (Ferritin H) X >sp|P07229|FRI1_RANCA 75 1.00E-47 88/116

MCOR0240S 554 1 P OF optic atrophy 1 (autosomal dominant) X ref|NP_001034398.1| 91 7.00E-99 168/184
MCOR0241S 545 1 P CM glucose regulated thiol oxidoreductase X >ref|NP_989441.1| 81 2.00E-86 148/181
MCOR0242S 520 1 FF OF MHC class I protein X >gb|AAA49389.1| 78 9.00E-66 114/146
MCOR0243S 511 1 P OF similar to zn-finger X >ref|XP_782581.1| 46 2.00E-36 77/167
MCOR0244S 536 1 FP UF similar to putative membrane protein X ref|NP_001002575.1| 96 6.00E-90 166/172
MCOR0245S 563 1 NH no hit
MCOR0246S 553 1 P UF hypothetical protein XP_787740 X >ref|XP_792833.1| 46 3.00E-40 84/179
MCOR0247S 484 1 P CM glucose-fructose oxidoreductase X >ref|NP_001028571.1| 91 2.00E-53 98/107
MCOR0248S 540 1 P DT Bungarus candidus beta-neurotoxin N >gb|AY425950.1| 93 9.00E-15 57/61
MCOR0249S 423 1 FP CM NADH-ubiquinone oxidoreductase B18 X sp|Q02368|NB8M_BOVIN 68 6.00E-43 80/117
MCOR0250S 588 1 FP UF similar to transmembrane protein X >ref|XP_415767.1| 81 1.00E-79 148/182
MCOR0251S 591 1 P CE epithelial mucin X >gb|AAB48542.1| 40 1.00E-27 74/185
MCOR0252S 575 1 FF CR calglandulin-like protein X sp|Q3SB15|CALGL_OXYSC 98 4.00E-84 153/156
MCOR0253S 301 1 NH no hit
MCOR0254S 373 1 P CT eukaryotic translation initiation factor X >dbj|BAD92356.1| 92 4.00E-58 114/123
MCOR0255S 165 1 NH no hit
MCOR0256S 475 1 P CR stromal cell derived factor 4 X ref|NP_001006302.1| 93 2.00E-83 147/158
MCOR0257S 417 1 NH no hit
MCOR0258S 503 1 P CR CSNK2A1 protein X >gb|AAH50036.1| 97 1.00E-95 163/167
MCOR0259S 222 1 P CT Nuclease sensitive element-binding protein X >ref|NP_989745.1| 90 9.00E-34 63/70
MCOR0260S 169 1 NH no hit
MCOR0261S 408 1 FP CT ribosomal protein L11 X >emb|CAH71474.1| 99 3.00E-72 134/135
MCOR0262S 228 1 P CP transporter associated with antigen X >gb|AAP36717.1| 60 4.00E-13 38/63
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0263S 506 1 P TA L-amino acid oxidase precursor X >gb|AAY89681.1| 81 7.00E-76 137/168

MCOR0264S 506 1 P CD procollagen (type III) N-endopeptidase X >ref|NP_001020611.1| 96 1.00E-59 122/126
MCOR0265S 517 1 FP CR regulator of G-protein signaling protein GAIP X >ref|NP_989560.1| 86 8.00E-75 130/151
MCOR0266S 565 1 NH no hit
MCOR0267S 246 1 FP UF hypothetical protein XP_420745 X >ref|XP_420745.1| 93 1.00E-20 45/48
MCOR0268S 523 1 NH no hit
MCOR0269S 197 1 P CD midgut aminopeptidase N2 X >gb|AAQ24379.1| 52 1.00E-07 31/59
MCOR0270S 462 1 P RN Putative rRNA methyltransferase 3 X >sp|Q5ZKM1|RRMJ3_CHICK 85 2.00E-67 127/148
MCOR0271S 513 1 P OF MHC class I protein X >gb|AAA48519.1| 58 4.00E-45 85/146
MCOR0272S 467 1 P CE similar to Mucin 5B precursor X >ref|XP_421033.1| 43 1.00E-28 62/141
MCOR0273S 387 1 FP TL C-type lectin-like protein 2 X >gb|AAK43585.1| 70 6.00E-48 85/121
MCOR0274S 363 1 NH no hit
MCOR0275S 400 1 NH no hit
MCOR0276S 560 1 FP UF Transmembrane emp24 domain X >sp|Q9BVK6|TMED9_HUMAN 90 9.00E-94 165/183
MCOR0277S 440 1 P CE similar to Filamin A X >ref|XP_538205.2| 72 2.00E-31 62/85
MCOR0278S 522 1 P CT Dr1-associated corepressor X sp|Q9D6N5|DRAP1_MOUSE 67 9.00E-53 109/161
MCOR0279S 479 1 P CE Ficolin-1 precursor X >ref|NP_001005799.1| 44 6.00E-25 69/154
MCOR0280S 453 1 P CR similar to Thioredoxin-like protein 2 X >ref|XP_421826.1| 81 3.00E-60 113/138
MCOR0281S 398 1 NH no hit
MCOR0282S 304 1 P OF coatomer protein complex X >ref|NP_001006339.1| 83 1.00E-39 83/100
MCOR0283S 252 1 P UF similar to CG17660-PA isoform 4 X >ref|XP_707885.1| 72 4.00E-28 58/80
MCOR0284S 487 1 NH no hit
MCOR0285S 293 1 P VT Escherichia coli K-12 MG1655 >gb|AE000176.1|AE000176 99 E-162 290/291
MCOR0286S 420 1 P UF MGC89502 protein X ref|NP_001008127.1| 95 3.00E-35 76/80
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0287S 433 1 P RT predicted CDS, reverse transcriptase X >ref|XP_781181.1| 63 9.00E-07 21/33

MCOR0288S 427 1 P CD Proteasome activator complex X sp|Q4U5R3|PSME1_BOVIN 56 2.00E-38 79/139
MCOR0289S 456 1 P CR similar to FGF intracellular binding X >ref|XP_533228.2| 85 6.00E-67 124/145
MCOR0290S 358 1 P DT pla2 gene for phospholipase A2 N dbj|AB111959.1| 89 1.00E-09 57/64
MCOR0291S 449 1 P UF similar to hypothetical protein FLJ10081 X >ref|XP_424221.1| 54 5.00E-18 54/100
MCOR0292S 471 1 P TL C-type lectin-like protein 2 X >gb|AAK43585.1| 43 5.00E-29 64/148
MCOR0293S 513 1 P CE Junctional adhesion molecule A precursor X sp|Q9Y624|JAM1_HUMAN 46 2.00E-30 71/154
MCOR0294S 508 1 FP CT Mitochondrial ribosomal protein L16 X ref|NP_060310.1| 55 2.00E-36 74/133
MCOR0295S 507 1 FP UF MGC85236 protein X >gb|AAH78477.1| 84 8.00E-40 79/94
MCOR0296S 562 1 P MT Uqcrc2-prov protein X >gb|AAH42931.1| 72 1.00E-71 131/181
MCOR0297S 501 1 NH no hit
MCOR0298S 474 1 P CE similar to beta-1 syntrophin X ref|NP_001005798.1| 87 1.00E-74 137/157
MCOR0299S 252 1 NH no hit
MCOR0300S 501 1 P OF similar to vesicle-associated membrane X >ref|XP_581657.1| 86 1.00E-39 78/90
MCOR0301S 456 1 FP CT eukaryotic translation initiation factor X ref|NP_001013113.1| 80 8.00E-64 120/150
MCOR0302S 525 1 P OF Pulmonary surfactant-associated protein X sp|P35248|SFTPD_RAT 41 5.00E-30 66/160
MCOR0303S 384 1 P CE NAD-dependent deacetylase sirtuin-2 X sp|Q8VDQ8|SIRT2_MOUSE 65 1.00E-21 49/75
MCOR0304S 544 1 P CR similar to ATP-binding cassette X >ref|XP_539916.2| 65 2.00E-60 119/181
MCOR0305S 544 1 P UF similar to Reticulocalbin-2 precursor X >ref|XP_544790.2| 76 2.00E-79 138/180
MCOR0306S 468 1 P CT similar to ribosomal protein S27 X >ref|XP_509802.1| 95 1.00E-42 81/85
MCOR0307S 573 1 P DT mtlp gene for muscarinic toxin-like protein N >emb|AJ421675.1|BMU421675 89 E-137 380/423
MCOR0308S 569 1 P CT UPF2 regulator of nonsense transcripts X >ref|XP_507656.1| 73 2.00E-52 105/142
MCOR0309S 562 1 P UF Hypothetical protein LOC23065 X >gb|AAM88856.1| 100 1.00E-13 39/39
MCOR0310S 579 1 P UF similar to FLJ20254 protein X >ref|XP_426216.1| 47 2.00E-47 84/176
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0311S 357 1 P UF Nucleolar complex protein 4 homolog X sp|Q5ZJC7|NOC4L_CHICK 63 4.00E-25 54/85

MCOR0312S 446 1 FP TL C-type lectin-like protein 2 X >gb|AAK43585.1| 72 6.00E-56 96/132
MCOR0313S 555 1 P CR CMIP protein / c-Maf-inducing protein X >ref|XP_423491.1| 94 4.00E-95 168/178
MCOR0314S 527 1 DT Ohanin precursor N >gb|DQ103590.1| 88 3.00E-36 132/149
MCOR0315S 554 1 FP CM Guanidinoacetate N-methyltransferase X >sp|Q71N41|GAMT_BRARE 77 3.00E-46 84/108
MCOR0316S 560 1 P CM methylcrotonoyl-Coenzyme A carboxylase X >ref|NP_998092.1| 80 2.00E-71 131/162
MCOR0317S 546 1 P UF similar to CG10189-PA isoform 3 X >ref|XP_850047.1| 70 1.00E-54 103/146
MCOR0318S 575 1 P UF similar to B-cell lymphoma 9 protein N >ref|XM_429583.1| 91 2.00E-96 258/283
MCOR0319S 554 1 FP OF MHC class II antigen X >gb|AAQ06509.1| 45 4.00E-33 75/166
MCOR0320S 513 1 FF UF hypothetical protein XP_420228 X >ref|XP_420228.1| 93 1.00E-65 125/133
MCOR0321S 530 1 P CR v-raf murine sarcoma 3611 viral oncogene X >ref|NP_001014964.1| 86 9.00E-53 99/115
MCOR0322S 538 1 P CE paxillin X >ref|NP_002850.1| 99 3.00E-95 151/152
MCOR0323S 557 1 FP CE zinc finger protein 184 (Kruppel-like) X >ref|NP_001025866.1| 61 5.00E-09 30/49
MCOR0324S 570 1 P OF MHC class I protein X gb|AAA48519.1| 56 5.00E-51 92/163
MCOR0325S 532 1 P UF Josephin-2 (Josephin domain containing 2) X sp|Q9CR30|JOS2_MOUSE 78 2.00E-57 104/132
MCOR0326S 564 1 P OF centromere protein ZW10 / kinetochore X >dbj|BAB39105.1| 61 2.00E-58 116/188
MCOR0327S 378 1 P CT 40S ribosomal protein S3 X >gb|AAT01919.1| 83 2.00E-25 60/72
MCOR0328S 472 1 FP UF CLE7 protein X >ref|NP_990700.1| 63 5.00E-34 71/111
MCOR0329S 559 1 P CM Pyruvate kinase muscle isozyme X sp|P00548|KPYK_CHICK 89 1.00E-47 91/102
MCOR0330S 538 1 P OF TNF receptor-associated protein X >ref|NP_001006175.1| 78 2.00E-79 136/174
MCOR0331S 518 1 NH no hit
MCOR0332S 567 1 NH no hit
MCOR0333S 525 1 P CT similar to 60S ribosomal protein L3-like X >ref|XP_414843.1| 84 5.00E-35 71/84
MCOR0334S 402 1 NH no hit
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0335S 548 1 P CR ATP-binding cassette, sub-family F X >dbj|BAD92801.1| 93 4.00E-93 171/182

MCOR0336S 489 1 P UF Hypothetical protein LOC431674 X >gb|AAH67964.1| 73 7.00E-66 118/161
MCOR0337S 525 1 P CT eukaryotic translation initiation factor X >ref|XP_939382.1| 92 1.00E-81 152/165
MCOR0338S 517 1 P CR erthyrocyte band 7 integral membrane X ref|NP_001011965.1| 92 7.00E-33 75/81
MCOR0339S 563 1 FP CM inosine monophosphate dehydrogenase X >ref|NP_001025772.1| 92 2.00E-93 166/179
MCOR0340S 368 1 P UF microsatellite MV4008 sequence N >gb|AF236360.1| 95 8.00E-08 39/41
MCOR0341S 578 1 P CT muscle, intestine and stomach expression X >ref|XP_425228.1| 65 2.00E-43 95/144
MCOR0342S 568 1 P RT reverse transcriptase-like protein X >gb|AAN15747.1| 42 1.00E-34 82/192
MCOR0343S 578 1 P CT DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box polypeptide 16 X ref|NP_956318.1| 93 E-100 180/192
MCOR0344S 521 1 NH no hit
MCOR0345S 580 1 P CP Sec61 alpha 1 subunit X emb|CAJ82441.1| 98 1.00E-68 132/134
MCOR0346S 555 1 NH no hit
MCOR0347S 534 1 FP TL C-type lectin-like protein 2 X >gb|AAK43585.1| 63 1.00E-41 78/123
MCOR0348S 595 1 P CM ATP synthase, H+ transporting X >gb|AAH11384.1| 99 E-105 196/197
MCOR0349S 503 1 FF UF hypothetical protein LOC428592 X >ref|NP_001026695.1| 89 2.00E-51 95/106
MCOR0350S 529 1 P CT splicing factor, arginine/serine-rich 2 N >ref|NM_001034118.1| 98 6.00E-59 125/127
MCOR0351S 244 1 P CD ubiquitin X >gb|AAV84266.1| 100 4.00E-38 80/80
MCOR0352S 545 1 FP CR Chloride intracellular channel protein X emb|CAI18421.1| 90 5.00E-78 142/157
MCOR0353S 436 1 P CM similar to alcohol dehydrogenase ADH-F X >ref|XP_420658.1| 77 1.00E-62 110/142
MCOR0354S 534 1 P OF Craniofacial development protein 1 X sp|Q75QI0|CFDP1_CHICK 50 3.00E-34 86/172
MCOR0355S 544 1 P CP similar to Protein disulfide isomerase X >ref|XP_419952.1| 89 7.00E-77 140/157
MCOR0356S 538 1 P UF LOC51136 protein X >gb|AAH88365.1| 67 2.00E-56 97/144
MCOR0357S 580 1 P CR similar to Component of oligomeric golgi X >ref|XP_239373.3| 54 2.00E-55 107/195
MCOR0358S 538 1 P CR Mitogen-activated protein kinase 3 X ref|NP_958915.1| 94 1.00E-95 165/175
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0359S 465 1 NH no hit

MCOR0360S 525 1 NH no hit
MCOR0361S 536 1 P CP vacuolar protein sorting homolog h-vps45 X >gb|AAC50931.1| 80 1.00E-65 122/151
MCOR0362S 195 1 P OF Annexin A2 (Annexin II) (Lipocortin II) X sp|P17785|ANXA2_CHICK 85 4.00E-24 55/64
MCOR0363S 544 1 P CR [3-methyl-2-oxobutanoate dehydrogenase X >gb|AAH04077.1| 92 2.00E-95 168/181
MCOR0364S 533 1 NH no hit
MCOR0365S 480 1 P CT mitochondrial ribosomal protein L51 X ref|NP_001008675.1| 72 3.00E-40 72/99
MCOR0366S 470 1 P DT mRNA for protease A, complete cds N >dbj|AB031394.1| 90 5.00E-13 67/74
MCOR0367S 559 1 P CT Eukaryotic translation initiation factor 5A X >sp|P10160|IF5A_RABIT 99 8.00E-53 103/104
MCOR0368S 435 1 NH no hit
MCOR0369S 546 1 P OF similar to peptidylglycine alpha-amidating X >ref|XP_424857.1| 82 5.00E-86 147/178
MCOR0370S 475 1 FF UF similar to RIKEN cDNA 0610009E20 X >ref|XP_415849.1| 95 2.00E-54 105/110
MCOR0371S 496 1 P CT Eukaryotic translation initiation factor 3 X >emb|CAG33415.1| 98 9.00E-91 163/165
MCOR0372S 532 1 FP CP similar to TRAP-complex gamma subunit X >ref|XP_422829.1| 93 2.00E-88 166/177
MCOR0373S 562 1 P MT similar to cytochrome c oxidase subunit X >ref|XP_419450.1| 63 7.00E-36 76/120
MCOR0374S 488 1 P CM ATPase, H+ transporting, lysosomal X ref|NP_001017064.1| 93 7.00E-08 30/32
MCOR0375S 304 1 NH no hit
MCOR0376S 539 1 P CE similar to Filamin A (Alpha-filamin) X >ref|XP_538205.2| 74 7.00E-58 106/143
MCOR0377S 380 1 P CM Glycogen phosphorylase, muscle form X sp|P11217|PYGM_HUMAN 82 8.00E-61 109/132
MCOR0378S 533 1 FP CM Fructose-1,6-bisphosphatase 1 X >ref|XP_425040.1| 87 2.00E-68 130/148
MCOR0379S 443 1 P CE actin related protein 2/3 complex X ref|NP_998321.1| 92 3.00E-57 100/108
MCOR0380S 451 1 FP UF DCN1-like protein 4 X >sp|Q92564|DCNL4_HUMAN 87 6.00E-61 109/125
MCOR0381S 340 1 P CT similar to 40S ribosomal protein S4 X >gb|AAH07308.2| 83 2.00E-47 94/112
MCOR0382S 296 1 P TP phospholipase A2 X >gb|AAN60018.1| 100 2.00E-37 68/68
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0383S 536 1 FF CD Chain A, Solution Structure Of Mouse X pdb|1J0G|A 95 2.00E-38 80/84

MCOR0384S 522 1 NH no hit
MCOR0385S 545 1 P CE cytoplasmic actin type 5 X >gb|AAQ18433.1| 100 3.00E-63 118/118
MCOR0386S 537 1 NH no hit
MCOR0387S 535 1 FF OF chemokine / interleukin-8 variant 3 X >gb|AAQ01586.1| 29 9.00E-06 26/88
MCOR0388S 409 1 NH no hit
MCOR0389S 464 1 P CP vacuolar protein sorting 45A variant X >dbj|BAD96934.1| 92 7.00E-76 142/153
MCOR0390S 485 1 NH no hit
MCOR0391S 424 1 P CR guanine nucleotide binding proteinrotein X >ref|XP_518165.1| 98 1.00E-62 117/119
MCOR0392S 383 1 P CM fumarylacetoacetate hydrolase domain X >emb|CAJ81463.1| 68 1.00E-40 83/122
MCOR0393S 530 1 FP CM Adenylate kinase isoenzyme 1 X sp|P05081|KAD1_CHICK 91 2.00E-78 148/162
MCOR0394S 421 1 P CM Fructose 1,6-Bisphosphate Aldolase X pdb|1EWD|A 86 9.00E-60 115/133
MCOR0395S 378 1 P CP chaperone for superoxide dismutase X sp|Q9WU84|CCS_MOUSE 60 5.00E-37 76/125
MCOR0396S 359 1 P UF Hypothetical protein CBG02169 X >emb|CAE58912.1| 81 2.00E-23 49/60
MCOR0397S 409 1 P UF putative Ariadne-like ubiquitin ligase PAUL X >gb|AAQ55547.1| 81 6.00E-64 103/126
MCOR0398S 499 1 NH no hit
MCOR0399S 473 1 NH no hit
MCOR0400S 374 1 FP CE alpha actin X >gb|AAU25922.1| 91 5.00E-31 64/70
MCOR0401S 349 1 NH no hit
MCOR0402S 525 1 NH no hit
MCOR0403S 192 1 P CD membrane-bound aminopeptidase P X >gb|AAK52065.1| 85 1.00E-25 51/60
MCOR0404S 504 1 P TP phospholipase A2 X >gb|AAN60018.1| 76 1.00E-68 127/167
MCOR0405S 401 1 P CR N-acetylglucosamine kinase X ref|NP_001032857.1| 72 9.00E-47 87/120
MCOR0406S 428 1 P CR ADP-ribosylhydrolase like 2 X >ref|NP_001006312.1| 78 2.00E-56 110/140
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0407S 188 1 P CT similar to ribosomal protein S27 isoform 2 X >ref|XP_886008.1 95 2.00E-20 45/47
MCOR0408S 423 1 P CP Sec61a1-prov protein X >gb|AAH45117.1| 92 1.00E-68 128/138
MCOR0409S 424 1 P CT 40S ribosomal protein S27 X sp|P47904|RS27_XENLA 85 2.00E-32 64/75
MCOR0410S 467 1 FP CP similar to Metaxin 2 X ref|XP_421989.1| 89 3.00E-70 132/148
MCOR0411S 397 1 P CT eukaryotic translation elongation factor X >gb|AAV66397.1| 89 6.00E-59 114/128
MCOR0412S 254 1 P CT 60S ribosomal protein L3 X gb|AAH09655.1| 21 3.00E-38 76/83
MCOR0413S 184 1 NH no hit
MCOR0414S 386 1 FP CR similar to S100 calcium binding protein X ref|XP_547580.1| 59 1.00E-21 57/96
MCOR0415S 487 1 P OF solute carrier family 26, member 11 X >ref|NP_001014866.1| 77 3.00E-63 125/162
MCOR0416S 497 1 FF CT 40S ribosomal protein S14 X sp|P62263|RS14_HUMAN 99 2.00E-79 148/149
MCOR0417S 508 1 P CR similar to Diablo homolog, mitochondrial X >ref|XP_415152.1| 82 5.00E-66 130/157
MCOR0418S 322 1 P CD poly-ubiquitin precursor X >gb|AAA31133.1| 100 7.00E-39 81/81
MCOR0419S 494 1 P CE putative collagen alpha-2 (XI) chain X >gb|AAA67751.1| 50 1.00E-31 66/130
MCOR0420S 525 1 NH no hit
MCOR0421S 540 1 NH no hit
MCOR0422S 500 1 P CE Keratin, type I cytoskeletal 19 X sp|O93256|K1C19_CHICK 85 2.00E-74 142/166
MCOR0423S 426 1 FP CR similar to recombination protein REC14 X >ref|XP_413745.1| 90 2.00E-66 117/129
MCOR0424S 469 1 P CM muscle phosphofructokinase X >ref|NP_989554.1| 84 5.00E-59 105/124
MCOR0425S 526 1 P OF Annexin A2 (Annexin II) (Lipocortin II) X sp|P17785|ANXA2_CHICK 94 2.00E-86 156/165
MCOR0426S 319 1 NH no hit
MCOR0427S 542 1 P OF inosine monophosphate dehydrogenase X >ref|NP_001025772.1| 97 1.00E-95 176/180
similar to lysophosphatidic acid
MCOR0428S 159 1 P OF acyltransferase X >ref|XP_415422.1| 78 1.00E-18 41/52
MCOR0429S 424 1 P CT similar to Transcription factor BTF3 X >ref|XP_423823.1| 95 3.00E-66 133/139
MCOR0430S 428 1 P OF nicastrin X >gb|AAR25612.1| 62 2.00E-44 92/147
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0431S 553 1 FP CT similar to RD RNA-binding protein isoform X ref|XP_591872.2| 70 9.00E-52 111/157

MCOR0432S 562 1 P CT Sf3b3 protein / Splicing factor 3b, subunit 3 X >gb|AAH31197.2| 100 3.00E-75 137/137
MCOR0433S 420 1 P CE similar to protocadherin 17; protocadherin X >ref|XP_417021.1| 94 7.00E-76 132/139
MCOR0434S 518 1 FP CT SWI/SNF related, matrix associated X sp|Q5ZK40|SNF5_CHICK 96 1.00E-93 165/171
MCOR0435S 532 1 FP OF similar to B-cell receptor-associated protein X >ref|XP_538200.1| 79 5.00E-73 140/177
MCOR0436S 508 1 P RT similar to reverse transcriptase like family X >ref|XP_783162.1| 38 1.00E-14 43/112
MCOR0437S 559 1 P CT eukaryotic translation inititation factor 4B X >gb|AAL54908.1| 98 e-101 180/183
MCOR0438S 370 1 FF CT 60S ribosomal protein L39 X sp|Q98TF5|RL39_CHICK 100 2.00E-23 51/51
MCOR0439S 478 1 FP CR Calgizzarin X sp|P24479|S10AB_CHICK 85 9.00E-37 76/89
MCOR0440S 533 1 P OF similar to nuclease sensitive element X >ref|XP_848660.1| 84 7.00E-10 32/38
MCOR0441S 495 1 FF CT similar to ribosomal protein S24 X ref|XP_864468.1| 96 7.00E-67 125/130
MCOR0442S 521 1 P CM Phosphoglycerate mutase 2 X sp|P15259|PGAM2_HUMAN 83 6.00E-78 141/168
MCOR0443S 482 1 P DT Snake BP-II gene for phospholipase A2 N dbj|D13384.1|TFLPLABPII 89 4.00E-26 97/108
MCOR0444S 408 1 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 85 8.00E-35 67/78
MCOR0445S 433 1 P TNtx alpha neurotoxin homolog 3 (NXH3) N >gb|AF197564.1|AF197564 92 e-121 398/432
MCOR0446S 452 1 NH no hit
MCOR0447S 153 1 NH no hit
MCOR0448S 473 1 FF CT similar to 60S acidic ribosomal protein X >ref|XP_424134.1| 93 5.00E-52 107/115
MCOR0449S 544 1 FF OF Parvalbumin beta X >sp|P02615|PRVB_BOACO 87 4.00E-47 95/108
MCOR0450S 386 1 P CD 26S proteasome subunit X dbj|BAD93292.1| 87 1.00E-23 54/62
MCOR0451S 493 1 P DT Ohanin precursor, gene N >gb|DQ103590.1| 91 8.00E-49 141/154
MCOR0452S 388 1 P OF Copz1 protein / similar to Coatomer X >gb|AAH25041.1| 91 3.00E-56 109/119
MCOR0453S 493 1 P DT Ohanin precursor, gene, complete cds N >gb|DQ103590.1| 93 5.00E-07 41/44
MCOR0454S 361 1 P TNtx mRNA for short chain neurotoxin N >dbj|AB017945.1| 98 4.00E-56 120/122
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0455S 322 1 P TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 100 1.00E-23 49/49
MCOR0456S 387 1 P CT ribosomal protein L14 X gb|AAL54903.1| 78 2.00E-35 81/103
MCOR0457S 366 1 P CE similar to Alpha-tectorin precursor X >ref|XP_546475.2| 42 3.00E-19 47/111
MCOR0458S 550 1 P CT elongation factor RNA polymerase II X ref|NP_001012865.1| 77 1.00E-68 133/172
MCOR0459S 577 1 NH no hit
MCOR0460S 262 1 P MT cytochrome oxidase subunit 3 X ref|YP_313713.1| 83 9.00E-26 59/71
MCOR0461S 587 1 FP CE zinc finger protein 593 X >ref|NP_001006307.1| 79 2.00E-54 102/128
MCOR0462S 177 1 P TNtx muscarinic toxin precursor X gb|ABB83639.1| 58 3.00E-06 27/46
MCOR0463S 534 1 P CD Proteasome (prosome, macropain) 26S X >gb|AAH73165.1| 96 5.00E-67 128/133
MCOR0464S 380 1 P TNtx muscarinic toxin precursor X >gb|ABB83639.1| 43 3.00E-09 32/74
MCOR0465S 458 1 P UF unnamed protein product X >dbj|BAB70838.1| 60 1.00E-06 25/41
MCOR0466S 334 1 P CT similar to 60S ribosomal protein L8 X >ref|XP_416772.1| 95 5.00E-55 105/110
MCOR0467S 366 1 FP TP phospholipase A2 X >gb|AAN60018.1| 85 5.00E-56 101/118
MCOR0468S 542 1 P RT predicted CDS, reverse transcriptase X >ref|XP_780819.1| 45 3.00E-10 45/98
MCOR0469S 522 1 NH no hit
MCOR0470S 431 1 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 97 8.00E-40 76/78
MCOR0471S 545 1 P CR interferon, gamma-inducible protein 30 X >ref|NP_001017196.1| 58 6.00E-58 106/180
MCOR0472S 343 1 NH no hit
MCOR0473S 534 1 FF CT ribosomal protein S10 X sp|P46783|RS10_HUMAN 98 6.00E-90 159/161
MCOR0474S 554 1 P CD similar to Microsomal signal peptidase X ref|XP_417247.1| 90 2.00E-93 166/183
MCOR0475S 334 1 P UF hypothetical protein XP_498725 X ref|XP_498725.2| 65 6.00E-19 47/72
MCOR0476S 428 1 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 100 4.00E-41 78/78
MCOR0477S 578 1 NH no hit
MCOR0478S 463 1 P CT similar to endothelial differentiation X >ref|XP_537793.2| 85 4.00E-65 126/147
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0479S 449 1 P TNtx muscarinic toxin precursor X >gb|ABB83639.1| 46 2.00E-11 36/77

MCOR0480S 345 1 P DT b1 gene for beta-bungarotoxin B1 chain N >emb|AJ251223.1|BMU251223 88 4.00E-25 101/114
MCOR0481S 555 1 FF CE apolipoprotein B mRNA editing enzyme X >ref|NP_001026732.1| 98 4.00E-78 148/151
MCOR0482S 409 1 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 98 5.00E-40 76/77
MCOR0483S 417 1 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 100 2.00E-40 77/77
MCOR0484S 512 1 FF CT ribosomal protein L27a X ref|NP_036105.2| 86 1.00E-79 139/148
MCOR0485S 400 1 P OF nuclease sensitive element binding X >ref|NP_989745.1| 85 2.00E-26 57/67
MCOR0486S 409 1 P TNtx Alpha-neurotoxin homolog 8 precursor X sp|P58370|NXAH8_MICCO 93 1.00E-30 58/62
MCOR0487S 437 1 FP CT 60S ribosomal protein L13a X gb|AAZ38985.1| 95 1.00E-74 138/144
MCOR0488S 349 1 P TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 100 2.00E-30 59/59
MCOR0489S 476 1 NH no hit
MCOR0490S 409 1 P TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 94 6.00E-27 53/56
MCOR0491S 419 1 P TP phospholipase A2 X >gb|AAN60018.1| 92 1.00E-42 77/83
MCOR0492S 409 1 FF CT 60S ribosomal protein L41 X sp|P62945|RL41_HUMAN 100 2.00E-06 25/25
MCOR0493S 449 1 FF CT 60S ribosomal protein L30 X sp|P67884|RL30_OPHHA 97 7.00E-58 112/115
MCOR0494S 493 1 P TP phospholipase A2 X >gb|AAN60018.1| 96 2.00E-32 62/64
MCOR0495S 444 1 P TP phospholipase A2 X >gb|AAN60018.1| 95 3.00E-68 116/121
MCOR0496S 493 1 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 8 precursor X sp|P58370|NXAH8_MICCO 95 1.00E-44 82/86
MCOR0497S 382 1 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 8 precursor X sp|P58370|NXAH8_MICCO 92 1.00E-42 79/85
MCOR0498S 380 1 P TNtx isolate ctx23 cardiotoxin precursor N >gb|DQ273581.1| 89 2.00E-52 172/192
MCOR0499S 537 1 FP CT ribosomal protein L7 X >ref|NP_001006345.1| 88 6.00E-84 155/176
MCOR0500S 518 1 NH no hit
MCOR0501S 287 1 P UF similar to apoA-I binding protein X >ref|XP_424208.1| 74 7.00E-36 71/95
MCOR0502S 301 1 P CT similar to ubiquitin and ribosomal X gb|AAI02492.1| 90 5.00E-39 83/92
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0503S 370 1 P CE ficolin X >ref|NP_056652.1| 74 7.00E-07 23/31

MCOR0504S 473 1 P MT cytochrome-c oxidase subunit II X >gb|AAL55554.1| 79 3.00E-65 123/155
MCOR0505S 474 1 NH no hit
MCOR0506S 521 1 NH no hit
MCOR0507S 454 1 NH no hit
MCOR0508S 561 1 P RT reverse transcriptase X >dbj|BAD72127.1| 58 5.00E-08 33/56
MCOR0509S 581 1 FF TP phospholipase A2 X >gb|AAN60018.1| 97 8.00E-81 137/140
MCOR0510S 506 1 NH no hit
MCOR0511S 393 1 P DT Ohanin precursor, gene, complete cds N >gb|DQ103590.1| 87 3.00E-26 116/132
MCOR0512S 503 1 FP CT 39S ribosomal protein L13, mitochondrial X sp|Q9BYD1|RM13_HUMAN 83 1.00E-79 138/165
MCOR0513S 460 1 NH no hit
MCOR0514S 528 1 NH no hit
MCOR0515S 500 1 P CT similar to ribosomal protein S24 X >ref|XP_521519.1| 99 2.00E-52 101/102
MCOR0516S 289 1 P CR Gamma-aminobutyric acid receptor X sp|O95166|GBRAP_HUMAN 100 4.00E-08 26/26
MCOR0517S 396 1 FF MT NADH dehydrogenase subunit 4L X >gb|AAY67987.1| 77 1.00E-30 70/89
MCOR0518S 482 1 P CT similar to ribosomal protein S19 X >ref|XP_533657.2| 98 2.00E-77 144/146
MCOR0519S 474 1 FP TNtx muscarinic toxin precursor X >gb|ABB83639.1| 65 2.00E-10 32/49
MCOR0520S 516 1 P TNtx Alpha-neurotoxin homolog 8 precursor X sp|P58370|NXAH8_MICCO 94 1.00E-36 66/70
MCOR0521S 525 1 P OF similar to lipoic acid synthetase isoform X >ref|XP_536255.1| 87 4.00E-69 127/145
MCOR0522S 497 1 FP CT similar to ribosomal protein L14 X >ref|XP_418775.1| 87 7.00E-67 120/137
MCOR0523S 534 1 P DN bradykinin-potentiating/C-type natriuretic N gb|AY310916.1| 89 8.00E-09 53/59
MCOR0524S 194 1 P TNtx Alpha-neurotoxin homolog 8 precursor X sp|P58370|NXAH8_MICCO 91 2.00E-20 43/47
MCOR0525S 359 1 NH no hit
MCOR0526S 399 1 P TW similar to WAP four-disulfide core X >ref|XP_875467.1| 54 2.00E-10 26/48
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0527S 528 1 FF CR FK506-binding protein 2 precursor X sp|P45878|FKBP2_MOUSE 82 2.00E-59 112/135

MCOR0528S 573 1 NH no hit
MCOR0529S 494 1 NH no hit
NADH dehydrogenase 1 beta subcomplex 4 /
MCOR0530S 495 1 FF CM Ndufb4 protein / NADH-ubiquinone X gb|AAH96421.1| 56 2.00E-37 71/126
MCOR0531S 429 1 P CR high density lipoprotein binding protein X sp|P81021|VIGLN_CHICK 97 2.00E-73 139/142
MCOR0532S 574 1 FF CD similar to Ufm1-conjugating enzyme 1 X >ref|XP_536135.1| 88 1.00E-87 145/164
MCOR0533S 555 1 FF CT 60S ribosomal protein L18 X sp|P69090|RL18_OREMO 90 3.00E-91 164/181
MCOR0534S 421 1 NH no hit
MCOR0535S 484 1 P CT Transcription initiation factor IIA X sp|P52657|T2AG_HUMAN 95 2.00E-37 76/80
MCOR0536S 528 1 P CR Peroxisomal membrane protein 11B X sp|O96011|PX11B_HUMAN 63 3.00E-40 88/138
MCOR0537S 646 1 P UF similar to RIKEN cDNA 1110015K06 X >ref|XP_414768.1| 94 E-116 202/213
MCOR0538S 334 1 P CT Elongation factor 1-gamma (EF-1-gamma) X sp|P29694|EF1G_RABIT 81 6.00E-34 67/82
MCOR0539S 344 1 FF TNtx Short neurotoxin homolog NTL4 precursor X sp|Q9YGI8|NXSH4_BUNMU 59 3.00E-22 51/86
MCOR0540S 428 1 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 100 4.00E-41 78/78
MCOR0541S 360 1 P CM isocitrate dehydrogenase 2 (NADP+) X ref|NP_955858.1| 72 1.00E-15 37/51
MCOR0542S 550 1 P CT ATP-dependent RNA helicase DDX39 X sp|O00148|DDX39_HUMAN 96 2.00E-44 90/93
MCOR0543S 431 1 FF TNtx alpha-neurotoxin-type protein 1 X sp|Q9PUB7|NXAH1_MICCO 100 5.00E-41 78/78
MCOR0544S 561 1 P CM similar to 3,2-trans-enoyl-CoA isomerase X >gb|AAH78332.1| 95 6.00E-29 64/97
MCOR0545S 456 1 P CE Microtubule-associated protein RP/EB X sp|Q66HR2|MARE1_RAT 64 4.00E-48 98/152
MCOR0546S 458 1 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 8 precursor X sp|P58370|NXAH8_MICCO 80 5.00E-33 69/86
MCOR0547S 307 1 P OF ADP/ATP carrier protein X >gb|AAB96347.1| 88 5.00E-47 90/102
MCOR0548S 600 1 P OF CD9 antigen X >ref|NP_990093.1| 55 3.00E-26 57/102
MCOR0549S 588 1 NH no hit
MCOR0550S 528 1 P TNtx ctx-1 gene, exons 1-3 N >emb|AJ238736.1|NNA238736 86 3.00E-11 75/87
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0551S 378 1 P TB natriuretic peptide X gb|AAC60341.1| 77 7.00E-22 55/71

MCOR0552S 465 1 FF TNtx Cytotoxin 7 precursor (Cardiotoxin 7) X sp|P49122|CX7_NAJAT 51 5.00E-16 42/82
MCOR0553S 339 1 P MT Dinodon semicarinatus mitochondrion >ref|NC_001945.1| 84 2.00E-42 240/284
MCOR0554S 272 1 NH no hit
MCOR0555S 413 1 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 98 6.00E-37 72/73
MCOR0556S 463 1 P CD autocrine motility factor receptor X >gb|AAD56722.1| 74 2.00E-58 116/155
MCOR0557S 455 1 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 100 4.00E-41 78/78
MCOR0558S 528 1 NH no hit
MCOR0559S 537 1 P CT similar to Rpl24 protein X >ref|XP_416616.1| 95 2.00E-80 152/160
MCOR0560S 483 1 NH no hit
MCOR0561S 568 1 P CP Translocon-associated protein delta X sp|Q62186|SSRD_MOUSE 79 6.00E-70 129/162
MCOR0562S 584 1 NH no hit
Ribosomal protein S6 kinase I (S6K) (p70-
MCOR0563S 553 1 P CR S6K) X sp|Q8BSK8|KS6B1_MOUSE 83 1.00E-47 89/107
MCOR0564S 407 1 FP CT 40S ribosomal protein S7 X sp|P62081|RS7_HUMAN 90 1.00E-34 79/87
MCOR0565S 527 1 P MT NADH-ubiquinone oxidoreductase X sp|O79557|NU6M_DINSE 70 4.00E-39 84/119
MCOR0566S 415 1 FF CT 40S ribosomal protein S26 X sp|P62854|RS26_HUMAN 98 7.00E-62 113/115
MCOR0567S 331 1 P UF musculoskeletal, embryonic nuclear X ref|NP_995325.1| 68 6.00E-09 33/48
MCOR0568S 423 1 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 100 4.00E-41 78/78
MCOR0569S 275 1 P TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 97 2.00E-20 43/44
MCOR0570S 457 1 FF MT similar to Ubiquinol-cytochrome c reductase X ref|XP_850254.1 74 2.00E-31 68/91
MCOR0571S 400 1 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 100 6.00E-40 76/76
MCOR0572S 466 1 NH no hit
MCOR0573S 410 1 NH no hit
MCOR0574S 234 1 NH no hit
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0575S 516 1 FP CT 60S ribosomal protein L18a X sp|Q02543|RL18A_HUMAN 98 2.00E-92 163/166

MCOR0576S 519 1 P UF ancient ubiquitous protein 1 isoform 2 X >ref|NP_001015555.1| 48 3.00E-25 63/131
MCOR0577S 461 1 P OF Ewing sarcoma breakpoint region 1 X gb|AAH68226.1| 85 4.00E-73 131/153
MCOR0578S 457 1 P RT transposon protein, putative, CACTA X gb|AAP51898.1| 34 7.00E-06 33/96
MCOR0579S 532 1 FP OF grancalcin X sp|Q8VC88|GRAN_MOUSE 63 4.00E-43 87/136
MCOR0580S 507 1 NH no hit
MCOR0581S 553 1 FF CT Histone deacetylase complex subunit X sp|O00422|SAP18_HUMAN 98 1.00E-83 150/153
MCOR0582S 417 1 P CR phospholipase C beta type X gb|AAA03065.1| 71 5.00E-47 99/139
MCOR0583S 408 1 P MT Cytochrome b X sp|Q9MLI9|CYB_MICFL 87 2.00E-59 114/131
MCOR0584S 428 1 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 100 4.00E-41 78/78
MCOR0585S 531 1 NH no hit
MCOR0586S 197 1 NH no hit
MCOR0587S 448 1 FF CT ribosomal protein S15 isoform X gb|AAH97585.1| 99 8.00E-66 123/124
MCOR0588S 466 1 NH no hit
MCOR0589S 375 1 NH no hit
MCOR0590S 448 1 P CR nucleotide binding protein 2 X >ref|NP_001007834.1| 86 7.00E-68 127/146
MCOR0591S 491 1 P CR similar to CBL E3 ubiquitin protein ligase X >ref|XP_576396.1| 39 1.00E-17 60/153
MCOR0592S 278 1 P UF similar to Nur77 downstream protein 2 X >ref|XP_415224.1| 83 2.00E-06 25/30
MCOR0593S 320 1 NH no hit
MCOR0594S 434 1 P CT Rpl17 protein X >gb|AAH03896.2| 100 4.00E-50 100/100
MCOR0595S 358 1 P MT NADH dehydrogenase subunit 1 X >gb|AAL66854.1| 85 3.00E-31 66/77
MCOR0596S 479 1 FP CR nucleotide binding protein 2 X >ref|NP_001007834.1| 80 4.00E-26 58/72
MCOR0597C 418 8 FF TNtx alpha-neurotoxin-type protein 1 X sp|Q9PUB7|NXAH1_MICCO 100 5.00E-41 78/78
MCOR0598C 427 6 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 98 1.00E-40 77/78
 N° de Clones Categoria
CLUSTER Tamanho (pb) FULL PRODUTO Blast Accession N° % ID e-value overlap
no Cluster 1aria

MCOR0599C 438 36 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 100 4.00E-41 78/78
MCOR0600C 423 25 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 7 precursor X sp|Q9PRI1|NXAH7_MICCO 100 4.00E-41 78/78
MCOR0601S 297 1 P TNtx alpha-neurotoxin-type protein 1 X sp|Q9PUB7|NXAH1_MICCO 100 1.00E-19 42/42
MCOR0602C 598 2 FF TL C-type lectin-like protein 2 X >gb|AAK43585.1| 72 6.00E-55 91/126
MCOR0603C 612 6 FP TL C-type lectin-like protein 2 X >gb|AAK43585.1| 71 3.00E-63 108/151
MCOR0604C 488 4 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 8 precursor X sp|P58370|NXAH8_MICCO 100 4.00E-48 86/86
MCOR0605C 500 5 FF TNtx Alpha-neurotoxin homolog 8 precursor X sp|P58370|NXAH8_MICCO 100 4.00E-48 86/86
MCOR0606S 384 1 P CT ribosomal protein S3 X >gb|AAD27643.1| 93 8.00E-29 60/64
MCOR0607S 458 1 P TP phospholipase A2 X >gb|AAN60018.1| 100 4.00E-71 119/119
MCOR0608S 335 1 P TP phospholipase A2 X >gb|AAN60018.1| 100 3.00E-45 81/81
MCOR0609S 448 1 FP TP phospholipase A2 X >gb|AAN60018.1| 97 3.00E-58 104/107
MCOR0610S 352 1 FP CD ubiquitin X gb|AAV84266.1| 100 2.00E-59 117/117
MCOR0611S 398 1 FF TK trypsin inhibitor preproprotein X >gb|AAP04484.1| 59 1.00E-25 53/89

e-value: valor significativo da sequência no NR protein database

FULL?: clones parciais (P), clones inteiros mas com sequenciamento incompleto (FP) e clones inteiros e com sequências completas (FF)
% ID: percentual da sequência obtida na comparação com o banco de dados
overlap: quanto da sequência apresenta semelhança com o banco de dados