BIOQUÍMICA I – 2021/22

8ª AULA PRÁTICA

Fracionamento celular e Respiração mitocondrial

A partir de 1945 foi optimizada a separação dos vários componentes da célula (núcleos,
mitocôndrias, lisossomas, membranas, etc.) em função das propriedades de densidade, e os trabalhos
de Claude foram pioneiros no processo de isolamento dos organelos celulares. O processo de
separação inclui 2 etapas principais:

A. Homogeneização de tecidos
Consiste em "esmagar" e romper as células de modo a que se libertem os seus conteúdos. Para
este efeito utilizam-se homogeneizadores. Há vários tipos de homogeneizadores:
 De lâminas ou "Waring blender" - para tecidos duros;
 Tipo "Potter-Elvehjem" - para tecidos mais moles;
 Polytron-Ultrassons - para células com parede dura e também organitos celulares.

B. Fraccionamento celular - Centrifugação

A homogeneização dos tecidos produz uma suspensão, que contém, para além de algumas
células intactas, os organitos celulares, tais como, núcleos, mitocôndrias, lisossomas, etc. Estes
organitos, fragmentos celulares e partículas intracelulares, possuem tamanhos, formas e composição
diferentes. A diferente composição determina que tenham densidades diferentes. Assim, quando
submetemos o homogeneizado à acção de forças centrífugas de intensidade crescente, vamos
removendo primeiro os componentes celulares mais pesados e subsequentemente os mais leves. A
esta técnica chamamos Centrifugação Diferencial.
Porém, esta técnica não nos permite separar partículas ou organitos cujas densidades sejam
semelhantes (exemplo: lisossomas e mitocôndrias). Neste caso usa-se outra técnica de centrifugação
a Centrifugação em Gradiente de Densidade (contínuo ou descontínuo).

Aparelhos - Centrífugas e Rotores

* Centrífugas
Tipo de Centrífuga r.p.m. Refrigeração Vácuo Travão xg

De mesa 4-6.000 - - ± 1.000-14.000

Preparativas 20.000 + ± + 1.000-50.000
Ultracentrífugas 60.000 + + + 50.000 - 300.000
* Rotores ou cabeças: Horizontais ou Angulares

0
Força centrífuga durante a centrifugação

Se considerarmos uma partícula que se move num círculo de raio r a uma velocidade angular
2
W, ela está sujeita a um campo centrífugo igual a W x r. A força centrífuga (Fc) nesta partícula, é
2 2
igual a m x W x r, sendo m a massa e W x r o campo de centrifugação. Logo,
2 2
Fc = m x W x r e W x r = j (Fc = m x j)
Uma partícula move-se neste campo a uma velocidade constante v, quando Fc é igual a v
x f , sendo v a viscosidade e f o coeficiente de fricção da partícula. Assim, a velocidade de
migração ou de sedimentação da partícula é: v = Fc / f = m W2 r / f
O coeficiente de sedimentação é normalmente expresso em unidades de Svedberg.
Aceleração j = W2 x r, onde, W = velocidade angular em rad/ s r = raio de rotação
N = nº rotações/ minuto (r.p.m.) e W = (N / 60 seg) x 2 
2 2 2 2
de onde, j = (N 2  / 60 seg) x r = (0,010966 x N x r) / seg cm/ seg
Como a aceleração envolvida no processo é a chamada aceleração de gravidade, g, para
exprimirmos a expressão anterior em g, temos que a dividir pelo valor da aceleração de
gravidade ou seja (g = 980 cm/ seg2).
j (em g) = (0,010966 x N2 x r (cm) x seg2) / 980 (cm) x seg2 = 0,0000118 N2 x r x g
g = Força gravitacional que actua na massa de 1 g à distância r do eixo de rotação.
F = S2 r / 89500 x g, onde, F = Força centrífuga relativa (g); r = raio de rotação; S = velocidade de rotação em rpm.

Deve-se ter em conta que uma partícula de uma dada densidade sedimenta num meio de
densidade inferior à sua, mas não sedimenta se a densidade do meio em que está suspensa for
igual ou superior à densidade da partícula, qualquer que seja a força centrífuga aplicada.
2 2 2
Deduz-se da seguinte equação: t = 4050  /  S r (dp-dm) x ln (x / x 0)
t = tempo necessário para uma partícula de densidade dp sedimentar da posição x0 para a
posição x, num meio de densidade dm e viscosidade  (em poises).

Isolamento da fracção microssomal e mitocondrial do fígado de rato.

1. Preparação do homogeneizado:
- Após matar o rato por decapitação, extrair o fígado e retirar o hilo e o tecido fibroso adjacente.
- Pesar o fígado e cortá-lo em pedaços grandes. Lavar os pedaços com sacarose 0,25 M (0 - 4 °C)
duas a três vezes e cortá-los em pedaços ainda mais pequenos.
- Colocar os pedaços de fígado na mesma solução de sacarose, na proporção de 10 a 15 ml/ g de
fígado.
- Homogeneizar num tubo do homogeneizador (tipo Potter) durante cerca de 10 vezes a 500
rotações/ minuto (rpm).
- Juntar os homogeneizados parciais num copo de vidro e redistribui-los pelos tubos de centrífuga.

2. Centrifugação diferencial (de acordo com a Fig.1):

- Dividir igualmente o material biológico pelos tubos da centrífuga Sorvall RC-5B e equilibrá-los
pesando-os numa balança.
- Centrifugar o homogeneizado a 2000 rotações/ minuto (rpm) durante 10 minutos.

1
 - Decantar cuidadosamente o sobrenadante (S1) num tubo de centrífuga. O sedimento constitui a
fracção nuclear (P1) que é eliminada.
- Centrifugar o anterior sobrenadante (S1) a 10000 rpm durante 10 minutos.
- Decantar o sobrenadante (S2). O sedimento (P2) constitui a fracção mitocondrial.
- Ressuspender o anterior sedimento (P2) em Tris 5 mM e centrifugar a 10000 rpm por l0 min
- O novo sedimento (P2’) é ressuspenso em Tris 5 mM para posterior caracterização bioquímica e
constitui a fracção mitocondrial.
- O sobrenadante (S2) é centrifugado a 20000 rpm durante 90 minutos.
- O sedimento (P3) obtido é ressuspenso em Tris 5 mM para posterior caracterização bioquímica
e constitui a fracção microssomal.
- O sobrenadante resultante (S3) é a fracção solúvel.
HOMOGENEI ZADO
2000 r pm/ 10 mi n.

P1 S1
FRACÇÃO NUCLEAR
10000 r pm/ 10 mi n.

P2 S2
( MI TOCÔNDRI AS E LI SOSOMAS)

10000 r pm/ 10 mi n.
( 2. 5 ml Tr i s/ t ubo)

P´ 2 S´ 2
FRACÇÃO MI TOCONDRI AL 20000 r pm/ 90 mi n.

P3 S3
FRACÇÃO SOLÚVEL
FRACÇÃO MI CROSSOMAL

Fig.1- Esquema representativo da centrifugação diferencial do fígado de rato. Obtenção das

fracções mitocondrial e microssomal.

“RESPIRAÇÃO MITOCONDRIAL”
Algumas estruturas subcelulares podem ser observadas ao microscópio electrónico
(ME) e identificadas bioquimicamente através da análise das principais biomoléculas
(proteínas, lípidos, glúcidos e ácidos nucleícos) ou da presença de enzimas marcadoras de
determinada estrutura biológica. No entanto, a análise funcional de uma célula só é possível
se aquela actividade enzimática for mantida (de forma semelhante às condições in vivo) ou se
forem medidos parâmetros funcionais, tais como a manutenção da respiração mitocondrial

2
ou a criação de uma diferença de potencial mitocondrial (m), essencial para a manutenção
da actividade mitocondrial e celular.

Estudo do consumo de O2 em mitocôndrias intactas

A função mitocondrial pode ser avaliada através da medição do consumo de O2,
permitindo determinar a oxidação de substratos específicos, através do uso de um eléctrodo
de O2. Nos organismos eucarióticos, a respiração (consumo de O2) processa-se ao nível das
mitocôndrias, mais concretamente, na membrana mitocondrial interna (MMI). O consumo de
O2 deve-se à sua redução por electrões produzidos no metabolismo que fluem através de um
sistema transportador de electrões (e-). A cadeia transportadora de electrões envolve a
transferência de e- do NADH para o complexo I (NADH desidrogenase), deste para a
ubiquinona (UQ  UQH  UQH2), que na sua forma reduzida se designa ubiquinol,
complexo III (citocromo c reductase), citocromo c, complexo IV (citocromo oxidase) e O2. Para
além de receber os electrões, o O2 combina-se com H+ (+ electrões produzidos pelo
metabolismo) e forma água: 2 e- + 2H+ + ½ O2  H2O
O FADH2 produzido pelo complexo II (ou succinato desidrogenase, uma enzima do ciclo
de Krebs) cede e- directamente à ubiquinona.
Assim, na cadeia respiratória mitocondrial (CRM), os electrões passam sempre de
substâncias com potencial de oxidação-redução mais baixo (NADH, FADH2) para substâncias
de potencial de oxidação-redução mais elevado (O2), tal como acontece nas pilhas eléctricas.

4H+ 4H+ 2H+ 3H+

c +
2e-
I Fo

II
IIIMatrix IV F1
-
NADH ½ O2 H2O ATP
FADH2 +
2H+
Fig. 1- Representação da cadeia respiratória mitocondrial (CRM).
Quando as mitocôndrias são isoladas em condições controladas (ex. meio iso-osmótico),
elas apenas consomem O2 e produzem ATP quando um substrato oxidável, como o ADP e
fosfato inorgânico, está presente. Estas mitocôndrias exibem um controlo respiratório óptimo.

3
Quando todo o ADP foi usado para a síntese de ATP, o consumo de oxigénio pára. Desta forma,
o consumo de O2 está acoplado à síntese de ATP.
Há substâncias que inibem o transporte de electões especificamente. É o caso da
rotenona, do malonato (ou o 3-nitropropionato), da antimicina A e do cianeto, que inibem,
respectivamente, o complexo I, complexo II, complexo III e o complexo IV da CRM.
Mitocôndrias lesadas podem ser capazes de consumir O2 na ausência de ADP (não
produzem ATP). Agentes desacopladores da mitocôndria (ex. 2,4-dinitrofenol, FCCP, CCCP)
que desacoplam a transferência de electrões para o O2 e tornam a membrana permeável a H+,
reproduzindo em mitocôndrias intactas o efeito observado quando as mitocôndrias estão
lesadas, ou seja, quando a sua integridade está comprometida.

1 Eléctrodo de O2
O consumo de O2 pela CRM é medido pelo eléctrodo de oxigénio, onde o O2 é reduzido
ao nível do cátodo (platina) dando origem a uma corrente que é proporcional à [O2] em
solução, desde que uma pequena voltagem polarizante (0,5-0,8 V) seja aplicada.
Ânodo (+): 4 Ag+ + 4 Cl- 4 AgCl + 4 e-
Cátodo (-): 4 H+ + 4 e- + O2 2 H2O
4 H+ + 4 Ag+ + 4 Cl- + O2 4 AgCl + 2 H2O
O tipo de eléctrodo usado é geralmente o eléctrodo de Clark, no qual os eléctrodos de
prata e platina são cobertos por uma membrana de
Teflon, permeável ao O2. A figura 2 mostra um
registo do consumo de O2 em células isoladas de
doentes com citopatia mitocondrial, após inibição
do complexo I com rotenona.
Fig. 2- Estudo do consumo de O2 em células isoladas de
doentes com suspeita de citopatia mitocondrial utilizando
o eléctrodo de oxigénio. O uso dos substratos e inibidores
dos vários segmentos da cadeia respiratória mitocondrial
permite detectar défices funcionais.

Os substratos e inibidores actuam (rever matéria leccionada nas aulas teóricas):

Rotenona - inibe o complexo I Succinato – substrato do complexo II
Digitonina – permeabiliza membranas Oligomicina – inibe ATPsintetase (ou complexo V)
m-CCP – desacoplador mitocondrial Malonato – inibe reversivelmente o complexo II
Duroquinol – análogo do ubiquinol KCN (cianeto de potássio) – inibe complexo IV
Glicerol-3-P – cede e- via FADH2 (shuttle glicerol-3-fosfato)

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2. Produção de ATP intracelular
O objectivo primordial da actividade respiratória é a produção de ATP, a “moeda”
energética de grande parte das reacções celulares. A análise da produção de ATP pode ser feita
através da bioluminiscência. Este fenómeno é exibido por alguns organismos biológicos,
incluindo as bactérias, fungos, protozoários, etc. A enzima luciferase é requerida para o
processo de bioluminiscência, actuando em moléculas de luciferina, que podem emitir luz na
presença de oxigénio, consumindo ATP. Assim, a emissão de luz pode ser usada para medir a
quantidade de ATP em solução, segundo a seguinte reacção:

Luciferase
Luciferina Oxiluciferina + luz

ATP ADP

Os níveis de nucleótidos de adenina (ATP, ADP, AMP) podem ainda ser medidos recorrendo,
por exemplo, à utilização da cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase reversa.

3. Índice ADP/O
O número de moles de ATP produzidos por átomo de oxigénio consumido é denominado
índice ADP/O. O valor mais alto (3) é atingido em mitocôndrias que respiram optimamente na
presença de um substrato associado à formação de NADH (como o piruvato ou malato). Isto
quer dizer que durante a passagem de um par de electrões ao longo da cadeia respiratória
mitocondrial são formadas 3 moléculas de ATP. Outros substratos respiratórios, como aqueles
que não conduzem à formação de NADH, apresentam índices ADP/O mais baixos. O succinato,
por exemplo, capaz de reduzir o FAD+ na presença da succinato desidrogenase apresenta uma
índice ADP/O de aproximadamente 2, o que significa que entra na cadeia respiratória a um
potencial mais baixo do que o piruvato ou o malato.

BIBLIOGRAFIA
-Plummer ST (1971) An Intorduction to Practical Biochemistry, Chp. 15 (15. Photosynthesis and
respiration), pp. 287-301.
-Hegyi G et al. (2013) Introduction to Practical Biochemistry, Chp.5 (Chapter 5. Cell disruption, cell
fractionation qnd protein isolation), p.60-71.