Isolamento e

identificação
Enterobacteriaceae
02/2017

BACTERIOLOGIA CLÍNICA

Profa. Dra. Maria Gorete Mendes de Souza

Carrijo
Isolamento e identificação
Enterobacteriaceae
 Enterobacteriaceae

Bacilos Gram-negativos
Habitat natural: microbiota do
intestino humano
Podem ser encontrados no solo,
água e vegetação
Fermentam a glicose

Reduzem nitrato em nitrito

Oxidase Negativa (exceção

Aeromonas, Plesiomonas)
 Enterobactérias

Enterobacteriaceae

A maioria apresenta motilidade (móveis)

Possuem a enzima catalase

Diversas patologias:
Mais de 70% das infecções urinárias,
30 a 35% de todas as sepses,
meningites, intoxicações alimentares,
pneumonias nosocomiais e etc
 Enterobacteriaceae

Capacidade de fermentar a lactose =

Diferenciação das cepas

Aeróbios ou anaeróbios facultativos

Crescimento em diversos meios

 Enterobacteriaceae

Escherichia Morganella

Klebsiella Salmonella

Enterobacter Shigella

Serratia Yersinia

Citrobacter Edwardsiella

Proteus Providencia

Pantoea Hafnia
MEIO DE CULTURA:
PARA UROCULTURA:
Ágar
Mac Conkey
Ágar Ágar
Mac Conkey CLED

Isolar bacilos Gram-

negativos (enterobactérias
e não fermentadores) Isolar e quantificar micro-
organismos Gram
positivos e negativos,
ÁGAR EMB leveduras
 Composição do meio Mac Conkey

Componentes Utilização Principal

Peptona 17g Fonte de energia, carbono e nitrogênio

Proteose peptona 3g Fonte de nitrogênio

Lactose 10g Fonte de energia e carbono
Sais Biliares 1,5g Inibir o crescimento de bactérias Gram-
positivas e Gram-negativas fastidiosas.

Cristal violeta 0,001g Inibir o crescimento de bactérias Gram-

positivas.

Cloreto de Sódio 5g Sal inorgânico

Vermelho neutro 0,03g Indicador de pH
Agar 13,5g Agente solidificante
pH final 7,1 +/- 0,2
 Interpretação do Ágar Mac Conkey

BACTÉRIA MORFOLOGIA DAS COLÔNIAS

Coloração vermelha ou rosada. Não são mucóides.
E. coli Podem ser rodeadas de um precipitado opaco de sais
biliares.
Klebsiella sp Grandes,rosadas, mucóides.
Enterobacter sp Grandes,rosadas. Não mucóides.
Serratia sp Vermelhas ou rosadas. Não mucóides.
Citrobacter sp Incolores, transparentes.
Arizona sp Vermelhas,se fermentam a lactose.
Proteus sp Incolores e transparentes.
Incolores, até café-esverdeado, odor adocicado
Pseudomonas sp
característico.
Salmonella sp Incolores, transparentes.
Shigella sp Incolores, transparentes ou levemente rosadas.
Staphylococcus sp Puntiformes, rosa-pálido,opacas e escassas.
 Interpretação do Ágar MacConkey
Indicador de pH

Amarelo

Vermelho neutro pH neutro

Vermelho (Rosa)
Diminuição do pH
 Interpretação do Ágar Mac Conkey

Interpretação da fermentação da Lactose

Possui a enzima beta-galactosidase Produção de ácidos

pH

Colônia vermelha (rosa)

Lactose
Lactose positiva

Não possui a enzima não ocorre produção de ácidos

Colônia incolor
Lactose negativa
 Composição do meio EMB (Eosina-Azul de Metileno)

Componentes Utilização Principal

Peptona 10g Fonte de energia, carbono e nitrogênio

Lactose 5g Fonte de energia e carbono

Sacarose** 5g Fonte de energia e carbono

Fosfato dipotássico 2g Sal inorgânico

Eosina 0,4g Inibem as bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas fastidiosas. Em ph ácido,
Azul-de-metileno 0,065
combinam-se, formando um precipitado,
servindo também como indicadores da
produção de ácido.
Agar 13,5g Agente solidificante
pH final 7,2 +/- 0,2

** Composição com sacarose = Fórmula de Holt-Harris Teague modificada

Composição sem sacarose = Ágar EMB Levine
 Interpretação do Ágar EMB

BACTÉRIA MORFOLOGIA DAS COLÔNIAS

Fermentadoras de lactose
E. coli
Negro-esverdeadas com brilho metálico

Klebsiella sp
Enterobacter sp Fermentadores fracos
Serratia sp Colônias púrpuras 24 – 48 hs
Hafnia sp

Proteus sp
Não fermentadores de lactose
Salmonella sp
Colônias transparentes.
Shigella sp

Fermentadora de sacarose e não de lactose

Yersinia sp Colônias transparentes EMB Levine
 Mac
Conkey

EMB

EMB
ÁGAR CLED
 Composição do meio CLED
(Cistina-Lactose-Deficiente em Eletrólitos)

Componentes Utilização Principal

Peptona de 3g
caseína Fonte de energia, carbono e nitrogênio
Extrato de carne 3g Fonte de energia, carbono e nitrogênio
Triptona 4g
L-cistina 0,128g Permitir o crescimento de “colônias anãs”
Lactose 0,001g Fonte de energia e carbono
Azul de 0,02g Indicador de pH
bromotimol
Agar 15,0g Agente solidificante
pH final 7,1 +/- 0,2
 Interpretação do Ágar CLED

BACTÉRIA MORFOLOGIA DAS COLÔNIAS

Fermentadoras de lactose
E. coli
Colônias amarelas
Colônias muito mucosas, cor variável de
Klebsiella sp
amarelo a branco azulado
Proteus sp Colônias azul translúcidas, menor que E. coli
Salmonella sp Colônias planas, cor azul
Enterococcus faecalis Colônias amarelas, com diâmetro menor
S. aureus Colônias amarelas, com diâmetro menor
Lactobacilos Colônias pequenas e rugosa
Pseudomonas
Colônias verdes, prateadas e periferia rugosa
aeruginosa
Staphylococcus
Colônias amarelo palha e brancas
coagulase negativa
 MEIOS MAIS UTILIZADOS PARA IDENTIFICAÇÃO ENTEROBACTÉRIAS

TSI Descarboxilação de
(Ágar Tríplice Açúcar e Ferro) aminoácidos

Citrato Fenilalanina

Indol Fermentação de carboidratos

Motilidade Malonato

Uréia Oxidase

DNAse Gelatinase
 Citocromo Oxidase
Hemoproteínas que contém ferro
Transfere hidrogênio ao oxigênio, com formação de água
(Cadeia respiratória)

Verifica a produção intracelular da

enzima oxidase pela bactéria

Diferencia:

Bacilos Bacilos
gram-negativos gram-negativos
não fermentadores Fermentadores
Oxidase Positiva Oxidase Negativa

Exceção: Vibrio, Plesiomonas e

Aeromonas. Oxidase Positiva
 Oxidase
Reagente 1%

Dicloridrato de tetrametil Oxidado - Roxo

-p-fenilenodiamina O2
+ Atmosf.
Citocromo
Azul-de-indofenol
oxidase
Reduzido - Incolor
+ H2O
 TSI
Componentes
Extrato de carne 3g
Extrato de levedura 3g
Peptona 15g
Proteose peptona 5g
Lactose 10g
Sacarose 10g
Glicose 1g
Sulfato ferroso 0,2g
Cloreto de sódio 5g
Tiossulfato de sódio 0,3g
Vermelho de fenol 0,024g
Ágar 12g
pH final 7,4
 TSI
NÃO FERMENTADOR

Não
fermentação O2

FUNDO ALCALINO PICO ALCALINO

 TSI
FERMENTADOR DE GLICOSE

Dextrose
O2 Pico Ácido Fundo Ácido

Reação Inicial
Ácidos mistos

Dextrose Pico alcalino Fundo Ácido

O2
Ácidos mistos Reação Tardia
 TSI
FERMENTADOR DE LACTOSE E/OU SACAROSE
FERMENTADOR DE GLICOSE

Dextrose
Pico Ácido Fundo Ácido
+
Lactose/Sacarose
O2

Ácidos mistos
 TSI
Interpretação da Produção de H2S
em meio ácido

Não fermentadoras de
Lactose/ Sacarose
Fermentadores de glicose
 TSI
A Partir da fermentação
Produção de Gás
da Glicose em meio
ácido
 Motilidade
Avalia se a bactéria tem a capacidade de se
mover pela presença dos flagelos

A bactéria móvel cresce além da linha de

inoculação, tornando o meio parcial ou
totalmente turvo.
 Motilidade

• Triptose (Peptona)..............10g
• NaCl......................................5g
• Ágar......................................3g
• Água destilada................1000ml
 Indol
Indol Produto do metabolismo do
aminoácido triptofano

Formação de um complexo de
cor rosa quando o indol reage
com o grupo aldeído do p-
dietilaminobenzaldeído (reativo
de Kovac´s)
 Indol

• Triptose (Peptona)..............10g
• NaCl......................................5g
• Água destilada................1000ml
 Interpretação
triptofanase
Triptofano Indol + ác.pirúvico + amônia

p-dimetilamino-benzaldeído
(reativo de Kovac´s)

Composto Rosa
 Interpretação
Resultado Cor da reação Interpretação

Positivo Rosa Presença de Indol

Negativo Amarelo Ausência de Indol

 Degradação de aminoácidos
Bactérias descarboxilam Liberando aminas de reação alcalina e
aminoácidos dióxido de carbono como produtos.

Descarboxilases Porção carboxila(COOH)

dos aminoácidos
Degradação de aminoácidos

Aminoácidos mais utilizados:

Lisina Cadaverina

Ornitina Putrescina

Arginina Citrulina
 Degradação de aminoácidos

Caldo Base (Moeller) c/ aminoácido Caldo Base (Moeller) CONTROLE

• Peptona................................5g • Peptona................................5g
• Extrato de carne...................5g • Extrato de carne...................5g
• Púrpura de bromocresol.......1g • Púrpura de bromocresol.......1g
• Glicose..........................0,005g • Glicose..........................0,005g
• Aminoácido........................10g • -----------------------------------------
• Água deionizada...........1000ml • Água deionizada...........1000ml
• pH: 6,0-6,2 • pH: 6,0-6,2
 Degradação de aminoácidos
Lisina descarboxilase
L-Lisina Cadaverina + CO2

Reação ocorre na ausência

de O2
Púrpura de
bromocresol
pH > 5,2
2-3 gotas de óleo mineral
estéril
 Degradação de aminoácidos
Elevação do pH (8,0) (+)

Indicador de pH pH
Púrpura de bromocresol Neutro

Diminuição do pH (6,8)
 NEGATIVO para o
aminoácido teste

Controle Teste

Teste inválido

Controle Teste

POSITIVO para o
aminoácido teste

Controle Teste
 MILI (Motilidade – Indol – Lisina)
Motilidade
• Extrato de levedo................................ 3g
• Triptona............................................. 10g
+
• Peptona............................................. 10g
• L-lisina................................................ 10g
• Ágar......................................................5g
• Glicose.................................................1g KOVACS - INDOL
• Sol. Púrpura de bromocresol 1%...1,25 ml +
• Água destilada...............................1000 mL

Lisina (+)
 Citrato (Ágar Citrato de Simmons)
O meio contém citrato de sódio,
um ânion, como única fonte de
carbono e fosfato de amônio como
única fonte de nitrogênio.
Citratase
(cátion magnésio)
Citrato de sódio
Alcalinização de meio
Hidróxido de amônia
Fosfato de amônio
 Citrato (Ágar Citrato de Simmons)
• Diidrogenofosfato de amônio................1g
• Cloreto de sódio.....................................5g
• Sulfato de magnésio............................0,2g
• Citrato de sódio......................................2g
• Azul de bromotimol............................0,08g
• Ágar.......................................................13g
• Água destilada.................................1000ml
 Indicador de pH
Azul (+)

Indicador de pH Azul de
bromotimol Indicador de pH
7,0

Amarelo (-)
Meio Malonato de Sódio
• Extrato de levedura............. 1g
• Sulfato de amônia............... 2g
• Fosfato de potássio...........0,6g
• Mono potássio.................. 0,4g
• Cloreto de sódio.................. 2g
• Malonato de sódio............... 3g
• Dextrose......................... 0,25g
• Azul de bromotimol...... 0,025g
• Água deionizada...........1000ml
 Meio Malonato de Sódio
Determinar a habilidade do Malonato de sódio = fonte de
micro-organismo de carbono
utilizar malonato de
sódio como única fonte
de carbono, resultando Sulfato de amônia = fonte de
na alcalinização do meio. nitrogênio

Positivo: bom crescimento, cor azul

Negativo: sem crescimento
 URÉIA (Ágar Uréia de Christensen)

Urease NH3
+
CO2
Diamina do ácido carbônico
(NH4) 2CO3

Carbonato de amônia
 URÉIA (Ágar Uréia de Christensen)
• Peptona..................................................1g
• Glicose....................................................1g
• Cloreto de sódio.......................................5g
• Fosfato dipotássio.....................................2g
• Vermelho de fenol..............................0,012g
• Ágar......................................................12g
• Água destilada..................................1000ml

Adiciona-se a base:
Solução de Uréia a 40%
 Interpretação
Resultado Cor do meio Interpretação

Positivo Rosa Meio Alcalino

Negativo Amarelo Ácido

 Fermentação de carboidratos
Consiste em verificar a capacidade do micro-
organismo fermentar ou não um determinado
carboidrato (açúcar)

Glicose Sorbitol Inositol

Lactose Arabinose Xilose

Sacarose Adonitol Ramanose

Rafinose Celobiose Maltose

Fermentação de carboidratos

Indicador Púrpura de Bromocresol

- +

Indicador Vermelho de Fenol

- +

Indicador de Andrade

- +
 Fenilalanina Desaminase

• D-fenilalanina...................................2g
• Extrato de levedura..........................3g
• Cloreto de sódio...............................5g
• Fosfato de sódio...............................1g
• Ágar................................................12g
• Água destilada..........................1000ml

• Cloreto férrico.....................................12g
REAGENTE • HCl concentrado..............................2,5ml
• Água destilada..........................1000ml
 Fenilalanina Desaminase
Fenilalanina desaminase
L-fenilalanina
Ácido fenilpirúvico

+
NH3

+
Ácido fenilpirúvico Íons férrico (Fe3+)
Complexo verde
REAGENTE
Fenilalanina Desaminase

+
 Fenilalanina Desaminase

Proteus

Diferencia os gêneros
Morganella

Providencia
 Ágar DNase
Diferenciação de micro-organismos baseado na
atividade de desoxirribonuclease (DNAse)
Ex: Serratia
 Ágar DNase

• Triptose..................................... 20g
• Ácido deoxiribonuléico............... 2g
• Cloreto de sódio......................... 5g
• Ágar.......................................... 15g
• Verde de metila..................... 0,05g ou
• Azul de ortotoluidina........................0,1g

pH =7,3 +/- 0,2

 Ágar DNase
(+) = zona clara ao
redor das colônias

(+) = zona rosa ao

redor das colônias
 Gelatinase (Ágar Gelatina)
Determina a habilidade do micro-
organismo de produzir enzimas
proteolíticas (gelatinases) que
liquefaz/hidrolisa gelatina.

• Extrato de carne...................................3g/L

• Peptona................................................5g/L

• Gelatina................................................120g/L (12%)

• Cloreto de sódio...................................30g/L (variável)

pH final 7,0
 Gelatinase (Ágar Gelatina)

TUBOS
 Gelatinase (Ágar Gelatina)
gelatinase
proteína + H2O proteinase polipeptídeos

gelatinase
polipeptídeos + H2O peptidase aminoácidos

A gelatina liquefaz a TUBOS

cerca de 28°C.
A incubação é feita a
cerca de 35°C Leitura: Deixar o tubo em um refrigerador
por cerca de 2 horas antes da
Muitas espécies requerem
incubação prolongada para
interpretação dos
liquefação de gelatina resultados.
Gelatinase (Ágar Gelatina)
FILME DE RAIO -X

Consiste de um material gelatinoso contendo

grãos ou cristais de brometo de prata, sensíveis
a radiação e distribuídos uniformemente.
Gelatinase (Ágar Gelatina)
FILME DE RAIO -X

Filme
Inóculo Bacteriano
5 mm x 1 cm
Denso (escala 10) –
cultura 18/24 hs
Em solução salina

Degradação do filme:
forma-se uma emulsão
no fundo do tubo e o
filme de raio-x torna-se
claro

GELATINASE (+) 48 a 72 hs / 37ºC

 Meio Rugai (IAL)
Rugai e Araújo modificado por Pessoa e Silva

Indol (tampa) Lisina

Fermentação da Glicose, Sacarose Motilidade

Produção de Gás

Fenilalanina – (LTD – Desaminação do L-triptofano)

Hidrólise da uréia

Produção de H2S
 Meio Rugai (IAL)
Rugai e Araújo modificado por Pessoa e Silva
 Meio Rugai (IAL)
Rugai e Araújo modificado por Pessoa e Silva

O meio IAL tem a DESVANTAGEM:

vantagem de ser prático
é a dificuldade de
para inoculação e de baixo
custo. interpretação de tantas provas

IDENTIFICA:
Os principais gêneros de
enterobactérias
Indica a presença de bactérias
não fermentadoras e Vibrios.
 MEIO EPM
(Escola Paulista de Medicina)
Produção de gás Formiase – Ácido fórmico = CO2 e H2O

Fermentação da Glicose

Produção de H2S

Hidrólise da uréia

Fenilalanina Ácido Fenilpirúvico

 Prova do Vermelho de Metila (VM)

Avalia os micro-organismos produtores de ácidos fortes a

partir da glicose através da via de fermentação mista.

Composição do meio Clark e Lubs:

• Peptona tamponada.....................7g
• Glicose.........................................5g
• Fosfato dipotássico......................5g
• Água destilada.....................1000ml
pH final=6,9
 Prova do Vermelho de Metila (VM)
Indicador de pH

Amarelo pH 6,0

Vermelho de metila
Vermelho pH 4,4 ou menor

Via Glicolítica de
Embden- Via dos Ácidos
Meyerhoff Mistos

Glicose Ácido Pirúvico Ácidos Mistos

+
pH CO2
Vermelho
pH 4,4 ou menor
 Prova do Vermelho de Metila (VM)
Interpretação
18-24hs Incubação
0,5 mL Caldo Inóculo denso 35°C

2 gotas de Vermelho
de Metila

Positivo: desenvolvimento de uma cor vermelha indica

produção de ácido suficiente para baixar o pH a 4,4.

Negativo: produção de quantidades menores de ácido a

partir do substrato, pode-se desenvolver uma cor
alaranjada entre o amarelo e o vermelho.
 Prova de Vogues Proskauer (VP)
Composição:
• Mesmo meio para o teste VM
• Meio de Clark e Lubs

Avalia os micro-organismos produtores de acetoína como

principal subproduto do metabolismo da glicose e formam
quantidades menores de ácidos.
 Prova de Vogues Proskauer (VP)
Interpretação
Via Glicolítica de
Embden- Via Butilenoglicol
Meyerhoff

Glicose Ácido Pirúvico Acetoína

+
Acetoína KOH 40% + O2 Atm 2CO2

Produto rosa a
Diacetila
(Produto )
+ α-naftol 5%
Catalisador vermelho
Prova de Vogues Proskauer (VP)
Interpretação
VP VM
Prova de Vogues Proskauer (VP)
Interpretação
VM VP

+ +
Testes Comerciais e Sistemas Automatizados

BD – BBL CRYSTAL TM
Testes Comerciais e Sistemas Automatizados

BACTRAY – Laborclin
 Testes Comerciais e Sistemas Automatizados

Api Biomerieux

Kits para cada grupo de

microrganismos
Software com base de dados
– web
https://apiweb.biomerieux.com/
Testes Comerciais e Sistemas Automatizados
Biomerieux

Identificação Bacteriana e
Testes de Sensibilidade

BD Phoenix

Identificação Bacteriana e
Testes de Sensibilidade
 Testes Comerciais e Sistemas Automatizados
MicroScan autoScan-4
System
Painéis para
Identificação Bacteriana e
Testes de Sensibilidade

WalkAway Plus System

Incubação automática
Identificação Bacteriana e
Testes de Sensibilidade
 www.unifran.edu.br

Av. Dr. Armando Salles Oliveira, 201

14404 600
Franca SP Brasil
T 55 16 3711 8888
F 55 16 3711 8886