UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS - UFAL

CENTRO DE TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MATERIAIS

CASSIO ERACLITO ALVES DOS SANTOS

SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS E SUAS

APLICAÇÕES EM BIOLOGIA

Maceió
2015
 CÁSSIO ERÁCLITO ALVES DOS SANTOS

SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS E SUAS

APLICAÇÕES EM BIOLOGIA

Tese de doutorado apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Materiais da Universidade
Federal de Alagoas, como requisito para obtenção
do título de Doutor em Materiais.

Orientador: Dr. Jandir Miguel Hickmann

Co-Orientador: Dr. Emiliano de Oliveira Barreto

Maceió
2015
 Catalogação na fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
Divisão de Tratamento Técnico
Bibliotecária Responsável: Maria Helena Mendes Lessa

S237s Santos, Cássio Eráclito Alves dos.

Síntese e caracterização de nanopartículas metálicas e suas aplicações em
biologia / Cássio Eráclito Alves dos Santos. – Maceió, 2015.
79 f. : il.

Orientador: Jandir Miguel Hickmann.

Coorientador: Emiliano de Oliveira Barreto.
Tese (Doutorado em Materiais) – Universidade Federal de Alagoas. Centro
de Tecnologia. Programa de Pós-Graduação em Materiais. Maceió, 2015.

Bibliografia: f. 73-79.

1. Nanopartículas – Síntese. 2. Ouro. 3. Prata. 4. Copaíba.

5. Biossensor. I. Título.

CDU: 53.047
 17

In memorian

Maura Pedrosa dos Santos

 18

AGRADECIMENTOS

Quero aqui expressar os meus sinceros agradecimentos a todos que me ajudaram

durante este trabalho:
 Aos Professores e amigos Dr. Jandir M. Hickmann (Orientador) e Dr.
Emiliano Barreto (Co-Orientador) primeiramente pela amizade e confiança e
seus valiosos ensinamentos durante todo esse processo, sem dúvida o que
vocês me ensinaram mudou minha vida.

 A Universidade Federal de Alagoas pela criação inovadora do Programa de

Pós-graduação em Materiais com abordagem multidisciplinar permeado os
institutos de Física, Química, ciências Biológicas e da Saúde e centro
tecnológico ao qual tive o prazer e satisfação em participar.

 Agradeço aos Professores do Grupo de Optica e Materiais, Prof. Dilson, Prof.

Eduardo e Prof. Márcio pelo apoio e incentivo ao estudo e a pesquisa.

 Aos colegas de turma que sempre me auxiliaram a superar as dificuldades das

disciplinas do programa de Pós Graduação em Materiais (PPGM).

 Aos meus amigos e irmãos Rafael Vidal, Paulo Sergio Carvalho, Laís Agra,
Fabíola Brito, Jamylle Ferro, Anderson Albuquerque, Isabela Fraga, João
Paulo Noé e se esqueci o nome de alguém me perdoe por favor,

 Aos amigos do Optma, que estão ou passaram por lá: Rogério, Itamar,
Amadeu, Samuel, Geovana, Cássia, Ana Rúbia, Alcenísio, Hemerson Pablo,
Marlon, Vanessa, Ítalo e em especial a Patrícia.
 Ao meu amigo Robert pelas discussões em inglês, obrigado Robert me ajudou
muito.

 A todos os professores do Programa, em especial a Marcio Alencar, Eduardo

Fonseca, Severino Marques, Osimar Silva, Solange Cavalcanti pela minha
formação intelectual.

 Ao apoio das instituições de fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico – CNPq e Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior – CAPES.

 E em especial a minha esposa Lidiane pelo carinho, compreensão e paciência

durante essa longa jornada que começou no mestrado, obrigado Lidiane

.
 19

"Não me sinto obrigado a acreditar que o mesmo Deus que nos dotou de sentidos, razão e
intelecto, pretenda que não os utilizemos."

(Galileu Galilei).
 20

RESUMO

As nanopartícula de ouro (NPAu) e de prata (NPAg) exibem uma variedade de efeitos e

aplicações na área biomédica. No presente estudo, nanopartículas de prata e ouro foram
sintetizadas e caracterizadas com objetivo avaliar seu efeito sobre a cicatrização de feridas e
sensoriamento de eotaxina, um analito de grande relevância para eventos inflamatórios. Em
um primeiro caso, NPAg foram sintetizadas por método químico de redução, e dispersas em
óleo de copaiba. Observou-se que todas NPAg tinham formas esféricas e se dispersaram no óleo
de copaiba. Essa composição NPAg mais óleo de copaiba mostrou-se mais eficaz para cicatrizar
feridas cutâneas do que a Dermazine, um medicamento de referência. Com as nanopartículas de
ouro (NPAu) foram sintetizadas por método químico de redução por citrato. Em seguida, estas
nanoestruturas foram funcionalizadas para confecção de um biossensor, com finalidade de
identificar o analito de escolha (eotaxina) por meio da identificação do deslocamento da banda
de ressonância de plasmon de superfície. Os resultados com este prótotipo do biosensor se
mostraram de grande potencial para deteccção da eotaxin em pequenas quantidades 15µL. As
partículas utilizadas neste estudo foram caracterizadas por espectroscopia de UV-vis e
microscopia eletrônica de transmissão, enquanto que aquelas associadas ao quartzo são
caracterizadas com espectroscopia UV-vis e microscopia de força atômica. Em conjunto, este
estudo revelou o potencial instalado na UFAL para síntese, caracterização e aplicação na área
biomédica de nanopartículas metálicas.

Palavras-chave: Nanopartículas-Síntese. Ouro. Prata. Óleo de Copaíba. Biossensor.

 21

ABSTRACT

The gold nanoparticles (NPAus) and silver (NPAgs) exhibit a variety of effects and
applications in the biomedical field. In this study, silver and gold nanoparticles were
synthesized and characterized in order to evaluate its effect on wound healing and sensing
eotaxin, an analyte of great relevance to inflammatory events. . In a first case, NPAgs were
synthesized by chemical reduction method and dispersed in copaiba oil. It was observed that
all NPAgs had spherical shapes and dispersed in copaiba oil. This composition NPAgs more
copaiba oil was more effective to heal skin wounds than Dermazine, a reference medicinal
product. With gold nanoparticles (NPAu) were synthesized by chemical methods by citrate
reduction. Then, these nanostructures are functionalized for making a biosensor, with the
purpose of identifying the analyte of choice (eotaxin) by identifying the displacement of the
surface plasmon resonance band. The results with this prototype of the great potential of
biosensor proved to detection of eotaxin in small quantities 15μL. The particles used in this
study were characterized by UV-vis spectroscopy and transmission electron microscopy,
while those associated with quartz are characterized with UV-vis spectroscopy and atomic
force microscopy. Together, this study revealed the potential installed in UFAL for synthesis,
characterization and application in the biomedical field of metal nanoparticles.

Key Words: Nanopartilces-Synthesis. Gold. Silver. Copaíba Oil, Biosensor.

 22

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Vasos contendo vidro rubi, feita no século 19. Vidro rubi foi fabricado durante
séculos, embora tenha sido apenas recentemente descoberto que o pigmento vermelho usado
contém nanopartículas de ouro. ----------------------------------------------------------------------- 21
Figura 2 - Detalhe de uma janela na Catedral de Altenberg. O vidro colorido manchado de
vermelho é composto por pequenas partículas de ouro coloidal que residem em uma matriz de
vidro. ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 22
Figura 3 - O Copo de Lycurgus. Esquerda imagem vista em luz refletida; direita imagem vista
da luz transmitida. -------------------------------------------------------------------------------------- 22
Figura 4 - Microscopia eletrônica de transmissão de diferentes nanopartículas de Au:
nanoesferas (A), nanocubos (B), nanoramos (C), nanobastões (D), nanobastões (E).
nanobastões (F), nanobipiramides (G). -------------------------------------------------------------- 23
Figura 5 - Comportamento da energia livre total ΔG como função do tamanho de crescimento
r da partícula. -------------------------------------------------------------------------------------------- 27
Figura 6 - Crescimento coloidal monodisperso do modelo de La Mer (Figura A) e aparato
típico de síntese de Nanopartículas via rota líquida (Figura B). ---------------------------------- 29
Figura 7. Resumo desenhado para realçar várias aplicações de NPAu com diferentes tipos de
conjugados de macromoléculas, como DNA, RNA, peptídeos e ácidos carboxílicos. -------- 34
Figura 8 - Quimissorção de cadeias de ácidos mercaptocarboxílico na superfície de em uma
nanopartícula de ouro.---------------------------------------------------------------------------------- 35
Figura 9 - Sistemas integrados de biomateriais e elementos eletrônicos para aplicações em
biossensores.--------------------------------------------------------------------------------------------- 38
Figura 10 - Usos de nanopartículas de prata NPs de prata (lado esquerdo) e prata (lado direito)
em medicina. -------------------------------------------------------------------------------------------- 40
Figura 11 - Representação esquemática de um biossensor usando nanopartículas de ouro,
depositados sobre um substrato de quartzo. Da esquerda para a direita: fonte de luz, substrato
de quartzo; camada de adesão mercaptosilano; nanopartículas de ouro; monocamada de thiol,
anticorpos e antigenos. O resultante aumento de espectros de absorbância após a ligação do
analito mais anticorpo com as NPAus é mostrado do lado direito da figura. ------------------- 48
Figura 12 - Solução de Nanopartículas de Ouro figura A, Substrato com monocamada de
NPAu com thiol 6 MHA figura B. ------------------------------------------------------------------- 52
 23

Figura 13 - Gráficos de Absorção das NPAgs em água, mostra resonância de plasmo da prata
em torno de 420nm. ------------------------------------------------------------------------------------ 55
Figura 14 - Imagens de HRTEM de NPAgs dispersas em óleo de copaíba. -------------------- 56
Figura 15 - Imagens de HRTEM de NPAgs dispersas em óleo de copaíba. -------------------- 56
Figura 16 - Distribuição de tamanho da NPAgs realizado pela contagem do diâmetro de 100
partículas selecionadas aleatoriamente. -------------------------------------------------------------- 57
Figura 17 - Análise histológica no 10º dia de experimento da remodelação da epiderme/derme
dos animais tratados com veículo (salina); com óleo de copaíba, controle negativo; com a
associação entre óleo de copaíba e nanopartículas de prata (NPAgCO); e com o fármaco de
referência, Dermazine. Secções de pele coradas com hematoxilina e eosina. Aumento de 10x.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 59
Figura 18 - Análise histopatológica no 10º dia de experimento da deposição de colágeno nos
animais tratados com veículo (salina); com óleo de copaíba; com a associação entre óleo de
copaíba e nanopartículas de prata (NPAg+OC); e com o fármaco de referência, Dermazine.
Secções de pele coradas com tricrômio de Masson, com propriedade de corar em azul as
fibras colágenas. Aumento de 20x. ------------------------------------------------------------------- 60
Figura 19 - Distribuição de tamanho da NPAu realizado pela contagem do diâmetro de 350
partículas (Figura B) e imagens de HRTEM de NPAus dispersas em água (Figuras A e C) - 62
Figura 20 - Gráficos de Absorção das NPAus em água, mostra ressonância de plasmon do
ouro (Figura A) e solução de NPAus utilizada para realizar filmes de monocamadas (Figura
B). --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 63
Figura 21 - Monocamada de ouro nanoparticulado sobre uma lâmina de vidro (Figura A e B)
e o gráfico apresentando a ressonância de plasmo do ouro em solução e sobre a lâmina de
vidro (Figura C). ---------------------------------------------------------------------------------------- 63
Figura 22 - Imagens de Microscópia de Força Atômica mostrando a distribuição (Figura A e
B) e o tamanho (Figura C) do “cluster” de ouro sobre o substrato de vidro.-------------------- 65
Figura 23 - Imagens de Microscópia de Força Atômica mostrando a distribuição em
monocamadas (Figura A e C), a altura (Figura B) e o tamanho (Figura D) dos “clusters” de
ouro sobre o substrato. --------------------------------------------------------------------------------- 66
Figura 24 - Espectro de absorção das NPAus na revestida com anti-eotaxina a anti-eotaxina
conjugada com o antígeno (eotaxin). ----------------------------------------------------------------- 67
 24

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Alguns exemplos de aplicações de nanopartículas usadas em Nanobiotecnologia. 19

Tabela 2 - Exemplos de empresas que comercializam os nanomateriais para aplicações
biológicas e médicas. ----------------------------------------------------------------------------------- 20
Tabela 3 - Principais métodos químicos e físicos para síntese de nanopartículas. ------------- 26
Tabela 4 - Efeito do tratamento com colóide no modelo de ferida infectada. ------------------ 61
 25

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AFM Microscopia de força atômica

Ag Prata
Au Ouro
AgNO3 Nitrato de prata
CCD Dispositivos de carga acoplada
C6H5Na3O7 Citrato de Sódio
CH4O Metanol
CTENE Centro de Tecnologia do Nordeste
DNA Ácido Desoxirribonucléico
EDS Energia dispersiva de espectroscopia de raios-X
EPM Erro padrão da média
ERO Espécies reativas de oxigênio
GOD Glicose oxidase
kV Kilovolt
HRTEM. Microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução
HauCl4.3H2O Ácido cloroáutico
HCl Ácido clorídrico
HNO3 Ácido nítrico
H2O2 Peróxido de hidrogênio
NH4OH Hidróxido de amónio
nm Nanomêtro
NPs Nanopartículas
NPAus Nanopartículas de ouro
NPAgs Nanopartículas de prata
NaCl Cloreto de Sódio (Solução Salina)
NaBH4 Boroidreto de sódio
 26

NaOH Hidróxido de sódio

OC Óleo de copaíba
OC-NanoAg Óleo de copaíba associado a nanopartículas de prata
PID Realimentação eletrônica
SPR Ressonância de plasma de superfície
TEM Microscopia eletrônica de transmissão
UV-Vis Ultra Violeta e Visível
UV-Vis-NIR Ultra violeta visível infravermelho próximo
UFC Unidades Formadoras de Colônias
6 MHA Ácido 6-Mercaptohexanoic
 27

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ----------------------------------------------------------------------------- 16
2 NANOTECNOLOGIA: FUNDAMENTOS E APLICAÇÕES -------------------- 18
2.1 NANOPARTÍCULAS METÁLICAS --------------------------------------------------- 21
2.2 SÍNTESE DE NANOPARTÍCULA METÁLICA ------------------------------------ 25
2.2.1 Métodos de Síntese de Nanopartículas Metálica ---------------------------------------- 25
2.2.2 Nucleação ------------------------------------------------------------------------------------- 27
2.2.3 Crescimento das Nanopartículas ----------------------------------------------------------- 29
2.3 Métodos de caracterização das nanopartículas--------------------------------------- 31
2.3.1 Espectrofotometria óptica UV-visível. ---------------------------------------------------- 31
2.3.2 Microscopia eletrônica de transmissão---------------------------------------------------- 31
2.3.3 Microscopia de força atômica -------------------------------------------------------------- 32
2.4 Aplicações das nanopartículas ----------------------------------------------------------- 33
2.4.1 Senssoreamento ------------------------------------------------------------------------------ 36
2.4.2 Terapêutica ----------------------------------------------------------------------------------- 38
3 OBJETIVO ---------------------------------------------------------------------------------- 41
3.1 Objetivo geral ------------------------------------------------------------------------------- 41
3.1.1 Objetivos específicos ------------------------------------------------------------------------ 41
4 PROCESSOS DE CICATRIZAÇÃO -------------------------------------------------- 42
5 METODOLOGIA -------------------------------------------------------------------------- 45
5.1 Síntese de NPAgs --------------------------------------------------------------------------- 45
5.2 Modelo de ferida excisional e tratamento --------------------------------------------- 46
5.3 Síntese de NPAus --------------------------------------------------------------------------- 47
5.3.1 Modelo do biossensor utilizando NPAus ------------------------------------------------- 47
5.3.2 Alvo do biossensor -------------------------------------------------------------------------- 48
5.3.3 Preparação dos substratos de quartzo ----------------------------------------------------- 51
5.4 Medidas de espectrofotometria óptica UV-Vis --------------------------------------- 52
5.5 Medidas de microscopia eletrônica de transmissão ------------------------------ 53
5.6 Medidas de microscopia força atômica ------------------------------------------------ 54
6 RESULTADOS ----------------------------------------------------------------------------- 55
6.1 Efeitos sobre a cicatrização de feridas infectadas ------------------------------------ 57
 28

6.2 Efeitos sobre Biossensores ---------------------------------------------------------------- 62

7 DISCUSSÃO -------------------------------------------------------------------------------- 68
8 CONCLUSÕES ----------------------------------------------------------------------------- 72
REFERÊNCIAS-----------------------------------------------------------------------------74
 16

1 INTRODUÇÃO

A nanotecnologia ampliou o uso de novos materiais em diferentes setores da sociedade.

Atualmente, é possível encontrar produtos produzidos a partir do conhecimento
nanotecnológico em vários setores da sociedade, tais como, eletrônicos, artigos esportivos,
pneus, roupas resistentes a manchas, cosméticos e medicamentos para diagnóstico, imagem e
entrega de fármacos (BORN, et al., 2006; DOWLING, et al., 2004)

A principal característica diferenciadora dos nanomateriais é seu tamanho, que se encontra

na dimensão dos átomos (HOET; SALATA, 2004). Sabe-se que, para um grupo de
nanopartículas em suspensão com massa fixa (10 mg/m3) e densidade unitária (1 g/cm3),
diminui o tamanho para menos de 100 nm, o número de partículas aumenta
exponencialmente, juntamente com a área da superfície (WEI YANGA; PETERSB;
WILLIAMS, 2008). Logo, o domínio sobre a síntese e modificação de materiais nesta escala
de tamanho é que impulsionou a nanotecnologia.

O prefixo “nano” deriva da palavra grega “anão”, a dimensão de um nanômetro (nm)

equivale a um bilionésimo de um metro, ou aproximadamente a largura de 6 átomos de
carbono ou 10 átomos de água moléculas. Para exemplificar a dimensão desta ordem de
grandeza, um cabelo humano tem aproximadamente 80.000 nm de largura, um glóbulo
vermelho possui aproximadamente 7.000 nm de largura, enquanto as proteínas podem variar
entre 1 - 20 nm (GM, 2003).

A crescente necessidade da área de biotecnologia compreender fenômenos abaixo da

escala molecular impulsionou o desenvolvimento de dispositivos e novos materiais capazes
manipular fenômenos em escala nanométrica, daí o termo nanobiotecnologia. Pesquisas nesta
área vêm possibilitando grandes avanços no campo do diagnóstico e desenvolvimento de
fármacos. Por exemplo, o desenvolvimento/uso de semicondutores pontos quânticos como
biomarcadores em investigação em biologia celular classificaria como ações da área de
nanobiotecnologia.

Inicialmente, os primeiros conceitos sobre a nanotecnologia foram apresentados em

1959 pelo físico Richard Feynman em sua palestra, com tema “There’s plenty of room at the
 17

bottom”. Feynman explorou a possibilidade de manipular materiais na escala dos átomos e

moléculas individuais, imaginando o conjunto da Enciclopédia Britânica escrita na cabeça de
um alfinete prevendo a crescente capacidade de analisar e controlar materiais em nanoescala
(SAHOO; PARVEEN; PANDA, 2007).

Após os relatos de Feynman, este novo conhecimento passou a ser discutido pela
comunidade científica sem a definição de uma terminologia. Somente em 1974, Norio
Taniguchi, pesquisador da Universidade de Tóquio usou o termo “nanotecnologia” para se
referir à capacidade da engenharia de materiais precisamente a nível nanométrico. Desde
então, o termo nanotecnologia passou a ser usado. Em seguida, a miniaturização passou a ser
perseguida pela indústria de eletrônica, que teve como objetivo desenvolver ferramentas para
criar e manipular essas nanoestruturas. Um marco para a indústria foi conquistado pela IBM
nos Estados Unidos, que usou a técnica chamada de litografia por feixe de elétrons para criar
nanoestruturas e dispositivos tão pequenos quanto 40 e 70 nm (SAHOO; PARVEEN;
PANDA, 2007).

Portanto, considerando a grande relevância do tema, bem como os aspectos de

aplicação do conhecimento em nanotecnologia, este trabalho objetivou a apresentar aspectos
sobre síntese e caracterização de nanopartículas de prata e ouro para aplicações em biologia.
 18

2 NANOTECNOLOGIA: FUNDAMENTOS E APLICAÇÕES

A nanotecnologia é uma área multidisciplinar que possibilita a interação entre a física,

ciência dos materiais, biologia, engenharias e química (SCIENCEDAILY, 2013). Atualmente,
as pesquisas na área de nanotecnologia mostra-se promissora devido à ampla gama de
aplicações, especialmente em biomédica, óptica e eletrônica.

Como resultados das intensas pesquisas na área da nanotecnologia, podemos observar

uma série de aplicações para as nanopartículas nos mais diferentes campos1. No que confere
a aplicação de nanopartículas em biologia, o tamanho e sua distribuição tornam-se
extremamente crítica quando os efeitos quânticos são utilizados para controlar as propriedades
do material. Para ilustrar, na área biológica destaca-se a aplicação das nanopartículas
metálicas de prata como agente bactericida. Esta ação somente torna-se possível devido à
ação da prata em comprometer a respiração bacteriana, e consequentemente, seu crescimento.
O conhecimento sobre a atividade antimicrobiana das nanopartículas de prata impulsionou o
desenvolvimento de diversos produtos encontrados no comercio em geral. Como exemplo
pode ser destacado a presença de nanopartículas de prata em refrigeradores, celulares, roupas,
e outros produtos. Na tabela 1 encontra-se resumido as principais aplicações de nanopartículas
aplicadas em nanobiotecnologia (PICHOT, 2008).

1
Aplicação de nanopartículas em células solares, nanoestruturas para entrega controlada de fármacos,
biosensores, nanoporos em cerâmicas para tratamento de água, etc.
 19

Tabela 1 - Alguns exemplos de aplicações de nanopartículas usadas em Nanobiotecnologia.

Nanopartículas Tamanho Exemplos de Aplicações

Inorgânicas

Ouro 10–30 nm Detecção colorimétrica para sequências

de DNA
Platina, paládio, rutênio 2–10 nm Chip para detecção de DNA
Metais óxidos 5–10 nm Imagem médica
(ferrofluidos e supermagnéticas)
Sílica nanométrico Sensores biológicos
Cristais semiconductores (Quantum 2–10 nm Detecção e quantificação
Dots)

Partículas Orgânicas
Carbono e fulereno nanométrico Marcadores de DNA
Dendrimeros 10–50 nm Entrega de fármacos
Polieletrólito complexo 50–200 nm Entrega de fármacos e vacinação
Copolímeros em óxidos 50–200 nm Entrega de fármacos
Latexes 20–1000 nm Ensaios em fase sólida, matrizes
bidimensionais
Partículas mistas
(orgânicas/inorgânicas)
Magnéticas 100–1000 nm Diagnóstico, extração de DNA, células,
vírus.
Fluorescentes 30–500 nm Bioensaios de fluorescência
Sílicas 50–200 nm Aplicações bioanalíticas
Nanocompósitos polímero-metal (ouro 10–30 nm Bioensaios
e polipirrol)
Fonte:(PICHOT, 2008)

Entender o comportamento das nanopartículas constitui um desafio para a ciência

fundamental, interligado ao seu enorme potencial de aplicação. Porém, mesmo assim,
considerando o impacto na área biomédica, o uso da nanotecnologia mostra-se potencialmente
necessário, em especial no que diz respeito aos agentes para a distribuição de drogas e
marcadores celulares. Algumas destas tecnologias encontram-se listados na tabela 2
(SALATA, 2004).
 20

Tabela 2 - Exemplos de empresas que comercializam os nanomateriais para aplicações

biológicas e médicas.

Empresa Maior área de atividade Tecnologia

Advectus Life Sciences Entrega de fármacos Nanopartículas poliméricas para
Inc. entrega de fármacos.
Alnis Biosciences, Inc. Bio-fármacos Nanopartículas poliméricas para
entrega de fármacos.
BASF Creme dental Nanopartículas de hidroxiapatita para
melhorar superfície dental.
Biophan Technologies, MRI shielding Materiais compósitos
Inc. nanomagnético/carbono para proteger
dispositivos médicos de campos de
rádio frequência.
Capsulution NanoScience Revestimentos farmacêuticos Revestimentos de poli-eletrólitos (8-50
AG para melhorar a solubilidade nm).
de fármacos
Eiffel Technologies Entrega de Fármacos Redução no tamanho dos carreadores
(100 até 50 nm).
Evident Technologies Biomarcadores luminescentes Pontos quânticos com grupos amina ou
carboxila na superfície, emissão entre
350-2500 nm.
Immunicon Separação de diferentes tipos Núcleo magnético rodeado por uma
de células camada polimérica revestido com
anticorpos para a captura de células
KES Science and Filtro AiroCide Nano-TiO2 para destruir organismos
Technology, Inc. patogênicos.
Nanoprobes, Inc. As nanopartículas de ouro para Nanopartículas de ouro bioconjugados.
marcadores biológicos
NanoMed Entrega de Fármacos Nanopartículas para entrega de
Pharmaceutical, Inc. fármacos.
Nanoshpere, Inc. Biomarcadores de ouro Código de barras de DNA ligado a
sondas rastreadas por ressonância de
plasmon.
QuantumDot Corporation Biomarcadores luminescentes Pontos quânticos bioconjugados.
Fonte: (SALATA, 2004)
 21

2.1 Nanopartículas metálicas

Nanopartículas metálicas são aquelas produzidas a partir de um átomo metálico desde

que atendem as definições de tamanho preconizado pela nanotecnologia (BLACKMAN,
2009). As NPs metálicas exibem propriedades diferentes daquelas dos átomos individuais ou
materiais massivos, também denominados “bulk”.

Considerando o aspecto histórico, pode ser verificado que os aspectos ópticos do ouro
em nanopartícula foram utilizados pelo homem há centenas de anos: por exemplo, a bela cor
de vidro vermelho rubi procede das nanopartículas de ouro (NPAus) em matriz de vidro
(Figura 1). Nos esmaltes decorativos conhecidos como brilho, encontrados em algumas
cerâmicas medievais (Figura 2 e 3), as propriedades ópticas especiais do esmalte surgiram
devido as NPAus que foram dispersas no esmalte de uma forma aleatória. Michael Faraday,
em 1857, em seu trabalho pioneiro intitulado "relações experimentais de ouro (e outros
metais) para a luz" explica as propriedades deste esmalte. A motivação do seu estudo foi a cor
vermelha das NPAus, um contraste marcante com a aparência familiar amarela do ouro na sua
forma massiva. Neste pequeno intervalo de tamanho, as partículas são menores do que o
comprimento de onda da luz resultando em propriedades ópticas que são diferentes daqueles
presentes nos materiais massivos (WENDER LUIZ DOS SANTOS, 2011).

Figura 1 - Vasos contendo vidro rubi, feita no século 19. Vidro rubi foi fabricado durante
séculos, embora tenha sido apenas recentemente descoberto que o pigmento vermelho usado
contém nanopartículas de ouro.

Fonte: (HISTORIC, 2013)

 22

Figura 2 - Detalhe de uma janela na Catedral de Altenberg. O vidro colorido manchado de

vermelho é composto por pequenas partículas de ouro coloidal que residem em uma matriz de
vidro.

Fonte: (FREUND, 2002)

Figura 3 - O Copo de Lycurgus. Esquerda imagem vista em luz refletida; direita imagem vista
da luz transmitida.

Fonte: (WALTERS; PARKIN,2009)

 23

Atualmente, com os avanços tecnológicos a morfologia dos nanomateriais mostra-se

melhor compreendida. Os átomos na superfície da matéria estão em um ambiente diferente
daqueles do interior do material, e este posicionamento mostra-se capaz de alterar
propriedades eletrônicas, químicas e físicas do aglomerado, mesmo para agrupamentos de
2000 átomos, onde cerca de 20% dos átomos se encontram na superfície. Por exemplo, para
NPs esféricas a razão superfície/volume aumenta com o inverso do raio. NPs com 1 nm de
diâmetro têm mais de 75%, enquanto que para uma NP com 20 nm essa porcentagem é menor
do que 0,5 %. Pode-se prever que em domínios nanométricos, onde a superfície passa a ser
determinante, as propriedades físicas e químicas das NPs vão depender fortemente do seu
tamanho.

Figura 4 - Microscopia eletrônica de transmissão de diferentes nanopartículas de Au:

nanoesferas (A), nanocubos (B), nanoramos (C), nanobastões (D), nanobastões (E). nanobastões
(F), nanobipiramides (G).

Fonte: (CHEN,KOU, et al.,2008)

Sabemos que compreender o comportamento destes sistemas é um desafio à ciência

básica, e que o estudo voltado às aplicações no dia a dia, permite explorar o potencial da
nanotecnologia. A óptica, a eletrônica e as propriedades catalíticas das NPs metálicas são
muito influenciadas pelo seu tamanho, forma e estrutura cristalina. Por exemplo, a prata (Ag)
 24

e ouro (Au), nanocristais de diferentes formas possuem respostas dispersão ópticas únicas
(CHEN KOU, et al., 2008).

Propriedades ópticas das NPAus e nanopartículas de prata (NPAgs) têm sido

amplamente utilizados para aplicações em biologia e de tecnologia devido as suas
propriedades ópticas únicas. Estas propriedades são conferidas pela interação da luz com os
elétrons na superfície das NPAus e NPAgs. Em um determinado comprimento de onda da luz,
oscilação coletiva de elétrons na superfície das NPAus e NPAgs causam um fenômeno
chamado ressonância de plasma de superfície (SPR), resultando em forte extinção da luz.
 25

2.2 Síntese de Nanopartícula Metálica

A seguir, será descrito as vias comuns de síntese de NPs metálicas, englobando

processos de estado sólido, gasoso ou líquido, capazes de formar diferentes tipos de NPs
metálicas com variações na forma, no tamanho e estabilidade.

2.2.1 Métodos de Síntese de Nanopartículas Metálica

O conceito “top-down” e “bottom-up” são duas abordagens para o processo de

fabricação de sistemas nanoestruturados. Esses termos foram aplicados pela primeira vez ao
campo da nanotecnologia pelo Instituto Foresight em 1989 (BISWAS;BAYER, et al., 2012).

Abordagem “top-down” corresponde ao uso de ferramentas de nanofabricação que são

controlados por parâmetros experimentais externos para criar estruturas nanométricas e
dispositivos funcionais com as formas e as características desejadas (BISWAS; BAYER, et
al., 2012). Por outro lado, abordagem "bottom-up" busca construir nanoestruturas a partir de
moléculas ou componentes atômicos menos complexos por agrupamentos baseados em
mecanismos complexos. Basicamente, esta área de nanofabricação que usa átomos ou
pequenas moléculas como blocos de construção de estruturas multi-níveis para realizar várias
operações é extremamente promissora, uma vez que resulta no aproveitamento de todos os
materiais utilizados (BISWAS; BAYER, et al., 2012).

Porém, durante a síntese das NPs metálicas, uma grande dificuldade encontrada é a
reprodutibilidade do processo aliada à redução dos resíduos químicos gerados e à pureza do
material obtido (WENDER LUIZ DOS SANTOS, 2011). Os principais métodos para a síntese
de NPs são hoje facilmente divididos em métodos químicos e físicos.
 26

Tabela 3 - Principais métodos químicos e físicos para síntese de nanopartículas.

Método Químico Referências

Redução química de sais de metais (JANA, GEARHEART e MURPHY, 2001)
(Método do Citrato)
Processo de redução de álcool (NETO, DIAS, et al., 2007)

Processo de polyol (SILVERT, HERRERA-URBINA, et al., 1996)

Microemulsions (PILLAI e SHAH, 1996; BOUTONNET, KIZLING

e STENIUS, 1982)
A decomposição térmica dos sais de (SAPIESZKO e MATIJEVIć, 1980)
metal
Síntese eletroquímica (YING , CHANG, et al., 1997)

Método Físico
Explosão pela técnica de fio (SEN, GHOSH, et al., 2003)
(Exploding wire technique)
Sputtering (TORIMOTO, OKAZAKI1, et al., 2006)

Deposição de vapor químico (SMITH e KODAS, 1995)

Micro-ondas de irradiação (WANG, XU e ZHU, 2002)

Ablação por laser pulsado (DAT, LEE, et al., 1995)

Os fluídos supercríticos (ZHANG e ERKEY, 2006)

Fonte: (Autor, 2015)

2.2.1.1 Redução química de sais de metais (Método do Citrato)

Em 1951, Turkevich e colaboradores descreveram o método de produção de

nanopartículas de Au de tamanho de 20 nm utilizando a redução de citrato HAuCl4 em água
(KIMLING, et al., 2006). Posteriormente, Frens em 1973, desenvolveu uma síntese físico-
química, utilizando citrato, e obteve tamanhos de nanopartículas variando entre 15 a 150 nm.
Ambos os métodos produzem nanopartículas esféricas quase em uma faixa ajustável de
tamanho. Trabalhos recentes têm demonstrado a forte influência das concentrações dos
reagentes, temperatura e pH sobre a morfologia e tamanho das nanopartículas.
 27

2.2.2 Nucleação

A nucleação é geralmente definida como a criação de embriões ou clusters antes da

formação de uma nova fase durante a transformação de vapor → líquido → sólido. Esse
processo é caracterizado por uma diminuição tanto da entalpia quanto da entropia do sistema
de nucleação isto é, ΔH < 0 e ΔS < 0. (ZHANG, et al., 2012).

Formação de grupos moleculares ocorre através das colisões aleatória e dos rearranjos
dos átomos ou moléculas da fase existente, como mostra na figura 5 (b). O crescimento de um
cluster pode ser representado como um processo cinético gradual (figura 5c). Depois de
alcançar um tamanho crítico (conjunto crítico ou núcleo), o crescimento do cluster começa a
tornar-se espontâneo (figura 5d). A cada passo, a formação e a decomposição de um cluster
podem ser descritos pelos fundamentos da teoria cinética. Um conjunto pode se formar
homogeneamente na fase inicial ou de forma heterogênea com diversas irregularidades, tais
como partículas ou íons pequenos, que auxiliam na superação pré-existente da barreira de
energia livre associada à formação de uma interface entre o pequeno aglomerado que vai da
nova fase até fase inicial (ZHANG, et al., 2012).

Figura 5 - Comportamento da energia livre total ΔG como função do tamanho de crescimento r

da partícula.

Fonte: (CLEMENS, et al 2015)

 28

Para o processo de nucleação ocorrer, a solução deve ser supersaturada, a fim de gerar
um tamanho extremamente pequeno de partícula única (BURDA, et al., 2005), (WENDER
LUIZ DOS SANTOS, 2011). A mudança de energia livre total, ΔG, é a soma da energia livre
devido à formação de um novo volume com a energia livre devida à nova superfície criada
(WENDER LUIZ DOS SANTOS, 2011).

Considere-se uma partícula esférica, onde V é o volume molecular das espécies

precipitadas, r o raio do núcleo, KB a constante de Boltzmann, S razão da saturação e γ a
energia livre de superfície por unidade de área de superfície (WENDER LUIZ DOS
SANTOS, 2011). Quando S é maior que 1, G mostra um máximo positivo em um tamanho
crítico r* (Figura 5 a).

Esta máxima energia livre é a energia de ativação para nucleação dada pela equação a seguir.

Equação 1. (BURDA, et al., 2005)

O tamanho crítico dos núcleos r * podem ser obtidos definindo dG/dr = 0

Equação 2 (BURDA, et al., 2005)

Para um dado valor de S, todas as partículas com r > r * vão crescer e todas as partículas com
r <r * vão dissolver. A partir da equação 2, quanto maior a proporção de saturação S, teremos
um menor tamanho crítico de r*.
 29

2.2.3 Crescimento das Nanopartículas

Após os núcleos serem formados a partir da solução, eles crescem através da

deposição das espécies solúveis na superfície sólida, fenômeno conhecido com adição
molecular (WENDER LUIZ DOS SANTOS, 2011). A nucleação para quando a concentração
cai abaixo do nível crítico, mas as partículas continuam crescendo pelo processo de adição
molecular até que a concentração de equilíbrio das espécies seja atingida (BURDA, CHEN, et
al., 2005). Existe uma taxa de crescimento diferencial para as partículas pequenas e para as
grandes neste estágio. Supondo que as partículas grandes são ligeiramente maiores que o
tamanho crítico, a energia livre impulsionando o crescimento é maior para as partículas
pequenas que vão crescer mais rapidamente (WENDER LUIZ DOS SANTOS, 2011).

Deve-se notar que são diferentes as taxas relativas de crescimento de partículas

pequenas e grandes quando os reagentes estão esgotados devido ao crescimento das
partículas. Neste caso, ocorrerá o processo conhecido como Ostwald ripening
(“amadurecimento” de Ostwald) (Figura 6), onde as partículas menores se dissolvem e se
depositam na superfície das partículas maiores (WENDER LUIZ DOS SANTOS, 2011). A
taxa de saturação (S) é decrescente e o tamanho de núcleos críticos correspondentes (r*) é
crescente (Equação 2).

Figura 6 - Crescimento coloidal monodisperso do modelo de La Mer (Figura A) e aparato típico

de síntese de Nanopartículas via rota líquida (Figura B).

Fonte: (MURRAY;KAGAN;BAWENDI, 2000)

 30

Nesta situação, partículas menores irão dissolver, enquanto que as maiores continuarão
a crescer. Parar a reação a este ponto resulta em uma larga distribuição de partículas com dois
regimes (por partículas menores e maiores) de cada lado da dimensão crítica (WENDER
LUIZ DOS SANTOS, 2011). A única maneira de obter partículas de tamanhos próximos à
monodispersão, nesta fase, é permitir que a reação prossiga até que a supersaturação se esgote
e os núcleos menores desapareçam completamente. Isto seria desejado para a síntese de
partículas relativamente grandes (micrôns em diâmetro), por exemplo.
Um fator adicional que deve ser considerado é o crescimento secundário. Este é o
crescimento das partículas por agregação com outras partículas. O crescimento por este
processo é mais rápido do que na adição molecular, e isso ocorre pela combinação de
partículas estáveis com pequenos núcleos instáveis.
Finalmente, devemos notar que as NPs são pequenas e não são termodinamicamente
estáveis, sendo necessário estabilizá-las, quer por adição de reagentes protetores à superfície
da partícula, tais como ligantes orgânicos ou agentes inorgânicos envolventes, ou colocando-
as em um ambiente inerte, tal como uma matriz inorgânica ou polimérica. A escolha adequada
do material de proteção também pode fornecer uma barreira para neutralizar a atração entre as
NPs devido à interação de van der Waals (ou de atração magnética, no caso de materiais
magnéticos).
 31

2.3 Métodos de caracterização das nanopartículas

2.3.1 Espectrofotometria óptica UV-visível.

Espectrofotometria na região UV-Vis do espectro eletromagnético é uma das técnicas

analíticas mais empregadas, em função de robustez, baixo custo e diversidade de aplicações
(ŁOBIńSKIA; MARCZENKO, 1992).
A espectrofotometria é fundamentada na lei de Lambert-Beer, que é a base matemática
para medidas de absorção de radiação por amostras no estado sólido, líquido ou gasoso, nas
regiões ultravioleta, visível e infravermelho do espectro eletromagnético. Para medidas de
absorção de radiação em determinado comprimento de onda, tem-se: A= log(Io/I) = εbc, onde
A é a absorvância, Io é a intensidade da radiação monocromática que incide na amostra e I é a
intensidade da radiação que emerge da amostra.
A absortividade molar (ε) é uma grandeza característica da espécie absorvente, cuja
magnitude depende do comprimento de onda da radiação incidente. O termo c é a
concentração da espécie absorvente e b, a distância percorrida pelo feixe através da amostra
(ŁOBIńSKIA; MARCZENKO, 1992).

2.3.2 Microscopia eletrônica de transmissão

A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) mostra-se como uma das técnicas

mais usadas para caracterização de nanopartículas, pois permite avaliar a morfologia, o
arranjo atômico e defeitos dos materiais (WILLIAMS, 2009). O microscópio eletrônico de
transmissão consiste basicamente de um canhão, que gera um feixe de elétrons de alta
energia, 100–400 keV (l = 0,01-0,004 nm); um conjunto de lentes condensadoras (C1, C2 e

C3), que transmitem o feixe até a amostra; lente objetiva, que recombina os feixes difratados e

transmitidos para a formação da imagem; e um conjunto de lentes intermediárias que projetam

a imagem em uma tela ou detector. Este sistema de lentes torna possível reduzir a secção
transversal do feixe, o qual é usado para iluminar a área de interesse na amostra. Uma função
importante do sistema de iluminação é o alinhamento do feixe eletrônico e a possibilidade de
variação do seu ângulo de incidência com respeito ao eixo ótico da lente objetiva. A
recombinação dos feixes difratados e transmitidos com diferentes intensidades resulta na
 32

diferença de contraste da imagem formada. O contraste de fase resulta da interação entre

feixes que percorrem regiões adjacentes da amostra, entre as quais haja diferenças de fase
provocadas por variações de espessura. O estudo da interação entre a radiação e a matéria
indica uma variação de intensidade periódica com a espessura da amostra, e com sua estrutura
cristalina. Finalmente, uma vez que o comprimento de onda dos elétrons corresponde à
distância inter-atômica nos sólidos, a difração se apresenta como fenômeno de importância
(WILLIAMS, 2009).
A difração de elétrons é rotineiramente conduzida em uma análise de microscopia
eletrônica de transmissão para obter informações adicionais como a estrutura cristalina, hábito
cristalino e orientação molecular. Os resultados obtidos podem ser comparados aos
providenciados pela difração de raios-x, sendo que a grande diferença está na quantidade de
amostra empregada na análise.
Com o foco correto e amplificações adequadamente selecionadas, os elétrons criam
uma imagem projetada da amostra na tela fluorescente, sendo esta imagem registrada em uma
chapa fotográfica ou câmara CCD contidos no microscópio. As micrografias obtidas com a
difração de elétrons utilizando a TEM podem ser digitalizadas e comparadas com projeções
teóricas, bastando sobrepor os padrões de difração teóricos e experimentais (WILLIAMS,
2009). A composição qualitativa pode ser elucidada com a ajuda de EDS. Para que uma
amostra possa ser analisada por TEM é necessária uma fina espessura (com alguns
nanômetros), limpa, condutora e estável sob a ação do feixe. É importante, ainda, que a
amostra de TEM seja representativa.

2.3.3 Microscopia de força atômica

Microscopia de força atômica (AFM) é uma técnica que permite ver e medir a
estrutura de superfície com resolução e precisão atômica (EATON; WEST, 2010). Um
microscópio de força atómica possibilita obter imagens que mostra o arranjo dos átomos
individuais numa amostra, ou para ver a estrutura de moléculas individuais (EATON; WEST,
2010).
 33

Os três conceitos básicos para o funcionamento de um AFM são:

 Transdutores piezoeléctricos (em AFM, muitas vezes conhecidos como

scanners piezoeléctricos);
 Transdutores de força (sensores de força);
 Controle de feedback.

Basicamente, o transdutor piezoeléctrico move a ponta sobre a superfície da amostra, o

transdutor de força detecta a força entre a ponta e a superfície e o controle de realimentação
alimenta o sinal proveniente do transdutor de força de volta para o piezoeléctrico, para manter
fixa entre a ponta e a amostra (EATON; WEST, 2010).

Imagens pequenas de apenas 5 nm de tamanho, mostrando apenas 40-50 átomos

individuais, podem ser coletadas para medir a estrutura cristalográfica de materiais, ou
imagens de 100 micrómetros ou maiores podem ser medida, que mostra as formas de dezenas
de células vivas, ao mesmo tempo (EATON; WEST, 2010).

2.4 Aplicações das nanopartículas

Nas últimas décadas, o avanço da nanotecnologia possibilitou a síntese e caracterização de

uma série de nanoestruturas úteis para aplicações na área biomédica. As principais classes de
nanoestruturas biologicamente relevantes incluem pontos quânticos semicondutores,
nanopartículas magnéticas, nanopartículas poliméricas e nanopartículas metálicas.

Cabe mencionar as NPAu com sua capacidade de interação com os componentes celulares
como o DNA, RNA e proteínas, o que vem possibilitando o desenvolvimento de métodos para
entrega e estabilização de fármacos (DELONG, et al., 2010). O potencial das NPAu tem
estimulado a pesquisa em várias direções, que, para além da estabilização de RNA incluem
uma diversidade de aplicações em ciência dos materiais e tecnologias de sensores como
resumidos na Figura 7.
 34

Figura 7 - Resumo desenhado para realçar várias aplicações de NPAu com diferentes tipos de
conjugados de macromoléculas, como DNA, RNA, peptídeos e ácidos carboxílicos.

Fonte: (PARK, LEE; MIRKIN, 2006; ELBAKRY, eat al., 2009; KRPETI, et al., 2009; USON,
1978)

A funcionalização de nanopartículas mostra-se como uma estratégia necessária para

favorecer a estabilidade, funcionalidade e biocompatibilidade de nanoestruturas.
Exemplificando, as NPAu funcionalizadas devem apresentar na superfície da nanoestrutura
moléculas biológicas estáveis e capazes de manter a suas propriedades químicas e biológicas e
as NPAus devem ser capaz de continuar com suas propriedades, como a ressonância de
plasmon (NIKOOBAKHT; EL-SAYED, 2003) e espalhamento da luz (JANS, LIU; HUO ,
2009). Para aplicações biomédicas, funcionalização das NPAus mostra-se essencial, a fim de
orientá-las para áreas de doenças específicas e permitir-lhes de maneira seletiva interagir com
as células ou moléculas biológicas (DELONG, REYNOLDS, et al., 2010).

NPAus normalmente são estabilizadas contra agregação usando cadeias longas de

hidrocarbonetos constituídos por vários grupos funcionais. Uma das extremidades dessas
moléculas é conectada à superfície do ouro, enquanto que o outro ponto da extremidade é
conectado com as moléculas, como mostrado na Figura 8 (DELONG, REYNOLDS, et al.,
2010).
 35

Figura 8 - Quimissorção de cadeias de ácidos mercaptocarboxílico na superfície de em uma

nanopartícula de ouro.

Fonte: (REYNOLDS, et al., 2010)

No caso de NPAus solúveis em água, estes grupos funcionais são ácidos carboxílicos
que estabilizam as nanopartículas por repulsão eletrostática e pode ser explorada para a
conjugação de outras moléculas, para as partículas. A escolha do ligante depende do
tamanho das NPs e do solvente, estes ligantes podem também ser usados como pontos de
ancoragem para uma maior fixação biológica de moléculas. Ácidos mercaptocarboxílico
são populares na estabilização da NPAus, devido à forte afinidade do enxofre com o ouro
(DUBOISAND;NUZZO , 1992; USON , 1978).
O polietileno glicol (PEG) mostra-se como outro composto utilizado para
funcionalização uma vez que proporciona estabilidade coloidal, nanopartículas com PEG
sobre as suas superfícies repelem umas às outras por razões de carácter estérico
(KANARAS; KAMOUNAH; BRUST, 2002). O uso de PEG como um grupamento de
funcionalização permite a fabricação de NPAus solúveis em água que não agregam
mesmo sob condições extremas do pH e ou em presença de proteínas. Em alguns casos,
pode ser necessário para alterar o componente da funcionalização. Troca de grupos
funcionais pode ser motivada por transferência de NPAus a partir de uma solução aquosa
 36

em fase orgânica e vice-versa, e por meio da troca surfactantes hidrofílicos com

surfactantes hidrofóbicos e vice-versa (PELLEGRINO, et al., 2005).

2.4.1 Senssoreamento

Com o desenvolvimento da tecnologia, busca-se cada vez mais a simplificação dos

métodos analíticos. Este racional é comum nas áreas da química, medicina, biologia e
biotecnologia. Assim, nos últimos anos, tem-se tornado disponíveis no mercado um maior
número de detectores portáteis que permitem a redução do tamanho da amostra e economia no
tempo de análise. Os biossensores potenciaram o desenvolvimento de uma família de técnicas
eletroquímicas que oferecem rapidez e simplicidade.

Os biossensores são definidos como qualquer

dispositivo de detecção que incorpore tanto um
organismo vivo ou produtos derivados de
sistemas biológicos (enzimas, anticorpos, DNA,
etc.), com um transdutor que fornece a indicação,
sinal ou outra forma de reconhecimento de uma
substância específica no ambiente (THEVENOT,
et al., 1999).

Um biossensor é um dispositivo composto basicamente por dois elementos:

1. Um biorreceptor que é um elemento biológico sensível imobilizado (por exemplo,

enzima, a DNA sonda, anticorpo) que reconhece o analítico (por exemplo, substrato de
enzima, o DNA complementar, antígeno).

2. Um transdutor é usado para converter sinal químico resultante da interação dos

analíticos com o biorreceptor em um sinal eletrônico. A intensidade do sinal gerado é
direta ou inversamente proporcional à concentração de analítico. Transdutores
eletroquímicos são muitas vezes utilizados para desenvolver biossensores. Estes
sistemas oferecem algumas vantagens tais como baixo custo, design simples ou
pequenas dimensões. Os biossensores podem também basear-se em gravimétrico,
calorimetria ou de detecção óptica (BLUM; LECA-BOUVIER; SASSOLAS, 2011).

O primeiro biossensor foi descrito em 1962 por Clark e Lyons que imobilizava glicose
oxidase (GOD) na superfície do eletrodo de oxigênio em membrana de diálise amperométrica
semipermeável, a fim de quantificar a concentração de glicose numa amostra diretamente
(BLUM; LECA-BOUVIER; SASSOLAS, 2011).
 37

Os biossensores são categorizados de acordo com os princípios básicos de transdução

de sinal e elementos de bioreconhecimento. De acordo com os elementos de transdução, os
biossensores podem ser classificados como sensores eletroquímicos, ópticos, piezoelétricos e
térmicos (THEVENOT, et al., 1999). Os biossensores eletroquímicos são também
classificados como potenciométrico, amperométrico e sensores condutométricos.
Dentre as áreas de aplicação dos biossensores destacam-se o diagnóstico, biorreatores,
controle de qualidade, agricultura, mineração, defesa militar e etc (LIN; LIU, 2005). Algumas
vantagens de biossensores estão listadas abaixo:

1. Eles podem medir moléculas apolares que não respondem a mais de uma
medição em outros dispositivos.
2. Biossensores são específicos, devido ao sistema de imobilização usado
neles.
3. Com biossensores é possível o controle rápido e contínuo.
4. Tempo de resposta é curto (geralmente menos do que um minuto).
5. Praticidade.

Os dispositivos bioeletrônicos (Figura 9) podem operar em duas direções: Numa

configuração, o evento biológico altera as propriedades interfaciais de o elemento electrónico,
permitindo assim a leitura do bio-reação por monitorização o desempenho da unidade
eletrônica, tal como a leitura do potencial, impedância, cobrar o transporte, ou a resistência da
superfície de eletrodos ou transistores de efeito de campo, ou seguindo as frequências de
ressonância de cristais piezoelétricos. A segunda configuração de sistemas bioeletrônicos usa
as unidades eletrônicas para ativar os biomateriais em direção das funções pretendidas.
 38

Figura 9 - Sistemas integrados de biomateriais e elementos eletrônicos para aplicações em

biossensores.

Fonte: (LIN; LIU, 2005).

2.4.2 Terapêutica

Durante séculos, a prata tem sido utilizada para o tratamento de queimaduras e feridas
crônicas. Em 1000 a.C a prata já era conhecida por tornar a água potável (FONG; WOOD,
2006). O nitrato de prata foi utilizado na sua forma sólida e era conhecido por diferentes
termos como, "Lunar cáustica" em Inglês, "Lapis infernale" em latim e "Pierre infernale" em
francês (FONG; WOOD, 2006).

Diferentes tipos de metais (cobre, zinco, titânio, magnésio, ouro) foram utilizados para
síntese de nanomateriais com propriedade antibacteriana, mas apenas as nanopartículas de
prata mostraram ser eficazes para tal objetivo. Ao final do século 19, era comum a prática de
usar solução de nitrato de prata (1%) em curativos para reduzir infecções pós-operatórias
oculares (FONG; WOOD, 2006)

Em 1965, Moyer iniciou as investigações com soluções de nitrato de prata. Na época,

foram avaliadas várias concentrações de nitrato de prata e concluiu-se que uma solução de
0,5% de nitrato de prata tinha potencial de induzir morte em bactérias (Staphylococcus
 39

aureus, Pseudomonas aeruginosa e E. coli) em meios de cultivo bacteriano, bem como em

feridas infectadas. (KLASEN, 2000). O fármaco chamado acetato de mafenide foi introduzido
em curto tempo após a reintrodução de nitrato de prata, mudando alguns anos mais tarde, para
sulfadiazina de prata. (KLASEN, 2000).

A investigação atual suporta que as nanopartículas de prata podem ser exploradas na

medicina para o tratamento de queimaduras, materiais odontológicos, materiais de
revestimento de aço inoxidável, tecidos têxteis, tratamento de água, cremes protetores solares,
etc, por possuírem baixa toxicidade para células humanas, alta estabilidade térmica e baixa
volatilidade (MARCARTO, et al., 2007). Estudos recentes demonstram que NPAg possuem
um potencial anti-inflamatório (NADWORNY, et al., 2008;TIAN, et al., 2007) e de
aceleração no processo de cicatrização de feridas (HUANG, et al., 2007). Confirmando tal
propósito, a prata nanoparticulada é utilizada clinicamente como uma ferramenta valiosa no
arsenal terapêutico (Figura 10).
 40

Figura 10 - Usos de nanopartículas de prata NPs de prata (lado esquerdo) e prata (lado direito)
em medicina.

Fonte: (CHALOUPKA; MALAM; SEIFALIAN, 2010)

 41

3 OBJETIVO

3.1 Objetivo geral

Este trabalho teve como objetivo geral realizar a síntese de nanopartículas metálicas de
ouro e de prata visando aplicações em biologia.

3.1.1 Objetivos específicos

 Sintetizar nanopartículas de ouro e de prata.

 Caracterizar as nanopartículas por UV-Vis, AFM e HRTEM.
 Avaliar a atividade da emulsão composta por nanopartículas de prata em óleo de
copaíba no processo de cicatrização de feridas cutâneas infectadas.
 Desenvolver as bases para construção de um biossensor capaz de detectar a presença
de proteínas.
 42

4 PROCESSOS DE CICATRIZAÇÃO

O processo de cicatrização é um evento biológico complexo que visa reparar a área

lesada. Para que um ferimento seja curado com êxito, eventos de inflamação, proliferação e
remodelamento devem ocorrer em uma sequência apropriada, e o resultado final, geralmente
uma cicatriz de tecido conjuntivo, configura o somatório desse processo (CALVIN, 1998).
Assim, a cicatriz corresponde à tentativa biológica a qual o organismo recorre para restaurar
sua integridade, sendo este processo dividido em três fases: inflamatória, proliferativa e de
maturação. Tais fases não constituem processos isolados, e com frequência se sobrepõe umas
às outras (PILCHER, et al., 1999;SCHÄFFER;BARBUL, 1998).

A fase inflamatória inicia-se logo após a lesão e é caracterizada pela vasoconstricção

mediada por fatores neurogênicos durante um período de segundos a minutos, e, em seguida,
pelo vaso dilatação local que, por aumentar a permeabilidade vascular, favorece a exsudação
plasmática e a passagem de elementos celulares para a área da lesão. Os mediadores
bioquímicos de ação curta envolvidos nestes eventos são a histamina e serotonina. A
prostaglandina é um dos mediadores importantes no processo de cicatrização, pois além de
favorecer a exsudação vascular, ocasiona a sensibilização de terminações nervosas
desencadeando dor e promove ativação de leucócitos (CALVIN, 1998; AUKHIL, 2000).

A fase proliferativa é composta de três eventos importantes que sucedem o período de

maior atividade da fase inflamatória: neo-angiogênese, fibroplasia e epitelização. Esta fase
caracteriza-se pela formação de tecido de granulação, que é constituído por um leito capilar,
fibroblastos, macrófagos, um frouxo arranjo de colágeno, fibronectina e ácido hialurônico.
Esta fase inicia-se por volta do 3º dia após a lesão, perdura por 2 a 3 semanas e é o marco
inicial da formação da cicatriz (IBA; SHIBATA; KATO M., 2004).

A maturação da ferida tem início durante a 3ª semana sendo marcada pela

remodelagem dos tecidos no sentido de restaurar a forma e função do tecido lesado. Esta
etapa caracteriza-se pela deposição, agrupamento e remodelação do colágeno associado à
regressão endotelial, apresentando tecido conectivo, fibras colagênicas e poucos vasos
sanguíneos (WERNER; GROSE, 2003). O desequilíbrio desta relação favorece o
aparecimento de cicatrizes hipertróficas e quelóides. O aumento da resistência deve-se à
remodelagem das fibras de colágeno, com aumento das ligações transversas e melhor
 43

alinhamento do colágeno, ao longo das linhas de tensão. A fase de maturação dura toda a vida
da ferida, embora o aumento da força tênsil se estabilize, após um ano, em 70 a 80% da pele
intacta (DIPIETRO; BURNS, 2003).

As perdas teciduais são frequentes e têm como agravantes diferentes etiologias e

extensões pelo organismo. Dessa forma, é de suma importância ter alternativas de escolha
para o tratamento adequado, sempre que possível, ao tipo de lesão. Os tratamentos
preconizados para lesões cutâneas apresentam no decorrer do processo cicatricial limitações
quando ao desenvolvimento do processo de reparo. Isto implica na necessidade de administrar
doses elevadas e frequentes para alcançar e manter a resposta terapêutica desejada,
ocasionando, além de efeitos locais, a possibilidade de incidência de efeitos sistêmicos
indesejados (CHRAI, et al., 1973). Com isso, o tratamento de feridas objetivando melhores
resultados cicatriciais, modificou-se ao longo dos séculos, onde várias substâncias vêm sendo
utilizadas na tentativa de acelerar o processo cicatricial, como o emprego de diferentes
materiais sintéticos, biológicos ou biossintéticos, no intuito de suprir as deficiências do
tratamento convencional (MODOLIN, 1992).

Entre as estratégias que vêm sendo utilizadas para prolongar o tempo de contato do
medicamento sobre a superfície, no intuito de aumentar as oportunidades de absorção tecidual
após a administração tópica, destacam-se os sistemas dispersos. Estes sistemas constituem
uma interessante alternativa clínica por proporcionaram comodidade, simplicidade na
administração, tolerância e boa aceitação das preparações líquidas e, ao mesmo tempo, o
aumento do tempo de contato princípio ativo/área lesionada. Como consequência, os sistemas
dispersos têm potencial para reduzir a frequência de aplicação e diminuir a incidência de
efeitos secundários sistêmicos, quando comparadas com as formulações convencionais
(ZIMMER; KREUTER, 1995, CHIANG, et al., 2001). No entanto, dadas as dificuldades e
complicações que dificultam a cicatrização normal, estratégias inovadoras para o tratamento
de feridas que proporcionem uma cicatrização adequada são necessários.

Apesar da predominância, no arsenal terapêutico, de substâncias sintéticas, inclusive

as anti-inflamatórias, nos últimos anos têm-se verificado retomada à valorização de práticas
terapêuticas consideradas por muitos profissionais de saúde como populares ou não
científicas, inclusive a lenta reincorporação das ervas medicinais como alternativa ou
 44

complemento terapêutico. Vários foram os fitoterápicos testados e usados no processo de

cicatrização de feridas cutâneas que se mostraram promissoras.

A prata tem sido usada por centenas de anos para o tratamento de diferentes afecções
incluindo cauterização e cicatrização da pele (KLASEN, 2000, HANIF, et al., 2003). Dentre
seus efeitos biológicos descritos para a prata, vários trabalhos revelam suas ações bactericidas
por ser capaz de bloquear enzimas das vias fosforilativas, gerar alterações no DNA e na
parede bacteriana (MODAK; FOX, 1973). Levando-se em consideração as propriedades
antibacterianas, alguns autores têm sugerido possíveis propriedades pró-cicatrizantes da prata
(WRIGHT, et al., 2002).

A copaíba, também chamada copaífera, da família Caesalpinaceae, é representada por

uma árvore de grande porte chegando a medir 30 a 40 m de altura. Apresenta casca rugosa e
características peculiares como inflorescência, frutos e óleo obtido a partir do tronco, variável
de acordo com sua espécie (DWYER, 1951). Este último é representado por um produto ou
exsudação patológica do tronco da árvore (GOTLIEB; IACHAN, 1945) constituído
principalmente por óleo volátil hidrocarbonatado, ácido copaífero, cariophilene e outros
sesquiterpenos (BERG; SILVA, 1988; BRENETON, 1993). Além da existência de relatos
sobre o uso popular desta planta, há diferentes trabalhos científicos demonstrando suas
propriedades anti-inflamatória, analgésica e cicatrizante (BASILE, et al., 1988;SIMÕES, et
al., 1999).

Atualmente, a nanotecnologia tem possibilitado a produção de nanopartículas puras de

prata, o que proporciona uma melhora na taxa de liberação de íons (FAN; BARD, 1999.).
Recentemente, foi demonstrado que nanopartículas de prata exibem atividades citoprotetoras
em células infectadas com HIV (SUN, et al., 2005). Entretanto, estudos que avaliam as
propriedades cicatrizantes de nanopartículas de prata são raros. Além disso, ainda não foi
descrito estratégias que visem aperfeiçoar as propriedades biológicas de substâncias
reconhecidamente cicatrizantes, tais como óleo de copaíba e a prata. Dessa maneira,
acreditamos ser capazes de elevar o potencial cicatrizante do óleo de copaíba quando
associado com nanopartículas de prata.
 45

5 METODOLOGIA

Entre os diversos métodos de produção de nanopartículas (MURRAY; KAGAN,

2000), os métodos de síntese química por via úmida possuem uma grande vantagem de serem
de baixo custo e altamente escaláveis, abrindo a possibilidade para sua produção em escala
industrial. Utilizando este método, é possível obter partículas com dimensões nanométricas na
forma coloidal, com controle eficiente de tamanho e morfologia (MURRAY; KAGAN, 2000;
ZHOU, et al., 2009).

Embora alguns métodos de síntese de sistemas coloidais de nanopartículas sejam bem

conhecidos, existem ainda deficiências no desenvolvimento de colóides estáveis contendo,
por exemplo, nanopartículas de prata em óleos. Assim, além de produzir sistemas coloidais
aquosos de Ag, se possível com diferentes formas, investigaremos a produção de sistemas
coloidais orgânicos e biocompatíveis de Ag, utilizando o óleo de copaíba como dispersante
para as nanopartículas.

5.1 Síntese de NPAgs

EQUIPAMENTO E REAGENTES

 Erlenmeyer
 Balança
 Pipeta
 Agitador magnético ou mecânico
 Manta de aquecimento
 Termômetro
 AgNO3 (Nitrato de prata)
 C6H5Na3O7 (Citrato de Sódio)
 Água deionizada
 46

PROCEDIMENTO

As NPAg foram sintetizadas no Laboratório de Optica e Mateiais (OPTMA) da

Universidade Federal de Alagoas (UFAL) sob a supervisão do Professor Dr. Jandir
Hickmann. Para obter as NPAgs primeiro foi preparada a solução de partida, pesou-se 1g de
AgNO3 (Sigma-Aldrich) e dissolveu em 100 ml água deionizada, obtendo uma solução
transparente. Em seguida, 1 mL da solução de AgNO3 foi dissolvido em 49 mL de água
deionizada, na sequência a solução foi aquecida até atingir 96 °C, durante esse processo a
solução foi agitada com uma barra magnética. Ao atingir 96 °C foi adicionado a solução
1,75mL de citrato de sódio, preparado a partir de 0,1 g de C6H5Na3O7 (Sigma-Aldrich)
dissolvido em 10mL de água deionizada.

A temperatura foi mantinda em 96 °C e em agitação até acontecer a mudança de cor de

incolor para amarelo turvo. As NPAgs estabilizadas com citrato sintetizadas através desse
método apresentaram tamanho médio de 5 a 10 nm.

5.2 Modelo de ferida excisional e tratamento

Animais: Camundongos Swiss machos (18-25g) foram fornecidos pelo Biotério Central da
UFAL. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas do Comitê de Ética
Institucional (licença nº 23065.12614/2006-89).

Modelo de ferida excisional: Camundongos Swiss machos, previamente anestesiados e

tricotomizados, foram submetidos à excisão cirúrgica na região dorsal interescapular para
remoção da pele até o nível suprafascial de maneira circular (1 cm de diâmetro) e posterior
inoculação de 1.5x105 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) de Staphylococcus aureus
(ATCC 25923). Os ferimentos foram tratados uma vez ao dia por 9 dias consecutivos, com
aplicação tópica (200 µL) de soluções contendo salina (NaCl, 0,9%), óleo de copaíba (OC),
óleo de copaíba associado a nanopartículas de prata (OC-NanoAg, 0,01%), ou Dermazine®,
como medicamento de referência. O diâmetro do ferimento foi registrado diariamente por
 47

câmera (Sony Cyber-Shot, Dsc W80). No 10º dia de experimentação, os animais foram
sacrificados e parte da ferida removida para análise histológica, tendo sido utilizado como
corantes hemotoxilina/eosina para avaliar a estrutura tecidual e tricrômio de Masson para
marcação de colágeno. As feridas foram fotografadas no período pós-operatório imediato e no
3º, 6º e 9º dias pós-operatórios (câmera fotográfica Sony Cyber Shot, Dsc w80).

Análise estatística: Os resultados foram representados como média e erro padrão da média
(EPM), e avaliados através da análise de variância e do teste t de Student seguido do teste de
Newman-Kewls com um nível de significância selecionado para p<0.05.

5.3 Síntese de NPAus

5.3.1 Modelo do biossensor utilizando NPAus

O diagnóstico precoce da asma é um desafio importante que precisa ser enfrentado,

pois pode permitir o pronto tratamento de crises agudas desta patologia. Para o diagnóstico
precoce, podem ser utilizados eventos típicos do processo inflamatório alérgico (alteração nos
constituintes de matriz extracelular, mobilização de células inflamatórias – em especial
eosinófilos, expressão de moléculas de adesão, mediadores inflamatórios e óxido nítrico
exalado) como indicador da progressão e severidade da doença. Estes eventos podem ser
monitorados através de biossensores.

Biossensores são dispositivos que convertem uma informação biológica, por exemplo,
a presença de uma proteína, em outra informação que pode ser medida facilmente, por
exemplo, a modificação de uma frequência de ressonância de plásmon. A nanotecnologia traz
várias possibilidades para construção de biossensores e para desenvolvimento de novos
bioensaios (ANKER, et al., 2008). A introdução de nanopartículas de metal para detecção
pode facilitar significativamente a sensibilidade desses biossensores, controlando seu
tamanho, estabilidade química e alta atividade catalítica as nanopartículas torna-se uma
vantagem para esses biossensores (FUJIWARA , et al., 2006).
 48

Figura 11 - Representação esquemática de um biossensor usando nanopartículas de ouro,

depositados sobre um substrato de quartzo. Da esquerda para a direita: fonte de luz, substrato
de quartzo; camada de adesão mercaptosilano; nanopartículas de ouro; monocamada de thiol,
anticorpos e antigenos. O resultante aumento de espectros de absorbância após a ligação do
analito mais anticorpo com as NPAus é mostrado do lado direito da figura.

Fonte: (FREDERIX , et al., 2003)

5.3.2 Alvo do biossensor

A migração de leucócitos para o sítio da reação inflamatória é principalmente

dependente da expressão local de sinais químicos solúveis. Este conhecimento possui grande
relevância a considerar que estas células possuem papel fundamental na patogenia das
doenças alérgicas, tal como a asma. Os eosinófilos são leucócitos derivados da medula óssea
que estão intimamente relacionados em doenças específicas como as alergias e infecções
helmínticas. Os eosinófilos são células circulantes e sua infiltração nas vias aéreas e pulmão é
uma característica típica das alergias, em especial a asma.

Na asma a função dos eosinófilos mostra-se relacionada com a sua capacidade de

liberar grânulos de proteínas tóxicas, espécies reativas de oxigênio (ERO), citocinas e
mediadores lipídicos (LIU, et al., 2006). O recrutamento e a inflamação eosinofílica estão
envolvidos na patogênese da asma e o mediadores pró-inflamatórios derivados dos eosinófilos
são grandes contribuintes para inflamação na asma, incluindo os danos em células epiteliais
das vias respiratórias e a descamação, a disfunção das vias aéreas por aumento da liberação de
acetilcolina pelas terminações nervosas colinérgicas, hiperresponsividade, hipersecreção de
muco e o remodelamento das vias aéreas, caracterizada por fibrose e deposição de colágeno
 49

(KUDO; ISHIGATSUBO; AOKI, 2013). A asma possui um grande impacto na atualidade,

pois afeta cerca de 315 milhões de pessoas em todo mundo entre adultos e crianças
(STANOJEVIC, et al., 2012), e causa 1 morte em cada 250 indivíduos asmáticos, o que torna
esta doença um importante problema de saúde pública mundial (FOLLENWEIDER;
LAMBERTINO, 2013) No Brasil, considerando as estatísticas do DATASUS, as
complicações decorrentes da asma ocasionaram aproximadamente 660 mil internações no
período de janeiro de 2008 a abril de 2011. Deste total de internações, 45,5% foram
registrados no nordeste, 21,6% no sudeste, 15% no sul, 9% no norte e 10,2% no centro-oeste.
Neste mesmo período, foram gastos cerca de 334 milhões de reais no tratamento desses
pacientes. Porém, mesmo com todo gasto do sistema de saúde, neste período foram
notificados 2.828 óbitos decorrentes da asma (BRASIL, de 17 de dezembro de 2010).
Portanto, são necessários amplos esforços para melhorar o acesso à assistência médica e
reduzir a disparidade dos resultados do impacto da asma na saúde pública.

Apesar do mecanismo de recrutamento desta célula para o sítio da inflamação ainda

necessitar de melhor entendimento, é sabido que a eotaxina mostra-se como um fator
fundamental para o acúmulo de eosinófios no tecido afetado. A eotaxina é considerada o
mediador de maior seletividade no recrutamento de eosinófilos, e que sua síntese/expressão
ocorre antecipadamente à chegada de eosinófilos no tecido, o que significa que sua detecção
precoce no tecido revela a chegada posterior de eosinófilos. Portanto, a eotaxina mostra-se
como um alvo de grande relevância para detecção precoce de eosinófilos em reações
inflamatórias de origem alérgica.

EQUIPAMENTO E REAGENTES

 Erlenmeyer
 Balança
 Pipeta
 Agitador magnético ou mecânico
 Manta de aquecimento
 Termômetro
 HauCl4.3H2O (Ácido cloroáutico)
 50

 NaBH4 (Boroidreto de sódio)

 C6H5Na3O7 (Citrato de sódio)
 HCl (Ácido clorídrico)
 HNO3 (Ácido nítrico)
 Água deionizada

PROCEDIMENTO

As NPAus coloidais foram sintetizadas seguindo o procedimento de (JIN , KANG , et

al., 2001). Antes de começar a síntese, toda as vidrarias foram limpas em um banho contendo
uma solução HCl/HNO3 preparada na proporção de (3:1) e em seguida lavadas em água
deionizada várias vezes, antes de utiliza-las.

Antes de realizar a síntese foi preparada uma solução de ouro do ácido cloroáutico
(HauCl4.3H2O, Sigma-Aldrich), 1 g de HauCl4.3H2O foi adicionado em 100 ml água
deionizada. Dessa solução de ouro, 1 ml foi adicionado em 100 ml de água deionizada e
mantido por agitação por 10 minutos. Após esse tempo, foi adicionado 1 ml de 1% (w/v) de
citrato de sódio (Sigma-Aldrich) e após 1 minuto adicionou 1 ml da solução de 0.075% (w/v)
de NaBH4 (Sigma-Aldrich) e mais 1% (w/v) de citrato de sódio. A solução foi agitada durante
5 minutos e depois resfriada a 4º C.
 51

5.3.3 Preparação dos substratos de quartzo

EQUIPAMENTO E REAGENTES

 Erlenmeyer
 Balança
 Pipeta
 Agitador magnético ou mecânico
 Manta de aquecimento
 Termômetro
 NaOH (Hidróxido de sódio)
 H2O2 (Peróxido de hidrogênio)
 NH4OH (Hidróxido de amónio)
 HCl (Ácido clorídrico)
 HNO3 (Ácido nítrico)
 CH4O (Metanol)
 ((3-mercaptopropil) metiltrietoxisilano)
 Água deionizada
 Thiol 6 MHA

Os substratos de quartzo foram limpos imergindo-os em uma solução de NaOH à 2 M

durante 1 h, seguido por 7 min de segunda solução com uma mistura de 1:1:5,
respectivamente H2O2 (30% v /v), NH4OH (25% v/v) e água deionizada à 80-90 °C. Esse
procedimento garantiu uma camada de óxidos. Depois de limpos, os substratos de quartzo
foram imersos em uma solução contendo ((3-mercaptopropil) metiltrietoxisilano) (Sigma-
Aldrich), dissolvido em 95:5 (v/v) metanol/água a mistura a 2% (v/v) durante 72 horas.

Em seguida, os substratos foram lavados com metanol e desidratados com nitrogênio,

e depois secos em uma estufa de secagem por 10 minutos a 105 °C. As amostras de quartzo
com 3-mercaptopropi-metiltrietoxisilano foram imersas na solução de NPAus, para formar
uma monocamada de NPAus durante toda a noite. Ao fim, os substratos foram imersos em
 52

uma mistura aquosa de 0,4 mM de cloridrato de hidroxilamina e uma solução a 0,1% (w/v)
(HauCl4.3H2O) Figura (A).

Preparação da monocamada de thiol.

Os detalhes experimentais sobre a deposição das monocamadas de thiol 6 MHA sobre
NPAus em substratos revestidos, descritos em (FREDERIX, et al., 2003).

Figura 12 - Solução de Nanopartículas de Ouro figura A, Substrato com monocamada de NPAu

com thiol 6 MHA figura B

A B

Fonte: (Autor, 2015)

5.4 Medidas de espectrofotometria óptica UV-Vis

As medidas de absorção ótica foram utilizadas para avaliar a qualidade das amostras
sintetizadas, ou seja, se houve inicialmente a formação de NPs e também para acompanhar
possíveis mudanças de forma e tamanho durante a síntese. Neste estudo, os espectros foram
registrados em um espectrofotômetro UV-Vis-NIR (UV-3600 Shimadzu) projetado para a
medição de amostras líquidas. Este equipamento possui três detectores e um monocromador
de desempenho duplo para garantir alta sensibilidade, ruído reduzido e baixa dispersão de luz.
 53

Logo, após a síntese os coloides foram inseridos em cubetas de quartzo ultra pura da
Hellma com 1 cm de caminho óptico. As medidas varreram o intervalo de 200-800 nm em
comprimento de onda. Cobrindo toda a região de interesse na observação das nanopartículas
de ouro e prata.

5.5 Medidas de microscopia eletrônica de transmissão

Análises de MET de alta resolução (HRTEM) foram obtidas no Centro de

Microscopia do Nordeste (CETENE) utilizando usando o Microscópio Eletrônico de
Transmissão FEI TECNAI 20. A análise qualitativa foi realizada por um espectrômetro de
dispersão de energia (EDS) acoplado ao Microscópio Eletrônico de Transmissão FEI
TECNAI 20 operando a 200 kV.
A concentração da solução influencia fortemente o número de camadas de
nanopartículas depositadas e deve ser otimizada para que se obtenham imagens que permitam
a determinação da distribuição de tamanhos. As suspensões de nanopartículas de prata
analisadas em óleo de copaíba foram diluídas no respectivo líquido (1/10) e a nova solução foi
colocada sob uma grade de cobre (300 mesh) recoberto com carbono e cuidadosamente
raspados horizontalmente (em relação a grade) para que houvesse a formação de um filme
extremamente fino, possibilitando uma melhor visualização no microscópio. Já as
nanopartículas de ouro em água foram colocadas sob grade de cobre direto utilizando o
mesmo método anterior citado.
Após a mensuração das nanopartículas em diferentes campos de observação, as
imagens foram usadas para determinação do diâmetro médio das nanopartículas. A
distribuição de tamanho das nanopartículas foi determinada pelo negativo original,
digitalizado e expandido para 470 pixel/cm para uma resolução e medida mais precisa. O
histograma de distribuição de tamanho foi obtido pela contagem de aproximadamente 300
partículas. O diâmetro das partículas nas micrografias foi medido usando o programa
Photoshop.
 54

5.6 Medidas de microscopia força atômica

As imagens de AFM são obtidas pela varredura da superfície da amostra pela ponteira
mantendo-se fixa a força de interação ponta-amostra. A manutenção do nível de força entre a
superfície da amostra e a ponteira é obtida por meio do uso da realimentação eletrônica (PID)
que corrige continuamente a posição vertical do cantilever (em relação à amostra) como uma
variação do sinal de entrada no sistema de realimentação devido à variação topográfica da
amostra. A topografia é reconstruída a partir do movimento vertical usado para manter o nível
de ajuste da força fixo. Os diferentes modos para obtenção de imagens disponíveis dependem
do sinal de entrada usados no circuito de realimentação para controlar a posição vertical da
ponteira.

Neste trabalho, as imagens de AFM foram realizadas usando um microscópio de força

atômica MV4000TM (Nanonics, Israel), em modo intermitente e usando uma sonda de vidro
em um “Tunning Fork” com uma ponteira de 10 nm de diâmetro, frequência de ressonância
de 37.5kHz e fator de qualidade 1870. As imagens mostradas na figura 20 e 21 possuem uma
área de 1m1m e resolução de 256256 pontos. O sistema foi acusticamente isolado para
reduzir as interferências de ruído ambiente durante as medidas. Todas as imagens foram
realizadas em ar em condição ambiente com temperatura variando entre 23ºC e 25ºC e
humidade relativa variando de 35% a 45%.
 55

6 RESULTADOS

Após a síntese das nanopartículas, a caracterização física das amostras foi realizada
nas dependências do Grupo OPTMA utilizando espectroscopia de UV-VIS, quanto no Centro
de Tecnologia do Nordeste (CTENE) utilizando Microscopia Eletrônica de Transmissão. As
NPs Ag apresentaram na região visível do espectro uma banda com pico máxima de absorção
de 420 nm, devido o efeito de ressonância de plasmon de superfície (Figura 13). As imagens
de MET (Figura 14 e 15) mostram a dispersão das NPs Ag esféricas e a figura 16 mostra a
distribuição de tamanho em torno de 7 nm.

Figura 13 - Gráficos de Absorção das NPAgs em água, mostra resonância de plasmo da prata
em torno de 420nm

1,0
AgNPs
0,9

0,8

0,7

0,6
ABS

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0
350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
wavelength (nm)

Fonte: (Autor, 2015)

 56

Figura 14 - Imagens de HRTEM de NPAgs dispersas em óleo de copaíba.

Fonte: (Autor, 2015)

Figura 15 - Imagens de HRTEM de NPAgs dispersas em óleo de copaíba.

Fonte: (Autor, 2015)

 57

Figura 16 - Distribuição de tamanho da NPAgs realizado pela contagem do diâmetro de 100

partículas selecionadas aleatoriamente.

100

90

80

70

60
Contagem

50

40

30

20

10

0
0 5 10 15 20 25
diâmetro (nm)

Fonte: (Autor, 2015)

6.1 Efeitos sobre a cicatrização de feridas infectadas

O advento da nanotecnologia permitiu a utilização de partículas em nanoescalas, o que

criou novos horizontes terapêuticos, possibilitando a incorporação destas nanopartículas,
sobretudo as de prata – cujo comprovado efeito bactericida já foi descrito em diferentes tipos
de matriz, o que amplia suas aplicações.

Entretanto, as propriedades biológicas de colóides resultantes da incorporação de

nanopartículas metálicas em óleos minerais ainda não foram descritas. Sendo assim, nesta
etapa do trabalho avaliamos o efeito do óleo de copaíba associado à nanopartículas de prata
em modelos murinos de ferida cutânea infectada.

Análise histológica da ferida possibilitou avaliar a qualidade do processo de

cicatrização. As figuras 17 e 18 mostram a histologia das feridas após o tratamento com
 58

solução salina, óleo de copaíba (CO), nanopartículas de prata (NPAg), nanopartículas de prata
em copaíba (NPAgCO) ou Dermazine no 9º dia após a lesão.

A análise histológica de feridas tratadas com solução salina (NaCl, 0,9%) demonstra
uma epiderme totalmente desorganizada. Além disso, observa-se também uma menor
epitelização, bem como uma menor deposição de tecido conjuntivo no grupo de animais
tratados com salina (Figura 17 e 18). Áreas de degeneração tecidual, necrose e à persistência
de exsudatos inflamatórios na derme superior foi observada, juntamente com uma perda da
epiderme (setas). Em comparação, as feridas infectadas tratadas com CO ou NPAg mostrou
um menor teor de áreas necróticas do que aqueles tratados com solução salina isolada (Figura
17 e 18).

Os animais tratados com NPAgCO ou o medicamento de referência Dermazine®, por

outro lado, mostrou atenuação na infiltração de células inflamatórias e da proliferação
aumentada de fibroblastos (setas). No tratamento com NPAgCO houve uma re-epitelização
completa, resultando em uma epiderme bem organizado (*), comparável à da pele normal
adjacente, que não estava envolvida na geração de feridas e cicatrização (Figura 17 e 18). As
feridas tratadas com NPAgCO demonstraram uma formação melhorada da epiderme e a
deposição de tecido conjuntivo, quando comparado com os outros grupos (Figura 17 e 18).
 59

Figura 17 - Análise histológica no 10º dia de experimento da remodelação da epiderme/derme

dos animais tratados com veículo (salina); com óleo de copaíba, controle negativo; com a
associação entre óleo de copaíba e nanopartículas de prata (NPAgCO); e com o fármaco de
referência, Dermazine. Secções de pele coradas com hematoxilina e eosina. Aumento de 10x.

Salina CO

NPAg NPAgCO

Dermazine
Fonte: (Autor, 2015).
 60

Figura 18 - nálise histopatológica no 10º dia de experimento da deposição de colágeno nos

animais tratados com veículo (salina); com óleo de copaíba; com a associação entre óleo de
copaíba e nanopartículas de prata (NPAg+OC); e com o fármaco de referência, Dermazine.
Secções de pele coradas com tricrômio de Masson, com propriedade de corar em azul as fibras
colágenas. Aumento de 20x.

Salina CO

NPAg NPAgCO

Dermazine
Fonte: (Autor, 2015)
 61

Os resultados da análise histológica estão resumidos na Tabela 4.

Tabela 4 - Efeito do tratamento com colóide no modelo de ferida infectada.

Parâmetro

Tratamento Área da ferida (cm2) em dias

3 6 9

Salina 1,59 ± 0,02 1,38 ± 0,03 1,17 ± 0,01 17,50 ± 0,50

CO 1,61 ± 0,01 1,27 ± 0,02 0,90 ± 0,03 17,50 ± 0,50

NPAg 1,58 ± 0,07 1,22 ± 0,02 ** 0,92 ± 0,02 *** 17,00 ± 0,00

NPAgCO 1,44 ± 0,02 ** 1,00 ± 0,02 *** a 0,44 ± 0.03 *** b 12,50 ± 0,50

Dermazine® 1,53 ± 0,05 1,18 ± 0,04 *** 0,71 ± 0,04 *** 15,00 ± 0,00

Fonte: (Autor, 2015)

Os valores representam a média ± S.E.M. (n = 4). CO = óleo de copaíba, NPAg =

nanopartículas de prata e NPAgCO = nanopartículas de prata em óleo de copaíba. As
diferenças estatísticas foram determinadas por ANOVA seguido de Student-Newman-Keuls.
*** P <0,001, ** P <0,01 em comparação com o respectivo tratamento salino. aP <0,001 e
b
P<0,01 em comparação com animais tratados com Dermazine ®
 62

6.2 Efeitos sobre Biossensores

As imagens de MET (Figura 19A e 19C) mostram a dispersão das NPs Ag esféricas e
a figura 19B mostra a distribuição de tamanho em torno de 5 a 6 nm. As NPAu apresentaram
na região visível do espectro uma banda com pico máxima de absorção de 515 nm, devido o
efeito de ressonância de plasmon de superfície (Figura 20A).

Figura 19 - Distribuição de tamanho da NPAu realizado pela contagem do diâmetro de 350

partículas (Figura B) e imagens de HRTEM de NPAus dispersas em água (Figuras A e C)

400
A B
350

300

250
Contagem

200

150

100

50

0
0 2 4 6 8 10 12

C Diâmetro (nm)

Fonte: (Autor, 2015)

 63

Figura 20 - Gráficos de Absorção das NPAus em água, mostra ressonância de plasmon do ouro
(Figura A) e solução de NPAus utilizada para realizar filmes de monocamadas (Figura B)

1,0 B
0,9 A
0,8

0,7

0,6 A
Abs.

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0
300 400 500 600 700 800
Wavelength nm.

Fonte: (Autor, 2015)

Figura 21 - Monocamada de ouro nanoparticulado sobre uma lâmina de vidro (Figura A e B) e o

gráfico apresentando a ressonância de plasmo do ouro em solução e sobre a lâmina de vidro
(Figura C)

A B

Fonte: (Autor, 2015)

 64

0,30
C 545 nm
AuNPs
Slide 2
0,25
1,0 515 nm Slide 3
Slide 4
Slide 5 0,20
Abs

0,15

0,5
0,10

0,05

0,0 0,00
400 500 600 700 800

wavelength (nm)
Fonte: (Autor, 2015)

Depois de limpos os substratos de quartz, eram mergulhados a noite toda no adesivo

orgânico 3-mercaptopropi-metiltrietoxisilano, no dia seguintes limpos com Metanol para
retirar o excesso de adesivo. Na sequência os substratos foram mergulhados na solução de
NPAus como mostrado nas figuras 12A e 12B. Nas figuras 20A e 20B podemos observar os
substratos revestidos com monocamadas de NPAus, a cor pode mudar da cor rosa para violeta
e para azul, dependendo do tempo de contato entre substrato e solução de NPAus e, por
conseguinte, a espessura da película das partículas. Frederix e colaboradores (2003)
utilizaram o método de galvanização (Eletrodeposição) para que tenha monocamadas
homogêneas e controle da espessura da monocamada de nanopartículas de ouro.

Podemos observar um deslocamento da banda de absorção de 515 nm (NPAus) para

545 nm filme monocamadas (30 min imersos na solução de NPAus). As nanopartículas
depositadas sobre o quartzo com 3-mercaptopropi-metiltrietoxisilano foram comparadas com
as partículas em solução como mostrado no gráfico na figura 20C. Essa mudança já era
esperada, por que é dependente do tamanho e forma das partículas e de como elas ficaram
dispersas ao longo do substrato e a distância interpartículas dos clusters ou/ ilhas ao logo do
substrato de quartz.

A distribuição de tamanho das partículas de ouro na superfície não é uniforme como

mostrado nas figuras 22A, 22B, 23A, 23B e 23C. Essas não uniformidade em relação aos
 65

achados de Frederix e colaboradores (2003) relatam a necessidade de utilizar um processo de

galvanização para obeter superfícies com maior homogeneidade.

Na figura 22C observamos altura desses “clusters” em torno de 20 a 25 nm.

Figura 22 - Imagens de Microscópia de Força Atômica mostrando a distribuição (Figura A e B)

e o tamanho (Figura C) do “cluster” de ouro sobre o substrato de vidro.

A B

C 35
30
25
20
Z[nm]

15
10
5
0
-5
0 200 400 600 800 1000

X[nm]

Fonte: (Autor, 2015)

 66

Figura 23 - Imagens de Microscópia de Força Atômica mostrando a distribuição em

monocamadas (Figura A e C), a altura (Figura B) e o tamanho (Figura D) dos “clusters” de ouro
sobre o substrato.

A B

D
20

15
Z[nm]

10

0
0 50 100 150 200

X[nm]

Fonte: (Autor, 2015)

 67

Na figura 24 nota-se o reconhecimento molecular de anti-eotaxina e eotaxina podem

ser detectados como uma mudança da ressonância plasmon de superfície e uma mudança na
frequência de ressonância, observamos um acréscimo na absorbância em torno de 535 nm.

Figura 24 - Espectro de absorção das NPAus na revestida com anti-eotaxina a anti-eotaxina

conjugada com o antígeno (eotaxin).

0,006

NPAu+Thiol+Anti_body
0,005 NPAu+Thiol+Anti_body+Eotaxin

0,004

0,003
Abs

0,002

0,001

0,000
450 500 550 600 650 700 750
wavelength (nm)

Fonte: (Autor, 2015).

 68

7 DISCUSSÃO

Materiais em escala nanométrica têm recebido bastante atenção, pois apresentam

propriedades únicas e diferentes tanto do átomo isolado como do material convencional
(bulk). Seguindo neste avanço tecnológico as nanopartículas metálicas estão sendo em
diversos campos do conhecimento, incluindo a química, física, engenharia, biologia e
medicina. Como consequência destes avanços, ações de P&D (pesquisas/desenvolvimento)
com nanopartículas metálicas têm permitido aplicações para a área biomédica incluindo
diagnósticos e tratamentos inovadores. Buscando inserção mundial neste ambiente científico,
nos últimos vinte anos, vários grupos de pesquisa pelo Brasil vêm desenvolvendo ações para
dominar as 3 diferentes dimensões (síntese, caracterização e aplicação) que compreendem o
universo das nanopartículas.
Na Universidade Federal de Alagoas (UFAL), na última década, buscou-se agregar um
grupo de pesquisadores com competências e habilidades para realizar estudos na área de
síntese, caracterização e aplicações de nanopartículas metálicas para biologia e engenharia.
Neste grupo, buscamos estabelecer, in loco, infraestrutura e conhecimento capazes de permitir
dominar as diferentes dimensões da nanotecnologia e, com isso, avançar no conhecimento.
Portanto, considerando este racional, no presente trabalho buscou-se estabelecer na UFAL a
síntese, caracterização e aplicações de nanopartículas metálicas em diferentes áreas da
biologia.
Inicialmente, para atender a dimensão de síntese, a produção de nanopartícula metálica
de prata (Ag) e ouro (Au) foi realizada utilizando-se o método de redução química e deposição
física (sputtering), respectivamente. Em seguida, as nanopartículas foram caracterizadas
utilizando-se diferentes métodos físicos, incluindo Microscópia Eletrônica de Transmissão de
alta resolução (HRTEM), Espectroscopia Ultravioleta Visível (UV-Vis) e Microscopia de Força
Atômica (AFM). Por fim, as nanopartículas sintetizadas na UFAL foram propostas para serem
aplicadas em duas áreas do conhecimento biológico, a terapêutica e o diagnóstico. Neste
sentido, a nanopatícula de prata foi utilizada para obtenção de uma composição farmacêutica
utilizando óleo de copaíba, cujo propósito de utilização desta mistura foi à obtenção de um
agente com potencial cicatrizante para feridas cutâneas infectadas. No caso das nanopartículas
de ouro, o propósito foi o desenvolvimento de um biossensor capaz de identificar um mediador
inflamatório chave capaz de predizer o acúmulo de eosinófilo no tecido inflamado, a eotaxina.
 69

Na literatura podemos encontrar uma vasta literatura científica sobre vários tipos de
sínteses capazes de controle o tamanho, e até mesmo a estabilização por longos períodos das
NPAgs. Nós utilizamos a metodologia da redução utilizando citrato de sódio com adição de
borohidreto de sódio. O borohidreto de sódio é adicionado em uma pequena fração junto com
citrato de sódio. Visto que na literatura é reportado como um método de fácil execução, baixo
custo, e ainda capaz de estabilizar a solução coloidal evitando a agregação das nanopartículas
de prata (KHEYBARI, et al., 2010). Uma das grandes dificuldades reportadas na literatura é a
reprodutibilidade de síntese das NPAgs (CATALINA; ERIC, 2010). Após várias tentativas de
sínteses chegamos a um protocolo ideal capaz de garantir o tamanho e tempo ideal para
melhor estabilização das nanoestruturas. Para acompanhar esta estabilidade, mantivemos um
monitoramento das propriedades ópticas com ao auxílio da espectroscopia de UV-Vis. Em
sintonia com nossos achados, estudos de prévios, empregando um protocolo similar ao
utilizado neste estudo, reportam que as NPAgs são capazes de serem mantidas sem agregação
por longos períodos de armazenagem (KHEYBARI, et al., 2010). Vantagem de utilizar esse
método é o tempo de estabilização da NPAgs, observou-se por um período de
aproximadamente 7 meses que não havia agregração das nanopartículas de prata.

Para melhor domínio sobre as aplicações biológicas das nanopartículas, torna-se

necessário ampliar o conhecimento sobre as características físicas desta nanoestrutura. Logo,
espera-se um melhor entendimento sobre as potenciais interações com os sistemas biológicos.
Neste sentido, a microscopia eletrônica de transmissão e a espectroscopia de UV-VIS
mostram-se como ferramentas importantes para determinar a distribuição, diâmetro e
morfologia das nanopartículas. Aqui, a ressonância de plasmon de superfície na região de 420
nm confirmou a natureza química das nanopartículas de prata, e a microscopia eletrônica
revelou a forma esférica e o diâmetro médio de 7 nm, outra característica observada que as
nanopartículas de prata estavam bem dispersas.

Diversos estudos descrevem as propriedades biológicas das nanopartículas de prata e

suas variadas aplicações biomédicas, principalmente devido a relevante papel bactericidas e
anti-inflamatório, essenciais para a melhoria no processo de cicatrização de feridas, sendo
atualmente explorada no desenvolvimento de fármacos mais eficientes que aceleram aumento
da taxa de epitelização em feridas infectadas (KERMANIZADEH et al., 2013; RIGO et al.,
2013; CHALOUPKA et al., 2010). No mesmo racional, o óleo de copaíba é descrito com
 70

propriedades anti-inflamatória, analgésica e cicatrizante (BASILE , et al., 1988; BRITO, et

al., 1999).
Focados na aplicação das nanopartículas de prata sintetizadas e caracterizadas neste
trabalho, verificamos que animais com feridas cutâneas infectadas com Staphylococcus
aureus, exposta a uma emulsão composta por nanopartículas de prata em óleo de copaíba
exibiram uma redução no infiltrado de células inflamatórias, além de uma proliferação
aumentada de fibroblastos e uma re-epitelização completa com a formação de uma epiderme
bem organizada quando comparada ao controle.
A atividade da emulsão composta por NPAgCO apresentou-se como um promissor
cicatrizante por potencializar as características inerente a ação de ambos os componentes no
processo de cicatrização de feridas cutâneas infectadas com S. aureus, principal agente
infeccioso da pele e associadas com resistência a antibióticos.
Corroborando com os resultados do presente estudo, Krychowiak e col. (2014)
demonstraram que a combinação de nanopartícula de prata com extrato de Drosera binata e o
seu composto isolado (3-chloroplumbagin) atuam como propriedades bactericidas em S.
aureus resistentes a antibióticos. As nanopartículas de prata podem contribuir para o
desenvolvimento de novos materiais e substâncias com ação antimicrobiana e que contribuam
na para o processo de cicatrização. Chenwen e colaboradores (2013) verificaram em analises
in vivo e in vitro que curativos biativos desenvolvidos a partir da associação do polímero
(álcool polivinílico) com nanofibras de prata não apresentaram efeito tóxica e boa
biocompatibilidade, demonstrando excelente atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-
positivas S. aureus e E. coli gram-negativo.
A literatura científica reporta vários tipos de sínteses capazes de controle o tamanho, e
até mesmo a estabilização por longos períodos das NPs. Nós utilizamos a metodologia de
redução por citrato de sódio, visto que na literatura é reportado como um método de fácil
execução, baixo custo, e ainda capaz de estabilizar a solução coloidal evitando a agregação
das nanopartículas de ouro (JIN KANG, et al., 2001 ).

Uma das grandes dificuldades reportadas na literatura é a reprodutibilidade de síntese

das NPAus (FREDERIX, et al., 2003). Após várias tentativas de sínteses chegamos a um
protocolo ideal capaz de garantir o tamanho e tempo ideal para melhor estabilização
(aproximadamente 6 meses) das nanoestruturas. Para acompanhar esta estabilidade,
mantivemos um monitoramento das propriedades ópticas com ao auxílio da espectroscopia de
 71

UV-Vis. Em sintonia com nossos achados, estudos de prévios, empregando um protocolo

similar ao utilizado neste estudo, reportam que as NPAus são capazes de serem mantidas sem
agregação por longos períodos de armazenagem (JIN KANG , et al., 2001 ).

Para melhor domínio sobre as aplicações biomédicas das nanopartículas, torna-se

necessário ampliar o conhecimento sobre as características físicas desta nanoestrutura. Logo,
espera-se um melhor entendimento sobre as potenciais interações com os sistemas biológicos.
Neste sentido, a microscopia eletrônica de transmissão e a espectroscopia de UV-Vis
mostram-se como ferramentas importantes para determinar a distribuição, diâmetro e
morfologia das nanopartículas. Aqui, a ressonância de plasmon de superfície na região de 515
nm confirmou a natureza química das nanopartículas de ouro, e a microscopia eletrônica
revelou a forma esférica e o diâmetro médio de 5-6 nm.

Sensores que utilizam absorção da luz de nanopartículas de ouro depositadas sobre

substrato de vidro e utilizam a característica a ressonância de plamons superfície são
amplamente estudados devido a sua afinidade e fácil manufatura (FREDERIX , et al., 2003).
Tais sensores demostraram uma ressonância de plamons de superfície susceptível para
adsorver monocamadas de thiol, e, com isso, ampliar suas aplicações como biosensores
devido a diversidade de componentes de captura que podem ser inseridos nas terminações
thiols. Em alguns casos, a absorbância da monocamada de NPAus ligadas ao quartzo tem
sensibilidade maior a alterações nas propriedades dielétricas após ligação de biomoléculas,
em comparação com ressonância de plasmon de superfície de uma única NPAus.

Frederix e colaboradores (2003) elucidam um problema comum no que diz respeito à

deposição NPAus em monocamadas sobre substrato de quartz utilizando adesivos a base por
exemplo, Cr ou Ti, que são conhecidos por bloquear os fenômenos de ressonância de plasmon
de superfície e por alagar a banda de ressonância de plasmon, para evitar esse mesmo
problemas utilizamos um adesivo orgânico 3-mercaptopropi-metiltrietoxisilano.

Finalmente, foi montando um biosensor experimental para realizar um experimento

simples para mostrar o potencial deste método para detecção e aplicação real de um biosensor.
O método se revelou versátil o que permite aplicações nas fases líquida e gasosa. Além disso,
esta nova abordagem é promissora como uma alternativa fácil e de baixo custo para as
técnicas biosensoriamento convencionais.
 72

8 CONCLUSÕES

Com este estudo foi possível padronizar metodologias de síntese e caracterização de

nanopartículas metálicas na UFAL, bem como propor aplicações de relevância para desafios
na área biológica. Além disso pode ser concluído que:

 As NPs Ag sintetizadas e utilizadas para aplicação no ensaio biológico de ciatrização

apresentaram forma esférica e diamentro médio de 7 nm. Cabe destacar que estas
nanoestruturas em solução coloidal apresentaram-se estaveis à temperatura ambiente
por aproximadamente 7 meses.

 As feridas tratadas com NPAgCO demonstraram uma formação melhorada da

epiderme e a deposição de tecido conjuntivo, quando comparado com CO, NanoAg e
Dermazine®. Dessa maneira, quando as nanopartículas de prata são associadas com
compostos naturais com capacidade de cura, como o óleo de copaíba, surge uma classe
inovadora de medicamentos com potencial para a cura de feridas cutâneas infectadas
por bactérias.

 As NPAus sintetizadas e utilizadas confecção de um biossensor apresentaram forma

esférica com diamentro médio de 5 a 6 nm, e mostraram-se estaveis à temperatura
ambiente por aproximadamente 6 meses.

 Este estudo revela, pela primeira vez, o efeito das nanopartículas de prata em melhorar
os efeitos cicatrizantes do óleo de copaíba quando aplicado em feridas infectadas com
S. aureus.

 Estudos de caracterização física revelaram que a distribuição de tamanho das

partículas de ouro na superfície não foram uniformes.
 73

 O biossensor idealizado e confecionado neste estudo utilizando nanopartículas de ouro

revelou alterações na intensidade do comprimento de onda da ressonância de plasmon
demonstrando seu funcionamento.
 74

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