UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

INSTITUTO DE QUÍMICA E BIOTECNOLOGIA- IQB

DOSAGEM DE PROTEÍNA DO LEITE PELO MÉTODO DO BIURETO.

Daiane Soares dos Santos

Relatório da disciplina prática de Bioquímica do

Maceió - Al
Julho de 2019
Introdução.
Atualmente existem diversos métodos para a quantificação de proteínas, esses
métodos podem ser empregados ao avaliar alguns fatores importantes tais como,
natureza da proteína, presença de interferentes, rapidez, sensibilidade, eficiência e
outros. As proteínas desempenham papéis extremamente importantes, na maioria
dos processos biológicos, atuando como enzimas, hormônios, neurotransmissores,
transportadores através das membranas celulares, está presente na composição
dos anticorpos, importante para a coagulação sanguínea e transporte de oxigênio e
entre outros. Devido a sua ampla utilização a determinação de proteínas é de
grande interesse para profissionais de muitas áreas, como, indústria alimentícia,
laboratórios de análises clínicas, favorecendo o diagnóstico de certas doenças e
pesquisas de variadas áreas como em nutrição animal, ressaltando o
aproveitamento racional de nutrientes, em problemas relacionados à nutrição
humana, como obesidade, anorexia nervosa, desnutrição, entre outros. Os métodos
para a quantificação de proteínas são variados e se baseia nos princípos da
espectrofotometria e na lei de lambert-Beer.
A espectrofotometria é o método de medir o quanto uma substância química
absorve a luz, isso ocorre quando um raio de luz monocromática atravessa a
solução de uma certa substância capaz de absorver a energia desse comprimento
de onda. Parte da luz que incide sobre a solução é absorvida e a outra parte é
transmitida através da solução. As leis de Lambert-Beer são o fundamento da
espectrofotometria, no qual a quantidade de luz absorvida ou transmitida por uma
determinada solução depende da concentração do soluto e da espessura da
solução. Podem ser expressa matematicamente pela relação: T= e -a . 1.C
Sendo, T= Transmitância; e = Logaritmo Natural Euler; a= Constante; 1= Espessura
da solução e c = Concentração da solução (cor).
Convertendo a equação para forma logarítmica na base 10, temos: -log T=k. l . C
O valor de -log de T é chamado de absorbância (A) ou densidade ótica (DO), logo,
de acordo com a lei de Lambert-Beer, a absorbância de uma solução em
determinado comprimento de onda é diretamente proporcional a concentração da
substância e a espessura da solução atravessada pela luz.
O método trabalhado nesse relatório é o do Biureto. Esse método se baseia na
reação do reativo do biureto, que é constituído de uma mistura de cobre e hidróxido
de sódio com um complexante que estabiliza o cobre em solução, podendo ser
utilizado o tartarato de sódio. O produto de reação apresenta duas bandas de
absorção, uma em 270 nm e outra em 540 nm. A banda na região de 270 nm
aumenta em seis vezes a sensibilidade do método do biureto porém a banda na
região de 540 nm é a mais utilizada para fins analíticos, devido a diversas
substâncias que normalmente estão presentes na maioria dos meios analisados
absorverem na região de 270 nm, causando muita interferência. Neste método
podem ocorrer algumas interferências, como por exemplo, algumas substâncias que
possam reagir com os íons cobre (II). Quando ocorre tais interferências os métodos
para sua eliminação variam conforme cada caso, porém um método indicado na
literatura é a precipitação das proteínas com ácido tricloroacético e posterior
solubilização para determinação das mesmas. O método de biureto é rápido, utiliza
reagentes de baixo custo e não apresenta grandes variações de absortividade, pode
sem empregado para determinar proteínas totais em diversos meios, sendo eles:
soro ou plasma sanguíneo, líquido cérebro espinhal, urina, saliva e entre outros.
Objetivo.
Nessa prática, o objetivo é a quantificação da proteína do leite através do método de
Biureto.
 Materiais e Vidrarias Utilizadas
Erlenmeyer 100ml
Bureta 25mL
Pipetas de 1,2,5 e 10mL
Papel filtro
Proveta 20mL
Funil
Tubos de ensaio e estantes para tubos
Cubetas de 1 cm de caminho óptico
Lenços de papel
Espectrofotômetro ou Fotocolorímero
 Reagentes
Leite desnatado
Soluções padrão de proteína: 1,2,3,4,6,8 e 10mg.mL-1
Reagente de Biureto
Água destilada
Solução padrão de caseína.
Procedimento Experimental.
O experimento foi dividido em duas etapas.
Na primeira etapa, foi realizado a dosagem da proteína por espectrofotometria na
faixa do visível, para determinar as concentrações das soluções. Para isso, foram
organizados 10 tubos de ensaio e numerados de 1 a 9 sendo um deles chamado de
“branco”, afim de utilizá-lo para a calibração do espectrofotômetro. Foram tomados
diferentes quantidades de reagentes e colocados em cada tubo de ensaio, conforme
a tabela a seguir.
Solução Concentração
Tubos Água destilada padrão de caseína Reagente do
(mL) Caseína (mL) adicionada Biureto (mL)
(uM)
Branco 1 - 0 5
1 0,9 0,1 0,122 5
2 0,8 0,2 0,151 5
3 0,7 0,3 0,196 5
4 0,6 0,4 0,205 5
5 0,5 0,5 0,238 5
6 0,4 0,6 0,255 5
7 0,3 0,7 0,284 5
8 0,2 0,8 0,310 5
9 0,1 0,9 0,337 5
Após adicionado as devidas quantidades, os tubos foram agitados lentamente e
deixado em repouso sobre a bancada por 10 minutos. Em seguida, os tubos foram
levados para o espectrofotômetro de transmitância de 540nm.
A segunda etapa do experimento consiste na quantificação das proteínas do leite,
onde foram preparadas duas amostras. Na preparação da amostra I, colocou-se em
um erlenmeyer de 100mL, 10mL de leite desnatado e 25mL de água destilada. Com
o auxílio de uma bureta, foi acrescentado aos poucos gotas de HCl a 2% (v/v) até
que ocorresse a coagulação do leite, o volume gasto do ácido foi de
aproximadamente 0,72mL, em seguida verificamos o pH e oservamos um valor de
4,55 indicando uma solução ácida, decorrente do HCl. Filtramos e descartamos a
fração retida no papel composta pela caseína que é a principal é a principal proteína
contida no leite e representa cerca de 80% da sua composição. A solubilidade da
caseína é afetada pela adição de ácidos, pois a diminuição de pH reduz a presença
de cargas na molécula provocando a sua precipitação.
Para a amostra II, foi diluído leite e água destilada em uma proporção de 1/10, esta
amostra continha as proteínas totais do leite, tais como, caseína, lactoalbumina e
lactoglobulina. As duas amostras foram reservadas.Seguindo com o experimento,
foram separados dois tubos de ensaio e enumerados 1 e 2. no tubo 1, foi colocado
10ml de leite e levado para a centrífuga por 5 minutos. Após esse tempo
preparamos o tubo 2 contendo 0,5mL da solução do tubo 1 e 0,5mL de água
destilada. Em seguida foi preparado os ensaios de determinação de proteína
conforme a tabela abaixo:
Tubos / soluções 0 1 2
Reagente de 4 4 4
Biureto (mL)
Água destilada 1 -- --
(mL)
Amostra I (mL) -- 1 --
Amostra II (mL) -- -- 1
Após preparar as soluções, os tubos foram agitados para misturar os reagentes e
em seguida deixado em repouso por 15 minutos. Após o repouso, as soluções
foram levadas para leitura do comprimento de onda em 540nm.
Resultados e Discussões.
Após a leitura do comprimento de onda das soluções, foram anotados os valores de
absorbância e plotados os dados no excel afim de obter uma curva concentração
final de proteína (mg/mL) versus absorbância (A).

Conclusão.
A curva de calibração possui alguns desvios que podem decorrer de pequenos erros
durante o experimento, implicando assim nos cálculos para a determinação da
concentração de proteínas, no entanto, a prática utilizando o método de Biureto
mostra-se eficaz para a quantificação de proteínas do leite, esse método também
possui a vantagem de ser econômico e rápido.
Referências Bibliográficas.
Dimas A. M. Zaia*; Cássia Thaïs B; V. Zaia; Jaim Lichtig. DETERMINAÇÃO DE
PROTEÍNAS TOTAIS VIA ESPECTROFOMETRIA: VANTAGENS E
DESVANTAGENS DOS MÉTODOS EXISTENTES. Instituto de Química -
Universidade de São Paulo - 23/7/97 - São Paulo – SP
Almeida B; Leonardo V. F; CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS VIA MÉTODO DE
BIURETO COMO PROPOSTA INTERDISCIPLINAR PARA O ENSINO DE
QUÍMICA DE COORDENAÇÃO. Instituto Federal de Educação, Ciência e
Tecnologia do Rio de Janeiro. 20/03/2018. Nilópolis, RJ.