Cromatografia contracorrente: princípios e aplicações 1

Revista Eletrônica de Farmácia

Eletronic Journal of Pharmacy
ISSN 1808-0804
doi 10.5216/ref.v15ie.47586

Revisão

Cromatografia contracorrente: princípios e aplicações

Countercurrent chromatography: principles and applications

Cromatografía contracorriente: principios y aplicaciones

BÜTTENBENDER, Sabrina Laíz 1,∗ , SIMON, Elisa de Saldanha 1 , VOLPATO, and Nadia Maria 1

1
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
∗ [email protected]

Resumo. Introdução: Esta revisão aborda a cromatografia contracorrente (CCC), técnica utilizada para separação em que
são utilizadas duas fases líquidas imiscíveis, compostas por uma mistura de solventes. As vantagens da CCC frente a outras
técnicas cromatográficas estão relacionadas principalmente à ausência de um suporte sólido. Metodologia: São apresentados
os principais aspectos em relação à evolução da técnica, ao desenvolvimento metodológico e às aplicações em produtos
naturais e na enantiosseparação, relatadas em estudos publicados entre janeiro de 2013 e agosto de 2016. Resultados e
Discussão: A seleção do sistema de solventes bifásico (SSB) é um ponto crítico do método e tem sido alvo de importantes
estudos, os quais incluem também o desenvolvimento de modelos completamente teóricos para escolha do sistema de
solventes ideal. As tendências apontam para o uso de alcanos, já tradicionais em CCC, em que podem ser adicionados agentes
modificadores, como ácidos, bases e seletores quirais. Algumas inovações nos modos de eluição descrevem os gradientes
de polaridade, a extrusão da fase estacionária, a reciclagem de fase móvel e o refinamento por zona de pH. Conclusões: O
emprego da CCC para a separação de produtos de origem vegetal e de enantiômeros é destacado, evidenciando o potencial
desta técnica na separação de compostos com atividade biológica.
Palavras-chave: Cromatografia. Solventes. Produtos Biológicos.

Abstract. Introduction: This review addresses the countercurrent chromatography (CCC), a separation technique that
uses two immiscible liquid phases, composed of a solvents mixture. The advantages of CCC over other chromatographic
techniques are mainly associated to the absence of a solid support. Methodology: The main aspects regarding the evolution
of the technique, methodological development and applications to natural products and enantioseparation reported in studies
published between 2013 and August 2016 are presented. Results and Discussion: The biphasic solvent system (BSS) selection
is a critical point of the method, and it has been the subject of important studies, including the development of completely
theoretical models to choose the ideal solvent system. Trends observed addresses to the use of alkanes, well established in
CCC, in which it is possible to add some modifying agents, like acids, bases and chiral selectors. Some modifications in elution
modes are reported, such as polarity gradients, stationary phase extrusion, mobile phase recycling and pH-zone refining.
Conclusions: The use of CCC for the separation of vegetal products and enantiomers is highlighted, pointing the potential of
this technique for the separation of biologically active compounds.
Key-words: Chromatography. Solvents. Biological Products.

Resumen. Introducción: Esta revisión aborda la cromatografía contracorrente (CCC), una técnica de separación que
utiliza das fases líquidas inmiscibles, compuestas por una mezcla de solventes. Las ventajas de la (CCC) frente a otras
técnicas cromatográficas están relacionadas principalmente a la ausencia de un soporte sólido. Metodología: Se presentaron
los principales aspectos en relación a la evolución de la técnica, al desarrollo metodológico y las aplicaciones en productos
naturales y en la enantioseparación, reportadas en estudios publicados entre 2013 y agosto de 2016. Resultados y Discusión:
La selección del sistema de solventes bifásico (SSB) es un punto crítico del método y, ha sido objeto de importantes estudios,
incluyendo también el desarrollo de modelos completamente teóricos para elegir el sistema de solventes ideal. Las tendencias
apuntan al uso de alcanos, ya tradicionales en CCC, en que se pueden agregar agentes modificadores, como ácidos, bases y
selectores quirales. Se describieron algunas innovaciones en los modos de elución, como gradientes de polaridad, extrusión
de fase estacionaria, reciclaje de fase móvil y refinación por zona de pH. Conclusiones: Se destacó el empleo de la CCC para
la separación de productos de origen vegetal y de enantiómeros, evidenciando el potencial de esta técnica para la separación
de compuestos biológicamente activos.
Palabras-clave: Cromatografía. Solventes. Productos biológicos.
2 BÜTTENBENDER et al., 2018

1 Introdução chromatography”. Para a construção de indicadores rela-

A cromatografia contracorrente (CCC) é uma técnica de cionados às publicações de aplicação prática da técnica,
separação por meio da partição da amostra em um sistema utilizou-se a base de dados Scopus, limitando apenas para
líquido-líquido, sem envolver uma fase sólida. A fase esta- resultados em inglês, publicados entre janeiro de 2013 e
cionária (FE) e a fase móvel (FM) são líquidos imiscíveis, agosto de 2016. A busca retornou 428 resultados, sendo
obtidas a partir de uma mistura de solventes previamente que aqueles artigos cujo acesso ao texto completo não es-
equilibrados. A proporção relativa dos solutos da amostra tava disponível foram excluídos. Os trabalhos encontrados
em cada uma das fases está relacionada aos respectivos co- contendo aplicações práticas de CCC de alta velocidade e
eficientes de partição(1). de alta eficiência foram compilados em uma planilha ele-
trônica, descrevendo as informações: fonte da publicação,
Em comparação a outras técnicas cromatográficas, as tipo de equipamento utilizado, escala de trabalho e área de
principais vantagens da CCC estão relacionadas à ausência aplicação. Para o embasamento teórico da presente revisão
de suporte sólido para FE, permitindo a recuperação total foram também utilizados artigos científicos, de revisão e
da amostra injetada, visto que não há adsorção de analitos, capítulos de livros anteriores a este período. Trabalhos cujo
processo irreversível que pode levar ao esgotamento do su- enfoque principal era aprimoramento instrumental e mo-
porte e à perda de amostra(2). Ainda, o consumo de solvente delagem matemática em CCC não foram exaustivamente
por carga de amostra processada é menor em CCC, quando analisados, sendo segregados.
comparado com a cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE), devido à natureza líquida da FE. A razão entre o
volume de FE disponível para separação e o volume de FM
é em torno de 80% na coluna de CCC, em contraste a 20% 3 Resultados e discussão
da CLAE, onde a fração da coluna que participa ativamente
do processo de separação é limitada pela interface com a Breve Evolução da CCC
FM(1,3).
Em 1949, com o conceito de distribuição contracorrente,
Em CCC, a eficiência do processo está relacionada à re- foi desenvolvido o equipamento de Craig e Post, que con-
tenção da FE na coluna. A variação no volume relativo de sistia numa série de tubos de ensaio contendo a FE e uma
FE na coluna é capaz de modificar a resolução entre com- vazão de FM que os atravessava, sendo que a amostra era
postos com diferentes coeficientes de partição, melhorando colocada no primeiro tubo. Este equipamento não é mais
a eficiência de uma separação específica(4). Dispondo ape- utilizado, devido à necessidade de grande espaço físico e a
nas de alguns solventes de uso comum, pode-se ter grande sua fragilidade. Na distribuição contracorrente, o equilíbrio
variedade de sistemas de solventes, apenas variando as pro- é completado antes da transferência de fase(7,8).
porções de cada solvente no sistema(5).
No final da década de 1960 foram desenvolvidos os
Apesar das vantagens relacionadas ao uso de FE líquida primeiros protótipos e estudos envolvendo o princípio da
e do crescente número de estudos relacionados à separa- CCC, por Yoichiro Ito(2). Debates sobre a nomenclatura da
ção de compostos naturais, enantiômeros, macromoléculas técnica têm a acompanhado desde o início do seu desen-
e impurezas, ainda há pouca aplicação da CCC na indús- volvimento. O próprio nome gera controvérsias, uma vez
tria farmoquímica e farmacêutica. Ainda assim, a mesma que as duas fases não realizam uma circulação contracor-
é uma técnica com uso industrial promissor, pois o esca- rente entre si: apenas um dos líquidos flui enquanto o outro
lonamento de um método analítico piloto pode ser feito de está retido no sistema, através de um campo de força gra-
forma rápida e previsível, com elevadas taxas de pureza e vitacional gerado por um movimento centrífugo. Porém, a
rendimento(4,6), sendo este fato um diferencial em compa- nomenclatura envolvida foi adotada por seus usuários desde
ração com outras técnicas cromatográficas. seu desenvolvimento e, em 2009, a IUPAC publicou um re-
latório técnico intitulado Countercurrent Chromatography
Este estudo teve como objetivo revisar a evolução da téc- in Analytical Chemistry, no qual aborda as definições e a
nica de CCC, abordando aspectos relacionados aos sistemas terminologia geral relacionada à CCC(3,9,10).
de solventes e modos de eluição, enfatizando os estudos de
separação de produtos naturais e de enantiômeros publica- Desde o início dos anos 1970, quando Ito e Bowman(11)
dos recentemente. chamaram de Cromatografia Contracorrente a técnica cro-
matográfica que desenvolveram usando um tubo helicoidal
preenchido com duas fases líquidas imiscíveis, sem a
presença de um suporte sólido, a CCC vem sendo cons-
tantemente aprimorada por meio de diferentes princípios e
2 Metodologia equipamentos.
Para o desenvolvimento desta revisão integrativa, foi Um sistema cromatográfico preparado para executar
realizada uma pesquisa bibliográfica nas bases de da- CCC consiste de uma bomba que promove a vazão de FM,
dos Scopus e Web of Science, utilizando os termos de um injetor, um sistema tubular espiral, chamado de co-
busca “countercurrent chromatography” e “counter-current luna, que realiza um movimento planetário e origina um
campo de força gravitacional que mantem a FE retida, um
coletor de frações e um detector(3). As colunas utilizadas
Cromatografia contracorrente: princípios e aplicações 3

em CCC foram classificadas em duas principais catego-

rias, considerando a natureza, constante ou não, do campo
de força gravitacional gerado pelo instrumento: as colu-
nas hidrostáticas e as colunas hidrodinâmicas(2,3,9,12). Em
equipamentos hidrostáticos, o campo de força gravitacio-
nal é derivado da rotação em torno de um único eixo. Nos
equipamentos hidrodinâmicos, o campo de força gravitaci-
onal gerado na coluna tubular espiralada é variável, devido
à força gravitacional resultante da combinação dos movi-
mentos síncronos de centrifugação e de rotação em torno
do próprio eixo do suporte em que a coluna está envolta.
Este movimento planetário é chamado de “tipo J”(10,13).
Desde o surgimento da CCC foram desenvolvidas al-
gumas variações técnicas, utilizando o sistema hidrostático Figura 1. Artigos publicados com estudos de HSCCC e HPCCC.
ou hidrodinâmico. Como exemplo de sistemas hidrostáticos
temos a cromatografia contracorrente de gotículas (DCCC,
do inglês droplet countercurrent chromatography) e a cro- processada e de composto isolado recuperado.
matografia de rotação locular (RLCCC, do inglês rotation
locular countercurrent chromatography)(2,13). Entretanto, ainda há poucos instrumentos de HPCCC
disponíveis e a predominância de publicações envolvendo
Visando melhorar a resolução entre os sinais cromato- HSCCC é marcante (FIGURA 1). O desenvolvimento téc-
gráficos, diversos arranjos geométricos de colunas e eixos nico da CCC ainda está em evolução e, dentre as publicações
de rotação foram desenvolvidos(13), promovendo também levantadas na base de dados, aproximadamente 13% eram
aumento no volume de FE retida na coluna. O sistema estudos relacionados a novas metodologias ou modificações
chamado “J” é utilizado atualmente em equipamentos de instrumentais, estas últimas envolvendo principalmente a
cromatografia contracorrente de alta velocidade (HSCCC, geometria da coluna de separação(17).
do inglês high-speed countercurrent chromatography) e cro-
matografia contracorrente de alta eficiência (HPCCC, do Princípio Fundamental da CCC
inglês high-performance countercurrent chromatography).
O princípio de separação em CCC é baseado na parti-
Os equipamentos de HSCCC operam a velocidades de ção de um soluto entre duas fases líquidas imiscíveis, uma
rotação que geram forças de aceleração de até 80 vezes a sendo mantida estacionária no interior da coluna, e outra
aceleração da gravidade da Terra (80 g). De maneira geral, móvel, no processo cromatográfico dentro da coluna. Em
as análises realizadas nestes instrumentos têm duração mí- equipamentos hidrodinâmicos, a FE é mantida no interior
nima de 120 minutos(14). da coluna devido ao campo de força gravitacional gerado
no equipamento, resultante da combinação dos movimentos
Na década de 2000, desenvolveu-se a técnica de HPCCC, síncronos de rotação e revolução. A FIGURA 2A ilustra um
em que equipamentos com o mesmo mecanismo de fun- instrumento que realiza este movimento planetário, conhe-
cionamento foram capazes de atingir maiores velocidades cido como “tipo J”, em que os eixos de rotação e revolução
(1600 rpm), gerando forças gravitacionais de 240 g no são paralelos. A estrutura na qual a coluna está enrolada gira
interior da coluna(15). Separações por HPCCC tem me- em torno do seu próprio eixo e em torno do eixo central do
nor tempo de corrida, na ordem de dezenas de minutos, equipamento na mesma velocidade angular () e na mesma
mantendo boa resolução de análise em escala analítica e direção(2).
preparativa, com maior retenção de FE(14).
Este movimento mantém a fase menos densa do sistema
Guzlek, Wood e Janaway(15) publicaram um trabalho em uma das extremidades da coluna, chamada de cabeça,
comparando equipamentos de HSCCC e HPCCC, con- enquanto a fase mais densa tende a se movimentar em dire-
cluindo que campos de força gravitacionais de maior inten- ção à outra extremidade, chamada de cauda. Esta tendência
sidade retêm maior quantidade de FE na coluna, levando a permite a operação do equipamento em dois modos. No
separações com menor tempo de corrida. Ainda evidencia- modo normal, a coluna é inicialmente preenchida pela fase
ram que os métodos em HPCCC foram capazes de processar mais densa (a fase inferior do sistema de solventes) e, en-
uma quantidade dez vezes maior de amostra, com maior re- tão, a FM de menor densidade (a fase superior) é bombeada
solução entre os sinais cromatográficos(15). da cauda para a cabeça da coluna. Já no modo reverso, a
coluna é preenchida com a fase menos densa e a fase mais
Outro trabalho confrontando diferentes instrumentos de densa é bombeada da cabeça para a cauda. Desta forma,
CCC foi realizado por Zhang e colaboradores(16), que apre- com velocidade de rotação e vazão adequadas, é possível
sentaram uma análise comparativa de custo-eficiência. Em reter mais de 50% de FE na coluna, que é o percentual mí-
comparação com métodos desenvolvidos em HSCCC pu- nimo indicado para separações eficientes(3,18).
blicados anteriormente, o método em HPCCC teve melhor
desempenho, com maiores quantidades de amostra bruta Este comportamento proporciona, ainda, um eficiente
contato do soluto com as duas fases líquidas. Na FIGURA
4 BÜTTENBENDER et al., 2018

Figura 2. (A) Coluna espiral de equilíbrio hidrodinâmico que realiza

movimento planetário síncrono “tipo J”; (B) Distribuição das fases no
interior da coluna espiral em diferentes momentos do movimento (I, II, III
e IV); (C) Distribuição das fases em uma volta da coluna espiral. FI: Fase
Inferior; FS: Fase Superior.

2B é possível observar um esquema com várias posições (I,

II, III e IV) que a coluna atinge durante o movimento plane-
tário. O interior da coluna é dividido em zonas diferentes,
no que se refere a força gravitacional resultante (FIGURA
2C). Próximo ao eixo central de rotação ocorre a mistura
das duas fases líquidas, e na região restante tem-se a zona
de decantação, em que o campo de força gravitacional é
alto(3). Desse modo, o campo de força gravitacional pro-
duzido no interior da coluna é alternante e não constante.
Estabelece-se um equilíbrio hidrodinâmico entre as fases, Figura 3. Composição percentual (v/v/v/v) das 23 misturas nomeadas de
sendo que cada uma delas pode ocupar, aproximadamente, A a Z.
metade do volume total da coluna(18).

Em CCC, o coeficiente de partição (K) é calculado como

a razão entre a concentração de soluto na FE por aquela na nas composições foram água, acetato de etila, metanol e
FM. A faixa mais indicada de valores de K é de 0,4 a 2,5(19). hexano, evidenciando a popularidade dessa família de sol-
Valores baixos indicam afinidade do soluto pela FM, o que ventes, conhecida como HEMWat (do inglês hexane/ethyl
pode levar à eluição junto ao front de solvente, enquanto acetate/methanol/water). A separação de amostras de cará-
valores elevados estão associados à maior interação com a ter hidrofílico é direcionada ao uso de menor proporção de
FE, levando a tempos de corrida mais longos(19). alcano, ou então de outros solventes, como as combinações
entre clorofórmio, metanol e água (ChMWat) ou hexano,
Sistemas de Solventes butanol e água. Para o isolamento de compostos ionizáveis,
é possível ajustar o valor de K pelo controle do pH, utili-
A maior parte dos sistemas de solventes utilizados em zando ao invés de água, uma solução aquosa de sulfato de
CCC são misturas ternárias ou quaternárias contendo água amônia ou ácido trifluoracético, por exemplo(23,24).
e solventes orgânicos, que se separam em duas fases, a
superior e a inferior. Inicialmente, utilizou-se clorofórmio Estudos recentes têm utilizado sistemas bifásicos aquo-
como principal solvente hidrofóbico, mas devido aos efeitos sos, principalmente para separação de compostos bioativos,
ambientais e biológicos deletérios associados a solventes visto que preservam a atividade e a conformação das subs-
clorados, popularizou-se o uso de sistemas contendo alca- tâncias em solução(25,26). A separação do sistema aquoso
nos como solvente majoritário da fase superior. Sistemas em duas fases pode ser promovida por duas estratégias. A
que contém heptano ou hexano, acetato de etila, metanol primeira, e mais amplamente aplicada, é a utilização de
e água em diferentes proporções são eficazes na separa- polímeros, como polietilenoglicol de alto peso molecular,
ção de substâncias em uma ampla faixa de polaridade, que confere característica menos polar a uma das fases(27).
abrangendo compostos lipofílicos até moderadamente po- A segunda é pela adição de líquidos iônicos, que são sais
lares(20). Composições pré-definidas desses solventes são líquidos de viscosidade elevada em temperatura ambiente
propostas e tabeladas, sendo uma delas conhecida como compostos, por exemplo, pelo cátion imidazólio combinado
sistema Arizona, com nomenclatura de A a Z para as dife- a diferentes ânions(28).
rentes proporções (FIGURA 3). Em geral, esses sistemas se
separam em duas fases rapidamente, o que está relacionado Seleção do sistema de solventes bifásico (SSB)
a processos com boa retenção de FE (2).
Em CCC, a etapa crítica em estudos almejando o isola-
Skalicka-Woźniak e Garrard(22) realizaram um levanta- mento de uma substância é a seleção do sistema de solventes
mento dos sistemas de solventes bifásicos utilizados para bifásico (SSB). Diferente de outras metodologias de sepa-
purificação de produtos naturais por CCC e CPC no pe- ração, a FE e a FM não são independentes, pelo contrário,
ríodo de 1984 a 2014. Os quatro solventes mais listados a composição de cada uma das fases está relacionada ao
Cromatografia contracorrente: princípios e aplicações 5

equilíbrio formado entres ambas em um sistema de dife- que é interessante quando se deseja separar produtos natu-
rentes solventes. Por esta razão, não é possível escolher a rais cuja estrutura molecular ainda é desconhecida.
FE separadamente da FM. São escolhidas em uma mesma
etapa, em que é avaliada a natureza e a proporção de cada Para métodos completamente teóricos de seleção do
componente da mistura de solventes que formará as duas sistema de solventes, a solubilidade de cada composto é
fases. calculada em cada uma das fases. É necessário conhecer,
além da composição da fase e da estrutura molecular dos
A seleção empírica do SSB geralmente envolve pro- solventes, a estrutura molecular do analito, pois os mode-
cessos iterativos de determinação dos valores de K em los in silico levam em conta as características geométricas
experimentos de partição ou dos fatores de retenção (Rf) das moléculas envolvidas. O processo completo, até che-
em cromatografia em camada delgada (CCD)(29). Como a gar ao cálculo de K, requer pelo menos três plataformas de
possibilidade de combinações de solventes é praticamente softwares diferentes(30), o que limita a aplicação de apenas
infinita, alguns protocolos foram montados para auxiliar na estratégias computacionais para escolha do SSB.
busca sistemática de um sistema de solventes adequado(23).
Modos de Eluição
Para selecionar o sistema de solventes por CCD, uma
porção de amostra é dissolvida em SSB com mesmo vo- As aplicações mais convencionais de CCC utilizam
lume de fase inferior e superior. Alíquotas iguais coletadas um sistema de solventes em modo de eluição isocrático
de ambas as fases são aplicadas em uma placa cromatográ- para separação de componentes majoritários de misturas
fica de sílica e eluídas com a fase menos polar, avaliando-se complexas(9). Diversas alternativas têm sido empregadas
então os valores de Rf dos componentes a serem separados. visando o isolamento de compostos de diferentes polarida-
Utilizando diferentes proporções de solventes HEMWat e des ou corridas de menor duração, como, por exemplo, a
ChMWat, Friesen e Pauli(19) demonstraram a relação exis- eluição em gradiente de polaridade.
tente entre os valores de Rf e os coeficientes de partição
obtidos experimentalmente. É desejável que os valores de Alterar a proporção dos solventes da FM durante a cor-
Rf estejam entre 0,29 e 0,71, pois estão relacionados a va- rida de CCC foi uma das primeiras estratégias empregadas
lores de K entre 0,4 e 2,5. No entanto, esta correspondência para separar componentes com uma ampla faixa de valo-
não necessariamente implica um bom resultado em CCC, res de K de uma mistura complexa. Para evitar a perda de
já que o mecanismo de separação por CCD envolve tam- FE durante este processo, o ideal é que o sistema de sol-
bém, além da partição, a adsorção da amostra no suporte ventes seja robusto, mantendo a composição da FE estável
sólido(1). mesmo quando a composição da outra fase é alterada(33).
O gradiente pode ser linear ou não, sendo este último o mais
Para os experimentos de partição, a amostra em estudo empregado, no qual em algum ponto da corrida com o sis-
é dissolvida nas proporções de solventes em teste. Após o tema de solventes primário é bombeada uma nova FM(34).
equilíbrio, é feita a quantificação do analito em cada uma Tipicamente, em uma corrida em modo reverso, a nova FM
das fases, geralmente por CLAE, e a partir desses resulta- é composta por uma proporção menos polar dos mesmos
dos é calculado o valor de K para um determinado SSB. solventes utilizados no SSB original, para eluir os analitos
Obtendo-se o valor de K do analito em equilíbrio estático de menor polaridade.
é possível inferir com boa correlação o valor de K no equi-
líbrio hidrodinâmico de CCC(30), o que justifica o amplo Yang e colaboradores(35) isolaram quatro podofilotoxi-
uso dessa estratégia em grande parte dos estudos(29). nas com modos de eluição isocrático e gradiente, utilizando
HEMWat (4:6:3:7 e 4:6:4:6, v/v/v/v). Os testes foram reali-
A predição ou estimativa do valor de K por modelos zados em HSCCC em modo reverso, variando a composição
matemáticos tem sido estudada para facilitar a escolha do da FM constituída por metanol e água. Os modos de gra-
SSB ideal. A estimativa é feita com base nas propriedades diente linear e não-linear apresentaram melhor resolução.
termodinâmicas do analito e dos solventes. Ren e cola- Ainda, o gradiente não-linear apresentou menor tempo de
boradores(31) empregaram um método semiempírico para corrida (360 minutos) em relação ao linear (420 minutos).
seleção do SSB para separação de sete componentes de
Spirodela polyrrhiza (L.) com diferentes polaridades. A es- Para otimizar a separação de compostos com valores de
tratégia computacional utilizada no trabalho, NRTL-SAC K muito diferentes também pode ser usado um gradiente de
(do inglês nonrandom two-liquid segment activity coeffi- fluxo. O aumento da vazão de FM durante a corrida permite
cient), requer o resultado de três a cinco experimentos de diminuir o tempo de separação para compostos com afini-
partição para predizer o valor de K em diferentes proporções dade pela FE(34). Entretanto, a resolução pode ser afetada,
de SSB, mesmo que em famílias de solventes distintas(32). devido à maior perda de FE causada por fluxos mais eleva-
Enquanto as características termodinâmicas dos solventes dos(36).
utilizados podem ser extraídas da literatura, os valores ex-
perimentais de K são necessários para determinação dos Todavia, Ko e colaboradores(37) conseguiram melhor
parâmetros moleculares dos solutos. Com esses dados, a resolução e separação aplicando um gradiente de fluxo. Fo-
estrutura dos compostos alvo não precisa ser informada, o ram testados diferentes fluxos para a separação por HPCCC
de cinco oligostilbenos, após otimização do SSB HEMWat
(4:8:4:10, v/v/v/v) utilizado em modo reverso. Foi testado
6 BÜTTENBENDER et al., 2018

um gradiente, onde um fluxo de 4 mL/min foi mantido nos que passa a ser bombeada continuamente. Esta, retida inici-
70 minutos iniciais, quando então passou para 8 mL/min. A almente na coluna, é eluída completamente, permitindo que
alta velocidade atingida pelo equipamento de HPCCC foi todos os componentes separados sejam recuperados(42).
capaz de reter 65% da FE, mesmo com alta vazão de FM. Em estudo realizado em escala preparativa, Paek e Lim(43)
separaram sete compostos naturais de raízes de Nardosta-
Já para compostos ionizáveis, que quando em sua forma chys chinensis com atividade farmacológica, cujos valores
neutra possuem valores de K muito próximos, pode ser apli- de K variavam de 0,49 a 4,23.
cado um gradiente de pH. Durante a eluição, são bombeadas
fases móveis aquosas ajustadas a diferentes valores de pH, De maneira semelhante à eluição com extrusão, existe a
de acordo com o pKa dos ácidos ou bases que se deseja eluição em modo duplo, em que os dois modos de eluição,
separar(29,38). normal e reverso, são utilizados, um em seguida do outro,
em uma mesma análise. A fase que está sendo bombeada
Na década de 1990 desenvolveu-se a técnica de CCC no primeiro modo é trocada pela outra fase, com a troca
com refinamento por zona de pH, a qual separa compostos simultânea da direção do fluxo, passando a operar no outro
ionizáveis utilizando modificadores de natureza ácida e bá- modo(17).
sica no sistema de solventes. Diferente do modo de eluição
em gradiente de pH, em que a adição de base ou ácido é A possibilidade de otimizar a eluição em CCC se dá
feita somente na FM(34), no refinamento por zona de pH também pela reciclagem da FM. O efluente da coluna é
há adição de baixas concentrações de modificadores de pH retornado a ela continuamente até que se consiga a separa-
em ambas as fases do sistema. ção desejada. É como se a coluna fosse expandida, o que
aumenta a eficiência de separação(44). É preciso uma adap-
Nesta técnica, pela combinação da adição de um agente tação instrumental, para que a tubulação de saída do detector
de retenção na FE e de um agente de eluição na FM é possí- esteja conectada à tubulação de entrada da bomba de FM.
vel reter os analitos e fazer uma eluição modulada de acordo A quantidade de solvente consumida não se altera, mas há
com suas diferenças de polaridade e pKa(3). É uma estra- um prolongamento da duração do experimento cromato-
tégia para otimização de separação que tem sido utilizada gráfico(34). Uma desvantagem inerente a essa técnica é o
em instrumentos convencionais de CCC em escala prepa- alargamento dos sinais cromatográficos. Com o aumento
rativa, principalmente para separação de alcaloides, ácidos do número de ciclos, os picos são estendidos, até o limite
orgânicos, aminoácidos e peptídeos(34,39). Inicialmente, a em que se deve interromper a reciclagem, para evitar a so-
coluna é preenchida com a FE contendo o agente de reten- breposição dos sinais. Por este motivo, amostras de maior
ção. Após a injeção da amostra, sob velocidade de rotação complexidade requerem um tratamento prévio, de forma
desejada, é bombeada FM contendo o agente de eluição, que se eliminem os solutos indesejados, ou se obtenham
que irá gradativamente entrar em equilíbrio com o agente frações mais simples dos compostos alvo. Para a separação
de retenção, criando zonas bem definidas de diferentes va- de polifenóis, Liu e colaboradores(45) fizeram uma pré-
lores de pH, onde as moléculas podem estar protonadas ou purificação do extrato de Malus hupehensis (Pamp.) Rehder
não(40). Assim, analitos de diferentes valores de pKa irão por HSCCC convencional. Posteriormente, duas frações
se deslocar para a FM ou FE de acordo com a afinidade das em que houve coeluição de compostos de interesse foram
espécies formadas. submetidas à HSCCC com reciclagem, que foi efetiva na
separação dos compostos de estrutura similar que não ha-
Alguns ácidos graxos saturados e insaturados possuem viam sido resolvidos pela técnica convencional.
mesmo K e são coeluídos em separações por CCC. En-
glert e Vetter(41) utilizaram o refinamento por zona de Sistemas de Detecção
pH para separação de ácidos graxos de óleo de girassol,
com SSB composto por hexano/acetonitrila/metanol/água Embora seja recomendado o monitoramento contínuo
(4:7:1,4/0,5 v/v/v/v). Foram adicionados 20 mM de amônia do processo de separação, não é necessário que exista um
(NH3) na fase inferior e 35 mM de ácido trifluoroacético sistema de detecção acoplado ao equipamento de CCC.
(TFA) na fase superior, sendo que foram testadas corridas Uma vez que o SSB e as condições cromatográficas estejam
em modo normal e reverso. No modo reverso ainda houve definidos, as frações coletadas podem ser analisadas poste-
coeluição de alguns ácidos, mas no modo normal (NH3 riormente por CLAE, CCD ou outra técnica adequada. De
como agente de retenção e TFA como agente de eluição) os modo geral, os equipamentos de CCC são acoplados aos
analitos foram recuperados com pureza maior de 95%. mesmos detectores utilizados em CLAE. A detecção por
ultravioleta (UV)-visível de forma contínua é a de maior
Outra otimização de eluição pode ser feita com a extru- emprego, sendo que 87% dos cromatogramas apresentados
são da FE, voltada para separação de amostras complexas, em isolamento de produtos naturais por CCC empregam
em que os solutos possuem grandes diferenças de polari- este detector(29).
dade entre si. O objetivo é acelerar a eluição dos compostos
retidos na FE, ou seja, aqueles com maiores valores de K, Entretanto, muitas das moléculas separadas por CCC
que levariam mais tempo para serem eluídos na FM(24). A não absorvem, ou absorvem pouca energia na faixa UV.
primeira parte do processo é uma eluição convencional, na É o caso, por exemplo, de saponinas e terpenoides, que
qual, após o bombeamento de um determinado volume de têm sido separados por CCC acoplada a detector evapora-
FM, a eluição é continuada substituindo-se a FM pela FE, tivo por espalhamento de luz (ELS, do inglês evaporative
Cromatografia contracorrente: princípios e aplicações 7

light scattering)(39). A evaporação do solvente em detec- Costa e Leitão(48) revisaram e propuseram estratégias
tores ELS é uma vantagem quando há perda de FE durante para o isolamento de flavonoides livres e glicosilados por
a análise. Os solventes da FE podem alterar a linha de base CCC. Por exemplo, a adição de butanol a uma proporção de
no cromatograma gerado pela detecção on-line por UV(46). SSB da família HEMWat é capaz de otimizar o particiona-
mento de solutos polares, como os flavonoides glicosilados
Juntos, os cromatogramas com detecção por UV-visível e alguns flavonoides livres, pois age como modificador da
e ELS representam aproximadamente 96% das separações fase orgânica. Também sugerem o uso de SSBs compostos
de produtos naturais por CCC(29). Existem estudos envol- por acetato de etila, butanol e água, em que é possível apli-
vendo o monitoramento do eluente de CCC por técnicas que car um gradiente de polaridade pela alteração da proporção
forneçam informações estruturais, como ressonância mag- de butanol, o que teria grande impacto na polaridade da fase
nética nuclear de próton(47) e espectrometria de massas(1). orgânica, e menor impacto na fase aquosa.
Aplicações da CCC na purificação de produtos naturais Em relação aos terpenoides, Song e colaboradores(35)
e na enantiosseparação apontam que a baixa polaridade e a ausência de absorção
UV dificultam o isolamento por tecnologias de separação
Pelo levantamento realizado na base de dados Scopus, comuns, e, portanto, a CCC acoplada a detectores ELS tem
foram contabilizadas 306 publicações na área entre janeiro se mostrado adequada para a separação destes compostos.
de 2013 e agosto de 2016 em que foi possível acesso ao Já o isolamento e purificação de alcaloides, devido à na-
texto completo. Destas, 12 artigos (3,92%) eram de revi- tureza alcalina das moléculas, apresentam bons resultados
são, 39 (12,75%) envolviam o desenvolvimento de novos principalmente em CCC com refinamento por zona de pH,
instrumentos ou de novos modelos teóricos para CCC, e os em que SSBs contendo solventes clorados, alcanos ou éter
255 artigos restantes (83,33%) eram estudos a respeito de metil-terc-butílico se destacam(49).
alguma aplicação prática da técnica. Entre estes, em apenas
22 (8,63%) foram realizados estudos em escala analítica. Skalicka-Woźniak e Garrard(22), em sua revisão, tam-
A facilidade de desenvolvimento de métodos em escalas bém avaliaram todos os SSBs utilizados para as separações
semipreparativa e preparativa é um diferencial da CCC, dos produtos naturais. Os sistemas foram divididos em gru-
tornando-a muito atrativa para as áreas que visam à ob- pos hierárquicos baseados no solvente primário da fase
tenção de maiores quantidades de compostos purificados. hidrofóbica. Para a maioria das classes, os sistemas de
solventes mais empregados são aqueles baseados em al-
Os artigos com aplicação da CCC foram categorizados canos, como a família HEMWat. A exceção é a classe das
de acordo com os compostos separados entre: produtos saponinas, em que os sistemas clorados são os mais utiliza-
naturais, enantiômeros, impurezas, produtos biotecnoló- dos, seguidos de outros solventes, especialmente sistemas
gicos e outros, que incluem pesquisas em engenharia de baseados em álcoois imiscíveis em água, como álcool butí-
alimentos, por exemplo. Aproximadamente 85% dos arti- lico(39).
gos aplicaram a CCC para separação de produtos naturais,
com predominância daqueles de origem vegetal. De acordo com Friesen e colaboradores(29), a CCC tem
sido empregada principalmente como uma etapa de um pro-
A purificação de produtos de origem natural é um pro- cesso mais complexo de fracionamento de produtos naturais
cesso complexo em que, por vezes, são necessárias técnicas do que como único procedimento de separação. Em um
de separação muito variadas. A CCC se destaca de outros fluxo de separação, a possibilidade de trabalhar com gran-
métodos de separação devido, principalmente, às vanta- des volumes de amostra bruta, minimizando tratamentos
gens associadas à ausência de um suporte sólido, com o prévios e etapas de filtração e evaporação de solventes, por
custo reduzido e a possibilidade de 100% de recuperação exemplo, pode ser vantajosa em termos econômicos e de
da amostra, já que não haverá perda por adsorção ao su- eficiência(29). Ainda, a variedade de solventes que pode
porte. Além disso, compostos com uma ampla diversidade ser utilizada em CCC possibilita o acoplamento a outras
de polaridade podem ser purificados. Esta versatilidade é técnicas de cromatografia líquida.
possível, pois há inúmeros sistemas de solventes capazes
de compor as FE e FM, que podem ser ajustadas de acordo Mais uma aplicação da CCC é para o que tem sido
com a polaridade desejada. chamado de “nocaute” de compostos majoritários, prin-
cipalmente na avaliação da contribuição biológica de um
Em trabalho de revisão que contemplou estudos em CCC metabólito para a atividade global de um extrato natural.
e CPC publicados entre 1984 e 2014, Skalicka-Woźniak e Quando se deseja isolar os compostos minoritários, que
Garrard(22) contabilizaram um total de 2594 compostos ve- estão presentes em níveis muito baixos e às vezes até por
getais separados por CCC. Flavonoides e flavonolignanas CLAE indetectáveis, é mais efetivo remover previamente os
são a classe mais popular em separações por CCC, com 695 componentes principais. Desta forma, há o enriquecimento
compostos. Terpenoides e alcaloides aparecem em segundo dos compostos menores, possibilitando o seu isolamento e
e terceiro lugar, com 312 e 297 substâncias, respectiva- identificação estrutural(50). Este enriquecimento também
mente. Esta diferença sugere que talvez a CCC esteja mais pode ser alcançado adicionando uma fração de metabólitos
adaptada para determinados produtos naturais, particular- minoritários previamente separada para um extrato original
mente flavonoides e flavonolignanas. que não foi modificado, sendo esta abordagem chamada
de DESIGNER (do inglês Depletion and Enrichment of
8 BÜTTENBENDER et al., 2018

Select Ingredients Generating Normalized Extract Resour- Além da separação de compostos naturais e enantiôme-
ces)(51). ros, existem diversas outras aplicações da CCC encontradas
na literatura, embora menos frequentes, como, por exemplo,
Para a separação de enantiômeros, de forma similar a a identificação de impurezas e a purificação de compostos
outras técnicas como eletroforese capilar (EC) e CLAE, inorgânicos e fármacos sintéticos(9). Entre os produtos com
em CCC é necessário utilizar um seletor quiral (SQ), que atividade biológica, a maioria é de origem vegetal, mas há
é adicionado ao SSB. Idealmente, o SQ é uma molécula também exemplos recentes em preparações biotecnológicas
com alta enantiosseletividade em relação ao racemato alvo, provenientes de algas(64), fungos(65) e bactérias(66).
solúvel em apenas uma das fases do SSB, que geralmente
será utilizada como estacionária, pois assim a quantidade Versatilidade da CCC
requerida de SQ é menor(3). Os principais SQs utilizados
são derivados de ciclodextrinas (CDs), em especial de -CDs, A CCC está estabelecida como uma técnica de separação
pois apresentam, para muitas estruturas, boa estereossele- preparativa e, apesar do seu surgimento na década de 1970,
tividade e habilidade de reconhecimento quiral(5). segue em evolução, sendo que uma parcela dos artigos pu-
blicados na área é referente ao desenvolvimento de novos
No entanto, até o momento, dificilmente são alcançados instrumentos ou novos métodos de eluição. É notável que a
fatores de separação cromatográfica () maiores que 1,5(52), maioria das inovações esteja relacionada à natureza líquida
devido à dificuldade de identificar um SQ altamente enan- de ambas as fases cromatográficas, como o refinamento por
tiosseletivo para os racematos alvo, e pela menor eficiência zona de pH e outras otimizações do modo de eluição.
relacionada à técnica. Huang e Di(5) afirmam que essa
desvantagem inibe o desenvolvimento e as aplicações da se- Os processos de separação por CCC podem ser muito
paração quiral por CCC, que tem evoluído mais lentamente flexíveis, pois outras modificações podem ser aplicadas
que a enantiosseparação por outros métodos. Em contrapar- além dos usuais parâmetros ajustáveis de outras técnicas de
tida, de modo positivo, o custo menor pode tornar a CCC cromatografia líquida, como polaridade e vazão da FM. Al-
competitiva, uma vez que o SQ adicionado ao SSB pode gumas das estratégias mais singulares praticadas em CCC
ser recuperado no final da corrida. Ainda, na técnica, po- são a troca do modo de operação pelo intercâmbio entre
dem ser utilizados reagentes de grau analítico, diminuindo as fases, a extrusão da FE e o refinamento por zona de pH
o custo total do método. Dessa forma, a utilização da CCC pela adição de modificadores em ambas as fases do sistema.
em escala preparativa é apontada como atrativa para a se-
paração de compostos quirais. Neste contexto, os pesquisadores devem adotar uma
abordagem lógica para desenvolvimento de novos proces-
Estratégias para otimizar a separação de enantiômeros sos de separação. Os avanços relativos à determinação do
são apresentadas na tabela 1, que lista alguns dos principais SSB adequado, em especial os modelos preditivos, são fun-
artigos de CCC quiral publicados entre 2013 e 2016. A elui- damentais para a praticidade de utilização da técnica e a
ção com reciclagem, aplicada por Tong, Zheng e Yan(62) difusão do seu uso em outros campos de pesquisa.
e descrita em outros estudos, é uma forma de aumentar a
resolução dos enantiômeros, sem recorrer a um consumo
extra de solvente tampouco de SQ. É possível também re-
correr ao reconhecimento quiral bifásico, o qual consiste na
adição de dois SQs no SSB, um lipofílico e outro hidrofí-
lico, com o objetivo de aumentar a enantiosseletividade(5).
Também a formação de complexos entre íons metálicos e 4 Considerações finais
seletores quirais é uma estratégia que pode ser utilizada em
CCC para a enantiosseparação de compostos que possuem As vantagens inerentes da técnica, como a possibilidade
grupos de caráter eletronegativo em sua estrutura, como de injeção direta de extratos brutos, tornam a CCC uma
aminas, carbonilas e hidroxilas. As ligações de coordena- alternativa para contornar os problemas associados com ad-
ção que ocorrem entre complexos com íon metálico são sorção na fase sólida. Além disto, a relação custo-eficiência
mais estereosseletivas que as outras forças intermolecula- tem se mostrado promissora, principalmente em compara-
res(58), de modo que o poder de reconhecimento quiral é ção com métodos equivalentes desenvolvidos em CLAE. O
aumentado, o que pode levar à separação de maior resolu- tempo de análise dos métodos desenvolvidos em CCC ainda
ção e pureza(5). é considerado longo, tornando-se uma desvantagem frente
a outras técnicas.
A CCC quiral está no início de seu desenvolvimento,
e ainda são necessárias melhorias na eficiência de separa- A separação de compostos para avaliação de seu po-
ção. Huang e Di(5) trazem os principais aspectos a serem tencial terapêutico ou toxicológico é um dos principais
desenvolvidos: seletores quirais com melhor seletividade; propósitos dos estudos em CCC, que vai de encontro aos
otimização dos SSBs para que não interfiram no reconheci- interesses da indústria farmacêutica e farmoquímica. A ob-
mento do SQ; novos designs de instrumentos que permitam tenção de quantidades significativas dos produtos isolados,
melhor retenção de FE e novos métodos para aumentar a mesmo que em concentrações baixas na mistura inicial, é
resolução. um desafio para as técnicas de separação já consagradas,
dentre as quais a CCC é vista como vantajosa.
Cromatografia contracorrente: princípios e aplicações 9

Agradecimentos of geniposide from Gardenia jasminoides Ellis by high-

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico performance counter-current chromatography. Sep. Purif.
e Tecnológico (CNPq), à Universidade Federal do Rio Technol. 2012;89:193–198.
Grande do Sul (PROBIC-FAPERGS) pelo provimento das 17. Englert M, Vetter W. Tubing modifications for
bolsas de estudo e ao Programa de Pós-Graduação em countercurrent chromatography (CCC): Stationary phase
Ciências Farmacêuticas da UFRGS pela manutenção do retention and separation efficiency. Anal. Chim. Acta.
equipamento de HPCCC. 2015;884:114–123.
18. Ito Y. Countercurrent chromatography. J. Biochem.
Biophys. Methods. 1981;5(2):105–129.
5 Referências 19. Friesen JB, Pauli GF. G.U.E.S.S. - A generally useful
estimate of solvent systems in CCC. J. Liq. Chromatogr.
1. Marston A; Hostettmann K. Developments in the Relat. Technol. 2005;28(17):2777–2806.
application of counter-current chromatography to plant 20. Friesen JB, Pauli GF. Rational development of sol-
analysis. J. Chromatogr. A. 2006;1112(1–2):181–194. vent system families in counter-current chromatography. J.
2. Ito Y. Golden rules and pitfalls in selecting optimum Chromatogr. A. 2007;1151(1–2):51–59.
conditions for high-speed counter-current chromatography. 21. Berthod A, Hassoun M, Ruiz-Angel MJ. Al-
J. Chromatogr. A. 2005;1065(2):145–168. kane effect in the Arizona liquid systems used in
3. Minguillón C. Countercurrent chromatography, scope countercurrent chromatography. Anal. Bioanal. Chem.
and perspectives: Application to chirotechnology. Chem. 2005;383(2):327–340.
Eng. Technol. 2012;35(1):35–45. 22. Skalicka-Woźniak K, Garrard I. A comprehensive
4. Sutherland IA. Recent progress on the industrial scale- classification of solvent systems used for natural product
up of counter-current chromatography. J. Chromatogr. A. purifications in countercurrent and centrifugal partition
2007;1151(1–2):6–13. chromatography. Nat. Prod. Rep. 2015;32(11):1556–61.
5. Huang X, Di D. Chiral separation by counter- 23. Garrard I. Simple Approach to the Develop-
current chromatography. TrAC, Trends Anal. Chem. ment of a CCC Solvent Selection Protocol Suitable
2015;67:128–133. for Automation. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol.
6. Wood P, Ignatova S, Janaway L, Keay D, Hawes D, 2005;28(12–13):1923–1935.
Garraard I et al. Counter-current chromatography separa- 24. Hu R, Pan Y. Recent trends in counter-current chro-
tion scaled up from an analytical column to a production matography. TrAC, Trends Anal. Chem. 2012;40:15–27.
column. J. Chromatogr. A. 2007;1151(1–2):25–30. 25. Freire MG, Pereira JFB, Francisco M, Rodríguez H,
7. Hostettmann K, Marston A, Hostettmann M. Prepara- Rebelo LPN, Rogers RD et al. Insight into the Interactions
tive Chromatography Techniques: Applications in Natural That Control the Phase Behaviour of New Aqueous Bipha-
Product Isolation, 2nd ed., Germany: Springer, 1998. sic Systems Composed of Polyethylene Glycol Polymers
(8) Sumner N. Developing counter current chromato- and Ionic Liquids. Chem. Eur. J. 2012;18(6):1831–1839.
graphy to meet the needs of pharmaceutical discovery. J. 26. Li W, Wu T. Rapid separation of polysaccharides
Chromatogr. A. 2011;1218(36):6107–6113. using a novel spiral coil column by high-speed countercur-
9. Berthod A, Ruiz-Ángel MJ, Carda-Broch S. Coun- rent chromatography. J. Sep. Sci. 2016;39(8):1404–1410.
tercurrent chromatography: People and applications. J. 27. Zhou XY, Zhang J, Xu RP, Ma X, Zhang ZQ.
Chromatogr. A. 2009;1216(19):4206–4217. Aqueous biphasic system based on low-molecular-weight
10. Ito Y. Counter-current motion in counter-current polyethylene glycol for one-step separation of crude
chromatography. J. Chromatogr. A. 2014;1372:128–132. polysaccharides from Pericarpium granati using high-
11. Ito Y, Bowman RL. Countercurrent Chromato- speed countercurrent chromatography. J. Chromatogr. A.
graphy: Liquid-Liquid Partition Chromatography without 2014;1362:129–134.
Solid Support. Science. 1970;167(3916):281–283. 28. Berthod A, Carda-Broch S. Use of the ionic li-
12. Rubio N, Minguillón C. Enantioselecive Recognition quid 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate in
in Solution: The Case of Countercurrent Chromatography. countercurrent chromatography. Anal. Bioanal. Chem.
In: Berthod A, editors. Chiral Recognition in Separa- 2004;380(1):168–177.
tion Methods: Mechanisms and Applications. Heidelberg: 29. Friesen JB, McAlpine JB, Chen SN, Pauli GF. Coun-
Springer; 2010. p. 241-274. tercurrent Separation of Natural Products: An Update. J.
13. Ito Y. Origin and Evolution of the Coil Pla- Nat. Prod. 2015;78(7):1765–1796.
net Centrifuge: A Personal Reflection of My 40 Years 30. Liu Y, Friesen JB, McAlpine JB Pauli GF. Solvent
of CCC Research and Development. Sep. Purif. Rev. System Selection Strategies in Countercurrent Separation.
2005;34(2):131–154. Planta Med. 2015;81(17):1582–1591.
14. Sutherland IA, Fisher D. Role of counter-current 31. Ren D, Han B, Xin Z, Liu W, Ma S, Liang
chromatography in the modernisation of Chinese herbal Y et al. Computation-aided separation of seven compo-
medicines. J. Chromatogr. A. 2009;1216(4):740–753. nents from Spirodela polyrrhiza (L.) via counter-current
15. Guzlek H, Wood PL, Janaway L. Performance chromatography. Sep. Purif. Technol. 2016;165:160–165.
comparison using the GUESS mixture to evaluate counter- 32. Ren DB, Yi LZ, Qin YH, Yun YH, Deng BC, Lu HM
current chromatography instruments. J. Chromatogr. A. et al. Systematic and practical solvent system selection stra-
2009;1216(19):4181–4186. tegy based on the nonrandom two-liquid segment activity
16. Zhang M, Ignatova S, Hu P, Liang Q, Wang Y, Suther- coefficient model for real-life counter-current chromato-
land I et al. Cost-efficient and process-efficient separation graphy separation. J. Chromatogr. A. 2015;1393(47–56).
10 BÜTTENBENDER et al., 2018

33. Ignatova S, Sumner N, Colclough N, Suther- nuclear magnetic resonance spectroscopy. J. Chromatogr.
land I. Gradient elution in counter-current chromato- A. 2015;1398:83–93.
graphy: A new layout for an old path. J. Chromatogr. A. 48. Costa FN, Leitão GG. Strategies of solvent system
2011;1218(36):6053–6060. selection for the isolation of flavonoids by countercurrent
34. Huang XY, Svetlana I, Hewitson P, Di DL. An chromatography. J. Sep. Sci. 2010;33(3):336–347.
overview of recent progress in elution mode of coun- 49. Fang L, Liu Y, Yang B, Wang X, Huang L. Separation
ter current chromatography. TrAC, Trends Anal. Chem. of alkaloids from herbs using high-speed counter-current
2016;77(214–225). chromatography. J. Sep. Sci. 2011;34(19):2545–2558.
35. Yang Z, Liu X, Wang K, Cao X, Wu S. Novel li- 50. Zhao H, Hu X, Chen X, Shi S, Jiang X, Liang
near and step-gradient counter-current chromatography for X et al. Analysis and improved characterization of mi-
bio-guided isolation and purification of cytotoxic podophyl- nor antioxidants from leaves of Malus doumeri using a
lotoxins from Dysosma versipellis (Hance). J. Sep. Sci. combination of major constituents’ knockout with high-
2013;36(6):1022–1028. performance liquid chromatography-diode array detector-
36. Leitão G, Costa F. Gradient Elution in Countercur- quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. J.
rent Chromatography. Planta Med. 2015;81(17):1592–1596. Chromatogr. A. 2015;1398:57–65.
37. Ko J, Choi J, Bae SK, Kim J, Yoon KD. Separation 51. Alvarenga RFR, Friesen JB, Nikolić D, Simmler C,
of five oligostilbenes from Vitis amurensis by flow-rate gra- Napolitano JG, Breemen R et al. K-Targeted Metabolomic
dient high-performance counter-current chromatography. J. Analysis Extends Chemical Subtraction to DESIGNER Ex-
Sep. Sci. 2013;36(24):3860–3865, 2013. tracts: Selective Depletion of Extracts of Hops (Humulus
38. Duanmu Q, Li A, Sun A, Liu R, Li X. Semi- lupulus). J. Nat. Prod. 2014;77(12):2595–2604.
preparative high-speed counter-current chromatography se- 52. Han C, Xu J, Wang X, Xu X, Luo J, Kong L.
paration of alkaloids from embryo of the seed of Ne- Enantioseparation of racemic trans--viniferin using high
lumbo nucifera Gaertn by pH-gradient elution. J. Sep. Sci. speed counter-current chromatography based on indu-
2010;33(12):1746–1751. ced circular dichroism technology. J. Chromatogr. A.
39. Song H, Lin J, Zhu X, Chen Q. Developments in high- 2014;1324:164–170.
speed countercurrent chromatography and its applications 53. Tong S, Wang X, Lu M, Xiong Q, Wang Q, Yan J.
in the separation of terpenoids and saponins. J. Sep. Sci. Enantioseparation of 2-(substituted phenyl)propanoic acids
2016;39(8):1574–1591. by high-speed countercurrent chromatography and investi-
40. Ito Y. pH-zone-refining counter-current chromato- gation of the influence of substituents in enantiorecognition.
graphy: Origin, mechanism, procedure and applications J. J. Sep. Sci. 2016;39(8):1567–1573.
Chromatogr. A. 2013;1271(1):71–85. 54. Zhang P, Xie X, Tang K, Xu W. Chiral
41. Englert M, Vetter W. Overcoming the equivalent- separation of brompheniramine enantiomers by recy-
chain-length rule with pH-zone-refining countercurrent ch- cling high-speed countercurrent chromatography using
romatography for the preparative separation of fatty acids. carboxymethyl--cyclodextrin as a chiral selector. J. Sep.
Anal. Bioanal. Chem. 2015;407(18):5503–5511. Sci. 2016;39(12):2300–2306.
42. Wu D, Cao X, Wu S. Overlapping elution-extrusion 55. Tong S, Zhang H, Cheng D. Preparative Enantiose-
counter-current chromatography: A novel method for ef- paration of -Substituted-2-Phenylpropionic Acids by Coun-
ficient purification of natural cytotoxic andrographoli- tercurrent Chromatography With Substituted -Cyclodextrin
des from Andrographis paniculata. J. Chromatogr. A. as Chiral Selectors. Chirality. 2015;27(11):795–801.
2012;1223(53–63). 56. Han C, Luo J, Xu J, Zhang Y, Zhao Y, Xu X
43. Paek JH, Lim SS. Preparative isolation of aldose re- et al. Enantioseparation of aromatic -hydroxycarboxylic
ductase inhibitory compounds from Nardostachys chinen- acids: The application of a dinuclear Cu2(II)--cyclodextrin
sis by elution–extrusion counter-current chromatography. complex as a chiral selector in high speed counter-current
Arch. Pharm. Res. 2014;37(10):1271–1279. chromatography compared with native -cyclodextrin. J.
44. Kostanyan AE. Simple equations to simulate Chromatogr. A. 2015;1375:82–91.
closed-loop recycling liquid-liquid chromatography: Ideal 57. Sun G, Tang K, Zhang P, Yang W, Sui G. Separation
and non-ideal recycling models. J. Chromatogr. A. of phenylsuccinic acid enantiomers using biphasic chiral
2015;1423:71–78. recognition high-speed countercurrent chromatography. J.
45. Liu Q, Zeng H, Jiang S, Zhang L, Yang F, Chen X Sep. Sci. 2014;37(14):1736–1741.
et al. Separation of polyphenols from leaves of Malus hu- 58. Zhang P, Sun G, Tang K, Yang W, Sui G,
pehensis (Pamp.) Rehder by off-line two-dimensional High Zhou C. Enantiomeric separation of oxybutynin by recy-
Speed Counter-Current Chromatography combined with cling high-speed counter-current chromatography with
recycling elution mode. Food Chem. 2015;186:139–145. hydroxypropyl--cyclodextrin as chiral selector. J. Sep. Sci.
46. Michel T, Destandau E, Elfakir C. New advances 2014;37:3443–3450.
in countercurrent chromatography and centrifugal parti- 59. Tong S, Shen M, Cheng D, Zhang Y, Ito Y, Yan
tion chromatography: Focus on coupling strategy. Anal. J. Chiral ligand exchange high-speed countercurrent ch-
Bioanal. Chem. 2014;406(4):957–969. romatography: Mechanism and application in enantiose-
47. Hammann S, Conrad J, Vetter W. Fractiona- paration of aromatic -hydroxyl acids. J. Chromatogr. A.
tion of technical octabromodiphenyl ether by counter- 2014;1360:110–118.
current chromatography combined with gas chromato-
graphy/mass spectrometry and offline and online (1)H
Cromatografia contracorrente: princípios e aplicações 11

60. Tong S, Ito Y, Ma Y. Enantioseparation of DL- 64. Hammann S, Tillmann U, Schröder M, Vetter W. Pro-
tryptophan by spiral tube assembly counter-current ch- filing the fatty acids from a strain of the microalgae Alexan-
romatography and evaluation of mass transfer rate for drium tamarense by means of high-speed counter-current
enantiomers. J. Chromatogr. A. 2014;1374:77–84. chromatography and gas chromatography coupled with
61. Tong S, Shen M, Zheng Y, Chu C, Li XN, Yan J. mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 2013;1312:93–103.
Preparative enantioseparation of propafenone by counter- 65. Lu R, Liu X, Gao S, Zhang W, Peng F, Hu F et
current chromatography using di-n-butyl L-tartrate com- al. New tyrosinase inhibitors from paecilomyces gunnii. J.
bined with boric acid as the chiral selector. J. Sep. Sci. Agric. Food Chem. 2014;62(49):11917–11923.
2013;36:3101–3106. 66. He S, Wang H, Yan X, Zhu P, Chen J, Yang R. Prepa-
62. Tong S, Zheng Y, Yan J. Application and com- rative isolation and purification of macrolactin antibiotics
parison of high performance liquid chromatography and from marine bacterium Bacillus amyloliquefaciens using
high speed counter-current chromatography in enantiose- high-speed counter-current chromatography in stepwise
paration of ()-2-phenylpropionic acid. J. Chromatogr. A. elution mode. J. Chromatogr. A. 2013;1272:15–19.
2013;1281:79–86.
63. Tong S, Zheng Y, Yan J. Enantioseparation of chiral
aromatic acids by multiple dual mode counter-current ch-
romatography using hydroxypropyl--cyclodextrin as chiral
selector. J. Sep. Sci. 2013;36(12):2035–2042.