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    Aula 2 Metodos de Estudo Da Celula - Parte 1

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    ahboleira
    O documento descreve os principais métodos de estudo em biologia celular e molecular, incluindo: (1) a história inicial dos estudos celulares com o microscópio no século XVII; (2) o desenvolvimento de técnicas de microscopia óptica e eletrônica que permitiram visualizar estruturas celulares; (3) os principais tipos de microscopia como campo claro, fluorescência e eletrônica.

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    O documento descreve os principais métodos de estudo em biologia celular e molecular, incluindo: (1) a história inicial dos estudos celulares com o microscópio no século XVII; (2) o desenvolvimento de técnicas de microscopia óptica e eletrônica que permitiram visualizar estruturas celulares; (3) os principais tipos de microscopia como campo claro, fluorescência e eletrônica.

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    AULA 2 METODOS DE ESTUDO DA CELULA _PARTE 1

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    O documento descreve os principais métodos de estudo em biologia celular e molecular, incluindo: (1) a história inicial dos estudos celulares com o microscópio no século XVII; (2) o desenvolvimento de técnicas de microscopia óptica e eletrônica que permitiram visualizar estruturas celulares; (3) os principais tipos de microscopia como campo claro, fluorescência e eletrônica.

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    Aula 2 Metodos de Estudo Da Celula - Parte 1

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    ahboleira
    O documento descreve os principais métodos de estudo em biologia celular e molecular, incluindo: (1) a história inicial dos estudos celulares com o microscópio no século XVII; (2) o desenvolvimento de técnicas de microscopia óptica e eletrônica que permitiram visualizar estruturas celulares; (3) os principais tipos de microscopia como campo claro, fluorescência e eletrônica.

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    TEMA: MÉTODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA

    CELULAR E MOLECULAR
    MÉTODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA CELULAR E
    MOLECULAR
    • Os primeiros estudos da célula foram iniciados no
    séc. XVII com a utilização de microscópios
    rudimentares de luz , idealizados por Robert Hooke
    (1635-1703), que foram utilizados para observar as
    primeiras células vegetais.

    • O aperfeiçoamento dos sistemas ópticos concorreu


    para o melhoramento da resolução dos microscópios
    e para o desenvolvimento dos diversos tipos de
    microscópios com maior definição.
    MÉTODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA CELULAR E
    MOLECULAR
    • Actualmente, os microscópios ópticos possuem
    características especificas, que lhes permitem
    visualizar os mais minuciosos aspectos das
    particularidades das células.
    • O aparecimento dos microscópios electrónicos
    (TEM) e de varrimento (Scanning) com poderes de
    resolução muito elevados e com sistemas de registo
    de imagens, inicialmente fotográficos e
    posteriormente digitais, permitiu um avanço no
    conhecimento das células e das suas estruturas,
    bem como a identificação de outras que a
    microscopia de luz até então, não tinha conseguido
    visualizar.
    MICROSCOPIA
    O Desenvolvimento de técnicas de preparação laboratorial
    para a visualização dos materiais biológicos permitiu o
    aparecimento de diversos tipos de microscopia:

    • Microscopia óptica (200 nm)


    – Campo claro
    – Fluorescente
    – Avançada:
    • Microscopia Confocal
    • Microscopia de contraste fases, etc.
    • Microscopia electrónica (1 nm)
    – Transmissão (TEM)
    – Varrimento ou Scanning (SEM)
    TIPOS DE MICROSCÓPIOS

    • Microscópio electrónico de
    • Microscópio óptico composto transmissão
    • Microscópio de luz ultravioleta • Microscópio electrónico de
    • Microscópio de fluorescência varrido
    • Microscópio petrográfico • Microscópio de iões em
    • Microscópio de campo escuro campo
    • Microscópio de contraste de fases • Microscópio de sonda
    • Microscópio de luz polarizada • Microscópio de efeito túnel
    • Microscópio Confocal • Microscópio de força atómica
    • Microscópio electrónico • Microscópio virtual
    • Estéreo Microscópio
    UNIDADES DE MEDIDA EM CITOLOGIA

    Servem para medir as células

    • Comprimento
    – μm (micra o micrómetro) = 10 -3 mm
    • (milésima parte do milímetro)
    – nm (nanómetro) = 10 -6 mm
    • (milésima parte do micrómetro)
    – Ä (Ängstrom) = 10 -7 mm
    • (décima da milésima parte do
    micrómetro)
    UNIDADES DE MEDIDA EM CITOLOGIA
    Servem para pesar as células
    • Massa:
    – mg (miligrama) = 10 -3 g
    – μg (micrograma) = 10 -6 g
    – ng (nanograma) = 10 -9 g
    – pg (picograma) = 10 -12 g
    – Da (dalton) = peso de um átomo de hidrogénio
    • Ex: H2O = 18 Da
    – kDa (quilodalton) = 103 Da
    • Ex: Hemoglobina = 64,5 kDa ou 64 500 Da
    O MICROSCÓPIO ÓPTICO
    MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO
    A luz passa através da amostra fazendo com que a área observada seja
    bem iluminada. O feixe de luz passa através da amostra e é captado pela
    objectiva. O microscópio usado pela maioria dos estudantes e
    pesquisadores é o microscópio de campo claro.

    É usada para o exame de rotina de laminas histológicas, visualização de


    tecido de células, microrganismos, etc. nos laboratórios de analises clínicas
    e pesquisa.

    MICROSCOPIA DE CAMPO ESCURO

    Alguns raios luminosos incidem na amostra e são captados pela lente


    objectiva gerando figuras luminosas num campo escuro.

    É indicada para amostras com pouco contraste. Na pratica clínica o


    microscópio de campo escuro serve para examinar a existência de cristais
    nas amostras de urina, como o acido úrico e oxalato e identificar bactérias
    como Treponema pallidum (Sífilis).
    Princípios da formação da imagem ao Microscópio
    Células da mucosa bucal

    Diferenças de
    Sem coloração índices de
    refracção

    Cores de
    Com coloração interferência

    Campo
    Com coloração
    escuro
    fluorescente
    Microscopia de campo claro e sistema analisador
    de imagens

    • Sistema Analisador de
    Imagens - medidas manuais e
    automáticas, incluindo filtros de
    estruturas por forma, tamanho e
    cor.
    Preparação do espécime para microscopia de
    campo claro (cortes)

    2001/2002
    Prof. Doutor José Cabeda
    MICRÓTOMO
    Exemplo de algumas imagens obtidas com microscopia de campo claro

    http://www.esacademic.com/pictures/eswiki/50/250px-
    Plagiomnium_affine_laminazellen.jpeg
    Exemplo de algumas imagens obtidas com microscopia de campo claro
    Exemplo de algumas imagens obtidas com microscopia de campo claro
    Exemplo de algumas imagens obtidas com microscopia de campo claro
    Aplicações da Microscopia
    de Campo Escuro
    É empregue para estudos de
    pequenos materiais:
     Plâncton
     Bactérias
     Cristais

    Microscopia de campo escuro


    da bactéria Leptospira spp
    MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA

    • Permite a localização de moléculas específicas na célula

    • Os corantes fluorescentes promovem uma marcação brilhante


    contra um fundo escuro

    •O corante pode estar directa ou indirectamente relacionado com a


    molécula alvo da célula

    •Podem ser utilizadas em simultâneo vários pigmentos


    fluorescentes

    • As células podem estar fixadas ou vivas.


    MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
    • O microscópio de fluorescência usa a capacidade de algumas
    moléculas em fluorescer sob luz ultravioleta visualizando
    moléculas auto fluorescentes como a vitamina A.

    • A excitação e a emissão de luz das moléculas fluorescentes


    são reguladas por filtros para promover cor e contraste.

    • É utilizada na deteção de antígenos ou anticorpos nos


    procedimentos de coloração imunocitoquímicos.

    • As moléculas fluorescentes também podem ser injectadas em


    animais ou em células para serem usadas como rastreadores.
    Tais métodos são usados para estudar as junções
    intercelulares, rastrear fibras nervosas e detectar marcadores
    de crescimento em tecidos mineralizados.
    O MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA
    TÉCNICAS AVANÇADAS DE MICROSCOPIA E
    FERTILIZAÇÃO
    • Num estudo publicado na Scientific Reports, investigadores da
    Northwestern descobriram que quando o óvulo humano é activado por uma
    enzima do espermatozoide, ocorre uma explosão de faíscas de zinco.
    • O tamanho da erupção está directamente relacionada com a saúde do ovo
    e a sua capacidade de se transformar num embrião viável.
    • Para entender o mecanismo molecular da centelha de zinco os
    investigadores podem recorrer a quatro abordagens físicas que resolvem
    distribuições de zinco em células individuais:
    – uma sonda química para imagens de fluorescência de células vivas
    dinâmicas
    – uma combinação de microscopia electrónica de transmissão com
    espectroscopia de energia dispersiva,
    – microscopia de fluorescência de raios -X
    – tomografia elementar tridimensional para o mapeamento elementar de alta
    resolução.
    Espermatozoides humanos corados com
    laranja de acridina.
    Observação microscópica de fluorescência
    para avaliar os danos do ADN.
    Cabeças dos espermatozoides corados de
    verde possuem ADN normal, enquanto que
    a coloração laranja indica alteração do
    ADN.
    Células epiteliais
    em cultura, com
    coloração vermelha
    para a queratina e
    verde para o DNA.
    Micrografias de células em divisão celular, tiradas com um
    microscópio de fluorescência

    Foram utilizados três


    fluoróforos:
    • DAPI (emite luz azul) para
    marcar cromossomas
    • GFP (proteína verde
    fluorescente intracelular que
    emite luz verde)
    • rodamina (luz vermelha) para
    marcar os microtúbulos. Cada
    fluorocromo justifica a utilização
    de filtros específicos,
    dependendo do comprimento de
    onda necessário para excitação
    (indicado em cima e do lado
    esquerdo) escala expressa em
    nm.
    MICROSCÓPIO CONFOCAL
    MICROSCÓPIO CONFOCAL
    Microscopia óptica de objectos 3D
     Microscopia de varrimento Confocal
    – Gera imagens 3D de células vivas
    – Remove imagens fora de foco
     seccionamento óptico
    – Pode se fazer observações no interior de espécimes
    espessos (ovos, embriões, tecidos)
    Microscópio Confocal de
    Raios Laser Cianobactéria
    filamentosa Microcoleus
    encontradas em solos de
    terras áridas em todo o
    mundo
    Aplicações da Microscopia Confocal a Laser

    Células em prófase

    Células em apoptose: condrócitos


    Aplicações da Microscopia Confocal a Laser

    Protozoário Macrófago
    Aplicações da Microscopia Confocal a Laser

    Divisão celular / Fuso mitótico


    Grãos de Pólen
    MICROSCOPIA ÓPTICA AVANÇADA

    • Permite a observação de células vivas transparentes


    • Os desvios de fase induzidas pela luz através do espécime são utilizados
    para gerar contraste.

    – Contraste de fase (luz refractada e não refractada)


    – Contraste de interferência diferencial (dois feixes de luz)
    MICROSCOPIA DE CONTRASTE INTERFERENCIAL
    MICROSCOPIA DE CONTRASTE INTERFERENCIAL

    Os prismas modificam a fase da onda luminosa

    Contraste com o meio em que se encontra o material a ser


    analisado
    Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial

    Observação de materiais biológicos sem coloração:

    1. Parasitologia: Interpretação de estruturas e apêndices dos parasitas


    (taxonomia)
    2. Análise de massa seca celular – organização e compactação de material
    biológico
    3. Monitorização de culturas celulares

    Algas

    Escamas
    APLICAÇÕES DA MICROSCOPIA DE CONTRASTE
    INTERFERENCIAL

    Cultura Celular: macrófago Ácaro


    MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO
    O microscópio de polimerização é uma modificação simples do microscópio
    óptico e possui
     2 Filtros ou Prismas:

    1º Polarizador → Entre a fonte de luz e o espécime


    2º Analisador → Entre a objectiva e a ocular

    Filtros:

    Promovem a seleção de apenas um plano de direcção de vibração das


    ondas luminosas. Plano da luz polarizada (PLP)

    Observação:
    Microscopia de luz comum → feixe de ondas luminosas → direção de
    vibração em todos os planos
    MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO

    2º

    1º
    APLICAÇÕES DA MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO

    1. Análise de macromoléculas que apresentam graus ordenados


    de agregação: DNA, colágenos fibrilares, celulose, tubulina

    2. Análise de células que apresentem organização interna de


    suas macromoléculas altamente cristalinas: célula muscular
    esquelética, espermatozoides (ordem molecular).

    3. Análise de tecidos biológicos com ordem molecular nos


    arranjos de macromoléculas: tecidos ósseos, cartilagens, etc

    4. Análise de componentes cristalinos dos minerais

    5. Outros: parede celular; amido.


    Aplicações da Microscopia de Polarização

    Tecido ósseo

    Grãos de Amido
    Aplicações da Microscopia de Polarização
    Coloração: Picro-sirius / Luz polarizada

    Tecido ósseo : sistema de Havers Tecido ósseo: osso esponjoso /


    ou ósteon / fibras colágenas fibras colágenas

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