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Journal of Global Antimicrobial Resistance 21 (2020) 34–41

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Jornal da Resistência Antimicrobiana Global

Página inicial do jornal:www.elsevier.com/location/jgar

Terapia fágica para o tratamento de infecções virulentasKlebsiella pneumoniaeinfecção em um

modelo de camundongo

Taruna Ananda,*, Nitin Virmania, Sudarshan Kumarb, Ashok Kumar Mohantyb, S.

Pavulraja, Bidhan Ch. beraa, Rajesh K. Vaida, Umang Ahlawata, BN Tripathia
aCentro Nacional de Culturas de Tipo Veterinário, Conselho Indiano de Pesquisa Agrícola (ICAR)–Centro Nacional de Pesquisa em Equinos, Sirsa Road, Hisar,
Haryana-125001, Índia
bICAR–National Dairy Research Institute, Animal Biotechnology Centre, Karnal, Haryana-132001, Índia

ARTIGOINFO ABSTRATO

Historia do artigo: Objetivos: Klebsiella pneumoniaeé um importante patógeno emergente de humanos e animais levando a sérias
Recebido em 10 de abril de 2019 consequências clínicas. O aumento do uso de antibióticos promoveu o surgimento de bactérias produtoras de β-
Recebido em forma revisada em 20 de setembro de 2019
lactamase (ESBL) de espectro estendido e resistentes a carbapenêmicos.K. pneumoniaeDeformação. Recentemente,
Aceito em 20 de setembro de 2019
a terapia fágica ganhou força como uma possível alternativa contra a resistência antimicrobiana emergente. Este
Disponível online em 8 de outubro de 2019
estudo foi realizado para avaliar os efeitos terapêuticos de um novo fago lítico (VTCCBPA43) em um modelo de
camundongo pneumônico, a fim de explorar a eficácia da terapia fágica contraK. pneumoniaeinfecção. Métodos:O
Palavras-chave:
fago com cauda VTCCBPA43 foi avaliado quanto à sua cinética de crescimento, gama de hospedeiros in vitro e
terapia fágica
sensibilidade à temperatura e pH. Os constituintes proteicos foram analisados por SDS-PAGE e nLC-MS/MS. A
Pneumonia
modelo de mouse
eficácia terapêutica foi observada 2 h após o desafio com virulentaK. pneumoniaeem um modelo de camundongo
Resistência antimicrobiana emergente BALB/c.
Resultados:Verificou-se que o fago VTCCBPA43 é altamente tolerante à temperatura (até 80-C). Foi mais ativo em pH
5, teve um tamanho de explosão de 172 PFU/mL e exibiu uma gama de hospedeiros estreita. Foi identificado como
um fago do tipo KP36 por proteômica shotgun. Após aplicação intranasal de dose única (2 - 109PFU/camundongo)
pós-desafio com virulentoK. pneumoniae,foi observada a presença de fago biologicamente ativo in vivo e uma
redução significativa na carga bacteriana do pulmão em todos os pontos de tempo. Uma redução na gravidade da
lesão sugeriu efeitos benéficos gerais da terapia fágica VTCCBPA43 no modelo de camundongo pneumônico.

Conclusão:Esta pesquisa representa a primeira evidência in vivo de terapia fágica eficaz contra
K. pneumoniaeinfecção por via intranasal.
© 2019 Sociedade Internacional de Quimioterapia Antimicrobiana. Publicado pela Elsevier Ltd. Este é um
acesse o artigo sob a licença CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

1. Introdução alternativas aos antibióticos estão em andamento e a terapia fágica ganhou

atenção significativa[9,10]. Assim, a terapia fágica para o tratamento de
Klebsiella pneumoniae,uma bactéria Gram-negativa anaeróbica camundongos com pneumonia, infecções por queimaduras e septicemia[11–
facultativa, é uma das principais causas de infecções graves de início na 16] foi explorado. No entanto, a tradução da aplicação de fagos para o
comunidade, como pneumonia necrotizante, abscesso hepático e tratamento de infecções humanas e animais ainda não foi alcançada devido
endoftalmite endógena, bem como infecções nosocomiais do trato a desafios e restrições, incluindo especificidade do fago, fatores físico-
respiratório, trato urinário, feridas e corrente sanguínea[1–4]. Infecções químicos que afetam a estabilidade do fago, acessibilidade à bactéria alvo
causadas porK. pneumoniaeem lactentes, idosos e pacientes no hospedeiro doente, desenvolvimento de cepas resistentes, neutralização
imunocomprometidos são frequentemente fatais[5]. Além disso, resistente a por anticorpos e variabilidade decorrente da via selecionada e dose de
antimicrobianosK. pneumoniae,cepas produtoras de β-lactamase (ESBL) de administração[17]. Entre os fatores físico-químicos, a estabilidade do fago
espectro estendido e resistentes a carbapenêmicos, surgiram como uma em uma faixa de temperaturas é geralmente reconhecida como um critério
causa de grande preocupação em todo o mundo[6–8]. No cenário atual de importante, mas, curiosamente, a atividade de prateleira deKlebsiella fagos
resistência antimicrobiana emergente, a busca por por durações mais longas nunca foi avaliado. Além disso, entre um pequeno
número de fagos contraK. pneumoniaerelatada até o momento, apenas
uma única tentativa terapêutica por via intranasal utilizando Siphoviridae
* Autor correspondente. phage1513 foi relatado[11]. O estudo atual
Endereço de email:[email protected] (T. Anand).

http://dx.doi.org/10.1016/j.jgar.2019.09.018
2213-7165/© 2019 Sociedade Internacional de Quimioterapia Antimicrobiana. Publicado pela Elsevier Ltd. Este é um artigo de acesso aberto sob a licença CC BY-NC-ND (http://
creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
 T. Anand et ai. / Journal of Global Antimicrobial Resistance 21 (2020) 34–41 35

descreve o isolamento, caracterização e aplicação terapêutica de um novo 2.5. Curva de crescimento de uma etapa do bacteriófago
fago, VTCCBPA43 (referido como BPA43 daqui em diante) em um modelo de
camundongo pneumônico. Um experimento de crescimento em uma etapa foi realizado para determinar o
tamanho da explosão e o período latente do BPA43, conforme relatado anteriormente
[18], usando uma multiplicidade de infecção (MoI) de 0,001 com fago.
2. Materiais e métodos

2.6. Determinação do intervalo de hospedeiros por teste local

2.1. Coleta de amostras e enriquecimento de bacteriófagos

bacterianoK. pneumoniaeisolados (Tabela Suplementar S1) do Centro

Uma amostra de água foi coletada assepticamente do rio Ganga,
Nacional de Culturas de Tipo Veterinário (NCVTC) (Hisar, Índia) foram usados
Banaras Ghat (coordenadas de latitude e longitude, 25.321684-N,
como hospedeiros para determinação da atividade biológica. Para o teste
82.987289-E), Índia, e foi transferido para o laboratório em temperatura
spot, uma alíquota de 500mL de cultura fresca de bactérias foi adicionado a
ambiente. Para o enriquecimento de bacteriófagos, 40 mL de amostra
3 mL de 0,75% de top agar e foi derramado em uma placa de 1,5% de NB
de água foram misturados com caldo de 5 nutrientes (NB) e cultura
agar. Após a solidificação do ágar superior, 5mL de suspensão de
bacteriana em crescimento exponencial (K. pneumoniaeMTCC109) com
bacteriófago foi colocado nas placas e incubado durante a noite a 37-C.
incubação adicional a 37-C com agitação vigorosa. Após a incubação, o
caldo enriquecido foi centrifugado a 10.000 rpm por 10 minutos e
filtrado em 0,22mm filtro de membrana de fluoreto de polivinilideno
2.7. Análise de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil
(PVDF). A atividade do bacteriófago foi detectada usando o ensaio spot.
sulfato de sódio (SDS-PAGE) e caracterização baseada em espectrometria de
Amostras de filtrado qualificadas foram diluídas em série e 100
massa
mL de cada diluição foi semeado em bactérias hospedeiras pela técnica de
ágar de camada dupla. Uma placa claramente separada foi purificada três
O perfil proteico do BPA43 foi analisado em gel SDS-PAGE 10% corado
vezes por coleta em tampão SM (5,8 g/L NaCl, 2,0 g/L MgSO4, 50 mL/L de 1 M
com corante de prata e o perfil proteico estrutural foi analisado utilizando o
Tris, pH 7,5, 5 mL/L de gelatina a 2% pré-esterilizada) e replaqueamento. As
software AlphaEaseFC (Alpha Innotech). Para caracterização de proteínas
características da placa foram registradas e o título de fago foi determinado.
por cromatografia líquida em nanoescala – espectrometria de massa em
tandem (nLC-MS/MS), 200mL de 109O bacteriófago PFU/mL foi concentrado
a 50mL em um SpeedVac em 4-Proteínas C e fágicas totais foram separadas
2.2. Cultura em massa e preservação de bacteriófagos usando 12% SDS-PAGE com subsequente coloração usando Coomassie
brilhante azul seguido de descoloração. Uma pista completa foi então
Para a preparação da suspensão concentrada de fagos, 2 mL de cortada em sete pedaços e os pedaços individuais foram descorados usando
cultura hospedeira de crescimento exponencial foram suspensos em 40% de acetonitrila (ACN) e 40 mM de NH4HCO3na proporção de 1:1 (v/v) e
tampão SM e co-incubados com suspensão de fagos (109PFU) por 20 foram digeridos com 12,5 ng/mL em 37-C. Os peptídeos foram extraídos da
min a 37-C. Isso foi seguido pela adição de 50 mL de NB e incubação mistura de digestão, foram liofilizados, dessalinizados e reconstituídos em
sucessiva por 8–12 h a 37-C. Clorofórmio foi adicionado ao lisado bruto 20mL de água de grau LC-MS contendo 0,1% de ácido fórmico e foram
e foi mantido por 10 min com posterior centrifugação. DNase submetidos a nLC (Nano-Advance; Bruker, Alemanha) seguido de
pancreática I e RNase (1mg/mL) (Merck, Darmstadt, Alemanha) foram identificação usando um espectrômetro de massa quadrupolo CaptiveSpray
adicionados ao sobrenadante seguido de incubação subsequente por Maxis HD (QTOF) (Bruker). Os peptídeos foram carregados em uma coluna
30 min em temperatura ambiente. NaCl e PEG 8000 (Sigma-Aldrich) nano-trap (Bruker Magic C18AQ; 5mm de tamanho de partícula e tamanho
foram adicionados ao sobrenadante para concentrações finais de 1 M e de poro de 200 Å) e foram eluídos em uma coluna analítica (Bruker Magic
10% (p/v), respectivamente. Após a centrifugação, o sedimento de C18AQ; 0,1 - 150 mm, 3mm de tamanho de partícula e tamanho de poro de
bacteriófago foi dissolvido em tampão SM e, em seguida, as partículas 200 Å) usando um gradiente linear de 5-45% ACN a 400 nL/min durante 55
de fago foram purificadas por extração com clorofórmio (1:1 v/v) e min. Peptídeos carregados positivamente foram analisados no modo de
centrifugação. aquisição dependente de dados em QTOF. A varredura de pesquisa TOF-MS
foi adquirida na faixa m/z de 400–1400 e os seis íons mais intensos foram
2.3. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) selecionados sequencialmente por Q1 para análise MS/MS. Para análise dos
dados, uma lista de compostos foi gerada pelo controle QTOF v.24.8 usando
O TEM foi realizado colocando a suspensão de fagos em grades de cobre o programa de pós-processamento Hystar e foi submetida ao mecanismo de
revestidas com carbono por 5 min, seguidas de coloração negativa com busca Mascot v.2.4.1 (Matrix Science Ltd., Londres, Reino Unido) com o
ácido fosfotungstico a 1% (pH 7) por 10 s. As eletromicrografias foram banco de dados NCBInr. As proteínas identificadas foram classificadas em
tiradas usando um microscópio eletrônico JEOL (JEOL UK, Welwyn Garden proteínas específicas do fago e depois em
City, UK) operando a 80 kV.
K. pneumoniae-proteínas específicas do fago.
2.4. Sensibilidade de temperatura e pH do bacteriófago
2.8. Indução de pneumonia e terapia fágica em um modelo de camundongo
Para avaliação da estabilidade do pH, a suspensão do bacteriófago
foi misturada em tampão de acetato de sódio (pH 3–6) e solução salina Camundongos BALB/c de ambos os sexos (6–8 semanas de idade, peso
tamponada com fosfato (PBS) (pH 7–10) na proporção de 1:10 (v/v) e foi 20–25 g) foram usados neste estudo. As aprovações necessárias para
incubada à temperatura ambiente por 1 h antes da diluição e experimentação animal foram obtidas do Comitê de Ética Animal do
plaqueamento usando o método soft-agar overlay. Para o teste de Instituto e do Comitê de Biossegurança do Instituto do Centro Nacional de
estabilidade de temperatura, as suspensões de bacteriófagos foram Pesquisa em Equinos (NRCE) (Hisar, Índia). As diretrizes definidas pelo
incubadas a 4, 25, 37, 45, 55, 65, 80 e 90-C por 1 h antes da diluição e Comitê para Finalidade de Controle e Supervisão de Experimentos com
plaqueamento pelo método soft-agar overlay. As placas foram Animais (CPCSEA), Ministério do Meio Ambiente e Florestas, Governo da
enumeradas após incubação durante a noite a 37-C. Para avaliação da Índia, foram rigorosamente seguidas durante toda a duração do
atividade de prateleira por um período mais longo, a suspensão de experimento.
fago colocada a 37-C foi avaliado quanto à atividade por teste local a K. pneumoniaeMTCC109 foi usado para estabelecer o experimento
cada 10 dias. modelo de pneumonia por instilação de uma dose bacteriana via via intranasal
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rota. A dose ótima para induzir pneumonia foi estabelecida pela

instilação de quatro doses diferentes em um inóculo de 25mL (108–1011
UFC) em seis camundongos cada e sacrificando-os em intervalos de 48h
e 96h (n =3 de cada grupo/intervalo). A dose de 109A UFC foi decidida
comparando lesões macroscópicas e microscópicas (100% dos animais
apresentando lesões sem mortalidade). Os animais foram amplamente
divididos em três grupos principais, como segue: grupo B, apenas
instilação de bactérias (109UFC); grupo BP, bactérias (109UFC) seguido
de bacteriófago (109PFU) administrado por via intranasal após 2 h de
infecção bacteriana; e grupo P, instilação intranasal de 109Bacteriófago
PFU apenas. Seis animais de cada grupo foram sacrificados aos 6,12,
24, 48 e 96 h pós-infecção (hpi) e aos 6, 10 e 14 dias pós-infecção (dpi).
Os pulmões foram removidos assepticamente, pesados,
homogeneizados em PBS estéril (pH 7,2) e submetidos a exame
bacteriológico (contagem de UFC) em ágar MacConkey (para grupos B e
BP) e estimativa de fagos (contagem de PFU) usando a técnica de
sobreposição de ágar mole (para grupos BP e P). O sangue foi coletado
de camundongos usando a técnica retro-orbital e o soro foi testado
para detectar a presença de bacteriófago.
Para estudos patológicos, amostras representativas de tecido dos
pulmões foram coletadas de cada camundongo e fixadas em formalina Figura 1.Morfologia do bacteriófago VTCCBPA43 conforme visualizado por microscopia eletrônica
tamponada neutra a 10% por 96 h. O espécime fixado foi processado de transmissão.
por métodos convencionais, foi incluído em parafina, seccionado em 3–
4mm de espessura, corados com hematoxilina e eosina (H&E) e vistos
ao microscópio (Nikon modelo-81i; Nikon). A pontuação das lesões
pulmonares foi realizada para quantificar e comparar as diferenças das
lesões em camundongos infectadosvsgrupos tratados com
bacteriófagos com base nas características mais características
observadas nos pulmões. Pontuações para lesões foram dadas com
base em leve, moderada, grave e generalizada. Os parâmetros
histológicos selecionados para pontuação das lesões incluíram:
extensão da necrose do parênquima alveolar; bronquiolite com
exsudato inflamatório no lúmen; infiltração de neutrófilos e linfócitos; e
infiltração peribrônquica e perivascular.

2.9. Análise estatística

Figura 2.Curva de crescimento em uma etapa do bacteriófago VTCCBPA43.
Os dados foram expressos como a média de três experimentos
independentes e foram submetidos a análises estatísticas usando o
GraphPad Prism1v.5.04 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA). A espectro estreito contra isolados bacterianos, conforme indicado pelo teste de
análise de variância de duas vias (ANOVA) seguida do teste post-hoc de manchas (Tabela Suplementar S1).
Bonferroni foi usada para comparar as médias replicadas por linha. AP-
valor <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. 3.3. Sensibilidade de temperatura e pH

3. Resultados O Phage BPA43 foi testado quanto à sua estabilidade térmica em

uma faixa de temperatura de 4–90-C e mostrou-se ativo até uma
3.1. Isolamento e caracterização morfológica do fago BPA43 temperatura de 80-C (Fig. 3). O fago era biologicamente ativo em 37-C
durante um período de 100 dias, conforme indicado pelo teste no local.
O fago lítico produziu placas circulares claras de 2 a 3 mm no hospedeiro O fago também se mostrou estável de pH 4 a 10 e foi mais ativo em pH
K. pneumoniaeMTCC109 (para caracterização baseada em PCR de 5 (Fig. 4), enquanto que perdeu completamente sua atividade em pH 3.
características patogênicas, consulte a Fig. S1 complementar) após
incubação por 12 h a 37-C. BPA43 foi observado por TEM (Figura 1) para ser
um fago com cauda (Caudovirales)com uma cabeça de simetria icosaédrica 3.4. Perfil de proteína por SDS-PAGE seguido por nLC-MS/MS
medindo 48 nm, uma cauda de 89 nm - 15 nm e uma placa de base de 25 nm
- 34 nm. O bacteriófago BPA43 concentrado em PEG mostrou uma banda de
proteína principal de 35 kDa junto com muitas outras bandas de
3.2. Cinética de crescimento e análise de gama de hospedeiros proteína (Fig. 5) em gel SDS-PAGE a 10%. Por proteômica shotgun, um
total de 346 proteínas específicas de fago foram identificadas contra o
Os parâmetros de multiplicação do fago BPA43 foram determinados banco de dados disponível no NCBI que correspondeu a pelo menos
usando a curva de crescimento de uma etapa (Figura 2). O período um peptídeo. Destas, 10 proteínas (tabela 1) pertenceu especificamente
latente, definido como o intervalo de tempo entre a adsorção e o início aKlebsiella fagos (KP36 e KP15) e a maioria pertencia a KP36. A maioria
do burst, foi de 70 min e o tamanho médio do burst foi de 172 PFU/ dessas proteínas foi identificada com pelo menos três peptídeos por
célula. A atividade biológica do fago BPA43 foi testada em proteína, exceto por três proteínas, que foram identificadas com um
K. pneumoniaeisolados (n =10) obtido de NCVTC em que o fago BPA43 peptídeo. A cobertura da sequência para as proteínas variou de 4,2% a
mostrou atividade lítica moderada a forte com um 37,3%. Análise BLASTp de proteínas hipotéticas de alta pontuação
 T. Anand et ai. / Journal of Global Antimicrobial Resistance 21 (2020) 34–41 37

(ou seja, 916,4 e 706,0) exibiu 99% de identidade com a principal proteína do
capsídeo deKlebsiellafago KLPN1 (vírus Kp36).

3.5. Terapia fágica em um modelo de camundongo

3.5.1. Isolamento de bactérias e bacteriófagos de tecido pulmonar

murino e soro
O isolamento bacteriano dos pulmões de animais infectados (grupo
B) revelou significativamente maior (P <0,05) Contagens de CFU
comparadas com o grupo tratado com fago infectado (grupo BP) ao
longo do experimento (Fig. 6). Durante o período experimental, uma
redução significativa nas contagens bacterianas foi observada em 48
hpi no grupo tratado em comparação com o grupo não tratado, onde
as contagens bacterianas foram maiores até 10 dpi. Além disso, a
técnica de soft-agar overlay demonstrou placas produzidas por
partículas vivas de fagos até 6 dpi de extratos pulmonares de animais
Figura 3.Avaliação da estabilidade de temperatura do bacteriófago VTCCBPA43 pela do grupo BP, embora a concentração de fagos (PFU/mL) diminuísse
técnica de soft-agar overlay. com o tempo e nenhuma placa pudesse ser detectada após 6 dpi (Fig. 7
). Já no caso do soro, a presença do fago foi demonstrada por spot test
até 24h apenas nos animais dos grupos BP e P.

3.5.2. O tratamento com bacteriófagos protege os camundongos do desenvolvimento

de lesões patológicas graves
As lesões observadas emK. pneumoniae-camundongos infectados
eram característicos de pneumonia broncoalveolar. A análise
macroscópica das lesões nos pulmões de animais infectados é
apresentada na Fig. Suplementar S2a,c. Em camundongos infectados
não tratados (grupo B), alterações histopatológicas (Fig. 8a–c)
observada às 12 hpi incluiu congestão grave dos vasos sanguíneos e
trombose com infiltração moderada de neutrófilos, que progrediu em 1
dpi para necrose generalizada do parênquima alveolar juntamente com
infiltração neutrofílica, vasculite e presença de exsudato eosinofílico no
espaço alveolar. O epitélio bronquiolar encontrava-se necrosado com a
presença de infiltrado neutrofílico no lúmen. A gravidade das lesões
aumentou ainda mais em 2 dpi com a presença de necrose franca no
parênquima pulmonar, incluindo alvéolos, bem como epitélio
Figura 4.Avaliação da estabilidade do pH do bacteriófago VTCCBPA43 em diferentes pH. bronquiolar, juntamente com infiltração de linfócitos e neutrófilos. Aos
3 dpi, além das lesões acima, infiltrado peribronquiolar de linfócitos e
presença de linfócitos e macrófagos no exsudato inflamatório foram os
principais achados. A intensidade das lesões foi reduzida aos 6 dpi com
a presença de áreas focais de necrose e infiltração composta
principalmente por linfócitos e macrófagos. Aos 14 dpi, o parênquima
pulmonar não apresentava grandes alterações de necrose (mesa 2).

Lesões histopatológicas observadas nos pulmões de camundongos no

grupo de tratamento bacteriófago (grupo BP) (Fig. 8d-f) foram de
intensidade marcadamente menor em todos os intervalos, especialmente
até 1 dpi, em comparação com o grupo B. Aos 2 dpi e 3 dpi, os principais
achados foram áreas focais de necrose e infiltração neutrofílica leve a
moderada com vasculite e edema. Lesões macroscópicas são mostradas na
Fig suplementar. S2b,d. A principal diferença nas lesões em comparação
com o grupo B em 2 dpi e 3 dpi foi que nenhum exsudato de células
inflamatórias no lúmen bronquiolar, áreas focais de necrose ou infiltração
moderada e nenhum manguito perivascular/peribrônquico foi observado.
Os pulmões eram amplamente normais com pequenas áreas focais de
necrose e infiltração de linfócitos e macrófagos observados em 6 dpi, e
nenhuma lesão foi discernível em 14 dpi (mesa 2). A classificação das lesões
nos pulmões com base na gravidade demonstra claramente as diferenças
entre animais tratados com bacteriófagos (grupo BP) e não tratados (grupo
B). As pontuações para necrose e infiltração foram mais altas em 2–3 dpi em
camundongos do grupo B e mostraram variação distinta com o grupo
tratado. Para as lesões brônquicas, a pontuação foi maior em 2 dpi e
Figura 5.Perfil proteico do bacteriófago VTCCBPA43 em gel de eletroforese em gel de
praticamente nenhuma lesão brônquica pôde ser observada nos animais do
dodecil sulfato de poliacrilamida a 10% (SDS-PAGE). M, marcador de proteína; pista 1, 107
PFU de lisado de fago bruto; pista 2, 106PFU de lisado de fago bruto. Foi observado um total de grupo tratado (grupo BP). Da mesma forma, células linfocíticas
sete bandas de proteína com uma banda de proteína principal de 35 kDa. perivasculares e peribrônquicas
38 T. Anand et ai. / Journal of Global Antimicrobial Resistance 21 (2020) 34–41

tabela 1
Lista de proteínas identificadas por cromatografia líquida em nanoescala – espectrometria de massa em tandem (nLC-MS/MS).

Proteína Peptídeos únicos PI MW (kDa) pontuações SC (%) RMS90 (ppm)

Proteína hipotética KP36_34 (Klebsiellafago KP36) Proteína 11 5.6 35,5 706.0 24,8 18.03
portal (Klebsiellafago KP36) 4 5,0 48,0 168,5 14.9 18.57
replicação de gp41 e helicase de DNA de recombinação (Klebsiellafago KP15) 1 5.7 53,6 18.6 4.2 467.04
Proteína hipotética KP36_33 (Klebsiellafago KP36) Proteína hipotética KP36_34 ( 1 4.9 17.6 14.8 9.2 59.11
Klebsiellafago KP36) Proteína portal (Klebsiellafago KP36) Subunidade de cunha 17 5.6 35.3 916,4 37.3 16.01
da placa de base (Klebsiellafago KP15) Proteína hipotética KP36_34 (Klebsiella 16 5,0 48,0 845,9 36,0 16.20
fago KP36) Principal proteína da cauda (Klebsiellafago KP36) Proteína hipotética 1 4.4 14.4 18.2 15.4 423.06
KP36_34 (Klebsiellafago KP36) 7 5.6 35.3 397,6 22.3 3,95
3 4.6 23.9 111,0 20.2 1.07
3 5.6 35.3 81,0 9.1 0,61

pI, ponto isoelétrico; MW, peso molecular; SC, cobertura de sequência; RMS, raiz quadrada média.

resistência antimicrobiana, a terapia fágica está ressurgindo como uma

possível alternativa de tratamento. Além disso, devido à maior
associação deK. pneumoniaecom infecções graves, neste estudo foi
explorada a utilidade terapêutica de um fago (BPA43) contra este
patógeno em um modelo de camundongo BALB/c. O BPA43 foi isolado
da água do Ganges, que tem sido um tema de interesse no passado
desde que Sir Ernest Hankin, um bacteriologista britânico, relatou a
presença de marcada atividade antibacteriana contraVibrio cholerae
nas águas do Ganges, que mais tarde foi correlacionado com a
presença de bacteriófagos[22–25].
Curiosamente, o BPA43 foi considerado relativamente estável ao
calor na faixa de temperatura de 4 a 80-C (Fig. 3). O pico de atividade do
BPA43 foi observado aos 45-C, com uma diminuição moderada de 2,5%
log PFU/mL a 80-C.K. pneumoniaefagos, incluindocKp-lyy15, phageZ,
PKP126, vB_Klp_1, vB_Klp_3, vB_Klp_4, vB_Klp_5 e vB_Klp_6, foram
relatados anteriormente como relativamente ativos em 70-C[26–29]em
Figura 6.Isolamento bacteriano de extratos de tecido pulmonar de camundongos infectados: carga comparação com outros fagos, sugerindo uma tolerância geral a altas
bacteriana (CFU/mL) no grupo B (somente bactérias) versus grupo BP (bactérias e bacteriófagos).
temperaturas entreK. pneumoniae fagos. No entanto, como exceção, o
* P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001.
PodoviridaeVerificou-se que o fago KP34 exibe sensibilidade relativa a
uma temperatura de 60-C
[30]. Alta resistência térmica também foi observada anteriormente em
bacteriófagos de fontes termais[31]e lodo tratado termicamente
[32]bem como em fagos lactocócicos[33,34], mas não em nenhum
bacteriófago de origem ribeirinha. Este é o primeiro relato do
isolamento e caracterização de um bacteriófago termotolerante isolado
da água do rio Ganges. A tolerância a altas temperaturas foi
previamente ligada à formação de ligações cruzadas nas proteínas do
capsídeo do fago, hidrofobicidade elevada ou forte interação entre a
proteína G do gene mutado e outras proteínas do capsídeo, levando à
estabilização do fago contra a desnaturação térmica[35,36]. Além disso,
o BPA43 mostrou-se estável e biologicamente ativo a 37-C durante um
período de 100 dias, o que enfatiza sua viabilidade na prateleira e
utilidade para fins terapêuticos, pois a manutenção da cadeia de frio
não será necessária para esta preparação de fagos durante o
transporte para locais distantes.
Figura 7.Isolamento de bacteriófagos (carga de bacteriófagos em PFU/mL) a partir de extratos de tecido
O conteúdo total de proteína de BPA43 foi extraído e os peptídeos foram
pulmonar de camundongos infectados tratados com bacteriófago (grupo BP). dpi, dias pós-infecção.
identificados por proteômica shotgun em um experimento nLC-MS/MS (
tabela 1). O banco de dados UniProt hospeda 33 proteomas de referência e
43 outros proteomas paraKlebsiellafagos. Em particular, o proteoma
a infiltração também foi mínima nos animais tratados. Nenhum dos camundongos do relatado de KP36 (para o qual o BPA43 correspondeu ao máximo,
grupo P apresentou qualquer lesão em qualquer um dos intervalos. dependendo dos peptídeos de pontuação mais alta) contém apenas 158
proteínas (ID do proteoma UP000010391 e genoma de referência
4. Discussão NCBI:txid1129191), em que muitas proteínas ainda são relatadas como
hipotéticas. Uma pontuação significativa foi obtida para a homologia do
K. pneumoniaesubesp.pneumoniaeé um membro da família peptídeo comKlebsiellafago KP36, levando à identificação confiável do fago
Enterobacteriaceae e tem um amplo espectro de doenças entre as BPA43 (tabela 1). Isso enfatiza a utilidade da tecnologia baseada em
espécies, incluindo broncopneumonia, infecção do trato urinário, proteínas, como nLC-MS/MS, como uma alternativa rápida para a
abscesso hepático e doença sistêmica[19,20]. É uma das principais identificação de fagos em comparação com a análise bioinformática baseada
causas de infecções nosocomiais, especialmente em pacientes no genoma, que consome tempo e requer experiência. Apenas alguns
debilitados e imunocomprometidos.[21]. Nesta era de surgimento desses relatórios estão disponíveis para
 T. Anand et ai. / Journal of Global Antimicrobial Resistance 21 (2020) 34–41 39

Figura 8.Seções pulmonares de camundongos BALB/c do grupo (a–c) B e (d–f) grupo BP sacrificados em 1, 3 e 6 dpi (coloração com hematoxilina e eosina). (a) Necrose do parênquima
alveolar com infiltração moderada a intensa de neutrófilos e presença de exsudato neutrofílico na luz bronquiolar (100-). (b) Necrose franca dos alvéolos e epitélio bronquiolar com forte
infiltração de neutrófilos no lúmen bronquiolar e no parênquima (400-). (c) Necrose do parênquima alveolar com infiltração de neutrófilos, linfócitos e macrófagos (400-). (d) Vasos
sanguíneos congestionados com infiltração leve a moderada de neutrófilos no parênquima pulmonar (100-). (e) Área focal de necrose e infiltração de neutrófilos no parênquima
pulmonar (100-). (f) Infiltração discreta de linfócitos e neutrófilos no parênquima pulmonar (400-). Grupo, B,9UFC); grupo BP, bactérias (109UFC) seguido de bacteriófago (109PFU)
administrado por via intranasal após 2 h de infecção bacteriana.

mesa 2
Classificação das lesões histopatológicas nos pulmões de camundongos do grupo B em comparação com o grupo BP.a, b

Tempo pós-infecção Necrose de alvéolo Bronquiolite com exsudato Infiltração de células inflamatórias Infiltração peribrônquica e
parênquima inflamatório no lúmen perivascular

Grupo BP Grupo B Grupo BP Grupo B Grupo BP Grupo B Grupo BP Grupo B

12 hpi + ++ – – + ++ – –
1 dpi + ++++ – ++++ ++ ++++ – ++
2 dpi ++ ++++ + +++ ++ ++++ + ++
3 dpi ++ +++ – +++ +++ ++++ + +++
6 dpi + +++ – + + +++ – ++
10 dpi – ++ – – + ++ – –

hpi, horas pós-infecção; dpi, dias pós-infecção.

aGrupo B, apenas instilação de bactérias (109UFC); grupo BP, bactérias (109UFC) seguido de bacteriófago (109PFU) administrado por via intranasal após 2 h de infecção bacteriana.
bPontuações para lesões foram dadas com base em leve (+), moderada (++), grave (+++) e generalizada (++++).

cumprindo o objetivo de identificação rápida de bacteriófagos por meio de bem como vias intranasais para terapia fágica antes e imediatamente após a
métodos proteômicos baseados em MS[37–39]. infecção comK. pneumoniae[11,21]. No entanto, como hipótese
A eficácia terapêutica do BPA43 foi explorada em um modelo BALB/cmouse. A anteriormente[11], a via intraperitoneal não é uma via normal para
patologia de uma cepa virulenta deK. pneumoniaesubesp. pneumoniae ( administração de medicamentos e a probabilidade de detecção precoce por
Suplementar Fig. S1) foi estudado em animais tratados com bacteriófagos em células imunes é maior, por isso utilizamos a via intranasal de administração
comparação com um grupo de controle positivo (grupo B) durante um período de de fagos para terapia. Uma queda significativa na contagem bacteriana nos
14 dias (Fig. 8;Mesa 2) por meio de avaliação clínica, alterações histopatológicas pulmões dos animais do grupo tratado com bacteriófago (grupo BP) após
macroscópicas e pontuação das lesões histopatológicas. No grupo controle 48h está de acordo com os achados macroscópicos e histopatológicos.
positivo (grupo B), as alterações começaram às 12 horas e progrediram de Lesões leves em camundongos do grupo tratado (grupo BP) em 6 dpi podem
alterações broncopneumônicas focais para infecção generalizada nos pulmões. No ser devidas a endotoxinas liberadas pelas bactérias lisadas. O BPA43 pode
grupo de tratamento com bacteriófagos (grupo BP), foram observadas lesões ser detectado nos tecidos pulmonares até 6 dpi, embora com uma tendência
patológicas marcadamente menos intensas, com necrose e células inflamatórias decrescente contínua a partir de 6 hpi, o que reflete a densidade
relativamente menores. A pontuação das lesões pulmonares confirma ainda mais decrescente de bactérias no tecido.
a recuperação precoce da broncopneumonia (mesa 2). A utilidade dos fagos para A diminuição dos sinais clínicos e das lesões macroscópicas e
o direcionamentoK. pneumoniaeinfecções, por exemplo, broncopneumonia, microscópicas, juntamente com uma queda significativa na contagem
abscesso hepático e queimaduras, foi documentado anteriormente por meio de bacteriana, ressaltam a importância do BPA43 como um fago com potencial
tratamento em vários estágios da infecção e, em todos os estudos, foi terapêutico promissor no tratamento de doenças patogênicas.K.
estabelecido que a terapia fágica precoce é eficaz na eliminação de bactérias pneumoniae-broncopneumonia induzida. A utilidade da tecnologia
[11,21,40]. Estudos anteriores utilizaram a via intraperitoneal como relativamente fácil de nLC-MS/MS também foi destacada na identificação de
bacteriófagos.
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