ASTAXANTINA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ - UFPR
SETOR DE TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE
BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA
VANESSA GHIGGI
ESTUDO DO CRESCIMENTO E INDUÇÃO DA PRODUÇÃO DO PIGMENTO
ASTAXANTINA POR Haematococcus pluvialis.
CURITIBA
2007
VANESSA GHIGGI
ESTUDO DO CRESCIMENTO E INDUÇÃO DA PRODUÇÃO DO PIGMENTO
ASTAXANTINA POR Haematococcus pluvialis.
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

Graduação em Processos Biotecnológicos –
PPGBiotec – UFPR, como parte das exigências
para obtenção do título de Mestre em Processos
Biotecnológicos.
Orientador: Prof. Dr. Julio César de Carvalho

Co-orientador: Prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol
CURITIBA
2007
AGRADECIMENTOS
“Algumas pessoas percorrem ao nosso lado, vendo muitas luas passarem,

alimentando o nosso ego com alegria...”. Todo meu amor e gratidão aos meus
pais (Dorival e Terezinha), que além da vida, me deram coragem para a luta,
inspiraram-me a certeza de sua presença e esperança para o futuro, estando
ao meu lado como amigos e orientadores. Obrigada pelo apoio, amor,
abdicação e confiança dedicados todos estes anos e, principalmente, pela
credibilidade no meu trabalho e incentivo durante toda esta caminhada!
Agradeço meu irmão por seu esforço, comprometimento e sede de
conhecimento, buscando sempre as soluções para todos os meus problemas.
“...Cada pessoa que passa em nossa vida é única. Sempre deixa um pouco de
si e leva um pouco de nós...”. Ao professor orientador Dr. Julio César de
Carvalho, que dedicou seu tempo, compartilhou experiências, soube ser
orientador e amigo, minha homenagem e gratidão.
Minha Gratidão também àqueles que repartiram os seus conhecimentos,
ensinando a arte de construir um hoje comprometido com o amanhã... Obrigada
a toda equipe de professores do PPGBIOTEC.
“...Existem pessoas em nossas vidas que nos deixam felizes pelo simples fato
de terem cruzado o nosso caminho...”. Minha gratidão aos amigos e colegas do
PPGBiotec, em especial Larissa e Luciana e a Profa Kazuko (PUC-PR) que
sempre me impulsionaram e me acolheram com muito carinho e amizade.
“...O destino nos apresenta outros amigos, que não sabiam que iam cruzar o
nosso caminho e que foram muito importantes ...”. A toda equipe da Ouro Fino
Microalgas, em especial Camila Suarez e João Marcus Uratani e da IMCOPA
(Susan e Adriana) pelo convívio, amizade, companheirismo.
“...Alguns amigos dão brilho aos nossos olhos, música aos nossos lábios, pulos
aos nossos pés e sentido à nossa vida...”., agradeço ao meu namorado,
Marcelo, pelo seu incentivo, as suas palavras, companhia e compreensão.
“Grandes foram as lutas, maiores foram as vitórias e o Senhor sempre

estivestes ao meu lado... fazendo da derrota uma vitória... da fraqueza uma
força” (Isaías 55.10-11). Agradeço ao Senhor que estivestes presente desde o
princípio, em cada dificuldade, em cada alegria. Obrigada DEUS por toda força
e proteção!
“ O futuro dependerá daquilo que fazemos no presente”.
Ghandi
RESUMO
A microalga H. pluvialis, uma fonte do pigmento astaxantina, tem sido amplamente

estudada em vista de sua potencialidade na produção industrial de astaxantina,
apresentando alto teor de pigmento celular quando exposta à condições de stress.
Devido à sua coloração atrativa e funcionalidade biológica, como antioxidante, a
astaxantina tem sido utilizada como suplemento alimentar, corante em alimentos e
fonte de pigmento em aquacultura.
Estudou-se condições de cultivo para produção de biomassa e parâmetros de
indução da produção de astaxantina, visando a otimização do crescimento celular e
obtenção de pigmento. Os efeitos fisiológicos de diferentes meios de cultivo, pHs,
salinidades e intensidades de luz foram investigados, além de condições de extração
química e estabilidade da astaxantina. A melhor condição de crescimento vegetativa
foi observada em meio SAG, com irradiação de 2,7Klux e pH controlado 7,0.
Vários fatores indutores da produção de astaxantina têm sido sugeridos. Em nosso
estudo a carotenogênese foi positivamente influenciada pelo aumento da
intensidade de luz (7,0Klux) e a salinidade apresentou efeito positivo até 0,7% NaCl.
O método de Sedmak et al. (1991) para extração química da astaxantina foi eficiente
para a extração nos cistos de H. pluvialis. Os melhores resultados de extração
química e estabilidade foram obtidos com a mistura de solventes
diclorometano:metanol (25:75 v/v).
Palavras-chave: Haematococcus, Astaxantina, Stress, Indução, Pigmento.

ABSTRACT
The microalga H. pluvialis, a potential source of astaxanthin, has been widely studied
in recent years because of its high intracellular pigment content, produced under
conditions of stress. Due to its attractive orange color and biological function as
antioxidant, astaxanthin has been used as a dietary supplement, food colorant and
as a pigment source in aquaculture.
We studied the culture conditions for biomass production and the factors responsible
for astaxanthin production induction, with the aim of optimizing the vegetative growth
and production of pigment. The physiological effects of different culture media, pHs,
salinities and light intensity were investigated, besides chemical extraction conditions
and astaxanthin stability. The best vegetative growth was observed on SAG medium
under light intensity of 2.7 klux and pH controlled at 7.0.
Several factors promoting astaxanthin formation in grown cultures have been
suggested. In our studies, the carotenogenesis was positively influenced by the
increase of light intensity (7.0 klux) and the salt concentration was beneficial up to
0.7% NaCl. The Sedmak et al. (1991) method of astaxanthin chemical extraction was
efficient for H. pluvialis cysts, and the best results of chemical extraction and stability
were obtained with the mixture of solvents dichloromethane:methanol (25:75, v/v)
Key words: Haematococcus, Astaxanthin, Stress, Induction, Pigment.

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E UNIDADES
ATCC – American Type Culture Collection

Ax/Chl: relação astaxantina/clorofila
BHA: Butil hidroxi anisol
BHT: Bultil hidroxo tolueno
C/N: relação carbono/nitrogênio
DO: demanda de oxigênio
DMSO: dimetil sulfóxido
FDA: Food and Drug Administration
g: aceleração da gravidade, 9,81 m.s-2
HPLC: Cromatografia líquida de alta performance
LED: diodo emissor de luz
MBBM: meio Bold´s Basal modificado
mcg: micro gramas
OD: densidade óptica
OMS: Organização Mundial da Saúde
OTR: taxa de transferência de oxigênio
PFD: photon flux density
PBR: fotobioreatores fechados
rpm: rotações por minuto
SAG: Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen
UV: ultravioleta
v/v: volume por volume
µ: velocidade específica de crescimento
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 9
1.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 10
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................... 11
1.3 SIGNIFICADO E IMPACTO DO ESTUDO ..................................................... 11
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................ 12
2.1 CORANTES ................................................................................................... 12
2.2 LEGISLAÇAO NACIONAL E INTERNACIONAL DE CORANTES ................. 14
2.3 CAROTENÓIDES .......................................................................................... 17
2.4 ASTAXANTINA ............................................................................................... 19
2.4.1 Interesse Comercial da Astaxantina ............................................................ 22
2.4.2 Astaxantina Natural x Astaxantina Sintética ................................................ 25
2.5 MICRORGANISMOS PRODUTORES DE ASTAXANTINA................... ......... 27
2.5.1 Xanthophyllomyces dendrorhous ............................................................... 29
2.5.2 Haematococcus pluvialis ............................................................................. 33
2.5.2.1 Cepas comumente utilizadas ................................................................... 38
2.5.2.2 Meio de Cultivo de Haematococcus pluvialis .......................................... 39
2.5.2.3 Condições de Cultivo do Haematococcus pluvialis ................................. 48
2.5.2.4 Recuperação e Purificação do Pigmento Astaxantina ............................. 55
3 MATERIAIS E METODOS ............................................................................... 63
3.1 MICRORGANISMO ...................................................................................... 63
3.2 MEIOS DE CULTURA ................................................................................... 63
3.2.1 Meios de Cultivo para Haematococcus pluvialis SAG 34-1b ...................... 63
3.2.2 Meio de Manutenção para Haematococcus pluvialis SAG 34-1b ............... 65
3.3 CONDIÇÕES DE CULTIVO ........................................................................... 65
3.4 MÉTODOS ANALÍTICOS ............................................................................... 69
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 73
4.1 ESTUDO FISIO-MORFOLÓGICO .................................................................. 73
4.2 CINÉTICA DE CRESCIMENTO EM DIFERENTES MEIOS DE CULTIVO..... 77
4.3 CINÉTICA DE CRESCIMENTO COM DIFERENTES INTENSIDADES
DE LUZ ................................................................................................................. 81
4.4 COMPARAÇÃO DAS TÉCNICAS DE DETERMINAÇÃO DE BIOMASSA ..... 83
4.5 ANÁLISE DA INFLUENCIA DE DIFERENTES pHs INICIAIS ....................... 84
4.6 ANÁLISE DA INFLUENCIA DE DIFERENTES pHs CONTROLADOS .......... 87
4.7 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL COM DIFERENTES pHs E
SALINIDADES ..................................................................................................... 89
4.8 CINÉTICA DE CRESCIMENTO COM DIFERENTES LEDS E INFLUENCIA
SOBRE A PRODUÇÃO DE ASTAXANTINA. ....................................................... 95
4.9 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL COM DIFERENTES SALINIDADES E
INTENSIDADES DE LUZ....................................................................................... 98
4.10 TESTE DE SENSIBILIDADE A ANTIBIÓTICOS ............................................ 102
4.11 ANÁLISE DE MÉTODO QUÍMICO DE EXTRAÇÃO DA
ASTAXANTINA ..................................................................................................... 102
4.12 COMPARAÇÃO ENTRE SOLVENTES EXTRATORES ............................... 104
4.13 ALTERAÇÕES NO MÉTODO DE EXTRAÇÃO QUÍMICA .......................... 105
5 CONCLUSÃO .................................................................................................... 107
6 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ............................................... 108
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 109
9
1 INTRODUÇÃO
Com o desenvolvimento da indústria de alimentos tem-se observado o

aumento da demanda por corantes, totalizando o número de 700. A cor do produto
tem se caracterizado um dos principais indicativos de qualidade do ponto de vista do
consumidor e fator fundamental na decisão de compra do produto e, desta forma,
sendo empregado pelos produtores às estratégias de marketing e agregando-se
valor comercial ao produto. No entanto, a segurança na utilização de corantes
sintéticos em alimentos vem sendo questionada quanto a sua inocuidade, abrindo-se
um nicho crescente para o mercado de corantes naturais.
Outra vantagem no desenvolvimento de corantes derivados de fontes naturais
é que muitos são bioativos, como é o caso da astaxantina, licopeno, antocianinas e
β-caroteno. Seguiu-se então a formulação de leis para uso destes corantes, com o
objetivo de proteger a saúde do consumidor. Assim, no início do século XX, uma
lista dos corantes permitidos foi divulgada nos EUA e hoje, apenas sete corantes
sintéticos são permitidos.
A utilização de substâncias sintéticas, derivados de produtos petroquímicos,
atinge diretamente a produção de corantes alimentares, fato este que preocupa
quanto ao aspecto de alterações orgânicas que possam ser causadas pela ingestão
destas substâncias ao longo do tempo. É bem provável, que o aumento das
restrições quanto aos derivados petroquímicos venha a eliminar alguns corantes que
são atualmente utilizados. Conseqüentemente, o mercado de pigmentos naturais
está em expansão e há a necessidade de se encontrar fontes alternativas para
corantes em alimentos, sendo a produção de pigmentos de origem biotecnológica
uma ferramenta importante a ser explorada.
Diante deste cenário, tem aumentado a demanda do pigmento natural
alaranjado astaxantina, para aplicação em indústria de alimentos, ração para
aquacultura, indústria farmacêutica e cosmética, como pigmento e molécula bioativa.
Embora os principais produtores atuais deste pigmento utilizem a síntese química, a
pesquisa biotecnológica deste pigmento está em expansão e, nesta área, se
destacam dois microrganismos conhecidos atualmente como os principais
produtores de astaxantina, a microalga Haematococcus pluvialis e a levedura
Xanthophyllomyces dendrorhous. Dentre estes, o H. pluvialis destaca-se pela
produção de maiores concentrações de astaxantina em relação ao seu peso seco
10
quando comparado ao X. dendrorhous, muito embora, apresente baixa velocidade

de crescimento e um complexo ciclo de vida.
Quando expostas a condições ambientais extremas observa-se a mudança
morfológica das células verdes de H. pluvialis, formando-se cistos vermelhos ricos
em astaxantina. Diversos estudos visando aumentar a eficiência do processo de
obtenção de biomassa de H. pluvialis e, conseqüentemente, aumentar os
rendimentos de astaxantina são relatados, justificado por sua importância econômica
e investimentos no conhecimento do processo biotecnológico do H. pluvialis com o
objetivo de tornar-se competitivo a produção sintética.
Diante das potencialidades da microalga H. pluvialis este trabalho aborda um
estudo das suas características morfológicas, ciclo evolutivo e cultivo em
fotobioreator, buscando alternativas para uma maior produtividade de astaxantina.
Parâmetros de produção de biomassa e/ou pigmento como pH, intensidade de luz e
salinidade foram avaliados a partir de estudos de outros autores.
Este trabalho contém uma revisão da literatura com informações sobre
pigmentos naturais, destacando-se a astaxantina e seus principais microrganismos
produtores. Estão descritos também neste trabalho os materiais, equipamentos,
microrganismo, meios de cultivo e os métodos analíticos usados na determinação da
concentração de biomassa e pigmento. Os resultados compõem-se de estudos físio-
morfológicos e cinéticos da microalga H. pluvialis, avaliação de parâmetros de
cultivo e formação de cistos de astaxantina. Finalmente, a conclusão dos resultados
resume as melhores condições de cultivo e produção de astaxantina obtidas em
nosso estudo.
1.1 OBJETIVO GERAL
Este trabalho consiste no estudo da produção e recuperação do pigmento

astaxantina, a partir da microalga Haematococcus pluvialis. Para tanto, são
avaliadas as condições de cultivo e parâmetros cinéticos para a produção e extração
do pigmento, para possíveis aplicações futuras em alimentos.
11
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1º) Estudar o ciclo de vida e a morfologia da microalga H. pluvialis, relacionando

suas características fisiológicas com a produção de biopigmentos.
2º) Otimizar condições de cultivo para produção de biomassa da microalga H.
pluvialis.
3º) Estudar os parâmetros de cultivo para produção de astaxantina sob diferentes
condições de stress ambiental.
4º) Estudar processos de extração do pigmento astaxantina.
1.3 SIGNIFICADO E IMPACTO DO ESTUDO
Os estudos com microalgas estão em crescente expansão no Brasil e no

Mundo. Explorar esta área permite avaliar etapas como o aumento da relação
eficiência na produção da astaxantina a partir da engenharia biotecnológica, para
futuras aplicações como biopigmento na indústria de alimentos e/ou como molécula
bioativa na indústria farmacêutica e pesquisas médicas, atendendo à crescente
demanda do mercado.
12
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 CORANTES
A legislação brasileira define corante alimentar como uma substância ou

mistura de substâncias com propriedades de conferir ou intensificar a coloração de
alimentos e/ou bebidas (ANVISA, 1977).
Dos três principais fatores de qualidade do alimento, cor, sabor e textura
(FRANCIS, 1999) a cor é a primeira característica notável no alimento (GRIFFITHS,
2005; FRANCIS, 1999) e somente após sua aparência ter sido aprovada, serão
julgados o sabor e a textura do produto (O`CARROLL, 1999). A cor é usada pelo
consumidor para identificar um alimento e julgar sua qualidade (GRIFFITHS, 2005)
sendo importante na primeira impressão do produto, seleção visual e decisão de
compra pelo consumidor (OĆARROLL, 1999). Estudos mostram que a cor pré-
determina nossa expectativa de sabor e gosto, inclusive o nível aparente de doçura
(GRIFFITHS, 2005). Do ponto de vista das indústrias de alimentos, a adição de
corantes assegura a uniformidade da produção, ajuda a reforçar a coloração que já
está presente no produto, mas em intensidade menor que a desejada pelo
consumidor (SPEARS, 1988), confere cor a produtos incolores e/ou a alimentos
“divertidos” como doces festivos e fornece uma variedade atrativa de alimentos aos
consumidores (FDA, 1998). A quantidade e composição dos pigmentos alimentares
exercem influência na aceitação do consumidor e, consequentemente, no valor
comercial do produto (CSERHÁTIA et al., 2000).
Nas últimas décadas a segurança dos corantes sintéticos tem sido
questionada, levando a uma redução no número de corantes permitidos em
alimentos em vários países (PARMINO-DURAM et al., 2001). A preferência da
sociedade por ingredientes “naturais” tem estimulado o interesse em explorar novos
meios e fontes para a produção biotecnológica de corantes alimentícios (MAPARI et
al., 2005). Um grande interesse no uso de corantes derivados de fontes naturais é
que muitos são bioativos, como é o caso da astaxantina, licopeno, antocianinas e β-
caroteno (GRIFFITHS, 2005, OĆARROLL, 1999). De fato, uma pesquisa da
preferência do consumidor revelou que “natural” é frequentemente percebido pelo
consumidor como sendo sinônimo de “seguro” (DREW e LYONS, 1988, apud
SPEARS, 1988) agregando ainda o fator emocional às estratégias de marketing. Um
13
estudo realizado pelo grupo GENAMAZ (Projeto BRA/96/025 - SUDAM/PNUD) em

2000, observou a substituição dos corantes artificiais decorrente da sensibilização
ecológica que se traduz em uma exigência crescente dos consumidores e dos
órgãos de saúde que questionam os efeitos colaterais dos aditivos químicos
(MAIMOM, 2000).
Mercado de Corantes Alim entícios
27%
42%
11%
20%
Art if iciais Idênticos aos naturais Caramelos Nat urais
FIGURA 1: Mercado mundial de corantes alimentícios em 1995 (DOWNHAM E COLLINS, 2000).
Segundo Downham e Collins (2000), o mercado de pigmentos naturais cresce

a uma velocidade de 5 a 10% ao ano, enquanto a previsão de crescimento dos
corantes artificiais está entre 3-5% . No Brasil, a indústria de alimentos representa
4% do PIB e 30% do total das exportações. O setor conta com 38 mil empresas, 750
mil empregos diretos e faturamento anual de R$ 58,1 bilhões. Considerando que a
maioria dos alimentos processados leva corantes, o mercado destes pigmentos está
em franca expansão (MAIMOM, 2000).
Algumas cores são mais populares que outras, tradicionalmente vermelhos e
amarelos têm sido considerados as cores mais atrativas em alimentos.
(O`CARROLL, 1999), tendo ampla aplicação e assim sendo interessante ampliar a
gama de pigmentos naturais disponíveis à indústria de alimentos nesta faixa de
espectro. Segundo Spears (1988) o número de corantes naturais disponíveis às
indústrias de alimentos é relativamente pequeno, sendo realizadas muitas pesquisas
para investigar novas fontes potenciais de pigmentos ainda não permitidos. A
restrição nos corantes naturais disponíveis e suas dificuldades de incorporação
proporcionam um desafio aos produtores de corantes naturais, incentivando a
descoberta de novos pigmentos, melhoramento dos métodos de extração
tradicionais, novos processos biotecnológicos e produção de plantas. Estas fontes
14
incluem plantas, microrganismos, algas e animais (SPEARS, 1988). Pigmentos

derivados de plantas representam fontes efetivas de novos pigmentos, mas sua
linha de produção não é muito rentável, além do mais, sofrem problemas de colheita,
tamanho do cultivo, armazenamento e purificação da fração final (BLANC, 1998).
Por outro lado, corantes provenientes de microrganismos oferecem a vantagem de
produzir continuamente pigmentos bem definidos (SPEARS, 1988), podendo ter
maiores rendimentos, devido sua velocidade de crescimento ser relativamente alta
(WISSGOTT e BORTLIK, 1996).
2.2 LEGISLAÇAO NACIONAL E INTERNACIONAL DE CORANTES
A lista de corantes sintéticos permitidos difere em diferentes países, mas o

conceito geral é similar em todos. Nos Estados Unidos, o órgão responsável por
regulamentar o uso de corantes em alimentos, o FDA, separa aditivos de cor em
duas categorias: "corantes certificados" (derivados primariamente do petróleo) e
"corantes isentos de certificação" (obtidos na maior parte de fontes minerais, de
plantas, ou animais) (FDA, 1993). Em 1900, cerca de 80 corantes artificiais podiam
ser usados em alimentos, porém, atualmente, o FDA permite o uso de apenas sete
corantes artificiais na indústria alimentícia e de cosméticos (FDA, 1998). Assim como
a legislação dos EUA, a legislação européia (tabela 1) não distingue entre corante
natural ou sintético, no entanto, vários corantes derivados de fontes naturais são
observados na lista de corantes permitidos no mercado europeu e dos EUA
(MAPARI et a.l, 2005). Segundo Spears (1988), o número de corantes artificiais na
União Européia (UE) tem sido drasticamente reduzido.
15
TABELA 1 - Corantes permitidos na União Européia para uso em alimentos, segundo a Directiva
94/36/EC (EUROPEAN COMMISSION, 2006):
EC No Nome Comum EC No Nome Comum

E 100 Curcumina E 151* Negro brilhante BN, Negro PN
E 101 Riboflavina, Riboflavina 5`- E 153 Carvão vegetal
fosfato
E 102* Amarelo tartrazina E 154* Marrom FK
E 104* Amarelo de quinolina E 155* Marrom HT
E 110* Amarelo crepúsculo FCF E 160a Carotenos
Laranja crepúsculo S
E 120 Cochonilha, acido carmínico, E 160b Urucum, bixina, norbixina
carmins
E 122* Azorubina, carmoisina E 160e Beta-apo-8`-carotenal (C30)
E 123* Amaranto (Vermelho E 160d Licopeno
Bordeaux)
E 124* Vermelho Ponceau 4R e E 160c
Extrato de páprica, capsantina,
conchonilha A capsorubina
E 127* Eritrosina E 160f Éster etílico de beta-apo-8`-acido
carotênico (C30)
E 128* Vermelho 2G E 161b Luteína
E 129* Vermelho Allura AC E 161g Cantaxantina
E 131* Azul marinho V E 162 Vermelho de beterraba, betaína
E 132* Indigotina, Índigo Carmin E 163 Antocianinas
E 133* Azul brilhante FCF E 170 Carbonato de cálcio
E 140 Clorofilas e clorofilinas E 171 Dióxido de titânio
E 141 Complexos de cobre de E 172* Óxidos e hidróxidos de ferro
clorofilas e clorofilinas
E 142* Verde S E 173* Alumínio
E 150a Caramelo E 174* Prata
E 150b Caramelo sulfito E 175* Ouro
E 150c Caramelo amônia E 80* Litorubina BK
E 150d Caramelo sulfito de amônia
* Corantes artificiais
A seguir (tabela 2), estão descritos os corantes de uso permitido pela

legislação brasileira em alimentos e bebidas, segundo a Resolução vigente nº. 4, de
24 de novembro de 1988 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA,
1988):
16
TABELA 2 - Corantes de uso permitido em alimentos e bebidas pela legislação vigente no Brasil:
Corantes naturais:
Açafrão Clorofila, clorofila cúprica, Urzela:
Ácido carmínico sal de amônio de clorifilina Orceína, orceína sulfonada
Antocianinas cúprica, sal de potássio de Páprica
Cacau clorofilina cúprica, Riboflavina
Carmin sal de sódio de clorofilina Urucum
Carvão vegetal cúprica. Vermelho de beterraba
Carotenóides: Choconilha Xantofilas: cantaxantina,
α, β e γ-caroteno, bixina, Cúrcuma, Curcumina luteína, flavoxantina,
norbixina, capsantina, Hemoglobina criptoxantina, rodoxantina,
capsorubina, licopeno Índigo rubixantina, violaxantina.
Corantes sintéticos idênticos aos naturais:
β -caroteno Riboflavina Xantofilas: Cantaxantina,
Beta-apo-8'-carotenal Riboflavina-5-(Fosfato de luteína, flavoxantina,
Éster etílico do ácido sódio) criptoxantina, rodoxantina,
Beta-apo-8'-carotenóico rubixantina, violaxantina.
Corante caramelo:
Caramelos
Corantes inorgânicos:
Alumínio Dióxido de titânio Ouro
Carbonato de cálcio Óxidos e hidróxidos de ferro Prata
Corantes artificiais:
Amarelo Crepúsculo FCF Eritrosina Tartrazina
Azul brilhante FCF Indigotina Vermelho
Bordeaux S ou amaranto Ponceau 4R
Fonte: ANVISA (1988)
A tabela 2 permite-nos observar o contraste entre o número de corantes

naturais permitidos pela ANVISA em relação ao número restrito de corantes
artificiais. Tem-se prestado atenção especial ao valor potencial de determinados
corantes naturais, especialmente os polifenólicos e carotenóides, dado seu poder
benéfico à saúde. Embora vários pigmentos da família dos carotenóides tenham uso
liberado pela ANVISA e pelas legislações vigentes dos EUA e União Européia, ainda
existe uma ampla gama de carotenóides a serem pesquisados que não então
listados nestas e podem oferecer propriedades vantajosas de estabilidade, custo de
produção, atividade biológica e coloração diferenciada. A produção de carotenóides
a partir de fontes biológicas tem sido uma área de intensiva investigação (AUSICH,
1997). Com o poder da biotecnologia e tecnologia do DNA recombinante, a
capacidade biossintética de organismos para produzir carotenóides pode ser
melhorada (AUSICH, 1997). Neste contexto, busca-se o desenvolvimento de novas
técnicas de cultivo como cultura de células, plantas ou microalgas, em níveis
competitivos; ou ainda técnicas de mutagênese que aumentem a produtividade
destes metabólitos e/ou reduzam sua toxicidade (MAPARI et al., 2005).
17
2.3 CAROTENÓIDES
O termo carotenóides refere-se a uma classe de pigmentos naturais, de

coloração amarela a vermelha, os quais estão amplamente distribuídos nos reinos
animal e vegetal (HUI et al., 2005), sendo reportados e caracterizados mais de 600
variantes estruturais desta família de pigmentos, encontrados em fontes naturais
(AUSICH, 1997). Estes pigmentos são responsáveis por grande variedade de cores
vistas na natureza sendo as mais notáveis o amarelo brilhante, alaranjado e
vermelho das frutas, folhas e animais aquáticos (LORENZ e CYSEWSKI, 2000).
Das várias classes de pigmentos existentes na natureza, os carotenóides
encontram-se entre as mais abundantes e importantes dada a grande diversidade e
a relevância das funções que assumem (LORENZ e CYSEWSKI, 2000), podendo
ser encontrados nas três principais linhas evolutivas archaebacteria, eubacteria e
eukarya (ARMSTRONG e HEARST, 1996). Carotenóides são compostos
isoprenóides (C40H56), constituídos por 8 unidades C5-isopreno e tem um esqueleto
central linear constituído de 22 átomos de carbono e 9 duplas ligações conjugadas e
extremidades finais anelares ou quase anelares com 9 átomos de carbono, em cada
uma (LA FUENTE et al., 2006). Esta estrutura química é responsável pela sua
coloração característica, dado que as duplas ligações absorvem parte do espectro
luminoso que nelas incide (ARMSTRONG e HEARST, 1996). O Espectro UV/VIS
dos carotenóides é de grande importância para as análises, porque proporciona
informação sobre sua estrutura. O espectro é devido à presença de um longo
cromóforo de duplas ligações conjugadas (c.d.b.). Pelo menos 7 c.d.b. são
necessárias para um carotenóide ter uma coloração perceptível. Logo, o espectro de
absorção dos carotenóides depende do número de duplas ligações conjugadas em
sua molécula, assim quanto mais longo o cromóforo, tanto maiores são os
comprimentos de onda de absorção máxima, variando estruturalmente na faixa de
410 a 510 nm (Figura 2) (MELENDEZ-MARTINEZ et al., 2007).
18
Absorbância
2
1,8
1,6
1,4
1,2
0.8
0.6
0.4
0.2
0
350 370 390 410 430 450 470 490 510 530 550
Comprimento de Onda (nm)
FIGURA 2: Espectro de absorção dos carotenóides: astaxantina, β-caroteno e cantaxantina
(Adaptado de FONTANA, 2007).
Esta classe de pigmento compreende duas classes principais, os carotenos e

as xantofilas (Figura 3). Os primeiros são hidrocarbonetos poliênicos cíclicos ou
lineares, enquanto as xantofilas são carotenos com pelo menos um átomo de
oxigênio funcional (como –OH e =O) em sua molécula e representam a grande
maioria dos carotenóides (LA FUENTE et al., 2006; GONZALEZ, 2000).
Carotenos
Xantofilas
FIGURA 3: Exemplos típicos de carotenos e de xantofilas. O segmento linear destacado na estrutura

do β-caroteno corresponde ao esqueleto central de 22 carbonos comum a todos os
carotenos e xantofilas (LA FUENTE et al., 2006).
19
Em decorrência da presença das insaturações, os carotenóides são sensíveis

à luz, temperatura, acidez, bem como reações de oxidação (AMBRÓSIO et al.,
2006). Como regra geral, os carotenóides são lipossolúveis (HUI et al., 2005),
porém, excepcionalmente, adquirem alguma hidrossolubilidade como resultado de
processos oxidativos ou derivatizações naturais como no caso da norbixina do
urucum (ambas as funções carboxilas terminais demetiladas) e dos carotenóides
sulfatados de organismos marinhos (FONTANA et al., 1996).
Embora os carotenóides possuam diferentes propriedades biológicas, exibem
propriedades físico-químicas similares (ARMSTRONG, 1997). As duas funções
biológicas essenciais dos carotenóides em membranas fotossintéticas são absorver
energia solar e exercer proteção contra danos solares. Muitas outras bioatividades
têm sido consideradas em adição as suas propriedades antioxidantes (PALOZZA e
KRINSKY, 1992).
A aquacultura atual associa o termo carotenóides com a coloração
avermelhada da musculatura dos peixes salmonídeos, sendo que esta tonalidade é
considerada um dos mais importantes critérios de qualidade para o filé (LATSCHA,
1990). A taxa de deposição dos carotenóides na musculatura de salmonídeos
depende de um conjunto de fatores, como o tipo de pigmento na ração, densidade
energética da ração, tamanho dos peixes, estado fisiológico, fatores ambientais,
doenças, histórico genético e o período de arraçoamento com o carotenóide
selecionado (TORRISEN, 1995).
2.4 ASTAXANTINA
A astaxantina é um carotenóide de coloração vermelho-alaranjada, do grupo

xantofila, amplamente distribuído na natureza e comumente presente em animais
marinhos (MIAO et al., 2006; KUSDIYANTINI et al., 1998). É um dos principais
pigmentos da família dos carotenóides, conferindo a coloração característica de
alguns pássaros (flamingo e íbis escarlate), crustáceos (camarão e lagosta), peixes
(truta e salmão) e alguns microrganismos (JOHNSON e AN, 1991). É o principal
pigmento carotenóide encontrado em animais aquáticos (GUERIN et al., 2003). Em
muitos dos animais aquáticos nos quais é encontrada, a astaxantina tem várias
funções biológicas, incluindo proteção contra oxidação de ácidos graxos
20
poliinsaturados essenciais, proteção contra efeitos da luz UV e aumento da resposta

imunológica (LORENZ e CYSEWSKI, 2000).
Seu nome deriva do gênero de caranguejo Astacus astacus e, quimicamente,
é conhecida como 3,3'dihidroxi-β,β-caroteno-4,4'-diona, a qual é uma molécula que
apresenta 40 átomos de carbono (C40H52O4), com duas funções álcool e duas
cetonas em sua configuração (RENSTROM et al., 1981). A presença de finais
hidroxila e cetona em cada anel ionona explica algumas características únicas, como
a possibilidade de ser esterificada, seu elevado poder antioxidante e configuração
mais polar que outros carotenóides (GUERIN et al., 2003).
Na forma pura e cristalina, aparece como um pó fino de coloração escura
violeta-amarronzada, com peso molecular de 596.9 daltons e ponto de fusão de
aproximadamente 224ºC (RENSTROM et al., 1981). É insolúvel em água, podendo
ser dissolvida à temperatura ambiente em diclorometano (~ 30g/L), clorofórmio (~
10g/L), acetona (~ 0.2g/L), dimetilsulfóxido (~ 0.5g/L) e outros solventes não polares.
Seu espectro de absorção representa um polieno conjugado, com λmáx de 485nm em
clorofórmio, 479nm em etanol e 480nm em acetona (JOHNSON e AN, 1991).
A astaxantina é um composto opticamente ativo (VISSER et al., 2003). A
molécula de astaxantina tem dois carbonos assimétricos localizados nas posições 3
e 3` dos anéis nas extremidades da molécula (LORENZ e CYSEWSKI, 2000).
3S, 3`S
(3R, 3`S) meso
3R, 3`R
FIGURA 4: Fórmulas estruturais da astaxantina – estereoisômeros (STEPNOWSKI et al., 2004).

21
Conforme pode ser visualizado na figura 4, diferentes enantiômeros da

molécula resultam da forma em que os grupos hidroxila são ligados aos átomos de
carbono assimétricos. Quando o grupo hidroxila está acima do plano da molécula,
denomina-se “configuração R” e quando o grupo hidroxila está abaixo desse plano, é
denominado “configuração S”. Assim, os três enantiômeros possíveis são: 3R,3R`;
3S,3Sè 3R,3S (LORENZ e CYSEWSKI, 2000). No reino vegetal, freqüentemente se
encontram os isômeros 3S,3S'. (RENSTROM et al., 1981). A forma livre pode estar
esterificada por ácidos graxos, formando monoésteres e/ou diésteres de astaxantina,
ou pode estar associada a proteínas (carotenoproteína), como na musculatura do
salmão, exoesqueleto de lagostas (LORENZ e CYSEWSKI, 2000; GUERIN et al.,
2003; GONZALEZ, 2000) ou modificando sua coloração vermelha, como na
carapaça dos crustáceos, a qual adquire uma coloração verde, azul ou cinza
(HOISCHEM et al., 1998). A astaxantina também pode dar origem a hidrocarbonetos
como conseqüência da perda das funções oxigenadas e levar a geração de
moléculas estáveis, que são encontradas nos sedimentos fósseis (GONZALEZ,
2000).
A astaxantina na sua forma livre é instável e extremamente sensível em
relação aos fatores como luz, oxigênio, acidez e calor (GUERIN et al., 2003). Nestas
condições, são muito suscetíveis a uma variedade de conversões oxidativas,
processos degradativos, ou são isomerizados e este tipo de modificação química
altera a absorção de luz e, consequentemente a intensidade da coloração
(LATSCHA, 1990; STOREBAKKEN et al., 2004). Quando esterificada com um ou
dois ácidos graxos, esses estabilizam a molécula (GUERIN et al., 2003; LORENZ e
CYSEWSKI, 2000).
A astaxantina é um tetraterpenóide (JOHNSON e AN, 1991), formada pela via
do ácido mevalônico, através do acetato proveniente da fotossíntese e/ou da
respiração (GOODWIN, 1980). A via se inicia no Acetil-CoA e procede via malonato
a isopentenil pirofosfato (IPP), precursor geral de todos os isoprenóides (ANDREWS
et al., 1976; VISSER et al., 2003). Subsequentemente, 8 moléculas de IPP são
condensadas para formar o carotenóide incolor fitoeno. Através de quatro
desidrogenações e duas reações de ciclização, o fitoeno é convertido em β-
caroteno. Finalmente, o β-caroteno é oxidado para produzir astaxantina (ANDREWS
et al., 1976; RISE et al., 1994). Esta via é conhecida como caminho isoprenóide,
devido à presença dos precursores isoprenóides, especialmente o ácido mevalônico
22
(MVA) e o isopentenil difosfato, sendo responsável também pela síntese de várias

moléculas lipossolúveis como esteróis (ex. colesterol e ácidos biliares), hormônios
esteróides (ex. estrógeno, cortisol, aldosterona), prostaglandinas e vitaminas D, K e
E (LORENZ e CYSEWSKI, 2000). A astaxantina é conhecida como um
cetocarotenóide oxidado do betacaroteno (YUAN e CHEN, 1998).
A ordem destas reações e os produtos intermediários na biossíntese de
astaxantina são diferentes para vários microrganismos produtores de astaxantina
(YUAN et al., 2002). Os possíveis intermediários no caminho biossintético da
astaxantina são betacaroteno, echinenona, β-criptoxantina, cantaxantina,
zeaxantina, 3-hidroxi-equinenona, 3`-hidroxi-equinenona, adonirubina e adonixantina
(FRASER et al., 1997; YOKOYAMA e MIKI, 1995 apud YUAN et al., 2002). Na
microalga Haematococcus pluvialis, a astaxantina é sintetizada a partir do
betacaroteno através da hidroxi-equinenona ou da cantaxantina (SHOEFS et al.,
2001). Na levedura Xanthophyllomyces dendrorhous, a astaxantina é produzida a
partir do betacaroteno via echinenona, 3-hidroxi-equinenona e adonirubina
(ANDREWES et al., 1976; JOHNSON e AN, 1991). Na produção de astaxantina pela
Agrobacterium auratiacum, o caminho biossintético é controlado pelas condições de
cultura, especialmente oxigênio dissolvido no meio (YOKOYAMA e MIKI, 1995, apud
YUAN et al., 2002).
2.4.1 Interesse Comercial da Astaxantina
Este carotenóide tem elevado interesse científico e comercial, devido ao

aumento da demanda por pigmentos naturais e o seu alto valor no mercado mundial,
estimado em, aproximadamente, US$ 2500/kg (JEON et al., 2006; DONG e ZHAO,
2004), tendo grandes perspectivas de aplicação em indústrias farmacêuticas,
cosmética, alimentícia e de ração animal (GUERIN et al., 2003).
23
Figura 5: Mercado CEE de astaxantina (Fonte: FUENTE, 2006).
No entanto, atualmente, o maior consumo de astaxantina é na indústria de

rações para aquacultura, como fonte de pigmentação para crustáceos e peixes,
principalmente salmão e truta (OLAIZOLA, 2003; VISSER et al., 2003), fornecendo
uma pigmentação atrativa em seus ovos, carne e escama (LORENZ e CYSEWSKI,
2000; JOHNSON e AN, 1991).
Devido alguns destes animais marinhos (salmão, camarão e lagosta) serem
incapazes de sintetizar astaxantina, pigmentos carotenóides devem ser
suplementados em sua dieta para obter a coloração desejada, de melhor aceitação
do consumidor (JOHNSON e AN, 1991; OROSA et al., 2005; VISSER et al., 2003;
GUERIN et al., 2003). No meio ambiente marinho, a astaxantina é biossintetizada na
cadeia alimentar, por microalgas ou fitoplanctons, como nível primário de produção.
Microalgas são consumidas pelos zooplancton, insetos ou crustáceos que acumulam
a astaxantina e que, por sua vez, são ingeridos subsequentemente pelos peixes
(LORENZ e CYSEWSKI, 2000).
No início da década de 60, utilizavam-se subprodutos da indústria
camaroneira como fonte de astaxantina natural, porém para se obter uma coloração
satisfatória a partir desses ingredientes, para salmonídeos, a ração passou a
necessitar de uma taxa de inclusão na ordem de 10 a 25%. Como esses
subprodutos contêm elevados teores de umidade e matéria inorgânica os níveis de
inclusão não foram práticos e nem efetivos em termos de custos. No início da
década de 80, a cantaxantina sintética tornou-se a fonte predominante de
24
carotenóides utilizada na alimentação destes peixes, sendo substituída nos dias

atuais pela astaxantina (APTA - SAA, 2007) devido a estudos que demonstram a
superioridade desta como agente pigmentante que se deposita de maneira mais
eficiente, além de ser o pigmento encontrado naturalmente nos salmonídeos
(JOHNSON e AN, 1991).
O uso da astaxantina em aquacultura tem amplas funções, incluindo:
antioxidante, precursor hormonal, melhora da imunidade, atividade de pró-vitamina
A, reprodução, crescimento, maturação e fotoproteção (BASF, 2006; LORENZ e
CYSEWSKI, 2000).
Em 1990 as características antioxidantes da molécula de astaxantina
tornaram-se bem estabelecidas (OLAIZOLA, 2003; SCHROEDER e JOHNSON
1995). Vários estudos in vitro e em animais modelo demonstraram numerosas
funções da astaxantina no tratamento e prevenção de doenças (GUERIN et al.,
2003; MAHMOUD et al., 2004). Isto tem aberto a possibilidade de um novo mercado
para a astaxantina nas indústrias farmacêuticas e de alimentos (MIAO et al., 2006;
HUI et al., 2005) e estudos em medicina (JOHNSON e AN, 1991; LORENZ e
CYSEWSKI, 2000).
Há um aumento na quantidade de evidências sugerindo que devido à sua
estrutura, a astaxantina é um eliminador de oxigênio singlete (1O2) e radicais peroxil
(H2O2) mais potente que o betacaroteno, cantaxantina e zeaxantina (PALOZZA e
KRINSKY, 1992, BASF, 2006) e excede os benefícios antioxidantes das vitaminas C
e E (LORENZ e CYSEWSKI, 2000; BASF, 2006, PALOZZA e KRINSKY, 1992). É
relatado que a astaxantina possui poder antioxidante, aproximadamente 10 vezes
maior que outros carotenóides, inclusive o betacaroteno e mais de 500 vezes maior
que o α-tocoferol (SUH et al., 2006).
Radicais livres, como os radicais hidroxila e peroxil e formas altamente
reativas do oxigênio (ex. oxigênio singlete) são produzidos no corpo durante reações
metabólicas normais (GUERIN et al., 2003). Danos oxidativos têm sido ligados ao
envelhecimento, aterogênese, lesão por isquemia-reperfusão, retinopatia infantil,
degeneração macular relacionada à idade e carcinogênese (PAPAS, 1999, apud
GUERIN et al., 2003; SCHROEDER e JOHNSON 1995). Os carotenóides como
potentes antioxidantes biológicos, são capazes de absorver a energia de excitação
do oxigênio singlete em sua estrutura, ocorrendo a degradação da molécula de
25
carotenóide e, consequentemente, prevenindo que outras moléculas ou tecidos

sejam danificados (SKIBSTED et al., 2006, CHONG et al., 2007).
Dentre as funções biológicas da astaxantina e seus benefícios à saúde
humana, são relatados: proteção da pele contra danos por foto-oxidação com
radiação ultravioleta (MIAO et al., 2006; LYONS e O`BRIEN, 2002), prevenção
contra o envelhecimento precoce e doenças relacionadas à idade (GUERIN et al.,
2003; CARLOS e JOHNSON, 2004), prevenção e/ou retardo de doenças
degenerativas como a arteriosclerose e neurodegenerativas como Alzheimer`s,
Parkinson`s, Huntington`s (SCHROEDER e JOHNSON 1995; GUERIN et al., 2003;
KAMATH et al., 2005); melhora da resposta imune em animais e humanos
modulando o sistema imune humoral e não humoral, aumentando a produção de
imunoglobulinas A, M e G e do anticorpo celular T-helper (CHEN et al., 2006, MIAO
et al., 2006; MAHMOUD et al., 2004); melhora da função hepática (GUERIN et al.,
2003), proteção contra cânceres induzidos quimicamente e aumento das
lipoproteínas de alta-densidade (HDL) (MIAO et al., 2006; LORENZ e CYSEWSKI,
2000) e conseqüente melhora da função cardíaca (GUERIN et al., 2003).
Estudos epidemiológicos têm demonstrado correlação entre a ingestão
aumentada de carotenóide e redução da incidência de doenças coronarianas no
coração, degeneração macular e certos cânceres, aumento da resistência viral,
bacteriana e fúngica e infecções parasitárias (MAHMOUD et al., 2004, MIAO et al.,
2006; CHONG et al., 2007). Os efeitos anti-carcinogênicos da astaxantina têm sido
atribuídos ao efeito antioxidante, uma vez que, radicais livres estão relacionados
com processo de iniciação e propagação do câncer (BAKER e GÜNTHER, 2004).
2.4.2 Astaxantina Natural x Astaxantina Sintética
A astaxantina pode ser produzida por síntese química ou biotecnológica (HU

et al., 2006). Tradicionalmente, a produção em escala industrial de astaxantina tem
sido realizada principalmente por síntese química (BOUSSIBA et al., 2000,
OLAIZOLA, 2003; YAMANE et al., 1997), porém a forma sintética é cara (>US$
3,000 / kg) e pode conter astaxantina com configuração diferente da natural
(BOUSSIBA et al., 2000). Os maiores produtores de astaxantina, atualmente, são
BASF e Hoffman-La Roche (KUSDIYANTINI et al., 1998; OLAIZOLA, 2003)
dominando 80% do mercado mundial (JOHNSON e AN, 1991). Porém, segundo a
26
indústria química BASF (BASF, 2006) o processo de síntese da astaxantina é um

dos mais complexos e longos da empresa, possuindo 14 passos.
A produção biotecnológica de carotenóides como a astaxantina é um campo
de pesquisa de grande interesse, devido seu alto valor de mercado e o crescimento
da demanda por produtos naturais (HUI et al., 2005). Apesar de mais de 95% do
mercado de aquacultura consumir derivados sintéticos da astaxantina, o aumento da
demanda de consumo por produtos naturais faz com que os pigmentos sintéticos
sejam menos desejáveis e proporciona uma oportunidade para a produção de
astaxantina natural (LORENZ e CYSEWSKI, 2000). Além disso, nos últimos anos, o
uso de compostos químicos sintéticos como aditivo alimentar tem sido estritamente
regulado (YAMANE et al., 1997) sendo a fonte natural de astaxantina preferível pela
sua segura utilização como aditivo alimentar (KUSDIYANTINI et al., 1998).
Segundo a figura 6, algumas empresas, como a Cyanotech e a Aquasearch,
produzem astaxantina natural utilizando a microalga Haematococcus pluvialis.
Outras com a Archer Daniels Midland, produzem astaxantina natural utilizando a
levedura Xanthophyllomyces dendrorhous. Entretanto empresas como a Cyanotech
e Igene apresentam uma produção mensal de astaxantina muito baixa (em torno de
75Kg e 60Kg, respectivamente) quando comparada à Roche (6 toneladas). A baixa
produção e elevado custos de processo tornam difícil sua inserção no mercado
mundial (McCOY, 1999).
Síntese Química
Carophyll pink ®Lucantin Pink®
Síntese Biotecnológica
Haematococus pluvialis
Aquasand ®
Carophyll red and yellow ®
X. dendrorhous: Natuphill pink®
X. dendrorhous: Astanat®
FIGURA 6: Principais Produtores de Astaxantina (Adaptado de FUENTE, 2006).

27
Segundo Ausich (1997), as vantagens na síntese química de carotenóides

são a produção de carotenóides de excepcional pureza e uniformidade, além do
custo total de produção destes carotenóides ser relativamente baixo. Porém, há
desvantagens como a complexidade de síntese de certos carotenóides e a
necessidade de desenvolver um novo processo químico para cada carotenóide que
se deseja sintetizar. Além disso, a síntese química produz misturas de
estereoisômeros, alguns dos quais podem não ser encontrados na natureza, não ser
ativos como os isômeros de ocorrência natural, não ser desejados pelo publico
consumidor ou, ainda, podem ter efeitos indesejados (AUSICH, 1997; LIM et al.,
2002; GONG e CHEN, 1998). Segundo Lim et al. (2001) a forma de astaxantina
produzida quimicamente possui estabilidade e atividade menor que aquelas
produzidas por fontes naturais.
A produção de astaxantina de fontes naturais é uma potencial alternativa para
substituir a astaxantina sintética (HUI et al., 2005). Segundo Ausich (1997) a síntese
biológica, apresenta algumas vantagens, como extensa capacidade biossintética dos
microrganismos e, devido às características da biossíntese de carotenóides, o
conhecimento da biossíntese de um carotenóide é aplicável a outros carotenóides.
Com a produção biotecnológica, apenas os estereoisômeros de ocorrência natural
são produzidos (OLAIZOLA, 2003; AUSICH 1997). Finalmente, todas as ferramentas
modernas de bioprocesso e tecnologia do DNA recombinante podem ser usadas
para desenvolver sistemas para produção de carotenóides com melhores
rendimentos (LORENZ e CYSEWSKI, 2000; AUSICH 1997). No entanto, dentre as
desvantagens, estão a produção, freqüentemente, de misturas de diferentes
carotenóides nos sistemas biológicos, requerendo processamento e purificação, que
aumentam o custo do processo. Em muitos casos a tecnologia é nova e requer
considerável pesquisa para melhorar o sistema e, finalmente, o custo total de
produção atualmente é maior que o processo de síntese química (AUSICH 1997).
No entanto, a fonte natural de astaxantina é preferível pela sua segura utilização
como aditivo alimentar (KUSDIYANTINI et al., 1998).
2.5 MICRORGANISMOS PRODUTORES DE ASTAXANTINA
A astaxantina foi primeiramente isolada e identificada em lagostas em 1938 e

muitos estudos têm sido realizados para extrair astaxantina de diversas fontes
28
biológicas (LIM et al., 2002). Fontes naturais importantes na obtenção de

astaxantina são os crustáceos (principalmente o camarão Padalus borealis e os
microcrutáceos Euphanasia pacifica e Euphanasia superba) e alguns
microrganismos (JOHNSON e AN, 1991).
Uma grande variedade de microrganismos é capaz de sintetizar astaxantina,
como as microalgas Haematococcus pluvialis, Chlorella zofingiensis e Chlorococcum
sp., as leveduras Xanthophyllomyces dendrorhous e Candida utilis e algumas
bactérias como Agrobacterium aurantiacum, Halobacterium salinarum,
Mycobacterium lacticola e Brevibacterium spp. (ANDREWES et al., 1976; CALO,
1995; YOKOYAMA e MIKI., 1995; MIAO et al., 2006; IP e CHEN, 2005, JOHNSON e
AN, 1991; RISE et al., 1994; LIU e LEE, 2000; YUAN et al.,2002; ATCC, 2006). É
provável que existam na natureza outros microrganismos, além dos já conhecidos,
que produzam astaxantina, especialmente em ambientes com condições adversas,
uma vez que os carotenóides apresentam a capacidade de proteger microrganismos
heterotróficos contra a luz e radicais oxigenados (JOHNSON e AN, 1991).
TABELA 3 - Fontes naturais de astaxantina (Fonte: AlgaTechnologies, 2007)

Fontes Concentração de
Astaxantina (ppm)
Salmonídeos ~5
Plânctons ~ 60
Eufasídeos ~ 120
Camarões árticos ~ 1200
Xanthophyllomyces dendrorhous ~ 8000
Haematococcus pluvialis ~ 40,000
Dentre os microrganismos citados, a levedura Xanthophyllomyces

dendrorhous e a microalga Haematococcus pluvialis têm sido os principais
microrganismos usados na produção de astaxantina natural e atraído atenção em
todo o mundo como as fontes mais promissoras na produção industrial de
astaxantina biotecnologicamente (DONG e ZHAO, 2004, AR et al., 2007). A levedura
X. dendrorhous produz uma concentração de astaxantina consideravelmente menor
que a microalga H. pluvialis, no entanto essa tem como vantagem uma rápida
velocidade de propagação podendo proporcionar um bom rendimento de produção
de astaxantina (JOHNSON e AN, 1991). Segundo um estudo realizado por Passos
et al., 2007, a microalga H. pluvialis revelou maior conteúdo de carotenóides totais,
enquanto a levedura X. dendrorhous, apesar de um menor conteúdo de pigmentos
29
totais, apresentou a maior relação entre a concentração de astaxantina livre e o

conteúdo de carotenóides totais. Contudo, segundo AR et al., (2007) em relação à
produtividade de astaxantina, o máximo reportado foi 150 µg.g-1.dia-1 com uma cepa
selvagem de X. dendrorhous e 340 µg.g-1.dia-1 com a cepa mutante e, no caso do H.
pluvialis, os valores máximos foram de 290 a 488 µg.g-1.dia-1, dependendo das
condições de cultivo (AR et al., 2007).
Além disso, a astaxantina existe principalmente como astaxantina livre na
levedura X. dendrorhous (PARAJÓ et al., 1998) e éster de astaxantina na microalga
H. pluvialis (JOHNSON e AN, 1991). Assim a levedura X. dendrorhous é mais
apropriada para preparação de trans-astaxantina purificada, julgando-se pelo estado
da astaxantina, que a alga H. pluvialis, mas seu conteúdo de astaxantina é menor
que na alga e para preparação de trans-astaxantina purificada a partir de
microrganismos é necessário escolher uma espécie que produza grande quantidade
de astaxantina (YUAN e CHEN, 2000). Logo estes dois microrganismos têm muito a
ser desvendado para obter-se as ótimas condições de crescimento e produtividade
de astaxantina aproveitando-se ao máximo o seu potencial.
2.5.1 Xanthophyllomyces dendrorhous
A levedura vermelha X. dendrorhous tem sido extensivamente estudada

(AUSICH, 1997), sendo uma fonte potencial na produção de astaxantina
(STOREBAKKEN et al., 2004; ANDREWES et al., 1976).
O estado anamorfo (ou imperfeito) da levedura X. dendrorhous foi isolado,
contendo astaxantina, no final dos anos 60, a partir de exudatos ricos em açúcar de
árvores decíduas em regiões montanhosas do Japão e Alaska por Herman Jan Phaff
e colaboradores (PHAFF et al., 1972). Esta foi originalmente chamada “Dendrorhous
montanae” (PHAFF et al., 1972), mas como este nome não atendia as exigências do
Código de Nomenclatura Botânica, o gênero foi posteriormente mudado para Phaffia
em homenagem aos diversos anos que Herman Jan Phaff dedicou-se a pesquisa de
leveduras (JOHNSON e AN, 1991).
Phaff e colaboradores pesquisaram o estado teleomórfico (ou estado
perfeito) desta levedura por muitos anos, mas não tiveram sucesso até 1995,
quando Golubev (1995) reportou o estado perfeito em certas cepas e chamou o
teleomorfo de Xanthophyllomyces dendrorhous. Embora seja comumente assumido
30
que todas as cepas desta levedura poderiam ser designadas X. dendrorhous, Fell et
al., (1999) observaram que este grupo de leveduras é muito mais complexo e que
provavelmente existem várias linhagens filogenéticas (FELL et al., 1999).
A figura 7 mostra a morfologia do X. dendrorhous em estado imperfeito ou
assexuado (chamado Phaffia rhodozyma). Esta levedura reproduz-se
assexuadamente em ótimas condições de crescimento enquanto, em condições
desfavoráveis (limitação de nitrogênio, baixas temperaturas, presença de poliálcoois
e deficiência de água) estimula a reprodução sexuada (estado teleomorfo ou
perfeito, chamado X. dendrorhous) figura 8 (CARLOS e JOHNSON, 2004).
FIGURA 7: Células de X. dendrorhous em estado anamorfo (chamado Phaffia rhodozyma) (American

Society for microbiology, 2007).
FIGURA 8: Indução do estado teleomorfo do X. dendrorhous (American Society for microbiology,

2007).
Os critérios usados na identificação desta levedura como basidiomiceto

incluem sua habilidade de sintetizar carotenóides, propriedades metabólicas como a
habilidade de usar uréia, a qual é menos comum em leveduras ascomicetos, a
estrutura de sua parede celular e a forma de brotamento. As evidências mais
conclusivas de sua origem filogenética é a parede celular multicamadas e de
brotamento heteroblástico (JOHNSON e AN, 1991), a qual é característica de
heterobasidiomicetos (AN et al., 1989). Além disso, esta relação é suportada pela
composição de carboidratos presentes na parede celular (JOHNSON e AN, 1991).
31
Outras propriedades incluem a capacidade de assimilar compostos carbonados,

incluindo diversos mono, di e polissacarídeos. Além disso, cresce entre as
temperaturas de 0ºC a 27ºC (JOHNSON e AN, 1991).
FIGURA 9: X. dendrorhous produzindo astaxantina. Ampliação 1000X. (Fonte: FUENTE, 2006).
A levedura X. dendrorhous possui algumas propriedades vantajosas: produz

astaxantina naturalmente (AUSICH, 1997) e sintetizam astaxantina como
carotenóide principal (ANDREWES et al., 1976; VISSER et al., 2003), não requer luz
para seu crescimento e pigmentação, pode utilizar vários tipos de sacarídeos, sob
condições aeróbias e anaeróbicas e pode crescer em uma velocidade de 0,10 a 0,15
h-1 (ANDREWES et al., 1976; JOHNSON e LEWIS, 1979).
A concentração de astaxantina presente em isolados naturais de
Xanthophyllomyces dendrorhous geralmente está entre 300 - 450µg/g de biomassa
seca (AN et al., 1989), sendo que a análise por HPLC em coluna de sílica gel indicou
que a astaxantina compreende 65-95% dos carotenóides totais desta levedura
(SEDMAK et al., 1990) e é uma fonte natural do isômero 3R,3`R da astaxantina não-
esterificada (ANDREWS et al.,1976), enquanto a maioria dos organismos
conhecidos produtores de astaxantina sintetizam o isômero (3S,3`S) (ANDREWS e
STARR, 1976).
A X. dendrorhous tem grande valor comercial como fonte alimentar de
astaxantina natural, porém o nível de astaxantina tem que ser aumentado para
tornar-se competitiva com a síntese industrial química (SCHOROEDER e
JOHNSON, 1995), uma vez que o alto custo de produção limita o uso desta levedura
(RAMÍREZ et al., 2001) e isolados naturais de X. dendrorhous tem uma baixa
concentração de astaxantina (KUSDIYANTINI et al., 1998).
32
Muitas pesquisas têm sido realizadas visando desenvolver um processo de

fermentação eficiente da X. dendrorhous para produção de astaxantina para
produção comercial (VISSER et al., 2003; LIU et al., 2006). A produção microbiana
deste pigmento pode ser melhorada através de estratégias isoladas ou combinadas
(FONTANA et al., 1996). Protocolos de cultivo têm sido otimizados para o
melhoramento do processo de diversas formas: otimização do meio de cultura
(VISSER et al., 2003; YAMANE et al., 1997), condições de fermentação (HU et al.,
2006; YAMANE et al., 1997) e o uso de substratos mais baratos (FONTANA et al.,
1996; PARAJO et al., 1998). O uso de precursores e estimulantes químicos como o
ácido mevalônico, etanol, licopeno e ácido acético também poderiam melhorar a
produção de astaxantina em X. dendrorhous (CALO et al., 1995; MEYER e DU
PREEZ, 1993), mas pode acarretar alto custo para uso em larga escala de produção
de astaxantina (AN et al., 1989).
Artifícios de engenharia genética ou metabólica, bem como mutagênese
também podem ser usados, podendo aumentar a produção de astaxantina em pelo
menos 6 vezes comparado às linhagens selvagens (AN et al., 1989, LEE et al.,
2004). Os genes para a biossíntese de astaxantina têm sido elucidados e métodos
estão sendo desenvolvidos para melhorar a manipulação genética da X.
dendrorhous, obtendo-se cepas hiper-produtoras de astaxantina por técnicas
clássicas de mutação e “screening” (LEE et al., 2004; AN et al., 1989; VISSER et al.,
2003). O melhoramento genético destas cepas pode ser realizado de diferentes
maneiras diferentes: mutagênese, recombinação de mutantes (por exemplo, fusão e
protoplastos), clonagem e amplificação e genes (JOHNSON e AN, 1991).
No entanto, a instabilidade genética é o maior problema do uso de
mutagênese para criar cepas mutantes hiperprodutoras de carotenóides (VISSER et
al., 2003; PARAJÓ et al., 1998), mostrando alta freqüência de reversão (20 – 40%)
(AN et al., 1989). Apesar deste problema, alguns grupos de pesquisa têm isolado
com sucesso cepas mutantes estáveis de X. dendrorhous com aumento na
biossíntese de astaxantina (AN et al., 1989). No entanto, a maioria das cepas
mutantes estáveis mostraram uma redução na velocidade de crescimento e/ou
produção de biomassa (VISSER et al., 2003).
Cepas de X. dendrorhous com alta capacidade de produção de astaxantina,
combinadas a condições de cultivo otimizadas para alta produção de astaxantina
são usadas em indústrias, no entanto, detalhes destas cepas e processo de
33
fermentação são sigilosos devido à competição industrial no mercado de

carotenóides. Todavia, cepas mutantes estáveis de X. dendrorhous que produzem
3000 a 4000µg/g peso seco de levedura tem sido reportado produzir
economicamente astaxantina em produção comercial com volume de trabalho de
pelo menos 1500L (VISSER et al., 2003).
Uma outra estratégia que tem sido citada em alguns trabalhos para melhorar
a produção de astaxantina por X. dendrorhous, é a estimulação por extratos de
outros organismos no meio de produção (CARLOS e JOHNSON, 2004). Carlos e
Johnson (2004) observaram que um contaminante fúngico, denominado Epicoccum
nigrum, na placa de X. dendrorhous estimulou consideravelmente a produção de
astaxantina em várias cepas desta levedura, no entanto o mecanismo pelo qual este
contaminante estimulou a biossíntese de carotenóide em X. dendrorhous é
desconhecido. Carlos e Johnson (2004) sugerem uma nova função da astaxantina,
de proteção da X. dendrorhous contra compostos oxidantes produzidos por
atividades metabólicas de patógenos de plantas como E. nigrum e alguns fungos de
madeira podre, podendo estimular a produção de astaxantina.
2.5.2 Haematococcus pluvialis
As microalgas são um grupo extremamente heterogêneo de organismos

(OLAIZOLA, 2003) e constituem-se em um dos mais eficientes sistemas biológicos
de transformação de energia solar em compostos orgânicos, através da
fotossíntese. Dado que apresentam uma distribuição global, podendo ser cultivadas
nos mais inóspitos locais, tais como lagos salinos adjacentes a desertos ou nos
mares Ártico e Antártico, elas possuem um enorme potencial de aproveitamento,
quer como fontes de alimento, quer como reservatórios dos mais diversos
compostos químicos de interesse. Como qualquer outro microrganismo, as
microalgas reagem a variações do meio exterior com alterações do seu meio
intracelular (HENRIQUES et al., 1998). A grande diversidade de microalgas e suas
características fisiológicas tornam este grupo uma fonte potencialmente rica de
produtos químicos, com aplicação nas indústrias de alimentos, cosméticos e
farmacêutica (OLAIZOLA, 2003) uma vez que, a manipulação de condições de
cultivo, notadamente a presença ou ausência de determinados nutrientes, estimula a
biossíntese de compostos que vão desde enzimas a fármacos e antioxidantes
34
naturais, alguns de elevado valor comercial (HENRIQUES et al., 1998). Além disso,
cultivos de algas são um meio de seqüestrar dióxido de carbono, purificação de
efluentes e produção de biocombustível (LORENZ e CYSEWSKI, 2000; DONG e
ZHAO, 2004).
Há mais de 10 mil espécies de microalgas reconhecidas, porém, poucas são
comercialmente cultivadas: as principais são Spirulina, Chorella, Dunaliella e
Haematococcus (DONG e ZHAO, 2004). As duas primeiras espécies são usadas
para suplementação alimentar, enquanto as duas últimas pelo seu conteúdo
pigmentar, betacaroteno e astaxantina (OLAIZOLA, 2003). Como resultado do alto
custo de produção, os produtos comerciais obtidos a partir de microalgas podem
chegar a altos preços (LORENZ e CYSEWSKI, 2000).
A microalga Haematococcus pluvialis tem recebido aumentado interesse
como uma fonte promissora para produção de astaxantina (SUH et al., 2006,
GARCIA-MALEA et al., 2006). O cultivo de H. pluvialis, tanto em laboratório quanto
em escala comercial, tem recebido muita atenção (CIFUENTES et al., 2003). A
produção comercial de astaxantina utilizando microalgas está obtendo sucesso em
algumas indústrias (LORENZ e CYSEWSKI, 2000) destacando-se, neste campo, a
microalga Haematococcus pluvialis, devido seu elevado poder carotenogênico.
O Haematococcus pluvialis é uma microalga verde (Chlorophyta), móvel,
unicelular, fotossintética e capaz de sintetizar e acumular o pigmento astaxantina em
resposta às condições ambientais (DONG e ZHAO, 2004). Seu habitat natural
característico são cavidades rochosas periodicamente preenchidas com água da
chuva. Este habitat natural é típico em banhos de pássaros, outros ornamentos de
jardim e recipientes contendo água da chuva (Figuras 10 e 11). Pode ser encontrada
também em piscinas rochosas, mas é pouco tolerante a altas salinidades.
Ocasionalmente, o H. pluvialis aparece em grande quantidade em rios ou às
margens de lagos, quando a seca expõe grandes áreas de rochas ricas em fissuras
(CANTER-LUND e LUND, 1995).
Esta alga, tanto em seu habitat natural ou artificial muitas vezes tem que
resistir a variáveis e freqüentes condições ambientais extremas (CANTER-LUND e
LUND, 1995). Quando as condições ambientais tornam-se adversas, como escassez
de nutrientes, ou as piscinas rochosas começam a secar e aumenta a exposição à
radiação solar, o H. pluvialis entra em fase de resistência com formação de cistos,
que o permite sobreviver por longos períodos, até que as condições voltem a ser
35
favoráveis (Mera Pharmaceuticals, 2007). Em seguida, quando as condições

tornam-se favoráveis novamente, os cistos retornam à forma vegetativa verde
FIGURA 10: Banho de pássaros seco apresentando FIGURA 11: Banho de pássaros contendo
coloração por cistos de Haematococcus, no Reino Unido cistos de H. pluvialis. (Fonte: The Freshwater
(CANTER-LUND e LUND, 1995). Algal Flora of the British Isles ,2002)
O H. pluvialis é capaz de acumular uma quantidade superior de astaxantina

comparado a outras fontes naturais (BOUSSIBA et al., 2000) uma vez que é capaz
de acumular em torno de 1,5 a 6,0% p/p de astaxantina em relação ao seu peso
seco, cultivada em escala industrial (LORENZ e CYSEWSKI, 2000; KAMATH et al.,
2005; BOUSSIBA et al., 2000). No H. pluvialis a forma esterificada é predominante,
principalmente como astaxantina monoéster (LORENZ e CYSEWSKI, 2000). A
astaxantina padrão do Haematococcus pluvialis é aproximadamente 70 %
monoésteres, 25% diésteres e 5% livre (LORENZ e CYSEWSKI, 2000). O 3S,3`S
estereoisômero é a principal forma encontrada em H. pluvialis (TURUJMAN et al.,
1997). As células vegetativas possuem mais clorofila (a e b) e menos carotenóides,
no entanto, quando exposta a condições de stress, o organismo acumula
carotenóide no citoplasma e simultaneamente o conteúdo de clorofila total diminui
drasticamente (KAMATH et al., 2005). Dentre os carotenóides produzidos, a
astaxantina compreende 85-88% do conteúdo de carotenóides totais no H. pluvialis
(KAMATH et al., 2005) e outros cetocarotenóides como a cantaxantina, echinenona,
adonirubina e betacaroteno representam apenas uma pequena porcentagem do
conteúdo total de carotenóides nas células encistadas (GRUNG et al., 1992;
TSAVALOS et al., 1992 apud HARKER et al., 1996). Na alga H. pluvialis a
36
astaxantina existe principalmente como éster formado por combinação de vários

ácidos graxos com diferentes isômeros de astaxantina, no entanto a composição é
diferente para as diferentes cepas de H. pluvialis (YUAN e CHEN, 2000).
TABELA 4 - Porcentagem de clorofila e astaxantina em diferentes fases

morfológicas das células de H. pluvialis (adaptado de LABABPOUR e LEE, 2006).
Clorofila Total Astaxantina
Células vegetativas verdes 15,96 0,06
Aplanosporos 5,14 0,19
Cistos vermelhos 0,03 36,56
Esta alga, no entanto, possui algumas características desfavoráveis quando

comparada a outras microalgas cultivadas com êxito em escala comercial (como a
Dunaliella spp., Spirulina spp.) (CIFUENTES et al., 2003). A maior preocupação é
relacionada à sua lenta velocidade de crescimento, seu complexo ciclo de vida
(JEON et al., 2006; GARCÍA-MALEA et al., 2006; CIFUENTES et al., 2003) e ao
pouco entendimento das condições ótimas para crescimento e produção de
astaxantina (CIFUENTES et al., 2003) restringindo o uso comercial desta alga (SUH
et al., 2006). Por isso, muitas pesquisas têm buscado melhorar a baixa velocidade
de crescimento das células vegetativas móveis: 0,5 – 0,7div/dia (FAN et al., 1994;
GONG e CHEN, 1998; OROSA et al., 2005), excepcionalmente 0,9 div/dia (HAGEN
et al., 1993).
O acúmulo de astaxantina pela microalga verde explica um fenômeno natural
conhecido por “neve vermelha” ou “chuva de sangue” (SHOEFS et al., 2001,
CANTER-LUND e LUND, 1995). É uma característica comum a síntese de
carotenóides secundários em microalgas quando submetidas a stress (SHOEFS et
al., 2001). Normalmente várias condições de stress são combinadas para aumentar
a produção secundária de carotenóide (BOUSSIBA et al., 2000). O acúmulo de
astaxantina está relacionado a mudanças morfológicas e bioquímicas das células a
qual é modificado em função das condições de cultura (LORENZ e CYSEWSKI,
2000; GARCÍA-MALEA et al., 2006). Sob condições ótimas de crescimento as
células vegetativas verdes e flageladas do H. pluvialis persistem (GARCIA-MALEA et
al., 2006; KAMATH et al., 2005), estão em contínua divisão celular (BOUSSIBA et
al., 2000) e possuem carotenóides normalmente encontrados no filo Chlorophyta e
nos cloroplastos de plantas superiores, como betacaroteno, luteína, violaxantina,
37
neoxantina e zeaxantina (chamados coletivamente como carotenóides primários)

sendo a luteína (75-80%) o carotenóide mais abundante nas células verdes de H.
pluvialis (OROSA et al., 2005, GRUNG et al., 1992). Quando expostas a condições
ambientais extremas, a microalga muda a morfologia, resultando na formação de
cistos vermelhos imóveis (perda do flagelo), simultaneamente acumula grande
quantidade de astaxantina (80% da fração de carotenóide) (GARCIA-MALEA et al.,
2006; KAMATH et al., 2005; HARKER et al., 1996, GRUNG et al., 1992) e a cessa a
divisão celular (BOUSSIBA et al., 2000). Muitos fatores nutricionais e ambientais são
potenciais indutores da formação de astaxantina nas células de H. pluvialis
(HARKER et al., 1996). Sarada et al. (2002) observaram, claramente, que o stress é
um fator acumulativo no estado fisiológico da cultura. Segundo Kobayashi et al.
(2001) presume-se que o stress oxidativo está envolvido na regulação da
biossíntese de astaxantina devido ao seu poder antioxidante, protegendo a célula
contra os danos oxidativos por agentes ambientais. Há evidências de que a
astaxantina protege os cistos da luz solar e, particularmente, da luz ultravioleta
FIGURA 12: (a) Crescimento vegetativo das células de H. pluvialis; (b) células de haematocistos.
(LORENZ e CYSEWSKI, 2000).
Alguns fatores buscando a melhora e/ou manutenção do crescimento

vegetativo não permitiriam o acúmulo de astaxantina e algumas condições indutoras
da produção de astaxantina tendem a restringir o crescimento da alga (CIFUENTES
et al., 2003). Este modelo de crescimento celular e acúmulo de carotenóide tem
gerado duas estratégias de produção comercial de astaxantina por H. pluvialis: a
primeira, em apenas um passo, usando meio apropriado (sub-ótimo) tanto para
biomassa quanto produção de astaxantina, onde astaxantina é acumulada enquanto
as células estão crescendo (Microgaia Inc., 2007) e outra, em dois passos
consecutivos (Cyanotech Corporation 2007, Mera Pharmaceuticals, 2007,
38
BOUSSIBA et al., 2000], onde o primeiro estágio consiste em crescimento da

biomassa de H. pluvialis sob condições ótimas de pH, temperatura e nutrientes para
favorecer o crescimento vegetativo, seguido por um segundo estágio no qual a
carotenogênese é induzida através de um meio em condições de stress (GUERIN et
al., 2003; GARCIA-MALEA et al., 2005) e ambos os processos são realizados sob
condições fotoautotróficas (CIFUENTES et al., 2003). Em larga escala o cultivo em
duas etapas tem sido o mais utilizado (LORENZ e CYSEWSKI, 2000) sendo as duas
etapas realizadas de modo descontínuo. A produtividade do processo de dois
passos é diretamente proporcional à produtividade de biomassa na primeira etapa,
na qual as células vegetativas são produzidas (GARCÍA-MALEA et al., 2005).
Alternativamente, o metabolismo mixotrófico desta alga também tem sido
estudado e documentado (GUERIN et al., 2003; KOBAYASHI et al., 1993; GONG e
CHEN, 1997) e crescimento heterotrófico tem sido relatado em algumas cepas de H.
pluvialis (KOBAYASHI et al., 1993), no entanto, estas condições não têm sido
aplicadas em cultivos em escala comercial (CIFUENTES et al., 2003).
Vários fatores e/ou métodos promovendo a formação de astaxantina tem sido
sugeridos, como: alta irradiação (SHOEFS et al. 2001; SUH et al., 2006), deficiência
de nitrogênio (ZHEKISHEVA et al., 2002; SUH et al., 2006), deficiência de fosfato
(HARKER et al., 1996), deficiência de magnésio (BRINDA et al., 2004), adição de
acetato (KOBAYASHI et al., 1993, 2001, CORDERO et al., 1996), elevados níveis de
íon ferroso (KOBAYASHI et al., 2001) elevada temperatura (BOUSSIBA et al., 2000)
e adição de sal (CORDERO et al., 1996) entre outros.
2.5.2.1 Cepas comumente utilizadas
Dentre as cepas de Haematococcus pluvialis produtoras de astaxantina,

observadas na literatura, incluem-se as descritas na tabela 5.
TABELA 5 - Cepas selvagens produtoras de astaxantina

Linhagens Referências
NIES-144 KAEWPINTONG et al., 2006; KOBAYASHI et al., 1993; KATSUDA et al., 2004.
UTEX 16 YUAN et al., 1997; SUH et al., 2006; KIM et al., 2006; YUAN e CHEN 1998;
JEON et al., 2006, FABREGAS et al., 2001.
CCAP 34 /7 CORDERO et al., 1996; HARKER et al., 1996; OROSA et al., 2005
WZ26 MIAO et al., 2006
CCAP 34/8 GARCIA-MALEA et al. 2006
K-0084 BOUSSIBA et al., 2000
SAG 19-a KAMATH et al., 2005
39
2.5.2.2 Meios de Cultivo de Haematococcus pluvialis
Vários meios têm sido reportados para cultivo de Haematococcus pluvialis

incluindo meio Bristol (CIFUENTES et al., 2003), Bristol modificado N enriquecido
(9mM NaNO3) (SCHOEFS et al., 2001), Z8 (RENSTROM et al,. 1981), A9 (LEE e
PIRT, 1981 apud TRIPATHI et al., 1998), KM1 (KOBAYASHI et al., 1991 apud
TRIPATHI et al., 1998), OHM (FABREGAS et al., 2001), F1 (FABREGAS et al., 1998
apud KAEWPINTONG et al., 2006) e meio Bold`s basal (BBM) na forma original
(OROSA et al., 2005; SUH et al., 2006; BRINDA et al., 2004;) ou suplementado (KIM
et al., 2006; LABABPOUR e LEE, 2006), MCM (YUAN et al., 1996).
TABELA 6 - Composição dos meios de cultura autotróficos, heterotróficos e mixotróficos (mg/L de meio).
Componentes M1 Basal F1 BG- Hong M6 BBM Z8 KM1 MM1 MM2 OHM
11 Kong
CaCl2 . 2H2O 184 25 9,78 36 73 3676 25 - 20 20 20 110
Acetato de Sódio - - - - - - - - 1986 1986 1986 -
L-asparagina - - - - - - - - 405 - 405 -
Extrato de levedura - - - - - - - - 2000 - - -
FeCl3 - - - - - - - 16 - - - -
KNO3 500 10 410 - 300 - - - - - - 410
NaNO3 - - - 1500 - - 249 - - 466 - -
Na2HPO4 - - 30 - 30 1500 - - - - - 30
NaH2PO4 195 - - - 35,5 1778 - - - - - -
H3PO4 0.12 - - - - 12,37 - - - - - -
K2HPO4 - 75 - 40 - - 75 31 - 74 74 -
KH2PO4 - 175 - - - - 175 - - 175 175 -
NaCl - 2513 - - - - 25 - - - - -
KOH - 30,85 - - - - - - - - - -
H2SO4 - 0,99 - - - - - - - - - -
C6H5FeO7. 5H2O - - 2,21 - - - - - - - - -
FeSO4 .7H2O 20.9 4,976 - - 8,3 417 5 - 10 10 10 -
3
Fe citrato . H2O - - - - - - - - - - - 2,62
MgSO4.7H2O 61,6 4 16,41 75 24,6 1231 75 24 - - - 246
ZnSO4 0,72 0,0088 - - 0,014 71,89 - - - - - -
CuSO4.5H2O 0,62 1572 0,008 0,079 0,012 62,42 - - - - - 0,012
Na2MoO4. 2H2O 0,07 - 0,08 0,39 0,001 7,26 - - - - - 0,12
CoCl2. 2H2O 0,05 - 0,0078 - 0,0005 4,67 - - - - - 0,011
H3BO3 - 10.95 - 2,86 0,003 - - - - - - -
Cr2O3 - - 0,05 - - - - - - - - 0,075
SeO2 - - 0,036 - - - - - - - - 0,005
EDTA Na. 18600 49,34 - 1 6,7 372 45 30 - 45 45 -
Na2CO3 - - - 20 - - - 21 - - - -
NH4Fe(C6H5O7) - - - 6 - - - - - - - -
MnCl2 . 6 H2O - 1,445 0,66 1,81 - - - - 200 - - 0,98
ZnSO4.7H2O - - - 0,222 - - - - - - - -
Co(NO3)2. 6H2O - 0,389 - 0,049 - - - - - - - -
MnSO4. 7H2O 0,72 - - - 0,001 84,51 - - - - - -
Ca(NO3)2. 4H2O - 15 - - - - - 168 - - - -
Biotina - - - - - - - - - - - 25 μg/L
Tiamina - - - - - - - - - - - 17 μg/L
Vitamina B12 - - - - - - - - - - - 15 μg/L
Elementos traço* - - - - - - + + - + + -
* Os elementos traço consistem em sais de cobalto, cobre, molibdênio, níquel, iodeto a 0.05µM; tungstênio,
vanádio, cromo a 0.01 µM, zinco a 0.1 µM e manganês a 1,0 µM , segundo Renstrom et al., (1981).
Fonte: Adaptado de KAEWPINTONG et al., (2006), TRIPATHI et al., (1999), DONG e ZHAO (2004) e
FABREGAS et al., (2001).
40
Kaewpintong et al. (2006) observou que o crescimento do H. pluvialis é

bastante influenciado pelo tipo de meio de cultura. Os meios de cultivo autotróficos
(BBM, Z8 e A9), heterotrófico (KM1) e mixotrófico (BBM com acetato de sódio, MM1;
BBM com acetato de sódio e L-asparagina, MM2; KM1 sem extrato de levedura,
KM2) foram testados por Tripathi et al. (1998) para fomação de biomassa e
produção de astaxantina. Enquanto Kaewpintong et al. (2006), monitorou os meios
de cultivo autotróficos: M1, M6, F1, Hong Kong, Basal, BG-11 e Basal:BG-11 (1:1),
com o objetivo de obter o meio mais apropriado para produção de biomassa.
O meio F1 foi selecionado por Kaewpintong et al. (2006) como o mais
adequado para o crescimento celular de H. pluvialis, observando-se densidade
celular máxima de 5,44x104células/ml e taxa de crescimento 0,21d-1. As menores
densidades celulares e velocidades de crescimento foram detectadas nos meios M1
e M6. Os meios Hong Kong, Basal:BG-11 e BG-11 apresentaram características
similares de crescimento. Nos meios M1, F1, e Hong Kong embora as células
tenham começado a perder seus flagelos e converter-se a cistos, não houve
acúmulo aparente de astaxantina nestes meios até após 13 dias de cultivo.
Entre os meios autotróficos analisados por Tripathi et al. (1998), o meio BBM
foi o melhor para crescimento celular (obtendo o máximo crescimento celular de
1,5x105 células/ml, no décimo dia), enquanto houve crescimento lento nos meios Z8
e A9. No entanto, contagens de células de 3,0x105, 3,25x105 e 4,2x105 células/ml
foram obtidas nos meios heterotróficos KM1, MM2 e KM2, respectivamente.
Segundo Tripathi et al., (1998) a maior contagem celular em MM2 e KM2 que no
KM1 poderia ter sido devido à adição de vitaminas do complexo B (B1, B6 e B12
1,33:0,1:1,0 . As culturas em meio KM1 acumularam mais astaxantina que os outros
meios, porém quando adicionado elementos traço e vitaminas do complexo B aos
meios KM1, MM1, MM2 e KM2 observou-se maior taxa de acúmulo de astaxantina
nos meios MM1, MM2, e KM2 que observado em meio KM1. Os meios Z8, foram
considerados apropriados para a manutenção das culturas em meio inclinado, o
MM1 para a manutenção do crescimento vegetativo celular e o KM2 com adição de
elementos traço e vitaminas B foi o melhor para produção de astaxantina com uma
produção de 2.2% (p/p) (TRIPATHI et al., 1998).
Segundo Kaewpintong et al. (2006) tem-se relatado que a vitamina B possui
significante efeito sob o crescimento do H. pluvialis, no entanto seu efeito sob a
cultura ainda não está bem claro. Kaewpintong et al. (2006) observou melhora
41
significante sob o crescimento celular no meio F1 após a adição de vitaminas do

complexo B (B1, B6 e B12, na proporção 1,33:0.1:1) na concentração de 12 µg/L
com um aumento de aproximadamente 55% sob a densidade celular máxima 28.6%
sob a velocidade de crescimento específica em relação ao meio sem a adição de
vitamina B.
Segundo Harker et al. (1996) a alga H. pluvialis, quando cultivada em meio
BBM, pode manter o estado vegetativo por um considerável período de tempo e
apenas quando as culturas envelhecem e nutrientes como o nitrogênio são
esgotados, é que o crescimento torna-se limitado e as células formam cistos e
acumulam astaxantina.
Fontes de Carbono
Uma vez que as microalgas são microrganismos fotossintéticos, são capazes
de absorver e utilizar CO2 como a principal fonte de carbono no processo de
crescimento, podendo tolerar até 12% de CO2 a temperatura de 35ºC (DONG e
ZHAO, 2004). Porém, ao contrário de outras algas, o H. pluvialis pode utilizar
também algumas fontes de carbono orgânicas em pequena quantidade (DONG e
ZHAO, 2004). Como é o caso do acetato que tem sido frequentemente usado e/ou
testado como fonte orgânica complementar em alguns trabalhos (KOBAYASHI et al.,
2001; OROSA et al., 2005; HARKER et al., 1996; CIFUENTES et al., 2003, GONG e
CHEN, 1998).
O acetato parece ser importante fonte de carbono, melhorando crescimento e
carotenogênese, uma vez que, promove o encistamento celular e melhora a
formação de astaxantina (OROSA et al., 2005, HARKER et al., 1996; BOROWITZKA
et al., 1991; KOBAYASHI et al., 1993). Jeon et al. (2006) observou que um nível
próprio de acetato pode melhorar a produtividade volumétrica de biomassa de H.
pluvialis quando a luz é simultaneamente suprida. Assim, o acetato poderia
promover o crescimento celular, mas a concentração de acetato seria controlada
num nível apropriado para evitar inibição pelo mesmo. Quando acetato foi
suplementado mais que 50 mM, a cor das células desapareceu e estas depois
morreram. No entanto, aproximadamente 30 mM de acetato não causou
branqueamento celular e ainda ajudou as células a manterem o estado vegetativo
sob baixa intensidade de luz.
42
Tripathi et al. (1998) observaram que o crescimento do H. pluvialis foi mais

rápido em meio heterotrófico (KM1) e mixotrófico (MM2 e KM2) que no meio
autotrófico e, ao contrário do meio autotrófico, que apresentou prolongada fase
vegetativa, as células no meio KM1 mostraram encistamento logo após 5 dias,
subseqüentemente atingindo a fase estacionária de crescimento. Os resultados de
Tripathi et al. (1998) demonstraram que a adição de acetato de sódio, L-asparagina,
elementos traço e vitamina B nos meios autotróficos e heterotróficos poderiam
aumentar a biomassa e a produção total de astaxantina por H. pluvialis em menor
período de incubação reduzindo consideravelmente o custo do processo para a
produção comercial de astaxantina.
Sob condições mixotróficas com acetato de sódio como fonte de carbono tem-
se reportado velocidade específica de crescimento de 0.25d-1 (TJAHJONO et al.,
1994) a 0.58d-1 (KOBAYASHI et al., 1993).
Orosa et al. (2005), analisaram diferentes concentrações de acetato e
malonato (0%, 0.25%, 0.5%, 1% e 2% p/v) com o objetivo de encontrar a
concentração ótima para produção de biomassa, observando que a velocidade de
crescimento do H. pluvialis foi melhorada pela adição de 0,25% (p/v) de acetato de
sódio com relação às culturas controle fotoautotróficas, mas a concentração de
acetato maior que 0.5% causou inibição do crescimento. O mesmo efeito foi
observado com as culturas com malonato melhorando o crescimento do H. pluvialis
apenas na concentração de 0.25% (p/v) com leve inibição no crescimento sob
concentração maior que 0.25% (p/v). No entanto, foi observado um aumento no
tamanho celular sob alta concentração de malonato.
Dong e Zhao (2004) observaram que o H. pluvialis possui uma capacidade
limitada de metabolizar glicose, apresentando níveis baixos de produção de
biomassa e baixa taxa de conversão de glicose, possivelmente devido à perda ou
baixa atividade enzimática envolvida no metabolismo da glicose pela via Embden-
Meyerhof-Parnas (EMP) e ciclo do ácido tricarboxílico dentro das células da alga.
Fontes de Nitrogênio
Segundo Harker et al. (1996) variando a concentração de nitrato do meio a
alga poderia ser manipulada com relação tanto ao crescimento quanto à formação
de astaxantina. O principal problema da deficiência de nitrogênio é a redução da
velocidade de crescimento (OROSA et al., 2005).
43
Sarada et al. (2002) analisaram a influência de diferentes fontes de nitrogênio

(Ca(NO3)2, KNO3, NH4NO3 e NaNO3) no crescimento vegetativo do H. pluvialis,
observando máxima contagem celular com nitrato de potássio (6,2 x 105células/ml) e
menor no nitrato de amônio (1,65x105 células/ml). No entanto, as células crescendo
no meio com nitrato de potássio foram menores quando comparadas às que
cresceram nas outras fontes de nitrogênio e o conteúdo de clorofila foi maior na
cultura com nitrato de sódio.
Cifuentes et al. (2003) testou três fontes de nitrogênio (NaNO3, NH4Cl e uréia)
sob condições autotróficas. A melhor fonte de nitrogênio para crescimento
observada por Cifuentes et al., (2003) foi claramente cloreto de amônio, não apenas
produzindo uma maior biomassa quando comparado às outras fontes de nitrogênio,
mas também um estado saudável das células móveis na cultura, evidenciado por
uma coloração verde, um tamanho celular grande e fina matriz extracelular. Quando
cultivado em nitrato de sódio os parâmetros de crescimento (densidade celular e
peso seco) foram menores que no cloreto de amônio, mas significantemente
maiores que com uréia, onde o crescimento foi deficiente. Em todas as fontes de
nitrogênio testadas o número relativo de células vegetativas móveis durante o
crescimento foi alto (>85%) e maior em cloreto de amônio (95%) que em outras
fontes.
Orosa et al. (2005), testou diferentes concentrações de nitrato: 0, 0.15, 0.25,
0.5, 0.75 e 1g/L NaNO3 para determinar as condições ótimas para a produção de
biomassa. Os resultados mostraram que as culturas de H. pluvialis com diferentes
concentrações de NaNO3 não mostraram diferença no crescimento até o 11º dia,
quando as culturas com 0,15g/L NaNO3 tiveram diminuição na velocidade de
crescimento e as culturas sem nitrogênio não cresceram.
Condições de stress nutricional visando a produção de astaxantina

Segundo Fabregas et al. (2001) uma combinação de fatores poderia ser
aplicada na fase de encistamento com o objetivo de reduzir o período de indução da
formação de astaxantina.
44
• Deficiência de Nitrogênio
Alguns pesquisadores (OROSA et al., 2005; HAGEN et al.., 1993) têm
relatado que a exposição a meios deficientes em nitrogênio tem sido uma condição
eficiente para aumento do acúmulo de astaxantina no H. pluvialis.
Sarada et al. (2002) testaram a influência da fonte de nitrogênio (Ca(NO3)2,
KNO3, NH4NO3 e NaNO3) na produção de astaxantina e observaram que o conteúdo
de carotenóide total e produtividade de astaxantina foi maior nas culturas que
cresceram em meio com nitrato de sódio e menor em nitrato de amônio e potássio.
Observou-se um aumento (3x) significante na produtividade de astaxantina em
culturas com nitrato de cálcio comparado com outros meios com nitrato, sugerindo a
possível influência das condições de cultura na produção de astaxantina por stress
induzido.
Orosa et al. (2005), testou diferentes concentrações de NaNO3 (0, 0.15, 0.25,
0.5, 0.75 e 1g/L) para determinar as condições ótimas para a produção de
astaxantina e relataram que a concentração ótima de nitrato para obter astaxantina e
evitar a inibição da divisão celular foi 0.15g/L NaNO3. Orosa et al. (2005) relatou
ainda que em presença de nitrato no meio a relação entre a quantidade de clorofila e
de carotenóide foi maior que 4, no entanto esta relação decaiu sob deficiência de
nitrogênio. Em meio sem nitrogênio este decréscimo foi observado logo no primeiro
dia e nas culturas com 0.15 e 0.25 g/L NaNO3 o decréscimo ocorreu após o 9º e 11º
dia, respectivamente.
Segundo Orosa et al. (2005) a deficiência de nitrogênio é uma forma efetiva
de melhorar o acúmulo de astaxantina em Haematococcus, mas a densidade celular
é baixa devido à inibição da divisão celular. Uma solução para este problema seria o
uso de baixa concentração de nitrato, assim, em poucos dias o nitrato presente no
meio seria exausto, mas permitindo obter uma maior densidade celular (OROSA et
al., 2005). Segundo Orosa et al. (2005) a síntese de astaxantina requer nitrogênio
refletindo a necessidade de síntese contínua de proteína com o objetivo de suportar
o acúmulo massivo de pigmento.
• Adição de Acetato de Sódio

Cifuentes et al. (2003) testou o crescimento mixotrófico com adição de
diferentes concentrações de acetato de sódio (4, 8 e 12 mM) ao meio de cultivo e
observou que a adição de acetato causou significante aumento na quantidade
45
relativa de cistos, de 0.42% (cultura controle) para 8.7% (cultura com12nM acetato)
a 35 µmol fótons. m-2.s-1. Um menor aumento de cistos foi obtido a 85 µmol fótons.
m-2.s-1, de 1,9% (cultura controle) para 3.0% (cultura com 12mM acetato).
Orosa et al. (2005), estudou a formação de carotenóide em H. pluvialis sobre
diferentes concentrações de acetato (0%, 0.25%, 0.5%, 1% e 2% p/v) e também
usando outra fonte de carbono (malonato), nas mesmas concentrações, com o
objetivo de encontrar a concentração ótima para o máximo acúmulo de astaxantina.
Com a suplementação de acetato nas culturas, o H. pluvialis foi induzido a formar
cistos celulares, o qual foi associado com um aumento concomitante no conteúdo de
astaxantina na célula. O acetato também afetou a quantidade de clorofila presente.
O máximo conteúdo de clorofila por célula foi detectado nas culturas sem acetato no
meio. O acetato melhorou o acúmulo de carotenóides totais celular com valores 3
vezes maior que em culturas autotróficas. No entanto, o maior acúmulo ocorreu nas
culturas com 2% de acetato o qual apresentou inibição do crescimento
acompanhado por encistamento celular. As análises em HPLC mostraram que
acetato induziu principalmente o acúmulo de ésteres de astaxantina (quase 90% dos
carotenóides totais) e redução dos carotenóides primários, sendo que a quantidade
de luteína por célula foi mais que 5 vezes menor nas culturas com 2% de acetato
que nas culturas controle. Logo, o efeito do acetato foi dependente da concentração,
maiores concentrações inibiram o crescimento, mas aumentaram consideravelmente
o conteúdo de astaxantina por célula. O mesmo efeito foi observado com as culturas
com malonato, onde as células acumularam mais astaxantina em menos tempo que
nas culturas sem este composto ou ainda nas culturas com acetato. A quantidade de
astaxantina por célula já na menor concentração de malonato testada foi pelo menos
duas vezes maior que nas culturas controle.
• Adição de ferro
Kobayashi et al. (1993) desenvolveram um meio rico em Fe2+, com acetato
como fonte de carbono para melhorar a produção de astaxantina. Neste meio de
crescimento heterotrófico, uma mudança rápida na morfologia, formando-se cistos,
foi observada após 6 dias de cultivo (KOBAYASHI et al., 1993) o que levaria várias
semanas sob condições autotróficas (BOROWITZKA et al., 1991). Além da formação
de cisto, a produção de astaxantina teve melhor resultado pela adição de acetato e
Fe2+ que pela adição de acetato sozinho. A melhora na carotenogênese pela Fe2+ foi
46
inibida pela adição de iodeto de potássio, um consumidor de radicais hidroxila,

sugerindo que o radical hidroxila formado pela reação Fenton ferro-catalisada pode
ser requerida para melhorar a biossíntese de carotenóide.
Sabe-se que a forma ferrosa (Fe2+) é responsável pela formação de radicais
livres (especialmente radical hidroxila, HO·) pela via química de Fenton (Fe2+ + H2O2
→ OH- + HO· + Fe3+) acreditando-se que esta seja a razão deste íon estimular a
produção de astaxantina por ação antioxidante (HARKER et al., 1996). Logo,
Kobayashi et al. (1993) observou que Fe2+ pode trabalhar como um gerador de HO·
através da reação de Fenton ferro-catalisada nos cistos celulares para melhorar a
carotenogênese.
• Altas Concentrações de Sal

Tem-se relatado que o Haematococcus pluvialis possui pouca tolerância a
altas concentrações salinas, logo sob determinadas concentrações este fator
isoladamente ou associado a outras condições de stress tem se mostrado eficiente
na indução da produção de astaxantina (HARKER et al., 1996; SARADA et al., 2002;
CIFUENTES et al., 2003; CORDERO et al., 1996).
Sarada et al. (2002) investigaram o efeito de diferentes concentrações de
NaCl (0,25, 0,5, 1,0 e 2,0% p/v) em cultivo mixotrófico, sob o estado fisiológico da
cultura e produção de astaxantina. A adição de NaCl junto com acetato de sódio
mostrou diferenças marcantes no conteúdo de astaxantina, estimulando
significantemente sua produção, no entanto altas concentrações de NaCl (>1,0%
v/v) foram letais e a idade da cultura foi crucial na produção de astaxantina induzida
por stress. Culturas de 4 a 8 dias foram sensíveis a adição de NaCl enquanto
culturas mais velhas (12 – 16 dias) foram resistentes e acumularam 8.3-10.69 mg de
astaxantina/L comparado a 0.95-8.1mg/L em culturas de 4-8 dias, respectivamente.
A produtividade de astaxantina foi a mesma a 0,25 e 0,5% de NaCl em 9 dias de
cultivo.
Cifuentes et al. (2003), após stress das células por adição de sal observaram
significante mortalidade celular diretamente proporcional ao aumento da
concentração de sal, no entanto, observou-se um aumento no conteúdo total de
carotenóide e diminuição concomitante do conteúdo de clorofila, com o aumento da
salinidade. Apesar da alta mortalidade, um aumento na coloração vermelha nas
47
células sobreviventes em maior salinidade foi evidenciado e o aumento da

carotenogênese foi maior quando associada com alto PFD (85 µmol fótons m-2s-1).
Cordero et al. (1996) induziu a produção de astaxantina em Haematococcus
pluvialis em diferentes concentrações de acetato (0,025, 0,05 e 0,1g/L) e NaCl (0,1,
0,2 e 0,4%). As melhores condições de cultivo para produção de astaxantina foram
0,2% de NaCl, 0,025g/L de acetato de sódio e 0,05g/L de acetato de sódio, com
produção de 3,0, 1,83 e 1,78% de astaxantina por peso seco total, respectivamente.
A maior produção de astaxantina no bioreator foi 18,6mg/L com 0,2% de NaCl. Os
menores valores foram obtidos em 0,4% NaCl + 0,1g/L de acetato de sódio, com
produção de astaxantina de 0,47 e 0,50% por peso seco total e peso seco orgânico,
respectivamente. Tem sido mencionado que altas salinidades como 1% podem ser
letais ao H. pluvialis (BOROWITZKA et al., 1991). Boussiba e Vonshak (1991)
reportaram que expondo H. pluvialis a stress por adição de sal a 0,8% de NaCl,
causou completa inibição do crescimento, mas induziu um acúmulo massivo de
astaxantina.
• Adição de Peróxido de Hidrogênio (H2O2)

Harker et al. (1996) observou que a adição de H2O2 estimulou a síntese de
astaxantina por célula, porém quando exposta a altos níveis ou por um período
maior que 9-10 dias inibiu intensamente o crescimento da alga. Estes resultados
levam a hipótese de que stress oxidativo pode ser um mecanismo responsável pela
formação de astaxantina em H. pluvialis, apesar dos níveis de astaxantina serem
menores comparados aos obtidos pela exposição a baixos níveis de nutrientes
chave (HARKER et al., 1996).
Segundo Kobayashi et al. (1993) espécies ativas de oxigênio são capazes de
ativar a produção de astaxantina por estarem envolvidas com a modificação
estrutural de enzimas carotenogênicas como a glutationa transferase e glutationa
redutase, ou por participar diretamente em reações de enzimas carotenogênicas
como agente oxidante ou aceptor de H. Além disso, o stress oxidativo nas células de
H. pluvialis pode ser utilizado como oxidante para oxigenação e hidroxilação do
betacaroteno ou como aceptor de H para a regeneração de NAD(P). Posteriormente,
a função antioxidante da astaxantina foi testada, sugerindo que o acúmulo de
astaxantina pode proteger a célula contra danos por stress oxidativo ambiental,
estimulando sua produção.
48
2.5.2.3 Condições de Cultivo do Haematococcus pluvialis
Conforme tem se encontrado na literatura, as condições ótimas requeridas

para produção das células verdes são temperatura moderada (20-28ºC), baixo nível
de radiação (30-140µEm2s-1), alta concentração de nitrato e fosfato (20 e 1mM,
respectivamente), pH entre 6.0-7.0 e adição de acetato (0.25% p/v) como fonte de
energia adicional (BOUSSIBA et al., 2000; OROSA et al., 2005; BOROWITZKA et
al., 1991; GARCÍA-MALEA et al., 2006). A produção de células verdes limita o
processo de produção de astaxantina uma vez que este pigmento é acumulado no
interior dos cistos (GARCÍA-MALEA et al., 2005) tornado-se importante a otimização
da fase de crescimento vegetativo do H. pluvialis para alcançar-se bom rendimentos
de astaxantina.
Quanto ao fotobioreator
Tanto no estado de crescimento vegetativo, quanto de encistamento é
possível usar-se com sucesso inúmeros modelos de bioreatores (tanque agitado,
coluna de bolhas e bioreator airlift, bioreator tubular, sistema de bolsas, etc.)
(BOUSSIBA et al., 2000; KIN et al., 2006), mas basicamente dividem-se em
sistemas aberto ou fechado. As vantagens e desvantagens de alguns
fotobioreatores são relatados por algumas empresas e autores. Na Suíça,
fotobioreatores completamente fechados (com luz artificial) estão sendo usados para
a produção comercial de astaxantina; no Havaí, uma combinação de fotobioreatores
fechados e tanques de cultura abertos estão sendo usados com êxito para
produção, em larga escala, de H. pluvialis (LORENZ e CYSEWSKI, 2000).
No cultivo de células fotossintéticas, o design dos fotobioreatores para uma
iluminação efetiva é essencial para reduzir o custo de produção. Enquanto a luz
solar é a fonte de luz mais barata disponível, sua intensidade não é constante e
varia durante o dia e a região, e a intensidade de energia é limitada (KATSUDA et
al., 2004). Para alcançar condições de cultivo controladas e alta produtividade, um
mecanismo de iluminação elétrica com alta eficiência e que emite luz com efeito
fisiológico favorável nas células fotossintéticas devem ser usadas em sistemas de
fotobioreatores (KATSUDA et al., 2004).
Devido à baixa velocidade de crescimento, suscetibilidade a contaminação e
preferência por baixa temperatura de crescimento (HARKER et al., 1996), o cultivo
49
aberto (“outdoor”) tem sido geralmente mal sucedido (KAEWPINTONG et al., 2006),
no entanto, segundo Boussiba et al. (2000) é o sistema mais econômico e mais
utilizado por grandes produtoras de astaxantina por H. pluvialis.
Segundo Garcia-Malea et al. (2006) o uso de acetato de sódio aumenta os
riscos de contaminação e normalmente obriga que a produção seja realizada em
modo descontínuo, levando a baixos rendimentos. Com o objetivo de aumentar o
rendimento da produção de astaxantina, a produtividade de células verdes no
primeiro passo de produção deveria ser realizada continuamente em fotobioreatores
abertos (outdoor) sob condições autotróficas. Garcia-Malea et al., 2006 realizaram
cultivo sob saturação de nitrato e os resultados mostraram que a produção contínua
autotrófica de células vegetativas é possível. Observaram que a produção de células
verdes de H. pluvialis sob condições autotróficas outdoor é possível com velocidade
de crescimento e produtividade substancialmente maiores que as observadas em
condições heterotróficas e mixotróficas. A ausência de fontes orgânicas de carbono
permitiram com que a cultura opere por um longo período de tempo sem
contaminação, ainda que a esterilização do meio de cultura seja realizada apenas
por filtração como é o caso dos fotobioreatores abertos. Além disso, a alta irradiação
na superfície do reator ao meio-dia não danificou drasticamente as células. A alta
produtividade de biomassa e não indução de produção de astaxantina na cultura
contínua realizada por Garcia-Malea et al. (2006) foi devida à manutenção de
suprimento de nitrato suficiente para evitar a limitação de nitrogênio durante o
experimento.
FIGURA 13: Produção “outdoor” de microalgas em escala comercial da Cyanotech

Corporation, localizada em Kona, Hawaii.
50
Kaewpintong et al. (2006) estudou o efeito do cultivo de células vegetativas de

H. pluvialis em bioreator airlift em condições fotoautotróficas sob a velocidade
específica de crescimento e a densidade celular. Comparou-se o desempenho do
bioreator airlift e o bioreator de bolhas em escala laboratorial, utilizando o meio F1
(tabela 7). Segundo Kaewpintong et al. (2006), bioreatores pneumáticos são uma
alternativa eficiente para o cultivo de H. pluvialis, uma vez que esta microalga é
muito sensível ao cisalhamento. Em sistemas pneumáticos como colunas de bolha
ou bioreatores airlift, a mistura e a transferência de massa são induzidas apenas por
aeração, o qual gera baixo nível de cisalhamento e menor intensidade de energia
que tanques agitados. A comparação entre a performance da coluna de bolhas e do
bioreator airlift sob as mesmas condições de operação mostrou que a densidade
celular máxima e a velocidade de crescimento específico em bioreator airlift (79.5 x
104 células/ml e 0,45d-1) foi maior que em coluna de bolhas (42 x 104celulas/ml e
0,36d-1). Além disso, o modelo airlift proporcionou melhor movimentação dentro do
reator entre as células na zona interna (escura) e externa (clara) melhorando a
exposição celular a luz o que não pode ser obtido na coluna de bolhas. Este trabalho
mostrou que o sistema airlift em escala laboratorial é apropriado para cultivo de H.
pluvialis com bom rendimento tanto em sistema em batelada quanto semicontínuo,
sugerindo a investigação deste modelo em escala industrial seria atrativa.
Segundo Kaewpintong et al. (2006) o sistema de cultivo fechado, oferece
melhor controle do meio de cultura, proteção contra contaminação ambiental e
obtenção de alta densidade celular. Muitos estudos têm sido conduzidos para
investigar o cultivo de H. pluvialis em frascos sob ambiente controlado. No entanto,
na prática, para a produção em larga escala, o cultivo de H. pluvialis deve ser
realizado em um bioreator de grande capacidade (KAEWPINTONG et al., 2006).
A empresa Mera Pharmaceuticals (http://www.aquasearch.com/) produtora
comercial de microalgas com experiência em cerca de 40 espécies de microalgas
em escala pequena e grande, incluindo H. pluvialis, tem cultivado com sucesso
muitas espécies utilizando fotobioreatores fechados (PBRs) em escala comercial
maiores que 10.000 litros. Segundo Olaizola (2003) as condições de cultura em
fotobioreatores fechados com capacidade de mais de 2000L são estabelecidas,
controlados por computadores e escalonados para o fotobioreator PBRs em escala
comercial (capacidade para 25.000L ocupando uma área de 100m2) segundo o
módulo de crescimento Mera (MGM - Mera Growth Module). O MGM utiliza controles
51
de alto nível computadorizados, para monitorar, manter e ajustar o ambiente para

todas as condições críticas, tais como a temperatura, o pH e níveis nutrientes. Este
nível do controle permite a manutenção das circunstâncias que promovem a taxa de
crescimento mais desejável.
Em escala industrial a utilização da luz solar é, do ponto de vista econômico,
essencial para o crescimento fotoautotrófico da alga (SUH et al., 2006). Para
simplificar o processo convencional de produção em dois estágios Suh et al. (2006)
introduziram um fotobioreator de duas regiões para a produção de astaxantina em H.
pluvialis. No fotobioreator de 1L cilíndrico com duas regiões (dois tubos cilíndricos
concêntricos), o crescimento vegetativo foi acompanhado na região interna enquanto
simultaneamente a produção de astaxantina foi realizada na região externa. A
excessiva irradiação de luz (770±20µEm-2s-1) na superfície externa do bioreator
melhora o acúmulo de astaxantina nas células. Enquanto penetrando a região
externa, o suprimento de luz foi diminuído para 40±3µEm-2s-1 por sombreamento
pelas próprias células. A iluminação atenuada foi usada para crescimento das
células vegetativas na região interna. Segundo Suh et al. (2006), o uso de
fotobioreator com duas regiões minimiza as perdas de energia, reduz o custo com
equipamento e tempo de cultivo. Os resultados indicaram que é praticável usar este
método para produção de astaxantina com simultâneo crescimento vegetativo,
podendo ser uma boa alternativa de estratégia de redução do custo de produção e
otimização do processo em substituir a produção de dois estágios. Os resultados
obtidos indicaram que o fotobioreator com duas regiões é uma boa alternativa para
produção comercial de astaxantina por H. pluvialis com ambiente controlado.
FIGURA 14: Fotobioreator fechado com estruturas tubulares cilíndricas e transparentes (Fishace Ecological
Engineering, 2007).
52
Quanto ao pH do meio
O pH para cultivo de H. pluvialis tem sido em torno de, pH 6.5±0.5 (SUH et al.,
2006; KIM et al., 2006; CIFUENTES et al., 2003; HARKER et al., 1996; KOBAYASHI
et al., 1993; OROSA et al., 2005).
A influência do pH no crescimento vegetativo do H. pluvialis foi determinada
por Sarada et al., 2002 em meio basal com pH ajustado em 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 e 9.0, a
temperatura e intensidade de luz constantes e observaram maior contagem celular
em pH 7.0, menor contagem celular em pH 9.0, não havendo crescimento em pH
5.0.
Quanto à iluminação
A produção de células vegetativas verdes do H. pluvialis não tolera alta
irradiação e, logo, deve ser cultivada em condições de baixa intensidade de luz
(BOUSSIBA et al., 2000), no entanto este regime de pouca luz resulta em baixa
velocidade de crescimento requerendo a adição de fontes orgânicas de carbono
para melhorar ao crescimento (GARCIA-MALEA et al., 2006).
Segundo Boussiba et al. (2000) a intensidade de luz ótima para a fase de
crescimento celular está na faixa de 60-110 µmol fótons m-2s-1. Schoefs et al. (2001)
cultivou H. pluvialis em bioreator airlift com fluxo de fótons na superfície do bioreator
de aproximadamente 50 µmol fótons m-2s-1 e temperatura de cultivo constante em
20±1ºC, mantendo a cultura em alta e constante taxa de divisão celular. Por outro
lado, Kaewpintong et al. (2006) relataram que a ótima intensidade de luz para
crescimento de H. pluvialis foi de 20 µmol fótons m-2s-1.
Kaewpintong et al. (2006) testaram diferentes intensidades de luz na
superfície de um bioreator airlift e observaram aumento da densidade celular e da
velocidade específica de crescimento com o aumento da intensidade de luz até 20
µmol fótons m-2s-1 enquanto quando a intensidade da luz aumentou para 60 µmol
fótons m-2s1 não foi observado crescimento celular. Sob intensidade de luz menor
que 40 µmol fótons m-2s-1 quase todas as células estavam na forma vegetativa e em
intensidade acima de 50 µmol fótons m-2s-1 observou-se ausência de divisão celular.
Katsuda et al. (2004) estudou os efeitos do comprimento de onda no
crescimento celular do Haematococcus pluvialis sobre iluminação com LEDs
emitindo luz vermelha (λmax=625nm), verde (λmax=525nm), azul (λmax=470nm), azul-
violeta (λmax=410nm) e violeta (λmax=380nm) e lâmpada fluorescente e observaram
53
que LEDs vermelhos em relativa baixa intensidade, são favoráveis ao crescimento

celular. Comparando diferentes intensidades de luz (2.8, 8.0 e 12 µmol fótons m-2s-1)
utilizando LEDs, observaram ainda que para cada fonte de luz a velocidade de
crescimento na fase logarítmica foi quase independente da intensidade de luz,
mostrando que a intensidade de luz foi acima do nível de saturação. Sob iluminação
com LED vermelha ou a fluorescente a 2.8 µmol fótons m-2s-1 a concentração celular
atingiu um patamar mais cedo que a 8.0 µmol fótons m-2s-1 devido à atenuação da
luz pelas células. A 12.0 µmol fótons m-2s-1 um pequeno atraso no crescimento
celular foi observado, atribuída a indução da mudança da morfologia pela luz de
baixo comprimento de onda e alta intensidade, causando também supressão do
crescimento celular (KATSUDA et al., 2004).
Condições de stress ambiental visando a produção de astaxantina
• Alta intensidade de luz

Submeter a alga, H. pluvialis, a altas densidades de fluxo de fótons é o fator
isolado mais importante em termos de indução da carotenogênese (HARKER et al.,
1996; KOBAYASHI et al., 1993; CIFUENTES et al., 2003; BOUSSIBA et al., 2000).
Segundo Kim et al., (2006) uma iluminação apropriada com uma adequada
intensidade é requerida para a obtenção de altos níveis de astaxantina. Segundo
Jeon et al. (2005) a intensidade da luz e a concentração de acetato foram
selecionadas como os maiores fatores afetando a velocidade de crescimento da alga
e Cifuentes et al., (2003) observou uma indução da carotenogênese muito maior nas
culturas induzidas por alto PFD (150 µmol fótons m-2s-1) (33%) que sob limitação de
nitrogênio (12.8-18.5% em nitrato de amônio sob 85 µmol fótons m-2s-1,
respectivamente). Adicionalmente, Kobayashi et al. (1993) reportaram que a
iluminação continua é mais favorável à formação de astaxantina que ciclo de
iluminação claro/escuro (foto-período).
Kaewpintong et al. (2006) testou diferentes intensidades de luz na superfície
de um bioreator airlift e observou que sob intensidade acima de 50µmol fótons m-2s-1
houve mudança na morfologia e acúmulo de astaxantina enfatizando o fato de que o
acúmulo de astaxantina em H. pluvialis poderia ser induzido por alta intensidade de
luz. Boussiba e Vonshak (1991) relataram o acúmulo de astaxantina somente sob
54
intensidade acima de 90µmol fótons m-2s-1. Fabregas et al. (2001) reportaram

indução da formação de astaxantina em H. pluvialis sob 240umol fótons m-2s-1.
Segundo o estudo feito por Katsuda et al. (2004) citado anteriormente (pg. 68
- 69) sobre iluminação com LEDs, além do efeito sob o crescimento celular, LEDs
emitindo luz de baixo comprimento de onda (380-470nm) induziram o acúmulo de
astaxantina de 5-6% por célula seca, porém observou-se supressão do crescimento
celular após 4-5 dias de cultivos. Comparando diferentes intensidades de luz de 2,8,
8,0 e 12,0 µmol fótons m-2s-1, Katsuda et al. (2004) observaram ainda sob 12.0 µmol
fótons m-2s-1 um pequeno atraso no crescimento celular foi observado, enquanto
houve maior produção de astaxantina, atribuída a indução da mudança da
morfologia pela luz de baixo comprimento de onda e alta intensidade, causando
também supressão do crescimento celular (KATSUDA et al., 2004).
Assim Katsuda et al. (2004) propuseram uma nova estratégia de cultivo de
Haematococcus pluvialis sobre iluminação com LEDs vermelhos a relativamente
baixa intensidade de luz induzindo a produção de biomassa (e com substituição do
meio para evitar indução da mudança da morfologia), sem induzir um alto nível de
acúmulo de astaxantina, mas favorecendo o crescimento celular, e após a
concentração celular atingir um valor determinado, mudar para iluminação com
LEDs azuis em alta intensidade de luz (acima de 10 µmol fótons m-2s-1) para induzir
alto nível de acúmulo de astaxantina.
Segundo Fabregas et al. (2001) o uso de iluminação contínua em vez de
ciclos de iluminação escuro/claro pode ser uma fonte de stress adicional e poderia
ser usada para acelerar o processo de acúmulo de astaxantina, uma vez que a
quantidade de luz tem sido demonstrada ser mais importante que a intensidade para
a formação de astaxantina. Kim et al. (2006) comparam os efeitos da iluminação em
“flashes” na produção de astaxantina em Haematococcus pluvialis, com o método
convencional de iluminação contínua. Os resultados mostraram que, fornecendo luz
em flashes de baixa intensidade induziu-se a síntese de astaxantina mais
eficientemente que fornecendo a mesma quantidade de luz de maneira contínua. A
produção de astaxantina em H. pluvialis com iluminação intermitente externa ou
interna foi muito mais eficiente e econômica que sob luz contínua com a mesma
intensidade de luz média (a mesma quantidade de fótons). A iluminação interna em
“flashes” apresentou-se mais eficiente que externamente. Os resultados indicaram
que o uso de luz em “flashes”, principalmente quando usado internamente, é uma
55
forma promissora para induzir acúmulo de astaxantina em H. pluvialis no aspecto da

iluminação.
• pH do meio de cultura
Segundo Sarada et al. (2002) a produção de carotenóide é significantemente
afetada pelo pH do meio. A influência do pH na produção de astaxantina foi
determinada por esses autores através da indução de stress nutricional em meio
basal com diferentes pHs (5.0, 6.0, 7.0, 8.0 e 9.0), que levou a concentração de
pigmento (clorofila e carotenóide) alta em pH 7.0-8.0 e significantemente menor em
pH 6.0. No entanto, culturas que cresceram em pH 7.0 apresentaram maior
produção de astaxantina que aquelas que cresceram em pH 6.0, 8.0 e 9.0. Os
resultados indicaram que a resposta ao stress varia com o pH do meio e que pH 7.0
foi o melhor em termos de produção de astaxantina.
• Alta Temperatura
Segundo Boussiba et al. (2000) para o estado de encistamento o limite
máximo de temperatura poderia ser de até 35OC, enquanto o limite mínimo poderia
ser tão baixo quanto 2oC. Os melhores resultados foram obtidos quando a
temperatura foi mantida em 32oC.
2.5.2.4 Recuperação e Purificação do Pigmento Astaxantina
Extração
Segundo Olaizola (2003), as revisões de diferentes técnicas de colheita
disponíveis para obtenção de microalgas, incluindo floculação, filtração,
centrifugação e flotação com ar têm indicado que a centrifugação é possivelmente a
técnica mais confiável e apenas ligeiramente mais cara que outras técnicas, em
escala industrial. A biomassa de H. pluvialis é comumente obtida em escala
laboratorial, por centrifugação (GUERIN et al., 2003; KIM et al., 2005; KATSUDA et
al., 2004; OROSA et al., 2006; KAMATH et al., 2005, MIAO et al., 2006).
Devido os haematocistos serem mais densos que a água a obtenção dos
haematocistos em escala industrial é facilmente realizada por sedimentação e
subseqüente centrifugação (BOUSSIBA et al., 2000, LORENZ e CYSEWSKI, 2000)
ou filtração a vácuo (BOUSSIBA et al., 2000). Segundo Olaizola (2003), no caso da
56
biomassa de H. pluvialis para produção de astaxantina (Mera Pharmaceuticals), tem-

se a vantagem das células tornarem-se grandes e pesadas durante a
carotenogênese e formação de cistos sedimentando rapidamente no meio de
crescimento. Tem-se observado velocidade de sedimentação celular do H. pluvialis
maior que 1 cm/min (OLAIZOLA, 2003).
A biomassa celular deve ser rompida para aumentar a biodisponibilidade da
astaxantina (GUERIN et al., 2003). O extrato bruto de pigmento pode ser rompido
por moagem dos “pellets” com almofariz (GARCIA-MALEA et al., 2006; LORENZ e
CYSEWSKI, 2000; CIFUENTES et al., 2003, YUAN e CHEN, 2000), por
homogenizadores de tecidos (LABABPOUR e LEE, 2006; CIFUENTES et al., 2003;
YUAN e CHEN 1998), French press (SCHOEFS et al., 2001) ou nitrogênio liquido
em almofariz (para cistos) (CIFUENTES et al., 2003), aquecimento a 60ºC
(XYLANDER e BRAUNE, 1994 apud YUAN e CHEN, 2000) ou 70º C (BAR et al.
1994 apud YUAN e CHEN, 2000) ou ainda usando partículas de sílica e solvente
agitados vigorosamente (KATSUDA et al., 2004). Em escala laboratorial Yuan e
Chen (2000) observaram que a moagem em almofariz com pistilo foi simples, rápido
e eficiente para a extração de pigmentos da alga H. pluvialis especialmente para
uma grande quantidade de células algais. Olaizola (2003) sugere o uso de moinho
de bolas e homogeinizadores de alta pressão para ruptura das células de H. pluvialis
e recuperação da astaxantina em escala industrial, mas outros métodos são
possíveis, embora, segundo Lorenz e Cysewski (2000), detalhes exatos das técnicas
de moagem sejam exclusivos das companhias produtoras de H. pluvialis.
O próximo passo pode ser a redução do conteúdo de água da biomassa.
Ausência de água na biomassa melhora a recuperação de componentes
lipossolúveis como a astaxantina. No entanto, como a astaxantina é um composto
sensível ao calor, produtores comerciais têm desenvolvido tecnologias que limitam a
exposição da astaxantina a condições que causam degradação (OLAIZOLA, 2003).
A liofilização pode ser uma alternativa para remediar o problema causado por
tratamentos com altas temperaturas que podem degradar os carotenóides (TANG e
CHEN, 2000; YUAN e CHEN, 1998; BOUSSIBA et al., 2000), outra técnica relatada
é a secagem sob fluxo de nitrogênio (FABREGAS et al., 2001), embora a secagem
por spray tenha provado ser efetiva (BOUSSIBA et al., 2000).
Atualmente produtores comerciais de astaxantina não purificam astaxantina a
partir do extrato bruto (OLAIZOLA, 2003). Neste caso, o extrato de células secas é,
57
preferencialmente, estocado sob baixas temperaturas (-80oC) ou ainda sob ausência

de oxigênio, como embalagens a vácuo ou bolsas com introdução de nitrogênio. O
estágio final da produção de um produto com astaxantina na forma de partículas
facilmente digeridas por peixes, pode ser realizada de várias formas, mas
comumente envolve procedimentos de moagem em que as células secas são
moídas sob condições criogênicas na presença de antioxidante (etoxiquina, BHA,
BHT, tocoferol, di-tert-butil-p-cresol e galato de propila) para prevenir a oxidação da
astaxantina. O antioxidante preferencial tem sido o BHT, o qual é aprovado pela
FDA nos casos em que o produto final é utilizado como aditivo alimentar para peixes
que, normalmente, são destinados ao consumo humano. Normalmente, dependendo
do antioxidante usado, a quantidade adicionada durante a moagem é em torno de
0,05 a 5% (p/p) da quantidade de pó seco sendo moído (BOUSSIBA et al., 2000).
No entanto, para análises laboratoriais, quantitativas ou qualitativas, ou para
obtenção de astaxantina purificada com aplicação em alimentos ou farmacêutica, o
processo continua após a desidratação, com a recuperação da astaxantina usando
extração por CO2 supercrítico ou outras técnicas de extração de óleos, conforme a
utilização final da astaxantina.
Após o rompimento, o pigmento pode ser extraído com solventes orgânicos
como acetona (LABABPOUR e LEE, 2006; SARADA et al., 2002; KIM et al., 2005;
SUH et al., 2006; CIFUENTES et al., 2003; HARKER et al., 1995; KAMATH et al.,
2005; GARCIA-MALEA et al., 2006; OROSA et al., 2005; KOBAYASHI et al., 1993),
dimetil sulfóxido (DMSO) (TRIPATHI et al, 1998; BOUSSIBA e VONSHAK 1991;
CORDERO et al., 1996), metanol (KATSUDA et al., 2004; SCHOEFS et al., 2001),
diclorometano:metanol (25:75 v/v) (YUAN e CHEN 1998, 2000), acetona:metanol
(1:2 v/v) (FABREGAS et al., 2001). Segundo Lababpour e Lee (2006) a extração por
acetona tem boa sensibilidade, além de ser consideravelmente menos tóxica que
outros solventes como metanol, hexano, clorofórmio, n-propanol e acetonitrila.
Segundo Johnson e An (1991) o diclorometano (~30g/L), clorofórmio (~10g/L),
dimetilsulfoxido (~ 0.5g/L) e acetona (~ 0.2g/L) poderiam facilmente dissolver
astaxantina a temperatura ambiente. Foi reportado que 1L de diclorometano pode
dissolver 30g de astaxantina à temperatura ambiente e a solubilidade é maior que
em clorofórmio, acetona e DMSO (JOHNSON e AN, 1991; YUAN e CHEN, 2000).
Porém, Yuan e Chen (2000) observaram que apesar de o diclorometano ser um bom
solvente para extração de astaxantina, as células, debris e a solução extrato de
58
diclorometano não puderam ser separadas completamente por centrifugação e

algumas células e debris restaram ainda suspensas na solução de extrato. Quando
diclorometano foi misturado com metanol as células e debris suspensas na solução
de extrato poderiam ser completamente precipitadas por centrifugação a 10000g por
5-10 min. Além disso, Yuan e Chen (2000) observaram que mistura de metanol e
diclorometano foi um extrator efetivo para ésteres de astaxantina.
A Mera Pharmaceuticals (http://www.aquasearch.com/) tem desenvolvido um
método exclusivo de extração utilizando óleos comestíveis como solvente de
extração, uma vez que para aplicação humana o uso de solventes petroquímicos
pode causar preocupações com a saúde e/ou aceitabilidade devido possíveis
resíduos no produto final.
Análises
A análise de astaxantina tem sido realizada em experimentos laboratoriais por
HPLC com alta eficiência e sensibilidade (FABREGAS et al., 2001; SARADA et al.,
2002; CIFUENTES et al., 2003; SCHOEFS et al., 2001; GARCIA-MALEA et al.,
2006; OROSA et al., 2005; DONG e ZHAO, 2004) ou pela medida da absorbância
com espectrofotômetro (SARADA et al., 2002; SUH et al., 2006; KIM et al., 2005;
KAMATH et al., 2005; OROSA et al., 2005). A astaxantina tem sido determinada em
vários experimentos entre 474-480 nm (SARADA et al., 2002; OROSA et al., 2005;
CIFUENTES et al., 2003; SCHOEFS et al., 2001; KAMATH et al.., 2005;
KOBAYASHI et al., 1993; DONG e ZHAO, 2004) que é a faixa do máximo de
absorção da astaxantina (MIAO et al., 2006). Alguns autores têm utilizado o HPLC
equipado com detector PDA (matriz de fotodiodos) para a análise qualitativa e
quantitativa dos carotenóides (OROSA et al., 2005; BRINDA et al., 2004; KATSUDA
et al., 2004).
Diversas fases móveis para eluição têm sido usadas, por exemplo, solvente
isocrático consistindo de acetonitrila, metano e água (75:25:10) (SARADA et al.,
2002), ou a seqüência metanol 100%/acetonitrila:água (90:10)/ acetato de etila
100% (CORDERO et al., 1996), metanol puro (KATSUDA et al., 2004), etc.
Purificação
A complexidade da composição de pigmentos no extrato da alga faz com que
seja difícil separar todos os pigmentos numa única corrida cromatográfica, bem
59
como é difícil separar todos os ésteres de astaxantina (YUAN e CHEN, 1998; MIAO
et al., 2006). Segundo Yuan e Chen (1998), apesar de inúmeros métodos de HPLC
para separação de pigmento do H. pluvialis serem reportados, poucos são
apropriados para a separação simultânea de astaxantina, isômeros de astaxantina,
ésteres de astaxantina, outros carotenóides e clorofilas na alga.
• Saponificação
Segundo Yuan e Chen (2000) para a obtenção de astaxantina purificada a
partir de ésteres de astaxantina (presente em grande quantidade no H. pluvialis) é
necessário inicialmente fazer-se a saponificação do extrato para hidrólise dos
ésteres. O processo de saponificação descrito Yuan e Chen, 2000 por consiste
basicamente na hidrólise do extrato bruto de astaxantina com uma solução
previamente preparada de NaOH 0,107M dissolvido em metanol. O processo é
realizado sob atmosfera de nitrogênio e a seguir a mistura é evaporada e
concentrada sob nitrogênio e novamente adicionado NaOH e então é mantido 12
horas em banho de água, no escuro e sob nitrogênio.
Segundo Yuan e Chen (1999) alta temperatura favorece a hidrolise dos
ésteres de astaxantina mas também promove a degradação da astaxantina. Logo
com o objetivo de estudar o efeito da temperatura na hidrolise dos ésteres de
astaxantina e a na degradação da astaxantina durante a saponificação Yuan e Chen
(2000) monitoraram diferentes temperaturas (5, 10 e 15ºC) observando que a alta
temperatura (ex. 15ºC) a velocidade inicial de hidrólise é maior (8h), mas a
concentração final de astaxantina livre é menor, apresentando maior degradação,
enquanto em baixa temperatura (5ºC) a velocidade de hidrólise foi mais lenta, mas a
concentração final de astaxantina livre foi maior (94,3% de astaxantina livre após
12horas de saponificação).
A concentração da solução metanólica de NaOH é importante para promover
a hidrolise e minimizar a degradação da astaxantina durante esta etapa (YUAN e
CHEN, 1999). Yuan e Chen (2000) também avaliaram diferentes concentrações de
NaOH (0.018, 0.021, 0.026, 0.032 M) na reação a 5ºC e observou que a 0.021M foi a
concentração ótima para completa hidrólise após 12horas sem causar degradação
da trans-astaxantina a 5ºC. Com este método e saponificação ésteres de trans-
astaxantina no extrato de pigmento foi quase completamente hidrolisado e 94.4% de
60
trans-astaxantina livre foram produzidas do total de ésteres de trans-astaxantina, e a

degradação foi de 5.6% .
• Separação
Após a saponificação o extrato passa pela etapa de separação. Yuan e Chen
(1998) descreveram um método de HPLC em gradiente de fase reversa usando uma
coluna semipreparativa 250x10mm Beckman Ultrasphere C18 (5μm) a 25ºC e a fase
móvel descrita na tabela 7, para separação dos ésteres de astaxantina e isômeros
de astaxantina a partir de extratos saponificados e insaponificados do pigmento em
Haematococcus pluvialis. Observou-se que em comparação com os ésteres de
astaxantina, a astaxantina e a luteína são pouco retidos por colunas C18
comercialmente disponíveis, sendo estes dificilmente separados, o que poderia ser
melhorado pelo ajuste da proporção de água, metanol e acetonitrila. Os resultados
mostraram que 4 tipos de isômeros de astaxantina e ésteres de astaxantina,
(3S,3`S)-trans-astaxantina, (3S,3`S)-9-cis-astaxantina, (3S,3`S)-13-cis-astaxantina,
(3R,3`R)-trans-astaxantina e seus ésteres foram separados e identificados. Ainda
estabeleceram um método cromatográfico de purificação para obtenção preparação
de trans-astaxantina natural a partir do extrato saponificado de H. pluvialis isolando
3.7mg de astaxantina de 1g de biomassa seca de H. pluvialis. A astaxantina
purificada continha aproximadamente 97,7% de trans-astaxantina, 1,1% de cis-
astaxantina e 1,2% de impurezas.
Posteriormente, Yuan e Chen (2000) usaram um método cromatográfico
semipreparativo para purificação da trans-astaxantina usando coluna
semipreparativa 250x10mm Beckman Ultrasphere ODS (5μm) e a fase móvel
descrita na tabela 7. Os resultados indicaram que trans-astaxantina e cis-astaxantina
foram bem separadas na coluna de fase reversa e os carotenóides cantaxantina,
echinenona, e betacaroteno foram rapidamente eluídos pelo solvente B.
61
TABELA 7 - Fases móveis utilizadas para purificação e análises da astaxantina

Fase Móvel Função Autor
Diclorometano:metanol: acetonitrila:água Separação de trans-astaxantina, luteína e Yuan et al.
6,5:82:7,5:4 v/v cis isômeros de astaxantina (1997)
A: diclorometano:metanol:acetonitrila:água, A: separação de trans-astaxantina, Yuan e Chen
5.0: 85:5,5:4,5 v/v adonirubina, luteína e cis isômeros de (1998)
B: diclorometano:metanol:acetonitrila:água, astaxantina.
22:28:45,5:4,5 v/v B: eluição dos ésteres de astaxantina e o β-
caroteno
A: metanol:água:diclorometano 90:8:2 v/v A: separação e purificação da trans- Yuan e Chen
B: diclorometano e metanol 25:75 v/v astaxantina (2000)
B: lavagem da coluna e eluição da trans-
astaxantina
Segundo Yuan e Chen (1998) o comportamento de retenção e separação dos

carotenóides e clorofilas são significantemente afetados para proporção relativa do
diclorometano, metanol, acetonitrila e água na fase móvel. A presença de água
poderia aumentar a separação de carotenóides e clorofilas por aumento do tempo
de retenção destes e a presença de diclorometano melhorar a resolução obtida pela
adição de água. Para a purificação de trans-astaxantina Yuan e Chen (1998)
aumentaram o conteúdo de água e diminuíram a quantidade de diclorometano,
aumentando a separação de trans-astaxantina e adonirubina.
Segundo Yuan e Chen (1997) usando a fase móvel diclorometano:
metanol:acetonitrila: água (5.0: 85:5,5:4,5 v/v) é possível a separação de trans-
astaxantina, adonirubina, luteína e cis isômeros da astaxantina, enquanto os ésteres
de astaxantina e betacaroteno não poderia ser eluídos.
Miao et al. (2006) desenvolveram um método para melhorar a separação e
identificação dos carotenóides em H. pluvialis. O método de HPLC consistiu de um
Agilent serie 1100 com detector do tipo matriz de fotodiodos (PDA). Uma coluna
analítica YMC 250 x 4.6mm equipada com fase reversa de 5µm C18, incluindo uma
pré-coluna 10 x 4.6mm, usada a 20ºC. A fase móvel consistiu de um gradiente de 60
min de 83:17 para 98:2 (acetona/água), fluxo 0.8ml/min e injeção de 1,0µl. A faixa de
varredura foi de 300 para 800nm. Os resultados mostraram diferentes tempos de
retenção em cada componente do extrato de H. pluvialis. Carotenóides livres foram
eluídos em um tempo (time window) entre 6 e 15min, enquanto monoésteres de
astaxantina tipicamente levaram 20 a 34min e diésteres foram eluídos após 45min.
Como detectado por HPLC-PDA, a maioria dos compostos teve absorbância máxima
em aproximadamente 480nm, a qual é uma absorção característica do esqueleto da
astaxantina. O método melhorou a separação dos extratos pela desaceleração do
62
gradiente de acetona. Os resultados mostraram melhor separação dos ésteres de

astaxantina. Miao et al. (2006) identificou os ésteres de astaxantina em H. pluvialis
de acordo com a massa molecular e padrões de fragmentação característicos,
analisando em seguida os resultados pelo tempo de retenção em HPLC e LC-
(APCI)MS. Após análise por HPLC, 4 carotenóide livres, 15 monoésteres de
astaxantina e 12 diésteres de astaxantina foram identificados em H. pluvialis por
cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa com ionização química à
pressão atmosférica (LC-APCI)MS).
63
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MICRORGANISMO
A linhagem de microrganismo utilizada foi o Haematococcus pluvialis SAG 34-

1b, obtido da coleção de microrganismos SAG (Sammlung von Algenkulturen der
Universität Göttingen – Göttingen, Alemanha).
Taxonomia (Fonte: AlgaBase, 2007):

Reino: Plantae Ordem: Volvocales
Sub-Reino: Viridaeplantae Família: Haematococcaceae
Filo: Chlorophyta Gênero: Haematococcus Flotow
Sub-Filo: Chlorophytina Espécie: pluvialis Flotow
Infra-Filo: Tetraphytae Nome botânico: Haematococcus pluvialis Flotow
Classe: Chlorophyceae
A cepa foi mantida em meio inclinado ESP com incubação a 25±1ºC por 15
dias e em seguida refrigerado. Os repiques foram realizados mensalmente.
3.2 MEIOS DE CULTURA
3.2.1 Meios de Cultivo para Haematococcus pluvialis SAG 34-1b

• Meio SAG (SAG, 2006)
Componentes Solução Estoque Solução
(g/100ml) Nutriente
KNO3 1 20
K2HPO4 0.1 20
MgSO4 . 7H2O 0.1 20
Extrato de Solo * 30
Solução de Micronutrientes ** 5
Água Destilada 905
O pH inicial foi ajustado em 6.0 utilizando-se soluções 0,1N NaOH e/ou 0,1N
HCl e em seguida, o meio foi esterilizado em autoclave a 121°C/1 atm, por 20
minutos.
* Preparo do Extrato de Solo:
64
Preencheu-se um frasco de 6L com 1/3 de terra de jardim,sem fertilizante ou

agentes protetores de plantas. Adicionou-se água deionizada até 5cm acima do nível
de terra e esterilizou-se por aquecimento com vapor fluente duas vezes durante 1
hora em um intervalo de 24 horas. O extrato foi decantado por centrifugação e
descartou-se o sedimento. O sobrenadante foi armazenado em frascos, autoclavado
por 15 minutos a 121ºC/1atm e estocado em refrigerador.
** Preparo da solução de micronutrientes
Componentes Solução Estoque (g/100ml) Quantidade
ZnSO4 . 7H2O 0.1 1ml
MnSO4 . 4H2O 0.1 2ml
H3BO3 0.2 5ml
Co(NO3)2 . 6H2O 0.02 5ml
Na2 MoO4 .2H2O 0.02 5ml
CuSO4 . 5H2O 0.0005 1ml
Água Destilada - 981ml
FeSO4 . 7H2O - 0,7g
EDTA - 0,8g
Os componentes foram autoclavados separadamente em duas soluções (I e

II) que foram misturadas após resfriamento:
Solução I: 881ml de água destilada + Soluções estoque de todos os sais exceto
FeSO4 + 0.4 g EDTA
Solução II: 100 ml água destilada + 0.7 g FeSO4 + 0.4 g EDTA
• Meio MBBM (Meio Bold`s Basal Modificado)

Componentes Quantidade
CaCl2 . 2H2O 25mg
NaNO3 249mg
K2HPO4 75mg
KH2PO4 175mg
NaCl 25mg
FeSO4 .7H2O 5mg
MgSO4.7H2O 75mg
EDTA Na. 45mg
Solução de micronutrientes 5ml/L
Extrato de Solo 30ml
Água Destilada 970ml
O pH inicial foi ajustado em 6.0 com soluções 0,1N NaOH e/ou 0,1N HCl e,
em seguida, o meio foi esterilizado em autoclave a 121°C/1 atm, por 20 minutos.
65
• Meio mixotrófico
O cultivo mixotrófico foi realizado pela adição de 2g/L de acetato de sódio ao
meio de cultivo MBBM. O pH inicial foi ajustado em 6.0 utilizando-se soluções 0,1N
NaOH e/ou 0,1N HCl e em seguida, o meio foi esterilizado em autoclave a 121°C/1
atm, por 20 minutos.
3.2.2 Meio de Manutenção para Haematococcus pluvialis SAG 34-1b
Culturas estoque foram mantidas em tubos inclinados contendo meio ESP

(SAG, 2006).
Meio ESP = Meio SAG + 0,1% proteose-peptona + 1,5% ágar
O meio foi distribuído em tubos e esterilizado em autoclave a 121°C/1 atm,

por 20 minutos. Em seguida, os tubos foram inclinados até a solidificação.
FIGURA 15: Tubos com meio inclinado ESP com colônias de H. pluvialis.
3.3 CONDIÇÕES DE CULTIVO
• Temperatura
A temperatura foi mantida constante em todos os experimentos a 25 ±1˚C.
• Aeração
Os experimentos realizados em fotobioreator foram mantidos sob aeração de
por borbulhamento de ar de 400ml/min (0,08 vvm). Nos experimentos realizados em
erlenmeyer, os frascos foram agitados manualmente uma vez ao dia.
66
• Fotobioreator:
Desenvolveu-se um fotobioreator vertical (figura 16) com 5 lâmpadas
fluorescentes brancas independentes entre si, para que fosse possível manipular as
condições de crescimento vegetativo (baixa intensidade de luz) e indução de strees
(alta intensidade de luz) à cultura. O cultivo foi realizado em garrafões de 15L, com
5L de meio de cultura. A indução de stress por alta intensidade de luz foi realizada
pela adaptação de lâmpadas fluorescentes brancas junto às paredes do garrafão de
cultivo.
FIGURA 16: Fotobioreator vertical utilizado para cultivo de H. pluvialis
• Fotoperíodo
Todos os experimentos foram realizados sob fotoperíodo de 12:12h.
• Iluminação
As iluminações usadas para os diferentes experimentos foram:
1º) Cinética de crescimento do H. pluvialis com diferentes meios de cultivo:
Lâmpada fluorescente, intensidade de 1,5 Klux;
2º) Cinética de crescimento do H. pluvialis com diferentes intensidades de luz:
Lâmpada fluorescente, intensidade de 1,5 Klux e 2,7Klux;
3º) Estudo do ciclo evolutivo e alterações morfológicas das células do H.
pluvialis:
Crescimento vegetativo: Lâmpada fluorescente, intensidade de 1,5 Klux;
Indução da produção de astaxantina: Lâmpada fluorescente, intensidade de
4,2 Klux
67
4º) Análise da influência de diferentes pHs iniciais no crescimento vegetativo do

H. pluvialis e na produção de astaxantina:
4,2 Klux
5º) Análise da influencia de diferentes pHs controlados no crescimento
vegetativo e produção de astaxantina:
4,2 Klux.
6º) Avaliação da influencia de diferentes pHs contínuos e diferentes
concentrações de sal sob o crescimento celular e produção de astaxantina:
Lâmpada fluorescente, intensidade de 2,5 Klux
7º) Cinética de crescimento do H. pluvialis com diferentes cores e influência
sobre a produção de astaxantina:
LEDs de coloração vermelha, laranja, branca, violeta verde e azul.
8º) Teste de sensibilidade a antibióticos como método alternativo de inibição da
contaminação em cultivos mixotróficos de H. pluvialis.
Lâmpada fluorescente, intensidade de 2,0 Klux
9º) Planejamento experimental da produção de astaxantina por H. pluvialis em
diferentes concentrações de sal e intensidades de luz:
Lâmpada fluorescente, intensidades de 3,5 Klux, 5,3 Klux, 7,0 Klux.
• LEDs
Foram adaptados 6 LEDs de cada cor (vermelha, laranjada, branca, violeta
verde e azul) às paredes de frascos erlenmeyer de 1L contendo 300ml de meio de
cultura. Os frascos foram colocados em uma caixa com divisórias para evitar a
passagem de luz de um frasco para outro e recoberto com papel alumínio para
aumentar a intensidade da iluminação, conforme mostra a figura 17.
68
FIGURA 17: Cultivo de H. pluvialis em erlenmeyers, com LEDs de diferentes cores.
• pH
Os experimentos de análise da influência do pH (4º, 5º e 7º) foram ajustados
inicialmente (4º) ou continuamente (5º e 7º) em pH 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 e 9.0 com a
adição diária de soluções 0,1N NaOH e/ou 0,1N HCl.
• Salinidade
A salinidade foi ajustada nos experimentos com diferentes concentrações de
sal, pela adição de NaCl.
• Inóculo
Os inóculos foram obtidos pela inoculação com suspensão de microalgas
(obtida pela adição de água estéril à cultura em meio inclinado ESP) em erlenmeyer
contendo meio SAG e incubados de 8-10 dias, para que estivessem em fase de
crescimento vegetativo. Os inóculos foram utilizados na proporção de 10% em
relação ao volume de meio de cultivo.
• Antibióticos:
O teste de sensibilidade a antibióticos foi realizado em placas de Petri com
discos de papel comerciais nas concentrações de antibióticos padronizados pela
OMS e FDA para uso humano. Utilizou-se os antibióticos descritos na tabela 7:
TABELA 7 - Nome genérico e concentração dos discos de antibiograma utilizados.

Amoxicilina 10mcg Cefotaxima 30mcg Estreptomicina 10 mcg Ofloxacina 5 mcg
Ampicilina 10mcg Cefepime 30mcg Gentamicina 10mcg Penicilina G 10mcg
Bacitracina 20mcg Ciprofloxacina 5mcg Licomicina 2mcg Sulfonamida 30mcg
Cefazolina 30mcg Cloranfenicol 30mcg Neomicina 30mcg Vancomicina 30mcg
Cefalexina 30mcg Eritromicina 15mcg Norfloxacina 10mcg
69
3.4 MÉTODOS ANALÍTICOS
• Análise de Biomassa
A análise da biomassa foi realizada por coleta diária de amostra, em
duplicata, para determinação da turbidez, peso seco e densidade celular.
Através da absorbância:
Coletou-se 2 ml de amostra e determinou-se medida da absorbância nos
comprimentos de onda de 550nm (JEON et al., 2006), 680nm e 750nm (KATSUDA
et al., 2004), utilizando-se espectrofotômetro (Shimadzu, UV-1601PC, Kyoto, Japan).
A partir dos resultados obtidos pela análise turbidimétria a 680nm e 750nm
pode-se calcular o peso seco pelo método de Katsuda et al. (2004) a partir da
fórmula:
Peso Seco Calculado = [-4,2 x (OD680-OD750) + 1,4] x OD680

OD680
Onde, OD680 é a densidade óptica a 680nm e OD750 é a densidade óptica a

750nm.
Peso Seco:
Foram centrifugados 10ml de amostra, a 3500rpm (2034 x g) por 20minutos.
O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi seco em estufa a 100ºC por 24h.
Contagem de Células:
O número de células foi estimado por contagem em câmara de Neubauer,
sendo:
no de células/ml = no total de células contadas x fator de diluição x 10.000
no de quadrantes contados
• Análise de Pigmento
Extração
Foram centrifugados 2ml de amostra em tubo Falcon a 3500rpm (2034 x g)
por 5 minutos. Descartou-se o sobrenadante e o pigmento foi extraído do sedimento
70
pelo método de Sedmak (SEDMAK et al., 1990), adicionando-se ao sedimento 0,5ml

de DMSO pré-aquecido a 55ºC, a mistura é agitada em vórtex por 20-30 segundos,
0,1ml de fosfato de sódio 0.01M pH 7.0 foram adicionados para a separação dos
carotenóides em 1ml de solvente orgânico, adicionado em seqüência. Os tubos
foram então agitados em vórtex por 30-40 segundos para misturar a fase aquosa e a
fase orgânica. As fases foram então separadas por centrifugação por 5 minutos. A
fase orgânica foi removida e determinou-se a absorbância a 480nm.
Procurou-se evitar o contato com a luz, recobrindo-se os tubos Falcon com
papel alumínio e armazenando-se o extrato em frascos âmbar fechados com tampa
de borracha.
Através da absorbância:
Foi realizada a medida da absorbância no comprimento de onda de 480nm,
para determinação da astaxantina e 680nm, para determinação da clorofila (MIAO et
al., 2006), utilizando-se espectrofotômetro (Shimadzu, UV-1601PC, Kyoto, Japan). A
análise de astaxantina foi realizada em ambiente escuro para evitar a sua
degradação.
Microscópica
A produção de pigmento, mudança de morfologia e eficiência da extração
foram avaliados microscopicamente.
• Comparação entre solventes

A comparação entre os solventes extratores (acetona, acetonitrila,
clorofórmio, hexano e diclorometano:metanol 25:75v/v) após extração pelo método
de Sedmak et al. (1990) utilizando-se os diferentes solventes e a seguir foi realizada
a determinação em espectrofotômetro (Shimadzu, UV-1601PC, Kyoto, Japan) por
varredura espectral nos comprimentos de onda de 400nm a 700nm e por análise
microscópica.
• Tratamento de Dados
Todos os experimentos foram realizados em duplicata e os resultados
apresentados correspondem à média dos valores obtidos de cada amostra.
71
a) Velocidades Específicas de Crescimento:

Foram analisadas as curvas obtidas pela determinação de um modelo de
regressão polinomial utilizando o software Microsoft Excel 2007, com os valores
experimentais de peso seco e/ou contagem de células em função do tempo (d-1) e, a
seguir, o modelo foi usado para determinação analítica da velocidade específica de
crescimento (µ) por dia (d-1), expressa pela equação.
µ =1/X . dX/dt
Onde: dX/dt é a derivada da biomassa (g/L ou número de células/ml) em

relação do tempo e X é a concentração celular (g/L ou número de células/ml), em
função do tempo de crescimento.
b) Velocidade de encistamento:
A partir dos dados obtidos de um modelo de regressão polinominal, calculou-
se a velocidade de encistamento celular através da formula:
µencistamento = dAx:chl/dt
Onde: dAx:chl/dt é a derivada da relação entre a concentração de astaxantina

(480nm) e clorofila (680nm) em relação do tempo de indução de stress para
formação de cistos.
c) Produtividade Média de Astaxantina:

A produtividade média foi calculada por:
Produtividade média = ΔN
Δt
Onde ΔN é a variação na densidade celular e Δt o intervalo de tempo
considerado para os respectivos valores de N.
d) Conversão de unidades de luz (para lâmpada branca fluorescente)

1 mol de fótons = 6.022 x 1023 fótons.
µmol fótons m-2s-1 = 74 x Lux
Lux = 0.014 x µmol fótons m-2s-1 (Fonte: Environmental Growth Chambers,
2007)
72
d) Planejamento experimental:
Para a confecção dos gráficos de planejamento experimental transferiu-se os
dados tabulados no software Microsoft Excel 2007 para o Software Statistica 4.3
(STASOFT).
73
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 ESTUDO FISIO-MORFOLÓGICO
Com o objetivo de aprofundar os conhecimentos do ciclo de vida do H.

pluvialis, acompanhou-se as mudanças morfológicas da microalga durante o
crescimento vegetativo e após indução de stress por alta intensidade de luz.
O H. pluvialis é uma microalga eucarionte, unicelular, que vive em colônias e
se reproduz assexuadamente por formação de esporos móveis, chamados
zoósporos (esporos flagelados). Possui forma elipsoidal, esférica ou formato de pêra
Parede Celular Citoplasma
Cloroplasto
Núcleo
Tilacóide
Envelope Núclear
Membrana interna e externa
Nucléolo
Citoesqueleto Vacúolo
Reticulo Endoplasmático Rugoso Peroxissomo
Astaxantina
Reticulo Endoplasmático Liso
Complexo de Golgi
Ribossomo
Flagelos
Mitocondria
FIGURA 18: Corte esquemático da Célula vegetativa de Haematococcus pluvialis (LGPM, 2007).
O ciclo celular descrito na figura 19 compõe-se de células vegetativas verdes

flageladas (1), começo da perda do flagelo (2) e formação de aplanosporos (3)
aumentando de tamanho e reproduzindo-se por divisão celular no interior da célula
mãe (4). No entanto, sob condições desfavoráveis é inibida a divisão celular,
formando-se cistos resistentes vermelhos (5), ricos em astaxantina.
74
1
4
3 5
FIGURA 19: Ciclo de vida do H. pluvialis.
Do 1º dia até, aproximadamente, o 16º de cultivo, observou-se células

esféricas, verdes, móveis (biflageladas), de tamanho relativamente pequeno e
parede celular fina, com material gelatinoso adjacente ligando-se ao citoplasma
localizado na região central, como pode ser visualizado na figura 20. É possível
visualizar no citoplasma a presença de vacúolos que, segundo Canter-Lund e Lund
(1995) é comumente presente em microalgas flageladas e todas as algas de água
doce e responsável pelo equilíbrio osmótico. No interior do citoplasma encontram-se
os cloroplastos contendo tilacóides, no interior dos quais se encontra o pigmento
clorofila, que conferem coloração verde à alga e tornam a fotossíntese possível,
como está esquematizado na figura 18 (CANTER-LUND e LUND, 1995).
Parede Celular
Flagelo
Material
Gelatinoso
Citoplasma
FIGURA 20: Célula vegetativa de H. pluvialis (100x).
A partir do 16º dia, observaram-se células verdes, porém sem flagelo

(aplanosporos) e de tamanho aumentado (formação de cistos verdes), demonstrado
na figura 21. Isso foi observado também por Kobayashi et al. (2001) que relatou a
75
mudança na morfologia com aumento de tamanho da parede celular durante a

maturação celular.
FIGURA 21: Formação de aplanósporos de H. pluvialis (100x).
Nos dias subseqüentes (18º - 20º dia), algumas células iniciaram a produção
de astaxantina, o que foi observado pelo conteúdo celular vermelho no citoplasma
celular. Nota-se que a formação da astaxantina se inicia na região central e se
expande para o resto da célula radialmente, demonstrado na figura 22.
FIGURA 22: Início da formação de astaxantina no interior da célula de H. pluvialis (100x).
No 23º dia de cultivo foi realizada a indução de stress por alta intensidade de
luz, observando-se a formação de cistos vermelhos após o 5º dia de indução (Figura
23). No entanto, têm se relatado diferentes tempos de indução da formação de
cistos, variando com as condições de stress (OROSA et al., 2005, HARKER et al.,
1996, CIFUENTES et al., 2003). Segundo Lorenz e Cysewski (2000) dentro de 2 a 3
dias após o stress da cultura os haematocistos são formados e dentro de 3 a 5 dias
após a formação dos haematocistos, eles estão prontos para colheita. Segundo
Canter-Lund e Lund (1995) a formação de astaxantina é um indicativo de condições
76
desfavoráveis no meio e os cistos podem reverter para a forma vegetativa sob

condições favoráveis. Acredita-se ainda que na natureza a produção de astaxantina
esteja relacionada à proteção a luz ultravioleta ou deficiência de nutrientes
(CANTER-LUND e LUND, 1995). Segundo Harker et al. (1996) os cetocarotenóides
estão presentes em glóbulos lipídicos citoplasmáticos dentro do cloroplasto.
FIGURA 23: Cistos vermelhos de H. pluvialis
Observou-se que, quando não foi realizada a indução de stress para

formação de cistos vermelhos, as células “envelheceram” antes da formação de
cistos, visualizando-se algumas células em degradação, células brancas e/ou morte
celular (figura 24), sem que houvesse formação de cistos vermelhos. Isso indica que
a indução gradual não é efetiva para a formação dos cistos, sendo necessária uma
indução abrupta, logo que se atinge a fase estacionaria de crescimento, para obter-
se o máximo rendimento de formação de astaxantina.
(a) (b) (c)
FIGURA 24: (a) morte celular, com completa degradação da clorofila (100x). (b) e (c) degradação
celular em aumento de 100 e 40x, respectivamente.
Com relação ao tamanho das células, observou-se um aumento gradativo

durante o ciclo evolutivo (Figura 25). Segundo é relatado por alguns autores, as
células vegetativas de H. pluvialis medem em torno de 15-20 µm (GARCIA-MALEA
77
et al., 2006; LABABPOUR e LEE, 2005) chegando a 35- 50 µm (KOBAYASHI et al.,

2001; LABABPOUR e LEE, 2005) após a formação dos cistos vermelhos. Segundo
Kobayashi et al. (2001) o diâmetro dos cistos celulares varia com a condição de
stress e está diretamente relacionada à quantidade de astaxantina.
FIGURA 25: Relação entre o tamanho da célula vegetativa e do cisto do H. pluvialis.
4.2 CINÉTICA DE CRESCIMENTO EM DIFERENTES MEIOS DE CULTIVO.
O estudo da cinética de crescimento do H. pluvialis SAG 34-1b em diferentes

meios de cultivos, foi realizado com o objetivo de verificar a influência deste no
crescimento vegetativo e selecionar o meio a ser utilizado nos experimentos
seguintes.
Monitorou-se o crescimento vegetativo do H. pluvialis em meios de cultura
autotróficos (SAG e MBBM) e mixotrófico (MBBM + acetato de sódio) por um período
de 27 dias e os resultados obtidos estão representadas nas figuras 26, 27, 28 e 29.
A determinação da biomassa foi realizada por 4 métodos de análise, para que
futuramente fosse realizada a correlação e avaliação destes.
FIGURA 26: Resultados da cinética de crescimento em meio SAG e MBBM, obtidos pela análise da
turbidez, no comprimento de onda de 550nm.
78
FIGURA 27: Resultados da cinética de crescimento em meio SAG e MBBM, obtidos por
contagem celular.
FIGURA 28: Resultados da cinética de crescimento em meio SAG e MBBM, obtidos pela
determinação do peso seco.
FIGURA 29: Resultados da cinética de crescimento em meio SAG e MBBM, obtidos pelo cálculo do
peso seco com o método de Katsuda et al. (2004).
Dentre os meios de cultivo autotróficos, MBBM e SAG, estimou-se a

velocidade específica média de crescimento de 0.35d-1 e 0.27 d-1, respectivamente,
sendo as curvas de crescimento logarítmico e velocidade específica de crescimento
dos respectivos meios, representadas pelas figuras 30 e 31. Vários autores têm
reportado velocidade de crescimento do H. pluvialis sob diferentes condições de
79
cultivo autotróficos, variando de 0.21d-1 em cultivos em escala comercial

(OLAIZOLA, 2000) e laboratorial (KAEWPINTONG et al., 2006, CIFUENTES et al.,
2003) a 0.64d-1 (OROSA et al., 2005, CIFUENTES et al., 2003) e excepcionalmente
0,9d-1 em cultivos laboratoriais (GRUNGEWALD et al., 1997, HAGEN et al., 1993).
Logo, a velocidade específica de crescimento obtida em nosso estudo ficou dentro
da faixa esperada, embora próximo ao limite inferior.
(a) (b)
FIGURA 30: (a) Gráfico do logaritmo do peso seco (g/L) em função do tempo, obtido em meio de
cultivo SAG; (b) Curva de velocidade específica de crescimento em meio de cultivo SAG,
baseado na determinação do peso seco.
(a) (b)
FIGURA 31: (a) Gráfico do logaritmo do peso seco (g/L) em função do tempo, obtido em meio de
cultivo MBBM; (b) Curva de velocidade específica de crescimento em meio de cultivo
MBBM, baseado na determinação do peso seco.
Os dados de biomassa obtidos pela determinação do peso seco (g/L) no meio

SAG e MBBM, foram utilizados para gerar modelos polinomiais com regressão (R2)
de 0,998 e 0,997 respectivamente, representados pelas seguintes equações:
Para o meio SAG:

Biomassa (g/L) = 5E-08x6 - 3E-06x5 + 7E-05x4 - 0,000x3 - 4E-05x2 + 0,023x - 0,002
80
Para o Meio MBBM:

Biomassa (g/L) = 4E-06x4 - 0,000x3 + 0,005x2 - 0,012x + 0,049
Onde, x corresponde ao tempo (dias) em que foi determinada a biomassa.
Não foi possível analisar o crescimento em meio mixotrófico, devido a

problemas recorrentes de contaminação bacteriana, possivelmente decorrentes de
contaminação no próprio inóculo e/ou presença de fonte de carbono orgânica no
meio. A dificuldade em controlar-se a contaminação em cultivos mixotróficos já tem
sido relatada por alguns autores (GARCIA-MALEA et al., 2006; KAEWPINTONG et
al., 2006), contudo não tem se observado mudança significante na velocidade de
crescimento nos cultivos mixotróficos em relação aos cultivos autotróficos, sendo
que os valores relatados em cultivo mixotróficos têm variado de 0,25d-1 (TJAJONO et
al., 1994) a 0,58d-1 (KATSUDA et al., 2004, KOBAYASHI et al., 1993). Assim sendo,
optou-se por continuar os estudos com meios autotróficos.
Em nossos experimentos, a máxima contagem celular foi obtida no meio SAG
(1,26 x 105 céls/ml) no 20º dia de análise enquanto o meio MBBM apresentou
máxima contagem celular de 0.92 x 105 céls/ml, no 21º dia de cultivo. Tem-se
relatado baixa densidade máxima celular exibida por esta microalga em diferentes
condições de cultivo autotróficas, o menor valor relatado foi 0,54 x 105 céls/ ml em
meio autotrófico F1 (KAEWPINTONG et al., 2006) no entanto, a grande maioria dos
resultados relatam densidade celular de 1,0-2,5x105 células/ml (GRUNGEWALD et
al., 1997; HAGEN et al., 1993; CIFUENTES et al., 2003, TRIPATHI et al., 1998) e
excepcionalmente 5,5x105 células/ml (KOBAYASHI et al., 1993; SUH et al., 2006).
No entanto, tem se observado crescimento vegetativo de 12 – 15 dias (FABREGAS
et al., 2001; TRIPATHI et al., 1999; KAEWPINTONG et al., 2006; SUH et al., 2006).
Logo, a densidade celular obtida nos dois meios de cultivo testados (SAG e
MBBM) foi relativamente baixa e observou-se prolongada fase vegetativa nos meios
selecionados em comparação aos relatados em literatura, provavelmente em função
da menor concentração do inóculo e ainda indicando a necessidade de otimização
das condições de cultivo durante a fase vegetativa de crescimento, visando obter-se
maior concentração de biomassa e menor tempo de cultivo.
O meio SAG apresentou, durante todo o período de análise, células
vegetativas verdes móveis, enquanto as células em meio MBBM começaram a
apresentar aplanosporos a partir do 17º dia de análise. No entanto, apesar das
81
células começarem a perder o flagelo e aumentarem de tamanho, não houve

acúmulo aparente de astaxantina nos meios SAG e MBBM mesmo após 27 dias de
cultivo, indicando que as células podiam manter-se neste meio, mas não tão ativas
quanto as células vegetativas.
Têm-se relatado que o crescimento do H. pluvialis é bastante influenciado
pelo tipo de meio de cultura (Kaewpintong et al., 2006); nossos resultados também
demonstram diferença na cinética de crescimento do H. pluvialis nos meios SAG e
MBBM, embora vários fatores ambientais possam afetar o crescimento da microalga.
O meio SAG apresentou maior produtividade média (7.23 x 103 céls. ml-1d-1) embora
tenha menor velocidade específica de crescimento celular, mas apresentou maior
tempo de crescimento exponencial. Enquanto o meio MBBM, apresentou maior
velocidade específica de crescimento, mas menor período de crescimento
exponencial, apresentando produtividade média de (4.71 x 103 céls. ml-1d-1). Uma
vez que as condições de crescimento foram as mesmas, esta variação na cinética
de crescimento microalgal nestes meios, possivelmente deve-se às maiores
concentrações de nitrato e fosfato no meio MBBM, apresentando-se mais “rico” que
o meio SAG.
A fonte de nitrogênio também pode ser responsável pela diferença na
cinética observada entre os meios SAG (KNO3) e MBBM (NaNO3), uma vez que
vários autores têm reportado a importância da fonte de nitrogênio e/ou sua
concentração na divisão celular (CIFUENTES et al., 2003; OROSA et al., 2005;
SARADA et al., 2002). Sarada et al. (2002) testou diferentes fontes de nitrogênio
(Ca(NO3)2, KNO3, NH4NO3 e NaNO3), observando máxima concentração celular em
nitrato de potássio e a menor em nitrato de amônio. Segundo Sarada et al., 2002 as
células que cresceram em KNO3 foram menores que as que cresceram nas outras
fontes de nitrato, enquanto o conteúdo de clorofila foi maior em nitrato de sódio e
menor em nitrato de potássio. Cifuentes et al. (2003) também observaram variação
na velocidade de crescimento em diferentes fontes de nitrogênio de 0,44d-1 (uréia),
0,59d-1 (NaNO3) e 0,70d-1 (NH4 Cl).
4.3 CINÉTICA DE CRESCIMENTO COM DIFERENTES INTENSIDADES DE LUZ.
Em virtude da maior produtividade obtida no meio SAG em relação ao meio

MBBM no experimento anterior, optou-se pela utilização do meio SAG para os
82
experimentos seguintes. Visando-se verificar a influência da irradiação no

crescimento vegetativo, comparou-se a cinética de crescimento do H. pluvialis em
meio autotrófico SAG sob diferentes intensidades de luz (1,5 e 2.7 Klux).
Analisando-se as curvas de crescimento, representadas pela figura 32, é possível
visualizar claramente a influência deste fator ambiental no crescimento vegetativo
desta microalga.
(a) (b)
FIGURA 32: (a) Gráfico da absorbância a 550nm em função do tempo em cultivos sob diferentes
intensidades de luz; (b) Gráfico do peso seco calculado (método de Katsuda et al., 2004)
em função do tempo, em cultivos sob diferentes intensidades de luz.
.
A partir de modelos criados com os dados da determinação do peso seco,
obteve-se as seguintes equações:
Para crescimento em 2,7Klux (R² = 0,999):

Biomassa (g/L) = 2E-06x4 - 0,000x3 + 0,004x2 + 0,006x + 0,007
Para crescimento em 1,5Klux (R² = 0,999):
Biomassa (g/L) = 6E-08x6 - 5E-06x5 + 0,000x4 - 0,001x3 + 0,004x2 + 0,010x + 0,008
A velocidade específica média de crescimento sob intensidade de luz 1,5Klux

foi de 0,27d-1, apresentando máxima contagem celular de 1,26 x 105 céls/ml no
21ºdia, enquanto no cultivo sob intensidade de luz de 2,7 Klux obteve-se velocidade
de crescimento de aproximadamente 0,54 d-1 e a máxima contagem celular foi de
2,62 x105 céls/ml no 17º dia de cultivo, sendo as curvas de crescimento logarítmico
observadas na figura 33. A produtividade média obtida no cultivo sob maior
intensidade de luz foi 12,9 x 103 céls. ml-1d-1, representando um aumento de 89% em
relação à produtividade média obtida no meio sob 1,5 Klux (7.23 x 103 céls. ml-1d-1).
83
Conforme os valores descritos na literatura e citados anteriormente, os resultados

obtidos no cultivo sob intensidade de luz de 2,7 klux está entre os melhores
resultados relatados em meio de cultivo autotrófico, refletindo a influência da
intensidade de luz sob o cultivo autotrófico do H. pluvialis.
Contudo sabe-se que a intensidade de luz deve ser controlada para evitar
fotoinibição e indução da formação de cistos. A intensidade de luz ideal para
crescimento vegetativo diverge entre os diferentes autores variando de 1,48 Klux
(KAEWPINTOG et al., 2006) a 4,44-8,14 Klux (BOUSSIBA et al., 2000). Além disso,
Kaewpintog et al. (2006) relatou inibição de crescimento a partir de 3,7 Klux. Logo,
as intensidades testadas estão dentro dos valores encontrados na literatura.
(a) (b)
FIGURA 33: (a) Gráfico do logaritmo do peso seco em função do tempo, obtido em meio de cultivo
SAG 2,7 Klux. (b) Gráfico logaritmo do peso seco em função do tempo, obtido em meio
de cultivo SAG 1,5 Klux .
4.4 COMPARAÇÃO DAS TÉCNICAS DE DETERMINAÇÃO DE BIOMASSA
A relação entre as 4 técnicas utilizadas para análise da biomassa nos

experimentos de cinética de crescimento, estão representadas na figura 34,
podendo-se observar que as técnicas apresentam excelente proporcionalidade, no
entanto considerando-se os valores de peso seco como referência observou-se leve
superestimação nos valor obtidos pela determinação da absorbância (550nm).
Assim, em razão da praticidade e proporcionalidade da técnica em relação às outras
determinações, optou-se por utilizar o peso seco calculado (pelo método de Katsuda
et al., 2004), para as medidas de biomassa nos experimentos seguintes.
84
Relação entre Peso Seco e Núm ero de Relação entre Peso seco e a absorbância
Células/m l (550nm )
0,8 0,8
0,7 0,7
0,6 0,6
0,5 0,5
g/L
0,4
g/L
0,4
0,3 0,3
0,2 0,2
0,1 0,1
0 0
0 100000 200000 300000 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800
Células/m l Absorbância
Relação entre Peso Seco Calculado (g/L`) e

Peso Seco Experim ental (g/L)
0,8
0,7
0,6
0,5
g/L
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800
g/L`
Figura 34: Relação entre as técnicas de determinação da produção de biomassa
4.5 ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DE DIFERENTES pHs INICIAIS
De forma a continuar os estudos de crescimento vegetativo e indução da

produção de astaxantina, investigou-se o efeito de diferentes pHs iniciais, visando-se
a otimização da produção de biomassa e de pigmento.
A análise do crescimento vegetativo sob diferentes pHs iniciais apresentou
velocidade especifica média, em cada um dos meios de cultivo, de 0.38d-1, 0,43 d-1,
0.45 d-1, 0.40d-1 e 0.39d-1 nos pHs 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 e 9.0, respectivamente. As
curvas de crescimento podem ser visualizadas nas figuras 35 e 36.
85
FIGURA 35: Resultados da determinação do peso seco calculado em função do tempo, em meios
com diferentes pHs iniciais.
FIGURA 36: Curva logarítmica do peso seco calculado (g/l) em função do tempo, em meios com
diferentes pHs iniciais.
Observou-se durante o crescimento um considerável e rápido aumento no pH

do meio, como pode ser visualizado na figura 37, com estabilização após o 11º dia
de cultivo, possivelmente devido ao consumo, pela microalga, dos ânions que são
nutrientes. Mesmo assim, o pH inicial teve influência sobre o crescimento vegetativo.
As produtividades médias obtidas nos meios sob pH 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 e 9.0 foram
respectivamente 0,035 g.L-1d-1, 0,040 g.L-1d-1, 0,043 g.L-1d-1, 0,034 g.L-1d-1, 0,034
g.L-1d-1. Logo, a faixa de pH inicial de 6.0 -7.0 apresentou os melhores resultados de
velocidade de crescimento e produtividade média em relação aos outros cultivos,
embora se tenha observado pouca influência do pH inicial sob o crescimento
vegetativo. Os resultados obtidos são semelhantes aos relatados por Labapour et al.
(2004) que testou diferentes pHs iniciais (6,8, 7,8 e 8,8) e observou aumento do pH
para 10.0 após 150 horas de cultivo e crescimento semelhante em todos os meios
de cultivo. Sarada et al. (2002), utilizando meio BBM sob diferentes pHs iniciais
86
observaram máxima contagem celular em culturas a pH 7.0, não havendo

crescimento em pH 5.0 e a menor contagem celular observada foi em pH 9.0.
FIGURA 37: Mudança do pH durante o cultivo em meios de cultura com diferentes pHs iniciais.
A indução da produção de astaxantina foi realizada no 21º dia de cultivo,

expondo as culturas a condições de stress, por alta intensidade de luz. Conforme é
observado na figura 38, o pH inicial do meio teve influência significante sob a
indução de stress no cultivo de H. pluvialis. Os meios com pH 8.0 e 9.0 foram os
primeiros a apresentar produção de astaxantina com rápida degradação da clorofila.
Os demais meios mostraram lenta produção de astaxantina e degradação da
clorofila, mostrando-se de coloração verde-amarronzada, embora
microscopicamente, observou-se a formação de cistos celulares, mas sem acúmulo
aparente de astaxantina. Possivelmente este resultado se deva aos meios em pH
8.0 e 9.0 terem entrado em fase de declínio antes dos demais, mostrando-se como
um fator de stress importante para produção de cistos com astaxantina. Nossos
resultados foram contrários aos relatados por Sarada et al. (2002), que observaram
maior produção de astaxantina nas culturas que cresceram em pH inicial 7.0 em
relação às que cresceram em pH 6.0, 8.0 e 9.0. No entanto, Sarada et al., 2002
também observaram que a melhor produção de astaxantina por condição de stress
precede drástica degradação da clorofila.
Os resultados mostraram que a resposta ao de stress varia com o pH inicial
do meio e os pHs 8.0 e 9.0 foram os melhores em termos de produção de
astaxantina.
87
(a) (b)
FIGURA 38: (a) Gráfico da absorbância a 680 nm (proporcional à concentração de clorofila);

(b) Gráfico da absorbância a 480 nm (proporcional à concentração de astaxantina).
4.6 ANÁLISE DA INFLUENCIA DE DIFERENTES pHs CONTROLADOS
O crescimento vegetativo sob pH controlado apresentou resultados

significantemente melhores, além de ter apresentado maior influência sobre o
crescimento vegetativo, que o experimento anterior com pHs iniciais. Conforme é
visualizado nas figuras 39 e 40, o cultivo em pH 7.0 apresentou novamente os
melhores resultados para obtenção de biomassa, contudo observou-se fácil
contaminação do cultivo sob esta condição. As velocidades especificas médias
estimadas em cada um dos meios de cultivo foram de 0,18d-1; 0,45 d-1; 0,58 d-1;
0,40d-1 e 0,39d-1 nos pHs 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 e 9.0, respectivamente. Todos os cultivos
comportaram-se melhor sobre pH controlado que sob pH inicial, com exceção do
cultivo em pH 5.0 que tem se mostrado inadequado para produção de biomassa de
H. pluvialis. As produtividades obtidas foram de 0,028 g.L-1d-1, 0,053 g.L-1d-1, 0,076
g.L-1d-1, 0,045 g.L-1d-1 e 0,043 g.L-1d-1. Não foi encontrado, nas referências
consultadas, relatos na literatura utilizando cultivo com pH controlado, por isso não
foi possível comparar nossos resultados.
88
FIGURA 39: Gráfico de crescimento vegetativo, obtido pela determinação do peso seco em função do
tempo, em meios de cultivo com diferentes pHs controlados.
FIGURA 40: Gráfico do logaritmo do peso seco em função do tempo, em meios de cultivo com
diferentes pHs controlados.
Os resultados obtidos pela indução da produção de astaxantina sob alta

intensidade de luz em cultivos com pH controlado foram os mesmos observados
anteriormente nos cultivos com diferentes pHs inicias. A figura 41 mostra nitidamente
a produção de astaxantina nos cultivos em pH 8.0 e 9.0 no 6º dia de indução
enquanto os outros cultivos (pH 5.0, 6.0 e 7.0) permaneceram verdes. Logo, os
cultivos em pH 8.0 e 9.0 mostraram-se novamente como condição alternativa para
indução de stress na biomassa de H. pluvialis, destacando-se o cultivo em pH 8.0
em que a degradação da clorofila foi mais rápida que o cultivo em pH 9.0.
89
FIGURA 41: Da esquerda para direita estão os cultivos em pH 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 e 9.0,
respectivamente, após a indução de stress por alta intensidade de luz.
4.7 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL COM DIFERENTES pHs E SALINIDADES
Realizou-se um planejamento experimental com duas variáveis

independentes, pH e salinidade, visando-se avaliar as melhores condições de
crescimento vegetativo e produção de astaxantina sob estes parâmetros, além de
verificar a sensibilidade desta microalga à salinidade. O planejamento contou com 9
pontos e foi analisado por 21 dias para crescimento vegetativo e por 6 dias após a
indução para avaliação da produção de astaxantina.
Plotando-se os dados de crescimento vegetativo, por determinação do peso
seco, em função do tempo (figura 42), verificou-se um máximo de população em pH
7.0 e 0% de sal, havendo inibição do crescimento nos meios sob concentração de
sal a partir de 0,4% .
90
Figura 42: Gráfico da concentração de biomassa em função do tempo, para diferentes pHs e
concentrações de NaCl durante o cultivo. Utilizou-se a escala secundária para os cultivos
em pH 5.0/1,0% NaCl, pH 7.0/0,4% NaCl e pH 9.0/1,0% NaCl.
O maior crescimento em pH 7.0/0% NaCl era esperado; quanto ao

comportamento da microalga em outros pHs e salinidades, utilizou-se os dados para
gerar modelos (Figura 43), a partir dos quais foi determinada a velocidade e
produtividade da biomassa; estes dados foram, por sua vez, usados para gerar uma
superfície de resposta usando o software Statistica, que podem ser vizualizados a
seguir (Figuras 44, 45 e 46).
Biomassa
real (g/L)
Biomassa
estimada (g/L)
Figura 43: Relação entre a biomassa estimada e a biomassa real para todos os modelos, indicando
boa correlação entre valor real e estimado.
91
Tabela 8: Dados do modelo de crescimento utilizados para avaliação estatistica.

-1 -1 -1
pH Salinidade µ (d ) Produtividade máxima (g.L d )
5,0 0 0,27 0,041
6,0 0 0,41 0,053
7,0 0 0,49 0,059
8,0 0 0,35 0,050
9,0 0 0,34 0,046
5,0 1 0,34 0,012
6,0 0,1 0,21 0,031
7,0 0,4 0,15 0,007
9,0 1 0,07 0,003
veloc especifica em funcao de pH e salinidade

z=-0,703+0,299*x-44,578*y-0,02*x*x-8,132*x*y+9139,52*y*y
1,000%
SAL
0,036
,400% 0,072
0,108
0,144
0,18
0,215
0,251
,100% 0,287
0,323
0,359
0,000%
4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 above
PH
FIGURA 44: Velocidade específica de crescimento em função do pH e salinidade.
produção de biomassa em fução de pH e salinidade

z=-1,001+0,477*x-229,997*y-0,033*x*x-0,535*x*y+18357,8*y*y
1,000%
SAL
0,064
,400% 0,128
0,192
0,257
0,321
0,385
0,449
,100% 0,513
0,577
0,642
0,000%
4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 above
PH
FIGURA 45: Diagrama da produção de biomassa em função do pH e salinidade.

92
produtividade máxima (g/L.dia) em função do pH e salinidade

z=-0,063+0,032*x-15,376*y-0,002*x*x-0,31*x*y+1382,86*y*y
1,000%
SAL ,400%
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
,100% 0,039
0,044
0,049
0,000%
4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 above
PH
FIGURA 46: Diagrama da produtividade máxima de biomassa em função do pH e salinidade.
Estatisticamente, os pontos de salinidade e pH analisados foram insuficientes

para definir com precisão o ponto ótimo para crescimento vegetativo do H. pluvialis,
logo, os gráficos obtidos apresentaram um elevado grau de incerteza à análise. De
acordo com a análise do Statistica, não é possível afirmar que haja efeito
significativo do pH ou da salinidade na velocidade específica máxima de
crescimento, na faixa analisada, no entanto, houve significativo efeito linear negativo
da salinidade na produtividade de biomassa, ficando clara a sensibilidade do H.
pluvialis a altas salinidades. Contudo, conforme era esperado, verificou-se que altas
salinidades são inibitórias ao crescimento vegetativo, sendo os melhores resultados
obtidos em ausência de sal e o pH ideal provavelmente encontra-se na faixa de 6,5
e 7.5.
Para avaliar a influência do pH e salinidade sob a produção de astaxantina
inicialmente analisou-se a absorbância em 480nm em função do tempo, conforme a
figura 47, e a relação entre a clorofila e astaxantina, conforme a figura 48.
Figura 47: Gráfico da absorbância a 480nm em função do tempo, sob diferentes condições de pH e salilidade
93
Figura 48: Gráfico da relação 480:680nm (proporcional a relação Ax/Chl) em função do tempo, sob
diferentes condições de pH e salinidades.
A partir dos dados de produção de astaxantina, razão abs 480/ abs 680
(proporcional a relação Ax/Chl) e a velocidade de variação dessa razão, descritos na
tabela 9, foram criados modelos utilizados para gerar gráficos 3D no Statistica, que
são visualizados nas figuras 49, 50 e 51.
Tabela 9: Dados do modelo de indução da astaxantina, utilizados para avaliação estatistica.

-1
pH salinidade abs 450 ax/chl max veloc. Encistamento (d )
5 0 0,144 0,625429 0,091732
6 0 0,244 3,18776 1,1688839
7 0 0,31 4,829979 0,6131642
8 0 0,624 20,87525 5,9063904
9 0 0,648 18,17157 4,5766495
5 1 0,365 6,118066 1,9073098
6 0,1 0,316 3,063188 1,307575
7 0,4 0,796 12,54532 3,4426714
9 1 0,605 21,55705 8,6497445
FIGURA 49: Gráfico 3D da absorbância a 480nm em função do pH e salinidade.

94
Figura 50: Gráfico 3D da razão Ax/Chl em função do pH e salinidade.
Figura 51: Gráfico 3D da velocidade de encistamento [ d(Ax/Chl)/dt ] em função do pH e salinidade.
A regressão feita utilizando o software mostrou significante efeito linear

positivo do pH e quadrático negativo da salinidade sobre a variação da absorbância
a 480nm, o que significa que maiores pHs induziram a produção de astaxantina
enquanto a salinidade apresentou efeito positivo até um limite a partir do qual
observou-se efeito negativo. A velocidade de encistamento e a relação Ax/Chl
variaram linearmente com o pH. Possivelmente, o ponto ótimo de obtenção de
astaxantina está num intervalo de salinidade entre 0,5 e 0,7% e pH maior que 8.0.
Fica claro, que tanto os valores de pH quanto salinidade têm importante influência
sobre a produção de astaxantina.
95
Não se encontrou, nas referências consultadas relatos da avaliação

simultânea destes parâmetros sobre o crescimento vegetativo e produção de
astaxantina para comparação dos resultados obtidos, no entanto várias pesquisas
têm apresentado concentração de sal entre 0,2% e 0,4% (CORDEIRO et al., 1996;
HARKER et al., 1996) como ideal para encistamento, sendo observado
branqueamento celular sob concentrações superiores a 0,8% (CIFUENTES et al.,
2003; HARKER et al., 1996).
4.8 CINÉTICA DE CRESCIMENTO COM DIFERENTES LEDS E INFLUÊNCIA

SOBRE A PRODUÇÃO DE ASTAXANTINA.
O LED é um diodo semicondutor que quando energizado emite luz visível

monocromática, produzida pelas interações energéticas do elétron. Vários artigos
tem relatado a utilização de LEDs para a fotossíntese em plantas com mais
eficiência do que as lâmpadas fluorescentes e incandescentes (TENNESSEN et al.,
1995; SMITH, 1982; GOINS et al., 1997). Logo, uma vez que o H. pluvialis é um
microrganismo fotossintético, testamos 6 diferentes cores de LEDs (vermelho,
branco, alaranjado, azul, verde e violeta) em cultivo autotrófico, para avaliar a
influencia sobre o crescimento do vegetativo e formação de cistos.
Os resultados obtidos no cultivo sob diferentes LEDs estão ilustrados nas
figuras 52, 53, 54 e 55. Observou-se inibição do crescimento e/ou morte celular nos
cultivos sob iluminação verde, violeta e laranja. No entanto nos cultivos com LEDs
branco, vermelho e azul observou-se velocidades especificas médias de
crescimento de 0.34d-1, 0.50d-1 e 0,38d-1 e produtividade média de 0.019 g.L-1d-1,
0,030 g.L-1d-1 e 0,016 g.L-1d-1, respectivamente. Já foi reportado por Katsuda et al.
(2004) a indução do crescimento vegetativo com a utilização de LED vermelho em
cultivo de H. pluvialis, no entanto este observou supressão do crescimento
vegetativo sob LED azul e a indução de intenso acúmulo de astaxantina. Além disso,
observamos crescimento vegetativo sob LED branco, que atualmente não são
vendidos emitindo luz branca pura resultando da mistura de azul, vermelho e verde
(General Eletrical Company, 2007), justificando o crescimento intermediário entre o
LED vermelho e o azul em nosso experimento.
Contudo, a velocidade de crescimento relatada por Katsuda et al. (2004) em
cultivo mixotrófico com LEDs vermelho foi de 0,60d-1 e, em detrimento com nossas
96
cinéticas anteriores, acreditamos que nossos resultados de crescimento vegetativo

podem ser melhorados com aplicação de maior intensidade de luz vermelha e
associando-se estratégias como pH controlado ou cultivo mixotrófico para
otimização da produção de biomassa.
FIGURA 52: Gráfico de crescimento vegetativo, obtido pela determinação do peso seco calculado,em
meios sob iluminação com diferentes LEDs.
(a) (b)
FIGURA 53: (a) Gráfico do logaritmo do peso seco calculado, obtido em cultivo sob iluminação de LED branco;
(b) Curva de velocidade específica de crescimento em cultivo sob iluminação de LED branco,
baseado na determinação do peso seco calculado.
(a) (b)
FIGURA 54: (a) Gráfico do logaritmo do peso seco calculado obtido em cultivo sob iluminação de LED vermelho;
(b) Curva de velocidade específica de crescimento em meio de cultivo sob iluminação de LED
vermelho, baseado na determinação do peso seco calculado.
97
(a) (b)
FIGURA 55: (a) Gráfico do logaritmo do peso seco calculado, obtido em cultivo sob iluminação de
LED azul; (b) Curva de velocidade específica de crescimento em meio de cultivo sob
iluminação de LED azul, baseado na determinação do peso seco.
Os dados de biomassa obtidos pela determinação do peso seco calculado no

meios com LEDs branco, vermelho e azul, foram utilizados para gerar modelos
polinomiais, representados pelas seguintes equações:
Para o cultivo com LED branco (R² = 0,999):

Biomassa (g/L) = -6E-05x3 + 0,002x2 - 0,001x + 0,023
Para o Cultivo com LED vermelho (R² = 0,998):
Biomassa (g/L) = -0,000x3 + 0,005x2 - 0,024x + 0,065
Para o Cultivo com LED azul (R² = 0,999):
Biomassa (g/L) = -6E-05x3 + 0,002x2 - 0,007x + 0,025
Quanto a influência dos LEDs na indução de produção de astaxantina não

observou-se produção aparente de astaxantina em nenhum dos cultivos por 10 dias.
No entanto no cultivo sob iluminação azul verificou-se a formação de pequenas
incrustações de cistos vermelhos nas paredes do erlenmeyer exatamente nas
posições onde o LED estava fixado, assim possivelmente o LED azul exerça
influência sobre a produção de astaxantina, como relatado por Katsuda et al. (2004),
mas é provável que em nossos experimentos a intensidade utilizada tenha sido
inferior a necessária. Ou ainda, supõe-se que a indução da produção de astaxantina
não esteja diretamente relacionada à emissão de LED azul e sim ao stress pela
intensidade de luz aplicada, uma vez que, tem-se relatado que o espectro de
absorção na luz visível da clorofila concentra-se na faixa da luz vermelha (660nm) e
azul (430nm) (GOINS et al., 1997), melhorando o processo de fotossíntese em
98
plantas com a aplicação de “reforços” nessa faixa espectral com LEDs

(TENNESSEN et al., 1995; SMITH, 1982; GOINS et al., 1997) o que possivelmente,
seria aplicável à estimulação do crescimento microalgal.
4.9 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL COM DIFERENTES SALINIDADES E

INTENSIDADES DE LUZ
Aplicando-se três diferentes intensidades de luz (3,5, 5,3, 7,0 Klux), a 5

diferentes concentrações de sal (0, 0,2, 0,4, 0,8 e 1,0%) sob células de H. pluvialis
na fase estacionária de crescimento, realizou-se um planejamento experimental com
2 variáveis independentes (em 3 e 5 níveis) e 15 pontos. O aumento da absorbância
a 480nm em função do tempo de indução em cada ponto é visualizado na figura 56,
onde observa-se aumento da absorbância em todos os níveis de indução e as
figuras 57 e 58 mostram a absorbância a 680nm e a relação Ax/Chl em função do
tempo de indução, respectivamente.
Abs.
0,5 7 klux, 0% sal
7 klux, 0,2% sal
0,45 7 klux, 0,4% sal
0,4 7 klux, 0,8% sal
7 klux, 1% sal
0,35 5,3 klux, 0% sal
0,3 5,3 klux, 0,2% sal
5,3 klux, 0,4% sal
0,25 5,3 klux, 0,8% sal
0,2 5,3 klux, 1% sal
3,5 klux, 0% sal
0,15 3,5 klux, 0,2% sal
0,1 3,5 klux, 0,4% sal
3,5 klux, 0,8% sal
0,05 3,5 klux, 1% sal
0 Tempo de
0 1 2 3 4 5 6 Indução (dias)
Figura 56: Gráfico da absorbância a 480nm em função do tempo, sob diferentes condições de
irradiação e salinidade.
99
Figura 57: Gráfico da absorbância a 680nm em função do tempo, sob diferentes condições de
irradiação e salinidade.
Figura 58: Gráfico da relação Ax/Chl em função do tempo, sob diferentes condições de irradiação e
salinidade.
A partir dos dados acima, criou-se modelos que foram utilizados para gerar
superfícies de resposta, por regressão, no Statistica, da absorbância 480nm, 680nm
e relação Ax/Chl em função da salinidade e intensidade de luz que são visualizados
nas figuras 59, 60 e 61.
100
FIGURA 59: Gráfico 3D da absorbância a 480nm em função da salinidade e intensidade de luz.
FIGURA 60: Gráfico 3D da absorbância a 680nm em função da salinidade e intensidade de luz.
FIGURA 61: Gráfico 3D da relação Ax/Chl em função da salinidade e intensidade de luz.

101
Estatisticamente, o modelo proposto apresentou influência positiva linear da

intensidade de luz e salinidade sob a absorbância 450nm, no entanto a salinidade
apresentou influência negativa (quadrática), refletindo um intervalo ótimo de
salinidade para indução da produção de astaxantina. Aproximadamente no intervalo
entre 0,5 e 0,7% as NaCl e intensidade de luz a partir de 7,0 Klux estariam as
melhores condições de encistamento e salinidades; a partir de 0,7% diminuiria a
concentração de astaxantina, possivelmente devido ao aumento da mortalidade
celular. Tanto o aumento da intensidade de luz quanto de salinidade têm efeito
negativo sobre a concentração de clorofila (absorbância 680nm) e positivo sobre a
razão Ax/Chl.
Nossos resultados indicam que tanto a intensidade de luz quanto a
concentração de sal foram fatores significativos na indução da produção de
astaxantina em H. pluvialis, contudo, o Statistica indicou maior efeito do aumento da
intensidade de luz sobre a carotenogênese que a salinidade. Vários estudos têm
sido publicados utilizando-se isoladamente altas intensidades de luz e diferentes
salinidades para a indução da produção de astaxantina. Dentre eles, tem-se relatado
que o efeito da luz é o fator indutivo isolado mais importante para a indução da
astaxantina (KIM et al., 2006) em relação à indução por salinidade, deficiência de
nitrogênio (HARKER et al., 1996, CINFUENTES et al., 2003) e altos níveis de ferro
(HARKER et al., 1996).
Os valores ótimos de intensidade de luz para indução de astaxantina,
encontrados nas referências consultadas varia de 6,3 a 11,1 Klux (CIFUENTES et
al., 2003; HARKER et al., 1996). Quanto a salinidade, embora muitos autores tenha
relatado bons resultados na carotenogênese com concentrações menores de sal
(0,2%) (CORDEIRO et al., 1996) e alta taxa de mortalidade sob stress salino a 0.8%
(CIFUENTES et al., 2003, HARKER et al., 1996). Logo, os resultados obtidos estão
de acordo com os encontrados em literatura.
Tem-se relatado também drástica degradação da clorofila durante a
carotenogênese em vários artigos (CIFUENTES et al., 2003, SARADA et al., 2002).
Do inicio da indução (fase estacionaria de crescimento com presença de
aplanósporos) ao sexto dia de análise, observamos degradação de 82% sob o
conteúdo de clorofila na condição de 7,0 klux/1,0% NaCl e 57% sob 3,5 klux e 0%
NaCl.
102
4.10 TESTE DE SENSIBILIDADE A ANTIBIÓTICOS
A facilidade de contaminação de cultivos mixotróficos por bactérias, nos levou

a verificar a resistência do H. pluvialis a diversos antibióticos. Dentre os 24
antibióticos testados observou-se resistência da microalga H. pluvialis aos
antibióticos listados na tabela 10, pela observação de colônias do H. pluvialis
próximas ao disco, enquanto nos demais, observou-se halo de inibição. A adição de
antibióticos ao meio de cultivo possibilitaria o cultivo mixotróficos, heterotrófico e,
ainda, cultivo autotrófico aberto, com menor potencial ou ausência de contaminação.
TABELA 10 - Antibióticos para os quais observou-se resistência do H. pluvialis é resistente.

Ampicilina 10 mcg Cefazolina 30 mcg Gentamicina 10 mcg
Amoxicilina 10 mcg Cefepime 30 mcg Ofloxacina 5 mcg
Bacitracina 20 mcg Cefotaxima 30 mcg
Recentemente, um estudo da aplicação de antibiótico para cultivo axênico de

H. pluviais foi publicado por Joo e Lee (2007) que testaram 12 diferentes antibióticos
(cefalosporina, griseofulvina, bacitracina, polimixina B, anfotericina B, eritromicina,
neomicina, tetraciclina, gentamicina, rifamicina, ampicilina e canamicina) e
observaram resistência com cefalosporina, griseofulvina, anfotericina B e ampicilina.
No entanto Joo e Lee, 2007 observaram que a cefalosporina e a anfotericina B
afetaram o crescimento da cultura e induziram a formação de astaxantina, por outro
lado, a adição de griseofulvina ou ampicilina não afetou o metabolismo celular e
permitiu aumento da produtividade, com resultados de densidade celular
comparáveis as obtidas em cultivo fechado, o qual é 10-30% maior que as obtidas
em cultivos abertos sem esterilidade.
Logo, acredita-se que a suplementação de antibióticos apropriados aos meio
de cultivo pode ser uma ferramenta eficiente, podendo reduzir a contaminação sem
afetar o crescimento ou outros metabolismos, embora mais estudos devêm ser
realizados para verificar a influência destes sobre a microalga.
4.11 AVALIAÇÃO DE MÉTODO QUÍMICO DE EXTRAÇÃO DA ASTAXANTINA
O método de Sedmak et al. (1990), é um método químico utilizado para

extração de astaxantina na levedura X. dendrorhous. Segundo Sedmak et al. (1990)
103
este método é rápido, quantitativo, reprodutível e pode ser usado em pequenos

volumes de amostra. Devido à praticidade deste método em pequenas quantidades
de amostra tentou-se adaptá-lo para a extração da astaxantina na microalga H.
pluvialis evitando-se assim, utilizar-se métodos mecânicos que requerem maiores
quantidades de amostra e são mais lentos.
Pode-se observar na figura 62, que o método de Sedmak foi eficiente na
extração do pigmento astaxantina nos cistos de H. pluvialis, sendo observado
completa extração do sedimento (2ml de amostra) após 2 repetições do método
utilizando acetona como solvente extrator. Embora se tenha observado
microscopicamente o rompimento de algumas células, a figura 63 indica que,
possivelmente, a extração ocorra por permeabilização da membrana celular. A
ruptura com DMSO é um método rápido e reprodutível em comparação aos métodos
mecânicos, logo é um método alternativo que pode ser usado com eficiência para a
extração da astaxantina em células de H. pluvialis.
(a) (b)
FIGURA 62: (a) Cisto integro de H. pluvialis; (b) Cisto de H. pluvialis durante extração pelo método de
Sedmak.
FIGURA 63: Células de H. pluvialis após a primeira extração pelo Método de Sedmak, utilizando
acetona como solvente extrator
104
4.12 COMPARAÇÃO ENTRE SOLVENTES EXTRATORES
Como foi apresentado na revisão bibliográfica (pg. 73), tem se observado a

extração da astaxantina utilizando-se diversos solventes extratores e, dentre eles, a
acetona tem sido um dos solventes orgânicos mais relatados em artigos para
extração de astaxantina.
Avaliou-se o potencial extrator dos solventes orgânicos: acetona, acetonitrila,
clorofórmio, hexano e mistura de diclorometano:metanol (25:75 v/v). Segundo os
resultados expostos na figura 64, dentre os solventes analisados, o de maior
potencial extrator da astaxantina foi a mistura de diclorometano:metanol e em
seguida a acetona. No entanto, comparando-se as absorbâncias obtidas a 680nm e
455nm observou-se maior extração das clorofilas a e b, respectivamente, pela
acetona que pela mistura de diclorometano:metanol. Para a completa extração do
pigmento astaxantina das células de H. pluvialis o método de Sedmak precisou ser
repetido 2 vezes com a mistura diclorometano:metanol, 4 vezes com a acetona, 6
vezes com acetonitrila, 7 vezes com clorofórmio e mais de 8 vezes com o hexano.
Lababpour e Lee (2005) testaram diversos solventes orgânicos (metanol,
hexano, clorofórmio, n-propanol e acetonitrila) e selecionaram a acetona como o
melhor para a extração do pigmento devido sua boa sensibilidade e baixa toxicidade
em relação aos demais testados. Lababpour e Lee (2005), também observaram
máxima absorbância da clorofila em acetona e mínima em clorofórmio, enquanto a
astaxantina mostrou máxima absorbância em acetonitrila e mínima em n-propanol.
Em nosso estudo a astaxantina apresentou menor absorção em acetonitrila que em
acetona.
FIGURA 64: Gráfico da extração da astaxantina com diferentes solventes (amostra diluída 1:2).
105
A eficiência do diclorometano:metanol (25:75 v/v) já havia sido relatado

anteriormente por Johnson e An, 1991 observando que 1L de diclorometano pode
dissolver 30g de astaxantina a temperatura ambiente e a solubilidade é maior que do
clorofórmio, acetona e DMSO. Yuan e Chen (1998) observaram a eficiência do
diclorometano como solvente extrator para a extração da astaxantina, mas
observaram que as células, debris e a solução extrato de diclorometano não
puderam ser separadas completamente por centrifugação e algumas células e
debris foram ainda suspensas na solução de extrato. Quando diclorometano foi
misturado com metanol às células e debris suspensos no extrato, poderiam ser
completamente precipitada por centrifugação a 10000g por 5-10 min. Além disso,
Yuan e Chen (2000) observaram que mistura de metanol e diclorometano foi um
extrator efetivo para ésteres de astaxantina.
Testou-se ainda a estabilidade da astaxantina e da clorofila nos extratos
obtidos com cada solvente por um período de 12 dias armazenado em frascos
âmbar a temperatura ambiente. Verificou-se boa estabilidade em acetona e na
mistura de diclorometano:metanol, não apresentando degradação (mesma
absorbância) até o último dia de análise. Os extratos com acetonitrila e clorofórmio
começaram a apresentar diminuição na absorbância gradativamente a partir do 6º
dia de armazenamento e no hexano, devido à sua alta taxa de evaporação, não foi
possível realizar o teste de estabilidade.
4.13 ALTERAÇÕES NO MÉTODO DE EXTRAÇÃO QUÍMICA
Tentando-se simplificar o método de Sedmak e verificar a possível

degradação da astaxantina pelo calor do DMSO pré-aquecido a 55ºC, comparou-se
os resultados obtidos com diferentes solventes utilizando-se DMSO aquecido
(método de Sedmak) e DMSO a temperatura ambiente (Sedmak modificado). Os
resultados demonstrados nas figuras 65 e 66 mostram melhores resultados
utilizando o Método de Sedmak modificado, indicando um a possibilidade de
degradação da astaxantina pela adição do DMSO aquecido, uma vez que tem-se
relatado a sensibilidade deste pigmento ao calor.
106
FIGURA 65: Comparativo entre o método de Sedmak e Sedmak modificado utilizando acetona como
solvente extrator (amostra diluída 1:2).
FIGURA 66: Comparativo entre o método de Sedmak e Sedmak modificado utilizando

diclorometano:metanol (25:75 v/v) como solvente extrator.
Os resultados obtidos indicam que a extração da astaxantina poderia ser feita

pelo metodo de Sedmak modificado usando DMSO à temperatura ambiente.
107
5 CONCLUSÃO
Os resultados encontrados neste trabalho fornecem dados bastante úteis para

os estudos com H. pluvialis, permitindo concluir que é possível otimizar a produção
de biomassa com condições que propiciem o aumento da velocidade de crescimento
vegetativo e produtividade média, além das condições de indução de astaxantina
com a aplicação de fatores de stress, isoladamente ou associados, tornado a
produção biotecnologica de astaxantina competitiva à síntese química. As melhores
condições de crescimento vegetativo obtidas em nosso estudo foram crescimento
em meio de cultivo SAG, iluminação com lâmpada fluorescente com intensidade de
2,7 klux e pH controlado 7.0, visualizados na tabela 11.
São vários os fatores responsáveis pelo acúmulo de astaxantina que podem
ser estudados e testados isoladamente ou associados. Em nossos resultados
podemos concluir que o stress é um fator acumulativo do estado fisiológico da
cultura e das condições de cultivo. Os melhores resultados foram obtidos nos
intervalos de entre 0,5 e 0,7% de NaCl e intensidade de luz a partir de 7,0 Klux, além
de observarmos influência do pH a partir de 8,0 sobre a carotenogênese.
TABELA 11 - Condições de cultivo do H. pluvialis e indução da produção de astaxantina.

Fator Condição Ideal Condição Aceitável
Para crescimento vegetativo
Meio de cultivo - SAG
Temperatura - 25±1
pH Controlado 7.0 Inicial 6.0 – 7.0
Iluminação 2,7 Klux 1,5 Klux
Aeração - 400ml/min
Salinidade 0% Até 0,1%
Para indução da produção de astaxantina
Iluminação A partir de 7,0 Klux A partir de 3,5 Klux
Salinidade 0,5 – 0,7% >0 % e < 0,7%
pH 8.0 8.0 – 9.0
O método químico de Sedmak et al. (1990) demonstrou ser um método

eficiente e prático para extração da astaxantina em células de H. pluvialis, embora
tenham sido obtidos melhores resultados sem o aquecimento do DMSO a 55ºC.
Dentre os solventes extratores testados a mistura de diclormetano:metanol (25:75
v/v) apresentou maior potencial extrator de astaxantina e boa estabilidade durante o
armazenamento.
108
6 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
1. Estudar e controlar os parâmetros de agitação e aeração nos cultivos de

Haematococcus pluvialis.
2. Analisar a condições de cultivo para formação de líquens por cultivo associado de
Xanthophylomyces dendrorhous e Haematococcus pluvialis
3. Seleção de cepas mutantes com maior velocidade de crescimento.
4. Avaliar os efeitos da astaxantina na proteção à radiação ultravioleta em humanos,
com possibilidade de aplicação em indústria de cosméticos.
109
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ - UFPR

ESTUDO DO CRESCIMENTO E INDUÇÃO DA PRODUÇÃO DO PIGMENTO

ASTAXANTINA POR Haematococcus pluvialis.

ESTUDO DO CRESCIMENTO E INDUÇÃO DA PRODUÇÃO DO PIGMENTO

ASTAXANTINA POR Haematococcus pluvialis.

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-

Orientador: Prof. Dr. Julio César de Carvalho

“Algumas pessoas percorrem ao nosso lado, vendo muitas luas passarem,

“Grandes foram as lutas, maiores foram as vitórias e o Senhor sempre

A microalga H. pluvialis, uma fonte do pigmento astaxantina, tem sido amplamente

Palavras-chave: Haematococcus, Astaxantina, Stress, Indução, Pigmento.

Key words: Haematococcus, Astaxanthin, Stress, Induction, Pigment.

ATCC – American Type Culture Collection

Com o desenvolvimento da indústria de alimentos tem-se observado o

quando comparado ao X. dendrorhous, muito embora, apresente baixa velocidade

1.1 OBJETIVO GERAL

Este trabalho consiste no estudo da produção e recuperação do pigmento

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1º) Estudar o ciclo de vida e a morfologia da microalga H. pluvialis, relacionando

1.3 SIGNIFICADO E IMPACTO DO ESTUDO

Os estudos com microalgas estão em crescente expansão no Brasil e no

A legislação brasileira define corante alimentar como uma substância ou

estudo realizado pelo grupo GENAMAZ (Projeto BRA/96/025 - SUDAM/PNUD) em

Mercado de Corantes Alim entícios

Art if iciais Idênticos aos naturais Caramelos Nat urais

FIGURA 1: Mercado mundial de corantes alimentícios em 1995 (DOWNHAM E COLLINS, 2000).

Segundo Downham e Collins (2000), o mercado de pigmentos naturais cresce

incluem plantas, microrganismos, algas e animais (SPEARS, 1988). Pigmentos

2.2 LEGISLAÇAO NACIONAL E INTERNACIONAL DE CORANTES

A lista de corantes sintéticos permitidos difere em diferentes países, mas o

EC No Nome Comum EC No Nome Comum

A seguir (tabela 2), estão descritos os corantes de uso permitido pela

A tabela 2 permite-nos observar o contraste entre o número de corantes

O termo carotenóides refere-se a uma classe de pigmentos naturais, de

Esta classe de pigmento compreende duas classes principais, os carotenos e

FIGURA 3: Exemplos típicos de carotenos e de xantofilas. O segmento linear destacado na estrutura

Em decorrência da presença das insaturações, os carotenóides são sensíveis

A astaxantina é um carotenóide de coloração vermelho-alaranjada, do grupo

poliinsaturados essenciais, proteção contra efeitos da luz UV e aumento da resposta

(3R, 3`S) meso

FIGURA 4: Fórmulas estruturais da astaxantina – estereoisômeros (STEPNOWSKI et al., 2004).

Conforme pode ser visualizado na figura 4, diferentes enantiômeros da

(MVA) e o isopentenil difosfato, sendo responsável também pela síntese de várias

2.4.1 Interesse Comercial da Astaxantina

Este carotenóide tem elevado interesse científico e comercial, devido ao

Figura 5: Mercado CEE de astaxantina (Fonte: FUENTE, 2006).

No entanto, atualmente, o maior consumo de astaxantina é na indústria de

carotenóides utilizada na alimentação destes peixes, sendo substituída nos dias

carotenóide e, consequentemente, prevenindo que outras moléculas ou tecidos

2.4.2 Astaxantina Natural x Astaxantina Sintética

A astaxantina pode ser produzida por síntese química ou biotecnológica (HU

indústria química BASF (BASF, 2006) o processo de síntese da astaxantina é um

FIGURA 6: Principais Produtores de Astaxantina (Adaptado de FUENTE, 2006).

Segundo Ausich (1997), as vantagens na síntese química de carotenóides

2.5 MICRORGANISMOS PRODUTORES DE ASTAXANTINA

A astaxantina foi primeiramente isolada e identificada em lagostas em 1938 e

biológicas (LIM et al., 2002). Fontes naturais importantes na obtenção de

TABELA 3 - Fontes naturais de astaxantina (Fonte: AlgaTechnologies, 2007)

Dentre os microrganismos citados, a levedura Xanthophyllomyces

totais, apresentou a maior relação entre a concentração de astaxantina livre e o