Análise Kjeldahl
Análise Kjeldahl
Análise Kjeldahl
Métodos de
análises químicas de
polpa fresca da maçã
Vice-Governador do Estado
Eduardo Pinho Moreira
Presidente da Epagri
Luiz Ademir Hessmann
Diretores
DOCUMENTOS Nº 241
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Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina (Epagri)
Rodovia Admar Gonzaga, 1347, Itacorubi, Caixa Postal 502
88034-901 Florianópolis, SC, Brasil
Fone: (48) 3665-5000, fax: (48) 3665-5010
Site: www.epagri.sc.gov.br
Ficha catalográfica
ISSN 0100-8986
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AUTORES
Bianca Schveitzer é Mestre em Química, responsável pelo Laboratório de
Ensaio Químico da Epagri/Estação Experimental de Caçador, localizada na Rua Abílio
Franco, 1500 – Caixa Postal 591, 89500-000, Caçador, SC. Contatos pelos telefones
(49) 3561-2034, (49) 3561-2010 (fax) e pelo e-mail: [email protected].
br.
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APRESENTAÇÃO
A Diretoria Executiva
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SUMÁRIO
Introdução................................................................................................................. 9
Referências ............................................................................................................. 22
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Introdução
Entre as frutas de clima temperado cultivadas no Brasil, a maçã ganha
destaque pela expansão em área plantada e em volume de produção alcançada
nos últimos 20 anos. De um total de 931ha em 1972, a área plantada passou para
18.041ha em 1980 e mais de 32.500ha em 2002, mostrando um incremento médio
de aproximadamente 500ha/ano nesse período (Epagri, 2012). Com esse crescente
aumento na cadeia produtiva, atualmente o Brasil apresenta perspectiva favorável
também para exportação do fruto e para produção e exportação de suco concentrado
de maçã, entre outros derivados (Rizzon et al., 2005). Em 2012, foram exportadas 39
mil toneladas, representando um crescimento de 15,5%, enquanto as importações
caíram 17,6% em comparação com igual período de 2011 (Epagri, 2012).
Atualmente, a produção anual de frutas no Brasil ultrapassa 34 milhões de
toneladas, correspondendo a 7,5% da produção total (Coan, 2006; Ferraz et al.,
2002), o que posiciona o País como o terceiro maior produtor de frutas no mundo. A
maior parte da produção de frutos é voltada para o mercado in natura, no qual, em
geral, os produtores conseguem maior retorno econômico, vendendo os excedentes
para a indústria a um preço menor.
Na grande variedade de frutos disponíveis, a maçã é uma fruta muito
apreciada pelo mercado em razão de sua característica sensorial e disponibilidade
comercial durante todo o ano por ser uma fruta que se conserva bem por períodos
longos.
Hoje, o setor produtivo da maçã no estado de Santa Catarina caracteriza-se
pela organização e profissionalização, sendo destaque entre as cadeias produtivas
de frutas no Estado. Do total de maçãs produzidas, cerca de 85% são consumidos in
natura e apenas 15% são industrializadas. Em relação aos cultivares, mais de 95%
dos pomares brasileiros são formados principalmente pelos cultivares Gala (incluindo
suas mutações Royal Gala e Imperial Gala) e Fuji (entre as quais Fuji Suprema e Kiko);
em seguida, vem a Golden Delicious. Todos esses cultivares são indicados para a
elaboração de suco (Rizzon et al., 2005).
A partir do momento da colheita, e comumente antes mesmo, iniciam-se os
cuidados de pós-colheita e preparação para consumo ou armazenagem dos frutos
para consumo posterior, na entressafra. Segundo Chitarra & Chitarra (1990), as perdas
pós-colheita de frutas e hortaliças podem ser classificadas em diversos tipos, quais
sejam: a) quantitativas, que correspondem à redução do peso pela perda de água
ou matéria seca, ou, ainda, pelo manuseio inadequado do produto; b) qualitativas,
que ocorrem em características sensoriais, como sabor ou aroma, ocasionando
deterioração na textura e aparência; c) nutricionais, através de redução no teor de
vitaminas, proteínas, lipídios e minerais, que podem acarretar outros danos aos
produtos, como o “bitter pit”, que é um distúrbio fisiológico verificado em todas
as áreas de produção de maçãs do mundo, associado ao baixo conteúdo de cálcio
(Ca) e a elevados teores de magnésio (Mg), potássio (K) e nitrogênio (N) nos frutos
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(Amarante et al., 2006; Argenta & Suzuki, 1994). Assim, um adequado suprimento
de Ca em maçãs retarda a maturação (Poovaiah et al., 1988) e reduz a incidência de
doenças e de diversos distúrbios fisiológicos pós-colheita, especialmente o “bitter
pit” (Meheriuk et al., 1994). Não somente a deficiência de Ca, mas também elevados
teores de Mg, K e N estão associados ao desenvolvimento de “bitter pit” nos frutos
(Argenta & Suzuki, 1994).
Dessa forma, é imprescindível determinar a concentração correta desses
nutrientes para poder avaliar as condições nutricionais dos frutos e, principalmente,
o potencial de conservação em câmaras frias, o que está relacionado com o teor de
nutrientes e suas relações na polpa fresca da fruta no estágio de pré-colheita.
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1 O Laboratório de Ensaio Químico da Estação
Experimental de Caçador
1.1 Estrutura do laboratório
A Figura 1 representa o fluxo do procedimento analítico no Laboratório de
Ensaio Químico da Estação Experimental de Caçador, desde o preparo das amostras
até os procedimentos analíticos propriamente ditos.
1.2 Amostragem
Todo o resultado das análises nutricionais depende de uma boa amostragem,
ou seja, da coleta de amostras representativas, para responder efetivamente às
necessidades e ao correto encaminhamento para o laboratório. Esse cuidado deve
ser rigorosamente observado e respeitado, uma vez que pode acarretar erros na
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interpretação dos resultados analíticos e na identificação das limitações nutricionais.
Para a análise dos teores de minerais na polpa fresca de maçã, recomenda-
-se colher frutos de calibre médio, sadios e sem danos. Para cada amostra, deve-se
coletar aproximadamente 20 frutos aleatoriamente na parte mediana das plantas. O
período de coleta é de 15 a 20 dias antes do ponto de colheita comercial (Suzuki &
Argenta, 1994). Os frutos devem ser acondicionados em saco plástico, identificados e
encaminhados para o laboratório. Durante a amostragem no campo, o produtor deve
ter o cuidado de coletar os frutos respeitando o prazo de carência da aplicação do
último tratamento químico. Após a amostragem, os frutos não devem ficar expostos
ao sol, e imediatamente devem ser encaminhados ao laboratório.
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um grande erro experimental na determinação da concentração correta dos
nutrientes contidos nas amostras.
Dessa forma, alguns procedimentos devem ser adotados para evitar
contaminações, que podem invalidar o resultado e ocasionar perda da amostra. Os
seguintes procedimentos são utilizados na lavagem de vidraria:
• Lavar com água corrente, escovando por dentro e por fora, e enxaguar duas
vezes com água corrente abundante;
• Levar à estufa para secagem a 60oC;
• Após os vidros secos, adicionar solução de detergente para vidrarias de
laboratório, Nochromix;
• Lavar várias vezes com água destilada;
• Enxaguar abundantemente com água desionizada;
• Levar novamente à estufa para secagem a 60oC.
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uso em cozinha, e deve ser feita de forma a homogeneizar totalmente a amostra e
formar uma espécie de papa com a polpa dos frutos.
Em seguida, as amostras são conduzidas para pesagem, para cada uma
das solubilizações, feitas com pipetadores automáticos. Como é muito difícil
pesar exatamente a massa da papa de maçã, o peso de cada amostra, para cada
solubilização, é devidamente anotado para posterior realização dos cálculos da
quantidade de nutrientes na massa da amostra pesada.
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2 Metodologia química
2.1 Solubilização sulfúrica para determinação de nitrogênio
a) Materiais e equipamentos:
• capela de exaustão;
• balança analítica;
• bloco digestor para 15 tubos de digestão;
• destilador Semi-micro Kjeldahl.
b) Reagentes e soluções:
• H2SO4 concentrado;
• H2O2 30%;
• Mistura catalítica:
- 100 partes de sulfato de potássio (K2SO4),
- 10 partes sulfato de cobre (CuSO4 . 2H2O),
- 1 parte de selênio elementar.
Deve-se misturar bem e levar a mistura à estufa a 60oC por aproximadamente
30 minutos, ou até a solução clarear.
c) Procedimento experimental:
• Pesar aproximadamente 5g de polpa triturada de cada amostra, dentro de
tubos para digestão macro, e anotar o peso para cálculo de concentração;
• Adicionar 1g da mistura catalítica;
• Adicionar 5ml de H2O2;
• Adicionar 5L de H2SO4 concentrado;
• Colocar os tubos no bloco digestor, aumentando a temperatura
gradativamente até cerca de 335oC. Deixar por uma hora ou mais, até a
completa digestão da matéria orgânica, caracterizada pela formação de um
líquido incolor ou levemente esverdeado;
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• Durante a digestão, colocar pequenos funis sobre a boca do tubo digestor a
fim de evitar a secagem do extrato;
• Deixar esfriar;
• Determinar o teor de nitrogênio pelo processo de destilação do Método
Semi-micro Kjeldahl.
a) Reagentes e soluções:
• Ácido bórico a 20g/L;
• 200g de H3BO3;
• Dissolver em 1,5L de H2O destilada, agitando até dissolver completamente o
sal;
• Reservadamente, pesar 0,198g de verde bromocresol e 0,132g de vermelho
de metila. Dissolver a mistura em 200ml de álcool etílico. Deixar sob agitação
constante por alguns minutos;
• Adicionar à mistura os 200g de ácido bórico pesado e dissolvido,
acrescentando 1,5L de álcool etílico;
• Completar o volume para 10L com H2O destilada;
• Solução estoque de H2SO4: transferir uma ampola de Tritisol® de H2SO4
concentrado (98%) para balão volumétrico de 1L, completando o volume
com água desionizada;
• NaOH 5N: Dissolver 1kg de NaOH em 5L de água desionizada;
• Álcool etílico 99o.
b) Procedimento experimental:
• Ao extrato digerido contido no tubo de digestão, obtido no item 2.1,
letra c, são acrescidos 50ml de água desionizada, devendo-se acoplá-lo
no destilador Semi-micro Kjeldahl (Figura 4, extremidade esquerda, com
solução transparente);
• Conectar na extremidade do condensador do destilador um erlemeyer
de 250ml contendo 10ml de solução de H3BO3 20g/L com a mistura de
indicadores (Figura 4, com solução laranja para destacar);
• Adicionar gradativamente ao extrato 10ml de NaOH 5N, o que, em
consequência da mudança de pH, liberará o nitrogênio que estava na forma
de sulfato de amônia (NH4SO4) para amônio (NH4+), que é volátil. Durante
esse processo o amônio é condensado por resfriamento e fixado pela
solução de H3BO3 + indicadores;
• A destilação deve ocorrer até atingir um volume aproximado de 50ml;
• Retirar o erlemeyer e titular com H2SO4 0,05N até o ponto de viragem,
caracterizado pela mudança na coloração da solução, que adquire a cor
rosa.
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Figura 4. Equipamentos utilizados para a destilação do nitrogênio
a) Materiais e equipamentos:
• capela de exaustão;
• balança analítica;
• bloco digestor para 40 tubos de digestão;
• espectrofotômetro UV-VIS;
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• espectrômetro de absorção atômica;
• lâmpada de cátodo oco de Ca, K e Mg.
b) Reagentes e soluções:
• H2SO4 concentrado;
• H2O2 30%.
c) Procedimento experimental
• Pesar aproximadamente 5g de polpa triturada em tubos para digestão de
50ml, fazendo anotações para cálculo de concentração;
• Adicionar 3ml de H2O2 30%;
• Adicionar 1,5ml de H2SO4 concentrado;
• Levar os tubos ao bloco digestor por 1 hora ou mais, aumentando a
temperatura gradativamente até cerca de 220oC;
• Permanecer nessa temperatura até o extrato apresentar cor transparente
e translúcida;
• Quando necessário, um excedente de peróxido de hidrogênio pode ser
adicionado lenta e gradativamente (0,5ml por adição) até o clareamento
do extrato;
• Deixar esfriar;
• Completar o volume para 50ml com água desionizada.
a) Reagentes e soluções:
• H2SO4 concentrado;
• (NH4)6.MoO24;
• (NH4)2.VO3;
• Curva analítica de P – preparar solução de P, contendo 0, 4, 8 e 12ppm em
ácido sulfúrico H2SO4 0,2mol/L;
• Solução de molibdato 50g/L:
- Dissolver 50g de (NH4)6.MoO24 em 800ml de água desionizada quente
- Deixar esfriar
- Completar o volume para 1L com água desionizada;
• Solução de vanadato 2,5g/L:
- Dissolver 2,5g de (NH4)2.VO3 em 500ml de água desionizada quente;
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- Adicionar 350ml de HNO3 65%;
- Deixar esfriar;
- Completar o volume para 1L com água desionizada;
• Manter as soluções em geladeira.
b) Procedimento experimental:
• Pipetar 5ml do extrato da solubilização peróxido de hidrogênio/sulfúrica;
• Adicionar 5ml de água desionizada;
• Adicionar 4ml da mistura dos reagentes molibdato e vanadato;
• Deixar reagir por aproximadamente 1 hora;
• Com auxílio de um espectrômetro a 420nm (Figura 5), efetuar a leitura do
fósforo no extrato solubilizado após a construção da curva analítica.
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at al., 2009). Nesse método, a solução-amostra é aspirada e nebulizada em uma
chama com a mistura ar-acetileno e convertida em vapor atômico. Alguns dos átomos
serão termicamente excitados pela chama, mas a maioria deles permanecerá em seu
estado fundamental. Para serem excitados, esses átomos precisam absorver radiação
específica, proveniente de uma lâmpada de cátodo oco que emite radiação na
chama no mesmo comprimento de onda, que será absorvido por eles. Os metais das
soluções aspiradas na chama, com temperatura entre 2.000 e 2.500oC, transformam-
-se em seu estado fundamental. Cada elemento químico absorve a energia em um
comprimento de onda definida, que é identificado pelo equipamento.
a) Reagentes e soluções
• La2O3;
• HNO3;
• Tritisol®, padrão de K, Ca e Mg;
• Solução de lantânio 5%:
- Pesar 58,6g de La2O3 para um balão volumétrico de 1L;
- Adicionar 250ml de ácido clorídrico (HCl) concentrado;
- Completar o volume com água desionizada;
• Solução de lantânio 0,4%: diluir a solução de La 5% em água destilada para
obter essa concentração;
• Curva analítica de Ca:
- Preparar a partir da solução de Tritisol® de Ca 1000g/L, padrões com
concentração de Ca: 0,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0ppm, em 10% de ácido sulfúrico
8,1N e com adição de 2ml de lantânio 5% para cada 100ml de amostra.
• Curva analítica do K e Mg:
- Preparar a partir da solução de Tritisol® de K e Mg 1000g/L, padrões
com misturas de K e Mg: 0,0 e 0,0; 2,0 e 0,5 ; 4,0 e 1,0; 6,0 e 2,0ppm,
respectivamente, em soluções ácidas.
b) Procedimento experimental:
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Figura 6: Espectrofotômetro de absorção atômica
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REFERÊNCIAS
1. AMARANTE, T.V.C.; CHAVES, D.V.; ERNANI, P.R. Análise multivariada de atributos
nutricionais associados ao “bitter pit” em maçãs ‘Gala’. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, v.41, n.5, p.841-846, 2006.
11. MEHERIUK, M.; PRANGE, R.K.; KIDSTER, P.D. et al. Postharvest disorders of
apples and pears. Ottawa: Agriculture and Agri-Food Canada, 1994. 67p.
(Agriculture and Agri-Food Canada. Publication, 1737/E).
12. POOVAIAH, B.W.; GLENN, G.M.; REDDY, A.S.N. Calcium and fruit softening:
physiology and biochemistry. Horticultura Reviews, v.10, p.107-152, 1988.
13. RIZZON, L.A.; BERNARDI, J.; MIELE, A. Características analíticas dos sucos de
maçã Gala, Golden Delicious e Fuji. Ciência Tecnologia Alimentos, v.25, n.4,
2005.
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14. SUZUKI, A; ARGENTA, L.C. Teores minerais na polpa das cvs. Gala, Golden
Delicious e Fuji. Revista Brasileira de Fruticultura, Cruz das Almas, v.16, n.1,
p.92-104, 1994.
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