Universidade Federal do Oeste do Pará

Instituto de Ciências e Tecnologias das Águas

Bioprocessos industriais e
Biorreatores

Prof. Dr. Túlio Silva Lara

2017
Conceituando...

Bioprocesso – aplicação industrial de reações ou vias biológicas mediadas por células

vivas inteiras de animais e plantas, microrganismos e enzimas sob condições
controladas para a biotransformação de matérias primas em produtos ou
bioprocessos.

Produto  alimentos, medicamentos e compostos industriais.

Biooprocessos Não resultar em um produto direto (biorremediação,

desintoxicação de resíduos ou efluentes com ou sem subproduto ou derivados).
 Introdução

• A produção de vinhos e cervejas foram os primeiros processos fermentativos

desenvolvido em escala industrial.

• Ao longo do século XX, houve o desenvolvimento de bioprocessos baseados no

metabolismo microbiano; produção de diversas substâncias (acetona, butanol,
etanol, ácido cítrico, antibióticos, etc.).

• Atualmente, as fermentações encontram novas aplicações no tratamento

ambiental e produção de alimentos, produtos químicos e medicamentos.
 Pasteur: fermentação como o fenômeno que descreve a existência de vida na ausência
de oxigênio. Assim, e por razões históricas, o termo fermentação define os processos
biológicos desenvolvidos por microrganismos.

O termo fermentador se usa como sinônimo de biorreator, designando o recipiente onde ocorre
o processo.
O Bioprocesso pode ser dividido em três fases:

As operações que antecede a transformação

Processos de transformação

As operações finais para recuperar do produto

Esquema Bioprocessos
Esquema Bioprocessos em laboratório
 O sucesso de um dado processo fermentativo depende de
quatro pontos básicos:

- microrganismo

- meio de cultura

- forma de condução do processo fermentativo

- etapas de recuperação do produto

Destilador

Condução do processo
 Microrganismos para utilização industrial

A indústria dos bioprocessos emprega principalmente espécies:

-bactérias,

-algas,

algas bactérias
-fungos filamentosos e leveduras

-células mais complexas

leveduras

fungos filamentosos
Estrutura da DNA polimerase
Organismos utilizados na indústria
Microrganismos utilizados na indústria
 Microrganismos que possam ter interesse industrial, podem ser
obtidos basicamente das seguintes formas:

 Isolamento a partir de recursos naturais;

 Comprar em coleções de culturas;

 Obtenção de mutantes naturais;

 Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais;

 Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia

genética.
Fontes de microrganismos de interesse industrial: Isolamento a partir
de recursos naturais (solo, água, vegetais, etc)

 Grande importância para a obtenção de linhagens.

 Envolve muito trabalho experimental e custo

elevado.

 Pode resultar no isolamento de linhagens melhor

produtoras ou à descoberta de novos produtos.

- Deve-se definir o que se pretende obter, pois o simples isolamento pode levar à um
número inimaginável de culturas, dificultando a convergência para o processo ou
produto.
 Compra em coleções de culturas:

- É bastante viável;
- Existência de muitas coleções de culturas em vários países
Quem compra??
Silagem de milho: Bactérias produtoras de ácido lático.
Fermento para o pão: levedura Saccharomyces cerevisiae
Produção de Cerveja: Leveduras das espécies Saccharomyces
cerevisiae ou Saccharomyces carlsbergensis

Agricultura! Research Service Culture Collection (EUA) Coleção de Culturas Tropical - Campinas
 Microrganismos para utilização industrial

Obtenção de mutantes naturais.

- Normalmente, na proliferação celular.

- Podem ser isolados e ensaiados.

- O meio não modifica o mapa genético da célula (causa mutação), mas

afeta significativamente a expressão dos genes (Ps. Fonte de energia em bactérias).

Em geral, alterações naturais não são interessantes no processo

fermentativo, mas, eventualmente, podem gerar novas linhagens que
apresentem interesse prático.
Obtenção de mutantes naturais.
 Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais:

 Suspensões de células ou esporos submetidas a radiações ultravioleta ou

substâncias químicas mutagênicas (ex: nitrosoguanidina).

 A obtenção de mutantes é aleatória;

 Recuperam-se as células sobreviventes em meios ou condições específicas, de

forma a dirigir este isolamento para as células que se pretende.

 Tais programas de mutação/seleção costumam ser bastante dispendiosos, mas

levaram a várias condições de sucesso descritas na literatura.
Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais:

Luz UV e
nitrosoguanidina
Exemplo de mutantes ......

Caso relatado foi a significativa melhora de linhagens de Penicillium chrysogenum para

a produção de penicilina.

 Na década de 40 obtinha-se teor de penicilina no caldo fermentado da ordem de

100 unidades/cm3.

 Por volta de 1976, teores da ordem de 51.000 unidades/cm3.

cm3 = ml ?

Nova linhagem selecionada  trabalho de adaptação do meio de cultivo, da forma de

conduzir o processo fermentativo e as alterações nas etapas de recuperação do produto.
 Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas
de eng. genética

- A técnica do DNA recombinante trouxe imenso avanço na obtenção de células mais

produtivas, ou células produtoras de substâncias que normalmente não produzem.

- A introdução de fragmentos de DNA de

células em outras, via vetores, permite a
obtenção de células alteradas
geneticamente de forma dirigida.

- Possível de ser executada em microrganismos e células animais e vegetais.

 Ex. de aplicação da eng. genética:

A B C D P
a b c d

sequência metabólica que leva ao acúmulo de um dado produto (P)

Após determinação da reação limitante (ex: C→D) e da enzima responsável pela reação (c):

1) Identifica-se o gene que codifica para a síntese da enzima.

2) Introduz o gene na célula produtora.

↑ número de cópias do gene responsável pela síntese da enzima c ↑[enzima

c] ↑ velocidade da reação limitante.

Essa estratégia foi empregada no incremento da produção de cefalosporina por

Cephalosporiuni acremonium
 Pela técnica do DNA recombinante, genes de certas células são transferidos, via
vetores, a outras células, tornando-as produtoras de substâncias que naturalmente
não são por elas produzidas.
 Exemplos:

• Introdução do gene de síntese da glicoamilase de Aspergillus em células de

Saccharomyces cerevisiae, o que passa a permitir a fermentação alcoólica de
substratos amiláceos.

• Como receptores da codificação genética empregam-se bactérias

(Escherichia coli, Bacillus subtilis), leveduras (Saccharomyces cerevisiae), fungos
filamentosos (Aspergillus niger) e células animais (para a produção de proteínas
complexas e de maior valor agregado).
Características desejadas de microrganismos para
indústria
 Características desejadas de microrganismos para
indústria

1- Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto.

Exemplo: fermentação alcoólica de plantas,

O fator estequiométrico é igual a 0,511, ou seja, cada grama de glicose convertida gera
0,511g de etanol.

Sendo que o Saccharomyces cerevisiae, frequentemente permite obter um rendimento

da ordem de 90% deste valor estequiométrico.
 Se consegue manter um processo de fermentação alcoólica obtendo-se
100% de rendimento???

 As células têm de proliferar, o que significa a síntese de muitos outros

compostos intermediários.

 Geração de energia na forma de ATP (glicólise).

 Características desejadas de microrganismos para indústria

2- Permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se ter

elevada concentração do produto no caldo fermentado;

Ex: Na reação da fermentação alcoólica mediada por Saccharomyces cerevisiae,

quando se atinge 8-10% (em volume) em etanol no meio fermentado, ocorre clara
inibição da levedura  ↓ velocidade da conversão do açúcar em etanol.

Isso significa a necessidade de destilar um líquido que

contém apenas 10% de etanol e ainda irá gerar 90% de
resíduo.

Líquido com 90% de etanol

 Características desejadas de microrganismos para indústria

3- Não produzir substâncias incompatíveis com o produto;

Um microrganismo deve produzir o mínimo de outras substâncias, ao mesmo
tempo em que sintetiza o composto pretendido:

Resulta em:

- maior síntese do produto.

- facilidade na recuperação deste.

 Características desejadas de microrganismos para indústria

4-Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico.

Não basta que se tenha uma linhagem hiperprodutora, mas que ela se mantenha
como excelente produtora da substância de interesse ao longo de todas as etapas
envolvidas, desde sua conservação e proliferação em nível de laboratório,
germinadores e biorreator principal.
 Características desejadas de microrganismos para indústria

5- Não ser patogênico

Produção de vacinas
 Características desejadas de microrganismos para indústria

6- Não exigir condições de processo muito complexas:

- Ex: Microrganismos que tenham faixas ótimas de pH e temperatura ao invés
de valores pontuais para acúmulo do produto.

7- Não exigir meios de cultura dispendiosos;

↑ conhecimento das necessidades nutricionais de uma linhagem →
fornecimento dos nutrientes apenas necessários → ↓ custo
8- Permitir a rápida liberação do produto para o meio.

- A primeira etapa de recuperação do produto significa a separação do

microrganismo (por centrifugação ou filtração), trabalhando, a seguir, com o
líquido isento de células e estas descartadas. Assim, se algum produto ainda
permanece associado às células, será perdido.
 O sucesso de um dado processo fermentativo depende de
quatro pontos básicos:

- microrganismo

- meio de cultura

- forma de condução do processo fermentativo

- etapas de recuperação do produto

Destilador

Condução do processo
 Composição do meio de cultura

Deve conter nutrientes nas concentrações adequadas em função do

microrganismo e do objetivo do processo.

Em geral, meios de cultura utilizados no laboratório incluem:

- Água
- Uma fonte de energia e carbono: glicose, amido etc.
- Uma fonte de nitrogênio: inorgânica (sulfato de amônia, nitrato de
potássio, etc), orgânica (asparagina, glutamina, etc) ou complexa (farinha de
soja, etc)
- Nutrientes: Fe, Zn, Mn, Cu, Co, S, Se, Mo, Mg .....

Condições ótimas para o crescimento celular, necessariamente, as mesmas

para o processo produtivo.
 Características da Composição do meio de cultura

 A atividade e a estabilidade enzimáticas (Biomoléculas) são fortemente

dependentes da força iônica do meio, temperatura, pH e da relação entre
a concentração de substrato e de enzima.

 Estudos devem ser conduzidos previamente a fim de se eleger as

condições ótimas para a catálise enzimática.

 Disponibilidade de Oxigênio.
Composição do meio de cultura

• Para exploração comercial, os meios são substituídos na indústria

por matérias-primas de baixo.

• Em alguns casos, a matéria-prima passa por um tratamento prévio com

métodos físicos e/ou químicos.

• No caso de se tratar de um processo enzimático, o meio deverá

levar, além do substrato adequado, os elementos necessários para
que a enzima possa desenvolver sua atividade catalítica
(precursores, cofatores etc.).
 Meios de cultivos para microrganismos.

• Bagaço de mandioca;

• Bagaço e melaço de cana;

• Extrato de malte;

• Melaço e vinhaça de soja;

• Casca e polpa de café;

• Resíduos de frutas...
 Características desejadas de meios de cultura

 ser o mais barato possível;

 atender às necessidades nutricionais do microrganismo;

 auxiliar no controle do processo, como é o caso de ser ligeiramente tamponado, o

que evita variações drásticas de pH, ou evitar uma excessiva formação de espuma;

 não provocar problemas na recuperação do produto;

 os componentes devem permitir algum tempo de armazenagem, a fim de estarem

disponíveis todo o tempo;

 ter composição razoavelmente fixa;

 não causar dificuldades no tratamento final do efluente.

 O sucesso de um dado processo fermentativo depende de
quatro pontos básicos:

- microrganismo

- meio de cultura

- forma de condução do processo fermentativo

- etapas de recuperação do produto

Destilador

Condução do processo
 Forma de condução do processo fermentativo

Os microrganismos selvagens produzem o(s) bioproduto(s) em quantidades absolutamente

necessárias ao seu crescimento.

No caso de enzimas podem distinguir-se as enzimas catabólicas e anabólicas que estão, em

geral, sujeitas a regulação metabólica.
 Forma de condução do processo fermentativo

A nível industrial, o que se procura é

condicionar o microrganismo, de modo
para aumentar a produtividade do
bioproduto, pela formulação adequada do
meio, condições de fermentação e
manipulação genética.

Deste modo, a ultrapassar o controle metabólico da biossíntese desse bioproduto, por

exemplo uma enzima ou um grupo de enzimas.
Basicamente pode-se distinguir quatro tipos de fermentação ou cultura,
todos usados na biossíntese de bioprodutos:

Descontínua  os microrganismo são inoculados e multiplicam-se, até que se esgote

uma ou mais das fontes nutricionais essenciais ao seu crescimento.

Descontínua com alimentação  processa-se como a cultura descontínua e em

seguida, alimenta-se o fermentador com nutrientes, sem retirar meio de cultura.

Contínua  o meio de cultura é constantemente renovado e retirado o produto,

mantendo as concentrações de biomassa e dos nutrientes.

Semicontínua O biorreator é carregado com a matéria-prima e inóculo e, após o

término da fermentação, retira-se parte do meio fermentado e adiciona-se meio de
cultivo neste mesmo volume que foi retirado.
 A curva de crescimento, em cultura descontínua, é caracterizada genericamente por
quatro fases principais distintas.

lag

Inoculação
do meio

O crescimento celular, numa cultura descontínua, é acompanhado pela variação da

concentração de alguns nutrientes no fermentador devido ao seu consumo, para a formação
de micro e macromoléculas (ex: DNA, proteína, mRNA, outras) resultantes da atividade
metabólica celular.
 O sucesso de um dado processo fermentativo depende de
quatro pontos básicos:

- microrganismo

- meio de cultura

- forma de condução do processo fermentativo

- etapas de recuperação do produto

Destilador

Condução do processo
 Purificação do produto biotecnológico

• A recuperação do produto representa uma fração considerável do

custo de um processo fermentativo.

• Quando secretado fora da célula será necessário separá-lo de um

volume grande de água por decantação ou filtração. Quando
permanece dentro das células, estas terão que ser desintegradas para sua
extração.

• O produto é concentrado por precipitação, filtração, centrifugação,

extração por solventes, destilação, evaporação do solvente e secagem.

• Se a purificação for necessária, envolverá outros procedimentos,

como cristalização e métodos cromatográficos.
 Etapas de recuperação do produto (downstream)

• As operações de recuperação do produto são, na maioria das vezes,

responsáveis por grande parte dos custos do processo.

• Para a produção de produtos de elevado valor agregado como

antibióticos, enzimas, insulina, hormônios decrescimento, vitaminas as
operações de downstream podem corresponder a 50 ou 70 % do custo do
produto final.
Etapas de recuperação do produto
 Separação entre produto e microrganismo

Centrifugação;

Ruptura celular;

Filtração ou purificação;
Centrifugação:

• Usadas quando a velocidade de sedimentação é baixa;

• Serve para acelerar o processo de sedimentação;
• Usados em materiais mais sensíveis.
 Ruptura celular

Mecânico: Alta Pressão.

Físico: Choque osmótico, Congelamento e descongelamento, Aquecimento, Secagem.
Químico: solventes, detergentes e ácidos.
Enzimático: Celulases

Ruptura celular por ozônio

Filtração:

Utiliza-se um meio permeável capaz de separar o que é

desejado.

Gravidade;
Força Centrífuga;
Pressão (vácuo)
Tamanho.
 Purificação do produto biotecnológico

• Um problema a considerar é o despejo dos resíduos de fermentações, que podem

contaminar o meio ambiente como, por exemplo, o vinhoto resultante da
produção de etanol ou o soro das indústrias de laticínios.

• Existem formas de tratamento, como o crescimento de biomassa microbiana sobre

resíduos industriais, que elimina o problema e ainda permitem a obtenção de mais
um produto.
Biorreatores
Conceituando......

Denominam-se "biorreatores", "reatores bioquímicas", ou ainda "reatores

biológicos", os reatores químicos nos quais ocorrem uma série de reações
químicas catalisadas por "biocatalisadores".

Esse biocatalisadores podem ser enzimas ou células vivas (microbianas,

animais ou vegetais). Assim, logo de início, pode-se classificar os biorreatores
em dois grandes grupos:

• Grupo 1: Biorreatores nos quais as reações ocorrem na ausência de células

vivas, ou seja, são tipicamente os "reatores enzimáticos";

• Grupo 2: Biorreatores nos quais as reações se processam na presença de

células vivas".
Biorreatores
• São os reatores onde ocorrem uma série de reações químicas
catalisadas por biocatalisadores (enzimas ou células vivas)

• Biorreatores de microrganismos ≠ células vegetais e animais 

possuem diferentes particularidades

Bioreatores com membranas, nos quais

não se tem agitação mecânica.
Conceituando......

• A maioria dos processos industriais se desenvolve em cubas de vidro ou aço com

capacidade variada. Os agentes biológicos se encontram submersos no meio de
cultivo que ocupa.

• O desenho do biorreator deve se adequar ao objetivo do processo, possibilitando

a esterilização do sistema, aeração e homogeneização do meio, acréscimo de
nutrientes e de aditivos antiespuma, manutenção do pH, etc.
Conceituando......

• Os modelos de fermentadores mais utilizados com microrganismos contam com

agitação mecânica (90% do total de reatores utilizados industrialmente).

• O que facilita a distribuição dos nutrientes na cuba, mas gera calor que deve ser
eliminado mediante a circulação de água fria.

• Assepsia, quando necessária, é realizada.

Os sistemas submersos são
apropriados para o cultivo
de microrganismos livres,
mas resultam pouco
econômicos quando se
trabalha com células ou
enzimas caras.
A imobilização em
fermentadores menores,

Simplifica a purificação
do produto e permite a
reutilização das células
ou das enzimas, que
permanecem dentro do
biorreator.
Capacidade dos biorreatores.
Características básicas de biorreatores

1. Sistema de agitação;
2. Sistema de distribuição de O2;
3. Sistema de controle de espuma;
4. Sistema de controle de temperatura;
5. Sistema de controle de pH;
6. Portas de amostragem;
7. Sistema de limpeza e esterilização;
8. Linhas para esvaziar o biorreator.
 7. Sistema de limpeza e esterilização

• Sistema não asséptico – onde não é absolutamente necessário se

operar com culturas inteiramente puras (sistemas de descarte de
efluentes);

• Sistema asséptico – onde as condições de assepsia são pré-

requisitos para a formação do produto com sucesso;
 2.Sistema de distribuição de O2;
4. Sistema de controle de temperatura;
5. Sistema de controle de pH;
 Oxigênio

Processos aeróbios têm destaque na Biotecnologia Industrial, pois

estão envolvidos no cultivo de microrganismo para produção de
antibióticos, enzimas, vitaminas, fermentos e inoculantes, proteínas
recombinantes (hormônios, insulina), etc.

Processos fermentativos envolvendo cultivo de células aeróbias ou

aeróbias facultativas visando formação de produtos ou tratamento
biológico de águas residuais têm em comum o aspecto de exigirem
um adequado dimensionamento do sistema de transferência de
oxigênio (fase gasosa fase líquida).
 Oxigênio

Nada adianta alimentar o biorreator se não houver um ótimo

sistema de transferência de oxigênio:

Transferência entre fases gasosa e aquosa;

- Oxigênio dissolvido deve chegar às células;

- Oxigênio deve penetrar nas células;
- Oxigênio deve ser consumido na reação.
 Temperatura

• A reação que ocorre no biorreator pode ser exotérmica ou endotérmica, por isso,
os equipamentos deve ser equipados com um sistema de transferência de
temperatura.

• Sistema de circulação de vapor e água quente podem aquecer o sistema e também

pode ser útil para esterilização do biorreator antes do início do processo da
fermentação.
 pH

• No biorreator deve haver um sistema de determinação de pH assim como uma

entrada para balancear a reação com ácido/base que não ofereça nenhum risco de
contaminação para o sistema.

• Temperatura e pH também ficam mais homogêneos com a agitação.

 Sistema de Controle de espuma

• Formação excessiva de espuma pode:

1. Bloquear os filtros de saída de ar;

2. Aumentar a pressão do biorreator

• O controle é feito com a adição de agentes antiespumantes baseados em silicone

ou óleos vegetais que desestabilizam a espuma pela redução da tensão superficial.

 Sistema de agitação
Agitação adequada é essencial pois proporciona os seguintes efeitos nas três fases:

1- Dispersão do O2 no meio de cultivo.

2- Homogeneização para igualar a temperatura, pH e concentração de nutrientes.

3- Suspensão dos microrganismos e dos nutrientes sólidos.

4- Dispersão de líquidos imiscíveis.

 Sistema de agitação

Quando a velocidade de agitação é pequena, as bolhas não serão quebradas tendendo a

subir direto para a superfície. Além disso, irão se acumular no eixo do agitador,
coalescendo e diminuindo a transferência de oxigênio.

Quando a velocidade de agitação é grande, as bolhas pequenas irão circular por todo o
reator e terão o seu tempo de residência aumentado.
 Sistema de agitação

Quanto maior a agitação, melhor será o crescimento?

CUIDADO!!

Agitação excessiva pode romper as células e aumentar a temperatura

o que ocasiona uma redução na viabilidade celular!!

Deve-se buscar o equilíbrio entre a necessidade de mistura do meio

evitando-se o dano celular
 A CONDUÇÃO DOS BIOPROCESSOS ou Tipos de fermentação

Contínua ou descontínua (batelada), sendo que ambas as formas

apresentam vantagens e inconvenientes.

 SISTEMA DESCONTÍNUO

• O fermentador é carregado com a matéria-prima e o inoculo correspondentes, a

fermentação prossegue até o esgotamento dos nutrientes.

• Concluído o processo e extraído o produto, o fermentador é esvaziado, limpo e

esterilizado antes de receber outra carga.

Características:
 Tempo improdutivo entre as bateladas.
 Sistema é relativamente flexível.
 Risco de contaminação relativamente baixo.
 SISTEMA DESCONTÍNUO

Todos os nutrientes são adicionados antes

do início do processo.

O2, antiespumante, ácido e base

 Bastante utilizada na
indústria farmacêutica - ↓
risco de contaminação e
identificação de todos
materiais utilizados (lote).
 Processo descontínuo alimentado

• Um ou mais nutrientes são adicionados ao biorreator durante a fermentação; os

produtos só são retirados ao final do processo.

 A alimentação pode ser constante ou intermitente;

 Neste processo é possível controlar [substrato] no biorreator, contudo, aumentam

as possibilidade de contaminação.

 Uso: produção de acetona, glicerol, butanol, etc.

 Semicontínua
• Após colocado o meio de fermentação e o inóculo no reator, seguem-se as
seguintes operações nessa ordem:

Operação 1 - Aguarda-se o término da fermentação.

Operação 2 - Retira-se parte do meio fermentado.

Operação 3 - Adiciona-se ao reator um volume de meio de fermentação igual ao

volume de meio fermentado retirado na Operação 2.

O processo é repetido enquanto não houver

queda da produtividade.

- Uso: produção de vinagre

 Contínuo
• Adição de meio de cultura e remoção de caldo fermentado em vazões
constantes, mantém constante o volume de fermentação.

• Se dá pela manutenção de um estado estacionário, em que as variáveis de

estado (concentrações de células, de substrato limitante e de produtos)
são mantidas constantes ao longo do tempo.

• Caracterizado pelos longos períodos de funcionamento em estado

estacionário.

• Inicia-se com um processo descontínuo até dada fase, em que começa a

adição de substrato e remoção de caldo fermentado, levando ao
equilíbrio.
 Contínuo

 Manutenção do volume no biorreator:

 Sistemas de retirada de líquido por transbordamento

 Bombas de alta vazão acionadas periodicamente

 Em laboratórios mais avançados, esses sistemas são empregados com o

reator sobre uma balança, que coordena seu uso para manutenção da
massa.
Pontos positivos: Contínuo
1) Aumento da produtividade: ↓ “tempo morto”;
2) Meio fermentado uniforme;
3) Associação com outras operações contínuas;
4) Menor necessidade de mão de obra;

Pontos negativos: Contínuo

1) Maior investimento inicial;
2) Ocorrência de mutação nos microrganismos;
3) Contaminações;
4) Dificuldades de homogeneização;
5) Formação de espuma;
6) Crescimento de microrganismos nas paredes do biorreator.
Obrigado!!