Emissão Fluorescência

Prof. Dr. Anderson de Jesus Gomes

Tópicos Abordados

Princípio da
técnica

Exercícios Instrumento

Técnica
Instrumental

Preparo da
Aplicações
amostra

Vantagens e
desvantagens

2
Emissão de luz

•  Luminescência

• Fluorescência

• Fosforescência

•  Quimioluminescência

•  Bioluminescência

3
Emissão de luz

Luminescência é o termo que se usa quando a energia da excitação provém

da absorção de fótons. Inclui a Fluorescência e a Fosforescência.

Quimiluminescência é um termo geral para produção de luz quando a

energia de excitação é proveniente de uma reação química.

Bioluminescência é a denominação de um fenômeno de quimiluminescência

onde a reação química é realizada em um organismo, como o vaga-lume por
exemplo.

4
Quimiluminescência (Luminol)

Catalisador = Ferro da Hemoglobina

5
Bioluminescência

6
Absorção de um fóton e excitação de um elétron

Inicialmente, os elétrons em átomos ou moléculas estão energeticamente em um

nível “normal” de energia denominado de estado básico ou estado fundamental
(“ground state”). A absorção de um fóton por uma molécula excita um elétron,
levando ele de um estado de baixa energia (não excitado) para um estado
excitado.

7
Absorção

•  Absorção – a luz é absorvida por um átomo, íon ou molécula indo para um

estado energético mais elevado.
Emissão

Emissão – a emissão de um fóton pelo átomo, íon ou molécula, retornando para

um estado energético mais baixo

9
 Diagrama de Jablonski

Molecules 2012, 17(12), 14067-14090; doi:10.3390/molecules171214067

Sistemas Fotoluminescentes

Dentro dos Sistemas Fotoluminiscentes temos duas subdivisões

dependendo do estado excitado envolvido no processo:

Fluorescência: Se o estado envolvido é singleto (o spin do eletron mantém a

sua posição). É um processo rápido t = 10-9-10-7 segundos com elevada
intensidade nos picos de absorção.

Fosforescência: A orientação do eletron que foi promovido é invertida e temos

um tripleto. É um processo lento t = 10-3-10-2 segundos, com fraca intensidade
nos picos de absorção.

11
Diagrama de Jablonsky
Singleto e Tripleto

Multiplicidade = 2S + 1

As designações singleto e tripleto referem-se à multiplicidade de spin do estado eletrônico

(dada por 2S+1, onde S é a soma dos spins de todos os elétrons. O spin do primeiro elétron
é designado, arbitrariamente, como +½ o segundo, como -½. O valor de S é zero para cada
par de elétrons, logo a multiplicidade é 1 (singleto). No caso de dois elétrons
desemparelhados, S = 1 e a multiplicidade é 3 (tripleto).
Franck-Condon

O princípio do estado de Frank-Condon

considera que, uma vez que o tempo
necessário para que ocorra uma transição
eletrônica é muito menor do que o tempo de
movimentação dos núcleos, a transição
vibrônica mais provável é aquela que não
envolve a mudança nas coordenadas
nucleares.

Frank-Condon = transição vertical EP

Deslocamento Stokes

Quando o fóton emissor tem menos energia do que o fóton absorvido, esta
diferença da energia é chamada de deslocamento Stokes.
 Estados eletronicamente excitados
Blue Excitation
Absorption

Internal Conversion
femtoseconds
S2 excited state
Absorbance energy

S1 excited state

Fluorescence Nonradiative
nanoseconds dissipation

Ground State
Electrons 16
Processos fotofísicos: Fosforescência
Processos fotofísicos

18
Fatores que se relacionam com a Fluorescência

•  O rendimento quântico de fluorescencia (φF) de uma substância é a razão do

numero de fótons emitidos por fluorescência e o numero de fótons absorvidos;
varia de Zero a Um:

•  Zero: Quando a espécie não fluoresce

•  Entre zero e um: Quando a espécie fluoresce

Φf + Φic + Φisc + Φp = 1

φF= 0 não fluoresce

φF ≠ 0 fluoresce
19
Fatores que se relacionam com a Fluorescência

Tipo de Radiação (λ)

•  A fluorescência raramente resulta da absorção de radiação de comprimento de

onda inferior a 250 nm.

•  Rara ocorrência de fenômenos de fluorescência provenientes da

•  transição σ*→σ,

•  Fluorescencia proveniente de mecanismos menos energéticos

•  como π*→ π

20
Fatores que se relacionam com a Fluorescência

Temperatura

O rendimento quântico da maioria das moléculas diminui com o aumento da

temperatura, porque aumentam as colisões.
↑ Temperatura ↓ Fluorescência
 Fatores que se relacionam com a Fluorescência

Presença de Oxigênio
Diminui a intensidade de emissão de uma solução fluorescente.

↑ [Oxigênio] ↓ Fluorescência

22
Fatores que se relacionam com a Fluorescência
Concentração

Espectros de fluorescência do antraceno em diclorometano em várias

concentrações: 10-3 a 10-7 mol L-1.
23
 Fatores que se relacionam com a Fluorescência
Concentração

Espectro de fluorescência do pireno, em solução de diclorometano: 1x10-5 mol L-1

(linha azul); 1x10-3 mol L-1 (linha preta).
24
Concentração

•  Formação de dímeros no estado eletrônico fundamental,

•  Formação de dímeros no estado eletrônico excitado, ao qual se dá o nome de

excímero,

•  Transferência não-radiativa de energia,

•  Transferência radiativa de energia.

25
Fatores que se relacionam com a Fluorescência

Rigidez de Moléculas

A rigidez na estrutura molecular restringe a liberdade vibracional, minimizando

significativamente os relaxamentos vibracionais, aumentando a fluorescência
.

Fluoreno Bifenil

↑ Rigidez ↑Fluorescência
26
Fatores que se relacionam com a Fluorescência

Geometria de Moléculas
Moléculas Planares aumentam a fluorescência pois favorece a interacção e
conjugação entre os elétrons π.

↑ Geometria Planar
↑ Fluorescência

27
Fatores que se relacionam com a Fluorescência

Tipo de Moléculas
Também podem apresentar fluorescência os compostos que contêm grupos
carbonilo alifáticos e aliciclicos, ou duplas ligações altamente conjugadas.

Beta-caroteno

Indocianina verde
28
Fatores que se relacionam com a Fluorescência

Hidrocarbonetos Aromáticos
A maioria dos hidrocarbonetos aromáticos são fluorescentes em solução, sendo o
rendimento quântico tanto maior quanto maior for o numero de anéis e o seu grau
de condensação.

Benzeno Naftaleno Antraceno

Pireno

29
Benzopireno
Fatores que se relacionam com a Fluorescência

Transições n → π*

Nos compostos heterociclicos com átomos de Nitrogênio a transição electrônica é

de mais baixa energia e envolve uma transição do tipo n → π*, que se transforma
num estado de tripele e evita a fluorescência.

Piridina Pirolina Furano Tiofeno

30
Fatores que se relacionam com a Fluorescência

A presença de grupos:
•  Hidroxi (-OH),
•  Metoxi (-OR),
•  Amina (-NR2),
•  Cianeto (-CN)
Apresenta tendência a amplificar a fluorescência.

• 
Fatores que se relacionam com a Fluorescência

Em halogênios verifica-se um diminuição da sua intensidade com o aumento do

numero atômico do halogênio o que aumenta a velocidade do processo de
conversão inter-sistemas para o estado triplete. Também podemos observar
quebra de ligações que podem ou não absorver a energia de excitação.

Fluorobenzeno Clorobenzeno Bromobenzeno Iodobenzeno

Fatores que se relacionam com a Fluorescência

Anéis substituídos

Quando temos anéis benzênicos substituídos ocorre o deslocamento do máximo

de absorção e portanto dos níveis de fluorescência.

33
Fatores que se relacionam com a Fluorescência

Substituição na carbonila

A substituição de grupos carboxilo e carbonilo no grupo aromático impede

parcialmente a fluorescência.

34
 Metais

Os ions metálicos de transição não costumam formar quelatos fluorescentes, visto

que muitos deles são paramagnéticos. Este fato aumenta a velocidade de
conversão inter-sistemas para o estado tripleto.

35
Fluoróforos típicos

36
Fluorescência - espectros

37
Supressão de Fluorescência

Stern-Volmer

38
Exemplo

A fluorescência do sulfato de quinino é suprimida por altas concentrações de íon

cloreto. Os sinais de fluorescência F mostrados a seguir foram obtidos como uma
função da concentração do íon cloreto. Construa uma planilha eletrônica e
determine a constante de supressão Kq

IF [Cl-] [Cl-] F0/F

180,0 0,0000 0,0000 1,0000
87,5 0,0050 0,0050 2,0571
58,0 0,0100 0,0100 3,1034
43,2 0,0150 0,0150 4,1667
35,0 0,0200 0,0200 5,1429
28,5 0,0250 0,0250 6,3158
24,5 0,0300 0,0300 7,3469
19,1 0,0400 0,0400 9,4241
15,7 0,0500 0,0500 11,4650 39
 14.0000
Y = 209,95x + 1,0092
12.0000 R2 = 0,9999

10.0000

8.0000
F0/F

6.0000

4.0000

2.0000

0.0000
0.0000 0.0100 0.0200 0.0300 0.0400 0.0500 0.0600
[Cl]

Kq = 209,95 mol-1 L
40
Tópicos Abordados

Princípio da
técnica

Exercícios Instrumento

Técnica
Instrumental

Preparo da
Aplicações
amostra

Vantagens e
desvantagens

41
Espectrofluorímetro

42
Sistema de excitação

Lâmpadas de arco de mercúrio ou de xenônio

Xenônio:

Produz um espectro continuo entre 250 e 600 nm tendo um máximo a 470 nm

43
Lâmpada de mercúrio

Produz um espectro de linhas de comprimento de onda 365, 398 nm, …, 734 nm

(lâmpada de altas pressões). Para lâmpadas baixas pressões risca a 254 nm.

44
 Monocromadores

Dois monocromadores (1 de excitação e 1 de emissão)

1. A radiação do primeiro é separada: parte passa por um fotomultiplicador e outra

parte pela amostra.

2. A radiação resultante após dispersão pelo segundo monocromador é detectada

por um segundo fotomultiplicador.

45
Detector
Fotomultiplicadora

Aplica-se potencial elétrico crescente

Tópicos Abordados

Princípio da
técnica

Exercícios Instrumento

Técnica
Instrumental

Preparo da
Aplicações
amostra

Vantagens e
desvantagens

48
Para obtermos um espectro de fluorescência temos de calibrar o aparelho com o
comprimento de onda λ correspondente à maior absorção da amostra.

49
Cela e Compartimentos

Cela cilíndricas ou retangulares, de vidro ou de sílica.

50
Cuidado
Devem ser tomados os maiores cuidados na execução das análises devido á
possibilidade da existência de contaminações de substâncias fluorescentes em
teores não detectável por outros métodos.

Mãos = gordura fluoresce !!!

51
Tópicos Abordados

Princípio da
técnica

Exercícios Instrumento

Técnica
Instrumental

Preparo da
Aplicações
amostra

Vantagens e
desvantagens

52
Vantagens

•  Elevada sensibilidade

•  Limite de detecção 1µM

53
Desvantagens

•  Elevado custo inicial de instalação

•  Reprodutibilidade

•  Calibração da resposta

•  Sensibilidade (Impurezas)

54
Desvantagens
Contaminação do solvente ou da cubeta

DOI: 10.1039/C5AN01786F 55
Desvantagens

56
Limitações da Fluorescência
•  Nem todos os compostos fluorescem

•  Fluoróforo precisa ter:

•  Anel Aromático
•  Ter conjugações estendidas
•  Pelo menos um grupo doador de elétrons –OH, -NH2 ligado ao anel
aromático

•  Um grupo retirador de elétrons pode diminuir ou destruir a fluorescência

57
Tópicos Abordados

Princípio da
técnica

Exercícios Instrumento

Técnica
Instrumental

Preparo da
Aplicações
amostra

Vantagens e
desvantagens

58
Aplicações da Fluorescência

Fluorimetria é um método muito sensível e especifico e aplica-se a análises de:

§  Espécies e Produtos orgânicos

§  Alimentos

§  Produtos farmacêuticos

§  Amostras clínicas e produtos naturais

§  Anions

59
Água tônica

60
Microscopia de fluorescencia

61
Microscopia confocal

•  Microscopia confocal

62
Fluoróforos

63
 Diferenciação entre células vivas e mortas
Fluorescência (marcação de estruturas celulares e identificação de estruturas
vivas)

64
Medidas de cálcio

65
Quantum dots

66
Fluorescencia in vivo

67
Terapia Fotodinâmica
Terapia Fotodinâmica
Tópicos Abordados

Princípio da
técnica

Exercícios Instrumento

Técnica
Instrumental

Preparo da
Aplicações
amostra

Vantagens e
desvantagens

70
Exercício
Explique a diferença entre um espectro de fluorescência de emissão e um
espectro de fluorescência de excitação.

71
Exercício
Defina os seguintes termos:
(a) fluorescência,
(b) fosforescência,
(c) fluorescência ressonante,
(d) estado singleto,
(e) estado tripleto.
(f) relaxação vibracional.
(g) conversão interna,
(h) conversão externa,
(i) cruzamento intersistema.
(j) pré-dissociação.
(k) dissociação.
(1)  rendimento quântico,
(m) quimiluminescência.

72
Exercício
Por que a espectrofluorimetria é potencialmente mais sensível do que a
espectrofotometria?

73
Exercício
Em quais compostos mostrados abaixo você espera um maior rendimento quântico
de fluorescência? Explique

Fenolftaleína Fluoresceína

o,o’-dihidroxiazobenzeno
74
Exercício
Por que alguns compostos absorventes fluorescem e outros não?

75
Exercício
Discuta as maiores causas da espectrometria de fosforescência molecular não ser
tão usada como a espectrometria de fluorescência molecular.

76
Exercício
A forma reduzida da nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) é uma coenzima
importante e altamente fluorescente. Ela tem um máximo de absorção a 465 nm.
Soluções-padrão de NADH forneceram os seguintes valores de intensidade de
fluorescência:

Conc. NADH, umol/L Intnsidade relativa

0,100 2.24
0.200 4,52
0.300 6,63
0,400 9,01
0.500 10,94
0,600 13,71
0,700 15,49
0,800 17,91

77
Exercício (continuação)
(a) Construa uma planilha eletrônica e use-a para construir uma curva de
calibração para NADH.
(b) Encontre a inclinação e o intercepto por quadrados mínimos para o gráfico
de (a)
(c) Calcule o desvio padrão da inclinação e o desvio padrão da regressão para a
curva.
(d) Uma amostra desconhecida apresenta uma intensidade de fluorescência
relativa
de 12.16. Use a planilha para calcular a concentração de NADH.
(e) Calcule o desvio padrão relativo para o resultado da parte (d).
(f) Calcule o desvio padrão relativo para o resultado da parte (d) se a média de
três medidas foi 7.95.

78
Exercício

Um comprimido anti-malárico. contendo quinino, possui uma massa de 1.664 g foi

dissolvido com HCI 0.10 mol L-1 em quantidade suficiente para fornecer 500 mL
de solução. Uma alíquota de 20.00 mL foi então diluída para 100.0 mL com o
ácido. A intensidade da fluorescência para a amostra diluída, em 347.5 nm.
forneceu uma leitura de 245 em uma escala arbitrária. Uma solução-padrão de
100 ppm de quinino registrou o valor de 125. quando medida em idênticas
condições. Calcule a massa em miligramas de quinino no comprimido original.

79
Exercício

um comprimido de 4.236 g foi dissolvido em HCl 0,10 mol L-1 suficiente para
fornecer 1,000 L. A diluição de uma alíquota de 20,00 mL para 100 mL resultou
em uma solução que forneceu uma leitura de 448 em 347,5 nm. Uma segunda
alíquota de 20,00 mL foi misturada com 10,0 mL de uma solução de 50 ppm de
quinino após diluição a 100 ml. A intensidade da fluorescência dessa solução foi
525. Calcule a porcentagem de quinino no comprimido.

80
Exercício

Íons de ferro (II) catalisam a oxidação do luminol para H2O2. A intensidade da

quimi-luminescência resultante aumenta linearmente com a concentração de ferro
(II) entre 10-10e l0-8 mol L-1.
Exatamente 1,00 mL de água foi adicionado a uma alíquota de 2,00 mL de uma
solução de Fe(II) de concentração desconhecida, seguida pela adição de 2,00 mL
de uma solução diluída de H2O2 e 1,00 mL de uma solução alcalina de luminol. A
quimi-luminescência da mistura foi integrada durante um período de 10.0 s e
apresentou o valor de 14,3. A uma segunda alíquota de 2,00 mL da amostra foi
adicionado 1,00 mL de uma solução de Fe(II) 3,58x10-5 mol L-1. seguida pelo
mesmo volume de H2O2, e luminol. A intensidade integrada foi 33,3. Encontre a
concentração de Fe (II) na amostra.

81
Exercício

O quinino é uma das moléculas fluorescentes mais bem-conhecidas e as

sensibilidades dos fluorímetros são frequentemente especificadas em termos do
limite de detecção para essa molécula. A estrutura do quinino é dada abaixo. Diga
qual parte da molécula tem maior probabilidade de comportar-se como cromóforo
e como centro fluorescente.

82