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APLICABILIDADE DAS TÉCNICAS DE BIOLOGIA

MOLECULAR NA REPRODUÇÃO ANIMAL

APPLICABILITY OF MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES

IN ANIMAL REPRODUCTION

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MARTTOS, A. G; 2COSTA, I. B
1Graduanda em Medicina Veterinária – Faculdades Integradas de Ourinhos/FIO, Ourinhos, São
Paulo, Brasil – correspondência: [email protected]
2Docente em Medicina Veterinária – Faculdades Integradas de Ourinhos/FIO, Ourinhos, São Paulo,

Brasil

RESUMO
Por definição, a biologia molecular é uma derivação da ciência que estuda a biologia a nível
molecular. A difusão do conhecimento de tal área tem permitido a identificação de genes em
humanos, plantas e animais, com isso, as técnicas de biologia molecular estão sendo amplamente
utilizadas na medicina veterinária, não apenas para diagnósticos de doenças ocasionadas por
patógenos, mas também, na reprodução animal, especialmente pela precisão que as técnicas
oferecem, sendo muito utilizadas para sexagem de embriões, identificação de raças, testes de
paternidade e outras exigências relacionadas à reprodução animal.

Palavras-chave: Biologia Molecular. Biotecnologia. Reprodução.

ABSTRACT
By definition, the molecular biology is a derivation of the science that studies the biology at the
molecular level. The dissemination of knowledge of this area has allowed the identification of genes in
humans, plants and animals, as a result, the molecular biology techniques are being widely used in
veterinary medicine, not only for diagnosis of diseases caused by pathogens, but also, in animal
breeding, especially by the precision that the techniques offer, being widely used for sexing embryos,
identification of races, paternity test and other requirements related to animal reproduction.

Keywords: Molecular Biology. Biotechnology. Reproduction.

INTRODUÇÃO
A biologia molecular se originou à partir da definição da estrutura molecular
do DNA, em 1953, por Watson e Crick. Descobertas posteriores demonstraram que
tal molécula era considerada elemento primordial e que com isso seria possível
compreender as principais características dos seres vivos (PINHO, 2006).
As técnicas de biologia molecular, como a sexagem de embriões e o teste de
paternidade se tornaram exigidas na área reprodutiva veterinária para diversas
espécies e raças, a fim de maximizar o potencial reprodutivo de animais de alto valor
zootécnico.
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Atualmente, é possível contar com inúmeros marcadores moleculares para as

diversas características desejáveis e estes vêm auxiliando no desenvolvimento do
melhoramento genético.
Há uma grande quantidade de técnicas moleculares que estão relacionadas
com a reprodução animal. Nessa revisão serão citadas as técnicas mais comumente
utilizadas.

DESENVOLVIMENTO
ADVENTOS BÁSICOS
O que se conhece atualmente por genes, deve-se a estudos realizados à
partir das pesquisas de Mendel, no século XIX. O genoma reúne informações
responsáveis por conferir as características básicas de um ser vivo, sendo
encontrado no DNA. Portanto, essa molécula é a responsável por carregar o código
genético em todos os seres vivos, exceto os vírus (EÇA et al., 2004).
Os genes são constituídos por ácidos nucleicos, formados por blocos
estruturais elementares, conhecidos por nucleotídeos, onde cada nucleotídeo possui
uma molécula de açúcar, sendo que no RNA (ácido ribonucleico) o açúcar é uma
ribose e no DNA (ácido desoxirribonucleico) o açúcar é uma desoxirribose, uma de
fosfato (com propriedades ácidas) e outra de nitrogênio (com propriedades
levemente básicas). Porém o que difere o DNA do RNA é um nucleotídeo distinto,
sendo o RNA formado por adenina (A), guanina (G), citosina (C) e uracila (U) e o
DNA formado por A, G, C e T (timina), sendo G e A bases purinas, estruturas
bicíclicas e C, T e U bases pirimidinas monocíclicas (SNUSTAD; SIMMONS, 2010;
TURNER et al., 2004).
Em 1953, James Watson e Francis Crick, deduziram que a organização dos
nucleotídeos dentro do DNA se dá pela ligação de um ao outro, em cadeia. Além
disso, foi visto que as cadeias são mantidas unidas por atrações químicas fracas
entre pares de bases, chamadas pontes de hidrogênio, onde A pareia com T e G
com C, sendo assim as duas cadeias de uma molécula de DNA são complementares
(EÇA et al., 2004; TURNER et al., 2004).
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Além de apresentarem um nucleotídeo distinto, o RNA e DNA apresentam

outra característica que os difere, sendo o DNA uma molécula bifilamentar (dupla
hélice) e o RNA uma molécula unifilamentar (SNUSTAD; SIMMONS, 2010).
Assim, com a descoberta do DNA e do código genético, foi possível a
manipulação intencional do DNA, através de técnicas da engenharia genética, além
de propiciar incríveis avanços na área genética e da biologia molecular (FALEIRO et
al., 2011).

TÉCNICAS

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION – REAÇÃO EM CADEIA PELA

POLIMERASE) E PCR EM TEMPO REAL
A PCR foi desenvolvida em 1985 por Kary Mullis, o qual recebeu o prêmio
Nobel da Química por seu trabalho (WISCHRAL e GOMES FILHO, 2009). Essa
técnica vem se destacando na medicina veterinária nas mais diversas áreas, como
por exemplo, o diagnóstico de doenças infecciosas, aprimoramento da reprodução e
identificação de doenças genéticas.
De acordo com Melo et al.,(2012), na área da reprodução animal, a técnica
torna possível a identificação do sexo de embriões, entretanto, para que seja
favorável comercialmente, precisa atender algumas exigências, tais como, ser
barata, reproduzível e suficientemente rápida, permitindo assim avaliar, em pouco
tempo, grande quantidade de embriões.
O método consiste em amplificar uma determinada sequência selecionada de
DNA ou RNA, permitindo sintetizar em algumas horas, milhões de cópias da
sequência de interesse. Para isso necessita de um DNA como molde, nucleotídeos,
oligonucleotídeos, enzimas e uma solução tampão para a reação, sendo dividida em
três etapas: na etapa 1, o DNA que contém a sequência que será amplificada é
desnaturado por aquecimento a 92-95ºC, por aproximadamente 30 segundos; na
etapa 2, o DNA desnaturado é helicoidizado a um excesso de oligonucleotídeos,
incubando-os juntos a uma temperatura de 50-60ºC pelo tempo de 30 segundos; e
na etapa 3, a DNA polimerase (enzima), é empregada para replicar o segmento de
DNA entre os sítios complementares aos oligonucleotídeos (SNUSTAD; SIMMONS,
2010).
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Baseada na PCR convencional há a PCR em Tempo Real, responsável por

determinar medidas quantitativas nos ciclos da PCR, o que a torna mais rápida,
específica e sensível, permitindo a quantificação do DNA durante as reações, além
da amplificação simultânea, como ocorre na PCR convencional. Esta técnica
revolucionou o processo de quantificação de DNA e RNA, uma vez que, de maneira
precisa, quantifica os ácidos nucleicos, apresentando maior reprodutibilidade, por
determinar valores na fase exponencial da reação, a partir de um ponto que detecta
o ciclo em que a reação atinge o limiar da fase exponencial, permitindo a
quantificação exata e reprodutível utilizando a fluorescência (MELO et al., 2012).

MICROARRANJOS DE DNA
A metodologia é realizada inicialmente pela formação prévia de uma
biblioteca genômica, onde, a partir do pool de fragmentos genômicos, coloca-se
clones em uma microplaca de maneira automatizada, assim cada microplaca tem a
representação de grande parte dos clones da biblioteca para determinado genoma
(FALEIRO et al., 2011). Geralmente, para se criar uma biblioteca genômica, o DNA
genômico é preparado por digestão com protease e extração de fase, sendo
fragmentado por digestão ou agitação com enzimas de restrição, assim tem-se a
variação de tamanho para o vetor escolhido (TURNER et al., 2004).
A técnica de microarranjo está amplamente requisitada em pesquisas da área
animal, em especial nos estudos relacionados a características de herança
complexa e/ou de baixa herdabilidade (ROSA et al., 2007).
Segundo ROSA et al. (2007), a utilização de microarranjos em bezerras pré-
púberes e fêmeas adultas, é possível a partir da comparação do perfil de transcritos
de oócitos e embriões em inicial estágio de desenvolvimento. Os resultados
apresentaram número relevante de genes entre os modelos de estudo. Além disso, a
técnica pode ser empregada para outras finalidades dentro da reprodução animal e
outros ramos da zootecnia, como crescimento e metabolismo, resposta imune a
doenças e parasitoses e resposta a fatores de estresse não infecciosos, que podem
ser restrição alimentar, exposição a elementos tóxicos e outras condições
ambientais que sejam desfavoráveis.
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RFLPS (POLIMORFISMO NO COMPRIMENTO DOS FRAGMENTOS DE

RESTRIÇÃO)
Os SNPs (polimorfismos de nucleotídeo único) podem acontecer dentro de
sequências curtas, sendo reconhecidas por enzimas de restrição, fazendo com que
o tamanho do fragmento gerado por cortar uma molécula de DNA com enzimas de
restrição seja diferente para cada alelo, isto é chamado de RFLP (TURNER et al.,
2004).
Os RFLPs foram uma das primeiras técnicas a ser desenvolvida e uma das
mais utilizadas. As enzimas de restrição expressam, quando clivados, por meio da
eletroforese, as diferenças de comprimento de fragmentos do DNA, sendo
observadas através da hibridização dos fragmentos com sequências homólogas, que
pode estar marcado por radioatividade ou luminescência. Os RFLPs podem ter
origem por mudanças de pares de bases, rearranjo de DNA, inserção e/ou deleção
ou ainda diversidade natural nas populações, sendo as enzimas necessárias para
identificação de locus polimórficos. A técnica apresenta expressão codominante, e
como abrangem todo o genoma, há a possibilidade de ser associada com genes de
interesse econômico (ABAD et al., 2014).
Segundo Abad et al. (2014), nos últimos anos a técnica vendo sendo
empregada em conjunto com a PCR (PCR-RFLPs), o que aumentou a sensibilidade
do método, tornando mais fácil a identificação dos polimorfismos, sendo necessárias
pequenas quantidades de DNA. Essa associação das técnicas é muito utilizada para
caracterização de raças bovinas e em estudos de associação a caracteres
produtivos. Entretanto, a técnica apresenta limitações, sendo o uso intensivo de mão
de obra e o tempo necessário para a realização, os principais fatores limitantes.

QTL (QUANTITATIVE TRAIT LOCI)

O objetivo primordial da análise de DNA em animais domésticos está
relacionado com características de interesse econômico, estabelecendo os genes
que conferem as características fenotípicas (COUTINHO et al., 2010).
O QTL é uma das técnicas empregadas para identificação de genes de
interesse e seu mapeamento está relacionado com a identificação de determinadas
regiões cromossômicas relacionadas a características de interesse econômico,
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também chamado de loci de interesse quantitativo, porém isso depende do

desenvolvimento de mapas genéticos saturados pela utilização de marcadores
moleculares polimórficos e uma estrutura populacional que apresente a
característica de interesse (COUTINHO et al., 2010; MILAZZOTTO et al., 2008).
Atualmente é possível a identificação de genes determinantes que estão
relacionados com o desenvolvimento muscular, qualidade da carne e rendimento do
leite, por exemplo. Porém, a identificação de regiões no genoma que apresentem os
genes de interesse, pela utilização do QTL, apresenta limitações, como o alto custo,
pela necessidade em ter uma população experimental com no mínimo duas
gerações e a realização de genotipagem e fenotipagem completa dos indivíduos, o
custo de genotipagem para marcadores moleculares, a eficácia da técnica, que pode
ser variável, a herdabilidade da característica de interesse e a principal restrição é
que, como a técnica indica uma região cromossômica específica, onde se encontra
os genes de interesse, pode também conter diversos outros genes (COUTINHO et
al., 2010).

SEQUENCIAMENTO DE DNA
A técnica baseia-se na teoria de que organismos com características
fenotípicas distintas podem expressar genes relacionados às características, além
de obter a sequência de genes no genoma e ser a base para a construção de
plataformas de microarranjos, criadas para se analisar padrões de expressão gênica
em larga escala (COUTINHO et al., 2010).
O método também auxilia no diagnóstico molecular, pois permite o
conhecimento de sequências gênicas específicas, podendo, através de programas
de bioinformática, ser comparados e assim, oligonucleotídeos específicos podem ser
sintetizados e, assim, permitir a amplificação específica de fragmentos que podem
identificar de maneira específica animais, plantas e patógenos (FALEIRO et al.,
2011).
Entretanto, como o QTL, o sequenciamento de DNA apresenta limitações,
pois os microarranjos obrigam o conhecimento da sequência do gene impresso na
plataforma, limitando assim, a disponibilidade de arranjos para a espécie de
interesse (COUTINHO et al., 2010).
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MINISSATÉLITES (VNTR- VARIABLE NUMBER OF TANDEM REPEATS) E

MICROSSATÉLITES (SSR- SIMPLE SEQUENCE REPEATS)
O DNA repetitivo no genoma de eucarióticos consiste em sequências curtas,
em disposição em tandem de centenas de cópias, ficando conhecida como DNA
satélite, por terem sido identificadas como bandas satélite (TURNER et al., 2004).
Os VNTRs são marcadores formados por repetições de DNA em sequência,
sendo localizados em regiões controméricas e teloméricas nos cromossomos. A
técnica consiste em unidades repetidas de 15-100 nucleotídeos, sendo observada
em um locus que pode ser repetido em até 50 vezes, porém, o alto custo para sua
realização é um fator limitante. As repetições que os formam, servem como base do
fingerprinting de DNA, técnica empregada na identificação de pessoas e seus
parentescos (TURNER et al., 2004, 27 - 29; ABAD et al., 2014).
Os SSRs são marcadores que se encontram no genoma de eucariontes,
sendo utilizados nos estudos relacionados com a biodiversidade.
De acordo com Abad et al. (2014), a técnica consiste em pequenas
sequências que possuem de um a cinco pares de bases, repetindo-se em série em
um número variável, de uma dezena a uma centena de vezes. Além disso, são
necessários dois pares de oligonucleotídeos específicos, sendo complementares às
sequências que estão ao redor dos microssatélites.
Entretanto, por se encontrarem distribuídos no genoma e os nucleotídeos
repetidos serem poucos, são mais utilizados que os minissatélites, fazendo com que
a PCR se torne mais eficiente.

MARCADORES MOLECULARES
Os marcadores moleculares são utilizados para identificar a variação genética
entre indivíduos, podendo ser utilizado para associar uma característica de
interesse, sendo amplamente utilizado em decorrência de diversas características de
interesse (Polido et al., 2012).
Os diferentes tipos de marcadores disponíveis se diferenciam de acordo com
a tecnologia empregada, com o objetivo de revelar a variabilidade a nível de DNA,
além de proporcionar variação quanto à habilidade de identificar as diferenças entre
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indivíduos, facilidade na utilização, custo, possibilidade de repetição e consistência

(MILACH, 1998, 14 - 17).

SEXAGEM DE EMBRIÕES
A sexagem de embriões auxilia no desenvolvimento do melhoramento
genético em animais com alto valor comercial, com isso o criador pode, ainda na
fase embrionária, escolher o sexo desejado.
A sexagem fetal em equinos é realizada através da técnica de PCR, por
fornecer resultados sensíveis e confiáveis, visto que a diferenciação sexual é
estabelecida pela presença ou não do cromossomo Y e pela expressão do gene
SRY, responsável por codificar a proteína TDF (fator de determinação testicular),
que agindo nos tecidos gonadais gera: atrofia dos ductos de Muller,
desenvolvimento dos testículos, formação dos túbulos seminíferos, formação das
células de Leydig e produção de testosterona (OLIVEIRA et al., 2014).
Segundo Passaglia; Chaves (2007), o Brasil apresentou, nos últimos anos,
uso crescente da sexagem em animais de genética superior a partir da amplificação
da região repetitiva específica do cromossomo Y, seguida da eletroforese, sendo
estes os métodos mais utilizados comercialmente.

TESTE DE PATERNIDADE
Testes de paternidade se baseiam na exclusão genética, sendo assim, todos
os alelos do DNA presentes na prole precisam se encontrar na mesma posição dos
alelos dos pais, encontrando a origem materna e em seguida a paterna (VIEIRA et
al., 2011).
Segundo Abad et al. (2014), a utilização de marcadores moleculares propiciou
avanços no melhoramento genético, pois auxiliou na identificação de indivíduos e
essa prática se tornou essencial para a comercialização de animais, em especial,
àqueles com significativo valor zootécnico, assim como para, caracterização de
populações, estudos de biodiversidade e seleção assistida. A técnica de PCR é
amplamente empregada, em decorrência da necessidade de pouco material e curto
espaço de tempo para obter o resultado. Por outro lado, o emprego de marcadores
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moleculares, permite a automatização do processo, favorecendo a utilização de

outras técnicas como os microssatélites.

DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS
A biologia molecular é comumente utilizada para diagnosticar doenças, em
especial aquelas causadas por patógenos. Segundo Queiroz (2008), a PCR tem se
mostrado bastante útil para identificação de espécies de Leishmania, possibilitando
a detecção de cães assintomáticos e cães soronegativos.
Técnicas moleculares também são empregadas na identificação da
Erliquiose, Pseudoraiva, entre outras doenças, através da técnica de PCR, no
estado latente ou de replicação, auxiliando no controle de doenças (FONSECA
JÚNIOR et al., 2010; ALVES et al., 2005).

CONSIDERAÇÕES FINAIS
Apesar de serem eficazes e quase sempre seguras, muitas técnicas de
biologia molecular se mostram com uso limitado na rotina veterinária devido ao alto
custo que apresentam e, muitas vezes pela necessidade de se ter conhecimento
prévio da sequência de gene da espécie de interesse.

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