UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

INSTITUTO MULTIDISCIPLINAR EM SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO MULTICÊNTRICO

EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS - SBFIS

JÚLIA DE OLIVEIRA BORGES

EFEITOS DA DIETA HIPERPROTEICA RESTRITA EM

CARBOIDRATOS E/OU TREINAMENTO FÍSICO SOBRE
CONCENTRAÇÃO DE IRISINA E PARÂMETROS
MORFOFUNCIONAIS DO TECIDO ADIPOSO DE RATOS
WISTAR OBESOS

Vitória da Conquista, BA
2024
 JÚLIA DE OLIVEIRA BORGES

EFEITOS DA DIETA HIPERPROTEICA RESTRITA EM

CARBOIDRATOS E/OU TREINAMENTO FÍSICO SOBRE
CONCENTRAÇÃO DE IRISINA E PARÂMETROS
MORFOFUNCIONAIS DO TECIDO ADIPOSO DE RATOS
WISTAR OBESOS

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa Multicêntrico de

Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas/Sociedade Brasileira de
Fisiologia, Universidade Federal da Bahia, como requisito para
obtenção do título de mestre em Ciências Fisiológicas.

Orientador: Prof. Dr. Rafael Pereira de Paula

Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia - UESB

Co-orientadora:Profª. Drª. Amélia Cristina Mendes de Magalhães

Gusmão
Universidade Federal da Bahia – UFBA

Vitória da Conquista, BA
2024
 Biblioteca Universitária Campus Anísio Teixeira – SIBI/UFBA
B732
Borges, Júlia de Oliveira.
Efeitos da dieta hiperproteica restrita em carboidratos e/ou treinamento
físico sobre concentração de irisina e parâmetros morfofuncionais do tecido
adiposo de ratos Wistar obesos / Júlia de Oliveira Borges. -- Vitória da
Conquista, BA: UFBA, 2024.
154 f.; il.

Orientadora: Prof. Dr. Rafael Pereira de Paula.

Co-orientadora: Prof.ª. Drª. Amélia Cristina M. de Magalhães Gusmão.
Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências
Fisiológicas/Sociedade Brasileira de Fisiologia) - Universidade Federal da
Bahia, Instituto Multidisciplinar em Saúde, 2024.

1. Obesidade. 2. Dieta hiperproteica. 3. Exercício físico. I.

Universidade Federal da Bahia, Instituto Multidisciplinar em Saúde. II.
Paula, Rafael Pereira de. III. Gusmão, Amélia Cristina Mendes de
Magalhães. IV. Título.
CDU: 615.874.25(043.2)
Elaborado por Cinthia Gabrielli Gil CRB5-001631/0
 AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo dom da vida, por me capacitar e por sua infinita bondade e amor estampados
em cada detalhe da minha vida.

Aos meus pais, Vânia e Hélio, por serem alicerce em minha vida, fonte de amor, dedicação e
incentivo.

À minha irmã, Luiza, por trazer leveza e alegria à minha vida em todos os momentos.

À Ignácio, pelo companheirismo, cuidado e paciência ao longo desses anos em que a

iniciação científica, e depois o mestrado, tomou muitos finais de semanas e férias.

À Universidade Federal da Bahia e ao Programa de Pós-graduação Multicêntrico em Ciências

Fisiológicas (PPGMCF) por todo apoio.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão

da bolsa de estudos, me permitindo vivenciar o PPGMCF em outras universidades.

Ao Professor Rafael Pereira, pela orientação, disponibilidade e compartilhamento de

conhecimentos. Sou grata por sua confiança, paciência e cuidado ao longo do mestrado,
tornou a minha jornada mais leve.

À Professora Amélia Cristina, pela co-orientação, cuidado e apoio à minha trajetória

acadêmica. Sou grata pela confiança e responsabilidades atribuídas a mim.

À Luciano Evangelista e Grazielle Bittencourt por tornarem o meu estudo possível e por
serem meus primeiros mestres na pesquisa científica.

Aos meus amigos, Amanda, Maiara e Thiago, pelo acolhimento que nem nos meus melhores
sonhos eu imaginaria. À Amanda pela doçura, paciência e cuidado de irmã mais velha rsrs
(quem tem o mesmo orientador são automaticamente irmãos), você me inspira a ser mais
resiliente. À Maiara por ser companhia e guia nos experimentos, pela presteza e incentivo,
você me inspira a ser mais corajosa e resolutiva. À Thiago pela prontidão, por me auxiliar a
lapidar minhas habilidades e, infelizmente, por dividir seu neurônio mais prejudicado
comigo, você me inspira a ser adaptável e cooperativa. Sem vocês minha trajetória não seria a
mesma, espero que saibam.
Ao Grupo de Pesquisa em Bioquímica e Fisiologia (BqFis) por ter sido casa dos meus
primeiros passos na ciência e hoje poder contribuir com o mesmo. Agradeço aos alunos de
iniciação científica, Ingra, Samuel, Karine, Laura, Alice, Pedro, Douglas, Bianca, André e
Suzana pelo suporte no desenvolvimento dos experimentos.

Aos professores do PPGMCF pela condução do programa e das disciplinas com excelência,
mesmo tendo a oportunidade de vivenciar outras universidades do país, não precisamos ir
longe para ter acesso aos melhores. Em especial aos professores Lucas, Regiane, Leandro,
Amélia e Telma que tive o privilégio de ser aluna durante o mestrado.

Agradeço ao professor William Festuccia, Albert Peixoto e demais colegas do Laboratório de

Fisiologia Molecular e Metabolismo da Universidade de São Paulo (USP) pela oportunidade,
acolhimento e orientações concedidas para condução de western blotting nas amostras do
presente trabalho.

Aos colegas da pós-graduação pela boa convivência e cooperação diária, especialmente aos
colegas dos laboratórios 103, 106 e 108.

Aos(às) funcionários(as) e técnicos(as) da UFBA pelo suporte.

“O mundo precisa da ciência, e a ciência precisa das mulheres”

(Irina Bokova)
BORGES, Júlia de Oliveira. Efeitos da dieta hiperproteica restrita em carboidratos e/ou
treinamento físico sobre concentração de irisina e parâmetros morfofuncionais do tecido
adiposo de ratos Wistar obesos. 2024. Dissertação (Mestrado). Instituto Multidisciplinar em
Saúde, Universidade Federal da Bahia, Vitória da Conquista, 2024.

RESUMO

Objetivo: Avaliar os efeitos do treinamento físico e/ou da dieta hiperproteica restrita em

carboidratos e sobre a modulação da irisina plasmática e muscular e alterações morfológicas
e funcionais no tecido adiposo branco e marrom de ratos Wistar machos em um modelo de
obesidade. Métodos: 28 ratos Wistar machos com obesidade induzida por dieta hipercalórica
(HC) foram divididos em 4 grupos: Grupo submetido à dieta HC e sedentário (n=7); Grupo
submetido à dieta HC e treinado (n=7); Grupo submetido à dieta hiperproteica restrita em
carboidratos (HP) e sedentário; Grupo submetido à dieta hiperproteica restrita em
carboidratos (HP) e treinado (n=7). Após o período de 12 semanas, os animais foram
eutanasiados e os tecidos adiposos subcutâneo (TASC), epididimal (TAE) e marrom (TAM),
assim como o músculo gastrocnêmio e o sangue torácico foram coletados para posteriores
análises. Avaliou-se a composição corporal, dosagem sérica e tecidual de irisina/FNDC5,
morfologia do músculo gastrocnêmio e TASC e TAM. Foram avaliados também parâmetros
de metabolismo energético no TASC e TAM e marcadores de atividade mitocondrial, perfil
inflamatório, dano oxidativo e atividade das enzimas antioxidantes no TASC, TAE e TAM.
As análises estatísticas foram realizadas através do teste ANOVA two-way (2 dietas x 2
condições de treinamento), seguida pelo pós-teste de Bonferroni. Os dados foram
apresentados como média±erro padrão. Resultados: A dieta HP e o treinamento físico
moderado por 12 semanas reduziram o peso e adiposidade corporal, bem como a área e o
diâmetro dos adipócitos no TASC e aumentaram o peso e a área das fibras do músculo
gastrocnêmio, bem como, a imunomarcação do precursor da irisina (FNCD5) e reduziram o
conteúdo tecidual de triglicerídeos. A concentração sérica de irisina aumentou apenas por
efeito do treinamento físico. No TAM, tanto treinamento físico quanto a dieta reduziram o
conteúdo tecidual de triglicerídeos, no entanto, somente o treinamento reduziu a área ocupada
por adipócitos uniloculares e aumentou a expressão gênica de UCP-1. Apenas o treinamento
físico aumentou a enzima citrato sintase, marcador de atividade mitocondrial, no TASC, TAE
e TAM. Ademais, o treinamento também determinou maiores efeitos benéficos no balanço
redox, aumentando a expressão gênica e atividade de enzimas antioxidantes no TASC e TAM
e reduzindo marcadores oxidativos (TBARS, proteínas carboniladas e nitritos totais). O perfil
inflamatório foi modulado positivamente tanto pela dieta HP quanto pelo treinamento físico,
que reduziram a razão TNF-α/IL-10 no TASC, TAE e TAM, aumentaram a expressão gênica
de adiponectina, bem como a imunomarcação de NF-κB, MCP-1 e a razão macrófagos totais/
macrófagos M2 no TASC. Isoladamente, o treinamento físico aumentou os marcadores
anti-inflamatórios IL-10 e IL-27 e reduziu os marcadores inflamatórios IL-6 (TASC e TAM),
IL-1β (TAE), bem como os macrófagos totais, estruturas crown-like e linfócitos no TASC e a
imunomarcação de NF-κB no TAM. Conclusão: No modelo estudado, os efeitos da dieta
hiperproteica restrita em carboidratos e do treinamento físico por 12 semanas atenuaram as
alterações provocadas pela obesidade sobre parâmetros de composição corporal, morfologia e
metabolismo tecidual, perfil inflamatório e oxidativo dos tecidos adiposos. Nossos achados
reforçam a importância do treinamento físico regular por modular positivamente a irisina e
conferir melhores benefícios morfofuncionais e sobre os perfis inflamatórios e oxidativos nos
depósitos de tecido adiposo de animais obesos.
Palavras-chave: Obesidade. Dieta hiperproteica. Treinamento físico. Tecido adiposo. Irisina.
BORGES, Júlia de Oliveira. Effects of high-protein and low-carbohydrate diet and/or
physical training on irisin concentration and morphofunctional parameters of adipose tissue
in obese Wistar rats. 2024. Dissertation (Masters). Instituto Multidisciplinar em Saúde,
Universidade Federal da Bahia, Vitória da Conquista, 2024.

ABSTRACT

Objective: To evaluate the effects of physical training and/or a high-protein and

low-carbohydrate diet on the modulation of plasma and muscle irisin and morphological and
functional changes in white and brown adipose tissue of male Wistar rats in an obesity model.
Methods: 28 male Wistar rats with obesity induced by a high-calorie diet (HC) were divided
into 4 groups: Group submitted to the HC diet and sedentary (n=7); Group submitted to the
HC diet and trained (n=7); Group submitted to a high-protein and low-carbohydrates diet
(HP) and sedentary; Group submitted to HP diet and trained (n=7). After a period of 12
weeks, the animals were euthanized and the subcutaneous (TASC), epididymal (TAE) and
brown (TAM) adipose tissues, as well as the gastrocnemius muscle and thoracic blood were
collected for further analysis. Body composition, serum and tissue levels of irisin/FNDC5,
gastrocnemius muscle morphology and TASC and TAM were evaluated. Energy metabolism
parameters were also evaluated in TASC and TAM and markers of mitochondrial activity,
inflammatory profile, oxidative damage and activity of antioxidant enzymes in TASC, TAE
and TAM. Statistical analyzes were performed using the two-way ANOVA test (2 diets x 2
training conditions), followed by the Bonferroni post-test. Data were presented as
mean±standard error. Results: The HP diet and moderate physical training for 12 weeks
reduced body weight and adiposity, as well as the area and diameter of adipocytes in the
TASC and increased the weight and area of gastrocnemius muscle fibers, as well as
immunostaining of the precursor of irisin (FNCD5) and reduced tissue triglyceride content.
Serum irisin concentration increased only as a result of physical training. In TAM, both
physical training and diet reduced tissue triglyceride content, however, only training reduced
the area occupied by unilocular adipocytes and increased UCP-1 gene expression. Only
physical training increased the enzyme citrate synthase, a marker of mitochondrial activity, in
TASC, TAE and TAM. Furthermore, training also determined greater beneficial effects on
redox balance, increasing gene expression and activity of antioxidant enzymes in TASC and
TAM and reducing oxidative markers (TBARS, carbonyl proteins and total nitrites). The
inflammatory profile was positively modulated by both the HP diet and physical training,
which reduced the TNF-α/IL-10 ratio in TASC, TAE and TAM, increased adiponectin gene
expression, as well as immunostaining of NF-κB, MCP -1 and the total macrophage/M2
macrophage ratio in TASC. Singly, physical training increased the anti-inflammatory markers
IL-10 and IL-27 and reduced the inflammatory markers IL-6 (TASC and TAM), IL-1β (TAE),
as well as total macrophages, crown-like structures and lymphocytes in TASC and NF-κB
immunostaining in TAM. Conclusion: In the model studied, the effects of a high-protein diet
restricted in carbohydrates and physical training for 12 weeks attenuated the changes caused
by obesity on parameters of body composition, tissue morphology and metabolism, and the
inflammatory and oxidative profile of adipose tissues. Our findings reinforce the importance
of regular physical training as it positively modulate irisin and confer better
morphofunctional benefits and on inflammatory and oxidative profiles in adipose tissue
deposits of obese animals.
Keywords: Obesity. High protein diet. Physical training. Adipose tissue. Irisin.
 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AGI-n3 Ácidos Graxos Insaturados ômega 3

AGI-n6 Ácidos Graxos Insaturados ômega 6
AMPK Proteína quinase ativada por AMP
ANOVA Análise de Variância
ATP Adenosina trifosfato
cDNA DNA Complementar
CEUA Comitê de Ética em Uso de Animais
CS Citrato sintase
Ct Cycle Treshold
DNA Ácido Desoxirribonucléico
ERO Espécies Reativas de Oxigênio
FNDC5 Proteína 5 contendo o domínio da fibronectina tipo III
GPx Glutationa Peroxidase
GSH Glutationa Reduzida
HC Dieta hipercalórica
HE Hematoxilina e eosina
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
HP Dieta hiperproteica e restrita em carboidratos
IFN-γ Interferon γ
IL Interleucina
MCP 1 Proteína Quimioatraente de Monócitos 1
NADPH Dinucleotídeo de Nicotinamida-Adenina-Fosfato
NCBI National Center For Biotechnology Information
NF-κB Fator nuclear kappa B
OMS Organização Mundial da Saúde
PAI-1 Inibidor de ativação de plasminogênio
PGC-1α Coativador-1 alfa do receptor ativado por proliferadores de
peroxissoma gama
qPCR Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
RNA Ácido Ribonucleico
SIRT 3 Sirtuína 3
TA Tecido adiposo
TAB Tecido adiposo branco
TAE Tecido adiposo epididimal
TAM Tecido adiposo marrom
TAME Tecido adiposo mesentérico
TAR Tecido adiposo retroperitoneal
TASC Tecido adiposo subcutâneo
TAV Tecido adiposo visceral
TBARS Thiobarbituric acid reactive substances
TNF-α Fator de Necrose Tumoral Alfa
UCP-1 Proteína desacopladora 1
UFBA Universidade Federal da Bahia
VA Volume de Amostra
VR Volume de Reação
 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 1
2 REFERENCIAL TEÓRICO .............................................................................. 4
2.1 Obesidade e tecido adiposo…………………………………………................. 4
2.2 Padrão dietético na gênese e tratamento da obesidade…................................... 7
2.3 Treinamento físico aeróbico na obesidade: efeitos sobre o tecido adiposo ....... 11
2.4 Irisina e tecido adiposo………………………………………………………... 12
3 OBJETIVOS ........................................................................................................ 15
3.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................... 15
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 15
4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 16
4.1 Animais e dieta experimental ......................................................................... 16
4.2 Procedimento experimental ............................................................................ 17
4.3 Protocolo de treinamento físico ..................................................................... 18
4.3.1 Avaliação da capacidade aeróbica............................................................. 19
4.3.2 Parâmetros do treinamento físico.............................................................. 19
4.4 Avaliação da massa corporal………………………………………………… 19
4.5 Eutanásia e coleta das amostras....................................................................... 20
4.6 Peso adiposo visceral………………………………………………………... 20
4.7 Dosagem de citocinas……………………………………………………….. 20
4.8 Balanço redox do tecido adiposo……………………………………………. 21
4.8.1 Peroxidação lipídica tecidual……………………………………………. 21
4.8.2 Proteínas carboniladas…………………………………………………... 21
4.8.3 Nitritos totais……………………………………………………………. 22
4.8.4 Atividade da enzima superóxido dismutase…………………………….. 23
4.8.5 Atividade da enzima glutationa peroxidase……………………………... 23
4.8.6 Atividade da enzima catalase…………………………………………… 24
4.9 Avaliação da atividade mitocondrial………………………………………... 25
4.10 Estudos histológicos……………………………………………………….. 26
4.10.1 Morfometria……………………………………………………………. 26
4.10.2 Imuno-histoquímica……………………………………………………. 27
4.10.3 Avaliação da imunomarcação………………………………………….. 29
 4.11 Análise da expressão gênica nos tecidos adiposos subcutâneo e marrom…. 29
4.11.1 Extração do ácido ribonucléico (RNA)………………………………... 29
4.11.2 Síntese do DNA complementar (cDNA) e ensaios de reação em cadeia
da polimerase em tempo real (qPCR)…………………………………………… 30
4.12 Extração e dosagem de lipídios no gastrocnêmio e tecido adiposo marrom. 32
4.13 Análise estatística ......................................................................................... 33
RESULTADOS.......................................................................................................... 34
DISCUSSÃO.............................................................................................................. 79
CONCLUSÃO........................................................................................................... 92
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 93
ANEXO A.................................................................................................................. 111
 1

1. INTRODUÇÃO

As mudanças no estilo de vida da população global, como os hábitos alimentares e o

nível de atividade física, possuem papel significativo na crescente prevalência da obesidade
em diversos países. A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que os indivíduos
adultos com excesso de peso triplicaram desde a década de 70 até 2016, correspondendo a
39% da população mundial (OMS, 2021). A obesidade é uma doença multifatorial cujas
características são definidas pelo excesso de gordura corporal acompanhado de alterações
metabólicas, sendo o principal fator de risco para o desenvolvimento de doenças crônicas não
transmissíveis (Liu e Ding, 2017; Azar et al., 2020; Rosini et al., 2012).
Fatores ambientais são determinantes para a gênese da obesidade, o consumo de
dietas hipercalóricas, ricas em carboidratos e lipídios, associado ao sedentarismo, propiciam o
desbalanço energético. O aumento da ingestão calórica em paralelo à diminuição do gasto
culmina no acúmulo dos substratos energéticos, em forma de triglicerídeos, no tecido
adiposo, principalmente através da hipertrofia dos adipócitos (Rogério e Calder, 2018).
O tecido adiposo é um órgão complexo que desempenha função primariamente
relacionada à homeostase energética e a partir da detecção das demandas metabólicas, atua no
armazenamento ou utilização dos lipídios. Além disso, exerce proteção dos órgãos contra
danos mecânicos, participa da termogênese, de respostas imunes e secreção de hormônios e
citocinas, que podem atuar em outros órgãos metabólicos (Feng, Zhang e Xu, 2013;
Chouchani e Kajimura, 2019).
No contexto da obesidade, ocorrem respostas adaptativas de reorganização quanto ao
tamanho e número dos adipócitos para lidar com o excesso de energia. O balanço energético
positivo em longo prazo estimula a hipertrofia dos adipócitos até um limiar crítico e ao
atingir esse ponto os adipócitos secretam hormônios e citocinas que possibilitam o
recrutamento de pré-adipócitos e a diferenciação dos mesmos em adipócitos maduros (Longo
et al., 2019). A remodelação do tecido adiposo tem sido apontada como precursora da
disfunção no padrão das adipocinas secretadas e recrutamento de células imunes favorecendo
um estado pró-inflamatório local e sistêmico (Dispirito e Mathis, 2015).
Além desse desbalanço entre as citocinas anti e pró inflamatórias secretadas pelo
tecido adiposo, que implica em uma inflamação de baixo grau, observa-se outras
consequências que correlacionam-se negativamente à funcionalidade desse tecido como
comprometimento da adipogênese, aumento da lipólise, hipóxia, disfunção mitocondrial,
fibrose e estresse oxidativo (Kusminski et al., 2016; Manna e Jain, 2015).
 2

Os modelos animais de obesidade têm sido estudados com intuito de explorar os

mecanismos fisiológicos, moleculares e celulares envolvidos na progressão e alterações
metabólicas decorrentes dessa doença. Nesse sentido, a indução da obesidade por dieta nos
animais se assemelha à gênese em humanos e demonstra correlação positiva entre ingestão de
dietas altamente palatáveis e hipercalóricas, ganho de peso e adiposidade. Sendo assim, esse
modelo é útil para o esclarecimento de mecanismos subjacentes da obesidade, assim como,
novas vias de intervenção terapêutica (Pinheiro-castro et al.,2019; Rosini et al., 2012).
As intervenções dietéticas em conjunto com o exercício físico são apontadas como
estratégia relevante para melhoria da qualidade de vida e saúde, pois diminuem os riscos para
a obesidade e consequentemente para as doenças crônicas e alterações metabólicas
decorrentes das mesmas (Atakan et al., 2021). As dietas restritas em carboidratos tem sido
estudadas quanto aos seus benefícios na manutenção ou perda do peso corporal, aumento do
gasto energético e controle glicêmico (Badman et al., 2009; Garbow et al., 2011; Asrih et al.,
2015).
Apesar dos estudos com humanos demonstrarem mudanças positivas em relação à
composição corporal, com redução do peso e massa gorda quando expostos à dietas com
baixo teor de carboidratos, em especial, a cetogênica (Paoli et al., 2021; Bowler e Polman,
2020; Vargas et al., 2018; Paoli et al., 2012), os impactos no tecido adiposo (i.e., efeitos
sobre a morfologia, balanço redox e secreção de citocinas) não são totalmente esclarecidos, o
que poderia ser investigado com modelos animais.
As dietas com baixo teor de carboidratos são categorizadas diferentemente de acordo
com a quantidade desse macronutriente (<26% das calorias totais) e observa-se que a maioria
dos estudos converge em utilizar grandes quantidades de lipídios e quantidade variável de
proteínas (Mcnally e Hartman, 2012). Contudo, a dieta hiperproteica também tem
demonstrado resultados relevantes que podem ser significativos no tratamento da obesidade,
como a perda de peso, melhoria da composição corporal e regulação da resposta glicêmica
em estudos com humanos (Moon e Koh, 2020; Pesta e Samuel, 2014) e animais (French et
al., 2017; Sousa et al., 2018).
Resultados prévios de estudos investigando o efeito da dieta hiperproteica sobre o
tecido adiposo demonstraram efeitos controversos, enquanto resultados positivos são
observados quando se associa dieta hiperproteica e treinamento físico. Medeiros e
colaboradores (2021) constataram hipertrofia dos adipócitos e aumento do estado
inflamatório de animais saudáveis submetidos a 12 semanas de dieta hiperproteica, o que foi
atenuado quando associado ao exercício físico. Em ratos alimentados com a dieta
 3

hiperproteica e submetidos ao exercício físico foi observado menor peso dos depósitos de
tecido adiposo (Ávila et al., 2018).
O exercício físico constitui-se como uma estratégia não farmacológica, sendo um
importante aliado na prevenção e no manejo da obesidade, além dos benefícios à saúde e
qualidade de vida. As alterações promovidas pelo treinamento físico no tecido adiposo
envolvem mudanças no tamanho, número e no conteúdo lipídico em ratos submetidos a dieta
rica em lipídios, independentemente da perda de peso (Gollisch et al., 2009).
A prática regular proporciona mudanças benéficas no metabolismo geral, regula o
estado redox da célula e o padrão inflamatório através do equilíbrio entre citocinas
pró-inflamatórias e anti-inflamatórias (Church, 2011; Effting et al., 2019; Speretta et al.,
2012). Ademais, as miocinas produzidas pelo tecido muscular durante o exercício
desempenham papel nessa regulação, pois extrapolam os efeitos locais no próprio tecido e
atuam em órgãos distantes, o que destaca o interesse das pesquisas mais recentes (Lee e Jun,
2019).
A irisina é uma adipomiocina clivada a partir da proteína 5 contendo o domínio da
fibronectina tipo III (FNDC5) e secretada na circulação (Bostrom et al., 2012). Estudos
recentes demonstram sua relação positiva com o treinamento físico (Lu et al., 2016), o frio
(Lee et al., 2014) e a dieta (Varela-Rodríguez et al., 2016), assim como, efeitos promissores
no tecido adiposo. Dentre eles, destacam-se a melhoria na captação de glicose, aumento da
lipólise e do gasto energético, redução da lipogênese e termogênese através do browning do
tecido adiposo branco (Zhang et al., 2014; Arhire, Mihalache e Covasa, 2019). Além disso,
demonstrou relevante atividade na redução do processo inflamatório em adipócitos
(Mazur-Bialy et al.,2017).
Sabendo-se que o exercício físico de moderada intensidade promove alterações
pertinentes no tecido adiposo e que as dietas restritas em carboidratos e hiperproteicas, apesar
de apresentarem possíveis repercussões positivas no âmbito da obesidade, ainda não são
totalmente esclarecidos os impactos morfofuncionais destas no tecido adiposo.
Diante do exposto, o presente estudo experimental pretende investigar os possíveis
efeitos do treinamento físico associado ou não ao consumo de dieta hiperproteica restrita em
carboidrato sobre a concentração de irisina, função e morfologia dos tecidos adiposos
abdominais e marrom em um modelo de obesidade induzida por dieta.
 4

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Obesidade e tecido adiposo

A obesidade é definida como uma doença crônica e tornou-se uma preocupação no
campo da saúde em diversos países do mundo e tem contribuído significativamente na
morbidade, mortalidade e custos com os cuidados de saúde. A causa está relacionada com a
interação de múltiplos fatores genéticos, ambientais, metabólicos e comportamentais (WHO,
2004; Upadhyay et al., 2018).
Caracteriza-se como obesidade a expansão do tecido adiposo (TA) de forma a causar
prejuízos à saúde devido às alterações metabólicas. Por ser um tecido altamente complexo,
implicações na sua homeostase podem contribuir para o desenvolvimento de outras doenças
crônicas não transmissíveis, tais como, diabetes mellitus, doença hepática gordurosa não
alcóolica, hiperlipidemias, hipertensão arterial, doenças cardíacas, infertilidade, dentre outras
(Piché, Tchernof e Després, 2020; Parto e Lavie, 2017).
A compreensão sobre o TA, até pouco mais de duas décadas atrás, era como
reservatório de energia, com funções relacionadas à proteção mecânica e térmica e também à
termogênese. Esse conhecimento foi ampliado ao se evidenciar seu papel na secreção de
proteínas com efeitos autócrinos, parácrinos e endócrinos, incluindo esteróides sexuais e
corticóides, peptídeos precursores de hormônios, fatores de complemento, citocinas
pró-inflamatórias e componentes das vias de coagulação (Ahima e Flyer, 2000; Trayhurn e
Beattie, 2001). Esses hormônios e produtos secretados pelo TA implicam na regulação
metabólica, imune, neuroendócrina e cardiovascular (Vieira-Potter, 2014).
Os principais constituintes celulares do TA são os adipócitos e em seu citoplasma os
lipídios são armazenados, sobretudo em forma de triglicerídeos. Os adipócitos apresentam-se,
em maioria, como maduros diferenciados e são separados entre si pela matriz extracelular e
fração vascular estromal. Esta última é formada por outros componentes: pré-adipócitos,
fibroblastos, células endoteliais, células musculares lisas e células imunocompetentes, como
os macrófagos, monócitos, linfócitos T, linfócitos B e células dendríticas (Vieira-Potter, 2014;
Lehning e Stanford, 2018). O funcionamento adequado e equilibrado dessas células é o que
mantém a homeostase energética, a proporção dos linfócitos, monócitos e macrógrafos
infiltrados, assim como, o tamanho do adipócito (Dispirito e Mathis, 2015).
Classicamente, os adipócitos são subdivididos em brancos e marrons. Os primeiros
são uniloculares e compõem o tecido adiposo branco (TAB) e os últimos são multiloculares e
formam o tecido adiposo marrom (TAM). A maior parte do volume celular do TAB é a gota
 5

de lipídio unilocular e o seu núcleo e citoplasma são deslocados à periferia da célula. Já o

TAM possui maior número de pequenas gotículas de lipídios, acompanhado também de maior
quantidade de mitocôndrias, e o citoplasma e o núcleo podem assumir diferentes posições,
centralizados ou não (Peirce et al., 2014).
No TAM, além da abundância de mitocôndrias estas são enriquecidas com a proteína
desacopladora 1 (UCP-1), responsável por desacoplar a oxidação dos substratos da produção
de ATP (Adenosina trifosfato) e direcionar à produção de calor e/ou aumento da taxa
metabólica (Marlatt e Ravussin, 2017; Tam, Lecoultre e Ravussin, 2012).
Por sua vez, o TAB possui funções relacionadas ao armazenamento de lipídios em
forma de triglicerídeos, sendo essa uma via lipogênica responsiva à diversos estímulos,
incluindo a insulina. Durante o déficit calórico outras vias são estimuladas para que ocorra a
lipólise com o intuito de liberar ácidos graxos livres na corrente sanguínea para utilização
como fonte de energia, principalmente pelos músculos esqueléticos e fígado (Bloor e
Symonds, 2014).
Adicionalmente ao TAB e TAM é descrito na literatura um outro subtipo denominado
tecido adiposo bege, que compreende células presentes nos depósitos de TAB mas possuem
maiores expressões de UCP-1 e, dependendo das condições, podem assumir as características
funcionais de adipócitos brancos ou se comportam oxidando substrato para obter calor, como
o TAM (Castro et al., 2017).
A extensiva atividade metabólica do TAB é devido a produção e secreção das
adipocinas, dentre elas a leptina, a adiponectina, adipsina e resistina, outros fatores como
inibidor de ativação de plasminogênio (PAI-1) e angiotensinogênio e citocinas secretadas
pelas células imunes como o fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina 6 (IL-6),
interleucina 10 (IL-10), interferon γ (IFN-γ), proteína quimioatraente de monócitos (MCP-1)
e outras (Goossens, 2008; Kusminski, Bickel e Scherer, 2016). Por meio da interação entre
esses fatores e outros tecidos e órgãos, o TA participa da modulação de importantes processos
biológicos (Torres-Leal et al., 2012).
O TAB está presente em diferentes depósitos distribuídos ao longo do corpo, sendo
subdividido em tecido adiposo subcutâneo (TASC) encontrado em todo corpo sob a pele,
principalmente nas coxas, nádegas e abdômen e o tecido adiposo visceral (TAV) localizado
em torno de órgãos internos, principalmente nos depósitos mesentéricos e omentais (Lehning
e Stanford, 2018).
Em humanos, o depósito de gordura omental compreende uma maior fração, quando
comparado com roedores. Contudo, em roedores machos, o depósito epididimal mostra-se
 6

representativo do TAV e pode ser considerado funcionalmente equivalente ao tecido omental

humano (Dispirito e Mathis, 2015; Tchkonia et al., 2013).
Os depósitos TAV e TASC possuem características intrínsecas que resultam em
propriedades metabólicas diferentes, impactando na capacidade de armazenamento de
lipídios e perfil de adipocinas (Lehning e Stanford, 2018). O TAV possui adipócitos com
formato mais irregular, alta vascularização, quantidade maior de receptores androgênicos,
maior taxa de lipólise e um padrão de secreção de citocinas pró-inflamatórias. Dessa forma, o
TAV está diretamente relacionado ao maior risco de diabetes mellitus tipo 2, hipertensão
arterial e dislipidemia do que o TASC (Bloor e Symonds, 2014; Foster e Pagliassotti, 2012;
Suarez-Cuenca et al., 2021).
A modificação do padrão secretório de citocinas e infiltração de células imunes são
pontos chaves vistos e bem estabelecidos no contexto da obesidade, o que inclui infiltração
de leucócitos e aumento dos níveis das citocinas pró-inflamatórias como IL-6, TNF-α,
MCP-1, IL-10 e elevação do estresse oxidativo, relacionado à infiltração de macrófagos
(Hahn et al., 2014; Feng, Zhang e Xu, 2013).
A hipertrofia dos adipócitos é considerada um dos principais contribuintes da
expansão do tecido adiposo na obesidade (Kolahdouzi et al., 2019). Sabe-se que esse tecido
possui a capacidade de alterar suas dimensões de acordo com o estado nutricional e outros
estímulos por meio de diversos mecanismos, como composição da matriz extracelular,
vascularização, tamanho e número de adipócitos, nível de estresse oxidativo e perfil de
citocinas e células imunes. A hipertrofia ocorre pelo aumento de lipídios nos adipócitos
pré-existentes e a hiperplasia pelo aumento do número de adipócitos quando há o
recrutamento de pré-adipócitos (Kusminski, Bickel e Scherer, 2016).
Dietas hipercalóricas, com excesso de substratos energéticos, podem no tecido
adiposo causar disfunção mitocondrial, o que leva a produção de espécies reativas de
oxigênio (ERO) e consequentemente ao aumento do estresse oxidativo tecidual. Por sua vez,
podem levar a danos oxidativos dos fosfolipídios, proteínas e DNA das células afetadas
(Hahn et al., 2014).
 7

2.2 Padrão dietético na gênese e tratamento da obesidade

Nos últimos anos, os aspectos ambientais se modificaram e a predisposição ao
sobrepeso e obesidade tem se relacionado ao estilo de vida adotado, por exemplo, os hábitos
alimentares e o nível de atividade física. Nesse contexto, ressalta-se a dieta com alta
densidade calórica, composta por elevadas quantidades de carboidratos e lipídios,
denominada dieta ocidental. Esses fatores resultam em um desbalanço energético, devido ao
aumento da ingestão calórica e diminuição no gasto, culminando no acúmulo de energia no
TA (Rogero e Calder, 2018).
Estudos anteriores com roedores demonstraram que a indução da obesidade por dietas
hipercalóricas é eficaz e corrobora com a manifestação de alterações metabólicas como
hiperlipidemia, hiperinsulinemia e intolerância à glicose (Junior et al., 2010), aumento do
peso, aumento da gordura corporal e alterações glicêmicas (Martins et al., 2015), o que a
torna estes modelos experimentais semelhantes tanto em relação à gênese quanto às respostas
metabólicas vistas em humanos (Rosini et al., 2012).
Dietas hipercalóricas, abundantes em carboidrato e lipídios, mostraram-se mais
eficazes em desencadear as alterações relacionadas à obesidade em ratos, do que dietas
hiperlipídicas ou hiperglicídicas (Maioli et al., 2016). Apesar de isoladamente essas dietas
promoverem alterações deletérias, a associação dessas duas características podem intensificar
os efeitos isolados de cada dieta, devido a maior disponibilidade de ácidos graxos, bem como,
de açúcares simples, como proveniente do leite condensado, com rápido efeito
hiperglicêmico (Pinheiro-Castro et al., 2019).
Foi observado por Masi e colaboradores (2017) que uma dieta com leite condensado
foi mais pró-inflamatória do que uma dieta hiperlipídica. Um estudo realizado por Almeida e
Santos (2015) constatou que em 8 semanas de experimento, a dieta hipercalórica (ração
controle, leite condensado e óleo de milho) determinou aumento do peso corporal e causou
dislipidemia em ratos. Outros estudos com tempo maior de exposição à dieta hipercalórica,
14 semanas (Nascimento et al., 2008) e 20 semanas (Junior et al., 2010), também foram
capazes de promover alterações metabólicas associadas à obesidade.
Nas últimas décadas, a elevação do consumo de dietas ricas em ácidos graxos
insaturados ômega 6 (AGI-n6) coincidiu com o aumento de doenças crônicas não
transmissíveis, por possuírem caráter pró-inflamatório, diferente dos ácidos
graxosiinsaturados ômega 3 (AGI-n3). A principal fonte de AGP-n6 é o ácido linoléico
obtido principalmente dos óleos de milho, cártamo e girassol (Mostafa et al., 2020).
 8

Em um estudo realizado por Sharma e Agnihotri (2020) avaliou os efeitos de

diferentes óleos ricos em AGI-n3 ou AGI-n6 no tecido adiposo e constatou melhores
resultados no AGI-n3 na redução do tamanho dos adipócitos e melhora na função do TA, o
que não foi visto nos animais alimentados com o óleo rico em AGI-n6.
Visto que a composição dietética tem direta relação com a indução da obesidade em
humanos e reproduzido em roedores, as intervenções com dietas são de interesse para manejo
e regressão dessa condição. Apesar disso, as adaptações moleculares do tecido adiposo em
resposta a diferentes dietas ainda é um ponto para debate. Sabe-se que essas são consideradas
importantes na melhoria do estado de saúde e composição corporal, mas as diferentes
distribuições de macronutrientes ainda são exploradas para melhor evidenciar sua eficácia no
contexto da obesidade (Atakan et al., 2021).
As dietas com restrição de carboidratos possuem diferentes classificações de acordo
com a contribuição desse macronutriente na porcentagem total de calorias. A discrepância
entre o teor de carboidrato nos estudos se tornou uma barreira na comunicação, levando à
ambiguidade na interpretação dos resultados, já que há uma ampla faixa e consequentemente
desfechos distintos.
Dessa forma, Feinman e colaboradores (2015) reuniram um consenso de acordo com
estudos experimentais prévios encontrados na literatura e recomendações para estabelecer as
classificações de acordo com a porcentagem de carboidratos presentes na dieta, exposto na
Tabela 1.

Tabela 1. Definições sugeridas para diferentes dietas com baixo teor de carboidratos
(adaptado de Feinman et al. (2015)).

Definição Quantidade em gramas de Energia proveniente

CHO dos CHO (%)

Dieta cetogênica com muito baixo 20-50 gramas <10

teor de carboidratos

Dieta com baixo teor ou restrita de <130 gramas <26

carboidratos

Dieta moderada em carboidratos 130-230 gramas 26-45

Dieta com alto teor de carboidratos * <230 gramas >45

CHO, carboidratos. *O autor considerou a recomendação da Associação Americana de Diabetes (ADA,

American Diabetes Association).
 9

A relevância clínica das dietas restritas em carboidratos surgiu após a utilização da

dieta cetogênica para o tratamento de crianças com epilepsia (Kessler et al., 2011). Tais
dietas relacionam-se ao processamento de ácidos graxos e aminoácidos para a produção das
cetonas, realizado nas mitocôndrias hepáticas, e os corpos cetônicos ( acetoacetato, acetona e
β-hidroxibutirato) desempenham papel de fonte energética alternativa para os tecidos
periféricos como coração, cérebro e músculos (Azar, Beydoun e Albadri, 2016).
O interesse pela redução de carboidratos como estratégia dietética para obesidade
baseia-se em alguns pontos, dentre eles: I) A associação direta entre o aumento da obesidade
e diabetes mellitus e mudanças no padrão alimentar da população, com quantidades maiores
de carboidratos; II) Esse padrão alimentar estimula a liberação contínua de insulina, que afeta
diretamente o metabolismo de lipídios, proteínas e carboidratos, favorece um estado
anabólico e inibe a lipólise, propiciando o acúmulo deste excesso de nutrientes em forma de
triglicerídeos no tecido adiposo e também de forma ectópica (Volek et al., 2008; Barber et al.,
2021).
Ademais, já foram relatados o impacto das dietas restritas em carboidratos no
aumento da saciedade (Gibson et al., 2014), melhora do metabolismo pós-prandial, atenuação
da resistência à insulina e, consequentemente, redução da lipogênese e aumento da lipólise
através da regulação positiva de enzimas lipolíticas, além de aumentar o consumo energético
devido ao estímulo à gliconeogênese, processo metabolicamente mais “custoso”, em virtude
do gasto energético necessário para cada molécula de glicose a ser formada (Zhu et al., 2022;
Papadopoulou e Nikolaidis, 2023).
Os estudos prévios com humanos e dietas restritas em carboidratos a curto e médio
prazo indicam resultados promissores quanto à composição corporal. Em homens treinados,
8 semanas com uma dieta de aproximadamente 10% de carboidratos reduziu a massa gorda e
tecido adiposo visceral (Vargas et al., 2018). Outro estudo realizado por 6 meses, pacientes
obesos reduziram o peso corporal, massa gorda e gordura visceral com uma dieta cetogênica
com baixo teor de carboidratos (Al Aamri et al., 2022).
Nos estudos com animais, há resultados controversos em relação à adiposidade após a
exposição às dietas com diferentes teores de carboidratos, atribuídos não somente às
diferentes distribuições quantitativas dos macronutrientes, mas também ao tipo de carboidrato
utilizado. Hernandez e colaboradores (2018) observaram redução do tecido adiposo visceral e
marrom sem que houvesse redução da massa magra de ratos após 12 semanas de dieta com
4% de carboidratos e 76% de lipídios. Já Kinzig e colaboradores (2010) evidenciaram
 10

aumento significativo da massa gorda após 6 semanas com dieta composta por 5% de
carboidratos e 80% de lipídios.
Outros experimentos realizados com animais evidenciaram os impactos da restrição
de carboidrato no tecido adiposo, como visto por Asrih e colaboradores (2015) após 4
semanas de dieta com 1,8% de carboidratos e 93,4% de lipídios, a redução dos marcadores
inflamatórios e do recrutamento de macrófagos no tecido adiposo. Pelo mesmo período de
tempo, Srivastava et al (2012) observaram com uma dieta composta por 3,2% de carboidratos
e 75,1% de lipídios o aumento mitocondrial no TAM e também dos níveis de UCP-1,
contudo, esses achados foram seguidos de aumento no depósito de gordura epididimal.
Como dito anteriormente, as dietas restritas em carboidratos podem apresentar
diferentes distribuições dos macronutrientes, sendo a baixa quantidade de carboidrato o
denominador comum, o que pode justificar a diversidade de resultados descritos acima. Não
obstante, as dietas com altas quantidades de proteínas têm se destacado pelos efeitos sobre a
ingestão alimentar e no peso corporal em humanos, sendo assim, um alvo terapêutico para a
obesidade (Pesta e Samuel, 2014).
De fato, uma dieta rica em proteínas e pobre em carboidrato, em curto prazo, foi
capaz de reduzir a fome e a ingestão calórica, além de aumentar a perda de peso em seres
humanos (Johnstone et al., 2008). O efeito das dietas ricas em proteínas sobre o peso corporal
é associado ao efeito sacietogênico das proteínas, o que impacta diretamente na ingestão
energética, apetite, deposição de gordura e consequentemente o peso (Pesta e Samuel, 2014).
A saciedade é influenciada por múltiplos fatores, incluindo o sistema endócrino,
neural e cognitivo, assim como o sistema gastrointestinal. A proteína é considerada o
macronutriente mais saciante e promove a redução da secreção de hormônios orexígenos,
aumento dos hormônios da saciedade e possui maior efeito térmico dos alimentos (Soenen e
Westerterp-Plantenga, 2008). Em estudo realizado por Crovetti e colaboradores (1998) foi
observado maior saciedade em refeição isocalórica com 68% de proteínas em relação a uma
refeição com 10% de proteínas.
Além disso, uma dieta rica em proteína pode influenciar vias gliconeogênicas para
manutenção da homeostase glicêmica, como demonstrado por Azzout-Marniche e
colaboradores (2006) ao relatar regulação positiva de duas enzimas chaves da gliconeogênese
(fosfoenolpiruvato carboxiquinase e glicose-6-fosfatase) em ratos alimentados com dieta
hiperproteica.
Em estudos com roedores, a dieta hiperproteica demonstra resultados divergentes
quanto às mudanças no peso corporal, indicadores metabólicos e adiposidade. Kinzig e
 11

colaboradores (2007) observaram um menor ganho de peso, menor ingestão calórica e

também menor insulina plasmática. Kostogrys e colaboradores (2015) também apontaram um
menor peso corporal, acompanhado de menores concentrações de triacilgliceróis plasmáticos.
Apesar desses dados serem, ao que parecem, promissores, poucos estudos avaliaram as
implicações da dieta hiperproteica no tecido adiposo no contexto da obesidade.
Outros experimentos também descreveram efeitos sobre o TA, como Schimid,
Kettelhut e Migliorini (1984) que, apesar de não identificarem diferença no peso dos animais
alimentados com dieta controle (i.e., balanceada) ou hiperproteica livre de carboidratos,
demonstraram redução significativa nos depósitos do TA epididimal nos animais submetidos
a dieta hiperproteica, quando comparado à dieta controle. Já Medeiros e colaboradores (2021)
verificaram aumento no tamanho dos adipócitos e nas citocinas pró-inflamatórias do tecido
adiposo epididimal de ratos expostos a 12 semanas de dieta hiperproteica, mas não quando
associado ao treinamento físico de resistência.
As estratégias dietéticas são apontadas como importantes aliadas no contexto da
obesidade e as dietas hiperproteicas e cetogênicas ganharam notoriedade no meio científico
por promoverem a perda de peso e outros desfechos metabólicos (Holland et al., 2016; Vargas
et al., 2018; Paoli et al., 2021; Johnstone et al., 2008; Kinzig et al., 2007), podendo contribuir
no tratamento de indivíduos obesos. Apesar disso, alguns resultados demonstram
controvérsias (Medeiros et al., 2021; Kinzig et al., 2010) e não são totalmente esclarecidas as
adaptações promovidas por essas dietas, bem como sua associação com o treinamento físico,
sobretudo acerca do tecido adiposo.

2.3 Treinamento físico aeróbico na obesidade: efeitos sobre o tecido adiposo

Os benefícios associados à prática regular de exercício físico são vistos em diversos
sistemas orgânicos do corpo humano e as adaptações promovidas por essa prática o torna um
importante aliado na prevenção da obesidade, diabetes mellitus tipo 2 e outras doenças
crônicas não transmissíveis. As principais alterações relatadas são na homeostase glicêmica,
através de adaptações musculares e hepáticas, melhoria na saúde cardiovascular e
manutenção ou perda do peso corporal (Gabriel e Zierath, 2017).
O aumento do gasto energético é uma estratégia eficaz utilizada na obesidade para
promover o balanço energético negativo. Por meio do exercício físico haverá ajustes
metabólicos para suprir a demanda energética exigida e, a partir disso, a mobilização das
reservas de energia, o glicogênio e os depósitos de gordura. (Petridou, Siopi e Mougios,
2019; Chaput et al., 2010).
 12

A mudança no perfil da secreção de hormônios e a presença ou não de substratos

energéticos levarão a ativação de enzimas das vias catabólicas durante a prática de exercício.
O exercício de moderada intensidade (60 a 70% do VO2max) estimula o aumento da lipólise
em duas a três vezes mais, comparando-se a taxa de repouso durante os 30 minutos iniciais e
pode aumentar progressivamente com o tempo de exercício (Tsiloulis e Watt, 2015).
Diante disso, estudos com humanos (Khoo et al., 2015; Bellicha et al., 2021) e
animais (Cordeiro et al., 2022) exercitados demonstraram a perda de peso e mudanças
positivas na composição corporal por meio da redução da adiposidade especialmente em
casos de sobrepeso e obesidade.
Ademais, o aumento do metabolismo oxidativo provocado pelo exercício físico
estimula mudanças térmicas, metabólicas e oxidativas, dentre eles o aumento da produção de
espécies reativas de oxigênio mitocondrial (Ji, Kang e Zhang, 2016). Contudo, como visto
por Matta et al (2021), esse estado pró oxidativo é presente logo após a sessão de exercício e
retorna às taxas basais seguido pelo aumento na expressão gênica de enzimas antioxidantes e
citoprotetoras, o que comprova o efeito adaptativo causado pelo treinamento de forma
sistêmica e em diferentes tecidos (Dias et al., 2023; Venditti e Meo, 1997; Franzoni et al.,
2017).
No tecido adiposo, já são bem estabelecidos os efeitos do treinamento físico aeróbico
sobre o tamanho dos adipócitos (Gollisch et al., 2009, a atividade mitocondrial (Trevellin et
al., 2014) e a secreção de adipocinas (Bradley et al., 2008; Golbidi e Laher, 2014) que
colaboram para a homeostase deste tecido.
Outros estudos em modelo animal demonstraram a redução de marcadores
inflamatórios em todos os depósitos de TA e aumento dos indicadores de função mitocondrial
no TAM, mesmo não havendo mudança significativa no peso (Welly et al., 2016), o exercício
aeróbico por 9 semanas também conseguiu impedir alterações em marcadores de dano
oxidativo provocado por dieta hiperlipídica (Lima et al., 2018) e reduziu a inflamação no TA
ao suprimir a infiltração de macrófagos inflamatórios e células T CD8 (Kawanish et al.,
2013).
Além das adaptações descritas anteriormente, a contração muscular decorrente do
treinamento físico estimula a secreção de citocinas e peptídeos pelo músculo esquelético,
denominadas miocinas, responsáveis pela comunicação deste tecido com diversos órgãos,
devido às suas funções autócrinas, parácrinas ou endócrinas (Hoffmann e Weigert, 2017;
Severinsen e Pedersen, 2020).
 13

2.4 Irisina e tecido adiposo

A irisina é uma miocina liberada no meio extracelular e na corrente sanguínea após a
clivagem proteolítica de uma proteína transmembrana encontrada principalmente no músculo
esquelético, a proteína fibronectina tipo III- contendo domínio 5 (FNDC5) (Boström et al.,
2012). A expressão da irisina e do seu precursor, a FNDC5, é regulada pelo coativador-1 alfa
do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma gama (PGC-1α), que por sua vez
medeia diversos processos biológicos relacionados ao metabolismo energético, em especial
no contexto do exercício físico, devido ao aumento da demanda energética (Boström et al.,
2012; Puigserver et al., 1998; Rius-Pérez et al., 2020).
O músculo esquelético representa a maior fonte de secreção e expressão de
FNDC5/irisina, confirmado por estudos com humanos (Huh et al., 2012) e animais
(Roca-Rivada et al, 2013). Roca-Rivada e colaboradores (2013) foram os primeiros a
revelarem que o tecido adiposo também participa dessa secreção, contudo a contribuição do
tecido muscular representa ~ 72% dos níveis circulantes totais da irisina.
Alguns fatores têm sido investigados quanto ao papel no mecanismo de
ativação/expressão de FNDC5, como o exercício físico (Zhu et al., 2021; Boström et al.,
2012; Lu et al., 2016), o estado nutricional (Furino et al., 2021; Varela-Rodríguez et al., 2016;
Roca-Rivada et al, 2013), o frio (Lee et al., 2014) e também a concentração da leptina
(Gutierrez-Repiso et al., 2013). Dentre esses, o exercício físico ganha destaque visto que foi
através dele que as atividades biológicas da irisina foram esclarecidas.
Independente do local de liberação, a irisina, ao atingir a corrente sanguínea, age
semelhante a um hormônio, em múltiplos órgãos e tecidos, além de atuar de maneira
autócrina. No tecido adiposo, foram relatadas mudanças, in vitro e in vivo, como a
transdiferenciação de tecido adiposo branco para tecido adiposo bege, estímulo à
termogênese (Boström et al., 2012) e, por isso, o aumento do gasto energético. Além disso,
aumenta a captação de glicose e lipólise e reduz o acúmulo lipídico (Arhire; Mihalache;
Covasa, 2019).
Mazur-Bialy e colaboradores (2017) constataram outra relevante ação da irisina nos
adipócitos. Ela atenuou diretamente o processo inflamatório em adipócitos cultivados, com a
redução da expressão e secreção de citocinas pró-inflamatórias, além de inibir a atividade
migratória de macrófagos. Outro trabalho demonstrou que a irisina atuou na diferenciação
fenotípica dos macrófagos tipo M1 para M2 (Dong et al., 2016). Tais efeitos possuem
relevância principalmente no contexto da obesidade, onde a inflamação crônica de baixo grau
contribui para manutenção e agravo da doença.
 14

Resultados controversos são encontrados a respeito da correlação entre adiposidade,

obesidade e níveis de irisina. Sabe-se que o tecido adiposo é responsável por parte da
secreção desse hormônio na circulação sanguínea, em especial, o depósito subcutâneo e em
menor quantidade pelos adipócitos dos depósitos viscerais (Roca-Rivada et al, 2013). No
entanto, alguns estudos relatam correlação positiva entre adiposidade, IMC e níveis
circulantes de irisina (Park et al., 2013; Furino et al., 2021), enquanto outros observaram
correlação negativa entre esses mesmos parâmetros (Lu et al., 2016; Moreno-Navarrete et al.,
2013). Essas diferenças podem ser atribuídas à hipótese de secreção compensatória pelos
adipócitos na obesidade, no intuito de alcançar melhor homeostase metabólica, e consequente
estado de resistência à ação da mesma, como visto também na resistência à leptina em
indivíduos obesos (Perakakis et al., 2017).
Estudos anteriores demonstraram os efeitos deletérios da obesidade sobre a saúde de
forma geral (Longo et al., 2019) e também sobre o tecido adiposo , assim como, a
contribuição dos fatores ambientais para a gênese da mesma (Kolahdouzi et al., 2019). Diante
disso, estratégias não farmacológicas são pesquisadas com intuito de reduzir tais
consequências, sendo bem estabelecido que a prática regular do exercício físico promove
efeitos benéficos sobre a saúde metabólica (Burneiko et al., 2006; Xu et al., 2011), sobre o
perfil inflamatório (Gonzalo-Encabo et al., 2021) e morfológico do tecido adiposo (Gollisch
et al., 2009).
Portanto, há evidências sobre os desfechos do exercício físico, dieta hiperproteica
restrita em carboidratos isoladamente sobre diferentes parâmetros no contexto da saúde e da
obesidade, no entanto, diante da complexidade e relevância dessa condição, há a necessidade
de elucidar se tais estratégias terapêuticas em conjunto poderiam atenuar ou reverter as
alterações deletérias decorrentes pela obesidade em estudo experimental.
Dessa forma, julga-se que o desenvolvimento do presente estudo contribuirá com o
entendimento sobre os mecanismos pelos quais o treinamento físico e a dieta hiperproteica e
restrita em carboidratos podem atuar sobre os parâmetros inflamatórios, oxidativos e
funcionais, bem como a morfologia dos depósitos adiposos branco e marrom, além do efeito
sobre os níveis de irisina.
 15

3. OBJETIVOS

3.1 Geral:

Avaliar os efeitos do treinamento físico e da dieta hiperproteica restrita em carboidratos

sobre a modulação da irisina plasmática e muscular e alterações morfológicas e funcionais no
tecido adiposo branco e marrom de ratos Wistar machos em um modelo de obesidade
induzida por dieta.

3.2 Específicos:

Investigar os efeitos de 12 semanas de treinamento físico e/ou dieta restrita em carboidratos e

hiperproteica em um modelo animal de obesidade induzida por dieta hipercalórica sobre:

● Massa dos tecidos adiposos, massa do tecido adiposo visceral, peso corporal e peso do
músculo gastrocnêmio;
● Parâmetros de inflamação, balanço redox e atividade mitocondrial dos tecidos
adiposos subcutâneo, epididimal e marrom;
● Morfometria dos tecidos adiposos subcutâneo e marrom e do músculo gastrocnêmio;
● Expressão gênica de marcadores de oxidação lipídica e capilaridade no tecido adiposo
subcutâneo;
● Expressão gênica de marcador de termogênese no tecido adiposo marrom;
● Modulação da irisina plasmática e da FNDC5 no músculo gastrocnêmio;
● Níveis de triglicerídeos no tecido adiposo marrom e no músculo gastrocnêmio.
 16

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Animais e dietas experimentais

Foram utilizados 40 ratos machos Wistar, pesando entre 150 e 200g, que foram
mantidos no biotério do Instituto Multidisciplinar em Saúde da Universidade Federal da
Bahia (IMS/UFBA) em ambiente com controle de luz (12 horas de luz, das 07:00h às 19:00h)
e temperatura (21±2ºC). Este estudo foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética em
Utilização de animais do IMS/UFBA, Protocolo: 053/2017 (Anexo A).
Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno com livre acesso à água e à
ração. Ao longo do experimento os animais foram alimentados com ração padrão comercial
(Nuvilab, Brasil) ou dieta hipercalórica com intuito de induzir a obesidade e posteriormente,
foram treinados ou não e permaneceram com a dieta hipercalórica ou mudaram para a dieta
restrita em carboidratos e hiperproteica.
A dieta hipercalórica foi constituída de 46,0% de ração padrão comercial associada a
8,0% de óleo de milho e 46,0% de leite condensado, como descrito anteriormente por
Almeida e Santos (2015). As dietas experimentais foram calculadas utilizando-se como base
a recomendação para dietas de roedores de laboratórios elaborada pelo American Institute of
Nutrition (AIN) e reportada por Reeves et al (1993).
As contribuições das frações de proteínas, carboidratos e gorduras no total de energia
metabolizável das dietas experimentais e a composição centesimal das dietas experimentais
(umidade, cinzas, proteínas, lipídeos, fibras) encontram-se nas tabelas 2 e 3, respectivamente.

Tabela 2. Contribuição das frações de proteínas, carboidratos e gorduras no total da energia

metabolizável das dietas experimentais controle (C), hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP).
Dietas experimentais
Item Controle HC HP
% de contribuição das frações dietéticas na energia metabolizável
Proteínas 29,6 12,9 65,1
Carboidratos 57,9 49,6 24,3
Gorduras 12,5 37,0 10,7
E. Metabolizável (Mkcal/kg) 3,93 4,37 4,43
 17

Tabela 3. Composição físico-química das dietas experimentais controle (C), hipercalórica

(HC) e hiperproteica (HP).
Dietas experimentais
Parâmetros (%) Controle HC HP
Umidade 14,2 ± 0,3 18,0 ± 0,6 12,0 ± 0,8
Cinzas 3,6 ± 0,0 4,5 ± 0,6 5,8 ± 0,9
Proteínas 20,4 ± 0,9 16,7 ± 0,3 47,3 ± 1,3
Carboidratos totais 52,1 ± 1,6 45,8 ± 0,7 20,0 ± 3,2
Extrato etéreo 5,3 ± 0,6 10,7 ± 2,1 4,8 ± 0,4
Fibras totais 4,4 ± 1,0 4,3 ± 1,2 10,1 ± 1,3

O planejamento estatístico e delineamento experimental para a definição do tamanho

dos grupos experimentais de ratos Wistar treinados ou não e submetidos a diferentes dietas
considerou o caráter crônico do estudo e o risco de perda amostral e inaptidão física ao longo
do protocolo de treinamento. O número de ratos Wistar por grupo (6 animais por grupo no
período de indução à obesidade e 7 animais por grupo para os tratamentos posteriores) foi
estabelecido com base nos estudos prévios realizados com treinamento físico em esteira
motorizada e dietas experimentais (Almeida e Santos, 2015; Coqueiro et al., 2018; Cunha et
al., 2012).

4.2 Procedimento experimental

Os procedimentos experimentais iniciais foram conduzidos de acordo com as
seguintes etapas:
1) Período adaptativo;
2) Indução da obesidade;
3) Tratamento dietético e exercício físico.
Em uma etapa conduzida previamente ao presente experimento, todos os animais
(n=40) passaram por um período adaptativo e receberam dieta controle padrão durante 2
semanas. Logo após essa etapa, os animais experimentais foram divididos aleatoriamente em
dois grupos: submetidos à dieta hipercalórica para indução da obesidade (n=34) ou dieta
controle normocalórica (n=6) por 8 semanas. Após esse período, foram eutanasiados 6
animais de cada grupo (controle e hipercalórica) com intuito de confirmar a obesidade,
através da avaliação da massa corporal e dos depósitos adiposos.
No protocolo experimental deste estudo, foram realizadas as intervenções com
tratamento dietético com a dieta hiperproteica restrita em carboidrato e/ou o treinamento
físico. Todos os animais que previamente receberam a dieta hipercalórica (n=28), foram
subdivididos nos seguintes grupos:
● Grupo de animais submetidos à dieta hipercalórica e sedentário (HC + SED, n=7);
 18

● Grupo de animais submetidos à dieta hipercalórica e ao treinamento (HC + TRE,

n=7);
● Grupo de animais submetidos à dieta restrita em carboidratos e hiperproteica e
sedentário (HP + SED, n=7);
● Grupo de animais submetidos à dieta restrita em carboidratos e hiperproteica e ao
treinamento (HP + TRE, n=7).
O fluxograma experimental do estudo pode ser visto na Figura 1.

Figura 1. Fluxograma ilustrativo dos grupos experimentais.

4.3 Protocolo de treinamento físico

A princípio, foi realizado um screening para seleção dos animais com aptidão para
fazer exercício em esteira. O screening consistiu em um período de sete dias de ambientação
e aclimatação ao aparato de treinamento. Os animais foram colocados durante dois dias
consecutivos em esteira elétrica motorizada de seis baias (AVS Projetos, Brasil) desligada por
5 minutos para ambientação. Após esse período, durante cinco dias consecutivos, a esteira foi
ligada e a velocidade aumentada, gradualmente, até atingir 10 m/min. Nesta velocidade, os
animais correram por cinco minutos. Quando necessário, estímulos mecânicos foram
disparados na parte final da esteira para motivar os animais a correrem. Ao final dos sete dias,
os animais que não apresentaram um padrão consistente de corrida (corrida contínua sem
 19

interrupções e sem necessidade de estímulos constantes) foram considerados inaptos e

excluídos do experimento.

4.3.1 Avaliação da capacidade aeróbica

Antes de iniciar o protocolo de treinamento, os animais foram submetidos a testes de
capacidade aeróbica máxima. Este consiste em um teste de esforço incremental na esteira
elétrica (Cunha et al., 2012), cuja velocidade inicial foi de 10 m/min, com incrementos de 5
m/min a cada três minutos. O teste foi realizado até a exaustão dos animais, e o critério de
fadiga utilizado foi a incapacidade de manter o padrão de corrida. Durante o período de
treinamento, a capacidade aeróbica foi reavaliada a cada quatro semanas para reajustar a
intensidade do exercício.

4.3.2 Parâmetros do treinamento físico

Os parâmetros de intensidade, frequência e duração para estabelecimento do
protocolo de treinamento (Tabela 4) foram baseados em diretrizes internacionais para
prescrição de exercício de endurance cardiorrespiratória (Garber et al., 2011), como se segue:
● Modalidade: Exercício aeróbico em esteira elétrica;
● Intensidade: 60% da capacidade aeróbica máxima (moderado);
● Tempo: 60 minutos contínuos;
● Frequência: Dias alternados;

Tabela 4. Protocolo de ajuste da intensidade do treinamento físico moderado.

Dias de treinamento
Parâmetros
1 2 3 4 5 6 7 8 9 ≥10

%CAmax 30 35 40 45 50 55 60 60 60 60

Tempo (min) 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

CAmáx: capacidade aeróbica máxima.

4.4 Avaliação da massa corporal

As mensurações da massa corporal foram realizadas semanalmente utilizando-se
balança digital (Acculab®).
 20

4.5 Eutanásia dos animais e obtenção das amostras do tecido e soro

Ao final das últimas 12 semanas experimentais, todos animais foram eutanasiados por
decapitação após 24 horas da última sessão de treinamento. Os depósitos de tecido adiposo
visceral (epididimal, retroperitoneal e mesentérico), subcutâneo abdominal e marrom, assim
como, do músculo gastrocnêmio dos animais foram pesados e devidamente armazenados.
Uma parte dos tecidos foi congelada em nitrogênio líquido e armazenados à - 70º C e outra
parte fixada em metacarn (clorofórmio: 6, metanol:3 e ácido acético:1) por 24 horas e
posteriormente em álcool etílico hidratado 70º INPM a fim de serem utilizados para estudos
histológicos e imunoistoquímicos.
O sangue do tronco dos animais foi coletado após 12 horas de jejum, em microtubos
secos de 1,5 mL, centrifugado para separação do soro e posteriormente armazenado a -70ºC
para futuras análises.

4.6 Peso do tecido adiposo visceral (TAV)

A partir do peso dos tecidos adiposos foi calculado o depósito visceral (TAV),
utilizando-se a seguinte fórmula:

TAV = TA epididimal + TA retroperitoneal + TA mesentérico

4.7 Dosagem de citocinas (ELISA)

Os níveis plasmáticos de irisina (Finetest®) e teciduais (tecidos adiposos subcutâneo,

epididimal e marrom) de TNF-α (Invitrogen®), IL-6 (Novex®, Life Technologies, EUA) e
IL-10 (Invitrogen®) foram quantificados por ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay)
por meio de kit comercial tipo sanduíche em fase sólida, segundo as orientações do
fabricante.

A técnica consistiu na utilização de uma placa de 96 poços sensibilizados com os

anticorpos policlonais específicos para ratos que podem se ligar aos antígenos presentes nas
amostras, as quais foram adicionadas em cada poço simultaneamente ao anticorpo policlonal
biotinilado específico (anticorpo secundário). Na etapa seguinte, foram realizadas lavagens
dos poços com tampão PBS por 3 vezes e a pipetagem da enzima peroxidase (HRP - Horse
radish peroxidase) conjugada à estreptavidina. Após a incubação e lavagem dos poços com
tampão PBS por 3 vezes para a remoção de toda enzima não ligada, a solução substrato da
enzima (peróxido de hidrogênio) foi adicionada reagindo com a enzima ligada, induzindo a
 21

produção de uma reação de cor pela presença do cromógeno TMB (tetrametilbenzidina), cuja
intensidade é proporcional a concentração das substâncias dosadas na amostra. As leituras
das reações foram realizadas em espectrofotômetro de microplacas a 450nm (VersaMax,
Molecular Devices, EUA).

4.8 Balanço redox do tecido adiposo

4.8.1 Peroxidação lipídica

A peroxidação lipídica no homogenatos dos tecidos adiposos (subcutâneo, epididimal

e marrom) foi estimada pelo ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (do inglês,
thiobarbituric acid reactive substances - TBARS) (Draper et al., 1993). Com o auxílio do
sistema TissueRuptor (Qiagen, EUA), os tecidos (100 mg/mL) foram homogeneizados em
tampão Tris HCl (50 mM), pH 8,0 e de hidroxitolueno butilado (BHT, 0,02 %) para evitar
oxidações espúrias. Em seguida, o homogenato foi centrifugado (Z 36 HK,
Hermle-Labortechnik, Alemanha) a 1.600xg por 10 min a 4 ºC para coleta do sobrenadante.
Posteriormente, o sobrenadante foi diluído (1:2) em tampão Tris HCl num volume final de
100 µL, adicionado de 100 µL de ácido tricloroacético (10%) e 800 µL de ácido
tiobarbitúrico (0,53%, dissolvido em ácido acético a 20%). A mistura reacional foi incubada
por 1 h a 95 ºC, seguido do resfriamento em gelo por 10 min a fim de cessar a reação. As
amostras foram novamente centrifugadas a 1.600xg por 10 min a 4 ºC, e a absorbância foi
lida a 535 nm em espectrofotômetro (SP 2000 UV, BEL® Photonics, Brasil). A concentração
de TBARS é calculada com base na curva feita com o padrão de malondialdeído (0 a 50 µM),
normalizada pela concentração de proteínas e expressa em mol de equivalentes de MDA/g de
proteína.

4.8.2 Proteínas carboniladas

A introdução de grupos carbonil nos resíduos de aminoácidos de proteínas é um dos

principais eventos de modificação pós-traducional por oxidação. O nível de proteínas
carboniladas nos homogenatos dos tecidos adiposos (subcutâneo, epididimal e marrom) foi
estimado pelo método descrito por Levine et al (1990). Os tecidos adiposos (100 mg/mL)
foram homogeneizados em tampão Tris HCl (50 mM), pH 8,0 e de hidroxitolueno butilado
(BHT, 0,02 %) para evitar oxidações espúrias. Em seguida, o homogenato foi centrifugado (Z
36 HK, Hermle-Labortechnik, Alemanha) a 1.600xg por 10 min a 4 ºC para coleta do
sobrenadante. Resumidamente, 100 µL do sobrenadante foram pipetados em microtubos
contendo 600 µL de 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH). Posteriormente, foram incubados
 22

durante 60 min à temperatura ambiente, protegido da luz, sob agitação. Em seguida, foram
adicionados 600 µL de TCA a 20%, seguido de agitação e refrigeração (banho de gelo) por
10 min e centrifugado por 5 min a 800xg. O pellet formado foi lavado por 3 vezes, seguidas
de centrifugação durante 5 min a 800xg, utilizando 600 µL de etanol: acetado de etila (1:5).
Após a última lavagem, o excesso de etanol:acetado de etila foi removido e foram
adicionados 800 µL de guanidina, seguida da incubação por 60 min à 37ºC e na sequência,
foi realizada a leitura no comprimento de onda 360 nm em espectrofotômetro (SP 2000 UV,
BEL® Photonics, Brasil). A concentração de proteínas carboniladas foi calculada pela
fórmula descrita:
𝐴𝑏𝑠 𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑎 𝑉𝑅
𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜𝑛𝑖𝑙𝑎𝑑𝑎𝑠 = −1 −1 × 𝑉𝐴
22.0 𝑀 𝑐𝑚

Onde:

22 é o coeficiente de extinção molar das hidrazonas alifáticas em unidades de 22,0 M-1 cm-1

VR é o volume de reação em mL;

VA é o volume de amostra em mL.

Os resultados foram expressos como nmol por miligrama de proteína.

4.8.3 Nitritos totais

Os níveis de óxido nítrico no sobrenadante dos homogenatos dos tecidos adiposos

(subcutâneo, epididimal e marrom) foram medidos por método indireto através da dosagem
de nitritos totais pelo ensaio de Griess (Green et al., 1982). Resumidamente, em placa de 96
poços foram pipetados 50 μL do sobrenadante do homogenato do tecido adiposo, 50 μL de
naftilenodiamina 0,1% seguido da incubação da placa no escuro e temperatura ambiente por
10 min. Após incubação, foi adicionado aos poços 50 μL de sulfanilamida 1% em ácido
fosfórico 5%, seguido de nova incubação durante 10 min. A absorbância foi determinada em
espectrofotômetro de placas em 540 nm. Os valores de absorbância das amostras foram
interpolados à equação da reta gerada pela curva padrão de nitrito de sódio (0 - 100 mM)
(Green et al., 1982).
 23

4.8.4 Atividade da enzima superóxido dismutase

A técnica para medir a atividade da enzima superóxido dismutase (SOD), baseia-se na

sua capacidade de inibir a auto-oxidação do pirogalol, de acordo com Marklund e Marklund
(1974). Portanto, quanto maior a concentração de SOD na amostra, menor é a auto-oxidação
do pirogalol. SOD compete com o O2- formado pela auto-oxidação do pirogalol, que é
responsável pela redução do MTT em cristais de formazana. No ensaio, 100 mg dos tecidos
adiposos foram homogeneizados com 1 mL de tampão fosfato (50mM, pH 7,0) e em seguida,
centrifugados por 10 minutos a 12.000 xg a 4°C. O sobrenadante foi retirado e usado como
amostra biológica. Foi pipetado na placa 30 μL de amostra, 99 μL de tampão fosfato (50 mM,
pH 7,0), 6 μL de MTT(1,25mM) e 15 μL de pirogalol (100 μM). Para o branco foi pipetado
144 μL de tampão fosfato (50 mM) e 6 μL de MTT (1,25 mM) e para o padrão 129 μL de
tampão fosfato (pH 7, 50 mM, 6 μL de MTT - 1,25 mM) e 15 μL de pirogalol (100 μM). Em
seguida, a placa foi incubada por 5 minutos em estufa a 37°C. Logo após, 150 μL de DMSO
foram adicionados para cessar a reação. As absorbâncias foram lidas em leitor de placas
(Thermoplate, Tp-reader, EUA) em um comprimento de onda de 570 nm. Os resultados
foram expressos em U/mg de proteína, onde uma unidade de SOD é definida como a
quantidade de enzima necessária para inibir 50% da redução do MTT.

4.8.5 Atividade da enzima glutationa peroxidase

A medida da atividade da enzima glutationa peroxidase (GPx) foi realizada de acordo

com o método proposto por Paglia e Valentine (1967). O método se baseia na oxidação da
glutationa reduzida (GSH), catalisada pela GPx, acoplada à reciclagem da glutationa oxidada
(GSSG) através da reação catalisada pela enzima glutationa redutase (GR) que utiliza o
dinucleotídeo de nicotinamida-adenina-fosfato (NADPH) como cofator. O decréscimo na
absorbância medida à 340 nm durante a oxidação do NADPH é indicativo da atividade da
GPx. Foram homogeneizados separadamente os tecidos adiposos subcutâneo, epididimal e
marrom em tampão Tris HCL 50 mM, pH 7,0 (tampão de ensaio) na proporção de 100
mg/mL. Após centrifugação a 10.000xg por 15 minutos à 4º C (Z 36 HK,
Hermle-Labortechnik, Alemanha), o sobrenadante foi removido e utilizado no ensaio. Foram
pipetados em cubeta 300 μL de tampão de ensaio, 250 μL de homogenato e 400 μL do mix
reacional (0,25 mM NADPH, 2,1 mM de GSH, 0,5 U/mL de GR e 1 mM de azida sódica).
 24

A azida sódica foi adicionada ao meio para inibir a catalase que também utiliza o
peróxido de hidrogênio como substrato. A reação foi iniciada pela adição de 50 μL de H2O2
0,2 mM, utilizado como substrato da reação. A decomposição do NADPH foi monitorada em
espectrofotômetro (SP 2000 UV, BEL® Photonics, Brasil) a 340 nm. Foram realizadas
leituras consecutivas a cada 15 segundos durante 6 minutos e a atividade da GPx foi
calculada utilizando a fórmula descrita:
∆𝐴340 /𝑚𝑖𝑛 𝑉𝑅
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑎 𝐺𝑃𝑥 = 6,22 μ𝑚𝑜𝑙/𝑚𝑖𝑛
× 𝑉𝐴

Onde:

ΔA340 é o delta da absorbância por minuto;

6,22 é o coeficiente de extinção molar do NADPH em unidades de μmol-1 cm-1;

VR é o volume de reação em mL;

VA é o volume de amostra em mL.

Uma unidade de enzima é definida como a quantidade de enzima que causa a

oxidação de 1 μmol de NADPH por minuto a 25º C. Os resultados foram expressos em
unidade por miligrama de proteína.

4.8.6 Atividade da enzima catalase

A atividade da enzima catalase foi mensurada a partir da taxa de decaimento do

peróxido de hidrogênio (H2O2) na absorbância de 240 nm (Aebi, 1984). Resumidamente, os
tecidos adiposos (subcutâneo, epididimal e marrom) foram homogeneizados em tampão
fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,2) na proporção de 100 mg/mL, e em seguida foi
centrifugado por 10 minutos a 10.000xg a 4 °C (Z 36 HK, Hermle-Labortechnik, Alemanha).
O sobrenadante coletado foi incubado com 900 μL do mix reacional (25 mL de tampão
fosfato para 40 μL de H2O2 30%), e as absorbâncias imediatamente determinadas a cada 10
segundos, durante um minuto, a 240 nm em espectrofotômetro (SP 2000 UV, BEL®
Photonics, Brasil). O tampão fosfato foi utilizado como branco para zerar o aparelho. A
atividade da catalase foi determinada pela diminuição da absorbância em 240 nm causada
pelo desaparecimento do H2O2, e calculada pela fórmula descrita:
Δ𝐴240 /𝑚𝑖𝑛 𝑉𝑅
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑎 𝐶𝑎𝑡𝑎𝑙𝑎𝑠𝑒 = −1 −1 × 𝑉𝐴
39.4 𝑀 𝑐𝑚
 25

Onde:

ΔA240 é o delta da absorbância por minuto;

39,4 é o coeficiente de extinção molar do H2O2 em unidades de 39.4 M-1 cm-1

VR é o volume de reação em mL;

VA é o volume de amostra em mL.

Uma unidade da enzima é equivalente a decomposição de 1 μmol de H2O2 por minuto a

25ºC. Os resultados foram expressos em unidade por miligramas de proteína.

4.9 Avaliação da atividade mitocondrial

O método proposto por Spinazzi et al (2012) descreve a medida da atividade

enzimática da citrato sintase (CS) que é utilizada como marcador exclusivo da abundância de
mitocôndrias presentes no tecido. A CS é a enzima inicial do ciclo do ácido tricarboxílico, e
catalisa a reação entre a acetil coenzima A (acetil CoA) e oxalacetato para formar o ácido
cítrico e CoA ligada a um grupo tiol (CoA-SH). O ensaio colorimétrico se baseia na reação
entre o ácido 5’,5’-ditiobis 2-nitrobenzoico (DTNB) e CoA-SH para formar o ácido
5-tio-2-nitrobenzóico (TNB), de modo que o aumento progressivo da absorbância é
proporcional à atividade da CS. Para realização do ensaio, os tecidos adiposos (subcutâneo,
epididimal e marrom) foram homogeneizados na proporção de 100 mg/mL em tampão Tris
HCL 250 mM, pH 7,4 suplementado com sacarose (85,4 mg/mL), em seguida centrifugados a
600 xg por 10 minutos à 4º C (Z 36 HK, Hermle-Labortechnik, Alemanha) e os
sobrenadantes separados para o ensaio. Para cada poço da placa de 96 poços foram
adicionados 126 uL do mix reacional (100 uL de tampão Tris HCL 200 mM + Triton 100x
0,2%, 20 uL de DTNB 1 mM e 6 uL de Acetil CoA) e 64 uL da amostra. A reação foi
iniciada ao adicionar 10 uL de oxalacetato 10 mM a cada poço, e o aumento da absorbância
foi monitorado em espectrofotômetro de placa (Thermoplate, Tp-reader, EUA) a cada 10
segundos, durante 3 minutos. A atividade da CS foi calculada utilizando a fórmula descrita:
Δ𝐴412 /𝑚𝑖𝑛 ×1,000 𝑉𝑅
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑎 𝐶𝑆 = −1 −1 × 𝑉𝐴
[( ) ]
13,6 𝑛𝑀 𝑐𝑚 × 𝑉𝐴 ×(𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑚𝑔/𝑚𝑙)

Onde:

ΔA412 é o delta da absorbância por minuto;

13,6 é o coeficiente de extinção molar do DTNB em unidades de mM-1cm-1;

 26

VA é o volume de amostra em mL.

A atividade específica da CS foi expressa em nmol/min/mg de proteína.

4.10 Estudos histológicos

Os tecidos adiposos subcutâneo e marrom e o tecido muscular gastrocnêmio foram

coletados, fixados por 24 horas e armazenados em álcool à 70%, posteriormente foram
submetidos às seguintes etapas: seleção macroscópica das amostras; processamento manual;
inclusão em parafina histológica em estado líquido (58ºC); microtomia dos blocos de parafina
em micrótomo manual, produzindo cortes de 4m de espessura que foram dispostos em
lâminas histológicas tratadas previamente com poli-L-lisina. As amostras produzidas foram
destinadas às reações de imuno-histoquímica e às análises morfométricas mediante coloração
anterior dos cortes de tecido com hematoxilina e eosina (HE).

4.10.1 Morfometria

Para a morfometria, as lâminas dos tecidos adiposos subcutâneo e marrom e do

músculo gastrocnêmio coradas com HE foram observadas em microscópio óptico (Olympus
BX51®) em aumentos de 20x. As imagens (20 a 30 campos, por lâmina/animal) foram
capturadas com o auxílio de uma câmera (Kontron Electronic KS-300, Eching, Germany)
acoplada ao microscópio, sendo avaliados os seguintes parâmetros por meio de um sistema
computadorizado para análises morfométricas (ImageJ):

Tabela 5. Análises morfométricas realizadas por tecido.

Análises morfométricas

Tecido Parâmetros avaliados

● Área seccional das fibras;

Gastrocnêmio ● Número de mionúcleos.

● Número de adipócitos;
● Diâmetro menor e maior dos adipócitos (10
Tecido adiposo subcutâneo adipócitos/campo);
abdominal ● Área dos adipócitos (10 adipócitos/campo).

● Número de adipócitos multiloculares e

uniloculares (%);
Tecido adiposo marrom ● Área dos adipócitos uniloculares (todos) e
multiloculares (50 adipócitos/animal);
● % de área de gotículas lipídicas.
 27

A porcentagem de gotículas lipídicas presentes no tecido adiposo marrom foi

realizada através da análise por segmentação de imagem e posterior uso de histograma para
tal, as fotomicrografias foram convertidas em escala de cinza e logo após, submetidas à uma
etapa de limiarização automática para que incluísse apenas os vacúolos lipídicos,
representados pela área branca (Figura 2) (Gonçalves et al., 2017).

Figura 2. Fotos ilustrativas da análise de percentual de gotículas lipídicas no programa

ImageJ 1.44P (National Institutes of Health, EUA). Ajuste da imagem para 8bit com
threshold red (A), limiarização para cinza (B) e posteriormente para preto - opção dark
background (C).

4.10.2 Imuno-histoquímica

Os cortes dos tecidos adiposos subcutâneo e marrom e do músculo gastrocnêmio

foram submetidos à reação de imuno-histoquímica (Flanders et al., 1989; Kliem et al., 1996).
Inicialmente os cortes foram desparafinizados em uma sequência de três soluções de xilol e
hidratados em álcool de concentrações decrescentes (álcool 100% por 5 minutos, álcool 95%
por 4 minutos e álcool 75% por 1 minuto). Para a recuperação antigênica, as lâminas foram
mergulhadas em uma solução de Tris-EDTA (pH 9,0) e levadas ao aquecimento em banho
maria por 20 minutos a 100°C e resfriadas em água e gelo durante 10 minutos. Foi realizado
o bloqueio da peroxidase endógena mediante solução composta de água destilada (196 ml),
azida sódica 10% (2 mL) e água oxigenada de 30% (2 mL) por 10 minutos prosseguindo-se
com a lavagem das lâminas em tampão fosfato salino (PBS) com tween (sabão).
Os cortes dos diferentes tecidos foram incubados com seus respectivos anticorpos
primários (tabela 6), diluídos em BSA 1%, overnight a 4ºC.
 28

Tabela 6. Anticorpos primários utilizados na imuno-histoquímica dos tecidos adiposos

subcutâneo e marrom e do gastrocnêmio.
Anticorpo Tecido Clone Diluição Fornecedor

NF-ⲕB TASC Policlonal 1:200 Cell Signalli®

AB7970

NF-ⲕB TAM Policlonal 1:300 Cell Signalli®

AB7970

CD68 TASC Monoclonal 1:100 AbD Serotec®

sc-53044

CD206 TASC Policlonal 1:50 Bioss®

bs-4727R

CD43 TASC Policlonal 1:100 Santa Cruz

Biotechnology®
MCA341GA

CD31 TASC Policlonal 1:300 Bioss®

bs-0468R

MCP-1 TASC Policlonal 1:50 Santa Cruz

Biotechnology®
sc-377082

FNDC5 Gastrocnêmio Policlonal 1:100 Finetest®

FNab03178

Em seguida, as lâminas foram incubadas com 50 µl de anticorpos secundários

biotinilados antimouse (CD-68) ou anti-rabbit (todos, exceto CD-68) por 1 hora. O produto
da reação foi detectado após a incubação com 50 µl do complexo Avidina-biotina-peroxidase
(Vector Laboratories, Burlingame®, CA, USA) por 30 minutos e a cor foi desenvolvida com
3,3-diaminobenzidina (ImmPACTTMDAB Peroxidase Substrate – Vector Laboratories®) por
10 minutos no TASC e 7 minutos no TAM e gastrocnêmio. A contracoloração foi realizada
com hematoxilina de Harris por 1 minuto e meio no TASC e 2 minutos e meio no TAM e
gastrocnêmio. Para cada reação de imuno-histoquímica foi realizado um controle negativo,
submetendo os cortes dos tecidos às mesmas condições da reação, omitindo-se, entretanto, a
incubação com o anticorpo primário.
 29

4.10.3 Avaliação da imunomarcação

A imunolocalização e a quantificação das células positivas para CD68 (macrófagos

totais), CD206 (macrófagos M2) e CD43 (Linfócitos T), além das estruturas crown-like,
definidas por Cinti et al (2005), no TASC, foi realizada em microscópio óptico (Olympus
BX51®) em aumentos de 20x, considerando-se 25 a 30 campos microscópicos por
lâmina/animal. Foi calculada a média do número de células inflamatórias/campo e de
estruturas crown-like/campo de cada corte analisado, além da razão entre células CD68 e
CD206.

Para quantificação da vascularização, estruturas positivas para CD31 com formato

redondo ou cilíndrico nos adipócitos foram consideradas como vasos sanguíneos e
quantificadas (Chin et al., 2016; Wagatsuma, 2006). Foram avaliados 30 campos por animal e
calculada a média das células CD31+/campo.

A imunomarcação de FNDC5 (gastrocnêmio), MCP-1 (TASC) e NF-ⲕB (TASC e

TAM) foi avaliada por porcentagem de área marcada em 30 campos/animal capturados com
uma câmera (Kontron Electronic KS-300, Eching, Germany) acoplada ao microscópio e
posteriormente avaliados através do software Image J.

4.11 Análise da expressão gênica nos tecidos adiposos subcutâneo e marrom

4.11.1 Extração do ácido ribonucléico (RNA)

O RNA total dos tecidos adiposos subcutâneo e marrom congelados foi extraído
utilizando o reagente de lise TrizolTM (Invitrogen, EUA) de acordo com as instruções do
fabricante, e o sistema TissueRuptor (Qiagen, EUA) foi usado para homogeneização dos
tecidos. Durante o processo de purificação, o RNA foi tratado com TURBO DNA-freeTM
(Invitrogen, EUA) para digestão de possíveis contaminações por ácido desoxirribonucléico
(DNA), seguindo as orientações do fabricante. A concentração (ng/μL) e pureza (A260:A230
e A260:A280) do RNA total foram avaliadas por espectrofotometria (NanoDropTM 2000,
Thermo Fisher Scientific, EUA). O RNA isolado foi mantido em ultra-freezer à -80ºC até o
momento da transcrição reversa.
 30

4.11.2 Síntese do DNA complementar (cDNA) e ensaios de reação em cadeia da

polimerase em tempo real (qPCR)

O cDNA foi sintetizado com até 2 µg do RNA total por meio do kit de transcrição
reversa High-Capacity RNA-to-cDNATM (Applied Biosystem, EUA), seguindo as instruções
do fabricante. Este material foi estocado em freezer à -80ºC até o momento da realização da
qPCR. A expressão dos genes que codificam as proteínas de interesse para cada tecido (tabela
7) foram quantificadas por qPCR utilizando o sistema PowerUpTM SYBRTM Green Master
Mix (Applied Biosystem, EUA) a partir das amostras de cDNA na concentração de 100
ng/µL. Todos os procedimentos foram realizados em duplicata, conduzidos de acordo com as
instruções do fabricante, sendo que o termociclador StepOne Plus (Applied Biosystem, EUA)
foi utilizado para realização dos ensaios.

Tabela 7. Genes que codificam as proteínas de interesse avaliados por qPCR.

Tecido adiposo subcutâneo Tecido adiposo marrom

1. TNF-α, IL-6, IL-10, IL-27, 1. SOD-1, Gpx-1 e CAT

adiponectina 2. UCP-1
2. SOD-1, CAT, Gpx-1 e Nrf2 3. GAPDH
3. CD-36, CPT-1, SIRT-1
4. GAPDH

As sequências específicas dos primers para os genes alvos estão descritas na tabela 8.
Para atestar 100% de identidade das sequências de primers, os anelamentos foram realizados
com auxílio da ferramenta Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) da plataforma
online National Center for Biotechnology Information (NCBI). A partir da obtenção dos
resultados de Ct (cycle treshold) fornecidos pelo termociclador, foi calculado a expressão
relativa (fold-change) por meio do método comparativo (2-ΔΔCt) (Schmittgen, 2001), e o
gene do gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi utilizado como controle
endógeno para correção da amplificação de cada amostra.
 31

Tabela 8. Sequência de primers de genes marcadores de função, perfil redox e inflamatório

dos tecidos adiposos subcutâneo e marrom em ensaios de qPCR.
Primers de genes marcadores de perfil redox (Rattus norvegicus)

Alvo Sequência de nucleotídeos (5’-3’) Referência

Forward: ATGGGGACAATACACAAGGC Almaghrabi et al., 2015

SOD-1
Reverse: TCATCTTGTTTCTCGTGGAC

Forward: GTCCGATTCTCCACAGTCGC Almaghrabi et al., 2015

Catalase
Reverse: CGCTGAACAAGAAAGTAACCTG

Forward: CACAGTCCACCGTGTATGCC Almaghrabi et al., 2015

Gpx-1
Reverse: AAGTTGGGCTCGAACCCACC

Forward: CACAGTGCTCCTATGCGTGA Shen et al., 2017

Nrf2
Reverse: TTCTGGGCGGCGACTTTATT

Primers de genes marcadores de perfil inflamatório (Rattus norvegicus)

Forward: TGTGCCTCAGCCTCTTCTCATTC Fanaei et al., 2021

TNF-α
Reverse: CATTTGGGAACTTCTCCTCCTTG

Forward: GGTCTTCTGGAGTTCCGTTT Fanaei et al., 2021

IL-6
Reverse: AGTTGGGGTAGGAAGGACTA

Forward: GACGCTGTCATCGATTTCTCC Ranjbaran et al., 2017

IL-10
Reverse: AGTAGATGCCGGGTGGTTCA

IL-27 Forward: TTCCTCGCTACCACACTTCG Zeng et al., 2012

Reverse: ATCCAGCCTCATTGCCCAC

Forward: CTACTGTTGCAAGCTCTCC Milan et al., 2012

Adiponectina
Reverse: CTTCACATCTTTCATGTACACC

Primers de genes marcadores de função do TASC ou TAM (Rattus norvegicus)

CD-36 Forward: CAGCTGCACCACATATCTACAC Renu et al., 2019

Reverse: TTAAACTTCGTGTTTGGAACAT

CPT-1 Forward: GGATGGCATGTGGGTAAAAG Abdel-Sattar et a., 2018

Reverse: TACTGACACAGGCAGCCAAA

SIRT-1 Forward: GCAGGGACGTCTTTGTGGCT Muñoz et al., 2018

 32

Reverse: TGTTTCCTGTGGGATACCTGA

UCP-1 Forward: CAATGACCATGTACACCAAGGAA Teimourian et al., 2020

Reverse: CTGACCTTCACCACCTCTGT

GAPDH Forward: ATGCTGGTGCTGAGTATGTC Li et al., 2020

Reverse: AGTTGTCATATTTCTCGTGG

4.12 Extração e dosagem de lipídios no gastrocnêmio e tecido adiposo marrom

A quantificação de lipídios no músculo gastrocnêmio e tecido adiposo marrom foi

realizada pelo método gravimétrico, após extração lipídica conforme descrito por Folch, Less
e Stanley (1957). Foi pesado 100 mg de amostra do tecido congelado em tubos previamente
identificados. O sistema TissueRuptor (Qiagen, EUA) foi usado para homogeneização do
tecido com 1900 µL de solução contendo clorofórmio:metanol (2:1) por 3 minutos. Foi
adicionado 400 µL de metanol e centrifugado (Z 36 HK, Hermle-Labortechnik, Alemanha)
por 10 minutos a 3000 rpm. O sobrenadante foi transferido para novos tubos com peso
conhecido. Acrescentou-se 800 µL de clorofórmio e 640 µL de solução de NaCl a 0,73%. Foi
centrifugado novamente as amostras por 10 minutos a 3000 rpm e o sobrenadante foi
descartado. O precipitado foi lavado por 3 vezes com 600 µL de solução de Folch (3% de
clorofórmio, 48% de metanol, 47% de água destilada e 2% de NaCl a 0,2%). A cada
lavagem, centrifugou-se por 10 minutos a 3000 rpm e descartou-se o sobrenadante. Após a
última lavagem, o sobrenadante foi descartado e os tubos levados à estufa (60ºC) para
evaporação. Após a secagem, o recipiente foi pesado novamente para o cálculo de diferença
do peso. A quantidade de lipídios extraída é dada pela diferença dos tubos de ensaio antes e
depois de secos. O extrato lipídico seco foi ressuspendido em 1 mL de isopropanol e
homogeneizado até a completa solubilização dos lipídios.

Os níveis de triglicerídeos foram determinados por meio de kit comercial

colorimétrico (Triglicerides Monorreagente - K117, Bioclin/Quibasa Química Básica,
Brasil), seguindo as instruções do fabricante. A leitura da absorbância foi feita por
espectrofotometria utilizando comprimento de onda de 500nm (SP 2000 UV, BEL ®
Photonics, Brasil).
 33

4.13 Análise estatística

Todas as variáveis de interesse deste estudo foram submetidas ao teste de normalidade

Shapiro-Wilk. As comparações foram feitas com o teste ANOVA two-way (2 dietas x 2
condições de treinamento), seguida pelo pós-teste de Bonferroni. As diferenças foram
consideradas significativas quando o valor de p<0,05. As análises foram realizadas no
programa SPSS 21.0 (2012, Armonk, NY. IBM Corp.). Os resultados são apresentados em
média±erro padrão (EPM) nas tabelas e nos gráficos.
 34

5. RESULTADOS

5.1 Massa corporal e massa dos tecidos

Os dados de composição corporal dos animais são apresentados na tabela 9. Os

resultados mostraram efeito significativo da dieta (p < 0.05), bem como do treinamento físico
(p < 0.05) sobre o peso corporal, peso do músculo gastrocnêmio, e todos os depósitos de
tecido adiposo estudados (TAME, TAR, TAE, TAV, TASC, TAM). A análise post hoc indicou
maior peso corporal e maiores depósitos de tecido adiposo, entre os animais submetidos
apenas à dieta HC quando comparado aos animais submetidos a dieta HP, em contrapartida, o
peso do músculo gastrocnêmio foi menor entre os animais submetidos a dieta HC. Os animais
treinados apresentaram menor peso corporal, maior peso do músculo gastrocnêmio e menor
peso dos depósitos de tecido adiposo, quando comparados aos animais sedentários.

Tabela 9. Composição corporal dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica
restrita em carboidratos (HP) associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE).
Efeito Efeito Interação
HC+SED HC+TRE HP+SED HP+TRE do da dieta x
TRE dieta TRE
Peso corporal 627.5±25.4 499.9±9.4* 540.2±8.5ϕ 479.9±13.8Φ < 0.01 < 0.01 0.04
* ϕ
Gastrocnêmio 0.48±0.02 0.56±0.01 0.58±0.01 0.57±0.01 0.04 < 0.01 0.03
TASC 3.59±0.51 2,09±0.23* 2.27±0.25ϕ 1.56±0.14 < 0.01 < 0.01 0.22
TAR 3.83±0.29 2,35±0.24* 2.09±0.30ϕ 1.82±0.31 < 0.01 < 0.01 0.04
* ϕ
TAE 2.54±0.17 1,56±0.12 1.64±0.22 1.50±0.16 <0.01 0.01 0.02
TAME 1.77±0.13 1,01±0.15* 1.00±0.15ϕ 0.85±0.08 < 0.01 < 0.01 0.03
TAV 8.14±0.47 4,92±0.40* 4.74±0.45ϕ 4.17±0.52 < 0.01 < 0.01 < 0.01
*
TAM 0.19±0.01 0.11±0.01 0.09±0.01ϕ 0.11±0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01

TASC, Tecido adiposo subcutâneo; TAR, Tecido adiposo retroperitoneal; TAE, Tecido adiposo epididimal; TAME, Tecido
adiposo mesentérico, TAV, Tecido adiposo visceral; TAM, Tecido adiposo marrom. Os dados são expressos como média ±
EPM. (*) HC+SED ≠ HP+SED, p< 0.05; (ϕ) HC+SED ≠ HC+TRE; p <0.05; (Φ) HP+SED ≠ HP+TRE; p <0.05.

5.2 Irisina sérica e muscular

A concentração sérica de irisina foi estatisticamente superior entre os animais

treinados (Figura 3A) (F = 17.1; p = 0.001). A análise post hoc dos subgrupos indicou que
apenas os animais treinados e submetidos à dieta hiperproteica (HP+TRE) apresentaram
diferença significativa em relação aos animais sedentários e submetidos ao mesmo padrão
dietético (HP+SED) (p = 0.001) (Figura 3C).
 35

Figura 3. Irisina sérica dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP), associada ou não (SED) ao
treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido de comparações pelo
pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do treinamento (A), efeitos
isolados da dieta (B) e análises de subgrupos (C). (θ) Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*)
HP+SED ≠ HP+TRE, p< 0.05.

A comparação da imunomarcação para o precursor da irisina (FNDC5) no músculo

gastrocnêmio mostrou efeito significativo para a dieta (Figura 4B) (F = 58.1; p < 0.001) e
para o treinamento (Figura 4A) (F = 671.0; p < 0.001). Os animais submetidos à dieta HP,
bem como ao treinamento físico, apresentaram áreas de imunomarcação maiores. A análise
post hoc (Figura 4C) confirmou que os animais treinados apresentaram maior
imunomarcação de FNDC5, independentemente da dieta aplicada (HC+TRE > HC+SED;
HP+TRE > HP+SED). Ademais, os animais treinados e submetidos a dieta HP apresentaram
valores significativamente maiores em relação aos animais sedentários submetidos à mesma
dieta (HP+TRE > HP+SED). As fotomicrografias representativas encontram-se na figura 5.
 36

Figura 4. Avaliação do precursor da irisina tecidual (FNDC5) através da quantificação da % da área marcada por campo
pela técnica de imuno-histoquímica no músculo gastrocnêmio dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e
hiperproteica (HP), associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA
Two-Way, seguido de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos
isolados do treinamento (A), efeitos isolados da dieta (B) e análises de subgrupos (C). (ω) Efeito significativo da dieta, HC
≠ HP, p <0.05; (θ) Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HP+SED ≠ HP+TRE, HC+SED ≠
HC+TRE p< 0.05; (ϕ) HP+TRE ≠ HC+TRE, p < 0.05.

Figura 5. Fotomicrografias representativas da imunomarcação de FNDC5 através da técnica de imuno-histoquímica no

músculo gastrocnêmio, obtidas com câmera acoplada em microscópio no aumento de 200x. (A) HC + SED, (B) HP + SED,
(C) HC + TRE e (D) HP + TRE. HC, Dieta hipercalórica; HP, Dieta hiperproteica restrita em carboidratos; TRE,
Treinamento físico; SED, Sedentário. Notar que em (D) a imunomarcação de FNDC5 se apresenta não somente na borda das
fibras musculares, mas também no centro.
 37

5.3 Análise morfométrica e qualitativa do tecido muscular

A morfometria do tecido muscular indicou efeito significativo da dieta (Figura 6B) (F

= 47.8; p < 0.001) e do treinamento físico (Figura 6A) (F = 9.4; p < 0.01) sobre a área das
fibras musculares do gastrocnêmio dos animais. Os animais submetidos a dieta HP, bem
como ao treinamento físico, apresentaram áreas das fibras musculares maiores. A análise post
hoc (Figura 6C) confirmou que os animais treinados apresentaram maior área das fibras
musculares (HC+TRE > HC+SED). Os animais submetidos a dieta HP, independentemente
do treinamento, apresentaram valores significativamente maiores em relação aos animais
submetidos à dieta HC (HP+TRE > HC+TRE; HP+SED> HC+SED).

Figura 6. Análise morfológica do músculo gastrocnêmio feita através da quantificação da área das fibras musculares dos
animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP), associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE).
As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os
resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do treinamento (A), efeitos isolados da dieta (B) e análises
de subgrupos (C). (ω) Efeito significativo da dieta, HC ≠ HP, p <0.05; (θ) Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠
TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠ HC+TRE p< 0.05; (ϕ) HP+TRE ≠ HC+TRE, HP+SED ≠ HC+SED p < 0.05.
 38

O número de mionúcleos foi influenciado pela dieta (Figura 7B) (F = 27.8; p <
0.001), mas não pelo treinamento físico (Figura 7A) (F = 2.7; p = 0.115). Os animais
submetidos a dieta HP apresentaram maior contagem de mionúcleos em relação aos animais
submetidos à dieta HC. A comparação de subgrupos (Figura 7C) indicou ainda que dentre os
animais submetidos a dieta HC, os que foram treinados apresentaram maior quantidade de
mionúcleos, enquanto a comparação entre animais sedentários submetidos a diferentes dietas
indicou que os animais do grupo HP+SED apresentaram maior quantidade de mionúcleos em
relação aos HC+SED (Figura 7). As fotomicrografias representativas das análises
morfológicas encontram-se na Figura 8.

Figura 7. Análise morfológica do músculo gastrocnêmio feita através da quantificação de mionúcleos do músculo
gastrocnêmio dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP), associada ou não (SED) ao
treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido de comparações pelo
pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do treinamento (A), efeitos
isolados da dieta (B) e análises de subgrupos (C). (ω) Efeito significativo da dieta, HC ≠ HP, p <0.05; (*) HC+SED ≠
HC+TRE p< 0.05; (ϕ) HP+SED ≠ HC+SED p < 0.05.
 39

Figura 8. Fotomicrografias representativas da área das fibras musculares do músculo gastrocnêmio feitas pela coloração
hematoxilina e eosina, obtidas com câmera acoplada em microscópio no aumento de 200x. (A) HC + SED, (B) HP + SED,
(C) HC + TRE e (D) HP + TRE. HC, Dieta hipercalórica; HP, Dieta hiperproteica restrita em carboidratos; TRE,
Treinamento físico; SED, Sedentário. Notar que a área das fibras musculares em (B) encontram-se maiores que em (A) e em
(D) maiores que em (C) representando o efeito da dieta HP e que em (C) maior que em (A) representando o efeito do
treinamento nos animais sedentários.

A comparação da quantidade de triglicerídeos intramuscular, um indicador de

qualidade muscular, mostrou efeito significativo tanto da dieta (Figura 9B) (F = 15.1; p =
0.001), quanto do exercício (Figura 9A) (F = 64.1; p < 0.001). A dieta HP e o treinamento
físico levaram a menores quantidades de triglicerídeos intramuscular (p < 0.05). Os animais
treinados apresentaram menores valores de triglicerídeos intramuscular quando comparados
aos animais sedentários submetidos ao mesmo padrão dietético (HC+TRE > HC+SED;
HP+TRE > HP+SED) (p < 0.05). Em contrapartida, a comparação entre animais sedentários
mostrou que a dieta HP levou a menores concentrações de triglicerídeos intramuscular
(HP+SED > HC+SED) (Figura 9C).
 40

Figura 9. Conteúdo de triglicerídeos intramuscular no músculo gastrocnêmio dos animais submetidos à dieta hipercalórica
(HC) e hiperproteica (HP), associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste
ANOVA Two-Way, seguido de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ±
EPM. Efeitos isolados do treinamento (A), efeitos isolados da dieta (B) e análises de subgrupos (C).(ω) Efeito significativo
da dieta, HC ≠ HP, p <0.05; (θ) Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠ HC+TRE,
HP+SED ≠ HP+TRE p< 0.05; (ϕ) HP+SED ≠ HC+SED, p < 0.05.

5.4 Análises no tecido adiposo

5.4.1 Tecido adiposo subcutâneo

Todos os parâmetros morfométricos do TASC foram significativamente influenciados

pela dieta (Figura 10 B, E e H) e pelo treinamento físico (A, D e G). Menores valores de área
dos adipócitos e medidas de diâmetro foram observados nos animais submetidos a dieta HP e
ao treinamento físico (p < 0.05). A análise de subgrupos (Figura 10 C) indicou que a área dos
adipócitos foi estatisticamente menor nos animais submetidos a dieta HC e treinados, quando
comparados aos sedentários submetidos à mesma dieta (HC+SED > HC+TRE). Comparando
os animais sedentários submetidos a diferentes dietas foi possível constatar que a dieta HP
promoveu menor diâmetro dos adipócitos (HC+SED > HP+SED). As fotomicrografias
representativas das análises morfológicas encontram-se na Figura 11.
 41

Figura 10. Análise morfológica do tecido adiposo subcutâneo feita através da mensuração da área (A – C), diâmetro maior
(D – F) e diâmetro menor (G – I) dos adipócitos dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP),
associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido
de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do
treinamento (A,D e G), efeitos isolados da dieta (B, E e H) e análises de subgrupos (C, F e I). (ω) Efeito significativo da
dieta, HC ≠ HP, p <0.05; (θ) Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠ HC+TRE, p<
0.05; (ϕ) HP+SED ≠ HC+SED, HP+TRE ≠ HC+TRE, p < 0.05.
 42

Figura 11. Fotomicrografias representativas das análises morfológicas no tecido adiposo subcutâneo feitas pela coloração
hematoxilina e eosina, obtidas com câmera acoplada em microscópio no aumento de 100x. (A) HC + SED, (B) HP + SED,
(C) HC + TRE e (D) HP + TRE. HC, Dieta hipercalórica; HP, Dieta hiperproteica restrita em carboidratos; TRE,
Treinamento físico; SED, Sedentário. Notar que (A) possui maior área e diâmetro dos adipócitos que (B), (C) e (D).

A análise da capilaridade através da imunomarcação de células CD31+ foi

influenciada pela dieta (Figura 12B) (F = 42.3; p < 0.001) e pelo treinamento físico (Figura
12A) (F = 59.8; p < 0.001). Os animais treinados apresentaram mais células CD31+ quando
comparados aos animais sedentários submetidos ao mesmo padrão dietético (HC+TRE >
HC+SED; HP+TRE > HP+SED) (p < 0.05). Independente da condição de treinamento, a
dieta HP promoveu maior imunomarcação de células CD31+ que os animais submetidos à
dieta HC (HP+TRE > HC+TRE; HP+SED > HC+SED) (Figura 12C). As fotomicrografias
representativas da análise encontram-se na Figura 13.
 43

Figura 12. Avaliação da capilaridade através da quantificação de células CD31+/campo pela técnica de imuno-histoquímica
no tecido adiposo subcutâneo dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP), associada ou não
(SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido de comparações
pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do treinamento (A),
efeitos isolados da dieta (B) e análises de subgrupos (C). (ω) Efeito significativo da dieta, HC ≠ HP, p <0.05; (θ) Efeito
significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HP+SED ≠ HP+TRE, HC+SED ≠ HC+TRE p< 0.05; (ϕ)
HP+SED ≠ HC+SED, HP+TRE ≠ HC+TRE, p < 0.05.

Figura 13. Fotomicrografias representativas das análises de imunomarcação para células CD31+/campo no tecido adiposo
subcutâneo, obtidas com câmera acoplada em microscópio no aumento de 200x. (A) HC + SED, (B) HP + SED, (C) HC +
TRE e (D) HP + TRE. HC, Dieta hipercalórica; HP, Dieta hiperproteica restrita em carboidratos; TRE, Treinamento físico;
SED, Sedentário. Setas pretas indicam as células imunomarcadas CD31+.
 44

5.4.2 Tecido adiposo marrom

A análise dos adipócitos multiloculares (Figura 14) e uniloculares (Figura 15) no

TAM mostrou efeito significativo apenas para o treinamento físico sobre a área desses
adipócitos (Multilocular: F = 4.3, p < 0.05; Unilocular F = 12.8, p < 0.01). Na análise de
subgrupos, a área dos adipócitos uniloculares e o percentual dos adipócitos multiloculares foi
estatisticamente menor no animais treinados e submetidos a dieta HP quando comparados aos
animais treinados e submetidos a dieta HC (p < 0.05), já o percentual de adipócitos
uniloculares foi estatisticamente maior nos animais treinados e submetidos a dieta HP quando
comparados aos animais treinados e submetidos a dieta HC (p < 0.05). As fotomicrografias
representativas das análises morfológicas encontram-se na Figura 16.

Figura 14. Análise morfológica do tecido adiposo marrom feita através da mensuração da área (A – C) e do percentual (D –
F) de adipócitos multiloculares dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP), associada ou não
(SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido de comparações
pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do treinamento (A e D),
efeitos isolados da dieta (B e E) e análises de subgrupos (C e F). (θ) Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p
<0.05. (ϕ) HP+TRE ≠ HC+TRE, p < 0.05.
 45

Figura 15. Análise morfológica do tecido adiposo marrom feita através da mensuração da área (A – C) e do percentual (D –
F) de adipócitos uniloculares dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP), associada ou não
(SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido de comparações
pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do treinamento (A e D),
efeitos isolados da dieta (B e E) e análises de subgrupos (C e F). (θ) Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p
<0.05. (ϕ) HP+TRE ≠ HC+TRE, p < 0.05.

Figura 16. Fotomicrografias representativas das análises morfológicas no tecido adiposo marrom feitas pela coloração
hematoxilina e eosina, obtidas com câmera acoplada em microscópio no aumento de 200x. (A) HC + SED, (B) HP + SED,
(C) HC + TRE e (D) HP + TRE. HC, Dieta hipercalórica; HP, Dieta hiperproteica restrita em carboidratos; TRE,
Treinamento físico; SED, Sedentário.
 46

O percentual de gotículas lipídicas nos adipócitos do TAM (Figura 17) não foi
modificado pela dieta (F = 0.03; p = 0.862) ou pelo treinamento físico (F = 2.7; p = 0.113).

Figura 17. Percentual de gotículas lipídicas/campo no tecido adiposo marrom dos animais submetidos à dieta hipercalórica
(HC) e hiperproteica (HP), associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste
ANOVA Two-Way, seguido de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ±
EPM. Efeitos isolados do treinamento (A), efeitos isolados da dieta (B) e análises de subgrupos (C).

A dosagem de triglicerídeos no tecido adiposo marrom mostrou efeito significativo

tanto da dieta (Figura 18 B) (F = 7.6; p = 0.01), quanto do treinamento (Figura 18 A) (F =
55.2; p < 0.001). A dieta HP e o treinamento físico levaram a menores quantidades de
triglicerídeos neste tecido (p < 0.05). Os animais treinados apresentaram menores valores de
triglicerídeos quando comparados aos animais sedentários submetidos ao mesmo padrão
dietético (HC+TRE < HC+SED; HP+TRE < HP+SED) (p < 0.05). Em contrapartida, a
comparação entre animais sedentários mostrou que a dieta HP levou a menores concentrações
desse parâmetro no tecido adiposo marrom (HP+SED < HC+SED) (Figura 18).
 47

Figura 18. Conteúdo de triglicerídeos no tecido adiposo marrom dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e
hiperproteica (HP), associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA
Two-Way, seguido de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos
isolados do treinamento (A), efeitos isolados da dieta (B) e análises de subgrupos (C). (ω) Efeito significativo da dieta, HC ≠
HP, p <0.05; (θ) Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠ HC+TRE, HP+SED ≠
HP+TRE p< 0.05; (ϕ) HP+SED ≠ HC+SED, p < 0.05.

5.5 Análises da atividade mitocondrial e metabolismo energético

5.5.1 Tecido adiposo branco

A atividade da enzima citrato sintase, marcador de quantidade mitocondrial, foram

significativamente influenciadas pelo treinamento físico em ambos os depósitos adiposos
branco avaliados (TASC: F = 28.2; p < 0.001; TAE: F = 8.8; p < 0.01). O post hoc indicou no
tecido adiposo subcutâneo maiores valores nos animais treinados independentes da dieta
(HC+TRE > HC+SED; HP+TRE > HP+SED). No TAE, apenas os animais do grupo
HP+TRE tiveram atividade da CS significativamente maior quando comparados aos
sedentários submetidos à mesma dieta (HP+TRE > HP+SED) (Figura 19F).
 48

Figura 19. Avaliação da atividade da enzima citrato sintase nos tecidos adiposos subcutâneo (A – C) e epididimal (D – F)
dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP), associada ou não (SED) ao treinamento físico
(TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido de comparações pelo pós-teste de Bonferroni.
Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do treinamento (A e D), efeitos isolados da dieta (B e E)
e análises de subgrupos (C e F). (θ) Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠
HC+TRE, HP+SED ≠ HP+TRE p< 0.05.

A análise da expressão dos genes que codificam as proteínas SIRT 1 e CPT1

evidenciou que a dieta HP (SIRT1: F= 4.9; p < 0.05; CPT1: F = 11.3; p < 0.01) e o
treinamento físico (SIRT1: F=16.3; p < 0.01; CPT1: F=12.6; p < 0.01) influenciaram
significativamente estes parâmetros. Os animais treinados e submetidos à dieta HP
apresentaram maior expressão de CPT1 do que os animais sedentários submetidos à mesma
dieta (HP+TRE > HP+SED) e maior que os animais treinados e submetidos à dieta HC
(HP+TRE > HC+TRE). A expressão gênica de SIRT1 foi significativamente maior entre os
animais treinados e submetidos à dieta HC, quando comparados aos sedentários e submetidos
ao mesmo padrão dietético (p < 0.05). Entre os animais treinados, a expressão gênica de
SIRT1 foi menor nos animais submetidos à dieta HP quando comparados aos animais do
grupo HC+TRE (HC+TRE > HP+TRE).

Já a expressão gênica da CD36 foi influenciada somente pela dieta (F= 15.7; p =
0.001). A análise post hoc revelou que os animais submetidos à dieta HP e treinados
apresentaram maior expressão desse parâmetro comparados aos animais sedentários e
submetidos à mesma dieta (HP+TRE > HP+SED). Entre os animais sedentários, aqueles
 49

submetidos a dieta HP apresentaram expressão significativamente maior da expressão gênica

de CD36 comparada à dieta HC (HP+SED > HC+SED).

Figura 20. Quantificação por qPCR dos mRNAs que codificam as proteínas de resposta metabólica SIRT1 (A – C), CPT1
(D – F) e CD36 no tecido adiposo subcutâneo dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP),
associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido
de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do
treinamento (A, D e G), efeitos isolados da dieta (B, E e H) e análises de subgrupos (C, F e I). (θ) Efeito significativo do
treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠ HC+TRE, HP+SED ≠ HP+TRE p< 0.05. (ϕ) HP+SED ≠ HC+SED,
p < 0.05, HP+TRE ≠ HC+TRE, p < 0.05.

5.5.2. Tecido adiposo marrom

A atividade da enzima citrato sintase (Figura 21 A-C) no TAM foi significativamente

influenciada pelo treinamento físico (F= 58.6; p < 0.001). A análise de subgrupos indicou que
independente da dieta, a atividade da CS dos grupos treinados foi estatisticamente superior à
dos animais sedentários (HP+TRE>HP+SED; HC+TRE>HC+SED). O treinamento físico
 50

também foi determinante para a maior expressão gênica da UCP-1(Figura 21 D-F) (F= 4.8; p
< 0.05).

Figura 21. Avaliação da atividade da enzima citrato sintase (A – C) e quantificação por qPCR dos mRNAs que codificam a
UCP-1 (D – F) no tecido adiposo marrom dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP), associada
ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido de
comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do
treinamento (A e D), efeitos isolados da dieta (B e E) e análises de subgrupos (C e F). (θ) Efeito significativo do treinamento
físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠ HC+TRE, HP+SED ≠ HP+TRE p< 0.05.

5.6 Balanço redox

5.6.1 Tecido adiposo subcutâneo
A concentração de TBARS (Figura 22 A-C) no TASC foi influenciada
significativamente pela dieta (F = 24.3, p < 0.001) e pelo treinamento físico (F = 23.1, p <
0.001). A dieta HP e o treinamento físico promoveram menores valores de TBARS no TASC.
Já a concentração de proteínas carboniladas (Figura 22 D-F) e nitritos totais (Figura 22 G-I)
foram significativamente influenciados apenas pelo treinamento físico (Proteínas
carboniladas: F = 7.8, p = 0.01; Nitritos totais: F= 37.5; p < 0.001), sendo observado
menores valores de proteínas carboniladas e nitritos totais no TASC dos animais treinados
fisicamente (p < 0.05).
 51

Figura 22. Concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico – TBARS (A - C), proteínas carboniladas (D - F) e
nitritos totais (G-I) no tecido adiposo subcutâneo dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP),
associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido
de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do
treinamento (A, D e G), efeitos isolados da dieta (B, E e H) e análises de subgrupos (C, F e I). (θ) Efeito significativo do
treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠ HC+TRE, HP+SED ≠ HP+TRE p< 0.05.

A atividade da enzima GPx (Figura 23 A-C) foi estatisticamente maior nos animais
treinados fisicamente (F = 18.8, p < 0.001). A atividade da enzima SOD (Figura 23 D-F)
sofreu influência da dieta (F = 15.6; p = 0.001) e do treinamento físico (F = 10.0; p < 0.01), a
análise post hoc indicou que entre os animais submetidos à dieta HC, os treinados tiveram
maior atividade da SOD (HC+TRE>HC+SED). Ademais, independente da condição de
treinamento, a dieta HP determinou maior atividade da SOD (HP+SED > HC+SED;
HP+TRE > HC+TRE).

Já a atividade da enzima catalase (Figura 23 G-I) não foi modificada pela dieta (F =
0.3; p > 0.05) ou pelo treinamento físico (F = 1.1; p > 0.05). No entanto, a análise de
subgrupos indicou que houve maior atividade da catalase nos animais submetidos à dieta HP
 52

e ao treinamento físico, em comparação aos animais na mesma condição dietética e

sedentários (HP+TRE > HP+SED).

Figura 23. Atividade das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase - GPx (A - C), superóxido dismutase - SOD (D - F) e
catalase (G-I) no tecido adiposo subcutâneo dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP),
associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido
de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do
treinamento (A, D e G), efeitos isolados da dieta (B, E e H) e análises de subgrupos (C, F e I). (θ) Efeito significativo do
treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠ HC+TRE, HP+SED ≠ HP+TRE p< 0.05; (ϕ) HP+SED ≠ HC+SED,
HP+TRE ≠ HC+TRE p < 0.05.

A figura 24 apresenta um painel da expressão de genes de proteínas citoprotetoras

(Nrf2, Catalase, GPx, SOD1) no TASC. A expressão de todos os genes investigados neste
painel foi significativamente aumentada nos animais submetidos ao treinamento físico (p <
0.05) e apenas a expressão do gene que codifica a GPx1 (Figura 24 G-I) foi
significativamente maior nos animais submetidos a dieta HP (p < 0.05).
 53

Figura 24. Quantificação por qPCR da expressão dos genes das proteínas envolvidas na capacidade antioxidante Nrf2 (A -
C), catalase (D - F), Gpx1 (G-I) e SOD1 (J-L) no tecido adiposo subcutâneo dos animais submetidos à dieta hipercalórica
(HC) e hiperproteica (HP), associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste
ANOVA Two-Way, seguido de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ±
EPM. Efeitos isolados do treinamento (A, D, G e J), efeitos isolados da dieta (B, E, H e K) e análises de subgrupos (C, F, I e
L). (ω) Efeito significativo da dieta, HC ≠ HP, p <0.05; (θ) Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05;
(*) HC+SED ≠ HC+TRE, HP+SED ≠ HP+TRE p< 0.05; (ϕ) HP+SED ≠ HC+SED p < 0.05.

5.6.2. Tecido adiposo epididimal

A análise da concentração de TBARS (Figura 25 A-C) foi influenciada pelo

treinamento físico (F= 8.3; p < 0.01). Com a análise dos subgrupos foi possível constatar que
entre os animais submetidos à dieta HC, aqueles submetidos ao treinamento físico tiveram
 54

menores valores deste parâmetro. As concentrações de nitritos totais (F = 43.3; p < 0.001)
também foram significativamente reduzidas nos animais treinados (Figura 25 G-I). A análise
post hoc da concentração de nitritos evidenciou que independente da composição dietética, o
treinamento físico reduziu este parâmetro (HC+TRE < HC+SED; HP+TRE < HP+SED).
Além disso, entre os animais sedentários, aqueles submetidos à dieta HP tiveram os níveis de
nitritos mais baixos (HP+SED < HC+SED). As concentrações de proteínas carboniladas não
foi influenciada significativamente pela dieta ou pelo treinamento físico (p > 0.05)

Figura 25. Concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico – TBARS (A - C), proteínas carboniladas (D - F) e
nitritos totais (G-I) no tecido adiposo epididimal dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP),
associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido
de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do
treinamento (A, D e G), efeitos isolados da dieta (B, E e H) e análises de subgrupos (C, F e I).(θ) Efeito significativo do
treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠ HC+TRE, HP+SED ≠ HP+TRE p< 0.05; (ϕ) HP+SED ≠ HC+SED
p < 0.05.
 55

A atividade da enzima Gpx (Figura 26 A-C) no TAE foi influenciada pelo treinamento
físico (F = 29.3, p < 0.001). A análise de subgrupos evidenciou que independente da dieta, os
animais treinados apresentaram maior atividade da GPx (HP+TRE>HP+SED;
HC+TRE>HC+SED). A atividade das enzimas superóxido dismutase e catalase não sofreram
influência das intervenções estudadas (Figura 26 D-F e G-I, respectivamente).

Figura 26. Atividade das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase - GPx (A - C), superóxido dismutase - SOD (D - F) e
catalase (G-I) no tecido adiposo epididimal dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP),
associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido
de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do
treinamento (A, D e G), efeitos isolados da dieta (B, E e H) e análises de subgrupos (C, F e I). (θ) Efeito significativo do
treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠ HC+TRE, HP+SED ≠ HP+TRE p< 0.05.

5.6.3 Tecido adiposo marrom

As concentrações de TBARS e proteínas carboniladas no TAM não foram

influenciadas pela intervenção dietética ou pelo treinamento físico (Figura 27 A-C e D-F,
 56

respectivamente). A concentração de nitritos (Figura 27 G-I) foi estatisticamente menor nos

animais treinados (F = 7.4, p < 0.01), o post hoc evidenciou que entre os animais submetidos
à dieta HP, o grupo treinado teve uma menor concentração de nitritos totais
(HP+TRE<HP+SED).

Figura 27. Concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico – TBARS (A - C), proteínas carboniladas (D - F) e
nitritos totais (G-I) no tecido adiposo marrom dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP),
associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido
de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do
treinamento (A, D e G), efeitos isolados da dieta (B, E e H) e análises de subgrupos (C, F e I). (θ) Efeito significativo do
treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HP+SED ≠ HP+TRE p< 0.05.

As atividades das enzimas antioxidantes GPx (F = 52.7, p < 0.001), SOD (F = 29.3, p
< 0.001) e catalase (F = 41.6, p < 0.001) no TAM foi significativamente aumentada nos
animais submetidos ao treinamento físico (Figura 28 A, D e G) (p < 0.05) e apenas a
 57

atividade da catalase (Figura 28H) foi significativamente maior nos animais submetidos a
dieta HP (p < 0.05).

Figura 28. Atividade das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase - GPx (A - C), superóxido dismutase - SOD (D - F) e
catalase (G-I) no tecido adiposo marrom dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP), associada
ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido de
comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do
treinamento (A, D e G), efeitos isolados da dieta (B, E e H) e análises de subgrupos (C, F e I). (ω) Efeito significativo da
dieta, HC ≠ HP, p <0.05; (θ) Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠ HC+TRE,
HP+SED ≠ HP+TRE p< 0.05.

A expressão de todos os genes de resposta antioxidante (GPx1: F = 4.4, p < 0.05;

SOD-1: F = 12.7, p < 0.01; Catalase: F = 10.7, p < 0.01) investigados no TAM foi
significativamente aumentada nos animais submetidos ao treinamento físico (p < 0.05)
(Figura 29 A, D e G). A análise de subgrupos demonstra que para a expressão de SOD
(Figura 29F) independe do tipo de dieta, pois o treinamento físico foi quem determinou o
 58

aumento significativo deste parâmetro (HC+TRE>HC+SED; HP+TRE>HP+SED). Ademais,

os animais submetidos à dieta HP e treinados tiveram a expressão da catalase aumentada,
comparando-se aos animais sedentários e com a mesma dieta (HP+TRE>HP+SED) (Figura
29I).

Figura 29. Quantificação por qPCR da expressão de mRNAs que codificam as proteínas de resposta antioxidante GPx-1 (A
- C), SOD-1 (D - F) e catalase (G-I) no tecido adiposo marrom dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e
hiperproteica (HP), associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA
Two-Way, seguido de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos
isolados do treinamento (A, D e G), efeitos isolados da dieta (B, E e H) e análises de subgrupos (C, F e I). (θ) Efeito
significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠ HC+TRE, HP+SED ≠ HP+TRE p< 0.05.

5.7 Perfil inflamatório

As figuras 30 – 32 apresentam um painel de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α,

IL1β, IL-6) e anti-inflamatória (IL-10) e a razão TNF-α/IL-10 dos depósitos de tecido
adiposo subcutâneo (Figura 30), epididimal (Figura 31) e marrom (Figura 32). A análise das
 59

citocinas pró e anti-inflamatórias no TASC (Figura 30) indicou que a concentração da

citocina pró inflamatória IL1β foi influenciada significativamente pelo padrão dietético (F =
6.9, p < 0.05), sendo significativamente menor animais submetidos a dieta HP (p < 0.05)
(Figura 30E). Já a citocina pró-inflamatória IL-6 foi influenciada significativamente pelo
padrão treinamento físico (Figura 30G) (F = 10.1, p < 0.01), enquanto a citocina pró
inflamatória TNF-α foi influenciada por ambas as intervenções (dieta: F = 13.6, p = 0.001;
treinamento: F = 39.5, p < 0.001) (Figura 30 A-B). A análise post hoc (Figura 30C) indicou
menores concentrações de TNF-α entre os treinados, independente do padrão dietético
(HC+TRE < HC+SED; HP+TRE < HP+SED), enquanto apenas entre os animais submetidos
a dieta HC houve diferença entre treinados e sedentários (HC+TRE < HC+SED).

A concentração da citocina antiinflamatória IL-10 foi significativamente influenciado

apenas pelo treinamento físico (Figura 30J) (F = 46.4, p < 0.001), enquanto a razão
TNF-α/IL-10, foi significativamente influenciada tanto pela dieta (F = 10.4, p < 0.001)
quanto pelo treinamento físico (F = 84.3, p < 0.001) (Figura 30 M-N). A análise post hoc
indicou menores valores entre os treinados, independente do padrão dietético (HC+TRE <
HC+SED; HP+TRE < HP+SED), enquanto apenas entre os animais submetidos a dieta HC
houve diferença entre treinados e sedentários (HC+TRE < HC+SED) (Figura O).
 60

Figura 30. Expressão das citocinas TNF-α (A – C), IL1-β (D – F), IL-6 (G - I), IL-10 (J – L) e razão TNF-α/IL-10 (M - O)
do tecido adiposo subcutâneo dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP), associada ou não
(SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido de comparações
pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do treinamento (A, D, G, J
e M), efeitos isolados da dieta (B, E, H, K e N) e análises de subgrupos (C, F, I, L e O). (ω) Efeito significativo da dieta, HC
≠ HP, p <0.05; (θ) Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠ HC+TRE, HP+SED ≠
HP+TRE p< 0.05; (ϕ) HP+SED ≠ HC+SED, p < 0.05.

A mesma análise no TAE mostrou perfil diferente do observado no TASC no que se

refere à citocina IL-1β que não mostrou influência significativa de nenhuma das intervenções
propostas neste estudo (p > 0.05) (Figura 31 D-F). Já a concentração da IL-6, assim como
 61

observado no TASC, também foi influenciada significativamente pelo treinamento físico (F =

10.1, p < 0.01) (Figura 31G). Da mesma forma, a citocina pró inflamatória TNF-α foi
influenciada por ambas as intervenções (dieta: F = 15.1, p < 0.001; treinamento: F = 62.0, p <
0.001) (Figura 31 A-B). A análise post hoc (Figura 31C) indicou menores concentrações de
TNF-α entre os treinados, independente do padrão dietético (HC+TRE < HC+SED; HP+TRE
< HP+SED), enquanto apenas entre os animais submetidos a dieta HC houve diferença entre
treinados e sedentários (HC+TRE < HC+SED).

A concentração da citocina anti-inflamatória IL-10 também foi significativamente

influenciado apenas pelo treinamento físico (Figura 31I) (F = 48.1, p < 0.001), enquanto a
razão TNF-α/IL-10 foi significativamente influenciada tanto pela dieta (F = 17.6, p < 0.001),
quanto pelo treinamento físico (F = 164.5, p < 0.001) (Figura 31 M-N). A análise post hoc
indicou menores valores entre os treinados, independente do padrão dietético (HC+TRE <
HC+SED; HP+TRE < HP+SED), enquanto apenas entre os animais submetidos a dieta HC
houve diferença entre treinados e sedentários (HC+TRE < HC+SED) (Figura 31O)
 62

Figura 31. Expressão das citocinas TNF-α (A – C), IL1-β (D – F), IL-6 (G - I), IL-10 (J – L) e razão TNF-α/IL-10 (M - O)
do tecido adiposo epididimal dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP), associada ou não
(SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido de comparações
pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do treinamento (A, D, G, J
e M), efeitos isolados da dieta (B, E, H, K e N) e análises de subgrupos (C, F, I, L e O). (ω) Efeito significativo da dieta, HC
≠ HP, p <0.05; (θ) Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠ HC+TRE, HP+SED ≠
HP+TRE p< 0.05; (ϕ) HP+SED ≠ HC+SED, p < 0.05.

Da mesma forma que observado no TASC, a análise da concentração da citocina

pró-inflamatória IL-1β no TAM foi influenciada pelo padrão dietético (Figura 32E) (F = 6.7,
p < 0.05), sendo estatisticamente menor nos animais submetidos à dieta HP (p < 0.05). Foi
 63

observado nos outros depósitos de tecido adiposo, que a concentração da IL-6 (Figura 32G)
também foi influenciada significativamente pelo treinamento físico (F = 20.4, p < 0.001), e a
concentração da citocina TNF-α foi influenciada por ambas as intervenções (Figura 32 A-B)
(dieta: F = 17.5, p < 0.001; treinamento: F = 50.6, p < 0.001), a análise post hoc (Figura 32C)
seguiu o mesmo padrão dos demais depósitos de tecido adiposo estudados.

Em contrapartida, a concentração da citocina anti-inflamatória IL-10 divergiu dos

demais depósitos de tecido adiposo, não sendo observada influência significativa da dieta ou
treinamento físico (p > 0.05) (Figura 32 J-L). No entanto, a razão TNF-α/IL-10 foi
significativamente influenciada tanto pela dieta (Figura 32N) (F = 7.6, p < 0.01) quanto pelo
treinamento físico (Figura 32M) (F = 31.3, p < 0.001), sendo observado na análise post hoc o
mesmo padrão dos demais depósitos de tecido adiposo estudados (Figura 32O).
 64

Figura 32. Expressão das citocinas TNF-α (A – C), IL1-β (D – F), IL-6 (G - I), IL-10 (J – L) e razão TNF-α/IL-10 (M - O)
do tecido adiposo marrom dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP), associada ou não (SED)
ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido de comparações pelo
pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do treinamento (A, D, G, J e
M), efeitos isolados da dieta (B, E, H, K e N) e análises de subgrupos (C, F, I, L e O). (ω) Efeito significativo da dieta, HC ≠
HP, p <0.05; (θ) Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠ HC+TRE, HP+SED ≠
HP+TRE p< 0.05; (ϕ) HP+SED ≠ HC+SED, p < 0.05.

A figura 33 apresenta um painel da expressão de genes de citocinas pró-inflamatórias

(TNF-α e IL-6) e anti-inflamatória (IL-10) e a razão TNF-α/IL-10 no TASC. O gene que
codifica o TNF-α foi significativamente reprimido nos animais submetidos ao treinamento
 65

físico (Figura 33 A) (F = 12.6, p < 0.01), independentemente da dieta aplicada, enquanto a

expressão do gene que codifica a IL-6 foi significativamente reprimida nos animais
submetidos ao treinamento físico (Figura 33 D) ( F = 54.0, p < 0.001) e à dieta HP (Figura
33E) (F = 13.9, p = 0.001).

Em contrapartida, a expressão do gene que codifica a IL-10 aumentou

significativamente nos animais treinados (Figura 33 G) ( F = 113.8, p < 0.001),
independentemente da dieta aplicada. A razão da expressão dos genes do TNF-α/IL-10 no
TASC mostrou influência significativa da dieta (Figura 33L) ( F = 5.9, p < 0.03) e do
treinamento físico (Figura 33 J) (F = 95.6, p < 0.001).
 66

Figura 33. Quantificação por qPCR da expressão dos mRNAs que codificam as proteínas da resposta inflamatória (TNF-α,
IL-6 e IL-10) de tecido adiposo subcutâneo dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP),
associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido
de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do
treinamento (A, D, G e J), efeitos isolados da dieta (B, E, H e K) e análises de subgrupos (C, F, I e L). (ω) Efeito
significativo da dieta, HC ≠ HP, p <0.05; (θ) Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠
HC+TRE, p< 0.05; (ϕ) HP+SED ≠ HC+SED, p < 0.05.

A expressão do gene que codifica a IL-27 foi significativamente aumentada nos

animais submetidos ao treinamento físico (Figura 34 A) (F = 103.2, p < 0.001),
independentemente da dieta aplicada. A expressão do gene que codifica a síntese da
adiponectina foi influenciada significativamente pela dieta (Figura 34E) (F = 24.2, p < 0.001)
e pelo treinamento físico (Figura 34D) (F = 5.9; p < 0.05). A análise post hoc (Figura 34F)
indicou que maior expressão de adiponectina no TASC dos animais submetidos a dieta HP,
independentemente se foram treinados ou se mantiveram sedentários (p < 0.05).
 67

Adicionalmente, apenas entre os animais que receberam dieta HC houve diferença

significativa entre treinados e sedentários, com maior expressão deste gene entre os animais
do grupo HC+TRE (p < 0.05).

Figura 34. Quantificação por qPCR da expressão dos mRNAs que codificam as proteínas da resposta inflamatória (IL-27 e
adiponectina) de tecido adiposo subcutâneo dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP),
associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido
de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do
treinamento (A e D), efeitos isolados da dieta (B e E) e análises de subgrupos (C e F). (ω) Efeito significativo da dieta, HC ≠
HP, p <0.05; (θ) Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠ HC+TRE, p< 0.05; (ϕ)
HP+SED ≠ HC+SED, HP+TRE ≠ HC+TRE, p < 0.05.

A imunomarcação de NF-κB no TASC foi reduzida pelo treinamento físico (Figura

35A) (F = 10.8, p < 0.01) e pela dieta (Figura 35B) (F = 8.0, p < 0.01) O post hoc (Figura
35C) evidencia que entre os animais que receberam a dieta HC, os treinados tiveram menor
porcentagem de área marcada/campo de NF-κB. Além disso, os animais sedentários que
receberam dieta HP apresentaram menor imunomarcação do NF-κB do que aqueles que
receberam dieta HC na mesma condição de treinamento.

Esse mesmo parâmetro foi avaliado no TAM (Figura 35D) e apenas o treinamento
físico determinou redução significativa (Figura 35D) (F = 67.3, p < 0.001). A análise de
subgrupos (Figura 35F) destacou que independente da dieta realizada pelos animais, o
treinamento físico determinou a redução desse parâmetro (HP+TRE<HP+SED;
HC+TRE<HC+SED). Ademais, os animais submetidos à dieta HP e sedentários
 68

apresentaram redução da marcação de NF-κB comparados aos submetidos à dieta HC na

mesma condição de treinamento (HP+SED<HC+SED). Entre os animais treinados, aqueles
que receberam dieta HP apresentaram maior área de imunomarcação de NF-κB
(HP+TRE>HC+TRE) (p < 0.05).

Figura 35. Avaliação da % de área marcada por de NF-κB p65/campo pela técnica de imuno-histoquímica no tecido adiposo
subcutâneo (A-C) e marrom (D-F) dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP), associada ou não
(SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido de comparações
pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do treinamento (A e D),
efeitos isolados da dieta (B e E) e análises de subgrupos (C e F). (ω) Efeito significativo da dieta, HC ≠ HP, p <0.05; (θ)
Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HP+SED ≠ HP+TRE, HC+SED ≠ HC+TRE p< 0.05; (ϕ)
HP+SED ≠ HC+SED, HP+TRE ≠ HC+TRE, p < 0.05.

As fotomicrografias representativas da imunomarcação de NF-κB nos TASC e TAM

encontram-se nas figuras 36 e 37, respectivamente.
 69

Figura 36. Fotomicrografias representativas da análise de imunomarcação para NF-κB no tecido adiposo subcutâneo,
obtidas com câmera acoplada em microscópio no aumento de 200x. (A) Animais obesos submetidos à dieta hipercalórica e
sedentários, (B) Animais obesos submetidos à dieta hiperproteica, (C) Animais obesos submetidos à dieta hipercalórica e ao
treinamento físico, (D) Animais obesos submetidos à dieta hiperproteica e ao treinamento físico. HC, Dieta hipercalórica;
HP, Dieta hiperproteica; TRE, Treinamento físico; SED, Sedentário. Setas pretas indicam áreas imunomarcadas.

Figura 37. Fotomicrografias representativas da análise de imunomarcação de NF-κB no tecido adiposo marrom, obtidas
com câmera acoplada em microscópio no aumento de 200x. (A) Animais obesos submetidos à dieta hipercalórica e
sedentários, (B) Animais obesos submetidos à dieta hiperproteica, (C) Animais obesos submetidos à dieta hipercalórica e ao
treinamento físico, (D) Animais obesos submetidos à dieta hiperproteica e ao treinamento físico. HC, Dieta hipercalórica;
HP, Dieta hiperproteica; TRE, Treinamento físico; SED, Sedentário. Setas pretas indicam áreas imunomarcadas.
 70

A imunomarcação para MCP-1 foi reduzida pelo treinamento físico (Figura 38A) (F =
250.9, p < 0.001) e pela dieta (Figura 38B) (F = 4.5, p < 0.05). O post hoc (Figura 38C)
indicou que independente da composição dietética, os animais treinados apresentaram menor
área marcada/campo por MCP-1 (HC+TRE<HC+SED; HP+TRE<HP+SED). Entre os
animais sedentários, aqueles submetidos à dieta HP apresentaram menor imunomarcação para
este parâmetro (HP+SED<HC+SED). As fotomicrografias representativas estão na figura 39.

Figura 38. Quantificação da % de área marcada por MCP-1/campo pela técnica de imuno-histoquímica no tecido adiposo
subcutâneo dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP), associada ou não (SED) ao treinamento
físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido de comparações pelo pós-teste de
Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do treinamento (A), efeitos isolados da
dieta (B) e análises de subgrupos (C). (ω) Efeito significativo da dieta, HC ≠ HP, p <0.05; (θ) Efeito significativo do
treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HP+SED ≠ HP+TRE, HC+SED ≠ HC+TRE p< 0.05; (ϕ) HP+SED ≠
HC+SED, p < 0.05.

Figura 39. Fotomicrografias representativas da análise de imunomarcação de MCP-1 no tecido adiposo subcutâneo, obtidas
com câmera acoplada em microscópio no aumento de 200x. (A) Animais obesos submetidos à dieta hipercalórica e
sedentários, (B) Animais obesos submetidos à dieta hiperproteica e sedentários, (C) Animais obesos submetidos à dieta
hipercalórica e ao treinamento físico, (D) Animais obesos submetidos à dieta hiperproteica e ao treinamento físico. HC,
Dieta hipercalórica; HP, Dieta hiperproteica; TRE, Treinamento físico; SED, Sedentário. Setas pretas indicam áreas
imunomarcadas.
 71

A contagem de macrófagos totais (Figura 40 A-C) e de linfócitos (Figura 40 J-L) no

TASC mostrou efeito significativo do treinamento físico (Macrófagos: F = 106.6, p < 0.001;
Linfócitos: F = 87.2, p < 0.001), enquanto a contagem de macrófagos M2 (Figura 40 D-F)
mostrou efeito significativo da dieta (F = 12.8, p < 0.01). A razão macrófagos totais/M2
mostrou efeito significativo do treinamento físico (F = 29.8, p < 0.001) e da dieta (F = 5.5, p
< 0.03). As fotomicrografias representativas das análises acima se encontram nas figuras 41 e
42.
 72

Figura 40. Contagem de macrófagos CD68 (A – C), macrófagos M2 (D – F), razão macrófagos M1/M2 (G – I) e contagem
de linfócitos CD43 em tecido adiposo subcutâneo dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e hiperproteica (HP),
associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA Two-Way, seguido
de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos isolados do
treinamento (A, D, G e J), efeitos isolados da dieta (B, E, H e K) e análises de subgrupos (C, F, I e L). (ω) Efeito
significativo da dieta, HC ≠ HP, p <0.05; (θ) Efeito significativo do treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠
HC+TRE, HP+SED ≠ HP+TRE p< 0.05; (ϕ) HP+SED ≠ HC+SED, p < 0.05; (ϕ) HP+SED ≠ HC+SED, p < 0.05.
 73

Figura 41. Fotomicrografias representativas da análise de imunomarcação de macrófagos totais (CD68+) (A-B) e
macrófagos M2 (CD206+) (C-D) no tecido adiposo subcutâneo, obtidas com câmera acoplada em microscópio no aumento
de 100x e 200x (A) Marcação para CD68+ no aumento de 100x, (B) Marcação para CD68+ no aumento de 200x (C)
Marcação para CD206+ no aumento de 200x, (D) Marcação para CD68+ no aumento de 200x. HC, Dieta hipercalórica; HP,
Dieta hiperproteica. Setas pretas indicam as células imunomarcadas para CD68+ (A e B) e CD206+ (C e D).

Figura 42. Fotomicrografias representativas da análise de imunomarcação de linfócitos no tecido adiposo subcutâneo,
obtidas com câmera acoplada em microscópio no aumento de 200x. (A) Animais obesos submetidos à dieta hipercalórica e
sedentários, (B) Animais obesos submetidos à dieta hiperproteica e sedentários, (C) Animais obesos submetidos à dieta
hipercalórica e ao treinamento físico, (D) Animais obesos submetidos à dieta hiperproteica e ao treinamento físico. HC,
Dieta hipercalórica; HP, Dieta hiperproteica; TRE, Treinamento físico; SED, Sedentário. Setas pretas indicam as células
imunomarcadas para CD31+. Setas pretas indicam as células imunomarcadas para CD43+.
 74

A contagem de estruturas crown-like no TASC mostrou efeito significativo apenas do

treinamento físico (Figura 43A) (F = 23.1, p < 0.001). Os animais treinados,
independentemente do padrão dietético ao qual foram submetidos, apresentaram menor
proporção de estruturas crown-like (p < 0.05) (Figura 43C).

Figura 43. Número de estruturas crown-like/campo (A-C) e fotomicrografia representativa da estrutura crown-like nos
aumentos de 100x e 200x (D-E) avaliados no tecido adiposo subcutâneo dos animais submetidos à dieta hipercalórica (HC) e
hiperproteica (HP), associada ou não (SED) ao treinamento físico (TRE). As análises foram feitas através do teste ANOVA
Two-Way, seguido de comparações pelo pós-teste de Bonferroni. Os resultados foram expressos como média ± EPM. Efeitos
isolados do treinamento (A), efeitos isolados da dieta (B) e análises de subgrupos (C). (θ) Efeito significativo do
treinamento físico, SED ≠ TRE, p <0.05; (*) HC+SED ≠ HC+TRE, HP+SED ≠ HP+TRE p< 0.05. Setas pretas indicam as
células imunomarcadas para CD68+ em forma de crown-like.
 75

5.8. Resumo dos resultados

Tabela 10. Resumo dos resultados obtidos no estudo estratificados pelos efeitos principais da
dieta ou treinamento sobre os parâmetros avaliados.
Tópico Parâmetro Efeito da Dieta Efeito do
treinamento

Peso corporal ↓ ↓

Composição TAV ↓ ↓
corporal
Peso do TASC, TAE, ↓ ↓
TAR, TAM e TAME

Peso do gastrocnêmio ↑ ↑

Irisina sérica ↔ ↑
Modulação da
irisina IHQ de FNDC5 no ↑ ↑
gastrocnêmio

Área das fibras ↑ ↑

musculares
Músculo
Número de mionúcleos ↑ ↔

Triglicerídeos ↓ ↓

Área dos adipócitos ↓ ↓

(TASC)

Diâmetro menor dos ↓ ↓

adipócitos (TASC)
Análises no
TASC Diâmetro maior dos ↓ ↓
adipócitos (TASC)

IHQ de capilaridade ↑ ↑
CD-31 (TASC)

Área dos adipócitos ↔ ↓

multiloculares (multi)

% de adipócitos multi ↔ ↔

Análises no TAM Área dos adipócitos ↔ ↓

uniloculares (uni)

% de adipócitos uni ↔ ↔

% de área das gotículas ↔ ↔

 76

lipídicas

Triglicerídeos ↓ ↓

Atividade da CS ↔ ↑
(TASC)

qPCR CD36 (TASC) ↑ ↔

Atividade
mitocondrial e qPCR SIRT1 (TASC) ↓ ↑
metabolismo
qPCR CPT1 (TASC) ↑ ↑
energético
Atividade da CS (TAE) ↔ ↑

Atividade da CS ↔ ↑
(TAM)

qPCR UCP-1 (TAM) ↔ ↑

TBARS (TASC) ↓ ↓

PTNS carboniladas ↔ ↓
(TASC)

Nitritos (TASC) ↔ ↓

Atividade CAT ↔ ↔
(TASC)

Atividade SOD ↑ ↑
(TASC)

Atividade GPx (TASC) ↔ ↑

qPCR Nrf2 (TASC) ↔ ↑

Balanço redox
qPCR CAT (TASC) ↔ ↑

qPCR GPx (TASC) ↑ ↑

TBARS (TAE) ↔ ↓

PTNS carboniladas ↔ ↓
(TAE)

Nitritos (TAE) ↔ ↓

Atividade CAT (TAE) ↔ ↔

Atividade SOD (TAE) ↔ ↔

Atividade GPx (TAE) ↔ ↑

 77

TBARS (TAM) ↔ ↔

PTNS carboniladas ↔ ↔
(TAM)

Nitritos (TAM) ↔ ↓

Atividade CAT (TAM) ↓ ↑

Atividade SOD (TAM) ↔ ↑

Atividade GPx (TAM) ↔ ↑

qPCR SOD (TAM) ↔ ↑

qPCR CAT (TAM) ↔ ↑

qPCR GPx (TAM) ↔ ↑

ELISA TNF-α (TASC) ↓ ↓

ELISA IL-6 (TASC) ↔ ↓

ELISA IL-10 (TASC) ↔ ↑

ELISA IL-1β (TASC) ↓ ↔

Razão TNF-α/IL-10 ↓ ↓
(TASC)

qPCR TNF-α (TASC) ↔ ↓

qPCR IL-6 (TASC) ↓ ↓

qPCR IL-10 (TASC) ↔ ↑

Razão qPCR ↓ ↓
TNF-α/IL-10 (TASC)
Inflamação
qPCR IL-27 (TASC) ↔ ↑

qPCR adiponectina ↑ ↑
(TASC)

IHQ NF-kB (TASC) ↓ ↓

IHQ MCP-1 (TASC) ↓ ↓

IHQ macrófagos ↔ ↓
(TASC)

IHQ macrófagos M2 ↑ ↔
(TASC)
 78

IHQ linfócitos (TASC) ↔ ↓

Razão macrófagos ↓ ↓
totais/M2 (TASC)

Crown-like (TASC) ↔ ↓

ELISA TNF-α (TAE) ↓ ↓

ELISA IL-6 (TAE) ↔ ↔

ELISA IL-10 (TAE) ↔ ↑

ELISA IL-1β (TAE) ↔ ↓

Razão TNF-α/IL-10 ↓ ↓
(TAE)

ELISA TNF-α (TAM) ↓ ↓

ELISA IL-6 (TAM) ↔ ↓

ELISA IL-10 (TAM) ↔ ↔

ELISA IL-1β (TAM) ↓ ↔

Razão TNF-α/IL-10 ↓ ↓
(TAM)

IHQ NF-kB (TAM) ↔ ↓

TASC, Tecido adiposo subcutâneo; TAR, Tecido adiposo retroperitoneal; TAE, Tecido adiposo epididimal;
TAME, Tecido adiposo mesentérico, TAV, Tecido adiposo visceral; TAM, Tecido adiposo marrom; IHQ,
Imuno-histoquímica; CS, Citrato sintase; qPCR, Reação em cadeia da polimerase em tempo real; CAT,
Catalase, GPx, Glutationa peroxidase; SOD, superóxido dismutase; PTNs, Proteínas; ↑, aumento do parâmetro
avaliado; ↓, redução do parâmetro avaliado; ↔, ausência de efeito no parâmetro avaliado.
 79

6. DISCUSSÃO

O presente estudo objetivou avaliar os efeitos de 12 semanas de treinamento físico de

moderada intensidade (TRE) e da dieta hiperproteica restrita em carboidratos (HP) sobre a
modulação da irisina e dos parâmetros morfofuncionais do tecido adiposo em animais com
obesidade induzida por dieta. Nossos resultados mostram que a intervenção dietética (i.e.,
dieta hiperproteica restrita em carboidrato) e/ou de treinamento físico aeróbico promoveram
efeitos benéficos sobre a composição corporal, concentração sérica e tecidual de
irisina/FNDC5, morfologia dos tecidos muscular e adiposo, parâmetros inflamatórios e de
balanço redox dos depósitos de tecido adiposo, assim como, sobre marcadores de função
tecidual. O efeito do treinamento físico isolado determinou, na maioria dos resultados
apresentados, melhores resultados em se contrapor às alterações do balanço redox, perfil
inflamatório e atividade mitocondrial dos tecidos adiposos branco e marrom.

O modelo de obesidade induzida por dieta induzida por 8 semanas do presente estudo
foi validado em trabalhos prévios do nosso grupo de pesquisa (Santos Filho, 2022;
Bittencourt, 2022). Esses dados iniciais determinam nosso ponto de partida e estão
diretamente relacionados aos resultados posteriores nesse mesmo grupo obeso. Após 12
semanas do tratamento com a dieta HP e/ou com o treinamento físico observou-se redução do
peso corporal e dos depósitos dos tecidos adiposos subcutâneo abdominal e viscerais.

A associação do treinamento físico com a dieta HP determinou redução mais

significativa do peso corporal do que a dieta isoladamente. Já é bem estabelecido que o
exercício físico crônico é uma importante ferramenta terapêutica para a obesidade devido às
mudanças metabólicas promovidas pelo aumento do gasto energético (Vidal e Stanford,
2020). A atividade adrenérgica induzida pelo exercício físico aumenta a mobilização dos
ácidos graxos armazenados no tecido adiposo devido ao aumento da síntese e da atividade de
enzimas como a lipase de triacilglicerol do adipócito (ATGL) (Tsiloulis e Watt, 2015). A
combinação do treinamento aeróbico com a dieta HP mostrou-se mais eficaz na redução da
massa corporal.

A perda de peso induzida pela dieta hiperproteica restrita em carboidratos pode ser
explicada pela saciedade, determinada por mecanismos relacionados aos hormônios da
saciedade Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1) e PYY secretados pelo intestino (Belza et al.,
2013; Leidy et al., 2015) e também pela termogênese promovidas pela alta concentração de
 80

proteínas na dieta (Astrup et al., 2015; Macdiarmid e Blundell, 1997). O efeito térmico das
proteínas requer de 20 a 30% da energia utilizável para o próprio metabolismo ou
armazenamento (Leidy et al., 2015). Ademais, a restrição de carboidratos corrobora com a
mobilização de outras fontes de energia para suprir as necessidades de glicose plasmática,
sobretudo para o sistema nervoso central, contribuindo para redução do peso corporal e
depósitos de gordura (Papadopoulou e Nikolaidis, 2023).

Estudos prévios possuem resultados divergentes, Almeida e colaboradores (2020)

observaram que após 6 semanas de dieta hiperproteica (35% do total de energia provenientes
de proteínas/ 3,8 kcal/g de ração) associada ou não ao treinamento resistido de subida em
escada (princípio da sobrecarga de peso, realizado 3 vezes na semana) não foi capaz de
modificar o peso corporal dos ratos comparado aqueles que receberam dieta controle. No
entanto, nesse mesmo estudo, foi possível observar o impacto da dieta hiperproteica sobre a
composição corporal ao reduzir o índice de adiposidade e o tecido adiposo epididimal dos
animais. As divergências entre o nosso resultado do peso corporal com o estudo apresentado
podem estar relacionados com o tempo de intervenção, visto que o tempo de intervenção foi
de 12 semanas, além da diferença da colaboração do percentual protéico da dieta.
Adicionalmente, no que tange ao efeito do treinamento físico, a modalidade de treinamento
também pode ter sido um fator determinante na divergência dos resultados do peso corporal.

Dentro deste contexto, Medeiros e colaboradores (2021) observaram que 12 semanas

de dieta hiperproteica (26,1% do total de energia provenientes de proteínas) não promoveu
mudança no peso corporal, no entanto, quando a dieta foi associada ao treinamento resistido
de subida de escada (princípio da sobrecarga de peso, realizado 3 vezes na semana) houve
redução desse parâmetro. Além disso, maiores pesos do tecido adiposo total e do depósito
epididimal foram observados no grupo sedentário submetido à dieta hiperproteica. Apesar do
mesmo período de intervenção, é importante ressaltar que tais diferenças com o nossos
resultados podem ser relacionadas aos fatores como as características da dieta hiperproteica,
visto que aplicamos uma dieta cujo conteúdo proteico correspondeu a 65,1% do total
energético obtido pela alimentação, além da diferença no modelo de exercício físico aplicado
durante o treinamento físico.

A redução do peso do TAM diante do treinamento físico ou da dieta HP isoladamente

pode ser atribuída à proteção que conferiram ao metabolismo tecidual, visto que esse é
prejudicado em animais obesos, o que corrobora com o acúmulo de substratos energéticos em
 81

um contexto obesogênico (Villarroya et al., 2018). A dosagem dos triglicerídeos nesse tecido
respalda esse dado, pois as intervenções, dieta HP ou treinamento físico, determinaram
menores valores de triglicerídeos teciduais no TAM. Além disso, o metabolismo do TAM está
estreitamente ligado a outros tecidos, a menor deposição nos depósitos de TAB,
proporcionadas por ambas intervenções, e menor circulação de ácidos graxos livres nesses
grupos, consequentemente impactou na menor deposição no TAM (Wang et al., 2021).

O treinamento físico e dieta HP do presente estudo também foram capazes de proteger

o peso do músculo gastrocnêmio, diferente dos animais obesos sedentários e com a dieta
hipercalórica que apresentaram menor peso desse tecido. Sabe-se que o treinamento físico,
mesmo aeróbico, contribui com a manutenção e aumento da massa muscular (França, 2020)
por proporcionar um equilíbrio proteico muscular positivo (síntese > degradação) ao ativar
vias de sinalização intracelulares e expressão de proteínas importantes para o metabolismo
das proteínas do músculo esquelético (Konopka e Harber, 2014). Ademais, a composição
dietética também tem papel crucial na síntese proteica, em especial, a ingestão de proteínas e
disponibilidade de aminoácidos que contribuem para balanço líquido de proteína muscular
positivo, permitindo maior preservação da massa muscular (Tipton, 2011; Carbone e
Pasiakos, 2019).

No presente estudo, o treinamento físico aeróbico determinou aumento significativo

da irisina sérica e da imunomarcação do precursor da irisina (FNDC5) no músculo
gastrocnêmio. Além disso, a associação do treinamento físico com a dieta HP determinou
maior imunomarcação de FNDC5 no músculo gastrocnêmio comparado ao grupo HC + TRE
e HP+SED. Tais achados reforçam o papel endócrino do músculo esquelético ao promover a
secreção de miocinas que atuam em outros órgãos. A contração muscular realizada durante o
exercício físico, em especial por ser realizado de forma crônica, é a responsável pelo aumento
da irisina circulante e do seu precursor no tecido muscular, sendo este o responsável pela
maior parte (~ 72%) dos níveis circulantes dessa miocina (Norheim et al., 2013; Roca-Rivada
et al., 2013).

A disponibilidade de proteínas e massa muscular também podem estar relacionadas

positivamente com a expressão de FNDC5, como visto no resultado do presente estudo e
como apontado por Macêdo e colaboradores (2017), enquanto a composição corporal e
concentração da irisina circulante estão diretamente relacionadas. Foi previamente relatado a
relação entre a irisina e metabolismo energético, como costatado por Xiong et al (2015) onde
 82

a superexpressão de FNDC5 ou perfusão subcutânea de irisina foi responsável por aumentar

o gasto energético, melhorou os distúrbios metabólicos de glicose e lipídios e atenuou a
resistência insulínica em camundongos obesos por dieta hiperlipídica. Outro estudo in vitro
observou que a irisina melhorou a lipólise dos adipócitos através da regulação positiva das
lipases HSL e ATGL (Gao et al., 2016).

Poucos estudos exploraram o efeito de intervenções dietéticas sobre os níveis de

irisina, dentre eles, Li e colaboradores (2022) observaram que o exercício físico e/ou restrição
de 30% do consumo de uma dieta hiperlipídica foram capazes de aumentar a concentração
sérica de irisina de ratos obesos em relação aos grupos que receberam uma dieta controle ou
hiperlipídica. Já Furino e colaboradores (2021) observaram aumento significativo da
concentração sérica da irisina e menor expressão proteica de FNDC5 no músculo
gastrocnêmio em animais submetidos a 8 semanas de dieta hiperlipídica. Contudo, nesse
mesmo estudo, intervenções com exercício físico e restrição calórica não modificaram tais
parâmetros desses animais obesos.

Um estudo realizado por Macêdo e colaboradores (2017) investigou o impacto de

diferentes composições dietéticas sobre a irisina e expressão de FNDC5 no músculo de
camundongos. As quatro dietas avaliadas: controle, hiperlipídica, rica em carboidrato e
hiperproteica (31% de contribuição energética constituída de proteína), foram aplicadas por
60 dias. A expressão gênica de FNDC5 e expressão proteica de irisina no músculo sóleo foi
reduzida nos grupos submetidos às dietas ricas em carboidratos e hiperlipídica, comparadas
ao grupo controle. Já dieta hiperproteica não diferiu estatisticamente do grupo controle e
protegeu os animais da redução da irisina e do seu precursor. Vale ressaltar a diferença no
modelo experimental (rato x camundongo) e no tempo de intervenção entre o estudo citado e
o nosso estudo.

O treinamento físico aeróbico, assim como a dieta HP, protegeu o músculo

gastrocnêmio da redução da área das fibras musculares causada pela obesidade. Além dos
efeitos já conhecidos dessa intervenção na preservação da massa muscular, como visto
também sobre o peso do gastrocnêmio, a maior concentração de irisina nesses animais
estimula efeitos importantes para saúde muscular, como visto por Colaianni e (2017) onde o
tratamento com irisina preveniu a perda de peso muscular e a diminuição das áreas das fibras
em camundongos.
 83

O estado pró-inflamatório sistêmico associado à obesidade leva a inúmeras alterações

metabólicas no tecido muscular, incluindo a ativação de vias catabólicas
ubiquitina-proteassoma (Cho et al., 2017) e a supressão de vias anabólicas, como a
IGF/PI3K/Akt/mTOR (Ferretti et al., 2018), o que explica a menor área das fibras musculares
nos animais submetidos à dieta hipercalórica e sedentarismo por 20 semanas (i.e., grupo
HC+SED).

A dieta HP isoladamente aumentou a área das fibras musculares e número de

mionúcleos. A ingestão de proteínas contribui com a disponibilidade de aminoácidos para
atender à alta demanda de turnover proteico do tecido muscular, o qual é necessário para a
reconstrução e remodelamento de proteínas danificadas, além da síntese de proteínas
miofibrilares musculares, essenciais para a contração muscular (Tipton, 2011). Por sua vez,
com o aumento de proteínas no interior do sarcoplasma há um desequilíbrio entre a razão
núcleo/sarcoplasma, sendo necessária a incorporação de células satélites devido a demanda
aumentada por núcleos (Mansur, 2018; Barroso et al., 2005).

A dieta HP e o treinamento físico foram determinantes para promover menores

concentrações de triglicerídeos intramusculares. Ao exercício físico de moderada intensidade
atribui-se a predominância na utilização de lipídios como fonte energética com consequente
mobilização e utilização de ácidos graxos, não exclusivamente do TA, mas também
intramuscular, através da lipólise (Silveira et al., 2011). Ademais, um estudo in vitro
conduzido por Vaugham e colaboradores (2014) observaram que a exposição de irisina a
miócitos também promoveu a indução da biogênese mitocondrial e maior expressão gênica
do PGC-1α, o que também pode contribuir para a melhor utilização dos triglicerídeos
intramusculares nos animais que apresentaram maiores concentrações séricas de irisina.

Além dos parâmetros quantitativos do músculo, a dosagem de triglicerídeos permite

avaliar a qualidade muscular. Sugere-se que o acúmulo de lipídios intramuscular observado
no grupo HC+SED do presente trabalho, está relacionado com o excesso de lipídios
circulantes, promovidos pelo estado de obesidade, além do prejuízo na beta-oxidação e
aumento de espécies reativas de oxigênio (ERO) no músculo (Hermsdorff e Monteiro, 2004;
Sishi et al., 2011). Essas mudanças promovem uma cascata de eventos iniciada pela
disfunção mitocondrial e ambiente lipotóxico, que, por sua vez, contribui com danos
celulares, estresse oxidativo e estado pró-inflamatório, que ativam vias de proteólise e
apoptose (Rubio-Ruiz, 2019).
 84

Podemos relacionar o efeito da dieta HP sobre os triglicerídeos intramusculares, em

especial entre os animais sedentários que tiveram a concentração de triglicerídeos do músculo
gastrocnêmio reduzidos, devido o direcionamento dos substratos (maioritariamente proteínas)
à própria metabolização ou armazenamento das proteínas, assim como, para suprir as
demandas energéticas do corpo ao utilizar a cadeia carbônica como fonte energética ou
direcionada à gliconeogênese (De Angelis e Tirapegui, 2007). Vale pontuar novamente que
essa dieta promoveu menor peso corporal e dos depósitos de tecido adiposo, quando
comparada à dieta hipercalórica entre os animais sedentários (i.e., HC+SED).

No presente trabalho, menor área e diâmetro dos adipócitos do TASC foram

observados nos animais submetidos por 12 semanas às intervenções com o treinamento físico
aeróbico ou com a dieta HP isoladamente. As alterações morfológicas encontradas no TASC
induzida pelo TRE são indicativas do estado catabólico proporcionado pelo aumento do gasto
energético e lipólise. Khalafi e colaboradores (2020) também encontraram resultados
semelhantes, o tamanho dos adipócitos significativamente menores nos animais obesos
submetidos ao treinamento de moderada intensidade comparados aos animais obesos e
sedentários, além disso, o TRE determinou a upregulation dos genes para translocase de
ácido graxo (CD36), carnitina palmitoiltransferase 1 (CPT1) e sirtuína 1 (SIRT 1).

No presente estudo, a lipólise aumentada e refletida na morfometria do TASC dos

animais treinados também foi acompanhada pela upregulation dos genes da CPT1 e SIRT1.
A SIRT1 é considerada uma chave mestre na regulação metabólica de diferentes tecidos
metabólicos, isso se deve à sua capacidade de modificar e controlar numerosos fatores de
transcrição e cofatores relacionados à homeostase sistêmica. No tecido adiposo branco, a
SIRT1 adapta a transcrição gênica de acordo com as mudanças nos níveis sistêmicos de
nutrientes (Li et al., 2013).

No estudo de Medeiros e colaboradores (2021), uma dieta hiperproteica foi

determinante para o aumento da área dos adipócitos do TAE apenas nos animais sedentários
saudáveis após 12 semanas de intervenção. Tais diferenças podem ser atribuídas às
particularidades dos modelos experimentais, mas também às características distintas dos
depósitos adiposos avaliados. Além disso, em nosso estudo a dieta HP promoveu a
upregulation no TASC do gene da CPT1, proteína da membrana externa da mitocôndria que
possui alto grau de controle sobre a taxa de oxidação de ácidos graxos (transporte celular e
 85

mitocondrial) (Price et al., 2003), o que pode justificar as reduções no tamanho dos
adipócitos dos animais submetidos à dieta HP.

Adicionalmente, a expressão do gene da CD36 que participa do fornecimento de

lipídios biologicamente ativos às células e oxidação dos mesmos (Silverstein e Febbraio,
2010) foi aumentada somente pela dieta HP. Vale ressaltar que a dieta hiperproteica também é
restrita em carboidratos, o que implica em menor disponibilidade de glicose e consequente
aumento da lipólise para atender as necessidades energéticas (Chaumontet et al., 2015).

A adaptação mitocondrial no tecido adiposo branco (TASC e TAE) foi vista no

presente trabalho através da medida da atividade da enzima citrato sintase. O treinamento
físico aeróbico aumentou este parâmetro, possivelmente devido ao aumento da demanda
energética gerada pelo músculo em atividade, dessa forma, a biogênese mitocondrial é
estimulada para fornecimento de ácidos graxos livres para esse tecido, sendo este um dos
mecanismos adaptativos que correlacionam o exercício físico e atividade mitocondrial
(Stanford et al., 2015).

A mitocôndria desempenha funções relevantes na diferenciação e maturação dos

adipócitos, metabolismo energético e balanço redox. Na obesidade, a diminuição do conteúdo
mitocondrial é uma característica do processo de disfunção mitocondrial, dentre as
consequências, há a redução da β-oxidação. Sendo assim, a respiração mitocondrial reflete a
capacidade oxidativa das células e o metabolismo do substrato (Mendham et al., 2020).

Os resultados apontados acima podem se correlacionar com as diferenças encontradas

no tamanho dos adipócitos dos grupos experimentais. Outra importante variável ligada
diretamente ao tamanho celular, em especial na obesidade, é a capilaridade, avaliada no
presente estudo através de marcação imuno-histoquímica, com o fator CD31. Durante a
obesidade há um aumento da angiogênese local com o intuito de compensar o aumento dos
adipócitos. Com a manutenção desse estado obesogênico pode ocorrer uma falha
angiogênica, o que explica a hipóxia tecidual, importante evento no remodelamento do TA na
obesidade (West et al., 1987; Pang et al., 2008). Sendo assim, o aumento da capilaridade no
TASC, por ambas as intervenções, pode ser explicado pela redução paralela da área e
diâmetro dos adipócitos.

Diferente do que foi observado no TASC, os parâmetros morfométricos do TAM

sofreram poucas alterações pelas intervenções do presente estudo. Apenas o TRE promoveu
 86

redução na área dos adipócitos multiloculares e uniloculares, no entanto, o número de

adipócitos e porcentagem de área referente às gotículas lipídicas não foram alteradas pela
dieta HP ou TRE. Resultados prévios de estudos envolvendo medidas de parâmetros do TAM
após treinamento físico são inconsistentes, visto que são relatados aumento ou diminuição da
massa e atividade do TAM em animais e humanos treinados (Garritson e Boudina, 2021).

Nossos achados de menor área de adipócitos do TAM podem estar relacionados ao

aumento da atividade mitocondrial, através da enzima citrato sintase, assim como maior
expressão do gene UCP-1, sugerindo que o treinamento físico aeróbico de moderada
intensidade protegeu os animais da disfunção mitocondrial e metabólica do TAM provocada
pela obesidade.

Em trabalhos anteriores, Wu et al (2014) constataram maior massa tecidual e

conteúdo de UCP-1 no TAM em animais alimentados com dieta hiperlipídica, mas tais
parâmetros foram acentuadamente suprimidos pelo exercício de resistência (corrida em
esteira a 75-85% do VO2 máximo, 1 hora/dia, 5 dias/semana, durante 8 semanas). Já Heras et
al (2018) observaram em animais treinados (55-65% da velocidade máxima de corrida, 5
vezes/ semana durante 50 minutos) em esteira por 8 semanas o aumento da massa do TAM e
maior expressão proteica de SIRT-1, UCP 1, 2 e 3, além do PGC-1α e fatores envolvidos na
biogênese mitocondrial.

A disfunção mitocondrial na obesidade, anteriormente citada, ocorre devido a

sobrecarga da capacidade mitocondrial de sustentar os níveis de ATP em resposta às
demandas energéticas. Como consequência, a elevada carga de substrato mitocondrial
aumenta a atividade da cadeia transportadora de elétrons (CTE) e a produção de ERO. Sua
fonte primária é a transferência de elétrons pela CTE, gerando ânions superóxido, que por sua
vez podem reagir com lipídios, óxido nítrico ou levar a formação de peróxido de hidrogênio
(Murph, 2009; Masschelin et al., 2020). Além disso, nos adipócitos, o sistema NADPH
oxidase também é responsável pela geração de superóxidos ou H2O2 (Sakurai et al., 2017).

O estresse oxidativo é resultado da produção acentuada de radicais livres e redução

nas defesas antioxidantes endógenas, de modo que, indivíduos e animais obesos (Furukawa et
al., 2004) apresentam eminente aumento dessa condição no TAB, que por sua vez
desempenha papel crítico na patogênese de diversas doenças. O estresse oxidativo sustentado
leva a prejuízos no metabolismo, uma vez que prejudica o comportamento fisiológico de
 87

enzimas metabólicas, como aconitato hidratase e piruvato desidrogenase quinase 2

(Masschelin et al., 2020).

O treinamento físico desempenhou efeito singular na redução de todos os marcadores

de dano oxidativo nos TAB avaliados. A respeito da capacidade antioxidante, a atividade da
enzima GPx foi aumentada no TASC e no TAE, adicionalmente no TASC houve aumento da
atividade da SOD e expressão gênica de GPx, CAT e Fator nuclear eritróide 2 relacionado ao
fator 2 (Nrf2).

Durante uma sessão de exercício físico, EROs são gerados no músculo e servem como
sinalizadores de vias sensíveis ao estresse redox, culminando na transcrição de genes
envolvidos na resposta antioxidante e consequente aumento na atividade de enzimas
antioxidantes. Isso explica a adaptação crônica que o exercício físico provoca no status redox
e evidências apontam para o Nrf2 como um regulador mestre na defesa celular, regulando
mais de 200 genes citoprotetores, quando translocado para o núcleo, mesmo na condição de
estresse oxidativo leve, como observado no treinamento físico aeróbico de moderada
intensidade (Done e Traustadóttir, 2016; Pires et al., 2022).

Estudos têm demonstrado que esse aumento de ERO e adaptações acontecem não
somente no músculo, mas também em outros tecidos (Dias et al., 2023; Farhat et al., 2015).
Matta et al (2021) demonstraram que uma sessão de exercício aeróbico induziu um ambiente
pró-oxidante transitório e promoveu resposta celular a exposição de ERO ao aumentar os
níveis de mRNA de genes antioxidantes e citoprotetores no tecido adiposo retroperitoneal.

No presente estudo, o TRE não aumentou a atividade de SOD e CAT no TAE, mas
protegeu o tecido do aumento dos marcadores de dano oxidativo. Não estão claros quais
mecanismos estão envolvidos nessa diferença na resposta antioxidante entre os depósitos
adiposos, no entanto podemos associar à cinética enzimática. A GPx possui um baixo Km
para H2O2 , sugerindo que ela o elimina eficientemente em concentrações mais baixas, já a
catalase é aumentada em situações de maior demanda e estresse oxidativo (Margonis et al.,
2007). Ademais as unidades de medida dos marcadores de dano oxidativo são mais baixas no
TAE comparadas ao TASC, sendo assim, necessária maior mobilização antioxidante.

Tratando-se do TAM, a UCP-1 é apontada como mediadora de mecanismo de defesa

contra a produção de ERO tecidual através da redução da hiperpolarização mitocondrial,
associada a sua capacidade de desacoplamento da respiração mitocondrial (Pan e Chen,
 88

2021). Além disso, estudos com animais transgênicos que expressam a UCP-1 no músculo
apresentaram atividades aumentadas das enzimas antioxidantes, atenuaram a obesidade e
prolongaram a vida útil dos animais, essa expressão forçada da UCP-1 no músculo é
dependente do Nrf2 (Klaus et al., 2005; Adjeitey et al., 2013; Keipert et al., 2014).

Apesar do TRE determinar, no presente estudo, o aumento da atividade de todas as

enzimas antioxidantes avaliadas no TAM, assim como a expressão gênica das mesmas, não
houve diferença dos marcadores de estresse oxidativo entre os grupos, com exceção dos
nitritos teciduais que foram reduzidos. Tais resultados podem ser justificados pela proteção
tecidual adicional proporcionada pelo exercício físico, mesmo que não haja dano oxidativo
excessivo no tecido.

O acúmulo de ERO também é prejudicial ao metabolismo no TAM, como visto na

obesidade (Alcalá et al., 2017), no entanto são importantes moléculas sinalizadoras e foi
demonstrado que a produção fisiológica de ERO aumenta a sinalização da proteína quinase
ativada por mitógeno (MAPK) e adenosina monofosfato cíclico (cAMP) / p38 para indução
da expressão da UCP1 (Ro et al., 2014).

Adicionalmente, é importante destacar que o TAM não está isolado de forma que
responde apenas às alterações nele mesmo, mas também se comunica com outros tecidos. O
crosstalk entre músculo esquelético e o TAM é relatado como importante para o equilíbrio
das ERO, uma vez que as miocinas produzidas pelo músculo favorecem a função do tecido
marrom e bege e da mesma forma, o TAM também secreta mediadores químicos, conhecidas
como batoquinas, que promovem a função muscular (Pan e Chen, 2021). Nossa hipótese é
que o aumento de ERO promovido pelo treinamento físico no músculo também promova
alterações no TAM a fim de restabelecer o equilíbrio redox sistêmico.

No presente estudo, a dieta HP não proporcionou benefícios ao balanço redox tanto

quanto o treinamento físico. A dieta HP reduziu TBARS, aumentou atividade da SOD e
expressão gênica de Gpx no TASC, não promoveu alterações no balanço redox no TAE e
reduziu a atividade da catalase no TAM. A maior ingestão de proteínas e oxidação de
aminoácidos aumenta a produção de ERO mitocondrial, quando associada a diminuição da
defesa antioxidante pode resultar em estresse oxidativo (Gu et al., 2008), como visto em
tecidos como pâncreas (Gu et al., 2010), cérebro (Żebrowska et al., 2019), glândulas salivares
(Kołodziej et al., 2017), fígado e rins (Gu et al., 2008), no entanto, não foi visto previamente
no tecido adiposo.
 89

Ademais, apesar da dieta HP promover menor peso corporal e deposição de substratos

no TA, a mesma pode não ativa vias sinalizadoras específicas, assim como o TRE, que
promove através do movimento mecânico do músculo, o início de uma cascata de eventos e
adaptações fisiológicas. Dessa forma, foi observado que o consumo da dieta HP promoveu
perfil oxidativo estatisticamente semelhante ao grupo HC+SED.

O desequilíbrio energético promovido pelo sedentarismo e consumo da dieta

hipercalórica é o ponto de partida para alterações morfológicas e funcionais no tecido adiposo
observadas no presente trabalho. Através dos parâmetros avaliados, pudemos traçar o
caminho dessas mudanças e visualizar o desfecho em uma teia complexa de
comprometimento funcional. O excesso de substratos culminou na hipertrofia dos adipócitos
e paralela alteração na capilaridade, metabolismo, função mitocondrial e balanço redox dos
ratos obesos. Todas as alterações até então discutidas são direcionadas ao desfecho que se
comunica com todos os elementos dessa teia que se auto sustenta: a inflamação.

Assim como observado para o balanço redox, o treinamento físico exerceu efeito
superior e protegeu todos os depósitos do TA do aumento de parâmetros pró-inflamatórios.
Sabe-se que a massa do tecido adiposo e tamanho dos adipócitos são fatores relevantes da
cascata de inflamação no tecido adiposo obeso (Skurk et al., 2007; Guo et al., 2004). Sendo
assim, tanto o TRE como a dieta HP conseguiram prevenir a elevação dos mesmos e
consequentemente interrompeu a sucessão de eventos da cascata inflamatória, como a
produção de citocinas e produção excessiva de ERO.

O estado redox tecidual está intimamente relacionado ao processo inflamatório no

tecido adiposo. Sugere-se que o aumento do estresse oxidativo, causado pelo estresse
metabólico, é uma das principais causas da secreção desregulada de citocinas e ativação de
vias inflamatórias (Sakurai et al., 2017). Este aumento das citocinas pró inflamatórias causa
uma mudança na população de células imunes, pois incluem também quimiocinas como a
proteína de quimioatração de monócitos (MCP-1) que corrobora com o recrutamento de mais
células imunes (Villarroya et al., 2018). Além do aumento na quantidade e distribuição de
macrófagos, ocorre também a mudança no fenótipo destas células, para o tipo M1, que
corroboram com secreção de citocinas e EROs (Villarroya et al., 2018).

Adicionalmente, o estresse oxidativo e a citocina TNF-α podem ativar o fator nuclear

kappa B (NF-κB), um importante fator de transcrição e tradução de outros citocinas como
IL-6, IL-1β e TNF-α. O estudo de Furukawa e colaboradores (2004) constatou que o aumento
 90

na expressão gênica das citocinas pró inflamatórias e redução na adipocina anti-inflamatória

adiponectina foram acompanhadas de altos níveis de marcadores de dano oxidativo no TAB
de camundongos.

A relação entre a TNF-α e IL-10 tem sido adotada como um indicador de estado
inflamatório e doenças associadas (Lira et al., 2009). Tanto a dieta HP quanto o treinamento
físico no presente estudo preveniram o aumento da razão TNF-α/IL-10 em todos os depósitos
avaliados. Ademais, a expressão gênica da adiponectina, adipocina com ação
anti-inflamatória e com relação inversa com peso corporal/Índice de massa corporal, também
foi alterada por ambas as intervenções.

O efeito superior do TRE pode ser atribuído a algumas alterações promovidas como:
1) Aumento da expressão protéica e gênica de IL-10 e expressão gênica de IL-27, além da
adiponectina no TASC, importantes marcadores anti-inflamatórios; 2) Aumento a expressão
de proteínas de IL-10 no TAE e redução da imunomarcação de NF-κB; 3) Maior proteção
contra danos oxidativos nos depósitos de TA avaliados; 4) Menor infiltração de células
inflamatórias (macrófagos totais, linfócitos e estruturas crown-like) no TASC.

No presente estudo, a dieta HP isoladamente aumentou a imunomarcação de

macrófagos M2 e reduziu a razão entre macrófagos totais e macrógagos M2 no TASC.
Apesar de não influenciar a quantidade de macrófagos M2, o total de macrófagos, assim
como a razão entre macrófagos totais e M2, foram reduzidas pelo treinamento físico
aeróbico. Estudos prévios destacam a inibição da infiltração de monócitos e macrófagos e
também a mudança fenotípica de macrófagos em animais obesos treinados (Kawanishi et al.,
2010; Kawanishi et al., 2013).

Os efeitos anti-inflamatórios do exercício físico crônico são atribuídos a alguns

mecanismos, além da redução da massa adiposa, ocorre também o aumento da produção e
liberação de citocinas anti-inflamatórias a partir da contração muscular (miocinas) e redução
na expressão de Toll Like Receptors (TLRs) nos monócitos e macrófagos, que interfere na
ativação e resposta inflamatória dos mesmos (Gleeson et al., 2011).

Os animais submetidos ao treinamento físico aeróbico no presente trabalho também

apresentaram maior expressão gênica da interleucina 27 (IL-27), indicativo adicional dos
efeitos do TRE sobre a inflamação e metabolismo lipídico. A IL-27 é uma citocina com
efeitos anti ou pró-inflamatórios a depender do contexto celular, mas apesar de não ser
 91

totalmente esclarecido os mecanismos, estudos prévios indicam que a IL-27 promove a

supressão de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α, IL-6 e IL-17 (Nam et al., 2016).
Adicionalmente ela promoveu melhora na captação de glicose e a deposição de
triacilgliceróis nos adipócitos brancos (Scaffidi et al., 2023). Wang e colaboradores (2021)
demonstraram que a sua sinalização é necessária para a termogênese adaptativa, homeostase
metabólica sistêmica e sua administração melhorou a obesidade e resistência insulínica em
camundongos.

Os níveis séricos mais elevados de irisina nos animais treinados também sugerem a
relação entre essa adipomiocina e as recentes descobertas acerca dos efeitos
anti-inflamatórios a ela atribuídos. Além de suprimir a expressão e secreção de citocinas
pró-inflamatórias (Mazur-Bialy et al., 2017), a irisina também promoveu a polarização dos
macrófagos tipo M1 para M2 em camundongos alimentados previamente com dieta
hiperlipídica (Dong et al., 2016). Outros estudos observaram o efeito da irisina induzida por
exercício, atenuando a inflamação no fígado, por meio da TLR4 (Zhu et al., 2021) e em
células β pancreáticas reduzindo a resistência insulínica através da inibição das vias TLR4 /
NF-kB (Zheng et al., 2021).

Na figura 44 encontra-se o resumo dos resultados encontrados no presente estudo.

Figura 44. Resumo dos efeitos promovidos pelo treinamento físico (TRE) ou dieta hiperproteica e
restrita em carboidratos (Dieta HP) isoladamente e os efeitos promovidos por ambas intervenções (TRE
| Dieta HP). Em negrito estão os resultados que tiveram efeitos promovidos pela associação entre as
intervenções. Imagem criada com BioRender.com.
 92

7. CONCLUSÃO

As intervenções terapêuticas para tratamento da obesidade propostas neste estudo

(i.e., dieta hiperproteica restrita em carboidratos ou treinamento físico aeróbico de moderada
intensidade), por 12 semanas, promoveram efeitos benéficos isoladamente sobre a
composição corporal, os aspectos morfológicos do tecido adiposo branco e músculo
gastrocnêmio e os parâmetros inflamatórios e oxidativos no TASC. Não obstante, o
treinamento físico, além de modular positivamente a irisina, protegeu de forma mais efetiva
que a intervenção dietética as alterações inflamatórias, o balanço oxidativo e da função
mitocondrial e metabólica nos depósitos de tecido adiposo subcutâneo abdominal, epididimal
e marrom de animais obesos.

Nossos achados reforçam os efeitos benéficos da associação entre a prática crônica do

exercício físico e a dieta hiperproteica restrita em carboidratos sobre a redução do peso
corporal, expressão de FNDC5 no músculo gastrocnêmio, redução de diâmetro dos adipócitos
e aumento da atividade da SOD, expressão gênica de adiponectina e imunomarcação de
CD31 no TASC. Mais estudos acerca da dieta hiperproteica e restrita em carboidratos são
necessários, em especial com outras proporções de proteína dietética, para confirmar ou
refutar os achados do presente estudo, além de esclarecer melhor os mecanismos e vias
relacionadas ao seu benefício.
 93

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ANEXO A - Parecer de aprovação da comissão de ética em uso de animais