Rutura Celular

Separação e Purificação de Bioprodutos
Rutura /
Desintegração Celular
6.1
Biotecnologia + Engenharia Biomédica
Plano da aula
 Introdução
 Parede celular
 Efeito das condições a montante
 Determinação do rendimento de rutura
 Métodos de rutura – princípios de funcionamento
 Métodos de rutura – vantagens e desvantagens

6.2
1
Introdução
 O aparecimento de produtos obtidos por técnicas de ADN

recombinante e a necessidade de se obter enzimas ou produtos

metabólicos específicos forçou o desenvolvimento de métodos
para a rutura celular
Células
produtoras de
Extracelular metabolitos de Intracelular
interesse
comercial
Romper a parede celular
6.3
 A rutura celular
 é das primeiras etapas no processo de isolamento de materiais

intracelulares
 é essencial no processo de "downstream“, afetando quer a
quantidade total da molécula de interesse a ser recuperada, quer a
sua atividade biológica
 Na rutura celular é importante:

 a associação da molécula de interesse com outros componentes
celulares;
 a possível presença de degradação enzimática;
 a eventual presença de contaminantes que podem influenciar o
desempenho das etapas subsequentes de purificação; e
 a eventual presença de contaminantes que afetem a atividade
biológica
6.4
2
 O processo de rutura celular é um fator chave na produção e
purificação de moléculas intracelulares, tendo impacto na

recuperação e qualidade do extrato celular
 No caso de proteínas (/enzimas) intracelulares:

 cada microrganismo possui características individuais quanto à
localização das enzimas intracelulares que produz
 a enzima de interesse pode estar no citoplasma, no periplasma ou,
ainda, estar armazenada no interior de algum organito celular, tal
como a mitocôndria.
 deste modo, o protocolo para a rutura celular e para a extração pode
variar em função do produto desejado
http://www.youtube.com/watch?v=1xaCxiIwEx4
Extraction of proteins from tumor tissues for studying different post
translational modifications in proteins
ESTE VÍDEO TEM ERROS NAS TEMPERATURAS
6.5
Parede celular
 A parede celular tem funções mecânicas e funções

bioquímicas
 função mecânica – confere rigidez à célula e permite-lhe resistir
a agressões do meio
 função bioquímica – permite trocas com o exterior necessárias
ao metabolismo celular
 Todos os organismos têm parede celular?

 não
 quando existe, a composição e estrutura da parede celular
varia de organismo para organismo
 As paredes celulares de diferentes organismos terão a

mesma resistência à rutura?
 não
6.6
3
Parede celular
 A composição e estrutura da parede celular varia com a

célula:
 Bactérias
 género Mycoplasma
 Gram-
 Gram+
 Fungos
 Leveduras ou bolores
 Tecidos vegetais
 Tecidos animais
6.7
Parede celular – Bactérias
 O género Mycoplasma não possui parede celular

 As bactérias dividem-se em dois grandes grupos, Gram+ e

Gram-
 Todas as bactérias possuem uma membrana celular (onde ocorre

a fosforilação oxidativa
 Envelope celular: distinção entre Gram+ e Gram-
 A parede celular varia – encontra-se fora da membrana celular; é

rígida e protege a célula da lise osmótica
Staphylocccus Proteus vulgaris e
aureus Pseudomonas sp.
(Gram+)
900x
6.8
4
Coloração de Gram e o envelope celular
 Gram-
 Membrana exterior é a principal barreira à permeabilidade
 Espaço entre a membrana interna e externa

 Espaço periplasmático: armazenamento de enzimas
6.9
GRAM - - envelope celular

Membrana exterior
(principal barreira à permeabilidade) Lipopolysaccharide
Porin
lipoproteina Braun
enzima
Periplasmic binding protein

Inner (cytoplasmic) membrane Permease
Cytoplasm
LDomingues 10
5
Coloração de Gram e o envelope celular
 Gram+
 Sem espaço periplasmático
 A maior espessura da camada de peptidoglucano, que nestes

organismos aparece associado a ácidos teicoicos e a
polissacáridos, confere-lhes, em geral, uma maior resistência à
rutura.
6.11
GRAM + - envelope celular

enzima
ácido Lipoteichoic ácido Peptidoglycan-teichoic
Membrana Citoplasmática
Citoplasma
6.12
6
Parede celular-Fungos
 Os organismos que pertencem ao Reino Fungi contêm quitina

na sua parede celular
 Composição química da parede celular

 Estrutura microfibrilar embebida numa matriz polimérica
 Polissacáridos (~80 %) associados a proteínas (~20 %) e
lípidos (1-13,5 %)
6.13
Fungos - Organização vegetativa

Talo – estrutura somática ou vegetativa de um fungo
a. Unicelular (Leveduras)
b. Filamentoso (Bolores)
hifas – filamentos microscópicos
micélio – rede de hifas
A hifa é a unidade estrutural

característica dos fungos
Dimorfismo
Alternância entre fase unicelular e micelar em resposta a variações nas condições

ambientais (temperatura, nutrientes, tensão de CO2, ...).
6.14
7
Células vegetais e outras células
 Algas
 A celulose é o principal componente estrutural da parede celular,

mas mananos e xilanos também se encontram presentes
 a parede celulósica, comum às células vegetais, é rígida e difícil
de romper
 As células animais, as bactérias halofílicas e as bactérias

Mycoplasma apresentam uma baixa resistência à rutura e
podem ser facilmente lisadas por stress osmótico num meio
hipotónico
 contudo, há células animais mais resistentes à rutura (e.g.,

parede dos vasos sanguíneos)
6.15
Efeito das condições a montante
 Efeito das condições a montante no desempenho da rutura

celular
 Condições que afetam a síntese da parede celular durante o

processo de crescimento
 Fase de crescimento
 fase estacionário vs fase de crescimento exponencial
 Taxa específica de crescimento
 Idade
 nº de gerações
 Como determinar o rendimento de desintegração?

 como avaliar a lise celular e a atividade do material libertado?
6.16
8
Tecidos sem
sementes
vegetais
bactéria
animais
Células
células
parede
fungos
algas,
rígida
Descrição
Métodos físicos ou químicos

Choque osmótico — — — — — •
Ciclos de azoto líquido — — — — — •

congelação-
descongelação
detergente por vezes a montante doutro método — — — — — •
enzimas e.g., celulases e pectinases em células vegetais; liticase • • — • — •

para leveduras; and lisozima para bactérias.
por vezes a montante doutro método
Métodos mecânicos
Sonicação Curtos ciclos de ondas ultrassónicas • • — — — •
• • — — — •
Prensa francesa
Moagem Pilão e almofariz • • • • • —
Homogeneização — — — • • —
mecânica
Homogeneização abrasão • • — — — •
com esferas de
vidro
6.17
Rendimento da
desintegração celular
6.18
9
 Como determinar o rendimento de desintegração?
 como avaliar a quantidade de células que se desintegraram e

a atividade do material libertado?
 Métodos diretos
 técnicas de plaqueamento
 observação/contagem ao microscópio
 contagem eletrónica
 …
 Métodos indiretos
 proteínas solúvel
 atividade enzimática
 turbidez
…
R – quantidade de produto libertado
Rm – quantidade máxima de produto para libertar
6.19
Rutura celular
suspensão
separação separação suspensão
em solução
das células de células em solução
de lavagem
solução 2ª separação 1ª separação

rutura
para de fragmentos de fragmentos
celular
purificação celulares celulares
 parte 1
 https://www.youtube.com/watch?v=5eKdZ0dVCCo
 parte 2
 https://www.youtube.com/watch?v=VKpthcW1llU
 parte 3
 https://www.youtube.com/watch?v=N7vxq948l-U 6.20
10
Métodos de rutura celular
Métodos de rutura celular
Mecânica Não mecânica
Atrito
Atrito sólido
hidrodinâmico Físicos Químicos Enzimáticos
6.21
Métodos de rutura mecânicos

Mecânicos
Atrito
Atrito sólido
Hidrodinâmico
Agitação mecânica Pressão Moagem Pressão

Ultra-sons
(Misturadores/ (Homogeneizador, (Moinho de bolas; (Prensa Hughes e
(Sonicação)
desintegradores) Prensa Francesa) Almofariz) X)
Os métodos mecânicos originam uma grande libertação de calor, sendo necessário arrefecer para
evitar a desnaturação dos produtos pretendidos
6.22
11
Rutura mecânica – atrito sólido
 A suspensão celular é congelada (< -10 ºC) e forçada a
passar por orifícios, onde a compressão contra os

cristais de gelo promove a rutura
6.23
Rutura mecânica – atrito hidrodinâmico

 Homogeneizador mecânico de alta pressão (tipo APV
Manton-Gaulin) – identico ao anterior, mas não

congelado
A, B – mola
C – válvula
D-sede da válvula
E – anel de impacto
6.24
12
Homogeneizador mecânico de alta pressão
 Nos homogeneizadores de alta pressão, a suspensão celular é

forçada através de um orifício existente na sede da válvula, que

funciona como pistão, obrigando as células a sofrer um forte
impacto contra um anel lateral.
 Conseguem-se eficiências de desintegração bastante elevadas,

sendo mesmo possível atingir os 100 %
 A cinética de desintegração é de primeira ordem relativamente

ao número de passagens:
k – constante
N – nº de passagens
P – pressão de operação
a – depende do organismo
6.25
Homogeneizador mecânico de alta pressão
 Homogeneizador de Manton-Gaulin APV

k – constante
N – nº de passagens
P – pressão de operação
a – depende do organismo
microrganismo a
Levedura padeiro 2,9
Bacillus brevis 1,8
Escherichia coli 2,2
Candida utilis 1,8
Saccharomyces cerevisiae 0,86
Bacillus subtilis 1,07
6.26
13
 Problema
 Testes com um homogeneizador Manton-Gaulin APV e uma

suspensão de levedura de padeiro indicaram uma recuperação
de proteína de 40 % por passagem, a uma queda de pressão de
400 bar.
 Calcule o número de passagens no homogeneizador para que a
recuperação suba para os 95 %.
6.27
Moinho de bolas
Câmara cilíndrica, com diferente geometria, onde tensões de
corte são geradas por discos fixos e esferas livres
6.28
14
Moinho de bolas
Câmara cilíndrica, com diferente geometria, onde tensões de
corte são geradas por discos fixos e esferas livres
 Operação em descontínuo
 Operação em contínuo
 Modelo dos tanques agitados em série
n – nº de tanques
6.29
Moinho de bolas
6.30
15
Moinho de bolas
Fatores que afetam a velocidade de desintegração:
1. Velocidade de rotação
2. Velocidade de alimentação
3. Diâmetro de esferas
4. Quantidade de esferas
5. Concentração de células
6. Temperatura
7. Geometria do agitador
8. Geometria da câmara
6.31
Ultrassons
 Gerador de energia elétrica a alta frequência (ca. 20 kHz)
a um transdutor que a transforma em vibração mecânica

(provoca cavitação e ondas de choque)
X – fração da proteína libertada (R/Rm)
6.32
16
 Ultrassons: sonicação
 Vantagens:
 Eficiente (~95 % rutura)
 Rápido (segundos a minutos)
 Efetivo contra muitos organismos
 Simples de operar
 Pequenos volumes (mililitros)
 Confinamento fácil
 Desvantagens:
 Grandes quantidades de calor geradas
 Uso laboratorial
 Baixa concentração celular
6.33
 Problema
 Usou-se uma estirpe de E. coli geneticamente modificada para produzir

citocromo b5 (proteína intracelular). A rutura das células foi feita por
sonicação a 20 kHz. Determinou-se o efeito da concentração celular na
eficiência de rutura e os resultados obtidos encontram-se apresentados
na Tabela 1.
Tabela 1 ‐ Efeito do volume da suspensão na cinética de
libertação de citocromo b5
Volume de suspensão k
(mL) (min-1)
50 0.93
100 0.44
200 0.23
 Com base na tabela, determine o tempo que demora a recuperar 90 % do

citocromo b5 em 200 ml de volume de suspensão.
 Explique como procederia para determinar a eficiência do processo de rutura
celular
10 min
6.34
17
Métodos de rutura não-mecânicos
Não-mecânicos
Secagem
Lise celular
(ar; vácuo; liofilização)
Química: Solventes;
Detergentes
Enzimática: lisozima e
Física: Osmótica; Ciclos Agentes caotrópicos enzimas relacionadas;
de Congelamento
Antibióticos fagos; antibióticos
Bases
6.35
Físicos: choque osmótico

Conceito: induzir uma mudança rápida na pressão osmótica
(NaCl, glicerol; sacarose), o que provoca o fluxo de água

para o interior da célula
Vantagens:
 Razoavelmente simples
 Não é necessário equipamento complexo
 Opera a baixas temperaturas
 Não afeta a estrutura proteica
 Efetivo contra células animais e bactérias gram-
Desvantagens:
 Nem sempre é efetivo contra outros microrganismos
 É necessária remoção de elevada concentração de sal a jusante
6.36
18
Físicos: Ciclos de congelação/descongelação
Conceito: congelar e descongelar sucessivamente;
permeabiliza a parede celular-conteúdos intracelulares

libertados na descongelação
Vantagens:
 A pasta celular pode ser manuseada num sistema assético
 Sistema ideal para armazenar o produto
 Relativamente simples e conveniente
 Capacidade para processar grandes amostras, desde que se
ultrapasse constrangimentos de transferência de calor
Desvantagens:
 Nem sempre é efetivo contra todos os microrganismos
 A eficiência de libertação da proteínas depende do organismo
 Dispendioso (principalmente a nível energético)
6.37
Físicos - Secagem
Conceito: desidratar a célula e fragilizar a sua estrutura
Vantagens:
 Razoavelmente simples
 Efetivo para grandes amostras: extratos de levedura e vegetais
Desvantagens:
 Etapas adicionais necessárias: concentração, desidratação
 Nem sempre efetivo contra todos os tipos de células
 Difícil de prever o desempenho
 Dispendioso (principalmente a nível energético)
6.38
19
Métodos químicos e enzimáticos
 Os métodos químicos podem promover a solubilização da

parede celular, atuando especificamente sobre alguns

componentes da membrana
 podem ser usados solventes orgânicos, detergentes, bases e

agentes quelantes
 Os enzimas podem hidrolisar as paredes das células

microbianas e, quando removida uma certa quantidade da
parede, a pressão osmótica pode rebentar a membrana
periplasmática, libertando o conteúdo intracelular.
 existem muitos preparados enzimáticos para utilização à escala

laboratorial
 apenas a lisozima é usada à escala industrial
6.39
 Em muitos casos, os métodos químicos e os enzimáticos não

provocam a desintegração celular, mas fragilizam a parede das

células tornando-as mais suscetíveis de romper por ação dos
métodos mecânicos
 É necessário ter em atenção o possível efeito desnaturante dos

agentes químicos sobre o produto que se pretende obter
6.40
20
Agentes químicos usados
 Solventes: tolueno, benzeno, hexano, etc
 o tolueno é o mais usado para permeabilizar células microbianas

 o clorofórmio também é usado em células Gram negativas para
extração seletiva de proteínas periplasmáticas
 Detergentes
 o SDS é o mais utilizado (com bact Gram negativas), e é mais
eficaz com células na fase exponencial de crescimento
 o Triton X-100 é mais utilizado com outras bactérias e com
leveduras
 detergentes não iónicos são usados para permeabilizar células
animais
6.41
Agentes químicos usados

 Agentes alcalinos
 a lise com substâncias alcalinas é das mais simples de promover

 as bases reagem com vários agentes da parede celular (e.g.,
saponificação de lípidos)
 exige produtos que mantenham atividade a pH entre os 11.5 e os
12.5, durante pelo menos 30 min
 Agentes quelantes
 estes agentes removem catiões da parede celular, desestabilizando-a
 o EDTA é o mais utilizado, ligando-se a Ca2+ e Mg2+
6.42
21
Seleção do método de rutura
1. O tipo de célula
2. Localização do produto intracelular

3. Aplicação pretendida para o produto
4. Sensibilidade do produto à temperatura e às forças de
tensão de corte
5. Facilidade de recuperação do produto dos segmentos
celulares
6. Simplicidade do método e custos de operação
7. Quantidade de células a processar
6.43
Bibliografia
1. Product Recovery in Bioprocess Technology; J.

Krijgsman; In: Biotechnology by open learning;

Butterworth-Heinemann, 1992
2. Aires Barros MR e Cabral JMS, Biosseparações, In:

Biotecnologia-Fundamentos e Aplicações, Lima N e Mota
M (eds), Lidel, 2003, pp 195-218.
6.44
22
Precipitação
7.45
Precipitação
 A precipitação é um método clássico utilizado principalmente

na recuperação de proteínas
 embora também possa ser utilizado na recuperação de outras
macromoléculas ou moléculas de baixo peso molecular
 o aumento de escala é simples
 A precipitação explora alterações na solubilidade de compostos

por alteração da composição do meio (e.g., adição de sais,
polímeros ou solventes)
 É predominantemente utilizada como etapa preliminar antes de

métodos de purificação de maior resolução
 e.g., antes duma cromatografia
7.46
23
Precipitação
 Usando como modelo a separação de proteínas, estas

apresentam à superfície grupos com carga positiva ou negativa

 em condições fisiológicas, a tendência é para a carga ser negativa
 Devido à polaridade, ocorre um equilíbrio entre a atração e a

repulsão entre os compostos polares em solução
 fruto destas forças, formam-se camadas limite à superfície das
proteínas com carga antagónica
 é a espessura desta camada limite que confere estabilidade à
proteína
 A adição de sais, polímeros, solventes ou polieletrólitos à

solução proteica, pode alterar a estrutura da camada limite que
estabiliza a molécula provocando a sua precipitação
7.47
Precipitação – adição de sais
 A adição de sais aumenta a força iónica do meio, diminuindo as

forças repulsivas e, consequentemente, a solubilidade – salting-

out
 As principais candicionantes da precipitação salina são:

 o custo do sal
 a solubilidade do sal (opera-se até 4 M)
 o calor de solução (pode desnaturar proteínas se elevado)
 a densidade final da solução (dificulta centrifugação)
 A eficiência é essencialmente devida ao anião (série de

Hofmeister)
citrato>fostafo>sulfato>acetato>cloreto>nitrato>tiocianato
 Os catiões devem ser monovalentes

7.48
NH4+>K+>Na+
24
 Sais mais utilizados
 Sulfato de amónio
 barato e muito solúvel
 corrosivo
 Sulfato de sódio
 elevado calor de dissolução
 baixa solubilidade abaixo dos 40 ºC
 Fosfatos de sódio ou potássio

 solúvel (menos que o sulfato de amónio e mais caro)
 corrosivo
 ação dependente da temperatura
7.49
 A precipitação com sais é um dos métodos mais antigos utilizados

para a recuperação de proteínas

 pela adição de sais, a solubilidade das proteínas (S) depende da força
iónica do meio de acordo com:
 onde:
  representa a força iónica do sistema;
  é característico de cada proteína e depende do pH e da temperatura
 K1 é característico de cada proteína e depende do sal utilizado
 aniões polivalentes (sais de sulfato ou de fosfato) apresentam valores

de K1 maiores, enquanto catiões polivalentes reduzem K1 (catiões de
cálcio ou de magnésio)
 daqui o sal mais utilizado ser o sulfato de amónio
 http://www.youtube.com/watch?v=F5pzOD-c6hg
7.50
25
 Problema
 Efetuaram-se testes preliminares para precipitar com sulfato de

amónio uma proteína que se encontra em solução numa
concentração de 15 g/l. Usaram-se duas concentrações de sal:
0,5 M e 1,0 M e as concentrações de proteína que
permaneceram em solução foram respetivamente 13,5 e 5,0 g/l.
Calcule a concentração de sulfato de amónio para se conseguir

recuperar 95 % da proteína.
7.51
Precipitação – ponto isoelétrico
 Atendendo a que a solubilidade em água diminui na

proximidade do pI
 o valor de  (equação anterior) atinge um mínimo perto do pI,

logo diminuindo a solubilidade
 a precipitação pode ocorrer usando menos sal ou outras sais mais

baratos e disponíveis (e.g., sais de ácido fosfórico, clorídrico ou
sulfúrico), e predominantemente a pH baixo
 em muitos casos não é necessário a posterior remoção do sal,

pois a concentração aplicada é baixa
7.52
26
Precipitação – polímeros não iónicos
 estes polímeros competem com as proteínas pela água de solvatação,

reduzindo a solvatação da proteína e a sua solubilidade
 estes não alteram a força iónica, nem o potencial eletrostático
 os polímeros mais usados são o dextrano e o polietileno glicol (PEG -

peso molecular entre os 4000 e os 6000 Da)
 na concentração usada (1 a 5 % PEG) a viscosidade não é elevada, nem
o custo elevado
 a solubilidade das proteínas decresce de forma exponencial com a

concentração do polímero, de acordo com
 S e S0 representam a solubilidade na presença e na ausência do polímero

e  uma constante
7.53
Precipitação por solventes
 A precipitação de proteínas pode também alcançar-se com

solventes orgânicos, neutros e de baixa polaridade

 e.g., metanol, etanol, ácido isopropílico
 A precipitação ocorre por redução da constante dielétrica que,

por sua vez, desestabiliza as interações eletrostáticas à
superfície das moléculas
 Atendendo a que estes solventes tendem a inativar moléculas

bioativas, a precipitação deve ocorrer a temperaturas baixas
Por vezes a temperaturas próximas de – 18 ºC
7.54
27
Precipitação por solventes
 A variação da solubilidade na presença do solvente pode ser descrita

por:
 onde:
 S e S0 representam a solubilidade na presença e na ausência do solvente;
 Dε representa a constante dielétrica (dependente do solvente)
 K2 representa uma constante dependente da temperatura e da proteína
 Quanto maior a constante dielétrica menor as forças de atração entre

grupos polares
 A Dε da água é cerca de 40 x maior que a de hexano
 o que indica uma força de atração muito maior em hexano e logo uma mais rápida
precipitação
7.55
Precipitação por polieletrólitos
 Os polieletrólitos atuam como agentes floculantes, como

combinação de efeitos de salting-out com exclusão molecular
 A interação é de natureza eletrostática, onde o polímero

polieletrólito liga-se a proteínas e a outros polímeros, formando
uma rede – ‘floco’
 Como exemplos de polieletrólitos destacam-se os polissacáridos

acídicos (e.g., carboximetil-celulose; alginato, pectato e
carraginato)
 A quantidade ótima de polieletrólito é determinada

empiricamente
7.56
28
Precipitação por iões metálicos
 Os iões metálicos são especialmente eficazes na precipitação de

proteínas de soluções diluídas
 Podem ser classificados em 3 grupos
Os que se ligam a ácidos carboxílicos e a compostos azotados

Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+ e Cd2+
Os que se ligam a ácidos carboxílicos

Ca2+, Ba2+, Mg2+ e Pb2+
Os que se ligam a grupos contendo enxofre

Ag+, Hg2+ e Pb2+
7.57
29

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Separação e Purificação de Bioprodutos

 Determinação do rendimento de rutura

 Métodos de rutura – princípios de funcionamento

 Métodos de rutura – vantagens e desvantagens

 O aparecimento de produtos obtidos por técnicas de ADN

recombinante e a necessidade de se obter enzimas ou produtos

Romper a parede celular

 é das primeiras etapas no processo de isolamento de materiais

 Na rutura celular é importante:

purificação de moléculas intracelulares, tendo impacto na

 No caso de proteínas (/enzimas) intracelulares:

 A parede celular tem funções mecânicas e funções

 Todos os organismos têm parede celular?

 As paredes celulares de diferentes organismos terão a

 A composição e estrutura da parede celular varia com a

Parede celular – Bactérias

 O género Mycoplasma não possui parede celular

 As bactérias dividem-se em dois grandes grupos, Gram+ e

 Todas as bactérias possuem uma membrana celular (onde ocorre

 A parede celular varia – encontra-se fora da membrana celular; é

 Membrana exterior é a principal barreira à permeabilidade

 Espaço entre a membrana interna e externa

GRAM - - envelope celular

Periplasmic binding protein

 Sem espaço periplasmático

 A maior espessura da camada de peptidoglucano, que nestes

GRAM + - envelope celular

ácido Lipoteichoic ácido Peptidoglycan-teichoic

 Os organismos que pertencem ao Reino Fungi contêm quitina

na sua parede celular

 Composição química da parede celular

Fungos - Organização vegetativa

A hifa é a unidade estrutural

Alternância entre fase unicelular e micelar em resposta a variações nas condições

 A celulose é o principal componente estrutural da parede celular,

 As células animais, as bactérias halofílicas e as bactérias

 contudo, há células animais mais resistentes à rutura (e.g.,

Efeito das condições a montante

 Efeito das condições a montante no desempenho da rutura

 Condições que afetam a síntese da parede celular durante o

 Taxa específica de crescimento

 Como determinar o rendimento de desintegração?

Métodos físicos ou químicos

Ciclos de azoto líquido — — — — — •

detergente por vezes a montante doutro método — — — — — •

enzimas e.g., celulases e pectinases em células vegetais; liticase • • — • — •

Moagem Pilão e almofariz • • • • • —

 como avaliar a quantidade de células que se desintegraram e

solução 2ª separação 1ª separação

Métodos de rutura celular

Mecânica Não mecânica

Métodos de rutura mecânicos

Agitação mecânica Pressão Moagem Pressão

passar por orifícios, onde a compressão contra os

Rutura mecânica – atrito hidrodinâmico

Manton-Gaulin) – identico ao anterior, mas não

 Nos homogeneizadores de alta pressão, a suspensão celular é

forçada através de um orifício existente na sede da válvula, que

 Conseguem-se eficiências de desintegração bastante elevadas,