ANAIS DO VIII SIMPÓSIO DE MICROBIOLOGIA APLICADA

Revista Ciência, Tecnologia & Ambiente, v. 6, n. 1, p. 1-545, 2017

 RESUMOS EXPANDIDOS

Produção de lipase por Yarrowia lipolytica utilizando resíduo de manga ..................................................................... 1

Triagem e identificação de microrganismos isolados do tubo intestinal de Culex quinquefasciatus.............................. 7
Utilização de Planejamento Fatorial para variação metabólica de Annulohypoxylon stygium....................................... 13
Alta densidade celular de Clostridium carboxidivorans com gás de síntese.................................................................. 20
Fitotoxicidade pela associação de vinhaça em solos com diferentes manejos................................................................ 26
Estabilidade de surfactante produzido por estirpe de Enterobacter aerogenes LBPMA-BMA10................................. 32
Atividade Antimicrobiana e Antibiofilme de Filtrados de Fungos Endofíticos.............................................................. 38
Avaliação da atividade inibitória de Lactobacillus spp. sobre Salmonella Heidelberg.................................................. 44
Diversidade de fungos basidiomicetos em tocos de eucalipto....................................................................................... 50
Avaliação de microrganismos contaminantes da micropropagação de pinhão manso.................................................... 56
Biofertilizante no controle de fitonematóides em tomateiro........................................................................................... 62
Monitoramento do crescimento de bactérias formadoras de biofilmes .......................................................................... 67
Influência da aeração na produção de ectoína por Halomonas salina............................................................................ 74
Ácido indolacético produzido por Torulaspora globosa imobilizada em espuma poliuretano...................................... 79
Hidrólise enzimática de hemiceluloses extraídas de resíduos agroindustriais................................................................ 85
Biomassa fúngica como nutriente para produção de EPS............................................................................................... 91
Produção de ficocianina por Aphanothece microscopica Nägeli em cultivo mixotrófico suplementado com
vinhaça............................................................................................................................................................................. 97
Preservação de Lactobacillus acidophilus utilizando xantana como agente encapsulante............................................. 103
Fermentação de xilose em etanol por leveduras Saccharomyces cerevisiae................................................................... 109
Viabilidade da inoculação de Cratylia argentea com microrganismos fixadores de nitrogênio para uso como
forragem em vinocultura...................................................................................................... ........................................... 115
Resíduos agroindustriais como substratos para produção de Metarhizium anisopliae................................................... 121
O potencial da vinhaça no crescimento de fungos do solo.............................................................................................. 127
Atividade celulolítica de fungos filamentosos isolados do intestino de insetos aquáticos.............................................. 133
Produção de pectina esterase e poligalacturonase por Aspergillus sp............................................................................. 139
Obtenção de biossólido de lodo de esgoto anaeróbio por biolixiviação bacteriana........................................................ 145
Atividade antibacteriana de extratos fúngicos contra a Xanthomonas vesicatoria......................................................... 151
Potencial inibitório contra Sclerotinia sclerotiorum utilizando composto natural e semissintético............................... 157
Produção de invertase por Aspergillus sp. em condições submersas.............................................................................. 163
Produção de frutosiltransferase por Aspergillus sp em cultivo submerso....................................................................... 169
Prospecção química de Nodulisporium sp: otimizaçao das condições de cultivo........................................................... 175
Caracterização da atividade tanásica produzida por fungos isolados da biomassa......................................................... 181
Produção de β-Glicosidase por bactérias das amêndoas do Theobroma cacao.............................................................. 187
Avaliação da atividade dos metabólitos secundários contra Xanthomonas vesicatoria.................................................. 193
Diversidade bacteriana do solo após desastre ambiental em Mariana, Minas Gerais..................................................... 199
Comunidade microbiana em solos com aplicação de vinhaça e tebutiurom................................................................... 205
Vinho de jabuticaba: análise físico-química e cariotipagem das leveduras.................................................................... 211
Fungos micorrízicos nativos e nutrição do morangueiro em sistemas orgânicos............................................................ 217
Fungos da Antártica: Metabólitos bioativos contra Xanthomonas citri subsp. citri....................................................... 223
Seleção de meios de cultivo para produção de poli(3-hidroxibutirato)........................................................................... 229
Produção de poli(3-hidroxibutirato) por Ralstonia solanacearum sob diferentes condições salinas.............................. 235
Acumulação de lipídio e produção de lipase por Candida viswanathii.......................................................................... 242
Avaliação da composição de micro-organismos de lodo de esgoto durante o processo de biorremediação.................. 248
OSMAC: Ferramenta útil para a exploração racional da microbiota subterrânea associada a Senna
spectabilis........................................................................................................................................................................ 255
Influência de biocarvão e rizosfera na microbiota do ciclo do metano em solo amazônico........................................... 261
Seleção de bactérias ácido láticas da silagem de capim Mombaça (Panicum maximum) baseada nas suas
propriedades funcionais in vitro...................................................................................................................................... 267
Potencial micotoxigênico de fungos isolados de solos de vinhaça................................................................................. 273
Tolerância de Stenotrophomonas acidamiliphila a ácido ferúlico.................................................................................. 280
Qualidade microbiológica de salgado recheado com hambúrguer vegano artesanal...................................................... 285
Caracterização da endoglucanase usando casca de café como substrato........................................................................ 290
Fungos Antárticos: Bioatividade contra Xanthomonas vesicatoria e Xanthomonas axonopodis pv. manihotis............ 295
Bioacumulação de cobre no biofilme perifítico e seu impacto ecológico....................................................................... 301
Agitação e aeração do inóculo visando maior produção de P(3HB)............................................................................... 307
Análise micrográfica de Poli(3-hidroxibutirato) após ensaio de degradação em solo.................................................... 313
Determinação de metanol em biorreatores anaeróbios por NIRS-SVM......................................................................... 319
Identificação de macrofungos encontrados no Extremo Sul da Bahia............................................................................ 325
Otimização da produção de xilanases por Aspergillus hortai em estado sólido............................................................. 331
Ação do cloranfenicol em bactérias presente no mosto.................................................................................................. 337
Bioestimulação de lodo de esgoto por meio de bagaço de cana-de-açúcar e borra de café............................................ 343
Densidades de Enterococcus sp em praia do Litoral Norte Paulista............................................................................... 349
Biodegradação em solo cultivado com cana-de-açúcar com tebutiurom e vinhaça........................................................ 355
Metabólitos de Schinus terebinthifolius com potencial antimicrobiano.......................................................................... 361
Identificação, por desreplicação, de ácidos orgânicos produzidos por Fusarium oxysporum........................................ 367
Ação da temperatura durante o processo fermentativo................................................................................................... 373
Atividade antibacteriana de filmes de gelatina e zeólita clinoptilolita-Ag...................................................................... 379
Avaliação da atividade β-glicosídica de fungo isolado da madeira................................................................................ 385
Produção de xilanase por Fusarium oxysporum utilizando resíduos agroindustriais..................................................... 391
Detoxificação de lodo de esgoto por meio de bioestimulação....................................................................................... 397
Isolamento de microrganismos do sistema digestivo do peixe Curimbatá...................................................................... 403
Presença de Candida sp e R. mucilaginosa na Baía Araçá............................................................................................. 409
Microbiolização de sementes com bactérias diazotróficas isoladas de milho................................................................. 415
Seleção de fungos filamentosos produtores de celulases e otimização da produção enzimática.................................... 421
Influência do meio na produção de biossurfactante pela Rhodotorula mucilaginosa..................................................... 427
Produção de enzimas lignocelulolíticas em lodo branco por diferentes Aspergillus...................................................... 433
Atividade antimicrobiana de frações de Cambará sobre microbiota de morango........................................................... 439
Metabólitos secundários de Alternaria sp., fungo endofítico isolado das folhas de Serjania lethalis A.
St.Hil....................................................................................................................... ......................................................... 445
Seleção de espécies de Aspergillus e Penicillium produtores de enzimas aplicadas na indústria de
alimentos.................................................................................................................... ...................................................... 451

RESUMOS SIMPLES

Novel culture medium SPsA (sweet potato-sucralose-agar) for optimal growth of bacteria and filamentous fungi….. 457
Sugarcane harvesting systems alter rhizosphere bacterial communities………………………………………………. 458
Evaluation of the mechanisms of degradation of lignocellulosic biomass by the basidiomycete fungus Laetiporus
sulphureus............................................................................................................................. ........................................... 459
Experimental evolution with budding yeast: getting high on ethanol………………………………………………… 460
Sex, alcohol and Darwin: experimental evolution of ethanol tolerance with fission yeast…………………………… 461
Screening of fungal isolates from Amazon soil.............................................................................................................. 462
Endophytic Bacteria Associated to Tabebuia roseo-alba: A Promissing Source of Bioactive Metabolites………….. 463
Toxicity of water soluble elements evaluated by yeast metabolism…………………………………………………. 464
Stringent response and fatty acid starvation: Importance and implications towards drug development……………… 465
Search for the role of eIF5A in endoplasmic reticulum stress using large-scale proteomic GFP screen in budding
yeast................................................................................................................................................................................. 466
Diversity of the genus Penicillium isolated from Quadrilatero Ferrifero soil…………………………………………. 467
Production and purification of ligninolytic enzymes by Mucor racemosus CBMAI 847…………………………….. 468
Temperature influence on lipase activity of Trichoderma harzianum immobilized on Celite………………………... 469
Optimization of β-glucanase production using wastewater from the pulp industry………………………………….. 470
Oleyl oleate synthesis by lipase from Burkholderia lata LBBIO-BL02………………………………………………. 471
Comparison of the fumigation-extraction and radiation-extraction methods in the evaluation of microbial biomass C
in cave soil……………………………………………………………………………………………………………... 472
Marker assisted selection for Pseudocercospora griseola resistance in common beans……………………………… 473
Amino acid supplementation under industrial yeast on sugarcane bagasse hydrolysate……………………………… 474
Time-course proteomics during Aspergillus nidulans growth on pre-treated sugarcane bagasse and straw………….. 475
Endoglucanase activity in digestive organs content of Teredinidae…………………………………………………… 476
Evaluation of riboswitch theo/metE for gene silencing in Xanthomonas citri………………………………………… 477
Evaluation of the use of commercial biomass for the treatment of wastewater of a sugar and alcohol industry……… 478
New hydrazones: Promising compounds against Mycobacterium tuberculosis………………………………………. 479
Preliminary test for kinetic study of fermentative processes of lactic acid producing Metschnikovia koreensis G18... 480
The influence of edible fungi in the total and digestible protein using agro-industrial wastes as substrate…………... 481
Production of extracellular biosurfactant/bioemulsifier among heavy-metal tolerant bacteria……………………….. 482
Antimicrobial/antioxidant activity of spices used in shrimp preparation……………………………………………… 483
Evaluation of bioactivity of essential oils and hydrolates in control of Alternaria sp, phytopathogenic fungus
isolated from tomato plants……………………………………………………………………………………………. 484
Experimental validation of an in silico approach for prediction of new thermostable GH11 endo-xylanases………... 485
Isolation of Bisphenol A degrading bacteria from an estuarine environment…………………………………………. 486
Evaluation of Basidiomycetes secretomes in order to search for new active carbohydrate esterases…………………. 487
Genome features of Serratia marcescens UENF 22-GI: a plant growth promoting bacterium isolated from
vermicomposted material……………………………………………………………………………………………… 488
Evaluation of the anti-bacterial activity of vegetable oil esters against Xanthomonas citri subsp. citri……………… 489
Ethanol fermentation of fungal extract by solid-state cultivation of Trichoderma reesei from sugarcane bagasse…... 490
Methodological adequacy to evaluate the reaction of common bean cultivars to Pseudocercospora griseola……… 491
Construction of an ultrasensitive arsenic biosensor through synthetic biology approaches…………………………... 492
Growth and stability of immobilized Desmodesmus subspicatus in alginate beads for cultivation in vinasse……… 493
Trophic and microbiological conditions of an artificial receiving system for aquaculture wastes…………………… 494
Poison and infections food caused by microbial agents……………………………………………………………….. 495
Oxygen transfer in heterotrophic cultivation of unicellular and filamentous cyanobacterium from vinasse………….. 496
Microorganism isolation for enzymatic activity verification as a form of waste industry process……………………. 497
Use of MALDI-TOF mass spectrometry for bacteria identification present in composting…………………………... 498
Use of waste coffee processing for carotenoids production…………………………………………………………… 499
Production of extracellular hydrolases and of bioflocculant of Bacillus thurigiensis-BDLJ2………………………… 500
Rosemary on polymicrobial biofilms of Candida albicans and Streptococcus mutans……………………………….. 501
Electrolytic Treatment of a Simulated Textile Effluent and Toxicology Bioassay with Saccharomyces cerevisiae…. 502
Fermentative parameters in Saccharomyces cerevisiae……………………………………………………………… 503
Biological treatment with microorganisms to reduce phytotoxicity of agroindustrial wastewater…………………… 504
Production and studies of blended enzymatic cocktails for sugarcane bagasse saccharification……………………… 505
Cultivation of fungus Pleurotus ostreatus (shimeji) in term hydrolyzed sugarcane bagasse…………………………. 506
Determination of the Minimum Inhibitory Concentration of compounds belonging to the class N-acylidranzones
and their respective Silver(I) complexes against Mycobacterium tuberculosis……………………………………….. 507
Evaluation of the structure and antibiotic activity of fluorophore-labeled mastoparan Polybia-MPII……………… 508
Use of MALDI-TOF for wastewater fungi identification…………………………………………………………… 509
Effect of rosemary (Rosmarinus officinalis L.) extract on polymicrobial biofilm of Candida albicans and
Enterococcus faecalis………………………………………………………………………………………………….. 510
Xylanase production by Rhizoctonia solani AG-1 IA isolated from bracharya, soybean and rice crop………………. 511
Biotic and abiotic assessment of a wetland in a frog pond effluent…………………………………………………… 512
Filamentous fungi diversity in Syrah grapes variety from Jequitinhonha Valley……………………………………... 513
Production of fungal β-1,3-glucanase using vinasse………………………………………………………………….. 514
Maintaining Escovopsis cultures in three preservation methods………………………………………………………. 515
Antifungal potential of compounds produced by actinobacteria………………………………………………………. 516
Obtention of Fuji apple cutin and qualitative screening for filamentous fungi cutinase producers…………………… 517
Bioprospecting of thermophilic fungi and producing enzymes for saccharification of lignocellulosic biomass……… 518
Microorganisms isolated from solid residue of olive oil production………………………………………………….. 519
Influence of different N-glycans in carbohydrate active enzymes secretion, folding and functional activity………… 520
Systemic infection by Candida spp. and its tropism to the central nervous system in a murine model………………. 521
Aspergillus nidulans as a platform for recombinant production of cellulases and oxidative enzymes for biomass
degradation…………………………………………………………………………………………………………...... 522
Influence of growth temperature on the antimicrobial activity of eugenol and thymol against Staphylococcus aureus 523
tris-(1,10-phenanthroline) iron(II): drug repositioning in the treatment of Tuberculosis……………………………... 524
Ochratoxigenic fungi isolated from different agricultural products belonging to the EPAMIG-URESM and
CCDCA-UFLA cultural collections…………………………………………………………………………………… 525
Growth of xylose fermenters S. cerevisiae in sugarcane bagasse hydrolyzed………………………………………… 526
Different concepts for identification of species within Fusarium fujikuroi complex associated with Pokkah boeng
of sugarcane……………………………………………………………………………………………………………. 527
Sediment profile influences on methane cycle communities in Amazonian wetlands………………………………… 528
Diversity of filamentous fungi in the south of Minas Gerais vineyards……………………………………………….. 529
Archaeal, bacterial and fungal responses to vinasse and nitrogen application to the sugarcane soil………………….. 530
Comparative analysis of the action of the adsorbents hydrotalcite, Moringa oleifera and activated carbon in the
treatment of landfill leachate…………………………………………………………………………………………. 531
Extraction of a yeast lipase from Antarctic environment using Aqueous Two-Phase System……………………… 532
Sensory analysis of fermented beverages from different yeasts……………………………………………………….. 533
Prospecting of yeast of biotechnological interest from residual activated sludge……………………………………... 534
Biodegradation of perfluorinated compounds and their impact in soil microbiota compared to plant toxicity datasets 535
Novel Biotechnological Spray Formulation for Fungi and Bacteria control………………………………………….. 536
Fungal strains identification for gold nanoparticles biosynthesis……………………………………………………... 537
Production and Evaluation of the Activity of Chitinase by Trichoderma reesei and Penicillium simplicissimum…… 538
Diversity and ligninolytic activity of fungi from regions with different states of conservation of the Iguazu National
Park…………………………………………………………………………………………………………………….. 539
Selection of fungi for xylanase production……………………………………………………………………………. 540
Isolation and identification of yeasts in homemade frescal minas cheese…………………………………………….. 541
Taxonomic assessment and antimicrobial screening of isolated bacteria from marine and terrestrial Antarctic
samples………………………………………………………………………………………………………………… 542
Comparison between culture media submitted with different microorganisms by the ecometric test………………… 543
Microbiological evaluation of leafy vegetables produced by organic and conventional farming systems……………. 544
Liquid agroindustrial waste in production of cellulase………………………………………………………………... 545
Produção de lipase por Yarrowia lipolytica utilizando resíduo
de manga
Adejanildo da Silva Pereira1, Gizele Cardozo Fontes2, Priscilla Filomena Fonseca Amaral1

1
Departamento de Engenharia Bioquímica, Escola de Química – Universidade Federal do Rio de Janeiro
*e-mail: [email protected]
2
Departamento de Tecnologia de Processos Bioquímicos– Universidade Estadual do Rio de Janeiro

______________________________________________________________________
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar a produção de lipase por Yarrowia lipolytica,
utilizando o tegumento fibroso do resíduo do processamento da manga variedade Ubá,
suplementado com diferentes fontes de nitrogênio. A fermentação foi realizada em meio
cultivo submerso, sendo este suplementado com ureia, cloreto de amônio, sulfato de
amônio, extrato de levedura, triptona de soja, triptona T1, milhocina, peptona e extrato
de levedura/peptona, todos na concentração de 2 g/L. Os resultados evidenciaram que o
emprego de meios suplementados com extrato de levedura, peptona e triptona T1
apresentam potencial para a produção de lipase extracelular, apresentando uma
atividade máxima 3412, 1490 e 1142 U/L respectivamente. O emprego dos demais
meios de cultivo não se mostraram eficazes na produção da enzima de interesse.
Portanto, o tegumento fibroso da manga variedade Ubá suplementado com fontes de
nitrogênio pode ser uma alternativa para a produção de lipase extracelular.

Palavras-chave: Bioprocesso; nitrogênio; levedura; enzima.

______________________________________________________________________
Production of lipase by Yarrowia lipolytica using mango
residue
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate lipase production by Yarrowia lipolytica,
using the fibrous tegument of the residue of the Ubá mango variety, supplemented with
different nitrogen sources. The fermentation was carried out in a submerged culture
medium, supplemented with urea, ammonium chloride, ammonium sulfate, yeast
extract, tryptone from soybean, tryptone T1, corncine, peptone or yeast extract /
peptone, all at the concentration of 2 g / L. The results evidenced that the use of media
supplemented with yeast extract, peptone and tryptone T1 present a potential for the
production of extracellular lipase, presenting a maximum activity of 3412, 1490 and
1142 U / L respectively. The use of the other culture media did not prove effective in
the production of the enzyme of interest. Therefore, the fibrous tegument of the Ubá
mango variety supplemented with nitrogen sources may be an alternative for the
production of extracellular lipase.
Keywords: Bioprocess; nitrogen sources; yeast; enzyme.
___________________________________________________________________

1
INTRODUÇÃO
Lipases são enzimas hidrolíticas, que têm como principal função realizar a
hidrólise de óleos e gorduras liberando ácidos graxos, diacilgliceróis, monoacilgliceróis
e glicerol (JAEGER & REETZ, 1998). Estas são enzimas de grande aplicação, tanto em
nível industrial (indústria alimentícia, de cosméticos e perfumes, biomédica, pesticidas,
detergentes, entre outras) como no acadêmico (BREUER et al., 2004).
As lipases podem ser de origem vegetal, animal ou microbiana. Os
microrganismos como as bactérias e fungos, são reconhecidos como bons produtores de
lipase extracelular (TREICHEL et al., 2010). Dentre os fungos a espécie da levedura
Yarrowia lipolytica possui grande potencial para ser usada na produção destas enzimas.
A utilização de resíduos agroindustriais como substrato para a produção de
bioprodutos, como enzimas, tem sido bastante estudada, pois esta é uma alternativa que
contribui para a redução dos custos dos bioprocessos e também agrega valor a esses
materiais. Entre os resíduos gerados pelas indústrias alimentícias está o resíduo da
manga, o qual pode ser uma importante matéria-prima para ser empregada como meio
de cultura para o crescimento celular e produção de lipases.
Portanto, neste trabalho, objetivou-se a produção de lipases por fermentação
submersa a partir da cepa Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682, utilizando como matéria-
prima o tegumento fibroso do resíduo industrial da manga Variedade Ubá.

MATERIAL E MÉTODOS
Matéria-prima

O resíduo agroindustrial da manga foi fornecido pela Tial – Tropical Indústria de

Alimentos S/A e utilizado como matéria-prima nas fermentações. O material foi
previamente seco e seus componentes separados manualmente (casca, tegumento
fibroso e amêndoa). O tegumento fibroso, matéria-prima empregada neste estudo, foi
posteriormente moído e peneirado em peneira com tamanho de partícula menor que
0,80 mm. Após estes procedimentos os mesmos foram embalados em sacos de
polietileno até o momento de serem empregados.

Preparação do Inóculo

Foi utilizada a levedura Y. lipolytica IMUFRJ 50682, isolada da Baía de

Guanabara, estocada em meio YPD contendo ágar (1% extrato de lêvedo, 2% peptona,
2%glicose) a temperatura de 4°C. O pré-inóculo foi realizado em erlenmeyer de 1000
2
mL contendo 400 mL de meio YPD, agitado em shaker a 160 rpm, 28°C por 72h. A
densidade óptica (570 nm) de uma amostra deste cultivo foi determinada visando
encontrar a concentração inicial células por meio da curva de peso seco; em seguida as
células foram centrifugadas em tubos falcon de 50 ml a 3000 rpm por 5 minutos e
adicionadas ao meio de produção.

Produção de lipase

O processo fermentativo foi realizado em meio cultivo submerso. Este foi

conduzido em erlenmeyer de 500 mL contendo 200 mL meio fermentativo, os quais
foram mantidos em shaker a 160 rpm a 28°C durante 20 horas. O meio fermentativo foi
suplementado com diferentes fontes de nitrogênio na concentração de 2 g/L. Ureia,
cloreto de amônio, sulfato de amônio, extrato de levedura, triptona de soja, triptona T1,
milhocina, peptona e extrato de levedura/peptona foram as fontes investigadas. Após 20
h de cultivo alíquotas de 20 ml foram retiradas e centrifugadas a 4°C, 3000 rpm durante
5 minutos, sendo o sobrenadante recolhido e congelado para a avaliação da lipase
extracelular.

Avaliação da Atividade da Lipase

A atividade da lipase foi estimada mediante a variação da absorbância a 410 nm

em espectrofotômetro, devido à oxidação do p-nitrofenil laurato (p-NFL) com uma
concentração de 0,162 mg.mL-1 em tampão fosfato de potássio (0,05 M), pH 7,0
(PEREIRA & MEIRELLES, 1997).

Análises estatísticas

A avaliação dos dados obtidos neste experimento foi realizada por meio da
análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey a 5% de significância, utilizando o
software Statistica® versão 7.0.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em estudos anteriores realizados por Pereira et al. (2016) não foi detectada produção de
lipase extracelular quando se empregou o resíduo total da manga e suas combinações,
sendo observado atividade lipásica apenas quando se utilizou o tegumento fibroso como
matéria-prima. Assim, nesse estudo foram realizados experimentos com tegumento
fibroso da manga suplementado com diferentes fontes de nitrogênio. Os dados obtidos
foram submetidos a Análise de Variância (ANOVA) (Tabela 1).

3
Tabela 1 – Resultado da ANOVA para a atividade lipásica obtida para o cultivo com o
tegumento fibroso da manga suplementado com diferentes fontes de nitrogênio
FV GL SQ QM F p
Fonte de Nitrogênio 8 19628641 2453580 410,863 0,000000
Resíduo 9 53746 5972
Total 17 19682387 2459552
GL = Graus de liberdade; SQ = Soma de Quadrados; QM = Quadrado Médio; F = Teste de
Fisher, p = probabilidade.
Observando a Tabela 1 verifica-se que as fontes de nitrogênio foram
significativas (P<0,05). Assim, realizou-se um teste de Tukey para identificar as
diferenças entre as médias das atividades lipásicas obtidas com as fontes de nitrogênio
(Figura 2).

Figura 2 – Atividade da lipase em meio de cultivo contendo o tegumento fibroso da

manga variedade Ubá suplementada com diferentes fontes de nitrogênio com 20 horas
de fermentação.
Nota: Médias seguidas de pelo menos uma mesma letra minúscula não diferem entre si a 5% de
significância pelo teste de Tukey.
Observa-se que a melhor fonte de nitrogênio foi o extrato de levedura,
apresentado uma atividade máxima de 3412 U/L após as 20 horas de fermentação. O
extrato de levedura é eficiente na produção de lipases, pois além de ser uma fonte de
nitrogênio é também uma boa fonte de vitaminas (Li et al., 2004). Galvagno et al.
(2011) também obtiveram aumento na produtividade de lipase ao usar o extrato de
levedura. Fickers et al. (2006) observaram uma atividade máxima de 1118 U/mL
utilizando 3% de extrato de levedura, 3% de soro de leite, 1,5% de glicose e 0,5% de
azeite de oliva.

4
 Depois do extrato de lêvedo, as maiores atividades foram quando se empregou
peptona bacteriológica ou triptona T1, observando-se valores máximos de 1490 e 1142
U/L, respectivamente. No entanto, a combinação de extrato de lêvedo e peptona não
favoreceu a produção de lipase. Rajendran e Viruthagiri (2007) utilizaram peptona
como fonte de nitrogênio e observaram o aumento da atividade com o incremento da
concentração de peptona. A utilização da ureia, do sulfato de amônio, do cloreto de
amônio e da milhocina não foram eficientes para a produção da lipase. Pereira-Meirelles
et al. (1997) também encontraram valores baixos para a atividade da lipase quando a
ureia foi utilizada.

CONCLUSÕES
Os resultados do presente estudo indicaram que o extrato de levedura foi a fonte
de nitrogênio que mostrou maior potencial em aumentar a produção da lipase
extracelular, apresentando uma produção máxima de 3412 U/L. O uso da peptona ou da
triptona também aumentou consideravelmente a produção, observando-se valores
máximos de 1490 e 1142 U/L respectivamente. A ureia, o sulfato de amônio, o cloreto
de amônio, a milhocina e a mistura extrato de levedura/peptona não apresentaram
potencialidade de aplicação neste estudo. Portanto, pode se concluir o resíduo do
tegumento fibroso da manga variedade Ubá apresenta-se como uma alternativa para a
produção de lipase extracelular pela levedura Yarrowia lipolytica.

AGRADECIMENTO
Os autores agradecem a FAPERJ pelo apoio financeiro no desenvolvimento do
trabalho.

REFERÊNCIAS
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STURMER, R., ZELINSKI, T., BROCKMAN, H. L., BORGSTROM, B., 2004.
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Production and down-stream processing of an extracellular lipase from the yeast

5
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GALVAGNO, M.A., IANNONE, L.J., BIANCHI, J., KRONBERG F., ROST, E.,
CARSTENS, M.R., CERRUTTI, P.P., 2011. Optimization of biomass production of a
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Acinetobacter radioresistens using Tween 80 as the carbon source. Biochemical
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PEREIRA, A.S., FONTES, G.C., AMARAL P.F. F., 2016. Produção de lipase por
Yarrowia lipolytica a partir do resíduo do processamento agroindustrial da manga
(Mangifera indica l. var ubá), suplementado com diferentes fontes de nitrogênio.
In Anais do XXV Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos - CBCTA.
Gramado: SBCTA Regional.

PEREIRA-MEIRELLES, F.V., ROCHA-LEÃO, M.H. E SANT’ANNA, G.L., 1987. “A

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196. http://dx.doi.org/10.1007 / s11947-009-0202-2.

6
 Triagem e identificação de microrganismos isolados do tubo
intestinal de Culex quinquefasciatus
Adriano Guimaraes Parreira1,2; José Márcio Gomes Fernandes1 Stenio Nunes Alves 2 Eduardo José
Azevedo Correa3

*[email protected] (autor para correspondência):

1
UEMG-Unidade Divinópolis MG.
2
UFSJ-CCO
3
EPAMIG- Pitangui MG
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Mosquitos são insetos dípteros pertencentes à família Culicidae e em grande parte
hematófagos. Dos gêneros dessa família, Culex e Aedes tem grande importância
sanitária no Brasil. Estão presentes em todo território nacional e, na tentativa de
combatê-los, buscam-se novas alternativas tendo em vista relatos de resistência aos
inseticidas tradicionalmente empregados. Uma das possibilidades de controle da
infestação e transmissão de doenças seria por meio de controle biológico, com o
emprego de bactérias endosimbiontes presentes na microbiota intestinal dos insetos e
capazes de bloquear a transmissão de vírus diversos. Com base nestas considerações, o
presente projeto buscou identificar espécies bacterianas cultiváveis presentes no tubo
intestinal de espécimes de Culex quinquefasiatus assim como avaliar os efeitos de
inseticidas comumente utilizados sobre as bactérias residentes. Para tal, foram montadas
cubas ao ar livre para a obtenção de larvas de Culex e mosquitos adultos. Em seguida, as
larvas e mosquitos tiveram seu trato intestinal assepticamente retirado e o material
triturado e plaqueado em meio BHI a fim de se obter culturas bacterianas para
identificação a nível de espécie. Foram identificadas várias espécies de bactérias
empregando-se espectrometria de massas sendo que a maioria delas não apresenta
relatos na literatura quanto a sua presença e colonização do trato intestinal de espécimes
do gênero Culex além de provados os efeitos danosos do uso do inseticida temefós
sobre a micobiota naturalmente encontrada em insetos daquele gênero.

Palavras-chave: Microbiota, intestino, Culicidae, controle biológico.

______________________________________________________________________________________________

Screening and identification of microorganisms isolated from

the intestinal tube of Culex quinquefasciatus
ABSTRACT
Mosquitoes are dipterous insects belonging to the Culicidae family and largely
hematophagous. Of the genera of this family, Culex and Aedes have great sanitary
importance in Brazil. They are present throughout the national territory and, in an
attempt to combat them, new alternatives are sought in view of reports of resistance to
insecticides traditionally employed. One of the possibilities of control of infestation and
transmission of diseases would be through biological control, with the use of
endosymbionts bacteria present in the intestinal microbiota of insects and capable of
blocking the transmission of various viruses. Based on these considerations, the present

7
project aimed to identify cultivable bacterial species present in the intestinal tube of
specimens of Culex quinquefasiatus as well as to evaluate the effects of commonly used
insecticides on resident bacteria. For this, vats were set up outdoors to obtain Culex
larvae and adult mosquitoes. Then, the larvae and mosquitoes had their intestinal tract
aseptically removed and the material crushed and plated on BHI medium in order to
obtain bacterial cultures for identification at the species level. Several species of
bacteria were identified using mass spectrometry and most of them do not present
reports in the literature regarding their presence and colonization of the intestinal tract
of specimens of the genus Culex, besides proving the harmful effects of the use of the
insecticide temefós on the mycobiota Naturally found in insects of that genus.
Keywords: Microbiota, intestine, Culicidae, biological control.
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Mosquitos são insetos dípteros pertencentes à família Culicidae, conhecidos
também como pernilongos, muriçocas ou carapanãs, adultos são alados, possuem pernas
e antenas longas e na sua grande maioria são hematófagos. Entre os Culicidae
encontramos a maior subfamília, Culicinae, com cerca de 3000 espécies divididas em 10
tribos que reúnem 34 gêneros. Destes, os gêneros Culex e Aedes tem grande importância
sanitária no Brasil, sendo o último vetor relacionado a transmissão da dengue, febre
amarela chikungunya e zika virus (TSETSARKINT et al, 2014), enquanto Culex
relaciona-se a transmissão da filariose, ainda comum em diversas partes do globo. Estão
presentes em todo o território nacional, são antropofílicos, tendo, portanto, especial
preferência pelo sangue humano. As fêmeas picam seus hospedeiros no intradomicílio e
no peridomicílio ao entardecer e ao amanhecer, podendo agir a noite ou qualquer hora
do dia, sendo considerado mosquito oportunista (IOC/FIOCRUZ, 2016). Em 2015 o
ministério da saúde confirmou a circulação do zika vírus em algumas regiões do Brasil,
no dia 1o de fevereiro de 2016, a OMS declarou situação internacional de emergência
em saúde pública em razão do aumento de casos de infecção pelo zika vírus em diversos
países e de uma possível relação da doença com quadros registrados de malformação
congênita e síndromes neurológicas (BRASIL, 2016). Na tentativa de combatê-los, a
indústria química vem investindo na busca de novos produtos, pois existem relatos de
vários casos de resistência aos empregados atualmente para controle de espécimes de C.
quinquefasciatus e A. aegypti (SUAREZ et al., 1996). Atualmente, uma alternativa que
vem merecendo atenção refere-se ao controle biológico de A. aegypti com o emprego de
bactérias endosimbiontes, presentes na microbiota intestinal de diversos insetos,
podendo causar infecções ou bloquear a transmissão de alguns vírus (WALKER et al,
2011). Desse modo, é de extrema importância o conhecimento da microbiota do tubo

8
digestivo dos artrópodes, em especial aqueles da família Culicidae, a fim de se
promover estudos mais detalhados acerca das principais espécies de micro-organismos
presentes e suas possíveis potencialidades quanto ao controle biológico relacionado a
proliferação dos vetores. Com base no que foi exposto, o presente trabalho buscou
realizar a triagem, cultivo e identificação de microrganismos cultiváveis isolados do
trato intestinal de espécimes de C. quinquefasciatus assim como avaliar os efeitos do
uso do inseticida tradicional temefós sobre a microbiota residente de espécimes daquela
espécie.
MATERIAL E MÉTODOS
Obtenção e manutenção dos espécimes de C. quinquefasciatus
Para a obtenção dos espécimes de C. quinquefasciatus presentes em campo
foram empregados: cubas plásticas (50 X 40 X 25cm) contendo 25 L de água
deionizada e 200g de ração, rotineiramente utilizada para a alimentação de
camundongos (Labina - Purina®). As larvas de C. quinquefasciatus foram obtidas de
criadouro semi- natural da Universidade Federal de São João Del Rei - Campus Centro-
Oeste Dona Lindu em Divinópolis, MG. As cubas que continham ovos eram
periodicamente levadas ao insetário da UFSJ-CCO e lá deixadas sob condições de
temperatura e umidade controladas, até a eclosão dos mesmos.
Obtenção dos tubos intestinais e isolamentos microbianos
Larvas de C. quinquefasciatus de 3 e 4 instar, obtidas a partir da eclosão dos
ovos, foram coletadas e levadas para a extração dos tubos intestinais. Outras larvas
foram deixadas na cuba, e aguardou- se que as mesmas se tornassem insetos adultos e,
com isso, sendo levadas posteriormente para a extração do trato intestinal. Os tubos
eram retirados e depositados em Eppendorfs contendo solução PBS e armazenados sob
refrigeração para posterior utilização. Volumes de 10 μL da solução contendo os tubos
macerados foram pipetados em placas de petri contendo meio BHI, empregando-se a
técnica de spread-plate. Feito isso, eram levadas até estufa bacteriológica mantida a
37oC e incubadas por até 24 horas, com vistas a obtenção das colônias em placas. Após
o crescimento eram feitos repiques com vistas a obtenção de culturas puras, A partir de
então a foram executados procedimentos de caracterização bioquímica empregando-se
testes IMVic. Colônias mais comuns eram selecionadas identificação em nível de
espécie por espectrometria de massas, conforme Muniaraj et al. (2012). Experimentos
adicionais foram executados buscando avaliar o efeito do inseticida temefós sobre a
microbiota intestinal dos insetos. Foi promovida a exposição das larvas selecionadas ao

9
inseticida em intervalos de 24 a 72h, seguindo-se os mesmos procedimentos de
isolamento dos tubos digestivos, inoculações e incubações descritos anteriormente. A
concentração do inseticida comumente empregada e utilizada nos experimentos foi de
1,2 μL.L-1, com vistas a manutenção de condições assépticas durante as manipulações
foram seguidos os procedimentos descritos por Jarusevicius (2013). A dissecção foi
realizada com auxílio de protocolo padrão (COLEMAN et al, 2007) empregando-se um
microscópio estereoscópico Stemi DV4 (Carls Zeiss).

RESULTADOS E DISCUSSÃO
No que se refere aos experimentos de isolamento e identificação dos micro-
organismos encontrados no trato intestinal de larvas e insetos adultos de C.
quinquefasciatus, foi possível observar considerável diversidade de espécies bacterianas
cultiváveis. As colônias que apresentavam diferenças demostradas por características
bioquímicas reveladas pelos testes IMVic foram identificadas a nível de espécie por
espectrometria de massas. Observou-se um total de seis espécies bacterianas diferentes a
partir dos isolados selecionados. Importante ressaltar que tais microrganismos foram
isolados tanto do trato intestinal de adultos quanto de larvas de C. quinquefasciatus. Das
várias espécies encontradas, Bacillus safensis é relatada como uma potente promotora
do crescimento em plantas (Kothari et al., 2013), embora, na literatura não são
encontrados relatos de patogenicidade em humanos. Já Corynebacterium amycolatum é
descrita como causadora de septicemia, peritonite, endocardite e mastite em humanos e
outros animais (ANVISA, 2013). Sphingobacterium multivorum, por sua vez, raramente
está associada a infecções em humanos, embora pacientes com lesões graves possam
apresentar infecção respiratória causada por esta espécie (LAMBIASE et al, 2009).
Aeromonas hydrophila apresenta atividade citotóxica (KHAJANCHI et al, 2010) o que
pode ocasionar patogenia em humanos. Curtobacterium albidum e Microbacterium
oxydans não apresentam relatos na literatura que as relacionam com doenças em
animais. Não foram encontrados estudos ou relatos na literatura a respeito da presença
das espécies bacterianas aqui identificadas no trato digestivo de membros da família
Culicidae sendo, portanto, a primeira descrição de tais espécies bacterianas isoladas
daquele ambiente. Do experimento realizado com larvas expostas ao inseticida Temefós,
em diferentes intervalos de tempo, vale ressaltar que apenas as larvas do tratamento
controle permaneceram viáveis. As larvas do Teste 1 (24 horas após), Teste 2 (48 horas
após) e Teste 3 (72 horas após a exposição ao inseticida) morreram após os intervalos de

10
exposição, porém, foi possível identificar 4 tipos diferentes de espécies bacterianas.
Para os tratamentos T2 e T3, no entanto, foram encontradas as mesmas espécies de
bactérias, ou seja, após a exposição ao inseticida a partir de 48h prevalecem as espécies
encontradas a partir daquele intervalo de exposição. O tratamento Controle 1 revelou o
predomínio de bactérias identificadas como Serratia fonticola, relatada na literatura
como um patógeno incomum em seres humanos (ALJORAYID et al, 2016). Já para o
Controle 2 foram encontradas bactérias da espécie Raoultella ornithinolytica que,
segundo a literatura, pode representar um agente infeccioso em casos raros,
principalmente em pacientes com lesões graves (KAYA et al, 2015). Em T1, foram
encontradas bactérias da espécie Pseudomonas mosseli, isenta de relatos que envolvem
importância clínica. Em T2 e T3 observou-se, por sua vez, predomínio da espécie
Aeromonas hydrophila, já relatada anteriormente, e encontrada com frequência no tubo
digestivo de insetos adultos não expostos ao inseticida Temefós. De igual maneira, não
são encontrados relatos na literatura que fazem menção ao efeito do inseticida Temefós
sobre a microbiota cultivável do tubo digestivo de espécimes de C. quinquefasciatus,
sendo este trabalho um primeiro relato relacionado.
CONCLUSÕES
Por meio deste trabalho foi possível identificar espécies bacterianas cultiváveis,
isoladas de tubos digestivos de larvas e insetos adultos de C. quinquefasciatus, até então
não descritas na literatura, assim como o efeito do inseticida comumente utilizado, o
organofosforado Temefós, sobre a microbiota que habita o trato intestinal de C.
quinquefasciatus. Faz-se necessário, contudo, estudos complementares a fim de se
avaliar o efeito do inseticida em intervalos de tempo menores, assim como ampliar os
estudos para isolamentos em espécimes de A. aegypti.
AGRADECIMENTOS
À UEMG-Unidade Divinópolis MG e a UFSJ-Campus CCO.
REFERÊNCIAS
ALJORAYID, A.; VIAU, R.; CASTELLINO, L.; JUMP, R. L.P. Serratia fonticola, pathogen or
bystander? A case series and review of the literature doi: 10.1016/j.idcr.2016.05.003, 2016.
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2016.

11
FORATINI, O. P. Culicidologia Médica. Vol. 2. Edusp. São Paulo, 2002.
JARUSEVICIUS, J. Análise microbiológica da flora intestinal do mosquito Aedes aegypti
através do sequenciamento do gene 16S rRNA na plataforma Illumina MiSeq. 2013. 36 f.
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título de Bacharel em Ciências Biomédicas. Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita
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KAYA, S.; BAYRAMOGLU, G.; SÖNMEZ, M.; KÖKSAL, I. Raoultella ornithinolytica
causing fatal sepsis. Braz J Infect Dis, vol. 19, n 2. Salvador, 2015.
KHAJANCHI, B. K.; FADL, A. A.; BORCHARDT, M. A.; BERG, R. L.; HORNEMAN, A. J.;
STEMPER, M. E.; JOSEPH, S. W.; MOYER, N. P.; SHA, J; CHOPRA, A. K. Distribution of
virulence factors and molecular fingerprinting of Aeromonas species isolates from water and
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KOTHARI W, KOTHARI RK, KOTHA CR, BHATT VD, NATHANI NM, KORINGA PG,
JOSHI CG, VYAS. Genome sequence of salt-tolerance Bacillus safensis strain VK, isolated
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LAMBIASE, A.; ROSSANO, F.; PEZZO, M. D., RAIA, V.; SEPE, ANGELA; GREGORIO, F.;
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MAZZARRI, M.B.; GEORGHIUOU, G.P. Caracterization of resistance to organophosphate,
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COLEMAN, J. et al. Dissection of Midgut and Salivary Glands from A. aegypti
Mosquitoes. J. Vis. Exp. v. 5, 2007.

12
Utilização de Planejamento Fatorial para variação metabólica
de Annulohypoxylon stygium.
Alana Evangelista Honório1*; Alan Cesar Pilon1; Dulce Helena Siqueira Silva1
1
Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) – Instituto de
Química, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. *e-mail: ([email protected])
______________________________________________________________________
RESUMO
A busca por substâncias bioativas tem impulsionado estudos em novas fontes naturais
até então inexploradas, como os organismos marinhos, fungos, entre outros. Neste
sentido, os micro-organismos, em especial, aqueles obtidos a partir de organismos
marinhos têm desempenhado um papel importante na produção de metabólitos com
esqueletos moleculares inéditos de alta diversidade estrutural e com um grande
potencial terapêutico. Dentro deste contexto, este estudo visa estabelecer, através de
ferramentas quimiométricas (Planejamento Fatorial 23), quais condições de cultivo
fornecem as maiores quantidades, em massa, de extrato do fungo endofítico
Annulohypoxylon stygium isolado da alga vermelha Acanthofera spicifera e como estas
variações podem afetar a diversidade química de seus metabólitos secundários. O uso
desta abordagem visa facilitar o desenvolvimento das etapas subsequentes de
isolamento de novos compostos bioativos, além de contribuir com o avanço nos estudos
da química de micro-organismos associados as espécies marinhas.
Palavras-chave: fungo endofítico, alga vermelha, Acanthophora spicifera,
anticolinesterásica.
____________________________________________________________________
Use of design of experiments for evaluation of the metabolic production from
endophyte Annulohypoxylon stygium.

ABSTRACT
The search for bioactive products has impulsed studies in new natural sources until then
unexplored, such as marine organisms, fungus, among others. In this sense,
microorganisms, especially those obtained from marine organisms, have played an
important role in the production of metabolites with novel molecular skeletons of high
structural diversity and with great therapeutic potential. In this context, this study aims
to establish, through chemometric tools (Factorial Planning 23), which cultivation
conditions provide as the largest mass of extract of Endophytic fungus Annulohypoxylon
stygium isolated from red algae Acanthofera spicifera and how these variations can
affect the chemical diversity of its secondary metabolites. The use of this approach aims
to facilitate the development of subsequent stages of isolation of new bioactive
compounds, as well as contribute to the chemical studies of associated microorganisms
as marine species.
Keywords: Endophytic fungus, red algae, Acanthophora spicifera, anticholinesterase.

13
INTRODUÇÃO
Nas últimas duas décadas os estudos com organismos marinhos tem recebido um
crescente destaque motivado, principalmente, pela alta diversidade estrutural de seus
quimiotipos, incluindo compostos halogenados, sulfonados e nitrogenados assim como
sua ampla variedade de efeitos terapêuticos associados a propriedades antioxidantes,
anti-inflamatórias, antimicrobianas e antitumorais (Pilon et al., 2016). A cytarabina e a
trabectedina são exemplos de promissores agentes anticâncer oriundos dos produtos
marinhos (Pilon et al., 2016).
O estudo de algas marinhas é de suma importância, pois garante oportunidades de
isolamento de organismos endêmicos incluindo novos gêneros e espécies. Dentro deste
contexto este trabalho visou o estudo do perfil químico da alga vermelha Acanthophora
spicifera, uma das espécies mais abundantes no litoral brasileiro, com propriedades
biológicas associadas a atividade antitumoral e antimicrobiana contra Staphylococcus
aureus e Escherichia coli (Muthuraman et al., 2014). Até o momento, foram isolados
nove fungos endofíticos que se encontram em fase de estudo químico e biológico.
Esses micro-organismos apresentam grande importância na pesquisa de produtos
naturais, não apenas pela ampla gama de metabólitos secundários produzidos, mas
também, pela sustentabilidade associada à produção de matéria prima em larga escala
através de processos fermentativos (Costa-Lotufo et al., 2009) e a manipulação de suas
condições de cultivo (tempo, pH, nutrientes, temperatura e aeração) que podem ser
modificadas, a fim de aumentar ou direcionar a produção de metabólitos de interesse
(Aly et al., 2011).
Afim de explorar toda a maquinaria genética diversos métodos tem sido aplicados
aos estudos dos perfis metabólicos de micro-organismos, como por exemplo, o uso de
ferramentas quimiométricas como o planejamento experimental (do inglês DOE, Design
of Experiments), que torna possível extrair em alta reprodutibilidade uma grande
quantidade de informações com um número mínimo de experimentos, permitindo
estimar todas as possíveis interações e predizer condições otimizadas através de
modelos de regressão (Pilon et al., 2016).
Dentre os diversos tipos de planejamento experimental, destacam-se os sistemas
de planejamento fatorial, pois permitem avaliar simultaneamente o efeito de um grande
número de variáveis a partir de um número reduzido de ensaios experimentais quando

14
comparados aos processos univariados, podendo ter várias respostas de interesse, que
talvez precisem ser consideradas simultaneamente (Peralta-Zamora et al., 2005).
No presente trabalho foi aplicado um planejamento fatorial para o fungo
endofítico Annulohypoxylon stygium pertencente à família Xilareaceae (Ascomycota)
associado a alga vermelha A. spicifera, afim de avaliar como a variação do pH, tempo
de crescimento e tipo de água afetam sinergicamente a produção em massa e a
diversidade de química de seus componentes.

MATERIAL E MÉTODOS
O endófito foi preservado em slants e posteriormente repicado para placas de Petri
contendo PDA e incubada por dez dias a 25oC, a fim de se obter maior massa micelar.
Foram utilizados Erlenmeyers de 500 mL (5 cm diâmetro) contendo 200 mL de
meio de cultivo, para uma maior aeração do sistema e assim auxiliar o processo de
crescimento. Para o planejamento experimental foi aplicado um fatorial 23 com 5 pontos
centrais. As variáveis escolhidas para realização dos experimentos foram: meio de
cultivo Czapeck e Extrato de Malte e, para os planejamentos foram avaliados: pH, tipo
de água e tempo de cultivo (Tabela 1). Todas as combinações e normalizações entre as
variáveis podem ser observadas na Tabela 1, totalizando 13 experimentos para cada
meio de cultivo (Czapek e Malte).

Tabela 1. Variáveis escolhidas para realização do planejamento fatorial 23.

Todos os meios de cultivo foram tamponados em Tris-HCl 0,01 M, pela sua
eficiência em todos os tipos de água na faixa de pH escolhida.

15
 Todos os equipamentos e meios de cultivo foram previamente esterilizados em
autoclave a 121ºC por 40 minutos. Após atingir a temperatura ambiente esses meios
foram inoculados com, aproximadamente, um terço do micélio de cada placa de Petri, e
mantidos a 25oC em modo estático por 20, 26 e 32 dias, conforme o experimento obtido
no planejamento. Após os períodos específicos, os meios de cultivo líquidos foram
filtrados para separar o micélio do caldo fermentado, que foi então submetido à partição
com AcOEt (3 vezes), fornecendo os extratos AcOEt após evaporação do solvente.
Todos os extratos foram analisados por experimentos hifenados em CLAE-DAD-CAD-
CORONA.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Ao analisarmos os resultados obtidos para os cultivos da linhagem A. stygium,
realizados em planejamento fatorial 23, verificou-se uma significativa diferença entre
massas obtidas para cada extrato e no número e intensidade dos picos obtidos em
CLAE-DAD-CAD-CORONA (Tabela 2), demostrando que a variação na produção
metabólica, em cada caso, está diretamente associada à variação dos parâmetros
propostos.

Tabela 2. Massas dos extratos brutos obtidos para o planejamento fatorial 23 realizado
com a linhagem do fungo endofítico A. stygium.
Os extratos do cultivo em Malte e Czapek foram analisados em CLAE-DAD-
CAD-CORONA com coluna analítica Luna Phenomenex tipo octadecil silano (C-18) e
eluição em gradiente H2O/MeOH (95:050:100) por 40 min., permanecendo nesta
condição por mais 10 min., com fluxo de 1,0 mL.min-1, Figura 1 e 2.
Foram também submetidos à avaliação antitumoral e anticolinesterásica para
verificar se havia variação no potencial biológico para cada experimento. Parte das

16
amostras (23/26) apresentaram resultados promissores frente à acetilcolinesterase
humana com inibição > 80%, ou seja, se mostraram mais ativas que o padrão tacrina
utilizado, evidenciando o potencial desses extratos em estudos para a descoberta de
agentes inibidores de acetilcolinesterase.

Figura 1. Cromatogramas extratos de Malte (Fr 01 a 09) e extrato padrão (19).

Figura 2. Cromatogramas extratos de Czapeck (Fr 10 a18) e extrato padrão (19).

Foi possível observar uma variação na produção metabólica de acordo com o tipo
de ensaio realizado, como aumento/diminuição de algumas bandas e
aparecimento/desaparecimento de outras. Esses resultados estão de acordo com o

17
esperado e reforçam a teoria de que diferentes fatores afetam de maneiras diversas a
produção metabólica de um micro-organismo.

CONCLUSÕES
Os resultados encontrados no estudo do fungo A. stygium isolado da alga A.
spicifera ajudam a confirmar que o uso planejamentos experimentais podem estimular
diferentes rotas biossintéticas e, portanto, fornecer uma grande variedade na produção
metabólica dos micro-organismos com interesantes características do ponto de vista
químico e biológico.
Além disso, esses estudos podem fornecer subsídios para uma melhor
compreensão das interações existentes entre os endófitos com as espécies de algas
marinhas hospedeiras.
Estes resultados demonstram ainda a importância da investigação dos organismos
marinhos, uma vez que estes não são muito explorados no âmbito das pesquisas
realizadas no Brasil, podendo trazer diversos avanços no campo da pesquisa em
produtos naturais.

AGRADECIMENTO
Os autores agradecem ao IQ-UNESP Araraquara, NuBBE, CEPID e BIOTA pelo
suporte financeiro. À CAPES pela bolsa de doutorado. Ao grupo GCBPN-USP Ribeirão
pela colaboração nas atividades biológicas.

REFERÊNCIAS
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MUTHURAMAN et. al., 2014. In vitro cytotoxicity and molecular docking studies on
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PERALTA-ZAMORA et. al., 2005. Por que otimização multivariada? Revista de

Engenharia Sanitária e Ambiental, vol. 10, no. 2, pp. 106-110.

18
PILON, A. C., et. al., 2016. Partial least squares model and design of experiments
toward the analysis of the metabolome of Jatropha gossypifolia leaves: Extraction and
chromatographic fingerprint optimization. Journal of Separation Science, vol. 39, pp.
1023-1030.

19
Alta densidade celular de Clostridium carboxidivorans com gás
de síntese
Alanna Medeiros Botelho1*; Roberta dos Reis Ribeiro1; Tatiana Felix Ferreira2; Priscilla Filomena
Fonseca Amaral1; Nei Pereira Jr1.
1
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Departamento de Engenharia Bioquímica.
*[email protected]
2
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Departamento de Processos Orgânicos.
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
O gás de síntese é um resíduo gerado por processos térmicos e composto
majoritariamente por CO e H2. A fermentação deste gás é uma alternativa
biotecnológica para produção de combustíveis e commodities químicas. A quantidade
de bioprodutos obtida depende da concentração celular no processo. Porém, devido ao
processo ser anaeróbio e o substrato gasoso, o aumento da concentração celular durante
a fermentação de gás de síntese é um desafio. A fim de determinar uma metodologia
para obtenção de elevada concentração celular, avaliou-se a importância da adição do
gás de síntese durante a fermentação. Além disso, avaliou-se também a estratégia de
batelada alimentada, além da adição de gás de síntese. Detectou-se 0,832 ± 0,03 g
p.s.cél.L-1 em 18 horas de cultivo com adição de gás de síntese a cada 2 horas. No
entanto, com a estratégia de batelada alimentada com meio concentrado e adição de gás
de síntese a concentração máxima obtida foi de 1,94 ± 0,01 g p.s.cél.L-1 em 34 horas de
cultivo.

Palavras-chave: Wood-Ljungdahl; acidogênese; solventogênese.

______________________________________________________________________________________________

High Clostridium carboxidivorans cell density with syngas

ABSTRACT
Syngas is a thermal processes residue composed mainly of CO and H2. Syngas
fermentation is a biotechnological alternative for fuels and chemical commodities
production. In the process, the amount of bioproducts obtained depends on the cell
concentration. However, to obtain high cell density in syngas fermentation is a
challenge since the process is anaerobic and the substrate is a gas. Syngas addition
during fermentation was evaluated to obtain high cell density. Besides that, a feed-batch
strategy followed by syngas addition was also evaluated. A cell concentration of 0,832
± 0,03 g d.w. cell.L-1 was detected in 18 hours of fermentation with syngas addition
every 2 hours. However, with a feed-batch strategy with syngas addition a cell
concentration of 1,94 ± 0,01 g d.w. cell.L-1 was detected after 34 hours of fermentation.

Keywords: Wood-Ljungdahl; acidogenesis; solventogenesis.

______________________________________________________________________________________________

20
INTRODUÇÃO
Com a necessidade de criação de rotas sustentáveis para a produção de
commodities químicas renováveis e biocombustíveis, surge o processo híbrido
termoquímico-bioquímico (Shen et al., 2014). Nesse processo, o gás de síntese (CO,
H2 e CO2) é fermentado por bactérias acetogênicas, tal qual Clostridium
carboxidivorans, reconhecida por sua capacidade de assimilar CO e CO2 por meio da
via redutora de Acetil-CoA (via Wood–Ljungdahl), convertendo-os em ácidos orgânicos
e compostos químicos (Liu et al., 2014).
Entretanto, há gargalos como a baixa taxa de crescimento dos micro-organismos
anaeróbicos e a reduzida conversão do gás de síntese, tornando necessário aprimorar a
etapa de aumento de biomassa. Portanto, o presente trabalho avalia o crescimento da
bactéria Clostridium carboxidivorans em meio ATCC 2713 em diferentes condições
operacionais visando a obtenção de elevada biomassa celular.
MATERIAL E MÉTODOS
Micro-organismo e pré-inoculo e condições de cultivo: A cepa Clostridium
carboxidivorans DSM 15243 (Liou et al., 2005) foram repicadas e conservadas em
frascos de soro (100 mL) devidamente vedados contendo 50 mL de meio de cultura
ATCC 2713 (American Type Culture Colection), com composição descrita por Botelho
(2016), e saturados com gás de síntese. Como pré-inóculo esses frascos eram incubados
em agitador rotatório a 150 rpm e 37ºC em posição horizontal por 24 h.
Para todos os cultivos frascos de soro de 100 mL contendo 45 mL de meio ATCC 2713
foram inoculados com 5 mL de pré-inóculo e incubados a 150 rpm, 37°C, na
horizontal.A concentração celular ([X]) foi determinada em espectrofotômetro a 600 nm
e convertida a gramas de peso seco de células por litro (g.p.s.cél.L-1) por curva padrão de
peso seco.
Cultivo de Clostridium carboxidivorans: Foram inoculados 20 frascos e incubados por
40 horas. A cada 2 horas de cultivo um frasco era utilizado para determinação de [X] e
do pH e nos demais frascos, realizada a adição de gás de síntese no headspace por 30 s.
Adição de gás de síntese durante o crescimento celular: Foram inoculados 10 frascos de
soro e retiradas alíquotas de 5 ml de todos os frascos após 24 h do inoculo. Nas
amostragens seguintes, 5 ml de amostra eram retiradas de apenas dois frascos, nos
seguintes tempos: Frascos A: 31 h, 48 h; Frascos B: 31 h e 55 h; Frascos C: 72 h e 79 h;
Frascos D: 144 h e 192 h; Frascos E: 240 h e 312 h. O gás de síntese foi adicionado no

21
headspace por 30 s após amostragens de 24 h, 31 h, 72 h, 144 h e 240 h, apenas nos
frascos onde retirou-se amostra.
Batelada alimentada e adição de gás de síntese: Foram inoculados 3 frascos de soro e
retiradas alíquotas de 5 ml de cada frasco nos seguintes tempos de cultivo: 0 h, 25 h, 28
h, 31h, 34 h e 73 h. A cada amostragem (5 mL), adicionou-se 5 mL de meio ATCC
2713 com concentração 10 vezes superior ao meio original (batelada alimentada), além
de gás de síntese (no headspace por 30 s).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Figura 1 mostra os resultados do cultivo de Clostridium carboxidivorans em
meio ATCC 2713 com adição de gás de síntese a cada amostragem (de 2 em 2 horas). É
possível observar que em 14 horas de cultivo ocorreu uma desaceleração do crescimento
celular, atingindo em seguida a fase estacionária. A concentração celular máxima obtida
foi 0,832 g p.s.cel.L-1 (densidade ótica média de 0,541 após diluição de 3 vezes) em 18
horas de cultivo. Segundo Ukpong et al. (2012), a fase estacionária de crescimento
celular de C. carboxidivorans se dá com a diminuição do pH do meio e a produção de
solventes, característica do início da fase solventogênica.

Figura 1 – Perfil cinético do crescimento celular de Clostridium carboxidivorans, cultivado em frasco de

soro de volume útil 100 ml e com 50 ml de meio ATCC 2713 e adição de gás de síntese.
Segundo Bruant et al. (2010), Clostridium carboxidivorans cultivado em frasco
de soro com 120 mL de volume útil contendo 20 mL de meio específico para
Clostridium, presença de 0,5 g.L-1 de extrato de lêvedo, headspace 1 atm com 100%
CO, a 37 ºC, 100 rpm e pH 6,0, apresenta uma fase de adaptação de 24 h, atingindo a
fase estacionária após quatro dias de incubação, alcançando uma densidade ótica (DO)
de 0,77. A diferença entre as concentrações obtidas deve, possivelmente, à presença de
glicose no meio de cultivo. A glicose é utilizada na via de crescimento heterotrófico,

22
atuando na ativação do metabolismo e reduzindo o tempo de adaptação da cepa, visto
que, a fixação de CO e CO2 através da via WL (via autotrófica) não é eficiente na
geração de ATP.
A fase exponencial, que ocorreu de 6 a 12 horas de cultivo (Figura 1), foi
utilizada para determinação da taxa específica de crescimento celular (µ) da cepa
Clostridium carboxidivorans DSM 15243 que foi de 0,55 h-1, com tempo de duplicação
de 1,26 horas.
Em seguida, estudou-se a influência da adição de gás de síntese em tempos
específicos. Assim, após a adição em 24 horas verificou-se um aumento médio de 0,30
g.p.s.cel.L-1 até a adição seguinte (31 h) (Tabela 1), o que não ocorreu no cultivo com
adição de gás de síntese a cada 2 h (Figura 1). No entanto, após a adição seguinte (31 h)
não se detectou aumento na concentração celular (Tabela 1).

Tabela 1 - Concentração celular (g.p.s.cel.L-1) e pH para o cultivo de Clostridium carboxidivorans em

meio ATCC 2713 com adição de gás de síntese em 0, 24 e 31 horas de cultivo.

Tempo (h) Concentração celular (g.p.s.cél.L-1) pH

0 0,03 ± 0,00 7,08 ± 0,00
24 0,78 ± 0,02 6,15 ± 0,00
31 1,10 ± 0,21 7,00 ± 0,00
48 1,02 ± 0,00 6,95 ± 0,04
55 1,02 ± 0,00 6,92 ± 0,11
±: Valor do desvio padrão para 2 réplicas.

Para cultivos mais longos (Tabelas 2, 3 e 4) há uma significativa redução da

concentração celular entre 24 horas e a adição seguinte de gás de síntese (terceira
adição). Isso possivelmente ocorre devido à escassez de fonte de carbono.
Tabela 2 - Concentração celular (g.p.s.cél.L-1) e pH para o cultivo de Clostridium carboxidivoransem
meio ATCC 2713 com adição de gás de síntese em 0, 24 e 72 horas de cultivo.

Tempo (h) Concentração celular (g.p.s.cél.L-1) pH

0 0,03 ± 0,00 7,08 ± 0,00
24 0,77 ± 0,02 6,14 ± 0,09
72 0,33 ± 0,03 6,93 ± 0,04
79 0,58 ± 0,23 6,90 ± 0,01
±: Valor do desvio padrão para a duplicata.
Tabela 3 - Concentração celular (g.p.s.cél.L-1) e pH para o cultivo de Clostridium carboxidivorans em
meio ATCC 2713 com adição de gás de síntese em 0, 24 e 144 horas de cultivo.

Tempo (h) Concentração celular (g.p.s.cél.L-1) pH

0 0,03 ± 0,00 7,08 ± 0,00
24 0,79 ± 0,01 6,12 ± 0,00
144 0,40 ± 0,02 6,62 ± 0,00
192 0,65 ± 0,03 6,81 ± 0,06
±: Valor do desvio padrão para a duplicata.

23
 Após a terceira adição, observa-se um pequeno aumento da concentração celular
para todos os cultivos (Tabelas 2, 3 e 4), evidenciando a existência de células viáveis e
capazes de assimilar a fonte de carbono fornecida através da terceira adição de gás de
síntese. Igualmente ao cultivo mais curto (Tabela 1), os cultivos mais longos
apresentaram uma queda inicial no pH, característica da fase acidogênica, seguindo de
um aumento do pH, característica da fase solventogênica, na qual os ácidos produzidos
na fase acidogênica são convertidos a etanol e butanol.
Tabela 4 - Concentração celular (g.p.s.cél.L-1) e pH para o cultivo de Clostridium carboxidivorans em
meio ATCC 2713 com adição de gás de síntese em 0, 24 e 240 horas de cultivo.

Tempo (h) Concentração celular (g.p.s.cél.L-1) pH

0 0,03 ± 0,00 7,08 ± 0,00
24 0,79 ± 0,03 6,15 ± 0,08
240 0,54 ± 0,04 6,53 ± 0,04
312 0,75 ± 0,10 6,77 ± 0,10
±: Valor do desvio padrão para a duplicata.
Observa-se na Figura 2 que com a estratégia de batelada alimentada com adição
de gás de síntese a partir de 25 horas de cultivo, a cada três horas de cultivo, direcionou-
se a rota metabólica à produção de biomassa. Assim, a concentração celular aumentou
2,51 vezes em 34 horas, enquanto o pH manteve-se estável.

Figura 2– Perfil cinético do crescimento de Clostridium carboxidivorans, cultivado em frasco de soro de

volume útil 100 ml e com 50 ml de meio ATCC2713 com adição de meio concentrado e adição de gás de
síntese em 25, 28, 31, 34 e 73 horas.

CONCLUSÕES
Foi possível obter elevadas concentrações celulares de Clostridium carboxidivorans
em meio ATCC 2713. Observou-se que o gás de síntese promove o crescimento celular.
A estratégia de batelada alimentada juntamente com a adição do gás de síntese mostrou-
se uma estratégia interessante para o aumento da concentração celular, aumentando de

24
0,78 g.p.s.cél.L-1± 0,02 no momento da primeira adição (25 h) para 1,94 g.p.s.cél.L-1 ±
0,01 cerca de nove horas depois dessa primeira adição.
AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à FAPERJ pelo financiamento por projeto Pensa Rio 2014.

REFERÊNCIAS

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Universidade Federal do Rio de Janeiro. 79 p. Dissertação de Mestrado em Tecnologia
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BRUANT, G. et al., 2010. Genomic analysis of carbon monoxide utilization and
butanol production by clostridium carboxidivorans strain P7T. PLoS ONE, vol. 5, no. 9,
pp. 1–12. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0013033
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acetogen Clostridium scatologenes strain SL1 as Clostridium drakei sp. nov.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, vol. 55, no. 5, pp.
2085–2091. http://dx.doi.org/10.1099/ijs.0.63482-0
LIU, K. et al., 2014. Continuous syngas fermentation for the production of ethanol, n-
propanol and n-butanol. Bioresource Technology, vol. 151, pp. 69–77.
http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2013.10.059
SHEN, Y. and BROWN, R. and WEN, Z., 2014. Syngas fermentation of Clostridium
carboxidivoran P7 in a hollow fiber membrane biofilm reactor: Evaluating the mass
transfer coefficient and ethanol production performance. Biochemical Engineering
Journal, vol. 85, pp. 21–29. http://dx.doi.org/10.1016/j.bej.2014.01.010
UKPONG, M. N. et al., 2012. Physiological response of Clostridium carboxidivorans
during conversion of synthesis gas to solvents in a gas-fed bioreactor. Biotechnology
and Bioengineering, vol. 109, no. 11, pp. 2720–2728. http://dx.doi.org/
10.1002/bit.24549

25
 Fitotoxicidade pela associação de vinhaça em solos com
diferentes manejos
Alessandra Baroni Rodrigues Neves1; João Vitor França Pirola1, Mirian Alves de Faria1, Paulo Renato
Matos Lopes1*
1
Faculdade de Ciências Agrárias e Tecnológicas, UNESP - Universidade Estadual Paulista, Câmpus de
Dracena. Rodovia Comandante João Ribeiro de Barros, km 651, CEP 17900-000, Dracena, Brasil.
*[email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
O trabalho teve como objetivo avaliar a ecotoxicidade de dois sistemas de manejo do
solo (convencional e orgânico) com diferentes volumes de vinhaça. Foram realizados
bioensaios de toxicidade com sementes de Lactuca sativa. Os resultados demonstraram
que as amostras de solo de manejo convencional favoreceram o desenvolvimento das
plântulas independente da adição de vinhaça. Por outro, foi observado indícios de
ecotoxicidade nos tratamentos de sistema orgânico. No entanto, uma análise das
caraterísticas físico-químicas das amostras e novos bioensaios são necessários para
detalhar o efeito do tipo de manejo e da associação da vinhaça na ecotoxicidade do solo.
Palavras-chave: cana-de-açúcar, ecotoxicidade, sistemas convencional e orgânico.
______________________________________________________________________________________________

Phytotoxicity to vinasse association in soils with different managements

ABSTRACT
The objective of this work was to evaluate the ecotoxicity of two soil management
systems (conventional and organic) with different vinasse volumes. Toxicity bioassays
were performed with Lactuca sativa seeds. Results demonstrated that conventional
management soil samples favored the plant development independent of vinasse
addition. On the other hand, ecotoxicity evidence was observed in organic system
treatments. However, physicochemical analysis of samples and new bioassays are
necessary to detail the effect of management systems and vinasse association in soil
ecotoxicity.
Keywords: Conventional and organic systems, ecotoxicity, sugarcane.
______________________________________________________________________________________________

26
INTRODUÇÃO
A cultura da cana-de-açúcar no Brasil é uma das mais importantes, devido à área
que ocupa e ao seu destaque socioeconômico e ambiental (Urquiaga, 1991). Neste
contexto, a geração de etanol combustível nas usinas sucroenergéticas vem
acompanhada de resíduos que são utilizados como fertilizantes nas lavouras. A vinhaça
representa um desses subprodutos e sua geração é elevada, representando dez a dezoito
litros para cada litro de álcool produzido (Silva et al., 2007).
Por seu alto teor de matéria orgânica e sua riqueza nutricional, a vinhaça tem
sido utilizada na fertirrigação (Canellas et al., 2003). Todavia, ela também pode ser um
composto potencialmente poluente, pois pode apresentar um impacto cem vezes maior
que o esgoto doméstico pelo alto índice de DBO e corrosividade (Silva et al., 2007).
Em relação aos sistemas de cultivo de cana-de-açúcar, tem-se o manejo
convencional como o modelo comumente adotado. Entretanto, a substituição pelo
manejo orgânico em lavouras canavieiras vem crescendo não só no país como
internacionalmente (Evangelista et al., 2013).
Estes sistemas agrícolas convencionais, baseados na utilização de fertilizantes
químicos e pesticidas e no constante revolvimento do solo, têm promovido impacto
negativo nos seus parâmetros de qualidade (Mielnickzuk et al., 2003). Em contrapartida,
a adoção do manejo orgânico na lavoura com práticas mais conservacionistas tem
despertado grande interesse atualmente (Xavier et al., 2006).
Além disso, a utilização agrícola intensiva e de forma inadequada tem
contribuído para a degradação das características físicas, químicas e biológicas do solo
(Cunha et al., 2001). Assim, o histórico do uso do solo reflete em diferenças na sua
estrutura e composição (Xavier et al., 2006).
Em suma, o presente trabalho teve por objetivo analisar o efeito ecotoxicológico
da aplicação de diferentes volumes de vinhaça em solo cultivado com cana-de-açúcar de
sistemas distintos de produção: convencional e orgânico.

MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado na Faculdade de Ciências Agrárias e Tecnológicas,
Universidade Estadual Paulista (FCAT/UNESP, câmpus de Dracena).
Foram utilizadas amostras de solos a partir de dois tipos de manejo distintos:
convencional e orgânico. O solo de manejo convencional e a vinhaça foram coletados
na usina Caeté no município de Paulicéia/SP. Por outro lado, o solo de manejo orgânico

27
foi coletado em uma propriedade pertencente a empresa Planeta Verde, localizada no
município de Lucélia/SP.
As amostras foram coletadas até no máximo 30 cm de profundidade do perfil do
solo. Posteriormente, foram peneiradas, homogeneizadas e acondicionadas em
recipientes plásticos para sua utilização no decorrer do experimento.
O delineamento experimental foi fatorial 2x4 (Tabela 1), sendo analisados 2
tipos de manejo de solo (convencional e orgânico) e 4 volumes de vinhaça (zero,
0,5*VV, 1,0*VV e 2,0*VV). O volume vinhaça (VV) referiu-se à dose geralmente
utilizada para aplicação na lavoura canavieira, segundo Lourencetti et al. (2012).
Tabela 1. Composição dos tratamentos com solo cultivados com cana-de-açúcar pelos
sistemas convencional e orgânico associado a diferentes volumes de vinhaça (VV)
Tratamentos Manejo do solo Volume de vinhaça (VV)
Conv - 0,0 Convencional -
Conv - 0,5 Convencional 0,5
Conv - 1,0 Convencional 1,0
Conv - 2,0 Convencional 2,0
Org - 0,0 Orgânico -
Org - 0,5 Orgânico 0,5
Org - 1,0 Orgânico 1,0
Org - 2,0 Orgânico 2,0
Foram realizados testes de ecotoxicidade por meio de avaliação fitotoxicológica
com sementes de Lactuca sativa (alface), segundo Morales et al. (2004). A
determinação do efeito tóxico de cada tratamento foi realizada a partir do extrato aquoso
solubilizado das amostras de solo, obtido de acordo a NBR 10.006 (ABNT, 2004).
O efeito fitotóxico do tipo de manejo de solo associado a diferentes volumes de
vinhaça foi analisado de acordo com Labouriau e Agudo (1987). Deste modo, foram
mensurados: a germinação das sementes, o alongamento da raiz (≥ 0,1 mm) e o índice
de germinação (GI - Germination Index).
GI representa um fator de germinação de sementes (%G) e alongamento da raiz
(%R) relativos ao controle negativo (CN) e é expresso pela equação: GI = (%G) x (%R)
/ 100. A fim de facilitar a interpretação dos dados, os resultados foram expressos pelo
cálculo “1 – GI”, cujos valores maiores representam maior efeito fitotóxico do
tratamento.
Os dados experimentais foram analisados efetuando-se a análise de variância
pelo teste de Tukey a 5,0% de probabilidade para a comparação de médias. Neste caso,
foi utilizado o software Microcal Origin 8.0.
28
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados de testes de toxicidade (1-GI) para os diferentes tipos de manejo
de solo cultivados com cana-de-açúcar associados ou não à vinhaça estão apresentados
na Figura 1 e na Tabela 2.

Figura 1. Ecotoxicidade entre os manejos convencional e orgânico com diferentes

volumes de vinhaça em solos cultivados com cana-de-açúcar (1-GI). (CN – controle
negativo, CP – controle positivo).
Tabela 2. Análise de variância nos dados de ecotoxicidade entre os tipos de manejo
com diferentes volumes de vinhaça em solos cultivados com cana-de-açúcar (1-GI)
Conv Org
CN 0,000±0,080 Aa 0,000±0,080 Aa
CP 1,000±0,000 Ab 1,000±0,000 Ac
0,0 -0,079±0,077 Aa 0,243±0,079 Bb
0,5 -0,105±0,094 Aa 0,220±0,052 Bb
1,0 -0,140±0,090 Aa 0,225±0,039 Bb
2,0 -0,094±0,058 Aa 0,149±0,060 Bab
*letras minúsculas representam diferença significativa das médias entre os tratamentos na
coluna, **letras maiúsculas representam diferença significativa das médias entre os
tratamentos na linha. (teste de Tukey a 0,05% de probabilidade)

Notou-se diferença na ecotoxicidade quando comparados os tipos de manejo do

solo, conforme apresentado na Figura 1 e na Tabela 2. Desta forma, demonstra-se na
Tabela 2 que, quando adicionado o mesmo volume de vinhaça, houve diferença
significativa na ecotoxicidade pelos dados “1-GI” para os sistemas de manejo
convencional (Conv) e orgânico (Org). Além disso, mesmo sem a adição desta
substância (tratamentos 0,0), os resultados de ecotoxicidade foram significativamente
diferentes quando comparados os solos Conv e Org.
Observa-se que o índice de germinação foi favorecido nas amostras com manejo
convencional do solo, independente dos volumes de vinhaça testados. Estes tratamentos
não apresentaram toxicidade e tiveram valores de “1-GI” menores que o controle

29
negativo (0,000). Entretanto, não houve diferença significativa entre os tratamentos
Conv em relação ao CN.
Devido à elevada concentração de matéria orgânica e presença de vários
nutrientes, a vinhaça representa uma alternativa viável como adubo (Canellas et al.,
2003). Portanto, sua adição nos tratamentos com solo de manejo convencional pode ter
auxiliado numa maior germinação das sementes e no desenvolvimento radicular.
No solo de manejo orgânico, foi demonstrado que sem adição de vinhaça (Org-
0,0) já houve indícios de toxicidade. Além disso, em todos os tratamentos com vinhaça,
observou-se que os valores de “1-GI” eram próximos a Org-0,0. Neste caso, as amostras
Org não tiveram diferença significativa nos valores de ecotoxicidade entre si. Em
relação ao CN, apenas Org-2,0 não foi significativamente diferente (Tabela 2).
Apesar do seu valor como fertilizante, a vinhaça também é caracterizada por ser
potencialmente poluente pela alta carga orgânica e baixo pH. Assim, pode representar
um efeito tóxico no meio ambiente, conforme Silva et al. (2007). Contudo, o valor
24,3% em Org-0,0 para “1-GI” pode estar relacionado com o tipo de solo e suas
características físico-químicas. Outro importante fator a se considerar é a utilização de
outras espécies em novos bioensaios de toxicidade para estas amostras de solo.
Ainda, faz-se necessária a análise dos parâmetros físico-químicos das amostras
de solo e a realização de outros bioensaios de toxicidade utilizando espécies diferentes
como organismos teste.

CONCLUSÕES
O histórico do solo de lavoura canavieira baseado no tipo de manejo adotado
representou diferenças na análise de ecotoxicidade independente da adição de vinhaça.
O volume adicionado não refletiu em alteração no efeito tóxico da vinhaça.

AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Pró-Reitoria de Pesquisa (PROPe/UNESP), às empresas
Usina Caeté e Planeta Verde pela disponibilidade na coleta das amostras de solo e
vinhaça e também ao GAIA da FCAT/UNESP, câmpus de Dracena.

REFERÊNCIAS
ABNT - ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS, 2004. NBR 10006:
Procedimento para obtenção de extrato solubilizado de resíduos sólidos. Rio de
Janeiro: ABNT, 7 p.
30
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31
 Estabilidade de surfactante produzido por estirpe de
Enterobacter aerogenes LBPMA-BMA10
Amanda Lys Silva1; Elane Cristina dos Santos1; Ana Maria López1,*
1
Lab. de Bioquímica do Parasitismo e Microbiologia Ambiental, Instituto de Química e Biotecnologia,
Universidade Federal de Alagoas. CEP 57072-900. Maceió-AL, Brasil. *e-mail: [email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Biosurfactantes/bioemulsificantes (BS/BE) são metabólitos produzidos por
microrganismos com capacidade de diminuir a tensão superficial. Eles têm recebido
enorme atenção devido a suas propriedades únicas quando comparado aos sintéticos.
Entretanto, a aplicabilidade dos biosurfactantes em várias áreas depende da estabilidade
dos mesmos. Desta maneira, a estabilidade do biosurfactante extracelular de
Enterobacter aerogenes LBPMA-BMA10 foi estudada em diferentes concentrações de
NaCl e condições de pH e temperatura. O índice de emulsificação foi medido após 24 h
(E24) usando o sobrenadante livre de células. Todas as amostras foram termalmente
estáveis em tolueno, mas não em querosene. Resultados similares foram obtidos quando
o pH do sobrenadante foi ajustado para 2, 7 e 10, bem como quando concentrações
diferentes de NaCl (2, 6 e 10 %) foram adicionadas às amostras. Tais resultados revelam
o potencial da estirpe LBPMA-BMA10 de Enterobacter aerogenes em produzir
biosurfactante, e sua potencial aplicabilidade em diferentes áreas da biotecnologia,
como a biorremediação.

Palavras-chave: Biotensoativos. Bactéria. Moléculas extracelulares.

______________________________________________________________________________________________
Stability of biosurfactant produced by the strain
Enterobacter aerogenes LBPMA-BMA10

ABSTRACT
Biosurfactant/bioemulsifiers (BS/BE) are metabolites synthesized by microorganisms
with capacity of reducing surface tension. They have been receiving increasing attention
as a result of their unique properties when compared to their synthetic chemical
counterparts. However, the applicability of biosurfactants in several fields depends on
their stability. In this way, the stability of an extracellular biosurfactant of Enterobacter
aerogenes LBPMA-BMA10 was studied in different concentrations of NaCl and
conditions of pH and temperatures. The emulsification index was measured after 24 h
(E24) using the cell-free supernatants of this microorganism cultures. All samples were
thermally stable in toluene, but not in kerosene. Similar results were obtained when the
pH of such supernatants were adjusted to 2, 7 and 10, or when different concentrations
of NaCl (2, 6, and 10 %) were added to them, emphasizing the ability of the strain
LBPMA-BMA10 of E. aerogenes to produce biosurfactants and its potential
applicability in different biotechnological fields, such as in bioremediation.

Keywords: Biotensoatives. Bacteria. Extracellular molecules.

______________________________________________________________________________________________

32
INTRODUÇÃO
Surfactantes são definidos como substâncias que mesmo em baixíssimas
concentrações podem diminuir com elevada eficácia a tensão superficial de solventes,
aumentando a solubilidade, a mobilidade, a biodisponibilidade e a biodegradação de
diferentes compostos (Ron and Rosenberg, 2001). Essa principal característica deve-se à
natureza anfipática das mesmas, capazes de agregarem-se em micelas nas interfaces
entre fases fluidas com diferentes graus de polaridade (Abbasi and Amiri, 2008). Essas
são as estruturas responsáveis para compatibilizar, por exemplo, a mistura de água com
óleos, por meio da geração de emulsões (Cooper and Goldemberg (1987). A
micelização é, portanto, uma propriedade intrínseca dos surfactantes.
De acordo com a origem, os surfactantes podem ser sintéticos ou biológicos,
sendo os últimos denominados de biosurfactantes. Geralmente, os biosurfactantes
apresentam baixo peso molecular e excelente atividade superficial, formando emulsões
estáveis (Uzoigwe et al., 2015). Já os bioemulsificantes têm maior peso molecular que
os biosurfactantes e também formam emulsões estáveis, porém sem reduzir muito a
tensão superficial (Liang et al., 2014; Uzoigwe et al., 2015). De acordo com o modo de
ação, os biosurfactantes podem ser de dois tipos: há os que permanecem aderidos à
membrana do microrganismo, enquanto outros são secretados para o ambiente
extracelular (Ron and Rosenberg, 2001).
A aplicabilidade dos biosurfactantes, seja na indústria farmacêutica ou em
campos de petróleo, por exemplo, depende da sua estabilidade em diferentes condições.
Portanto, a investigação do comportamento do surfactante frente a variações de pH,
temperatura e salinidade, é de suma importância na caracterização de moléculas
excretadas por microrganismos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a
estabilidade do biosurfactante extracelular produzido pela linhagem de Enterobacter
aerogenes LBPMA-BMA10 por meio da emulsão formada quando da mistura do
sobrenadante livre de células (após tratamentos específicos) da referida bactéria com
dois hidrocarbonetos (querosene e tolueno).

MATERIAL E MÉTODOS
Alíquotas (108 células.mL-1) de suspensões aquosas de Enterobacter aerogenes
LBPMA-BMA10 foram inoculadas no meio de produção de biosurfactante descrito por
Diab and El Din (2013). As culturas foram incubadas por 72 h (30 ± 1°C) sob agitação

33
orbital constante (180 rpm) em frascos contendo 50 mL do meio de cultura. Para a
verificação da estabilidade do índice de emulsificação, o volume total de cada cultura
foi centrifugado (20 min, 5.000 g) e o sobrenadante livre de células foi dividido em
alíquotas de 5 mL para a realização dos diferentes tratamentos, a saber: a) salinidade:
acrescentou-se NaCl ao meio de cultura nas concentrações de 2, 6 e 10 %; b)
temperatura: as amostras foram mantidas às temperaturas de 4, 30 e 100 °C durante uma
hora; c) alteração de pH: utilizou-se uma solução de NaOH ou HCl 5 M para ajuste do
pH para 2, 7 e 10. Para comparação, alíquotas foram mantidas sem tratamento. O índice
de emulsificação das amostras (Cooper and Goldemberg, 1987) foi obtido utilizando-se
como hidrocarbonetos querosene e tolueno. Após homogeneização sob agitação
(vortex), esse material foi incubado por 24 h, quando finalmente mensurou-se a altura
da zona de emulsão formada em relação ao volume total da mistura. Os resultados de
cada parâmetro foram submetidos a análise de variância (ANOVA) e suas médias
comparadas entre si através do teste de Tukey (5 % de significância).

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Sintetizados por muitos microrganismos como subprodutos de seu metabolismo
primário (Ron and Rosenberg, 2001), os biosurfactantes possuem grande apelo na
chamada tecnologia verde, sendo que a atividade emulsificante dos mesmos pode ser
compreendida pela investigação do seu índice de emulsificação (Liang et al., 2014). Os
resultados obtidos com o sobrenadante do cultivo de Enterobacter aerogenes BMA-10
mostraram que nenhum dos tratamentos ao qual a amostra foi submetida foi capaz de
alterar a capacidade emulsificante (E24) na presença do tolueno. Resultados semelhantes
foram obtidos por Abbasi and Amiri (2008), que verificaram a estabilidade do
bioemulsificante produzido por Enterobacter cloacae frente a variações de NaCl (5 – 40
g.L-1) na emulsificação tanto de tolueno como também do óleo de milho. No trabalho
Liang et al. (2014), a caracterização do surfactante excretado por uma linhagem de
Paenobacillus considerou a estabilidade do índice de emulsificação (E24) de suas
amostras em óleo de máquina, apresentando-se estável mesmo quando submetido a altas
temperaturas, variações de pH e salinidade < 5 %. A necessidade de se verificar a
estabilidade da emulsificação frente a diferentes concentrações de sal se justifica pelo
fato de que um dos possíveis usos de biosurfactantes microbianos é a recuperação de
ambientes marinhos impactados por derramamentos de petróleo, já que concentrações

34
salinas acima de 3 % são suficientes para inativar os surfactantes convencionais
(Uzoigwe et al., 2015).
No presente trabalho, quando se utilizou querosene – cuja composição inclui
hidrocarbonetos alifáticos, aromáticos e naftênicos, com cadeias carbônicas variando
entre 9 e 16 – todos os tratamentos tiveram efeito nas amostras do sobrenadante
proveniente do cultivo de E. aerogenes LBPMA-BMA10 (Figura 1).

Figura 1. Emulsificação do sobrenadante (pós-tratamento térmico) proveniente do cultivo de

Enterobacter aerogenes LBPMA-BMA-10 em tubos contendo querosene (A) ou tolueno (B). C= controle
(meio de cultura sem prévia inoculação e sem tratamento térmico); ST= sobrenadante livre de células de
cultura do mesmo microrganismo, o qual não foi submetido a quaisquer dos tratamentos.

Outra maneira de estudar a estabilidade dos surfactantes é por meio do cultivo

das células microbianas já em condições diferenciadas, como fizeram Dadrasnia and
Ismail (2015) ao trabalhar com Bacillus salmaya 139SI. Abbasi and Amiri (2008), por
sua vez, cultivaram E. cloacae em caldo nutriente e em meios de cultura alternativos
utilizando água do mar e aquele microrganismo foi incapaz de produzir biosurfactante
quando cultivado no meio complexo, ao contrário de Diab and El Din (2013), que
registraram a produção de biosurfactantes nesse meio de cultura. Na Figura 2 é possível
verificar que a temperatura de 100 °C por uma hora aumentou o poder de emulsificação
do biosurfactante na presença do querosene. A temperatura de 4 °C, por sua vez,
resultou numa porcentagem menor de emulsificação (20,75 ± 4,17) quando comparado
ao sobrenadante sem tratamento (52,87 ± 1,63). A acidificação e alcalinização do
sobrenadante favoreceram os índices de emulsificação das amostras (61,61 ± 1,4 e
62,59 ± 3,57, respectivamente) enquanto o pH neutro foi desfavorável (E24= 37,81 ±
1,44). Além disso, a emulsificação do querosene foi maior quando 2 % NaCl estava
presente no sobrenadante em comparação com o sobrenadante não tratado. Nas
concentrações de 6 e 10 %, valores reduzidos de E24 foram observados.
Sabe-se que a combinação de polissacarídeos, ácidos graxos e componentes
protéicos dos bioemulsificantes conferem a essas moléculas um elevado potencial não

35
somente para formar as emulsões, como também para estabilizá-las (Uzoigwe et al.,
2015). Por isso, a detecção dos aminoácidos e o estudo da contribuição dos
componentes protéicos tem sido reportada na literatura (Ron and Rosenberg, 2001). Da
mesma forma, os polissacarídeos também podem atuar eficientemente na formação de
emulsões estáveis. Assim, é imperativo determinar a composição química do
bioemulsificante de E. aerogenes LBPMA-BMA10, passo seguinte ao presente estudo.

Figura 2. Índices de emulsificação do sobrenadante livre de células de Enterobacter aerogenes BMA-10

em tubos com querosene (A) ou tolueno (B), 24 h após a agitação das amostras. Letras diferentes nas
barras do mesmo tipo de tratamento indicam diferença estatisticamente significativa pelo teste Tukey (ρ<
0,05), enquanto letras iguais indicam que as emulsificações obtidas nos não diferem entre si
estatisticamente. Tratamentos: NaCl (2, 6 e 10 %), temperatura (4, 30 e 100 °C) e pH (2, 7 e 10).
Legenda: ST= sem tratamento.

CONCLUSÕES
As emulsões formadas pelo sobrenadante livre de células de Enterobacter
aerogenes LBPMA-BMA10 são estáveis no tolueno mesmo quando as amostras foram
previamente tratadas com diferentes concentrações de sal, alterações no pH (2, 7 e 10)
ou submetidas durante uma hora às temperaturas de 4, 30 e 100 °C, o que indica que a
molécula excretada tem elevada afinidade por hidrocarbonetos aromáticos.

36
AGRADECIMENTO
Ao CNPq e a “S.A. Usina Coruripe Açúcar e Álcool” pelo auxílio financeiro.
REFERÊNCIAS
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produced by Enterobacter cloacae. African Journal of Biotechnology, vol. 7, no. 10, pp.
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Environmental Science and Technology, vol. 7, no. 7, pp. 671-679.
http://dx.doi.org/10.5897/AJEST2013.1451.
LIANG, T.,WU, C.,CHENG, W., CHEN, Y., WANG, C., WANG, I. and WANG, S.,
2014. Exopolysaccharides and Antimicrobial Biosurfactants produced by Paenibacillus
macerans TKU029. Applied Biochemistry and Biotechnology, vol.172, no.2, pp. 933–
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RON, E. and ROSENBERG, E., 2001. Natural roles of biosurfactants. Environmental
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Frontiers in Microbiology, vol. 6, no.1, pp. 1-6.
http://dx.doi.org/10.3389/fmicb.2015.00245.

37
 Atividade Antimicrobiana e Antibiofilme de Filtrados de
Fungos Endofíticos
Ana Graziela Gomes Travassos1*; Ana Nirla da Silva Sampaio1; Maria de Fátima Oliveira Almeida1;
Juliana Mesquita Vidal Martínez de Lucena1

1
Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Amazonas. *[email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
As interações benéficas fungo-planta podem gerar compostos de interesse
biotecnológico com perspectivas de desenvolvimento de novos antimicrobianos. Neste
trabalho, teve-se por objetivo testar os caldos metabólicos filtrados de fungos
endofíticos quanto à sua atividade antimicrobiana e antibiofilme contra Pseudomonas
aeruginosa (ATCC9027) e Escherichia coli (ATCC8739). Fungos endofíticos (n=19)
de diferentes plantas medicinais conservados na micoteca do IFAM/CMC, foram
reativados e cultivados em meios líquidos sob agitação a 25o C, por cerca de 14 dias
(dependendo da cepa). Os extratos foram obtidos por filtração do caldo de cultivo em
membrana Millipore (0,22 µm)e aplicados contra os patógenos por método de
microdiluição, na concentração de 3µg/ml, em triplicata. Os resultados foram obtidos
por leitora de absorbância (630nm), determinando a taxa de crescimento (TC%) e taxa
de formação de biofilme (TB%) após incubação a 37o C por 24h. E. coli não sofreu
inibição de crescimento, nem de adesão, apresentando TC% e TB% acima de 50% em
todos os casos. Contra P. aeruginosa, a melhor inibição ocorreu por Aspergillus sp. com
TC = 39,4±1% e nenhum biofilme formado. Outros filtrados apresentaram TB<50%
contra P. aeruginosa sem reduzir significativamente seu crescimento: Trichoderma sp.
(35,9%), 2 cepas de T. harzianum (21,4% e 41,9%), Fusarium falciforme (31,7%) e
Penicillium sp. (35,0%). Observou-se, portanto, que 6 cepas parecem promissoras para
estudos posteriores de sua composição química, visando o isolamento dos compostos
ativos.

Palavras-chave: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, inibição de biofilme,

inibição de crescimento, endófitos fúngicos.
______________________________________________________________________________________________

Antimicrobial and Antibiofilm Effect of Endophytic Fungi Filtrates

ABSTRACT
Fungal-plant beneficial interactions might be responsible for the production of
biotechnological interesting compounds with potential applicability in the development
of new antimicrobials. The present work aimed to evaluate the antimicrobial and
antibiofilm effect of fungal filtrates against Pseudomonas aeruginosa (ATCC9027) and
Escherichia coli (ATCC8739). Endophytic fungi (n=19) from different medicinal plants
preserved in the IFAM/CMC collection were cultivated under agitation for 14 days at
25o C. The broth were filtrated through a Millipore membrane (0,22 µm). Each filtrate
was tested in triplicate by microdilution against the pathogens in a concentration of
3µg/ml. The results were obtained by a microplate reader (630nm), determining the
38
growth inhibition (GI%) and biofilm inhibition (BI%) after 24h incubation at 37o C. E.
coli was not inhibited, showing both indexes over 50%. The best score against P.
Aeruginosa was achieved by Aspergillus sp. (GI = 39,4 ±1%) and the biofilm formation
was null. Other filtrates inhibited the formation of biofilm by P. aeruginosa with less
interference on growth: Trichoderma sp. (BI=35,9%), 2 strains of T. harzianum
(BI=21,4% and 41,9%), Fusarium falciforme (BI=31,7%) and Penicillium sp.
(BI=35,0%). These are promising strains for future chemical prospection of
antimicrobial compounds.

Keywords: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, biofilm inhibition, growth

inhibition, fungal endophytes
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Os metabólitos secundários isolados de fungos endofíticos levaram a crer que os
fungos poderiam se tornar a fonte principal de compostos bioativos, acabando com a
dependência dos hospedeiros produtores dos mesmos compostos (FREIRE et al. 2014).
Apesar de, após algum tempo, ter sido observado que com sucessivas repicagens esses
endófitos diminuem ou perdem a capacidade de produzir os metabólitos de interesse
(SACHIN et al., 2013), esses simbiontes continuam sendo importantes alvos da busca
por novos antimicrobianos.
Um desafio a ser vencido, é o controle de microrganismos produtores de
biofilmes, muitas vezes associados à resistência aos antimicrobianos. Algumas espécies
são mais habilidosas que outras na colonização de superfícies e muitos patógenos se
utilizam de compostos de sua parede celular ou da síntese de exopolímeros para ligar-se
às células e tecidos do hospedeiro (HALL-STOODLEY et al., 2004). Pseudomonas
aeruginosa e Escherichia coli possuem reconhecida aptidão para causar doenças graves
por meio de biofilmes e pela resistência adquirida aos antibióticos (BOUCHER, 2007;
COS et al. 2010; SILVA et al., 2011).
O presente estudo teve por objetivo avaliar se alguns filtrados obtidos do caldo
de cultivo de fungos endofíticos de diferentes plantas medicinais teriam a capacidade de
inibir o crescimento microbiano e/ou prevenir a formação de biofilme por bactérias
patogênicas in vitro.

MATERIAL E MÉTODOS
Foram cultivadas 30 cepas de fungos endofíticos conservadas na micoteca do
IFAM/CMC. As linhagens selecionadas (n=19) foram cultivadas em frascos
Erlenmeyers (250ml) por um período de 14 dias em caldo batata dextrose (BDA) ou

39
Sabouraud dextrose (SDA), dependendo do meio que possibilitou melhores condições
de crescimento a 25oC sob agitação constante. Após a incubação, os micélios foram
separados por filtração simples e os caldos de cultivo, filtrados por membrana Millipore
(0,22µm). Os filtrados fúngicos (FF) assim obtidos foram submetidos aos testes
antimicrobianos.
As cepas Escherichia coli (ATCC8739) e Pseudomonas aeruginosa
(ATCC9027) foram reativadas em caldo infusão cérebro coração (BHI) e incubadas por
24h a 35±2 oC. A concentração do inóculo foi determinada antes de cada ensaio
utilizando câmara de Neubauer, aferindo-se a concentração de 108 BC/ml. Os ensaios de
microdiluição para inibição de crescimento e de formação de biofilme seguiram
metodologia de Kwasnyand Opperman (2010) com algumas modificações. A
determinação da taxa de crescimento (TC%) e de formação de biofilme (TB%) foi
realizada conforme Melo et al. (2016). Cada ensaio foi realizado em triplicata na
concentração de 3µg/ml. Para controle positivo foi utilizada a amoxicilina na mesma
concentração.
Após a inoculação, as microplacas de 96 poços foram submetidas ao
espectrofotômetro de absorbância (630nm), gerando os dados iniciais (T0) para cada
ensaio. Para a determinação da TC%, foi realizada leitura após 24h de incubação (T24).
Para gerar os dados sobre a formação de biofilme num mesmo ensaio, foi removido o
sobrenadante de cada microplaca, seguido de lavagem sequencial (3x) com água
destilada estéril e coloração do biofilme com uma solução de cristal violeta (0,06%).
Após secar e ressuspender o biofilme corado, foi realizada a 3ª leitura (T B). Os valores
gerados serviram para calcular as taxas percentuais em relação ao controle negativo
(microrganismo inoculado somente com meio de cultura, sem inibidores).
Foram calculadas as diferenças T24 – T0, poço a poço, indicando quanto o
microrganismo cresceu em 24h. Cada triplicata gerou uma média e desvio padrão para
cada FF. O mesmo procedimento foi adotado para o biofilme (TB – T0). Em seguida,
foram calculados os valores percentuais, conforme abaixo:
TC% e TB%: a média das diferenças (triplicata) obtida para o controle negativo
(CN) foi considerada como 100% de crescimento e de biofilme para cada cepa,
calculando-se, em seguida, o percentual correspondente à média das diferenças das
triplicatas de cada FF, conforme abaixo:

40
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A maioria dos trabalhos publicados com extratos fúngicos avalia a ação
antimicrobiana por meio de difusão em ágar e microdiluição. Neste estudo, 19 filtrados
do caldo metabólico de fungos endofíticos foram testados por microdiluição,
observando sua atividade contra o crescimento dos patógenos de modo planctônico e
aderido ao fundo das microplacas.
Nenhum FF foi eficaz em inibir E. coli nas condições deste estudo, apresentando
valores de TC% e TB% acima de 50% em todos os casos.A menor TC% (64,5) foi
resultante do FF de Aspergillus sp. que, entretanto, produziu biofilme em grande
quantidade (TB = 92,0%). Por meio de antibiograma, Clementino et al. (2015) detectou
inibição de E. coli por cepas endofíticas do mesmo gênero.
Contra P. aeruginosa, a melhor inibição ocorreu pelo FF de Aspergillus sp., que
apresentou com TC = 39,4% e impediu totalmente a formação de biofilme. Os FF
obtidos do cultivo de Trichoderma sp., T. harzianum, Fusarium falciforme e Penicillium
sp. induziram uma TB<50% contra P. aeruginosa sem reduzir significativamente os
valores de crescimento planctônico, os quais resultaram em TC>70% em todos os casos.
Isto poderia indicar a capacidade de interferir com mecanismos envolvidos na
colonização de superfícies. Os resultados são mais detalhados na Tabela 1.
Avaliando extratos de 13 cepas isoladas de Costusspiralis contra 7 espécies
bacterianas e 2 leveduras por microdiluição, Ascêncio et al. (2014) obtiveram inibição
de P. aeruginosa por 5 amostras em concentrações muito superiores (MIC= 125µg/ml)
às relatadas aqui, e nenhuma delas foi eficaz contra E. coli. A partir dos resultados
obtidos, observou-se que 6 cepas fúngicas podem gerar informações interessantes com
estudos posteriores de sua composição química, visando o isolamento dos compostos
ativos. Essas cepas mostraram-se promissoras no combate à P. aeruginosa.

41
Tabela 1. Taxa de crescimento (TC%) e de formação de biofilme (TB%) por microrganismos
patogênicos em presença de diferentes filtrados fúngicos.
TC% TB%
Linhagens
P. aeruginosa E. coli P. aeruginosa E. coli
Trichoderma sp. 106,2±5,2 182,2±27,8 35,9±47,0 89,8±15,4
NI 101,0±14,3 161,4±9,9 153,9±91,1 72,8±8,3
T. harzianum 85,5±5,9 150,6±16,9 21,4±103,6 106,7±48,8
Trichoderma sp. 97,6±7,6 130,8±3,7 171,8±57,3 117,3±61,4
T. harzianum 76,2±5,3 123,7±21,9 41,9±12,6 117,0±6,9
T. harzianum 97,6±2,3 147,5±19,1 151,3±59,1 183,5±59,4
Aspergillus sp. 88,2±6,3 144,0±11,3 137,6±57,9 155,3±22,0
A. japonicus 76,2±3,1 154,2±9,6 150,4±31,9 110,2±19,6
Colletotrichum gloeosporioides 91,9±2,3 205,1±3,9 262,4±156,2 96,7±40,6
A. flavus 91,8±2,1 144,6±3,6 213,7±132,6 141,0±23,0
Fusarium falciforme 96,0±14,4 142,0±5,6 159,0±143,7 172,5±13,9
Fusarium falciforme 88,0±6,0 142,8±5,7 36,8±179,8 127,7±33,8
Penicilium sp. 89,1±2,1 164,2±4,7 35,0±81,1 158,0±44,0
Colletotrichum sp. 84,4±4,2 146,4±9,0 186,3±105,1 164,5±23,5
Hypocrealixii 76,9±5,1 150,6±6,3 84,6±184,8 116,2±21,1
Aspergillus sp 39,4±1,2 64,5±11,8 -5,1±158,5 92,0±14,9
Aspergillus sp. 86,2±1,3 177,9±3,5 347,9±95,6 120,2±14,8
Trichoderma sp. 97,5±4,6 134,7±13,9 382,9±58,6 133,7±40,3
Aspergillus sp. 88,5±9,5 129,9±6,6 254,7±159,1 120,0±38,3
Controle (+) 25,9±7,7 -19,5±26,7 87,3±54,0 -179,6±62,8
Controle (-)* 0,65±0,03 0,27±0,01 -0,04±0,1 -0,64±0,07

Controle (+): amoxicilina; Controle (-): caldo TSB-D com microrganismo-alvo; *valor absoluto de
densidade ótica, usado como referencia para os cálculos de TC% e TB%. NI: cepa não identificada.

CONCLUSÕES
O presente trabalho indicou cepas endofíticas promissoras para o isolamento de
compostos eficazes contra Pseudomonas aeruginosa. No que diz respeito à inibição de
biofilmes com extratos de fungos endofíticos , trata -se de um estudo pioneiro , cujos
melhores resultados foram obtidos por Trichoderma sp., T . harzianum , Fusarium
falciforme, Penicillium sp.e Aspergillus sp.

AGRADECIMENTOS
Ao INCQS/FIOCRUZ-RJ pelas cepas padrão utilizadas neste estudo. À FAPEAM pela
bolsa de fixação de doutores e apoio técnico (FIXAM). Ao Programa de Educação
Tutorial pela bolsa PET-Biologia (tutora e estudante).

REFERÊNCIAS
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43
 Avaliação da atividade inibitória de Lactobacillus spp. sobre
Salmonella Heidelberg
Ana Carolina Izidoro de Moraes¹*; Igor Herique Vellano Bastos¹; Rafaela Altarugio¹; Bianca Akemi
Nagayoshi¹; Letícia da Silveira Gross¹; Adriano Sakai Okamoto¹; Raphael Lucio Andreatti Filho¹

1
UNESP - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" - Departamento de Clínica
Veterinária- Área de Ornitopatologia *[email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
O Brasil é o segundo produtor mundial e o primeiro em exportação da carne de frango e
isso gera desafios na produção que interfere diretamente na qualidade final da carne.
Um dos principais agentes envolvidos na toxico infecção alimentar e nas infecções de
aves é a Salmonella spp. Com isso, medidas alternativas estão sendo utilizadas dentre
elas está o uso de próbioticos como o Lactobacillus spp., que demonstra eficiência no
combate a Salmonella spp. Para elucidar alguns dos mecanismos utilizados pelos
Lactobacillus spp. para inibir à Salmonella spp. utilizamos a técnica Spot-on-the-lawn,
que avalia o mecanismo de Quorum Sensing, e assim obtivemos resultados que levam a
concluir que, após o contato prévio coma Salmonella spp. o Lactobacillus spp.
aumentou seu halo de inibição contra a Salmonella spp.

Palavras-chave: Lactobacillus spp., Salmonella spp., Quorum Sensing, probióticos.

______________________________________________________________________________________________

Evaluation of the inhibitory activity of Lactobacillus spp. on

Salmonella Heidelberg
ABSTRACT
Brazil is the second world product and the first one to export chicken meat and this is
what happens in the final production of meat. One of the major agents involved in toxic
foodborne infection and bird infections is Salmonella spp. With this, alternative
measures are being used and among them is the use of probiotics such as Lactobacillus
spp., which demonstrates efficiency in combating Salmonella spp. To elucidate some of
the mechanisms used by Lactobacillus spp. to inhibit Salmonella spp., we used the
technique Spot-on-the-lawn, which evaluates the mechanism of Quorum Sensing, and
thus we obtained results that lead to the conclusion that, after previous contact

44
with Salmonella spp., the Lactobacillus spp. increased its inhibition halo
against Salmonella spp.
Keywords: Lactobacillus spp., Salmonella spp., Quorum Sensing, probiotics.
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO

Em 2015 o Brasil foi o segundo maior produtor mundial de carne de frango

(Abpa, 2016). A ocorrência de doenças transmitidas por alimentos tem sido foco de
discussões nos últimos anos, onde a Salmonella spp. é o principal e mais importante
agente envolvido, e mesmo com o aumento da tecnologia ainda é um problema
pertinente e de ocorrência mundial. (Boyle et al., 2007). Destacam-se as salmonelas
paratíficas (Berchieri Jr., 2000) por não serem específica de aves, assim oferecendo
maior risco para a população. Quando isoladas de aves e seus subprodutos têm maior
frequência quando comparado com outros animais (Andreatti Filho., 2007). Além disso,
a presença de animais portadores assintomáticos facilita a disseminação da doença
(Shinohara, et al, 2008). O uso indiscriminado de antibióticos em aves possibilitou a
manutenção de lotes positivos para Salmonella spp., o que promoveu o aumento da
resistência antimicrobiana (Ribeiro et al, 2008), gerando assim pesquisas de medidas
alternativas, entre elas o uso de probióticos (Santos and Gil-Tunes, 2005).

Probióticos são bactérias que fazem parte da microbiota natural das aves, e por
serem produtos naturais não apresentam todas as ações que os antibióticos possuem,
porém não geram resíduos nos produtos de origem. Além disso, eles induzem o
equilíbrio da microbiota intestinal, onde produzem metabólitos com ação
antimicrobiana, competem por sítios de ligações e auxiliam na melhoria da absorção de
nutrientes (da Silva and Andreatti Filho, 2000; Kuritza et al, 2014).

O objetivo do trabalho foi avaliar a capacidade dos Lactobacillus spp. inibirem o

crescimento da Salmonella Heidelberg pelo mecanismo de Quorum sensing.

MATERIAL E MÉTODOS
As amostras de Lactobacillus spp. (LCT) e de Salmonella Heidelberg (SH)
foram provenientes da bacterioteca do Laboratório de Ornitopatologia da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia UNESP- BOTUCATU.

Para o preparo do indutor, o Lactobacillus plantarum (LP) resistente aos

antibióticos Ácido nalidíxico (Nal) e Rifampicina (Rif) foi cultivado em caldo DeMan-
45
Rugosa-Sharpe (MRS) já a SH foi cultivada em caldo infusão de cérebro e coração
(BHI). Após o cultivo, foram agrupados 2 ml de caldo MRS, 2 ml de BHI, 100
microlitros do cultivo de LP e 100 microlitros do cultivo da SH. Dessa solução, foram
passados 100 microlitros em um caldo MRS com Nal e Rif e cultivado. Em seguida 100
microlitros deste caldo com antibiótico foi acrescentado em caldo MRS e novamente
incubado, o qual passou por um processo de filtração com uma membrana de 0.22µm,
gerando assim o indutor.

O Quorum sensing foi avaliado pelo o teste de antagonismo, o “Spot-on-the-

lawn” com modificações. Onde os LCT foram cultivadas no caldo MRS e no filtrado,
posteriormente foram gotejados 10 microlitros em pontos da placa de MRS e incubado.
Em seguida foi preparado um caldo BHI com 0,65% de Agar Agar, 20 ml para cada
placa de MRS, o qual foi mantido em banho Maria e quando atingiu 40°C acrescentou-
se 200 microlitros do cultivo de SH em BHI. Este preparo foi desprezado
cuidadosamente em cada placa, as quais foram incubadas e posteriormente realizada a
leitura dos halos de inibição.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Alguns Lactobacillus spp. possuem mecanismo de comunicação denominado de

Quorum Sensing que produzem, liberam e reconhecem substâncias sinalizadoras,
resultando em resposta coletiva a qual regulam atividades fisiológicas para sobreviver e
prosperar. No presente trabalho observou que os Lactobacillus spp. sobreviveram à
interação com a Salmonela spp. e a inibição foi aumentada após a interação. Após a
condução do teste de “Spot-on-the-lawn” (Figura 1) houve um maior halo de inibição
dos Lactobacillos spp. que foram cultivados com o indutor, do que os que não tiveram
contato com o indutor (Miiler and Bassler, 2001; Sola et al, 2012; Hawver et al, 2016).
Os Lactobacillus spp. apresentaram antagonismo à Salmonella spp. (Figura 2),
conforme descrito por Lima e colaboradores (2009). Com isso pode-se reduzir a
ocorrência de tóxico infecção alimentar, a utilização de drogas no controle da doença
nas aves e também os gastos e perdas econômicas para os produtores.

46
Figura 1. Comparação entre halos (1) Lactobacillus spp. cultivados sem indutor e (2)
com o indutor frente a Salmonella Heidelberg pelo método “Spot -on-the-lawn ”
representados em milímetros.

Figura 2. (1) Foto do teste “Spot-on-the-lawn” de Lactobacilus spp. cultivados sem o

indutor frente a Salmonella Heidelberg . (2) Foto do teste “Spot -on-the -lawn ” de
Lactobacilus spp. cultivados com o indutor frente a Salmonella Heidelberg.

1 2

CONCLUSÃO

Conforme os resultados obtidos, pode-se concluir que as amostras de

Lactobacillus spp. têm um sistema de comunicação Quorum sensing amplamente
adaptado, que os confere capacidade de comunicar e de alterar o comportamento em
resposta a presença da Salmonella Heidelberg. Além disso, novas estratégias
antimicrobianas poderiam ser estudadas com as substâncias que este mecanismo produz
para a inibição do crescimento da Salmonella Heidelberg.

47
REFERÊNCIAS

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Roc, p. 96- 111, 2007.

Berchieri Junior, Ângelo. Salmonellose Aviária. In: Berchieri Júnior, A.; Macari, m.
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48
Shinohara, N. K. S.; Barros, V. B.; Jimenez, S. M. C.; Machado, E. C. L.; Dutra, R. A.
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a 1 9 – 2012.

49
 Diversidade de fungos basidiomicetos em tocos de eucalipto
Beatriz Lourenço Manzato1; Caroline Lourenço Manzato1; Djanira Rodrigues Negrão2; Paula Leite dos
Santos3; Tadeu Antônio Fernandes da Silva Júnior1

1
Mestrado em Ciência e Tecnologia Ambiental, Universidade do Sagrado Coração.
*[email protected]
2
Faculty of Forestry, University of Toronto.
3
Faculdade de Ciências Agronômicas (FCA), Universidade Estadual Paulista ‘Júlio de Mesquita Filho’
(UNESP)
______________________________________________________________________________________________
RESUMO
O eucalipto (Eucalyptus spp.) é o gênero florestal mais utilizado para fins comerciais
em nível mundial. Uma das maiores preocupações dos silvicultores são os resíduos
deixados na área após o corte do eucalipto. Na tentativa de solucionar o problema, os
produtores acabam optando pelo método de rebaixamento ou remoção dos tocos.
Entretanto, a destoca mecanizada causa inúmeros impactos negativos à sustentabilidade
florestal. O emprego de fungos degradadores de madeira pode ser uma alternativa eficaz
sem impactar negativamente o ambiente, mas ainda é um método pouco estudado e
empregado em áreas de reflorestamento de eucalipto. Este trabalho se destaca por ser o
primeiro a realizar o levantamento da diversidade de fungos basidiomicetos
macroscópicos em tocos de eucalipto, em áreas de reflorestamento no estado de São
Paulo, de diferentes idades, com potencial para utilização na destoca biológica. Foram
realizadas sete coletas entre os meses de setembro de 2016 a fevereiro de 2017, onde
cada fungo coletado foi fotografado individualmente para identificação. Os fungos de
maior ocorrência nos tocos com dois anos de idade foram dos gêneros Coprinus spp. e
Ganoderma spp. Na área com os tocos de um ano de idade houve predomínio dos
gêneros Coprinus spp. e Galerina spp. Não foram encontrados fungos nos tocos da área
recém-cortada. Houve maior ocorrência e diversidade de fungos basidiomicetos
macroscópicos na área de reflorestamento de eucalipto com tocos de dois anos de idade.
Palavras-chave: Destoca biológica. Floresta plantada. Áreas de reflorestamento.
Resíduos florestais. Bioprospecção.
______________________________________________________________________________________________

Diversity of basidiomycete fungi on eucalyptus stumps

ABSTRACT
Eucalyptus (Eucalyptus spp.) is the forest genus most commonly used for commercial
purposes worldwide. One of the biggest concerns of foresters is the residues left in the
area after cutting the eucalyptus. In an attempt to solve the problem, the producers end
up opting for the method of lowering or removing the stumps. However, mechanized
clearing causes numerous negative impacts to forest sustainability. The use of wood-
degrading fungi can be an effective alternative without negatively impacting the
environment, but it is still a poorly studied method used in reforestation areas of
50
eucalyptus. This work stands out as being the first to carry out a survey of the diversity
of macroscopic basidiomycete fungi in eucalyptus stumps, in reforestation areas in the
state of São Paulo, of different ages, with potential for use in biological stump removal.
Seven samplings were carried out between September 2016 and February 2017, where
each fungus was photographed individually for identification. The most frequent fungi
in the two years old stumps were of the genus Coprinus spp. and Ganoderma spp. In the
area with one year old stumps, there was predominance of the genus Coprinus spp. and
Galerina spp. No fungi were found on the stumps of the freshly cut area. There was a
higher occurrence and diversity of macroscopic basidiomycetes fungi in the area of
reforestation of eucalyptus with two years old stumps.
Keywords: Biological stump removal. Planted forest. Reforestation areas. Forest
residues. Bioprospecting.
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
O eucalipto (Eucalyptus spp.) é originário da Oceania, sendo reconhecidas cerca
de 730 espécies. Entretanto, apenas 20 delas são utilizadas para fins comercias em nível
mundial (Santarosa et al., 2014).
Uma das maiores preocupações dos silvicultores são os resíduos deixados na
área após o corte do eucalipto, sendo eles tocos, cepos ou cepas. Quando a área florestal
é reformada, o próximo plantio é realizado nas entrelinhas, dobrando-se assim o número
de tocos na área. Um método utilizado para solucionar o problema é o rebaixamento ou
arranque desses tocos. Porém, são inúmeros os impactos negativos à sustentabilidade
florestal, como remoção do carbono orgânico, aumento da erosão, exportação de
nutrientes do solo e alterações nas ciclagens de nutrientes e na qualidade dos recursos
hídricos (Foelkel, 2014).
Os principais problemas causados pelo rebaixamento e remoção de tocos são a
compactação do solo, perturbação da microbiota, remoção de matéria orgânica,
impactos no armazenamento do carbono e emissão de gases de efeito estufa, aumento na
erosão e alteração da ciclagem de nutrientes, além da redução da biodiversidade
(Casseli, 2013).
O emprego de fungos degradadores da madeira não patogênicos ao eucalipto,
conhecidos como fungos de podridão branca, é um dos métodos com maior potencial
para acelerar o processo de degradação de tocos e raízes. Nessa prática basicamente, é

51
feita a inoculação dos tocos com fungos adaptados à região onde serão aplicados, sendo
esta prática denominada destoca biológica (Abreu et al., 2007).
A ação de fungos e bactérias é responsável pelo processo de degradação das
raízes contribuindo para a sustentabilidade desse sistema, pois há uma redução da
exportação de nutrientes da área e a manutenção da biodiversidade (Abreu et al., 2007;
Alonso et al., 2007).
O conhecimento da diversidade de fungos basidiomicetos degradadores de
madeira é de extrema importância para o setor florestal brasileiro, visto que possuem
potencial para serem empregados na destoca biológica do eucalipto. Este trabalho é o
primeiro a avaliar a diversidade de fungos basidiomicetos macroscópicos de ocorrência
nos tocos de eucalipto, além de estudar a relação da idade dos tocos com a sua
diversidade.

MATERIAL E MÉTODOS
As coletas foram realizadas em áreas de reflorestamento de eucalipto da empresa
LWARCEL Celulose em talhões com tocos recém cortados, e com um e dois anos de
idade, totalizando-se três áreas: área 1 (tocos recém-cortados); área 2 (tocos com um
ano de idade) e área 3 (tocos com dois anos de idade). Cada área foi dividida em três
subáreas: 1A, 1B e 1C (subáreas da área 1); 2A, 2B e 2C (subáreas da área 2) e 3A, 3B
e 3C (subáreas da área 3). A dimensão de cada subárea foi de 20 x 5 metros (20 tocos
nas linhas x 5 tocos nas entrelinhas), em um total de 100 m2. Cada subárea foi espaçada
em 200 metros entre si.
Os fungos foram coletados entre os meses de setembro de 2016 a fevereiro de
2017 totalizando-se sete coletas, nas seguintes datas: 08∕09∕2016 (1ª coleta); 28∕09∕2016
(2ª coleta); 27∕10∕2016 (3ª coleta); 27∕11∕2017 (4ª coleta); 14∕12∕2016 (5ª coleta);
24∕01∕2017 (6ª coleta) e 15∕02∕2017 (7ª coleta), sendo que em cada coleta todas as áreas
foram vistoriadas em sua totalidade.
Cada fungo coletado foi fotografado no local de ocorrência e acondicionado em
sacos de papel de 500 g em uma caixa de isopor para transporte até o Laboratório de
Ciência e Tecnologia Ambiental da Universidade do Sagrado Coração para
identificação dos gêneros e das espécies segundo Largent (1986) e Lincoff (1982).

52
 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O maior número de fungos basidiomicetos foi detectado na área com os tocos de
dois anos de idade (área 3) (Tabela 1), sendo o maior número encontrado nos meses de
setembro (1ª coleta), outubro (3ª coleta) e dezembro (5ª coleta). Na área com tocos de
um ano de idade (área 2) os fungos foram encontrados apenas no mês de outubro (3ª
coleta) (Tabela 1). Não foram encontrados fungos basidiomicetos na área com os tocos
recém-cortados (área 1) (Tabela 1).
A maior abundância de fungos basidiomicetos foi verificada na área com os
tocos de dois anos de idade (área 3), sendo predominantes os gêneros Coprinus spp.,
Ganoderma spp. e Pycnoporus sanguineus (Tabela 2).

Tabela 1. Número de fungos basidiomicetos macroscópicos coletados em tocos de eucalipto em

sete coletas realizadas em três áreas de reflorestamento com tocos de diferentes idades: área com
tocos recém-cortados (Área 1 – subáreas 1A, 1B e 1C); área com tocos de um ano de idade (Área
2 – subáreas 2A, 2B e 2C); e área com tocos de dois anos de idade (Área 3 – subáreas 3A, 3B e
3C).
Área 1 Área 2 Área 3
Coletas 1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C
1 0 0 0 0 0 1 7 14 5
2 0 0 0 0 0 0 1 0 2
3 0 0 0 4 0 4 0 1 4
4 0 0 0 0 0 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0 0 4 0
6 0 0 0 0 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0 0 1 0 0

53
Tabela 2. Abundância de fungos basidiomicetos macroscópicos coletados em três áreas
de reflorestamento com tocos de diferentes idades: área com tocos recém-cortados
(Área 1 – subáreas 1A, 1B e 1C); área com tocos de um ano de idade (Área 2 – subáreas
2A, 2B e 2C); e área com tocos de dois anos de idade (Área 3 – subáreas 3A, 3B e 3C).
Área 1 Área 2 Área 3
Gênero ∕ Espécie 1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C

Auricularia spp. 0 0 0 0 0 0 0 1 0

Coprinus spp. 0 0 0 2 0 3 1 11 1

Fuscoporia spp. 0 0 0 0 0 0 0 0 4

Galerina spp. 0 0 0 2 0 2 0 0 1

Ganoderma spp. 0 0 0 0 0 0 7 4 3
Pycnoporus 0 0 0 0 0 0 1 3 5
sanguineus

CONCLUSÕES
A idade dos tocos influenciou a quantidade e a diversidade dos fungos
basidiomicetos macroscópicos nas áreas de reflorestamento de eucalipto avaliadas.

REFERÊNCIAS

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Transferência de tecnologia florestal: cultivo de eucalipto em propriedades rurais:
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55
 Avaliação de microrganismos contaminantes da
micropropagação de pinhão manso
Bruno Fernando de Souza1; Daniela Defavari do Nascimento1*; Rosana Maria de Oliveira Freguglia1

1
Faculdade de Tecnologia de Piracicaba “Dep. Roque Trevisan” - Fatec Piracicaba.
*[email protected]

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
O pinhão manso (Jatropha curcas L.) é uma planta rústica, perene e que possui elevado
teor de óleo em suas sementes, tendo assim, grande potencial para a produção
energética. A propagação de genótipos superiores ainda é um desafio que pode ser
minimizado com o auxílio de técnicas biotecnológicas, como a micropropagação. A
cultura de tecidos é uma técnica bastante empregada para a multiplicação clonal de
plantas in vitro. No entanto, deve-se ter cuidado com o manuseio dos materiais de forma
a evitar contaminações por microrganismos, geralmente fungos e bactérias. Mesmo com
todos os cuidados, ainda é possível que haja contaminantes que não possam ser
removidos pelos métodos de assepsia, como é o caso dos microrganismos endofíticos,
que podem ou não causar patogenia nos tecidos em que se hospedam. Neste trabalho,
foram isolados os microrganismos presentes nas contaminações de explantes de pinhão
manso já estabelecidos in vitro. Para esta finalidade, microrganismos persistentes ao
longo do processo de regeneração de plantas foram inoculados em placas com meios de
cultura seletivos, YPD e YPD acrescido de antibióticos para fungos e leveduras e ágar
nutriente para bactérias. Posteriormente, realizou-se a coloração de Gram para
determinação da estrutura celular bacteriana e sua forma. Amostras provenientes de
contaminação de calos regenerados a partir de gemas (cocos gram +), em sua maioria,
são diferentes dos encontrados nos calos provenientes de embriões (bacilos gram +).

Palavras-chave: micropropagação, contaminação, microrganismos, pinhão manso.

______________________________________________________________________________________________

Evaluation of contaminating microorganisms at Jatropha micropropagation

ABSTRACT
Jatropha curcas L. is a rustic, perennial plant that has a high oil content in its seeds, and
thus has great potential for energy production. The propagation of higher genotypes is
still a challenge that can be minimized with the aid of biotechnological techniques, such
as micropropagation. Tissue culture is a widely-used technique for clonal multiplication
of plants in vitro. However, care must be taken in handling the materials to avoid
contamination by microorganisms, usually fungi and bacteria. Even with all care, it is
still possible that there are contaminants that cannot be removed by asepsis methods,
such as endophytic microorganisms, which may or may not cause pathogenesis in the
tissues in which they are housed. In this work, the microorganisms present in the
contaminations of Jatropha explants, already established in vitro, were isolated.

56
Persistent microorganisms obtained during plant regeneration process were inoculated
in plates with selective culture media, YPD and YPD supplemented with antibiotics for
fungi and yeasts and nutrient agar for bacteria. Subsequently, Gram staining was
performed to determine the bacterial cell structure and its shape. Samples from
contamination of callus regenerated from buds (gram + coccus), are usually different
from those found in calli from embryos (gram + bacilli).

Keywords: micropropagation, contamination, microorganisms, Jatropha.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
A cultura do pinhão manso (Jatropha curcas L.) se destaca como fonte
alternativa de cultura energética, que está ganhando importância, devido seu teor
elevado de óleo (30-40%) nas sementes e a composição lipídica semelhante ao
combustível fóssil. Além disso, por ser tóxica à ingestão humana, não compete com
fontes de óleo comestível (Deodore and Johnson, 2008).
Um desafio a ser vencido é a produção e obtenção de mudas selecionadas a
partir de plantas matrizes superiores e livres de contaminação microbiológica. Com isso,
a micropropagação aparece como alternativa viável para obtenção de plantas livres de
patógenos e para a propagação de elevada quantidade de plantas, em curto período de
tempo (Saturnino et al., 2005).
A associação entre meio de cultura e as condições físicas nas quais são
incubados os explantes, formam um ambiente extremamente favorável à proliferação de
microrganismos (Damião Filho, 1995). Essas contaminações podem ocorrer pela
presença de micróbios externos (epifíticos) ou endofíticos (Esposito-Polesi, 2011). No
caso de contaminações epifíticas, o manuseio e a falta de prática do manipulador podem
ser um fator determinante para que isso ocorra. Porém, mesmo tomando todas as
providências de uma assepsia rotineira, às vezes não é possível contornar
completamente a contaminação, por esta ter uma base endógena (Cid, 2010).
Contaminações que ocorrem frequentemente na cultura de tecidos vegetais
podem não ser consequência de ineficiência na técnica ou de descuido do manipulador,
mas sim da presença de microrganismos endofíticos, que nem sempre são caracterizados
como patógenos (Azevedo, 1998).
O presente trabalho objetivou identificar quais os microrganismos responsáveis
pela contaminação de explantes de pinhão manso micropropagados em meios de cultura
diversos.

57
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizadas gemas apicais/laterais e embriões de sementes de pinhão
manso, retiradas de plantas cultivadas no campus da Fatec Piracicaba “Dep. Roque
Trevisan”. As gemas foram coletadas, com aproximadamente 0,5cm de comprimento.
No laboratório, as gemas e sementes foram submetidas a processo de assepsia em
câmara de fluxo laminar, com solução de hipoclorito de sódio comercial (3:1) por 2
minutos, seguida de solução de etanol 70% por 1 minuto. Os explantes foram então
enxaguados em água autoclavada e inoculados nos meios de cultura.
Os meios de cultura usados foram: M1 – MS (MURASHIGE and SKOOG,
1962); M2 – MS + 0,2mg.L-1 de 6-benzilaminopurina (BAP) + 1,0mg.L-1 de ácido
naftaleno acético (NAA); M3 – 50% dos sais do meio MS + 0,2mg.L-1 de 6-
benzilaminopurina (BAP) + 1,0mg.L-1 de ácido naftaleno acético (NAA). Todos os
meios foram suplementados com sacarose (30 g L-1) e Phytagel® (2,3g.L-1). O pH foi
aferido para 5,7±0,1 antes da autoclavagem (120°C e 1 Kgf.m-2) por quinze minutos.
A incubação foi realizada em sala de crescimento climatizada (25 ± 3 °C), sob
fotoperíodo de 16 horas luz/escuro. Os explantes foram avaliados a cada 30 dias,
contados da data de inoculação, período esse que compreende a fase de estabelecimento
da cultura.
Microrganismos que apareceram durante o processo de micropropagação, após
estabelecimento do cultivo in vitro, foram isolados em meios de cultura apropriados
para posterior caracterização. Para identificação de fungos, foram usadas placas de Petri
com meios de cultura YPD e YPD acrescido de antibióticos (YPD/A) (100mg.L-1 de
cloranfenicol + 100mg.L-1 de tetraciclina). Para isolamento de bactérias, foram usados
meios ágar nutriente (NA). Análises de Gram também foram efetuadas. Uma alçada de
cada colônia do microrganismo contaminante foi dissolvida em solução salina 0,9%
(NaCl). Amostras destas diluições foram estriadas (semeadas com auxílio da alça de
platina) nos meios de cultura YPD, YPD/A e NA. Para observação do crescimento do
microrganismo, foram feitos plaqueamento, através da técnica de profundidade (pour
plate), em meio NA.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Inicialmente, para estabelecimento da cultura in vitro a contaminação é maior,
especialmente por fungos, tendo sido obtidos níveis de 90% de contaminações quando
se utilizou embriões zigóticos como explante, e 80% de perdas por contaminação

58
quando foram utilizadas gemas axilares. O índice de sobrevivência dos explantes não
contaminados nos primeiros 30 dias, foi de 100%. Nesta fase, os fitorreguladores
presentes nas formulações dos meios M2 e M3 (1,0mg;L-1 NAA e 0,2mg.L-1 BAP) se
mostraram essenciais para o desenvolvimento dos explantes, sendo responsáveis pela
indução de regeneração celular e desenvolvimento de calos com aspecto embriogênico.
Explantes mantidos na formulação de meio M1 (sem fitorreguladores) não foram
induzidos à formação de calos.
As contaminações que surgiram no estabelecimento in vitro da cultura não foram
analisadas neste trabalho, dando-se importância às contaminações que apareceram após
cultivo já estabelecido. Mais especificamente, 4 meses após inoculação 30% dos calos
em regeneração começaram a apresentar contaminações. Deste material contaminado,
foram escolhidas 8 amostras representativas das contaminações obtidas nos calos
regenerados a partir dos explantes, 4 de gemas (amostras 1 a 4) e 4 de embriões
zigóticos (amostras 5 a 8), as quais foram diluídas em solução salina 0,9% (NaCl) e
inoculadas em meios YPD, YPD/A e NA conforme descrito na metodologia.
As 8 amostras cresceram nos meios sem antibióticos, exceto as amostras 5 e 8
que não cresceram no meio NA quando inoculado pour plate. Estas mesmas duas
amostras, foram as únicas que cresceram também no meio YPD/A (Tabela 1).
Análise de coloração de Gram (Figura 1) indica que as amostras provenientes de
contaminação de calos regenerados a partir de gemas (cocos gram +), em sua maioria,
tratam-se de microrganismos diferente dos encontrados nos calos provenientes de
embriões (bacilos gram +). As únicas exceções foram a amostra 4, que além de
apresentar bactérias tipo cocos semelhantes às amostras 1, 2 e 3, apresentou também
bactérias do tipo bacilos, todas Gram positivas. A amostra 7 apresentou contaminação
na forma de cocos gram positivos, semelhante às amostras de contaminações de calos
provenientes de gemas. Outra exceção foi a amostra 8, que quando o microrganismo foi
isolado em YPD/A (Figura 1 8a), observou-se pequenos bacilos gram negativos,
enquanto que, microrganismos da mesma amostra, quando isolados em NA (Figura 1
8b) apresentou bacilos gram prositivos, semelhantes aos obtidos em análise das
amostras 5 e 6.
É importante mencionar que as transferências para renovação de meios de
cultura foram realizadas sempre num mesmo dia para todos os calos, independente do
tipo de explante de indução, desta forma, a chance de ter ocorrido contaminação por

59
manipulação fica menor, já que microrganismos contaminantes diferentes foram
encontrados conforme a fonte de explante usados.
Conforme Azevedo (1998), as técnicas biotecnológicas de propagação de
plantas, quase nunca levam em consideração os microrganismos endofíticos, o que pode
ocasionar desequilíbrio entre a planta e o endófito, resultando em respostas patogênicas.
Desta forma, há possibilidade de a contaminação ter sido desencadeada pelo estresse
sofrido pelo material já estabelecido in vitro, levando-se à suspeita de se tratar da
manifestação de microrganismos endofíticos.

Tabela 1: Crescimento microbiológico nos meios de cultura NA, YPD e YPD/A, avaliação de Gram e
forma dos microrganismos observados em microscópio óptico.
Meio de
1 2 3 4 5 6 7 8
Cultura
NA + + + + + + + +
NA pour
+ + + + - + + -
plate
YPD + + + + + + + +
YPD/A - - - - + - - +
+ em NA
Gram - + + + + - -
- em YPD
Forma cocos e
cocos cocos cocos bacilos bacilos cocos bacilos
bacilos
(+) houve crescimento e (-) não houve crescimento

1a 1b 2 3 4

5 6 7 8a 8b

Figura 1: Micrografias de análise de gram de microrganismos isolados, contaminantes da

micropropagação de pinhão manso. Amostras 1 a 4 microrganismos contaminantes em calos
provenientes de gemas como explantes; Amostras 5 a 8 microrganismos contaminantes em
calos provenientes de embriões como explantes. Algumas amostras apresentaram
microrganismos diferentes dependendo do meio em que foi isolado: 1a: isolado em YPD, 1b:
isolado em NA, 8a: isolado em YPD/A, 8b: isolado em NA. Demais amostras apresentaram
microrganismos com características similares independente do meio usado para seu
isolamento.

60
CONCLUSÕES
Os fitorreguladores (1,0mg;L-1 NAA e 0,2mg.L-1 BAP) se mostraram essenciais
para a regeneração dos explantes de pinhão manso.
Amostras provenientes de contaminação de calos regenerados a partir de gemas
(cocos gram +), em sua maioria, são diferentes dos encontrados nos calos provenientes
de embriões (bacilos gram +).

AGRADECIMENTO
Agradecemos ao CNPq pela bolsa de iniciação científica concedida a Bruno
Fernando de Souza, para desenvolvimento deste projeto.

REFERÊNCIAS

AZEVEDO, J.L., 1998. Microrganismos endofíticos. In: I.S. MELO, ee. Ecologia
Microbiana. Jaguariúna: Embrapa-CNPMA, pp. 117-137.
CID, L.P.B. (editor técnico), 2010. Cultivo in vitro de plantas. Brasília: Embrapa
Informação Tecnológica.
DAMIÃO FILHO, C.F., 1995. Micropropagação. Jaboticabal: FUNEP.
DEORE, A. C. and JOHNSON, S., 2008. High-frequency plant regeneration from leaf-
disc culture of Jatropha curcas L.: an important biodiesel plant. Plant Biotechnology
Reports, vol. 2, no. 1, pp. 7-11.
ESPOSITO-POLESI, N.P., 2011. Microrganismos endofíticos e a cultura de tecidos
vegetais: quebrando paradigmas. Revista Brasileira de Biociências, vol. 9, no. 4, pp.
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MURASHIGE, T. and SKOOG, F., 1962 A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, vol. 15, no. 1, pp. 473-
479.
SATURNINO, H.M.; PACHECO, D.D.; KAKIDA, J.; TOMINAGA N.;

GONÇALVES, N.P., 2005. Cultura do Pinhão Manso (Jatropha curcas L.). Informe

Agropecuário, vol. 26, no. 229, pp. 44-78.

61
 Biofertilizante no controle de fitonematóides em tomateiro
Camila Kiritani1*; Valdionei Giassi2

1
Centro de Pesquisa Mokiti Okada, filial da Fundação Mokiti Okada, Ipeúna/SP, CEP 13537-000, Brasil.
*(e-mail: [email protected])
2
Centro de Pesquisa Mokiti Okada- CPMO, filial da Fundação Mokiti Okada
____________________________________________________________________________________________

RESUMO

O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da aplicação no solo do

biofertilizante FertBokashi®Premium, produto a base de água, extrato de levedura,
composto orgânico e melaço de cana, para a redução populacional de nematóides nas
raízes. O experimento foi realizado em casa de vegetação contendo 3 tratamentos: sem
aplicação do biofertilizante, aplicação do biofertilizante preventivamente e aplicação do
biofertilizante curativamente com 7 repetições. Após 60 dias, as plantas foram coletadas
e avaliadas a massa seca da parte aérea, massa fresca da raiz e contagem de ovos e
juvenis. A aplicação do biofertilizante reduziu o número de ovos e juvenis tratados
preventivamente em 56% em relação ao controle. A massa fresca da raiz e a massa seca
da parte aérea não diferiram significativamente do controle.

Palavras-chave: produto biológico, Meloidogyne spp., nematóides das galhas, controle

biológico, Solanum lycopersicum
______________________________________________________________________________________________

Biofertilizer in the control of phytonematoids in tomato crop

ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate the effect of the application in the soil of a
biofertilizer FertBokashi®Premium, water-based product, yeast extract, organic
compound and sugar cane mollasses, for the population reduction of nematodes in the
roots. The experiment was carried out in a greenhouse containing 3 treatments: no
biofertilizer application, biofertilizer application preventively and biofertilizer
application curatively with 7 replications. After 60 days, the plants were collected and
evaluated dry mass of the aerial part, fresh mass of the root and egg and juveniles
counts. The application of the biofertilizer reduced the number of eggs and juveniles
treated preventively in 56% in relation to the control. The fresh root mass and dry mass
of the aerial part did not differ significantly from the control.

Keywords: biological product, Meloidogyne spp., root-knot nematode, biological

control, Solanum lycopersicum
______________________________________________________________________________________________

62
INTRODUÇÃO
O tomateiro (Solanum lycopersicum) é atacado por inúmeros patógenos que
causam os mais variados tipos de doenças. Os nematóides do gênero Meloidogyne,
formam estruturas no sistema radicular da planta denominadas galhas e podem
ocasionar murcha das plantas durante os períodos mais quentes do dia, desfolha
prematura, sintomas de deficiência mineral, clorose, redução e deformação do sistema
radicular. São os patógenos de maior importância econômica, causando perda de
produtividade com cerca de 25 a 85% (Araújo and Marchesi, 2009; Carvalho et al.,
1999; Nunes et al., 2010; Sousa et al., 2006). Quando atacadas severamente apresentam
redução do tamanho e da eficiência de seu sistema radicular (Robl et al., 2012).
O controle de nematóides por meio de nematicidas além de apresentar riscos à
saúde humana, animal e ao meio ambiente são pouco eficientes no controle de
meloidoginose em hortaliças (Sousa et al.,2006). Contudo, o controle biológico tem se
apresentado uma alternativa mais viável para o manejo destes fitopatógenos, por
minimizar o dano ambiental e por ser economicamente mais vantajoso, em comparação
aos métodos químicos convencionais (Araújo and Marchesi, 2009).
Neste trabalho, o objetivo foi avaliar o potencial de controle de nematóides
fitoparasitos por meio da aplicação do biofertilizante no solo, fornecendo assim uma
alternativa de controle destes patógenos.

MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido em casa de vegetação no Centro de Pesquisa
Mokiti Okada- Ipeúna-SP.
Utilizou-se vasos com capacidade para 2 litros, como substrato foi utilizado uma
mistura de solo arenoso (50%) e areia grossa (50%), ambos submetidos ao processo de
autoclavagem a 121°C por duas horas.
Foram utilizadas sementes de tomates da variedade “Santa Clara” semeadas em
bandejas plásticas de 128 células, contendo substrato autoclavado. Após 20 dias, as
mudas foram transplantadas em vasos, onde cada vaso recebeu uma muda,
representando uma unidade experimental.
Para este estudo, foi utilizado o FertBokashi ®Premium, biofertilizante a base de
água, extrato de levedura, composto orgânico e melaço de cana de açúcar.

63
 O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, sendo 3
tratamentos com 7 repetições. Desta forma, o experimento contou com os seguintes
tratamentos: T1- testemunha, irrigado somente com água; T2- aplicação do
biofertilizante, de forma preventiva (antes da inoculação dos nematóides) e T3-
aplicação do biofertilizante, de forma curativa (após a inoculação dos nematóides). A
aplicação do produto foi realizada semanalmente via irrigação, com 0,05 mL por vaso.
Foram inoculados 3.300 ovos de Meloidogyne spp. por planta. Antes da
inoculação, foram feitos 3 orifícios de 3 cm de profundidade em cada vaso, ao redor do
colo da planta, para que a suspensão infestasse diretamente a raiz. Com o auxílio de um
micropipetador, foram inoculados 1 mL da suspensão em cada orifício.
Após 60 dias, foram coletadas e extraídas as raízes das plantas e avaliados os
seguintes parâmetros: contagem de ovos e juvenis na massa total e em 10 gramas de
raiz, massa seca da parte aérea e massa fresca da raiz. Para extração dos ovos e juvenis
utilizou-se o método de Jenkins (Jenkins, 1964).
As médias foram submetidas à análise de variância e comparadas pelo teste de
Tukey a 10% de probabilidade com o auxílio do programa SISVAR (Ferreira, 2000).

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os tratamentos que foram submetidos a aplicação do biofertilizante foram
eficientes na redução da população dos nematóides em relação ao tratamento controle
(Tabela 1). O número de ovos e juvenis na massa fresca total das raízes, foi
significativamente menor quando a aplicação do biofertilizante ocorreu de forma
preventiva, reduzindo em 56% da população em relação ao controle. Apesar do
tratamento curativo não diferir estatisticamente, este reduziu em 37% o número de ovos
e juvenis em relação ao tratamento, onde não houve a aplicação do produto (Figura 1).
Tais resultados corroboram com o estudo de Sousa et al. (2006), onde a redução
do número de massa de ovos de nematóides em raízes de tomate foi ocasionada pelo
tratamento das mudas com cepas de micro-organismos. Segundo Maciel and Ferraz
(1996), o controle biológico de nematóides pode ocorrer pela produção de exsudatos
radiculares com propriedades nematicidas ou nematostáticas, reduzindo assim a
capacidade reprodutiva.

64
Tabela 1- Efeito do biofertilizante sobre o número de ovos e juvenis na massa fresca de
10 gramas de raiz (MFR 10), número de ovos e juvenis na massa fresca total da raiz
(MFR total), massa seca da parte aérea (MSPA) e massa fresca da raiz (MFR) de
tomateiro cv. Santa Clara.

MFR
MFR 10 MSPA MFR
Tratamento Total
(nº ovos e juvenis) (g) (g)
(nº ovos e juvenis)
Controle 3.460 a(1) 15.529 b(1) 19,43 a(1) 42,95 a(1)
Preventivo 2.124 a 6.904 a 19,85 a 35,6 a
Curativo 2.467 a 9.823 ab 20,09 a 39,42 a
CV% 27,84 30,23 8,14 10,34
(1)Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 10% de
probabilidade. Dados transformados a x^0,5.

55,54
60,00
50,00 41,97
% de redução

40,00 36,74
32,60 Preventivo
30,00
Curativo
20,00
10,00
0,00
População/10g raiz População/peso total raiz

Figura 1- Percentual de redução populacional de Meloidogyne spp. nos tratamentos

com aplicação de biofertilizante preventivo e biofertilizante curativo em relação ao controle.

De acordo com Freitas (2001), a transformação dos exsudatos radiculares pelos

micro-organismos pode fazer com que o nematóide não reconheça o estímulo
quimiotrópico e continue movimentando-se no solo até morrer. O mesmo autor ainda
cita que as rizobactérias ou seus metabólitos desencadeiam reações de
hipersensibilidade nas células vegetais, impedindo que as fêmeas dos nematóides
consigam energia suficiente para produzir ovos.
Apesar de não haver diferenças estatísticas entre os tratamentos no número de
ovos e juvenis em 10 gramas de raiz, a redução da populacional é bastante relevante em
relação ao controle, com diferenças de 1340 e 993 ovos e juvenis no tratamento
preventivo e curativo respectivamente.
Em infestações severas, os nematóides fitoparasitas tendem a reduzir o
desenvolvimento e consequentemente diminuem a massa da matéria seca das raízes

65
(Vilas-Boas et al., 2002). Todavia, a massa fresca da raiz avaliada neste estudo, obteve
maior peso somente no tratamento controle. A massa seca da parte aérea também não
demonstrou resultados significativos em relação ao controle, porém obteve uma maior
massa no tratamento curativo com aplicação do biofertilizante.
Estudos demonstram que o controle biológico dos fitonematoides utilizando
cepas individuais ou associações de micro-organismos, possuem capacidade de
biocontrole desses fitopatógenos, como produção de antibióticos, enzimas líticas e
indução a resistência (Dallemore-Giaretta et al., 2010; Sousa et al., 2006), corroborando
que a aplicação do biofertilizante via irrigação no solo realizado de forma preventiva,
pode ser uma alternativa viável no manejo do nematoide das galhas.

CONCLUSÕES
O biofertilizante mostrou-se eficiente no controle dos fitonematóides quando
aplicado no solo preventivamente. Avaliações a campo serão necessárias para
comprovar a eficiência do produto.

AGRADECIMENTO
Apoio financeiro do Centro de Pesquisa Mokiti Okada e Korin Agropecuária.

REFERÊNCIAS

ARAÚJO, F. F. and MARCHESI, G. V. P., 2009. Uso de Bacillus subtilis no controle

da meloidoginose e na promoção do crescimento do tomateiro. Ciência Rural, vol.39,

pp.1558-1561.

CARVALHO, J.W.A., MALUF, W.R., FIGUEIRA, A.R. and GOMES, L.A.A., 1999.

Obtenção de linhagens de tomateiro de crescimento determinado com resistência

múltipla a nematóides de galhas e a tospovírus. Ciência e Agrotecnologia, vol.23,

pp.593-607.

DALLEMORE-GIARETTA, R. et al., 2010. Associação de Pochonia chlamydosporia,

Bacillus cereus e fibra de coco no controle de Meloidogyne javanica em tomateiro.

Nematologia Brasileira, vol.34, nº1, pp. 18-22.

66
FERREIRA, D. F. Manual do Sistema SISVAR para análises estatísticas. Universidade

Federal de Lavras, 2000. 66 p.

FREITAS, L.G., 2001 [viewed 02 March 2017]. Rizobactérias versus nematóides [on

line]. Viçosa. Available from: http://www.ufv.br/dpf/labnematologia/rizo.pdf.

JENKINS, W. R.,964 A rapid centrifugal – flotation technique for separating nematodes

from soil. Plant Diasease Report, vol. 48, pp. 692.

MACIEL, S.L. and FERRAZ, L.C.C.B., 1996. Reprodução de Meloidogyne incognita

raça 2 e de Meloidogyne javanica em oito espécies de plantas medicinais. Scientia

Agricola, vol.53, pp.956-960.

NUNES, H. T., MONTEIRO, A.C. and POMELA, A.W.V., 2010. Uso de agentes

microbianos e químico para o controle de Meloidogyne incognita em soja. Acta

Scientiarum Agronomy, Maringá, vol. 32, no. 3, pp. 403-409.

ROBL, D.; et al., 2012. Controle de nematóides das galhas em plantas de tomate com

isolados mutantes de Paecilomyces Lilacinus. Universidade Federal do Paraná – UFPR,

Iniciação Científica CESUMAR jul./dez, vol. 14, no. 2, pp. 213-219.

SOUSA, C. S., SOARES, A.C.F., GARRIDO, M. S. and ALMEIDA, G.M.C.O., 2006.

Estreptomicetos no controle da meloidoginose em mudas de tomateiro. Pesquisa

Agropecuária Brasileira, vol.41, pp.1759-1766.

VERZIGNASSI, J. R, et al., 2007. Podridão de raízes de bananeira PV0376 causada por

Meloidogyne incognita no Pará. In Anais da Jornada de Iniciação Científica do Pet, 2.

Belém, PA, 2007. Belém, PA: PROEN/UFRA.

VILAS-BOAS, L. C. et al., 2002. Reação de clones de bananeira (Musa spp.) ao

nematóide Meloidogyne incógnita (Kofoid & White, 1919) Chitwood, 1949, Raça 2.

Revista Brasileira de Fruticultura, vol. 24, no. 3, pp. 690-693.

67
 Monitoramento do crescimento de bactérias formadoras de
biofilmes
Camila A. Ribeiro1 *; Jackson E. N. Batalha1; William de M. Silva2

1
Departamento de Bioprocessos e Biotecnologia, FCA-Unesp, Botucatu, *[email protected]
2
Instituto de Biotecnologia-IBTEC Unesp-Botucatu e Departamento de Bioprocessos e Biotecnologia,
FCA-Unesp, Botucatu.
______________________________________________________________________________________________

RESUMO

Os chamados biofilmes são, basicamente, uma camada (ou película) de micro-

organismos fortemente aderidos sobre uma superfície. Este fenômeno ocorre em
diversas situações do cotidiano, por exemplo, em instalações hidráulicas, como
tubulações, pias e cubas até mesmo sobre instrumentos cirúrgicos, médicos e
odontológicos. Está fina camada na escala de micrômetros é protegida por uma
substância extracelular polimérica que é peculiar dos biofilmes, conferindo ao
organismo presente no biofilme uma resistência aos agentes externos naturais nocivos à
sua manutenção e reprodução. Este trabalho tem como objetivo o levantamento da curva
de crescimento de bactérias formadoras de biofilmes. Dessa maneira, está sendo
apresentada a metodologia empregada para três bactérias formadoras de biofilme:
Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Com isso, espera-
se que essas informações ajudem diretamente na saúde pública em vista do papel quase
invisível dos biofilmes na transmissão de doenças

Palavras-chave: Superfícies, Adesão, Saúde, S. aureus, E. coli, P. aeruginosa.

______________________________________________________________________________________________

Monitoring the growth of biofilm-forming bacteria

ABSTRACT
So-called biofilms are basically a layer (or film) of microorganisms strongly
adhered to a surface. This phenomenon occurs in various everyday situations, for
example, in hydraulic installations, such as pipes, sinks and vats even on surgical,
medical and dental instruments. This thin layer on the micrometer scale is protected by
a polymeric extracellular substance that is peculiar to biofilms, giving the organism
present in the biofilm a resistance to natural external agents harmful to its maintenance
and reproduction. This work aims to survey the growth curve of biofilm forming-
bacteria. In this way, it is being presented the methodology used for three biofilm
forming bacteria: Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas
aeruginosa. Thus, it is hoped that this information will directly aid public health in
view of the almost invisible role of biofilms in disease transmission.

Keywords: Surface, Attach, Health, S. aureus, E. coli, P. aeruginosa.

68
INTRODUÇÃO
Nos últimos anos alguns trabalhos interessantes têm mostrado a importância do
estudo dos biofilmes (Gaspar-Grillo et al., 2012) principalmente com os aspectos
pertinentes à saúde humana, visto que diversos micro-organismos causadores de
doenças podem ser encontrados inseridos em biofilmes (Mendes et al., 2011; Flores et
al., 2009). M. Wilkins afirma que por volta da década de 1970, cientistas perceberam
que diversas bactérias eram capazes de aderir e crescer em diferentes superfícies do
ecossistema. Em seu trabalho, Wilkins et al. (2014) explica sobre 5 etapas do ciclo de
vida de um biofilme: (1) a adesão das bactérias, (2) divisão das bactérias, (3) camada
protetora extracelular polimérica e (4) a formação de colônias em estruturas
tridimensionais capazes de transportar oxigênio e nutrientes através de canais de
comunicação. Por fim, em (5) o ciclo se encerra com o espalhamento de pequenas
porções do biofilme que formarão um novo biofilme (Wilkins et al., 2014). Além desses
estudos, A. Braem produziu um mecanismo de liberação controlada de antibiótico na
superfície de titânio para evitar rejeições causadas por biofilmes que conduzem a perda
de ossos, amputações e recidivismo (Braem et al.,2015).

MATERIAL E MÉTODOS

Cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa

foram descongeladas da bacterioteca do Instituto de Biotecnologia Unesp - IBTEC.
Foram utilizados os processos convencionais de plaqueamento com ágar TSA e
MacConkey, além dos testes coloração Gram e EPM –mili – citrato. Após o isolamento
de colônias individuais para cada placa, foi realizada a inoculação em meio líquido em
que imediatamente foi colocado à temperatura de 37° C. A partir de então, nos tempos
0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 24, 30 e 48 horas foram feitas medidas de absorbância
através de um equipamento marca Eppendorf biophotometer ® d30 para a avaliação da
densidade ótica.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na Figura 2 podem ser observadas duas fotografias. À esquerda verifica-se a
placa contendo as colônias oriundas da bactéria Staphylococcus aureus, enquanto que à
direita, está sendo apresentada a colônia isolada em que foi retirada a bactéria para a

69
inoculação no meio líquido. O diâmetro de 5 mm foi medido com o auxílio de uma
lupa.

Figura 2 – À esquerda, observa-se o crescimento da Staphylococcus aureus em

48h de incubação a 37° C. À direita, observa-se uma imagem feita com o auxílio de
uma lupa no momento de escolha das colônias a serem utilizadas, com
aproximadamente 5 mm de diâmetro.

Na figura 3, semelhante à figura anterior, pode-se observar a placa feita para a

Staphylococcus aureus. Após, o tempo de 48 horas na temperatura de 37° C foi retirada
a bactéria de uma colônia isolada para o procedimento de inoculação no meio líquido.
De maneira análoga, foi obtida a colônia, porém percebe-se que o diâmetro é de
aproximadamente 2 mm.

Figura 3 - À esquerda, observa-se o crescimento da Escherichia coli em 48h de

incubação a 37° C. À direita, observa-se a colônia a ser utilizada com
aproximadamente 2 mm de diâmetro.

Na Figura 4, semelhante à figura anterior, pode-se observar a placa feita para a

Pseudomonas aeruginosa. Após, o tempo de 48 horas na temperatura de 37° C foi
retirada a bactéria de uma colônia isolada para o procedimento de inoculação no meio
líquido.

70
 Figura 4 - À esquerda, observa-se o crescimento da Pseudomonas aeruginosa
em 72h de incubação a 37° C. À direita, observa-se a colônia com aproximadamente
8 mm de diâmetro.

Foram construídos os gráficos da variação da absorbância em função do tempo após

a realização de todas as medidas em triplicata. Na Figura 5, observa-se a curva de
crescimento obtida para a Staphylococcus aureus. Pode-se notar um crescimento mais
acentuado entre os tempos de 1 hora a até 10 horas. Após dez horas na estufa, a leitura
de absorbância se manteve estável, o que indica que a densidade óptica chegou ao seu
máximo. Provavelmente, isto está relacionado com o limite máximo de crescimento das
bactérias nesse meio.

Figura 5- Curva de crescimento para a Staphylococcus aureus obtida através da

leitura da absorbância em cada tempo. Os pontos de absorbância do gráfico são
resultados de uma média, pois a leitura foi feita em triplicata.

Na Figura 6, observa-se a curva de crescimento obtida para a Escherichia coli.

Assim como a curva obtida para a Staphylococcus aureus, tem-se um elevado aumento
até as dez horas. Porém, percebe-se que a leitura de densidade óptica é levemente menor
para essa bactéria, sendo um indício da menor taxa de crescimento.

71
 Figura 6– Curva de crescimento para a Escherichia coli obtida através da leitura
da absorbância em cada tempo. Os pontos de absorbância do gráfico são resultados
de uma média, pois a leitura foi feita em triplicata.

Na Figura 7, observa-se uma curva de crescimento para Pseudomonas aeruginosa

totalmente diferente em relação ás anteriores.

Figura 7- Curva de crescimento para da Pseudomonas aeruginosa obtida através

da leitura da absorbância em cada tempo. Os pontos de absorbância do gráfico são
resultados de uma média, pois a leitura foi feita em triplicata.

CONCLUSÕES
O isolamento das colônias para a verificação do crescimento das bactérias é
essencial para evitar problemas de contaminação, e com isso ter maior confiabilidade no
ensaio de absorbância. A variação do diâmetro entre as colônias oriundas de diferentes
bactérias é uma indicação da taxa de crescimento para cada uma delas. Um aumento de
leitura de absorbância nas primeiras horas indica um aumento substancial na taxa de
crescimento de cada bactéria. Diferentemente, ocorre uma estabilização da absorbância.

72
Diante disso, é preciso entender os fatores envolvidos nesse comportamento, e com isso,
conciliar esses fatores com o exato momento de formação do biofilme.

AGRADECIMENTO
Este trabalho foi realizado com recursos obtidos pela Fundação de Amparo à
Pesquisa – FAPESP, processo n° 2015/20438-6. Agradecemos também a SISPROPE-
Unesp pela bolsa de iniciação científica.

REFERÊNCIAS

[1] GASPAR-GRILLO, J. et al. Isolamento e identificação de micobactérias em águas

tratadas provenientes do sistema de abastecimento de Araraquara-SP. Alim. Nutr., vol.
23, n. 1, pp. 147-155, 2012. ISSN 0103-4235 ISSN 2179-4448 on line.
[2] MENDES, R. et al, 2011. Contaminação por Bacillus cereus em superficies de
equipamentos e utensílios em unidade de alimentação e nutrição. Ciência e Saúde
coletiva, vol. 16 (9), pp. , 2011. http://dx.doi.org/10.1590/S1413-81232011001000030.

[3] FLORES, A. et al, 2009. Oral bacterial adhesion on amorphous carbon films.
Diamond & Related Materials vol. 18, pp. 1179–1185, 2009.
http://dx.doi.org/10.1016/j.diamond.2009.03.003.
[4] WILKINS, M. et al, 2014. New approaches to the treatment of biofilm-related
infections. Journal of Infection, vol. 69, no. S1, pp. S47–S52, 2014.
http://dx.doi.org/10.1016/j.jinf.2014.07.014.
[5] BRAEM, A. et al, 2015. Novel anti-infective implant substrates: Controlled release
of antibiofilm compounds from mesoporous silica-containing macroporous titanium.
Colloids and Surfaces. B: Biointerfaces, vol. 126, pp. 481–488, 2015.
http://dx.doi.org/10.1016/j.colsurfb.2014.12.054.

73
 Influência da aeração na produção de ectoína por
Halomonas salina
Carina Heigl1-2*; Nei Pereira Junior2

1
Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes - UFRJ *e-mail: [email protected]
2
Escola de Química - UFRJ.

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
O soluto compatível ectoína fornece proteção celular contra os efeitos da
dessecação, congelamento e aquecimento, e apresenta aplicações em diversos
segmentos da indústria. O gênero Halomonas tem atraído interesse para a produção de
ectoína pelos altos valores de produtividade obtidos e técnica fácil de obtenção do
produto. Produção química industrial não é viável pelo alto custo dos precursores, a
baixa qualidade do produto e a formação de co-produtos. O processo biotecnológico
possui algumas vantagens: microrganismo utilizado robusto e de fácil manuseio e
reagentes com custo e toxicidade mais baixos comparado com a síntese química.
Entretanto, alguns obstáculos ainda precisam ser superados, como as altas
concentrações de sal necessárias, que podem causar problemas nos equipamentos e
limitam o crescimento celular, diminuindo assim a concentração do produto. Após a
otimização do meio com o uso de metodologias estatísticas, a influência da aeração na
produção de ectoína foi investigada em biorreatores instrumentados, usando diferentes
níveis de taxa de aeração e velocidade de agitação. Assim, a aeração se mostrou um
fator limitante, já que o seu controle causou um ganho de 6 vezes na concentração de
ectoína, com diferença de 50% entre os dois biorreatores. Produtividade de ectoína
aumentou de 0.011g/L.h para 0.238g/L.h com taxa de aeração de 2.5 vvm, junto com o
fator de rendimento por célula (YP/X) acima de 0.8 g/g. Esses resultados mostram um
grande avanço se comparado com a literatura, que obteve fatores por volta de 0.25 g/g.

Palavras-chave: Soluto compatível, fermentação, halofílica.

______________________________________________________________________________________________

The Influence of Aeration in Ectoine Production by Halomonas salina

ABSTRACT
The compatible solute ectoine provides cell protection against the effects of
desiccation, freezing and heating, and presents applications in several industry
segments. The genus Halomonas has been regarded as promising for ectoine production
due to high productivity rates and easy technique described for secreting the product.
Chemical industrial production is not viable because of high cost of the precursors, the
low product quality and the formation of by-products. The biotechnological process,
however, has some advantages: the microorganism used is robust and easy to handle
74
and the reagent cost and toxicity are lower compared to the chemical synthesis.
Nevertheless, some obstacles still should be overcome, such as those concerning the
required high salt concentrations, which may cause problems for the equipments and is
responsible for limiting cell growth, lowering the product concentration. After the
optimization of the medium with the use of statistical methods, the influence of aeration
in ectoine production was investigated in instrumented bioreactors, using different
levels of both stirring speed and air flow. Thus, aeration was shown as a limiting factor,
once its control caused a 6 times gain in the ectoine concentration, with a 50% gain
between both bioreactors. Ectoine productivity increased from 0.011g/L.h to 0.238g/L.h
at 2.5 vvm air flow rate, along with a product yield per cell factor (YP/X) higher than 0.8
g/g. These results shows a big advance over those previously reported in the literature,
which reached yield factors around 0.25 g/g.

Keywords: Compatible solute, fermentation, halophilic.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Ectoína é um soluto compatível presente nos três reinos e descoberta em 1985
por Galinski em Halorhodospira (anterior Ectothiorhodospira) halochloris, no Egito.
Além do seu efeito osmoprotetor, esse soluto compatível também confere proteção
contra os efeitos do dessecamento, congelamento e aquecimento, tanto para
macromoléculas como para células inteiras. Tais características atraíram muita atenção
para essa molécula, que começou a ser obtida pela extração de produtores naturais
(Sauer and Galinski, 1998) ou pela síntese química (Lentzen and Neuhaus, 2013; Pastor
et al., 2010), porém de forma ineficiente. As aplicações são das mais diversas, sendo
elas a nível molecular ou celular. Podemos listar sua capacidade de estabilidade
enzimática e proteica, de DNA (podendo ser aplicada na otimização da técnica de
microarranjo) (Pastor et al., 2010) e de células inteiras, aumentando a sobrevivência de
diversos microrganismos como E. coli nos processos de secagem e de cultivo em altas
concentrações de sal (Nagata et al., 2002). As aplicações mais interessantes são as
biomédicas, onde a estabilização das células é capaz de evitar o desenvolvimento de
doenças, entre elas o Mal de Alzheimer, a encefalopatia espongiforme, doença de
Machado-Joseph, entre outras (Heigl, 2016). Muitos microrganismos foram descritos
produtores de ectoína, e um número maior ainda é capaz de fazer uso desse soluto
compatível como um protetor osmótico (Pastor et al., 2010; Steger et al., 2004). Porém,
sua produção é limitada por diversos razões, como os baixos fatores de rendimento e as
altas concentrações de sal necessárias para o estresse osmótico. Assim,
desenvolvimentos no processo de síntese de ectoína, seja pela otimização do meio de

75
cultivo ou nas condições de fermentação são necessárias, a fim de se obter maiores
concentrações de ectoína.

MATERIAL E MÉTODOS
1- Microrganismos e Inóculo: a cepa utilizada foi Halomonas salina DSMZ
5928, obtida liofilizada e então ativada (Meio DSM 593) e congelada (Meio
DSM 593 + 30% glicerol) no LADEBIO. Para ativação da cultura para
posterior fermentação, foi utilizado o protocolo de Lang et al. (2011), a 30ºC
e 200 rpm. Para fermentação visando a síntese de ectoína, foi utilizado o
protocolo de Heigl, (2016).
2- Quantificação de biomassa, substrato e produto: para a quantificação de
biomassa, foi utilizada a técnica de correlação de massa seca e absorvância a
600nm. As concentrações de glutamato monossódico e ectoína foram
determinadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE – Waters,
Milford, MA, E.U.A), como descrita por Onraedt et al. (2005).
3- “Ordenha Bacteriana”: para a obtenção da fração intracelular de ectoína,
após a centrifugação da amostra e remoção do sobrenadante, foi adicionado
o mesmo volume do sobrenadante em água destilada. Após 10 minutos
incubado a 30ºC e 200 rpm, a cultura é novamente centrifugada e o
sobrenadante seguinte guardado para análise.
4- Fermentação em Frascos Cônicos Agitados: após a ativação em frascos
cônicos agitados, a 30ºC e 200 rpm, por 24 horas, 10% (20 mL) da
suspensão bacteriana foram inoculados em frascos cônicos com meio de
fermentação, prosseguindo assim para a fermentação a 30ºC e 200 rpm.
Amostras foram removidas em intervalos constantes para levantamento do
perfil cinético.
5- Fermentação em Biorreator Instrumentado: após a ativação em frascos
cônicos agitados, a 30ºC e 200 rpm, por 24 horas, 10% (200 mL) da
suspensão bacteriana foram inoculados em 2 L de meio de fermentação em
um frasco de 4 L. A fermentação foi realizada a 30º, pH 7,1 com agitação
variando conforme tempo (500 rpm, aumentada para 600 rpm com 10 horas
de processo, e 700 rpm com 16 horas). Diferentes taxas de aeração foram
utilizadas: 1,7 vvm e 2,5 vvm. Amostras foram removidas em intervalos
constantes para levantamento do perfil cinético.

76
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Uma vez que a cultura de Halomonas salina para a síntese de ectoína apresenta
altas concentrações celulares, diferentes taxas de aeração foram testadas a fim de
observar se há ganhos na produtividade, investigando assim a influência da aeração na
síntese de ectoína. Como é possível observar na tabela abaixo (Tabela 1), o primeiro
ganho com a mudança do sistema é a diminuição do tempo do processo, passando de 30
para 20 horas. Além disso, também houve um ganho grande na proporção de ectoína
produzida por células, mostrando que essa maior aeração estimulou mais a produção de
ectoína do que o crescimento celular em si. Entre o sistema de frascos cônicos e o
biorreator II, que apresentou os melhores resultados, foi possível observar um ganho de
14 vezes (de 0,331 g/L para 4,764 g/L) na concentração de ectoína, e, principalmente,
um ganho de 21 vezes na produtividade volumétrica de ectoína, variável que considera
produção em g/L por hora de processo (de 0,011 g/L.h para 0,238 g/L.h). Entre os dois
reatores, houve um aumento de 50% na taxa de aeração, mantendo a mesma condição
de agitação, o que resultou em um aumento de 50% na concentração de ectoína e na
produtividade volumétrica. Outra observação de grande valia é no aproveitamento do
substrato, uma vez que o sistema de frascos cônicos não forneceu condição boa
suficiente para a cultura consumir o glutamato monossódico, tendo sido consumido
apenas 16% do mesmo fornecido, enquanto os biorreatores tiveram consumo de
aproximadamente 87%.
Tabela 1 – Variáveis de Resposta dos sistemas Frascos Cônicos e Biorreatores
Instrumentados com vazão de ar de 1,7 vvm (Biorreator I) e 2,5 vvm (Biorreator II)

Variável Frascos Biorreator I Biorreator II

Cônicos
Tempo (h) 30 20 20
YP/S (g/g) 0,048 0,085 0,140
YP/X(g/g) 0,140 0,635 0,883
YX/S (g/g) 0,342 0,134 0,159
RPS (%) 16,0 87,27 87,0
X máx (g/L) 2,542 5,146 5,603
Ect máx (g/L) 0,331 3,114 4,764
QP (g/L.h) 0,011 0,155 0,238
QX (g/L.h) 0,085 0,257 0,280

77
CONCLUSÕES
Tais resultados mostram que a aeração é um fator limitante não apenas para a
cultura e seu crescimento, mas principalmente para a síntese de ectoína, que pareceu ser
mais eficiente. Estudos posteriores serão realizados a fim de se observar se maiores
ganhos serão obtidos com maiores taxas de aeração, e até que ponto esse gasto será
economicamente viável.

AGRADECIMENTO
Agradeço ao grupo do LADEBIO – UFRJ e o professor Nei Pereira Jr, por todas
as oportunidades de desenvolvimento do projeto.

REFERÊNCIAS
HEIGL, C., 2016. Produção de Ectoína por Bactérias Halofílicas do Gênero
Halomonas. Rio de Janeiro: Universidade Federal do Rio de Janeiro. 113 p. Dissertação
de Mestrado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos.
LANG, Y. et al., 2011. Production of ectoine through a combined process that uses both
growing and resting cells of Halomonas salina DSM 5928. Extremophiles, vol. 15, pp.
303–310.
LENTZEN, G. and NEUHAUS, T. Synthesis of Cyclic Amidines, 2013.
NAGATA, S. et al., 2002. Effect of compatible solutes on the respiratory activity and
growth of Escherichia coli K-12 under NaCl stress. Journal of Bioscience and
Bioengineering, vol. 94, no. 5, pp. 384–389.
ONRAEDT, A. E. et al., 2005. Optimization of ectoine synthesis through fed-batch
fermentation of Brevibacterium epidermis. Biotechnology Progress, vol. 21, pp. 1206–
1212.
PASTOR, J. M. et al., 2010. Ectoines in cell stress protection: Uses and
biotechnological production. Biotechnology Advances, vol. 28, no. 6, pp. 782–801.
SAUER, T. and GALINSKI, E. A., 1998. Bacterial milking: A novel bioprocess for
production of compatible solutes. Biotechnology and Bioengineering, vol. 57, no. 3, pp.
306–313.
STEGER, R. et al., 2004. LcoP, an osmoregulated betaine/ectoine uptake system from
Corynebacterium glutamicum. FEBS Letters, vol. 573, pp. 155–160.

78
 Ácido indolacético produzido por Torulaspora globosa
imobilizada em espuma poliuretano
Caroline Jonas de Andrade*; Márcia Maria Rosa Magri

Universidade Federal de São Carlos, Departamento de Ciências da Natureza, Matemática e Educação –

Campus Araras/SP. *e-mail: [email protected]

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Micro-organismos promotores de crescimento vegetal são conhecidos por
auxiliarem as plantas em seu desenvolvimento, sendo a produção de hormônios vegetais
um dos principais mecanismos. A produção de metabólitos secundários por micro-
organismos em culturas imobilizadas, in vitro, tem mostrado ser atraente para estímulo
e aumento na produção de compostos de interesse. Considerando o exposto, o trabalho
teve como objetivo avaliar a produção do hormônio vegetal ácido indolacético (AIA)
pela levedura rizosférica Torulaspora globosa (6S01), em cultivo de células livres e
imobilizadas em espuma de poliuretano. Os testes consistiram do cultivo da levedura
nas duas condições, em meio BD com adição de triptofano. Os resultados obtidos
mostram que não houve diferença na produção de AIA, isto é, a produção não foi
estimulada pela condição imobilizada da levedura, como esperado e descrito na
literatura. Conclui-se que o processo de imobilização deve ser revisto, e outras matrizes
testadas, como alginato e quitosana, para melhor avaliação da produção de AIA por T.
globosa em condição imobilizada.

Palavras-chave: promotores de crescimento de plantas; leveduras rizosféricas;

imobilização de células.
______________________________________________________________________________________________

Indoleacetic acid produced by Torulaspora globosa immobilized on polyurethane

foam

ABSTRACT
Microorganisms that promote plant growth are known to assist plants in their
development, and the production of plant hormones is one of the main mechanisms. The
production of secondary metabolites by microorganisms in immobilized cultures, in
vitro, has been shown to be attractive for stimulating and increasing the production of
compounds of interest. Considering the above, the objective of this work was to
evaluate the production of the phytohormone indoleacetic acid (AIA) by the rhizosphere
yeast Torulaspora globosa (6S01), in culture of free cells and immobilized in
polyurethane foam. The tests consisted of the yeast culture in the two conditions, in BD
medium with addition of tryptophan. The results showed that there was no difference in
the production of AIA, i.e., the production was not stimulated by the immobilized
condition of the yeast, as expected and described in the literature. It was concluded that
the immobilization process should be reviewed, and other matrices tested, such as
79
alginate and chitosan, to better evaluate the production of AIA by T. globosa in
immobilized condition.

Keywords: plant growth promoters; rhizosphere yeasts; cell imobilization.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Micro-organismos associados às plantas são capazes de produzir hormônios
vegetais, como as auxinas, que são responsáveis pela extensão, divisão e diferenciação
celular; são capazes de estimular a germinação de sementes e tubérculos, promover o
desenvolvimento do xilema, estimular a formação de raízes, controlar processos de
crescimento vegetativo, fotossíntese, a biossíntese de metabólitos, e fatores de
resistência a estresses ambientais (Zhao, 2010). Dentre as auxinas, a que mais se destaca
é o ácido indolacético (AIA). Bactérias, fungos filamentosos e leveduras são descritos
na literatura como capazes de produzir AIA e estimular o desenvolvimento vegetal,
sendo, desta forma, denominados Micro-organismos Promotores de Crescimento
Vegetal (MPCV).
A imobilização de células (IC) consiste no confinamento físico de células
microbianas em uma região definida de espaço, na qual suas atividades catalíticas,
contínuas ou descontínuas, são mantidas. A alta concentração de células, em pouco
espaço, é capaz de promover alta produção de compostos metabólicos secundários de
interesse, como em processos fermentativos industriais (Freeman and Lilly, 1998).
A IC em espuma de poliuretano tem a capacidade de proporcionar a
concentração de uma quantidade aceitável de biomassa celular aderida, num tempo
substancialmente baixo. A estrutura porosa da espuma é altamente uniforme (mais de
97%), facilitando a exposição total das superfícies; desta forma evita-se problemas
associados à acessibilidade para as células, facilitando a rápida adesão celular (De Ory
et al., 2004).
Considerando o exposto acima, o trabalho teve por objetivo avaliar a produção
in vitro de ácido indolacético (AIA) pela levedura rizosférica Torulaspora globosa
(6S01), em cultivo de células livres e imobilizadas em espuma de poliuretano.

MATERIAL E MÉTODOS

80
 A levedura avaliada foi a linhagem 6S01 de T. globosa, isolada de rizosfera de
milho, e pertencente ao banco de micro-organismos do LAMAM – Laboratório de
Microbiologia agrícola e Molecular, da Universidade Federal de São Carlos.
Para a produção do inóculo, uma alçada da levedura foi utilizada para inocular
10 ml de meio YEPD em tubo Falcon; este foi incubado por 3 dias a 30ºC e 160 rpm.
Após este período, o meio de cultivo foi centrifugado para a separação da massa celular
do meio. As células foram ressuspendidas em solução salina (NaCl 0,85%) e efetuada a
contagem do número de células em câmara de Neubauer. Para a imobilização das
células em espuma, 6 cubos de 1 cm3 foram colocados em Erlenmeyer de 125 ml, com
50 ml de meio YEDP, sendo estes inoculados com 1 ml de uma suspensão de 4x105
células. Os frascos foram incubados por 3 dias, sendo os cubos de espuma, com células,
lavados com água destilada estéril, para retirada do meio de cultura.
Para os testes de produção de AIA, foram considerados dois tratamentos: T1 –
produção de AIA em cultivo de células livres; T2 – produção de AIA em cultivo de
células imobilizadas em espuma. Para ambos os tratamentos, foram utilizados frascos
Erlenmeyer de 500 ml, com 200 ml de meio BD (caldo de batata e dextrose), com
triptofano 5%; o inóculo de células livres consistiu na inoculação do meio com 4x105
células/ml, a partir do inóculo; para o tratamento com células imobilizadas, o inóculo
consistiu em 6 cubos de espuma com células. Cada tratamento foi preparado em
triplicata, sendo os frascos incubados por 72 horas, com amostragens realizadas a cada
12 horas.
As análises consistiram na quantificação do número de células livres (realizada
nos dois tratamentos), em câmara de Neubauer, e determinação do pH do meio, em
pHmetro digital. Também foi realizada a quantificação de AIA no meio; para tanto a
amostra foi centrifugada, para separação das células; em seguida 1 ml do sobrenadante
foi adicionado a 1 ml do Reagente de Salkowsky. Se houver a mudança da cor do meio,
após a reação, para rosa, indica a presença de AIA no meio. Quanto mais intensa a cor,
maior a concentração do metabólico; para determinação da quantidade presente no
meio, foi produzida uma curva padrão, com valores conhecidos de AIA.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados obtidos mostram que não houve diferença significativa entre os
tratamentos avaliados. A imobilização das células da levedura T. globosa em espuma de
poliuretano não proporcionou maior produção de AIA (Figura 1). Na literatura, porém,

81
é possível encontrar trabalhos que mostram que a imobilização das células microbianas
pode estimular, de forma significativa, a produção de metabólitos de interesse. Covizzi
(2007) realizou um trabalho onde a produção de lacase por células de Botryospaheria
rhodina imobilizada em espuma apresentou o melhor resultado, com produção três
vezes maior do produto de interesse, quando comparado com o cultivo de células livres.

Figura 1. Produção de AIA pela levedura T. globosa, em cultivo de células livres e

imobilizadas em espuma.

O mesmo resultado foi observado para o pH do meio; em ambos os tratamentos

o pH do meio sofreu queda, devido principalmente, à produção de ácidos orgânicos pela
levedura; esta produção, porém, não sofreu variações quanto a imobilização ou não das
células.

Figura 2. Variação do pH do meio de cultura com cultivo de T. globosa em células

livres e imobilizadas em espuma.

A quantificação de células livres nos cultivos não diferiu, apesar de apresentar

células imobilizadas na espuma; esse dado mostra que, no tratamento com células

82
imobilizadas, estas se soltaram da matriz, e se multiplicaram de forma planctônica no
meio (de forma livre). O número de células nesta condição se apresentou idêntica nos
diferentes tratamentos (Figura 3).

Figura 3. Número de células livres nos cultivos de T. globosa em células livres e

imobilizadas em espuma.

O desprendimento das células pode ocorrer devido o cultivo ter ocorrido em

incubadora refrigerada com agitação, a 160 rpm; nesta velocidade os cubos de espuma
se chocam, entre si e com a parede do frasco, podendo tornar frágil a estrutura do
biofilme. Uma vez que a levedura é unicelular, a estabilidade do biofilme está
diretamente relacionada a produção de compostos extra-celulares, como
exopolissacarídeos, importantes para a fixação das células. Novos estudos devem ser
realizados para avaliação da imobilização das células em outras matrizes, como alginato
ou quitosana, para avaliar a possibilidade de exploração da levedura na produção de
hormônios vegetais, para aplicação na agricultura.

AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq) por viabilizar a realização do trabalho, assim como o Laboratório de
Microbiologia Agrícola e Molecular da Universidade Federal de São Carlos, campus
Araras.
REFERÊNCIAS

COVIZZI, L. G., 2007. Seleção de um suporte sintético para imobilizar células do

Botryospaheria rhodina e comparação da produção de lacase por células livres e

83
imobilizadas. São José do Rio Preto: Universidade Estadual Paulista. 90 p. Tese de

Mestrado em Engenharia e Ciência de Alimentos.

DE ORY, I., ROMERO, L. E., and CANTERO, D. 2004. Optimization of

immobilization conditions for vinegar production. Siran, wood chips and polyurethane

foam as carriers for Acetobacter aceti. Process Biochemistry, 39(5), 547-555.

http://dx.doi.org/10.1016/S0032-9592(03)00136-5.

FREEMAN, A. and LILLY, M. D. 1998. Effect of processing parameters on the

feasibility and operational stability of immobilized viable microbial cells. Enzyme and

Microbial Technology, v. 23, n. 5, p. 335-345. http://dx.doi.org/10.1016/S0141-

0229(98)00046-5.

ZHAO, Y., 2010. Auxin Biosynthesis and Its Role in Plant Development. Annual

Review of Plant Biology, v.61, p.49–64. https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-

042809-112152.

84
 Hidrólise enzimática de hemiceluloses extraídas de resíduos
agroindustriais
Caroline de Freitas1*; Eleonora Cano Carmona2; Cárol Cabral Terrone2; Michel Brienzo3

1
Universidade Federal de São Carlos – Campus Araras *e-mail: [email protected]
2
Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista - Campus Rio Claro
3
Instituto de Pesquisa em Bioenergia, Universidade Estadual Paulista - Campus Rio Claro
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
As biomassas lignocelulósicas são fontes renováveis encontradas em abundância
na natureza. Esses resíduos têm se tornado interessantes, pois podem ser utilizados para
a produção de novos materiais. As xilanases são enzimas produzidas em grande
quantidade por fungos filamentosos, e são conhecidas pela sua capacidade de hidrolisar
a xilana, principal componente da hemicelulose, e a partir dos produtos da hidrólise,
outros compostos podem ser obtidos. Dentro deste contexto, o objetivo desse trabalho
foi comparar e determinar quais dentre as xilanases extraídas dos fungos estudados
como bons produtores dessas enzimas, apresentaram maior capacidade de hidrolisar a
xilana de hemiceluloses extraídas de diferentes resíduos agroindustriais. Para produção
das enzimas, os fungos foram cultivados em meio líquido de Vogel acrescido de 1%
(m/v) de farelo de trigo e, após o crescimento, as culturas foram filtradas a vácuo e esse
filtrado foi utilizado como fonte de enzimas extracelulares. Foi realizada a extração da
hemicelulose de bagaço de cana-de-açúcar, bagaço de malte e sabugo de milho através
de hidrólise alcalina modificada. Após a extração, foi realizada a atividade enzimática
utilizando xilanas comerciais e as hemiceluloses extraídas em laboratório. Dos
substratos estudados, aquele que foi hidrolisado em maior extensão pela maioria dos
filtrados foi o bagaço de malte. Em relação aos filtrados dos micro-organismos, o que
apresentou maior atividade enzimática em todos os substratos foi o de Aspergillus
versicolor. As hemiceluloses provenientes dos resíduos agroindustriais extraídas em
laboratório foram mais extensivamente hidrolisadas que as hemiceluloses comerciais
pelo filtrado da maioria dos micro-organismos estudados.

Palavras-chave: Resíduos agroindustriais; Xilana; Xilanase; Aspergillus versicolor

______________________________________________________________________________________________

Enzymatic hydrolysis of hemicelluloses extracted from agroindustrial residues

ABSTRACT

Lignocellulosic biomasses are renewable sources found in abundance in nature. These

residues have become interesting because they can be used for the production of new
materials. Xylanases are enzymes produced in large quantities by filamentous fungi and
are known for their ability to hydrolyze xylan, the major component of hemicellulose,
and other compounds can be obtained from the hydrolysis products. In this context, the
objective of this work was to compare and determine which of the xylanases extracted

85
from fungi studied as good producers of these enzymes, presented a higher capacity to
hydrolyze xylan from hemicelluloses extracted from different agroindustrial residues.
For the production of the enzymes, the fungi were grown in liquid Vogel medium added
with 1% (w/v) of wheat bran and, after growing, the cultures were vacuum filtered and
the filtrate was used as a source of extracellular enzymes. Hemicellulose was extracted
from sugarcane bagasse, malt bagasse and corn cob by modified alkaline hydrolysis.
After extraction, the enzymatic activity was performed using commercial xylanes and
hemicelluloses extracted in the laboratory. Of the substrates studied, the malt bagasse
was more extensively hydrolyzed by the majority of the fungi filtrates. In relation to the
microorganisms filtrates, that from A. versicolor presented greater enzymatic activity on
all the substrates assayed. Hemicelluloses from agroindustrial residues extracted in the
laboratory were more extensively hydrolyzed than commercial hemicelluloses by the
filtrates of the majority of the microorganisms studied.

Keywords: By products; Xylan; Xylanase; Aspergillus versicolor

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Atualmente, há um interesse global no uso tecnológico de resíduos
agroindustriais como fonte renovável de alimentos e biocombustíveis. A biomassa mais
abundante e renovável encontrada na Terra é a lignocelulose, que contém três grandes
grupos de polímeros: celulose, hemicelulose e lignina, e o seu acúmulo, além de
representar um problema de poluição ambiental, implica em perda de materiais com
grande potencial de conversão em produtos de valor comercial. (Sánchez, 2009).
A xilana é o polímero mais abundante na hemicelulose, e a segunda estrutura
orgânica predominante na parede celular vegetal. Sendo assim, a xilana é a
hemicelulose com maior incidência em resíduos agrícolas e agroindustriais (Silva and
Carmona, 2008). As xilanases são enzimas produzidas, principalmente por fungos e
bactérias, que atuam na degradação da xilana, liberando xilo-oligossacarídeos. Do ponto
de vista industrial, fungos filamentosos são produtores interessantes dessas enzimas por
conta de seu fácil cultivo e pela maior liberação dessas enzimas. (Knob and Carmona,
2008).
Como as hemiceluloses apresentam ligações relativamente fortes com a celulose
e lignina na parede celular da planta, é necessário um processamento para separar as
frações lignocelulósicas (Brienzo et al., 2009). Além disso, a extração das
hemiceluloses torna esses polissacarídeos mais acessíveis às enzimas. As hemiceluloses
podem ser hidrolisadas a açúcares através de hemicelulases e, a parte majoritária dos
trabalhos publicados sobre hemicelulases trata das propriedades e modos de ação, assim
como das aplicações das xilanases (Ogeda and Petri, 2010).

86
 Nesse contexto, a busca por novos processos de reaproveitamento de resíduos
agroindustriais e materiais lignocelulósicos tem aumentado, motivando estudos da
aplicação de enzimas microbianas capazes de hidrolisar esses compostos de forma
vantajosa. O objetivo desse trabalho foi comparar e determinar as atividades de
xilanases produzidas por fungos estudados como bons produtores dessas enzimas,
avaliando sua capacidade de hidrolisar a xilana de hemiceluloses extraídas de diferentes
resíduos agroindustriais.

MATERIAL E MÉTODOS
Os micro-organismos Aspergillus giganteus, Aspergillus versicolor,
Trichoderma inhamatum, Penicillium janczewskii e Penicillium sclerotiorum foram
mantidos em meio contendo farelo de trigo a 1% (m/v). As culturas foram incubadas,
nesse mesmo meio, para a produção de esporos por 7 dias a 28ºC.
O meio líquido de Vogel foi preparado utilizando-se a solução de sais de Vogel
diluída 50 vezes, acrescido de 1% (m/v) da fonte de carbono. Suspensões de conídios
das linhagens foram preparadas com água destilada esterilizada, em concentrações de 2
a 5 x 107 esporos/mL. Um volume de 1,0 mL dessas suspensões foi inoculado em
frascos de Erlenmeyer de 125 mL, contendo 25 mL de meio líquido.
Após o crescimento pelo período adequado para produção máxima de xilanase
por cada micro-organismo, as culturas foram filtradas a vácuo para a eliminação do
substrato, micélio e outras impurezas e o filtrado obtido foi congelado e utilizado como
fonte de proteínas e enzimas extracelulares.
As hemiceluloses foram extraídas do bagaço de cana-de-açúcar, sabugo de milho
e bagaço de malte utilizando o método de Brienzo et al (2009).
A atividade enzimática foi avaliada pelo método de Bailey et al. (1992)
modificado, em intervalos de 5 e 10 minutos de reação. A mistura de reação constituiu-
se da amostra do filtrado do fungo incubada em banho-maria a determinada temperatura
com 750 µL de solução do substrato a 1% (m/v) com tampão fosfato de sódio 0,05
mol.L-1, pH 6,0 ou 6,5, dependendo do micro-organismo. Após cada intervalo de tempo,
interrompeu-se a reação pela adição de 250 µL de ácido 3,5-dinitrosalicílico (ADNS).
Por fim, as soluções foram fervidas por cinco minutos, resfriadas e diluídas com 2,5 mL
de água destilada. A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro a 540
nm, utilizando-se curva de calibração de xilose. Uma unidade de atividade enzimática
(U) foi definida como a quantidade de enzima capaz de liberar extremidade redutora

87
equivalente a 1 μmol de xilose por minuto nas condições de ensaio. Os ensaios de
atividade foram realizados em duplicata.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
As atividades enzimáticas foram realizadas com os filtrados brutos dos micro-
organismos supracitados utilizando diferentes substratos para determinar a capacidade
de sua hidrólise enzimática na conversão da xilana em seus oligômeros correspondentes.
As xilanas comerciais estudadas foram beechwood, birchwood e de aveia. O
filtrado do micro-organismo que apresentou maior atividade enzimática sobre todas as
xilanas comerciais foi de A. versicolor, porém foi em farelo de aveia que o filtrado
desse fungo apresentou maior atividade xilanolítica, correspondendo a 141,4
µmol/mL.min.

Tabela 1. Atividade xilanase do filtrado bruto de fungos filamentosos sobre diferentes

xilanas comerciais.
Atividade xilanase (U/mL)
Micro-organismo Substrato: xilanas comerciais extraídas de

“Beechwood” “Birchwood” “Oat Spelt”

A. giganteus 0,7 ± 0,006 0,8 ± 0,03 1,2 ± 0,04
A. versicolor 88,5 ± 2,62 38,5 ± 0,4 141,4 ± 4,03
T. inhamatum 4,8 ± 0,01 22,6 ± 0,2 35,5 ± 2,82
P. janczewskii 3,0 ± 0,2 5,7 ± 0,17 10,4 ± 0,12
P. sclerotiorum 6,8 ± 0,24 10,6 ± 0,2 13,4 ± 1,76

Dentre os experimentos realizados com as hemiceluloses dos resíduos

agroindustriais, o filtrado do micro-organismo que apresentou o melhor desempenho
quanto atividade enzimática em todos os substratos também foi o de A. versicolor,
sendo que na hemicelulose de bagaço de malte sua atividade enzimática foi de 154,4
U/mL.

88
Tabela 2. Atividade enzimática do filtrado bruto de fungos filamentosos sobre
diferentes hemiceluloses provenientes de resíduos agroindustriais.

Atividade enzimática (U/mL)

Micro-organismo Substrato: hemiceluloses extraídas de
Bagaço de Cana Bagaço de Malte Sabugo de Milho
A. giganteus 0,99 ± 0,05 1,93 ± 0,03 1,25 ± 0,007
A. versicolor 97,22 ± 1,5 154,4 ± 3,72 119,64 ± 3,44
T. inhamatum 24,2 ± 0,92 41,77 ± 2,29 23,31 ± 0,34
P. janczewskii 22,22 ± 0,75 14,25 ± 0,06 13,84 ± 0,17
P. sclerotiorum 8,84 ± 0,11 10,52 ± 0,2 10,68 ± 0,32

O maior desempenho da atividade enzimática da maioria dos filtrados sobre as

hemiceluloses dos resíduos agroindustriais em relação às xilanas comerciais pode dever-
se ao fato de que os substratos comerciais continham apenas xilana, enquanto que os de
resíduos agroindustriais continham outros carboidratos hemicelulósicos, além da xilana,
bem como pelo fato do filtrado bruto não conter apenas xilanases, mas também outras
enzimas que podem hidrolisar as outras hemiceluloses.

CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos, foi possível comparar a capacidade de
diferentes fungos já estudados como bons produtores de enzimas xilanases de realizar a
hidrólise enzimática de diferentes hemiceluloses comerciais e extraídas no laboratório.
Dentre os filtrados dos cinco micro-organismos utilizados, aquele que
apresentou maior atividade enzimática em todos os substratos testados foi de A.
versicolor. Tendo isso em vista, é possível afirmar que mais estudos acerca das enzimas
xilanolíticas produzidas por esse fungo devem ser realizados, pois elas podem ser
utilizadas de forma vantajosa. Quanto aos substratos, a xilana do bagaço de malte foi
aquela que apresentou maior conversão em açúcares redutores através da ação
enzimática dos filtrados da maioria dos micro-organismos estudados, especialmente
aquele de A. versicolor.
O uso de resíduos agroindustriais para produzir compostos de alto valor
agregado através da hidrólise enzimática é uma tecnologia promissora que, além de dar
um destino mais adequado para esses resíduos, pode gerar lucro para as próprias
indústrias produtoras desses resíduos.

89
REFERÊNCIAS

BAILEY, M. J., BIELY, P., POUTANEN, K. Interlaboratory testing of methods for

assay of xylanase activity. Journal of Biotechnology. v. 23, n. 3, p. 257-270, 1992.

BRIENZO, M.; SIQUEIRA, A. F.; MILAGRES, A. M. F. Search for optimum

conditions of sugarcane bagasse hemicellulose extraction. Biochemical Engineering
Journal, v. 46, n. 2, p.199-204, out. 2009. http://dx.doi.org/10.1016/j.bej.2009.05.012

KNOB, A.; CARMONA, E. C. Xylanase production by Penicillium sclerotiorum and its

characterization. World Applied Sciences Journal, Rio Claro, v. 4, n. 2, p.277-283,
2008.

OGEDA, T. L.; PETRI, Denise F. S. Hidrólise enzimática de biomassa. Química

Nova, São Paulo, v. 33, n. 7, p.1549-1558, jul. 2010. http://dx.doi.org/10.1590/S0100-
40422010000700023

SÁNCHEZ, C. Lignocellulosic residues: Biodegradation and bioconversion by

fungi. Biotechnology Advances, v. 27, n. 2, p.185-194, mar. 2009.
http://dx.doi.org/10.1016/j.biotechadv.2008.11.001

SILVA, L. A. O.; CARMONA, E. C. Production and Characterization of Cellulase-Free

Xylanase from Trichoderma inhamatum. Applied Biochemistry And Biotechnology, v.
150, n. 2, p.117-125, jul. 2008. DOI: 10.1007/s12010-008-8296-y

90
 Biomassa fúngica como nutriente para produção de EPS
Caroline Sakata1; Ivanildo Vicente do Nascimento2, Valéria M.G. Nascimento1

1
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Câmpus Assis.
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
A produção de exopolissacarídeo (EPS) pelo fungo filamentoso Lasiodiplodia
theobromae apresenta interesse industrial, devido ao seu potencial de aplicação
relacionada a sua ação indutora de resposta pró-inflamatória e anti-tumoral e
anticoagulante quando sulfatado. Entretanto, a viabilidade industrial deste bioprocesso
ainda precisa superar desafios, como crescimento celular 10 vezes superior a produção
do EPS, gerando resíduo na forma de biomassa e baixa produtividade (concentração de
fonte de carbono/concentração de EPS). Estudos anteriores verificaram é viável a
produção de EPS utilizando biomassa residual de cultivo anterior como nutriente para
nova batelada de cultivo. O presente trabalho teve como objetivo determinar a
influência de diferentes temperaturas de cultivo (25-40°C), utilizando a biomassa
liofilizada de L. theobromae como nutriente para produção de EPS. Verificou-se que a
temperatura interfere no crescimento do fungo L. theobromae e na produção de EPS,
sendo que diferentes condições de cultivo requerem temperaturas distintas. A maior
produção de EPS utilizando sacarose (meio padrão) ocorreu a 20 °C, enquanto em meio
BV, os melhores resultados foram obtidos a 35 °C.
Palavras-chave: Exopolissacarídeos, temperatura, fungo filamentoso, viabilidade
industrial.
______________________________________________________________________________________________

L. theobromae biomass: culture medium nutrient for EPS production at different

temperatures
The production of exopolysaccharide (EPS) by the filamentous fungus Lasiodiplodia
theobromae presents an industrial interest, due to its application potential related to its
action inducing pro-inflammatory and anti-tumor response and anticoagulant when
sulfated. However, the industrial viability of this bioprocess still needs to overcome
challenges, such as cell growth 10 times higher than EPS production, generating
biomass residue and low productivity (carbon source concentration / EPS
concentration). Previous studies have verified that it is feasible to produce EPS using
previous culture biomass as a nutrient for a new culture batch. The objective of this
work was to determine the influence of different culture temperatures (25-40 ° C) using
the lyophilized biomass of L. theobromae as a nutrient for the production of EPS. It has
been found that temperature interferes with the growth of fungus L. theobromae and the
production of EPS, with different growing conditions requiring different temperatures.
The highest EPS production using sucrose (standard medium) occurred at 20 ° C, while
in BV medium the best results were obtained at 35 ° C.
Keywords: Exopolysaccharides, temperature, filamentous fungus, industrial viability.

91
INTRODUÇÃO
Há um crescente interesse científico e industrial pelos exopolissacarídeos (EPS),
devido à facilidade de obtenção e separação, e possuir vantagens em relação às gomas
tradicionais (Figueiredo, 2013). O Lasiodiplodia theobromae é um dos microrganismos
produtores de EPS que apresenta a capacidade de formar filmes plásticos, ação
imunomoduladora, indutora de resposta pró-inflamatória e anti-tumoral (Oliveira et al.,
2015) e capacidade de coagulação quando sulfatado (Vasconcelos et al., 2013).
Estudos do cultivo de L. theobromae em meio padrão (Sais de Vogel e 50 g/L de
sacarose), proprocionaram produção de 2,5 g/L de EPS e 24,3 g/L de biomassa
(Oliveira et al., 2015). O destino dessa biomassa é importante para o bioprocesso, para
diminuição de custos e por questões ambientais (Muzzarelli et al., 2000).
A utilização da biomassa seca de L. theobromae como nutriente no meio,
visando a produção de EPS foi estudada por Bueno (2016). A melhor condição de
cultivo foi composta de biomassa (40g/L) e Sais de Vogel (BV), obtendo-se 3,22 g/L de
EPS, enquanto no meio padrão (sem biomassa e com adição de sacarose), houve
produção de 1,3 g/L.
O presente trabalho teve como objetivo analisar o crescimento e a produção de
EPS por L. theobromae em diferentes temperaturas utilizando a biomassa seca
proveniente de cultivo anterior como nutriente no meio de cultivo em novo ciclo de
produção.

MATERIAL E MÉTODOS
Microrganismo
Foi utilizado o fungo filamentoso Lasiodiplodia theobromae isolado da berinjela
(S. elongena) gentilmente cedido pela Dra. Aneli de Melo Barbosa, pesquisadora
convidada da UEL, Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR. O microrganismo
foi inoculado em placa de Petri contendo meio VGA, composto por Sais Mínimos de
Vogel (VOGEL, 1956) (SMV), glicose (10 g/L) e ágar (15 g/L), e mantido por 5 a 7
dias a 28°C. A cepa foi armazenada em geladeira a 4°C.
Produção de EPS em condição padrão
O microrganismo foi repicado em placas de Petri contendo meio VGA e foi
mantido a 28°C por 5 dias. Após o crescimento, 4 discos de 8 mm de diâmetro foram
transferidos para Erlenmeyers de 250 mL contendo 50 mL de meio, composto por sais
mínimos de Vogel (VOGEL, 1956) (SMV) e 0,5 g/L de glicose. O pré-inóculo foi

92
 cultivado por 48 horas a 28°C em agitador orbital a 180 rpm. Posteriormente, o
conteúdo dos frascos foi triturado e homogeneizado por 60 segundos em blender (Pratic
Blender, Cadence) previamente higienizado com solução de álcool 70% (p/p). Desta
forma, foi obtida a suspensão micelial com absorbância entre 0,4 – 0,5 a 400 nm.
Foi transferido 12 mL e 4 mL da suspensão micelial para inocular cada
Erlenmeyer de 3.000 mL ou 1.000 mL, contendo 600 mL ou 200 mL de meio de
cultivo, respectivamente. O meio foi composto por 50 g/L de sacarose e SMV, e o pH
do meio foi corrigido para 5,8 utilizando-se HCl 1 mol/L. Os frascos foram mantidos
em agitador orbital, a 28°C, com velocidade de agitação de 180 rpm, por 72h.
Após o cultivo, a biomassa foi separada por centrifugação a 3800 rpm, 4°C, por
30 minutos. O sobrenadante foi separado e acrescentou-se etanol, na proporção de 3:1
(três volumes de etanol para um volume do caldo), para a precipitação do EPS, durante
24 h. Após este período, o EPS foi determinado por gravimetria.
A biomassa foi lavada 2 vezes com solução de NaCl 0,15 mol/L, repetindo-se a
centrifugação nas mesmas condições, liofilizada e utilizada como nutriente em nova
batelada de produção.
Produção de EPS utilizando biomassa seca como nutriente
A biomassa obtida do cultivo padrão foi autoclavada e seca em liofilizador.
Após a secagem, a biomassa foi triturada, para obtenção de partículas entre 0,5 e 1 mm.
Obteve-se a suspensão celular como descrita no item anterior, e foi inoculado 1
mL desta suspensão em Erlenmeyers de 250 mL, em quadruplicata, contendo 50 mL de
meio, que foi composto por 40 g/L de biomassa seca e SMV sem nitrato de amônio, e
foi adicionado 2,5 mg de cloranfenicol. O pH do meio de cultivo será corrigido para 5,8
com HCl 1 mol/L.
Os frascos foram mantidos em incubadora orbital a 180 rpm, por 72 h. O cultivo
foi analisado em diferentes temperaturas variando entre 25 e 40°C.
Métodos analíticos
A biomassa e o EPS foram secos a 70°C, em estufa, até peso constante, e
quantificados por gravimetria.
A determinação de açúcares redutores foi realizada pelo método do ácido 3,5-
dinitrosalicílico (DNS) (MILLER, 1959). A determinação de açúcares totais foi
realizada pelo método do fenol-sulfúrico descrito por Dubois et al. (1956).

93
RESULTADOS
Em meio padrão verificou-se aumento de biomassa até 30 °C (22,6 g/L) (Figura
1). A produção de EPS foi maior a 25°C, obtendo-se 1,17 g/L. De acordo com a
determinação de açúcares redutores e totais, houve maior consumo de açúcar nas
temperaturas entre 25 e 30°C. O pH do meio de cultivo apresentou pequenas variações,
entre 4,4 e 5,05.

Figura 1. Influência da temperatura no crescimento celular (biomassa) e na produção de

EPS de Lasiodiplodia theobromae cultivado em meio padrão . Condições de cultivo:
meio de cultivo composto de sais mínimos de Vogel e sacarose 50g/L, 72 h de incubação
, 180 rpm, temperaturas entre 25 e 35°C.

Em meio BV, a produção de EPS apresentou um perfil côncavo, a 30 °C foi

obtida menor produção de EPS do que a 28 e 35 °C (Figura 2). Em meio BV não foi
possível separar a biomassa seca do meio de cultivo, da biomassa proveniente de
crescimento celular, ainda assim foi realizada a gravimetria e verificou-se que entre 25 e
30 °C praticamente havia o mesmo valor de biomassa total, a 35 °C foi observado valor
superior aos demais (39 g/L). O consumo de açúcar redutor e total foi menor a 35 °C,
entretanto, nessa temperatura foram obtidos grandes valores de desvio padrão,
dificultando a análise. Foi medido o pH do caldo fermentativo após a centrifugação, e
verificou-se que o valor oscilou entre 6,98 e 8,4.

94
Figura 2: Influência da temperatura no crescimento celular (biomassa) e na produção de
EPS por Lasiodiplodia theobromae cultivado em meio BV. Condições de cultivo: meio
de cultivo composto de sais mínimos de Vogel e biomassa 40 g/L, 72 h de incubação,
180 rpm, temperaturas entre 25 e 35°C.

CONCLUSÕES
Verificou-se que a temperatura interfere no crescimento do fungo L. theobromae
e na produção de EPS, sendo que diferentes condições de cultivo requerem temperaturas
distintas. A maior produção de EPS utilizando sacarose (meio padrão) ocorreu a 20 °C,
enquanto em meio BV, os melhores resultados foram obtidos a 35 °C.

AGRADECIMENTOS
À FAPESP pela bolsa de iniciação científica.

REFERÊNCIAS

Bueno, Y. C., 2016. Biomassa do Fungo Filamentoso Lasiodiplodia theobromae:

Composição Química e Utilização como nutriente para Bioprocesso. Rio Claro:
Universidade Estadual Paulista. 54 p. Dissertação de Mestrado em Microbiologia
Aplicada.

Dubois, M. et al., 1956. Colorimetric method for determination of sugars and related
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95
Miller, G.L., 1959. Determination of reducing sugar by DNS method. Anal chem,
vol.31, pp. 426-428.

Muzzarelli, R. A. A. et al., 2000. Polyuronans obtained by regiospecific oxidation of

polysaccharides from Aspergillus niger , Trichoderma reesei and Saprolegnia sp.
Carbohydrate Polymers, vol. 43, pp. 55–61.

Oliveira, K. S., 2014. Otimização do cultivo de Lasiodiplodia theobromae para

obtenção de EPS e caracterização física e química dos polissacarídeos. Rio Claro:
Universidade Estadual Paulista. 133 p. Tese de Doutorado em Microbiologia Aplicada.

Oliveira, K. S. M. et al., 2015. (1→6)- and (1→3)(1→6)-β-glucans from Lasiodiplodia

theobromae MMBJ: Structural characterization and pro-inflammatory activity.
Carbohydrate Polymers, vol. 133, pp. 539–546.

Vasconcelos, A. F. D. et al., 2013. Sulfonation and anticoagulant activity of fungal

exocellular β-(1→6)-D-glucan (lasiodiplodan). Carbohydrate polymers, vol. 92, no. 2,
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(EPS) e jasmonato por Lasiodiplodia theobromae. Assis: Universidade Estadual
Paulista. 29 p. Monografia para Conclusão do Curso de Engenharia Biotecnológica.

96
Produção de ficocianina por Aphanothece microscopica Nägeli
em cultivo mixotrófico suplementado com vinhaça
Dayane Vanessa Morais1; Reinaldo Gaspar Bastos²; Isabely Fernanda Pizarro³.

1
Mestranda em Produção Vegetal e Bioprocessos Associados do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de São Carlos. [email protected]
2Professor Associado do Departamento de Tecnologia Agroindustrial e Socioeconomia Rural do Centro

de Ciências Agrárias da Universidade Federal de São Carlos. [email protected]

3
Bacharelanda em Biotecnologia no Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de São Carlos.
[email protected]

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Ficocianina é um pigmento natural que comumente substitui corantes sintéticos em
alimentos e cosméticos. Aphanothece microscopica Nägeli é uma cianobactéria com
grande potencial de uso em bioprocessos, incluindo tratamento de águas residuárias
agroindustriais e produção de proteínas unicelulares. Neste contexto, o objetivo deste
trabalho foi avaliar a produção de ficocianina por A. microscopica em meio BG11
adicionado de nitrato de sódio e vinhaça em diferentes concentrações. Os resultados
indicaram produção máxima de 0,091 mg de ficocianina por g de biomassa em 24h de
cultivo.

Palavras-chave: ficobiliproteínas, pigmentos, cianobactérias

______________________________________________________________________________________________

Phycocyanin production by Aphanothece microscopica Nägeli in mixotrophic

cultivation supplemented with vinasse

ABSTRACT
Phycocyanin is a natural dye that commonly replaces synthetics pigments in food and
cosmetics products. Aphanothece microscopica Nägeli is a cyanobacteria with a great
potential of being used in bioprocesses, including for agroindustrial wastewater
treatments and single cell protein production. The present work aimed to study the
phycocyanin production by A. microscopica in BG11 medium added with sodium
nitrate and vinasse in different concentrations. Results indicated maximum phycocyanin
production of 0,091 mg of phycocyanin per g of biomass in 24 hours of cultivation.

Keywords: phycobiliproteins, natural dyes, cyanobacteria

______________________________________________________________________________________________

97
INTRODUÇÃO

O crescente interesse no cultivo de microalgas está baseado na variedade de

aplicações comerciais que estes micro-organismos possuem, visto que podem ser
utilizados para a alimentação humana, produção de energia, extração de pigmentos e
outras substâncias celulares de interesse industrial (Zepka et al., 2008).
Aphanothece microscopica Nägeli é uma cianobactéria típica de estuários
localizados no sul do Brasil (Santos et al., 2017). Esta espécie é conhecida por habitar
ambientes extremos, como locais poluídos; assim demonstrando que estes organismos
são robustos e demandam necessidades nutricionais simples, com grande potencial de
uso como biocatalisador em bioprocessos (Queiroz et al, 2013; Santos et al., 2017).
Ficocianina é uma proteína fluorescente que pertence ao grupo das ficobiliproteínas, que
são proteínas solúveis em água e formam componentes extremamente importantes para
a máquina fotossintética pois são coletores de luz (Pandey et al., 2013).
Pigmentos a partir de microalgas são amplamente utilizados em várias
indústrias, como a alimentícia, nutracêutica, farmacêutica, aquicultura e cosmética.
Além disso, os pigmentos têm sido utilizados em laboratórios clínicos e de pesquisa,
devido às suas propriedades como marcadores de anticorpos e receptores (Santiago-
Santos et al., 2004; Begum et al, 2015).
Cianobactérias têm capacidades metabólicas muito versáteis, o que permite que
estas cresçam em condições autotróficas, heterotróficas e mixotróficas
(Subashchandrabose et al., 2013). Uma grande vantagem da utilização destes micro-
organismos é que podem assimilar fontes e energia de baixo custo, incluindo águas
residuárias (Lee e Kim, 2001; Rajoka et al., 2006; Silva, 2008). Nesse sentido, Hornes
(2008) estudou a produção de ficocianina por Aphanothece microscopica Nägeli
cultivada no efluente da indústria de processamento de pescado, alcançando remoções
de até 80% e 93% de DBO e NTK, respectivamente. O cultivo de Aphanothece
microscopica Nägeli no efluente industrial a 20ºC resultou em produção de até 27,2 mg
de ficocianina por grama de biomassa.
A vinhaça é a principal água residuária do processo de fabricação do etanol,
sendo gerada em grandes volumes durante o processamento industrial da cana-de-
açúcar, obtendo-se em torno de 10L por litro de etanol produzido. A vinhaça possui
odor e coloração escura característicos, sendo altamente poluente devido às altas
concentrações de matéria orgânica, baixo pH, altas DBO e DQO (Brasil et al., 2016).

98
 Bonini (2012) avaliou a eficiência de remoção de potássio e DQO da vinhaça
por A. microscopica Nägeli, alcançando redução de 60,76% para a DQO, com
rendimento global médio de 0,58mg/mg (biomassa/DQO). Os resultados obtidos
indicam viabilidade da utilização desta água residuária como meio de cultivo para esta
cianobactéria, devido à sua alta taxa de conversão da matéria orgânica presente no
efluente em biomassa microbiana. O mesmo estudo também identificou remoção
máxima em torno de 13% de potássio do efluente, sendo este íon considerado como o
composto nutriente principal da vinhaça.
Neste contexto, o presente trabalho tem como principal objetivo avaliar a
produção de ficocianina por Aphanothece microscopica Nägeli cultivada em meio
padrão BG11 suplementado com diferentes concentrações de vinhaça e nitrato de sódio.

MATERIAL E MÉTODOS

Inóculo
O inóculo de Aphanothece microscopica Nägeli 48, gentilmente cedido pela
Unidade de Pesquisa em Cianobactérias (UPC) da Universidade Federal do Rio Grande
(FURG), foi mantido e propagado no Laboratório de Microbiologia Aplicada e Controle
(LABMAC/CCA/UFSCar) em meio BG11 (Braun-GrunowMedium) (Ripka et al.,
1979, Bonini, 2012), e o pH foi ajustado para 7,4 – 7,6. Os meios de cultura foram
esterilizados por 20 minutos a 121ºC em autoclave. Foram realizadas contagens celulares
em Câmara de Neubauer antes do início dos ensaios, para verificação da concentração
inicial de células e pureza dos inóculos.

Ensaio
O experimento foi conduzido em Frascos Erlenmeyer de 125mL, que consistiam de
3,5mL de inóculo, 21,5mL de meio BG11, 25% e 50% a mais de nitrato de sódio (0,9375g e
1,875g, respectivamente); e 10%, 20% e 30% de vinhaça (2,5mL, 5mL e 7,5mL). Os
frascos foram mantidos em shaker por 24h, a 100 rpm, 25ºC e 2klux (fotoperíodo de 12
horas). O experimento foi conduzido em triplicata.

Extração e análise de ficocianina

10 mL de cada amostra foram dissolvidas em 20 mL de água deionizada e
centrifugadas a 3000 rpm durante 25 minutos. O sobrenadante foi descartado e as células

99
foram ressuspendidas em solução tampão de fosfato de sódio pH 6,85. As amostras foram
congeladas por 24h a -6ºC e descongeladas por 2h a 25ºC. O teor de ficocianina, em
mg.mL-1 foi determinado através da leitura das densidades óticas das amostras nos
comprimentos de onda de 620 e 652 nm, utilizando-se a Equação 1 (Bennett e Bogorad,
1973; Moraes et al., 2011):
CPC = (OD620 – 0,474xOD652) (1)
5,34
O rendimento da extração foi calculado através da Equação 2 (Silveira et al., 2007; Moraes
et al., 2011):
Rendimento = (CPC) V (2)
BS
Onde: CPC é o teor de ficocianina em mg.mL-1, V é o volume do tampão e BS a biomassa
seca.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Figura 1 apresenta a concentração de ficocianina obtida para os cultivos nas
diferentes condições. Percebe-se que apenas na condição suplementada com 10% de
vinhaça é que houve um discreto aumento na produção do pigmento. De acordo com
Perez-Garcia et al. (2011), os pigmentos das microalgas são produzidos naturalmente
em condições fotoautotróficas, podendo ser limitados em crescimento mixotrófico ou
heterotrófico. Assim, a maior produção com 10% de vinhaça pode ser explicada por
conta da turbidez não tão elevada, que permite a disponibilidade de luz, associada aos
nutrientes da vinhaça, como sais e moléculas orgânicas, os quais auxiliam no
crescimento microalgal e agem como cofatores de algumas enzimas. Para todas as
condições houve uma concentração final de células em torno de 106 células por mL, o
que sugere o acúmulo de ficocianina nestas condições.

100
 0,12

0,11

Ficocianina (mg g biomassa)

0,10

0,09
-1

0,08

0,07

0,06

0,05

0,04

0,03
Controle 25%N 50%N 10%Vin 20%Vin 30% Vin

Condição de cultivo

Figura 1. Rendimento em ficocianina nos diferentes cultivos de Aphanothece microscopica Nägeli. O

controle consiste de apenas meio BG11 e células de A. microscopica, 25 e 50% N representam o cultivo
em meio BG11 e 25 e 50% a mais de nitrato de sódio dissolvido no meio, e 10, 20 e 30% Vin
correspondem ao meio BG11 adicionados destas três concentrações do efluente.

CONCLUSÕES
Nas condições experimentais, pode-se concluir que é viável a produção de
ficocianina através do cultivo mixotrófico de Aphanothece microscópica Nägeli em
meio suplementado com vinhaça de cana-de-açúcar.

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101
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102
 Preservação de Lactobacillus acidophilus utilizando xantana
como agente encapsulante
Dener Acosta de Assis1, Izadora Almeida Perez1, Júlia Borin Fioravante2, Victoria de Moraes Gonçalves2,
Patrícia Diaz de Oliveira3*, Angelita da Silveira Moreira1,2,3, Claire Tondo Vendruscolo1,2,3

1
Centro de Ciências Químicas, Farmacêuticas e de Alimentos, Universidade Federal de Pelotas.
2
Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Faculdade de Agronomia Eliseu
Maciel, Universidade Federal de Pelotas.
3
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade
Federal de Pelotas. *E-mail: [email protected]

______________________________________________________________________________________________

RESUMO

Objetivou-se com este estudo a preservação de Lactobacillus acidophilus pela técnica

de secagem por spray dryer utilizando xantana como agente encapsulante e avaliar a
viabilidade do micro-organismo em diferentes condições de armazenamento. Foram
elaborados 3 tratamentos para obtenção das cápsulas: Tratamento 1 - 1,5% de xantana e
1,5% de Aerosil (T1); Tratamento 2 - 1% de xantana e 1% de aerosil (T2); Tratamento 3
- 0,5% de xantana e 0,5% de Aerosil (T3) e ainda Tratamento 4 sem solução
encapsulante (T4). A viabilidade do L. acidophilus foi avaliada nos dias 0, 7, 15 e 45 de
armazenamento à temperatura ambiente e sob refrigeração. Independentemente do
tratamento, o uso da solução encapsulante aumentou a sobrevivência inicial dos
microrganismos frente ao processo de secagem, em relação ao tratamento controle. O
material quando mantido à temperatura ambiente apresentou maior redução da
concentração celular ao final do período de armazenamento. A temperatura de
refrigeração aumentou a sobrevivência do micro-organismo, principalmente para o T1.
Somente o material obtido no T1 armazenados sob refrigeração por até 15 dias
apresentou concentração de células viáveis de acordo com o estabelecido pela legislação
para probióticos. Pode-se concluir que a goma xantana é um biopolímero que tem alto
potencial para ser utilizado como agente encapsulante de microrganismos probióticos.

Palavras-chave: microencapsulação; probióticos; spray dryer; armazenamento.

______________________________________________________________________________________________
Preservation of Lactobacillus acidophilus using xanthan gum as encapsulating
agent

ABSTRACT
The objective of this study was to perform the preservation of Lactobacillus acidophilus
by the drying at spray dryer using xanthan as an encapsulating agent and to evaluate
the micro-organism viability at different storage conditions. Three treatments were
elaborated to obtain the microcapsules, varying the concentration of the encapsulating
solution, being: Treatment 1 - 1.5% of xanthan and 1,5% of aerosil (T1); Treatment 2 -
103
1% xanthan and 1% aerosil (T2); Treatment 3 - 0.5% of xanthan and 0.5% of aerosil
(T3) and Treatment 4 without encapsulating solution (T4). The L. acidophilus viability
was evaluated at days 0, 7, 15 and 45 of storage at room temperature and under
refrigeration. Irrespective of the treatment, the use of encapsulating solution increased
the initial survival of the microorganisms against the drying process, compared to the
control treatment. The material when maintained at room temperature showed greater
reduction of the cellular concentration at the end of the storage period. The cooling
temperature enhanced the surviving micro-organisms, especially for T1. Only material
obtaining by T1 treatment and stored under refrigeration until 15 days had a
concentration of viable cell as established by legislation of probiotics. It can be
concluded that xanthan gum is a biopolymer which has high potential to be used as an
encapsulating agent of probiotic microorganisms.

Keywords: microencapsulation; probiotics; spray dryer; storage.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Probióticos são definidos como microrganismos vivos capazes de melhorar o
equilíbrio microbiano intestinal, produzindo efeitos benéficos à saúde do indivíduo
(BRASIL, 2002). Para que exerça sua função benéfica, a legislação estabelece que a
quantidade mínima viável para os probióticos nos alimentos deve estar na faixa de 108 a
109 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) na recomendação diária do produto
(BRASIL, 2008).
Alguns alimentos possuem propriedades intrínsecas e extrínsecas, bem como a
tecnologia envolvida na sua elaboração, desfavoráveis ao desenvolvimento das culturas
probióticas, se fazendo necessárias ações para manter a estabilidade dos mesmos
durante o processo de elaboração e armazenamento; a microencapsulação é uma
alternativa para superar o obstáculo da redução da viabilidade de probióticos em
diferentes produtos alimentícios (ETCHEPARE et al., 2015; SILVA et al., 2014; SAAD
et al., 2011). Segundo Menezes et al. (2013), a microencapsulação consiste em uma
tecnologia que permite recobrir partículas ou pequenas gotas de material com agente
encapsulante, formando microcápsulas protetoras; estas podem liberar seu conteúdo em
taxas controladas e/ou sob condições específicas, o que é um fato interessante em se
tratando de probióticos, os quais deseja-se que resistam às condições desfavoráveis
estomacais e possam chegar ao intestino numa concentração eficaz. Ding and Shah
(2009) avaliaram o efeito de vários materiais encapsulantes na estabilidade dos
probióticos demonstrando a capacidade da xantana, que também exerce efeito
crioprotetor externo, em produzir microcápsulas resistentes às condições

104
gastrointestinais e aplicáveis em alimentos. Objetivou-se aumentar a sobrevivência de
Lactobacillus acidophilus durante a secagem por spray dryer utilizando a xantana como
agente encapsulante, avaliando a viabilidade inicial e após armazenamento a
temperatura ambiente e sob refrigeração.

MATERIAL E MÉTODOS
Material e Tratamentos: o microrganismo probiótico utilizado foi o Lactobacillus
acidophilus ATCC 4356. Na solução encapsulante utilizou-se o agente encapsulante
xantana (Fufeng®, distribuída pela Farmaquímica) e o antiumectante/antiagregante
Aerosil®. Foram elaborados 3 tratamentos variando-se a concentração da solução
encapsulante, sendo: tratamento 1 (T1): 1,5% xantana + 1,5% aerosil; tratamento 2
(T2): 1% xantana + 1% aerosil; tratamento 3 (T3): 0,5% xantana + 0,5% aerosil. Ainda
um tratamento controle negativo (T4), contendo solução salina 0,89% em substituição à
solução encapsulante. As soluções foram esterilizadas.
Encapsulação: o inóculo foi padronizado em DO600nm 0,5, sendo obtido segundo
SILVA et al. (2014). Após, o inóculo foi centrifugado a 10.000 xg, a 4 °C por 10 min, e
as células obtidas foram ressuspensas nas respectivas soluções e homogeneizadas. A
secagem foi realizada em spray dryer LabMaq (MSD 1.0), com temperatura de entrada
de 120°C, na saída de 60°C, fluxo de ar de 3L/h e velocidade de entrada de 0.4 L/h. O
pó produzido foi envasado em frascos tipo penicilina armazenados em dessecador à
temperatura ambiente (25°) e sob refrigeração (4°C). A sobrevivência ao processo de
secagem ou viabilidade inicial percentual foi calculada de acordo com a equação 1 e o
resultado expresso em percentual.
Vi = (Cf /Ci) x 100 (1)
Onde: Vi = Viabilidade inicial, Ci = Concentração celular inicial, Cf =
Concentração celular final após atomização.
Avaliação da viabilidade: a viabilidade inicial (dia 0) dos microrganismos liofilizados
e após 7, 15 e 45 dias de armazenamento foi determinada conforme Silva et al. (2014)
adaptado. Foram adicionadas 0,01 g das microcápsulas a 1 mL de solução tampão 0,05
M e submetidas à agitação de 150 rpm, 37 °C por 3 h. Após, foram realizadas contagens
das diluições seriadas em meio MRS ágar e incubadas a 37 °C, por 72 h sob
anaerobiose.

105
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Obteve-se material pulverulento de excelente aspecto. A viabilidade inicial foi:
6,8% para T1, 4,4% para T2, 9,1% para T3 e 1,4 para T4. Verificou-se sobrevivência
variada do microrganismo ao processo de secagem, influenciada pelo tratamento (tabela
1). A viabilidade durante o armazenamento foi influenciada pelo tratamento e
temperatura de armazenagem.

Tabela 1 – Concentração microbiana (UFC g-1) dos inóculos e material probiótico

armazenado em temperatura ambiente (25 °C) e sob refrigeração (4 °C).
Ambiente (25° C)
Trat Inóculo 0 dia 7 dias 15 dias 45 dias
T1 3,4x1010±5Aa 2,3x109±2,4Ab 3,1x108±4,6x101Ac 2,6x108±8Ac 3,0x107±10Ac
T2 5x109±10Ca 2,2x108±2Cb 2,0x106±0Bc 5,0x104±0Bc 0±0Bc
9 Ba 8 1Bb
T3 8,2x10 ±2,6 7,5x10 ±2,1x10 3,0x105±0Bc 0±0Bc 0±0Bc
9 Da 7 Cb
T4 2x10 ±3,7 2,7x10 ±8 2,0x106±0Bc 3,6x106±5Bc 0±0Bc
Refrigeração (4° C)
Trat Inóculo 0 dia 7 dias 15 dias 45 dias
10 Aa
T1 3,4x10 ±5 2,3x109±2,4x102Ab 3,0x109±0Ab 9
2,4x10 ±693 Ab
6,2x108±35Ac
9 Ca
T2 5x10 ±10 2,2x108±2Cb 4,6x107±1,9x10Bc 7
3,0x10 ±2 Bc
3,2x106±0Bc
T3 8,2x109±2,6Ba 7,5x108±2,1x10Bb 2,7x107±1Bc 2,4x107±2Bc 8,3x105±0Bc
T4 2x109±3,7Da 2,7x107±8Cb 3,0x107±10Bb 6
3,0x10 ±1 Bc
5,0x105±0Bc
Trat = tratamento. Letras maiúsculas distintas significam diferenças na coluna, letras minúsculas
diferenças na linha (p≥0,05). T1: 1,5% xantana, 1,5% aerosil; T2: 1,0% xantana, 1,0% aerosil; T3: 0,5%
xantana, 0,5% aerosil; T4: 0,0 % xantana, 0,0 % aerosil.

Em todos os tratamentos observou-se diminuição da concentração microbiana

após a secagem. Isto se dá devido às altas temperaturas que causam injúrias e morte às
células (SAAD et al., 2011). A redução foi de 1 ciclo logarítmico na população
microbiana usando-se a solução encapsulante, enquanto que no controle negativo (T4)
foi de 2 ciclos. Esses resultados são superiores aos obtidos por Zhao et al. (2008) para L.
acidophilus encapsulados com β-ciclodextrina e goma arábica, que tiveram redução de
2 ciclos logs. Hain et al. (2015) também evidenciaram diminuição de 2 logs para
bactéria probiótica encapsulada em diferentes combinações de agentes encapsulantes
(alginato de sódio, xantana e β-ciclodextrina).
A utilização de xantana diminuiu a injúria celular frente ao processo de secagem
com temperatura de 120 °C, com destaque ao tratamento com maior concentração de

106
xantana e aerosil (T1), que também ocasionou viabilidade significativamente maior
durante o armazenamento, em ambas temperaturas.
O material armazenado à temperatura ambiente apresentou maior redução da
viabilidade ao tempo final (45 dias), diminuindo 2 logs no T1; já nos demais
tratamentos, ao final do período, não detectou-se nenhuma célula viável. Quando
armazenado sob refrigeração, o T1 manteve concentração superior a 108 UFC.g-1, valor
mínimo para essa porção de 1g ser considerada probiótico pela legislação atual
(BRASIL, 2008). T2 e T3 tiveram valores de 106 UFC.g-1, sendo o mínimo aceitável
para que os probióticos exerçam ação benéfica (FAO, 2002; ROY, 2005). Silva et al.
(2014) realizaram a microencapsulação de B. animalis e L. acidophilus utilizando como
encapsulante uma solução contendo diversos agentes. Relataram que o armazenamento
sob refrigeração auxiliou na estabilidade das células encapsuladas e que este evita
rearranjos no material de parede, impedindo a exposição inadequada dos
microrganismos às condições adversas, e assim auxiliando no incremento da vida útil
das microcápsulas.

CONCLUSÕES
O processamento utilizado permitiu a sobrevivência do probiótico Lactobacillus
acidophilus ATCC 4356. A xantana é um biopolímero com alto potencial para ser
utilizado como agente encapsulante de microrganismos probióticos.

REFERÊNCIAS
BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução
RDC n. 2, de 07 de janeiro de 2002. Aprova o Regulamento Técnico de Substâncias
Bioativas e Probióticos Isolados com Alegação de Propriedades Funcional e ou de
Saúde. Diário Oficial da União, Brasília, 09 de janeiro de 2002.BRASIL. Ministério da
Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Alimentos com alegações de
propriedades funcionais e ou de saúde, novos alimentos/ingredientes, substâncias
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Oficial da União, Brasília, 2008.
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.doi.org/0.1111/j.1750-3841.2009.01067.

107
ETCHEPARE, M. de A.; MENEZES, M. F. S. C.; BARRETO, A. R.; CAVALHEIRO,
C. P.; MENEZES, C. R. Microencapsulação de probióticos pelo método de extrusão
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2015. http://dx.doi.org/10.5902/2179-460X19718.FAO. Food and Agriculture
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24, p.1349-1354, 2008.

108
 Fermentação de xilose em etanol por leveduras
Saccharomyces cerevisiae
Dinis Pedro Silvério Batalha1; Daniela Defavari do Nascimento1*
1
Faculdade de Tecnologia de Piracicaba “Dep. Roque Trevisan” - Fatec Piracicaba.
*[email protected]

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
As preocupações ambientais dão cada vez mais importância aos biocombustíveis com
destaque para o bioetanol, mas há necessidade de encontrar matérias-primas
alternativas, que não concorram com a produção de alimentos ou propiciem o uso da
terra para fins energéticos. Os resíduos agroindustriais, de baixo valor econômico, como
o bagaço, atendem esse objetivo, mas para que a produção de etanol a partir de
materiais lignocelulósicos seja economicamente viável e capaz de competir com
combustíveis fósseis, é necessário identificar microorganismos capazes de fermentar
xilose, principal constituinte da hemicelulose. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o
microrganismo de excelência utilizado em escala industrial, pela sua resistência a altas
concentrações de etanol. No presente trabalho, foram testadas doze linhagens de
leveduras disponíveis no banco de germoplasma da Fatec Piracicaba quanto à sua
capacidade de metabolizar xilose, visando encontrar leveduras adaptadas à fermentação
na presença destas pentoses. Os testes preliminares permitiram observar quais se
adaptaram melhor ao substrato com xilose a 15% e 30%, pela medida de gás formado
durante a fermentação, três delas apresentaram resultados promissores com a presença
de xilose. No passo seguinte as fermentações com estas leveduras, numa escala maior,
permitirão medições da quantidade de xilose consumida e correlacionar com a
quantidade de etanol produzido.

Palavras-chave: Bioetanol, Biocombustíveis, Etanol celulósico, Química verde,

Pentoses.
______________________________________________________________________________________________

Xylose fermentation to ethanol by Saccharomyces cerevisiae yeasts

ABSTRACT
Environmental concerns are giving increasing importance to biofuels, with highlight to
bioethanol, however there is a need to find alternative raw materials, which do not
compete with the production of food or use of land for energy purposes. The
agroindustry waste, of low economic value, such as bagasse, meets this propose, but to
make the production of ethanol, from lignocellulosic materials, economically viable and
capable of rivaling with fossil fuels, it is necessary to identify microorganisms able to
ferment xylose, the main constituent of hemicelluloses. Saccharomyces cerevisiae
yeastsare excellence microorganisms to use at industrial scale, due to its resistance to
high ethanol concentrations. In the present work, twelve yeast strains available at the
germplasm bank of Fatec Piracicaba, were tested for their ability to metabolize xylose,

109
with the aim to find yeasts adapted to the fermentation in the presence of these pentoses.
Preliminary tests had permitted to observe which were better adapted to substrate with
xylose at 15% and 30%, by the measure of gas formed during the fermentation, three of
them presented promising results at the presence of xylose. At the next step,
fermentations with these yeasts on a larger scale will allow measurements of the amount
of xylose consumed and its correlation with the amount of ethanol produced.

Keywords: Bioethanol, Biofuels, Cellulosic ethanol, Green chemistry, Pentoses.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
O Brasil é, entre os países do BRICS, o que mais utiliza biocombustíveis para
transporte, e com tendência para aumentar, segundo Müller et al. (2011), a previsão para
2030 é que se exceda os 40%. A maior contribuição para esse percentual vem do etanol
combustível, para o qual 97,1% da matéria prima utilizada é a cana de açúcar. Entre
2012 e 2015 a produção nacional do combustível cresceu mais de 20% (EPE, 2015), já
para a safra de 2016/17 a CONAB (2016) estimou um aumento modesto de 2,6%
impulsionado pelo aumento da mistura de etanol anidro na gasolina de 25 para 27%,
porém o etanol hidratado deverá apresentar queda de produção, pela redução do
consumo e devido ao elevado preço do açúcar no mercado externo que leva as usinas a
aumentarem a produção de açúcar em detrimento do etanol.
A expectativa é de que as usinas possam utilizar bagaço de cana hidrolisado
como fonte de açúcares fermentescíveis. O aproveitamento do bagaço e palha da cana
poderá elevar a produção de etanol em 30 a 40% para uma mesma área plantada, porém,
o bagaço possui um grande teor de hemiceluloses, o que torna necessário o
aproveitamento dos açúcares com cinco carbonos como precursores de etanol
(EMBRAPA, 2016).
A fermentação alcoólica é realizada por diversas bactérias e leveduras e as
linhagens de Saccharomyces cerevisiae estão altamente adaptadas à utilização em
processos fermentativos de etanol e exploração industrial (Tortora et al., 2012). Como
vantagens principais apresentam alta tolerância a concentrações elevadas de etanol e
baixo pH, o que permite o controle de contaminação bacteriana, tão importante no
processo industrial (Moysés et al., 2016). Para a obtenção do etanol carburante, quando
se visa a utilização de bagaço de cana hidrolisado, surge um novo desafio, devido ao seu
alto conteúdo de xilose, uma vez que a S. cerevisiae não é capaz de converter a xilose
em etanol. Outros microrganismos capazes de realizar essa conversão são pouco
eficientes e não toleram altas concentrações de etanol (Mousdale, 2008), a permanência

110
de linhagens não Saccharomyces nas dornas é reduzida pois os teores alcoólicos desse
tipo de fermentação não permitem a sobrevivência de outros gêneros de leveduras
(Andrietta et al., 2006)
A fermentação alcoólica começa com a glicólise produzindo duas moléculas de
ácido pirúvico e duas moléculas de ATP. A Hexoquinase é a enzima que catalisa a
primeira reação, a conversão de glicose e ATP em glicose-6-fosfato e ADP. A hidroxila
do carbono 6 da glicose, para a qual o fosfato do ATP é transferido, é similar à água em
reatividade química e a água entra livremente no sítio ativo da enzima. Apesar disso, a
hexoquinase pode discriminar a glicose e a água devido às mudanças conformacionais
que ocorrem na enzima quando o substrato correto se liga ao sítio ativo. A xilose,
estereoquimicamente similar à glicose mas com um carbono a menos, liga-se à
hexoquinase em uma posição onde não pode ser fosforilada, porém suficiente para
induzir a mudança para a conformação ativa e, desse modo, a enzima fosforila a água,
assim, a adição de xilose à mistura de reação aumenta o consumo de ATP (Nelson and
Cox, 2002).
Algumas linhagens de levedura S. cerevisiae conseguem utilizar xilose como
substratos para reduzir a xilitol, através de enzimas específicas. Podem igualmente
aproveitar a xilose como nutriente, promovendo a sua isomerização a xilulose para
utilizar na síntese de ácidos nucleicos (Mousdale, 2008). Mas, a grande maioria das
linhagens naturalmente ocorrentes de S. cerevisiae é incapaz de metabolizar xilose
(CGEE, 2010).
A Embrapa (2016) desenvolve alguns projetos relacionados à produção de etanol
de segunda geração, os quais buscam identificar leveduras naturalmente capazes de
fermentar xilose, assim como o desenvolvimento de linhagens recombinantes de S.
cerevisiae com essa característica. Vários desafios surgiram após as primeiras
experiências com S. cerevisiae recombinantes, em simultâneo com o esclarecimento dos
caminhos metabólicos para a xilose na levedura, como a via das pentoses fosfato e a
formação de xilitol (Moysés et al., 2016).
Desta forma, a proposta do presente trabalho é identificar linhagens de leveduras
Saccharomyces cerevisiae que tenham a capacidade de fermentar açúcares de cinco
carbonos como a xilose e que ainda não tenham o metabolismo fermentativo inibido
pela presença desses açúcares, a fim de que possam ser utilizadas em processos
industriais de obtenção de etanol de segunda geração proveniente de materiais
lignocelulósicos após tratamento e sacarificação.

111
MATERIAL E MÉTODOS
Os testes têm sido realizados na Fatec Piracicaba com leveduras S. cerevisiae
disponível no banco de germoplasma da faculdade conservadas em ultrafreezer. Os
meios de cultura foram preparados a partir de caldo de cana diluído com água destilada
para correção do ºBrix para 11,5 e corrigido o pH para 4,5 com ácido sulfúrico diluído,
autoclavados por 15 minutos a 121ºC. Duas outras formulações de meios foram
testadas, acrescentando-se 15 e 30% de xilose ao meio base de caldo de cana a
11,5ºBrix.
Na primeira fase foram escolhidas 12 cepas, conforme tabela 1, multiplicadas
em caldo de cana a 7ºBrix e pH 4,5 a 30ºC com agitação constante por 48 horas, as
alíquotas de solução de levedura foram calculadas pela medição da turbidez em
espectrofotômetro a 600 nm, em proporção inversa à absorbância (1000 µl para 0,1
abs), e adicionadas em triplicata em tubos de ensaio com tubo Durham invertido e 10 ml
do respectivo meio de cultura (caldo de cana a 11,5ºBrix; caldo de cana a 11,5ºBrix +
15% xilose; e caldo de cana a 11,5ºBrix + 30% xilose), após 17 e 21 horas mediu-se a
altura de gás no tubo Durham.
Tabela 2 – Leveduras utilizadas na fase de seleção.
Tipo de Alíquota
Identificação Nome
Levedura (µl)
1 Munich Cerveja de Trigo 200
2 T58 Cerveja 150
3 Diamond Cerveja 500
4 Vinho de amora Natural 150
5 Usina da região Industrial 1500
6 A2 Industrial 150
7 Uva passa Natural 250
Monte Alegre do
8 Cachaça artesanal 250
Sul
9 Lev. Cerveja Natural 200
10 English Cerveja 200
11 S23 Cerveja 300
12 California Cerveja 750

Os resultados preliminares permitiram selecionar as leveduras que tiveram

melhor desempenho na presença de xilose com as quais os testes serão repetidos em
escala maior para a realização das medições de etanol produzido através de ebuliômetro
e a xilose consumida por espectrofotometria a 540 nm com reagente DNS e determinar
a sua relação.

112
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As leveduras que apresentaram resultados positivos no meio contendo 15% de
xilose decorridas 21 horas foram 3, 4, 5, 6, e 8, e destas as que se destacaram nas
primeiras 17 horas foram 3, 5, 6 e 8.
Já para o meio com 30% de xilose as que produziram mais gás foram 2, 3, 4, 5,
6, 9 e 10, mas apenas as leveduras 3, 5 e 6 obtiveram resultados significativos nas
primeiras 17 horas.
A levedura 9 apresentou resultados melhores no meio sem xilose.
As leveduras 1, 7, 11 e 12 tiveram pouca formação de gás nos três meios, por
isso, presume-se que têm baixo rendimento fermentativo.
Na figura 1 são exibidos tubos representativos da cepa 5.

Figura 1 – Tubos representativos da cepa 5, em meio constituído de caldo de cana a

11,5ºBrix, acrescidos de 30%, 15% e 0% de xilose, respectivamente.

Como se observa na figura 1 a formação de gás nos tubos Durham é um

indicador simples das leveduras que tiveram bom rendimento na fermentação e permite
a seleção das que têm maior potencial para fermentar na presença de xilose, o estudo da
relação de xilose consumida com a produção de etanol deverá permitir escolher cepas
com potencial para utilização em substratos com esse açúcar.

113
CONCLUSÕES
O teste preliminar revelou-se eficiente para selecionar as cepas que têm maior
potencial para fermentar em meios contendo xilose e escolher as que serão utilizadas na
próxima fase do estudo.

REFERÊNCIAS
ANDRIETTA, M.G.S. et al. 2006. Bioetanol: Brasil, 30 anos na vanguarda.
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Segundo levantamento. Brasília: CONAB.

EMBRAPA. 2016 [viewed 07 September 2016]. Genômica funcional, transcriptômica

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EPE - EMPRESA DE PESQUISA ENERGÉTICA. 2016 [viewed 29 August 2016].

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NELSON, D.L. and COX, M.M. 2002. Lehninger princípios de bioquímica, 3. ed.
São Paulo: CLR Balieiro Editores.

TORTORA, G. J. et al. 2012. Microbiologia. 10. Ed. Porto Alegre: Artm

114
 Viabilidade da inoculação de Cratylia argentea com
microrganismos fixadores de nitrogênio para uso como
forragem em ovinocultura
Eduardo José Azevedo Corrêa1*; Manoel Eduardo Silva1; Henrique Clayton1; Adriano Guimarães
Parreira2, Paulo de Oliveira1, Ivanildo Evôdio Marriel3.

1Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais (EPAMIG).

*e-mail [email protected] (autor para correspondência)
2 Universidade Estadual de Minas Gerais (UEMG).
3Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA).

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Este trabalho mostra os resultados de testes de inoculantes de microorganismos
fixadores de nitrogênio desenvolvidos pela EMBRAPA Milho e Sorgo em uma
forrageira chamada Cratylia argentea muito usada em agro ecossistema como
alimentação animal em países da região Amazônica. O objetivo do presente trabalho foi
avaliar a eficiência de estirpes de Rhizobium spp, que foram pré-selecionadas pela
equipe da Embrapa Milho e Sorgo, em campo experimental. Para isso, inoculamos
plantas de C. argentea em campo, inoculação tardia de plantas já adultas, com foco nas
estirpes 4 (CR42) e 22 (CR52) que mostraram ter maior eficiência simbióticas nos
estudos já realizados em casa de vegetação. Os trabalhos foram realizados no Campo
Experimental de Pitangui (CEPI/EPAMIG), Pitangui, MG, onde plantas adultas de C.
argentea em campo foram inoculadas tardiamente. Os resultados do presente trabalho
demonstraram que até o presente momento a fixação biológica não teve um significativo
papel no incremento do crescimento desta espécie, pelo menos quando as plantas são
inoculadas após um metro de altura. Outros experimentos estão sendo conduzidos com
inoculação em sementes no momento do plantio. Mas estudos principalmente em campo
são importantes para se avaliar e se obter uma estirpe de rizóbio eficiente
principalmente em condições de campo.
Palavras-chave: Fixação Biológica de Nitrogênio, Rizobium, Cratyllia argentea,
Consócio pastagem leguminosa, Ovinocultura.

115
 Rhizobia inoculation´s viability with nitrogen-fixing microorganisms in Cratylia
argentea to use as forage in sheep
ABSTRACT
This paper shows results from tests of microbial inoculants fixing of atmosferic nitrogen
developed by EMBRAPA CNPMS to forage plant called Cratylia argentea. A plant
very used in agroecosystems to animal supply in countries on Amazonia land. The aim
of this work was to evaluate the Rhizobium efficiency from EMBRAPA in an
experimental field located at Pitangui City. C. argentea plants was inoculated in field
after one year of growth, the inoculation was late in adult plant one years old, we
selected three stirpes of rhizobia CR52 BR 10257; CR42 BR10244 and CR 33 Br10243,
and one control treatment not inoculated. This rhizobia was selected by you greatest
symbiotic efficiency in older studies in green house conditions. This work has been
realized in the Pitangui Experimental field (CEPI/EPAMIG), Pitangui City, MG. Where
adult’s plants of C. argentea, growing in the field past ne year old and with over one
meter tall was inoculated with the EMBRAPA rhizobia stirpes. The results of the
present work shows that until now the Air Nitrogen Biologic Fixation are not significant
role to increase the C. argentea´s grow up, when the plants are one meter tall when they
are inoculated. Other experiments are been conducted in CEPI/EPAMIG to evaluate the
seeds inoculation´s efficient. However mainly fields studies are necessary and important
to evaluate and obtain one Rhizobia´s stirpes efficient in fields conditions.
Keywords: Biological Fixation of Nitrogen, Rizobium, Cratylia argentea, Consortium
leguminous pasture, Sheep.
______________________________________________________________________
INTRODUÇÃO
O gênero Cratylia pertence à subfamília Faboideae da família Fabaceae. É uma
planta perene, arbustiva atingindo de 1,5 a 3 metros de altura, com raízes profundas e
quando consorciadas com plantas de porte alto podem mostrar um habitus volúvel
rastejante. As folhas são trifolioladas com lâminas foliares amplamente ovadas com
pubescência prateada na face abaxial. As flores são arranjadas em pseudo racemo
alongado, com 6-9 flores por nó. As pétalas são predominantemente lilás ou,
excepcionalmente, brancas. Os legumes são retos, planos, até 20 cm de comprimento e
1-2 cm de largura, deiscentes, contendo 4-8 sementes ovais a quase circulares de cerca
de 1 cm de diâmetro, de tonalidade variando de amarelo escuro a castanho quando
maduros e sob condições de alta umidade, tem aspecto marrom escuro. O peso de mil

116
sementes é de aproximadamente de 220 gramas, ou seja, cerca de 4500 sementes por
quilograma (PETERS & SCHULTZE-KRAFT, 2002).
A Cratylia é leguminosa arbustiva nativa do cerrado, tolerante à seca e a solos
ácidos e tem potencial para adubação verde e forrageamento. Por essas características,
pode ser utilizada pelo agricultor familiar. Resultados com germinação mostram que as
sementes possuem em torno 80% de germinação, mantido tanto em sementes recém
colhidas quanto armazenadas (ARAÚJO, 2011).
Esta espécie tem potencial para ampliar a disponibilidade de fitomassa em
sistemas agrícolas, alimentar ruminantes em épocas de reduzida forragem natural e
recuperar áreas degradadas. MIRANDA (2011), na região central de Minas Gerais,
avaliou a produção de fitomassa de C. argentea em área de 105 m2. No primeiro
intervalo de cortes (outubro/2010 a fevereiro/2011) produziu 291,7 kg (27,7 t ha-1), de
fevereiro a maio/2011, produziu 220,7 kg (21,0 t ha-1) e de maio a setembro/2011
produziu 93,9 kg (8,9 t ha-1) concluindo que C. argentea pode ser importante espécie
para o fornecimento de fitomassa em agro ecossistema na região estudada.

MATERIAL E MÉTODOS
Inoculação de C. argentea tardiamente
Foi realizada a inoculação tardia com estirpes de Rizóbio cedidos pelo Dr.
Ivanildo Evódio Marriel EMBRAPA/CNPMS pré selecionados por CALAZANS
(2016). 10 mL de inoculante foram aplicados diretamente no colo de plantas adultas de
C. argentea com cerca de um ano, plantadas em espaçamento de 1 x 1 metros e podadas
a altura de 1 metro (conforme croqui da Figura 1). As plantas dentro de cada parcela e
obedecendo cada tratamento foram reinoculadas três meses após a inoculação inicial.
As “parcelas” foram montadas dentro do “pool” de plantas visando
homogeneidade no tamanho das plantas. Cada parcela ficou delimitada por uma
bordadura de plantas que foram inoculadas com a estirpe daquela parcela.

117
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
1 b b b b b b b b b b b b b b b
2 b b b b b b b b b b b b x x x x x
3 b b b b b b b b b x x x x x x x x x
4 b b b b b b b b b b x x x x x b b x x x x x
5 x x x x x b b b b b x x x x x b b x x x x x
6 x x x x x b b b b b x x x x x b b x x x x x
7 x x x x x b b b b b x x x x x b b x x x x x
8 x x x x x b b b b b x x x x x b b x x x x x
9 x x x x b b b b b x x x x x b b x x x x x Controle
10 x x b b b b b x x x x b b x x x x x CR52 (BR10257)
11 b b b b b b b b x x x x x b b x x x x x CR33 (BR10243)
12 x x x x b b b b b x x x x x b b x x x x x CR42 (BR10244)
13 x x x x b b b b b b b b b x x x x x
14 x x x x x b b b b b b x x x x
15 x x x x x b b b b b b b x x x x
16 x x x x x b b b b b b x x x x x
17 x x x x x b b b ARVORE x x x x x b b
18 x x x x x b b b b b b b x x x x x b b
19 x x x x x b b b b b b b b b b x x x x x b b
20 x x x x b b b b b b b b b b x x x x x b b
21 x x x x x b b b b b b b b b x x x x x b b
22 x x x x b b b b b b b b b b x x x x x b b
23 x x x x b b b b b b b b b x x x b b
24 x x x x x b b b b b b b b b b x x x x b b
25 x x x b b b b b b b b b b x x x x x b b
26 x x x x x b b b b b b b b b b x x x x x b b
27 x x x x x b b b b b b b b b b b b b b b b b
28 x x x x x b b b b b b b b b b b b b b b
29 x x x x x b b b b b b b b b b b b b b b b b
30 x x x x x b b b b b b b b b b b b b
31 x x x x x b b b b b b b b b b b b b
32 b b b b b b b b b b b b b b b b
33 b b b b b b b b b b b b b b b
34 b b b b b b b b b b b b b b
35 b b b b b b b b b b b ARVORES b b b b b

Figura 1. Croqui da área de inoculação tardia montada no setor de Ovinocultura do CEPI/EPAMIG. NOTA:
Tratamentos: Azul – estirpe de rizóbio CR52 BR 10257; Preto – estirpe CR42 BR10244; Laranja – estirpe CR 33
Br10243; E Branco – tratamento controle sem inoculação de rizóbio.
O desenvolvimento (crescimento em altura e diâmetro e acúmulo de nitrogênio
foliar) foi avaliado semanalmente dentro das parcelas, excluindo as bordaduras. Foram
coletados dados entre Novembro e Dezembro de 2016 e uma segunda coleta de dados
entre janeiro e fevereiro de 2017.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados experimentais obtidos não foram conclusivos sobre a eficiência
das estirpes de rizóbio utilizados em inoculação tardia de plantas de C. argentea. Não
foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os tratamentos e/ou
controle em nenhum dos tempos ou períodos avaliados (Tabelas 1 e 2).
Tabela 1. Resultado da Análise não paramétrica (Kruskal-Wallis) para dados de altura (cm) no período de
Novembro a Dezembro de 2016.
TRATAMENTO N Mediana Ranque de Média Z
BR10243' 118 101,50 231,7 -0,36
BR10244' 134 108,00 248,3 1,29
BR10257' 108 96,00 219,2 -1,42
Controle 110 103,50 240,1 0,40
Overall 470 235,5
H = 2,96 DF = 3 P = 0,398 N S
H = 2,96 DF = 3 P = 0,398 (adjusted for ties)

Tabela 2. Resultado da Análise não paramétrica (Kruskal-Wallis) para dados de altura (cm) para dados
coletados no período de Janeiro a Fevereiro de 2017.
TRATAMENTO N Mediana Ranque de Médias Z
BR10243' 118 101,50 231,7 -0,36
BR10244' 134 108,00 248,3 1,29
BR10257' 108 96,00 219,2 -1,42
Controle 110 103,50 240,1 0,40
Overall 470 235,5
H = 2,96 DF = 3 P = 0,398 NS
H = 2,96 DF = 3 P = 0,398 (adjusted for ties)

118
 O gráfico de box-plot de crescimento em altura da avaliação feita entre Janeiro e
Fevereiro de 2017 mostra que as plantas cresceram entre 70 e 80 centímetros entre o
inicio e o final da avaliação, entretanto se consideramos a distribuição dos dados entre
tratamentos dentro do mesmo período, vamos observar que não há diferenças
significativas, o que nos leva a não rejeitar a hipótese nula e dizer que os inoculantes
aplicados tardiamente em plantas com um metro de altura não surtiram efeito no
período até o momento avaliado.

Crescimento em altura de C. argentea inoculadas tardiamente

250

200
ALTURA (CM)

1 50

1 00

50

0
TRATAMENTO ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' '
3 4 7 o le 3 4 7 ol e 3 4 7 ole 3 4 7 ole 3 4 7 ole
24 24 25 tr 24 24 2 5 t r 24 24 25 t r 2 4 2 4 25 t r 2 4 2 4 25 t r
R1 0 R 1 0 R 1 0 Con R1 0 R1 0 R 1 0 Con R1 0 R1 0 R1 0 Con R1 0 R1 0 R1 0 C on R1 0 R1 0 R1 0 C on
B B B B B B B B B B B B B B B
COLETA DE DADOS 1 2 3 4 5

Figura 2. Crescimento em altura de C. argentea inoculadas tardiamente. (Coleta de Dados 1, 2, 3 ..

correspondem a 1ª, 2ª, 3ª ... semana de avaliação).
CONCLUSÕES
Não foram encontradas diferenças significativas entre os tratamentos, isso pode
indicar que as estirpes pré-selecionadas em vasos por CALAZANS (2016) não sejam
efetivas em campo, ou que a inoculação tardia desta espécie não é adequada, é provável
que as raízes finas mais profundas susceptíveis a infecção pela bactéria rizóbio não
foram atingidas pelo inoculante aplicado no colo da planta, sendo mais adequada a
inoculação de mudas ou sementes. Mais estudos e testes em campo serão importantes
para se alcançar dados mais consistentes e definir qual o melhor momento e a melhor
estirpe de rizóbio para uma maior produção de fitomassa de C. argentea em campo.
AGRADECIMENTO
Agradecemos a EMBRAPA pelo apoio na realização deste trabalho, a
FAPEMIG pelas bolsas disponibilizadas e recursos necessários para desenvolvimento
desta proposta e toda a equipe de trabalho do CEPI/EPAMIG onde foram desenvolvidos
os trabalhos desta pesquisa.

119
REFERÊNCIAS
ARAUJO, Sirlene Nunes, MANTRANGOLO, Walter José Rodrigues, MIRANDA,
Gabriel Avela, NETTO, Alecia Martins, SILVA, Igor Henrique Sena. Análises das
Sementes de Cratylia argentea: Cultura Potencial para Adubação Verde e Forragem.
Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento / Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG :
Embrapa Milho e Sorgo, 2011. 18 p.

CALAZANS Giovanna Moura; OLIVEIRA, Christiane Abreu; CRUZ, José Carlos;

MATRANGOLO, Walter José Rodrigues; MARRIEL, Ivanildo Evódio. Selection of
efficient rhizobial symbionts for Cratylia argentea in the cerrado 24 biome. Ciência
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MIRANDA , G,A.; MATRANGOLO,W.J.R; ARAÚJO, S.N. ; MOREIRA, J. A. A.;

PEREIRA, M.P.R; DA SILVA, I.H.S. Cratylia argentea: Produção de Fitomassa e
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VII Congresso Brasileiro de Agroecologia – Fortaleza/CE – 12 a 16/12/2011 Cadernos
de Agroecologia – ISSN 2236-7934 – Vol6, No. 2, Dez 2011

PETERS, M. & SCHULTZE-KRAFT, R. (2002). Cratylia argêntea (desv.) Kuntze.

FAO Grassland ndex, RomeItaly. Avalable online at:
http://www.fao.org/ag/agp/AGPC/doc/gbase/data/pf000517.htm. Acesso em: 30 abr.
2015.

120
 Resíduos agroindustriais como substratos para produção de
Metarhizium anisopliae
Eloane Daize Gomes Dallastra1; Lina María Grajales Agudelo1 *

1
Universidade Federal do Tocantins. *e-mail: [email protected]

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
A técnica de controle biológico com a utilização de fungos entomopatogênicos tem
aumentado nas últimas décadas. A crescente procura e os custos de produção levantam a
necessidade de se averiguar novos meios para produzi-los. Os resíduos agroindustriais,
por possuírem qualidade nutricional e baixo custo podem se constituir em uma
alternativa. O presente trabalho tem por objetivo avaliar a produção de conídios do
fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae ICBC 425 por Fermentação em
Estado Sólido (FES), utilizando: quirela de arroz, farelo de trigo e farelo de soja.
Experimentos preliminares foram realizados com o objetivo de determinar a
necessidade de pré-tratamentos nos substratos e definir as concentrações das FES
posteriores. Estas concentrações foram definidas em 50 e 33,3%. Fermentações
utilizando arroz Tipo I foram realizadas como referência. As fermentações foram
realizadas em sacos de polipropileno contendo 5g de substrato. Os experimentos
preliminares mostraram que o crescimento dos conídios nos resíduos agroindustriais
sem a realização de pré-tratamentos é estatisticamente igual às fermentações com pré-
tratamentos. Assim, as FES posteriores foram realizadas sem pré-tratamentos e as que
proporcionaram maior produção de conídios do fungo, em ordem decrescente, foram:
Farelo de trigo e quirela de arroz ambos sem pré-tratamento (50%); Farelo de trigo sem
pré-tratamento e arroz cozido (50%); Farelo de soja, farelo de trigo ambos sem pré-
tratamento e arroz cozido (33,3%) e Farelo de soja, farelo de trigo e quirela de arroz,
todos sem pré-tratamento a 33,3%; mostrando que a combinação desses substratos
permite ter uma maior produção de conídios em relação ao arroz Tipo I.

Palavras-chave: Fungo entomopatogênico, Resíduos da agroindústria, Controle

biológico. Fermentação em Estado Sólido.
______________________________________________________________________________________________

Agroindustrial waste as substrates for Metarhizium anisopliae production

ABSTRACT
The technique of biological control with the use of entomopathogenic fungi has increased in the
last decades. Rising demand and production costs raise a need to find new ways to produce
them. Agro-industrial waste, because of its nutritional quality and low cost, can be in a viable
form. The present work aims to evaluate the production of entomopathogenic fungi.
Metarhizium anisopliae ICBC 425 by Solid State Fermentation (FES), using: broken rice, wheat
bran and soybean meal. Preliminary experiments were carried out to determine the need for pre-
treatments on the substrates and to define as concentrations of subsequent FES. These
concentrations were defined as 50 and 33.3%. Fermentations using rice were carried out as

121
reference. Fermentations were carried out in polypropylene bags containing 5g of substrate.
Preliminary experiments showed that the conidia growth in agroindustrial wastes with and
without a pretreatment were statistically equal. For this reason, subsequent FES were performed
without pre-treatments. The higher production of fungus conidia, in descending order, were:
Wheat bran and rice seed (50%); Wheat bran without pre-treatment and cooked rice (50%);
Soybean meal, wheat bran, both without pre-treatment and cooked rice (33.3%) Soybean meal,
wheat bran and rice, 33.3%; It shows that a combination of the substrates allows a greater
production of conidia in relation to the conventional method that uses the Type I rice.

Keywords: Entomopathogenic fungi, Agroindustrial waste, Biological control, Solid

state fermentation.
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
A aplicação da técnica de controle biológico tem se intensificado nas últimas décadas
(Lacey et al., 2001) e isso se justifica em decorrência das diversas vantagens que os agentes
entomopatogênicos apresentam em relação aos agrotóxicos, como baixo custo, preservação
da biodiversidade nos ecossistemas e da segurança do homem (Alves, 1998; Grajales, 2010).
O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é mundialmente conhecido e
utilizado como agente biocontrolador de inúmeras pragas agrícolas, sendo produzido por
fermentação em estado sólido (FES) utilizando grãos de arroz como substrato (Faria and
Magalhães, 2001). A crescente procura pelo controle microbiano, aliada às despesas da
produção, levantam a necessidade de averiguar a eficiência de outros meios de cultura para
produzi-lo e os resíduos agroindustriais tornam-se uma forma viável por possuírem
propriedades nutricionais importantes, grande disponibilidade e baixo custo, em conjunto
com a regionalização da produção (Sene, et al., 2010).
O presente trabalho propõe analisar a produção de conídios do fungo M. anisopliae
utilizando como substratos quirela de arroz, farelo de soja e farelo de trigo, puros e em
mistura, com e sem pré-tratamento, tendo como referência fermentações conduzidas com
arroz tipo I.

MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados esporos do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae (ICBC
425). Arroz Tipo I, quirela de arroz, farelo de soja e farelo de trigo foram utilizados como
substrato.
Pré-inóculo: foi feito em frascos erlenmeyers contendo meio de cultura batata-
dextrose-ágar (BDA) esterilizados em autoclave (120 °C durante 20 min) e incubados em
câmara climatizada BOD (07 dias à 28 ± 1 °C). Após, foi preparada uma suspensão de

122
conídios utilizando uma Câmara de Neubauer (6,9×107 conídios/mL) e uma solução nutriente
(Schamne, 2010).
Pré-tratamento: O arroz e a quirela de arroz foram cozidos por imersão (800C durante
4 min) e deixados à temperatura ambiente até atingir umidade de 40% (Grajales, 2010). O
farelo de soja e o farelo de trigo foram lavados com água corrente, peneirados em tecido do
tipo “tecido-não-tecido” (TNT) e secados em estufa (800C durante 24 h). Ao testar os
substratos sem pré-tratamento, foi adicionado água até umidade de 40%.
Experimentos preliminares: os substratos puros (5g) foram colocados em sacos de
polipropileno (PP) (15x20cm) e esterilizados. Foi inoculado 1 mL da suspensão de conídios e
a fermentação ocorreu em câmara climatizada BOD, após a fermentação fez-se a contagem
dos conídios através de uma Câmara de Neubauer.
A partir dos resultados dos experimentos preliminares foram definidas misturas dos
substratos a 50 e 33,3% para as FES posteriores. Os substratos foram preparados,
esterilizados, inoculados, incubados e foi realizada a contagem da produção de conídios de
acordo com a metodologia descrita anteriormente.
Os experimentos foram realizados em delineamento inteiramente casualizado. Os
conídios produzidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e teste de Scott-
Knott, ambas no nível de 5% de probabilidade.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Experimentos preliminares: O farelo de trigo com e sem a realização de pré-
tratamento proporcionou a maior produção de conídios de M. anisopliae (Tabela 1) e a
proporção equilibrada de nutrientes deste farelo pode justificar este fato (Penariol, 2006).
Ambos os casos não diferiram estatisticamente, assim, a utilização do farelo de trigo sem
pré-tratamento poderia se constituir em um meio viável economicamente, pois em
produções em larga escala acarretaria uma diminuição de gastos energéticos, de mão de
obra e tempo.
Os resultados obtidos para o arroz e para quirela apresentados na Tabela 1 mostram
que a quirela de arroz com pré-tratamento proporcionou a menor produção de conídios. Após
cozimento e esterilização deste substrato foi possível constatar uma formação de aglomerados
maior em relação aos demais, o que segundo Alves and Lopes (2008), dificulta o crescimento
do fungo devido a diminuição da superfície de contato. Além disso, assim como Sene et al.,
(2010), foi observado uma maior dificuldade do desprendimento dos conídios da matriz
sólida no momento da contagem, justificando também a menor produção do microrganismo.

123
 O farelo de soja com e sem a realização de pré-tratamento foram os substratos que
apresentaram menor produção de conídios de M. anisopliae. Segundo Leite et al.,(2003), a
produção de fungos em meios ricos em nitrogênio e deficientes em carbono tendem a
produzir menor quantidade de conídios, o que é o caso do farelo de soja (Penariol, 2006).

Tabela 1 - Quantidades médias de conídios de M. anisopliae obtidas a partir dos substratos

puros após incubação por 07 dias em BOD (28 ± 1 °C).
Substrato Concentração (x107 conídios/g)
FTPT 165,6 a
FT 160,3 a
Q 101,6 b
AC 84,3 c
A 57,1 c
QPT 35,0 d
FSPT 12,9 d
FS 10,7 d
FTPT: farelo de trigo com pré-tratamento; FT: farelo de trigo sem pré-tratamento; Q: quirela sem
pré-tratamento; AC: arroz cozido; A: arroz sem pré-tratamento; QC: quirela cozida; FSPT: farelo
de soja com pré-tratamento; FS farelo de soja.
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si no nível de 5% de probabili-
dade pelo Teste Scott-Knott.

A partir dos resultados dos experimentos preliminares, optou-se por realizar as FES
posteriores utilizando os substratos sem a realização de pré-tratamento devido às questões
econômicas já mencionadas.
Com relação às misturas a 50%, os substratos que proporcionaram maior produção de
conídios de M. anisopliae foram o farelo de trigo com quirela de arroz (152,5x107 conídios/g)
e o farelo de trigo com arroz cozido (114,5x107 conídios/g), resultados estatisticamente
superiores à produção de conídios utilizando somente arroz cozido (61,3x107 conídios/g). A
produção mais elevada de conídios se deve ao fato de que o farelo de trigo pode ter dado
suporte nutricional à quirela e ao arroz e permitiu a diminuição da formação de aglomerados
do meio, aumentando a superfície de crescimento durante o cultivo (Lonsane et al., 1985).
A produção do fungo M. anisopliae em meio de farelo de trigo e quirela de arroz
sem realização de pré-tratamento constituiria uma alternativa economicamente viável, pois
ambos se tratam de resíduos agroindustriais de baixo custo e, no preparo destes, não foi
realizada a etapa de lavagem no farelo e cozimento na quirela, diminuindo
significativamente os custos da produção do fungo M. anisopliae.

124
 Os substratos que continham farelo de soja e quirela (65x107 conídios/g) ou arroz
cozido (60,7x107 conídios/g) proporcionaram uma menor produção de conídios quando
comparados com as duas primeiras misturas. Penariol (2006) sugere que o farelo de soja
tem carência de algum fator nutricional importante que pode ocasionar deficiência
morfológica ou fisiológica e a consequente baixa produção de conídios.
Os resultados da produção de conídios utilizando as misturas a 33,3%, ou seja, farelo
de soja com farelo de trigo sem pré-tratamentos e arroz cozido (91,6x107 conídios/g ) e
farelo de soja com farelo de trigo e quirela sem pré-tratamentos (90,2x107 conídios/g )
foram estatisticamente superiores à produção de conídios utilizando arroz cozido (75,9x107
conídios/g), confirmando assim, os resultados de Ayala (1996) e Santa et al., (2005) que
afirmam que a produção de esporos é favorecida quando se utiliza uma mistura de
substratos.
Além do aumento da produção de conídios de M. anisopliae utilizando essa
combinação de substratos, o custo de 1 kg da mistura contendo farelo de soja, farelo de trigo
e quirela de arroz a 33,3%, pode ser reduzido em aproximadamente 48% se comparado com
a utilização de 1 kg do meio padrão de arroz (Clicmercado, 2016). Portanto a utilização
destes resíduos agroindustriais em mistura é uma alternativa viável para a produção de M.
anisopliae, tanto do ponto de vista econômico, quanto do crescimento satisfatório dos
conídios do microrganismo, dessa forma, os resultados obtidos neste estudo podem servir
como base para a produção deste fungo em uma escala maior.

CONCLUSÕES
A partir dos experimentos preliminares concluiu-se que a utilização da quirela de
arroz, farelo de soja e farelo de trigo sem a realização de pré-tratamentos proporcionou
um crescimento de conídios igual estatisticamente aos experimentos realizados com pré-
tratamentos.
As fermentações em estado sólido realizadas com a mistura de resíduos
agroindustriais proporcionaram uma maior produção de conídios do fungo M.
anisopliae quando comparadas ao arroz tipo I.

AGRADECIMENTOS
Os autores gostariam de agradecer ao CNPq pelo suporte econômico do projeto
através do processo 448890/2014-3 e ao programa “Novos Pesquisadores UFT 2016”
pela bolsa ao servidor docente.
125
REFERÊNCIAS
ALVES, S.B. and LOPES, R.B., 2008 Controle microbiano de pragas na América Latina: avanços e
desafios. Piracicaba: FEALQ. 414 p.
ALVES, S.B., 1998. Controle microbiano de insetos. 2. ed. Piracicaba: FEALQ. 1163 p.
AYALA, L., 1996. Aproveitamento biotecnológico de batata refugos (Solanum tuberosum) para
produção de conídios do fungo entomopatogênico Beauveria bassiana (Bals) vuill por fermentação
no estado sólido. Curitiba: Universidade Federal do Paraná. Tese de Doutorado.
CLICMERCADO, 2016 [viewed 25 january 2016]. Cotações Encontradas [online]. Porto Alegre.
Available from: http://www.clicmercado.com.br/novo/cotacoes/buscacot.asp
FARIA, M. R de and MAGALHÃES, B. P., 2001. O uso de fungos entomopatogênicos no
Brasil. Biotec. Ciência & Desenv., v. 1, no. 22, p.18-21.
GRAJALES, L. M., 2010. Avaliação de um biorreator rotativo para fermentação em estado sólido.
São José do Rio Preto: Universidade Estadual Paulista. 98f. Dissertação de mestrado em Engenharia
e Ciência de Alimentos.
LACEY, L.A., FRUTOS, R., KAYA, K. H., and VAIL, P., 2001. Insects pathogens as Biological
control agents: Do they have a future? Biol. Control v. 21, p. 230-248.
LEITE, L.G.; BATISTA FILHO, A.; ALMEIDA, J.E.M. and ALVES, S.B., 2003. Produção de
fungos entomopatogênicos. Ribeirão Preto: Livroceres. 92p.
LONSANE, B.K.; GHILDYAL, N.P.; BUDIATMAN, and RAMAKRISHNA, S.V., 1985.
Engineering aspects of solid-state fermentation. Enzyme and Microbial Technology, v.7, n.6, p.258-
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PENARIOL, M.C., 2006. Requisitos nutricionais e produção massal de Bipolaris euphorbiae. 2006.
Jaboticabal: Universidade Estadual Paulista. 49f. Dissertação de Mestrado em Microbiologia
Agropecuária.
SANTA, H. S. D.; SANTA, O. R. D.; BRAND, D.; VANDENBERGH, L. P. de S. and SOCCOL, C.
R., 2005. Spore production of Beauveria bassiana from agro-industrial residues. Braz. arch. biol.
technol. V. 48, n. spe, p. 51-60.
SCHAMNE, P. A., 2010. Efeito de aditivos e fishfertilquitosana® em meios sólidos na produção de
conídios de metarhizium anisopliae (metsch.) sorokin e beauveria bassiana (bals.) vuillemin.
Guarapuava: Universidade Estadual do Centro Oeste. 48 f. Dissertação de Mestrado em Produção
Vegetal.
SENE, L.; ALVES, L.F. A. and LOBRIGATE, M. F. P., 2010. Produção de conídios de
Metarhizium anisopliae em meio sólido à base de resíduos agroindustriais. Arq. Inst. Bio., v. 77,
n. 3, p.449-456.

126
 O potencial da vinhaça no crescimento de fungos do solo
Emerson Delfino Reginaldo1; Margareth Batistote1; Thais Domingues da Silva1*; Maria do Socorro
Mascarenhas Santos1, Edilene Virgulina Cardoso1, Geisa Alves da Silva1, Elvio Mora Junior1

1
Universidade Estadual do Mato Grosso do Sul. *[email protected]
______________________________________________________________________________________________
RESUMO
A vinhaça principal efluente líquido das indústrias sucroenergéticas possui carga
poluidora, apresentando alta concentração de matéria orgânica está sendo utilizada para
a fertirrigação dos canaviais diminuindo custos com fertilizantes. Este estudo teve como
objetivo o isolamento e a caracterização morfológica e a quantificação de fungos
filamentosos do solo na presença e na ausência da vinhaça. O solo foi coletado na área
experimental no município de Glória de Dourados/MS, transportado e armazenado a
temperatura de 4ºC. Dez gramas de solo foram peneirados, triturados e diluído em 90
mL-1 de solução salina NaCl (0.85%) e homogeneizado. Foram realizadas diluições
seriadas e alíquotas de 1,0 mL-1 foram plaqueadas nos respectivos meios de cultura e
incubados por 72 horas na temperatura de 30ºC horas. Após o crescimento foi realizada
a caracterização morfológica dos microrganismos de forma macroscópica bem como a
quantificação através da Unidade Formadora de Colônias (UFC). O resultado mais
expressivo na caracterização morfológica foi apresentado no aspecto cor, sendo
observado para o solo com vinhaça uma diversidade maiores de cores do que no sem
vinhaça. Na quantificação dos fungos na presença da vinhaça que ocorreu o maior
crescimento de fungos, sendo no ponto 3 mais expressivo. A presença de vinhaça
mostrou um maior crescimento dos fungos, o que demonstra que este resíduo
agroindustrial poderá ser uma importante fonte potencializadora para o
desenvolvimento de fungos presentes no solo.
Palavras-chave: Matéria orgânica, resíduo, fungos.
______________________________________________________________________________________________
The potential of vinasse in soil fungus growth

ABSTRACT
The main vinasse liquid effluent from the sugarcane industries has a pollutant load,
presenting high concentration of organic matter is being used for the fertirrigation of
sugarcane plantations, reducing costs with fertilizers. This study aimed at the isolation
and morphological characterization and quantification of filamentous fungi from the soil
in the presence and absence of vinasse. The soil was collected in the experimental area
in the municipality of Glória de Dourados/MS, transported and stored at 4ºC. Ten grams
of soil were sieved, ground and diluted in 90 mL-1 of NaCl (0.85%) and homogenized.
Serial dilutions were performed and 1.0 mL-1 aliquots were plated in the respective
culture media and incubated for 72 hours at 30°C hours. After growth, the
morphological characterization of the microorganisms was performed in a macroscopic
way as well as the quantification through the Colony Forming Unit (CFU). The most
expressive result in the morphological characterization was presented in the color
aspect, being observed for the soil with vinasse a greater diversity of colors than in the
without vinasse. In the quantification of the fungi in the presence of the vinasse that

127
occurred the greatest growth of fungi, being in point 3 more expressive. The presence of
vinasse showed a higher growth of the fungi, which shows that this agroindustrial
residue could be an important potential source for the development of fungi present in
the soil.
Keywords: Organic matter, residue, fungis.
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO

O solo é um dos ambientes no qual se encontra uma enorme diversidade de

microrganismos. Alguns fatores influenciam na quantidade e na variedade desses
organismos e, nas suas atividades no solo, tais como pH, temperatura e clima e possuem
versatilidade para adaptações a mudanças ambientais havendo uma ligação muito
grande entre microrganismos, estrutura e matéria orgânica desse ambiente (MOREIRA
& SIQUEIRA, 2006).

Os microrganismos apresentam um papel fundamental atuando na decomposição

da matéria orgânica, como no ciclo de nutrientes, tais como nitrogênio, fósforo entre
outros. As práticas de manejo aliadas as condições físico-químicas são de suma
importância para uma boa nutrição do solo e uma eficaz atuação dos microrganismos
(DUARTE et al, 2009). Desta forma, a utilização da vinhaça na fertirrigação, desde que
seja feita de forma adequada, respeitando os critérios de armazenamentos, transporte e o
correto manejo da aplicação nos solos agrícolas, corresponde a uma medida técnica e
economicamente viável que traz benefícios ao solo e a obtenção de maior produtividade
em algumas culturas (DAMY et al., 2008).

Com o aumento exponencial da população, a procura por alimentos está cada

vez maior, motivo este que impulsiona a busca por uma otimização tanto da indústria
como da agricultura. Neste sentido, a possibilidade da utilização da vinhaça, subproduto
rico em matéria orgânica, vem sendo amplamente estudada como fonte potencializadora
podendo ser empregada na agricultura de pequeno porte, propiciando o
desenvolvimento microbiano do solo e consequentemente a disponibilidade de matéria
orgânica em constante decomposição no solo promovendo sua nutrição. O estudo visa o
isolamento, caracterização morfológica e a quantificação dos fungos filamentosos
presentes no solo na ausência e na presença da vinhaça.

128
MATERIAL E MÉTODOS

A pesquisa foi desenvolvida durante o período de 2015, na área Experimental da

UEMS, no município de Glória de Dourados/MS. O solo foi coletado, transportado e
armazenado em temperatura de 4ºC. Para o isolamento 10,0 gramas de solo foram
peneiradas, trituradas e diluído em 90 mL-1 de solução salina NaCl (0.85%), e
homogeneizada. Foi realizada a diluição seriada e 1,0 mL-1 das amostras e plaqueadas
em placas de Petri contendo o meio de cultura Ágar batata, e incubados por 72 horas
para o cultivo de fungos. Após o período de incubação foi realizada a caracterização
morfológica das colônias macroscopicamente e a quantificação foi realizada por meio
de contagem, também, macroscópicadas Unidades Formadoras de Colônias (UFC).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na avaliação dos aspectos morfológicos das colônias de fungos filamentoso

isolados do solo com vinhaça, em relação ao aspecto cor ocorreram variações tendo
como predominância as cores branco e bege. Em relação ao aspecto diâmetro ocorreu
variação de 2mm a 5,2mm. Quanto à morfologia: elevação convexa, forma irregular e
aspecto membranoso foi de 100% das colônias de fungos. Já na análise dos aspectos
morfológicos das colônias de fungos filamentoso isolados do solo sem a aplicação da
vinhaça, em relação ao aspecto cor, a que predominou foi a branca, entretanto foram
observadas colônias com outras cores. Em relação ao aspecto diâmetro ocorreu variação
de 3mm a 7mm, na morfologia, borda filamentosa, elevação convexa, forma irregular e
aspecto membranoso apresentaram um percentual de 100% das colônias analisadas
(Tabela 1).

Estudos realizados por Guimarães (2009), em relação a caracterização das

morfo-espécies dos fungos obtidos dos sistemas de tratamento de rejeitos da indústria
petroquímica, observaramcores distintas como amarelo, branco, bege, verde, cinza e
rosa.

129
TABELA 1. Caracterização morfológica dos fungos isolados do solo e cultivados em
meio Ágar Batata na presença e ausência da vinhaça.
Amostras Cor Borda Elevação Forma Aspecto Diâmetro
Branco/Marrom/Bege/Amarelo/ Filamentosa Membranoso/ 0,2 a
C/V Convexa Irregular
Verde/ Laranja/ Preto /Cinza /Lisa Viscoso 4,1mm*
Filamentosa/ 0,3 a 5,2
Branco/Marrom/ Convexa Irregular Membranoso
S/V Rugosa mm*
Amarela/Bege /Rosa /Verde
*Valores apresentados foram obtidos a partir de média simples.
A quantificação dos fungos filamentosos isolados do solo na presença e ausência
da vinhaça, pode-se observar que em todos os pontos analisados com aplicação da
vinhaça ocorreu maior crescimento das colônias de fungos em relação aos pontos
amostrais sem vinhaça, podemos observar que o ponto 3ocorreuuma maior quantidade
de Unidades Formadoras de Colônias (UFC g-1 de solo) fungos na presença e na
ausência de vinhaça (Figura 1). A vinhaça por possuir uma elevada carga de matéria
orgânica talvez tenha proporcionada uma carga de nutrientes necessários para maior
desenvolvimento da microbiota de fungos do solo.
Estudos realizado por Santos et al. (2009) avaliaram os efeitos da irrigação com
vinhaça sobre a população de micro-organismos do solo, e concluíram que com a adição
de vinhaça, após 60 dias de incubação, ocorreu o crescimento da população de fungos
filamentosos do solo
A vinhaça, quando aplicada, promove acidificação imediata do solo,
favorecendo o desenvolvimento de fungos que são os microrganismos responsáveis pelo
início do processo de decomposição (OLIVEIRA et al., 2011), uma vez que a matéria
orgânica contida na vinhaça é incorporada ao solo e colonizada por fungos, os quais a
transformam em húmus, neutralizando a acidez do meio, favorecendo a proliferação de
outros microrganismos (GIACHINI; FERRAZ, 2009).Desta forma sua utilização como
fonte de adubação pode se tornar viável, pois estes microrganismos são importantes na
atuação das reações químicas do solo.

130
Figura 1 – Quantificação das unidades formadoras de colônias (UFC g-1 de solo) de
fungos.

CONCLUSÕES
Os fungos apresentaram uma diversidade quanto ao aspecto cor, no entanto na
presença da vinhaça a diversidade foi maior.
A quantificação mostrou que houve um crescimento maior de fungos
filamentososno solo com presença de vinhaça, o que demonstra que este resíduo
agroindustrial poderá ser uma importante fonte potencializadora para o
desenvolvimento da microbiota do solo.

REFERÊNCIAS

DAMY, C. R. S.; LUZ, P. H. C.; VIZZOTTO, B. A. Manejo do uso da vinhaça no solo

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Básicas de Saúde (ICBS), Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Porto
Alegre- RG, 2009.

GIACHINI , C, F.; FERRAZ , M. V. Benefícios da utilização de vinhaça em terras de

plantio de cana -de-açúcar - revisão de literatura . Revista Científica Eletrônica de
Agronomia, Ano VII, www.revista.inf.br Nº 15, 2009.

131
GUIMARÃES, M. S de O. Coleta, isolamento e identificação de fungos presentes em
sistemas de tratamento de efluentes de indústria petroquímica para utilização em
processos degradação de hidrocarboneto aromático. Dissertação (Mestrado), MG, 2009.

MOREIRA, F.; SIQUEIRA, J. O. Microbiologia e Bioquímica do solo. Editora UFLA,

p. 623, 2002.

OLIVEIRA, E. M. L.; FENANDES, P. D.; OLIVEIRA, D. C de. S.; FREIRE, E de. A.

Possibilidades tecnológicas para a destinação da vinhaça: uma revisão. Revista Trópica
– Ciências Agrárias e Biológicas v. 5, N. 3, p.16, 2011.

SANTOS, T. M. C dos.; SANTOS, M. A. L dos.; SANTOS, C. G dos.; SANTOS, V. R

dos.; PACHECO, D. S. Efeito da fertirrigação com vinhaça nos microrganismos do
solo. Revista Caatinga, Mossoró, RN. v.22. p.155-160, 2009.

132
 Atividade celulolítica de fungos filamentosos isolados do
intestino de insetos aquáticos
Enide Luciana L. Belmont1*; Lorena Nacif-Marçal1; Neusa Hamada2; Carlos Gustavo Nunes-Silva3

1
Programa Multi-Institucional de Pós-Graduação em Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas -
UFAM. *e-mail: [email protected]
2
Coordenação de Biodiversidade, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA.
3
Instituto de Ciências Biológicas – ICB, Universidade Federal do Amazonas – UFAM.
______________________________________________________________________________________________

RESUMO

Fungos filamentosos tem despertado o interesse para bioprospecção por serem bons
produtores de enzimas extracelulares e com grande potencial de utilização na
bioindústria por apresentarem crescimento rápido e facilidade nas condições de cultivo.
Setenta fungos filamentosos isolados do intestino de larvas de Phylloicus (Insecta:
Trichoptera: Calamoceratidae) foram analisados para avaliar seu potencial quanto a
produção de celulases em resposta à presença de celulose como única fonte de carbono.
Foram realizados inóculos no centro das placas e armazenadas por 4 dias a 28 °C e
submetidos a choque térmico em estufa a 50 °C por 16 horas. As placas foram coradas
com solução de vermelho congo e lavadas com solução de NaCl para melhor
visualização do halo de hidrólise. Como resultado positivo para celulase 80% dos
fungos formaram halo de degradação e 8,5% foram considerados com potencial para
aplicação em biotecnologia.

Palavras-chave: Celulase; Hidrólise; Reserva Florestal Ducke; Trichoptera.

______________________________________________________________________________________________

Cellulolytic activity of filamentous fungi isolated from the intestine of aquatic

insects

ABSTRACT
Filamentous fungi have been of interest for bioprospecting due to being good
extracellular enzyme producers and great potential for use in bioindustry, demonstrate
rapid growth, ease in culture conditions. Seventy filamentous fungi isolated from gut of
Phylloicus (Insecta: Trichoptera: Calamoceratidae) were analysed concerning their
potential to production cellulolytic enzymes in response to cellulose presence as only
carbon source. Inocula were performed in the center of plates, stored for 4 days at 28 °C
and subjected afterwards to thermal shock at 50 °C for 16 hours. Plates were stained
with Congo red solution and washed with a NaCl solution for better detection of the
hydrolysis halo. As a positive result for cellulase 80% of fungi formed a halo of
degradation and 8.5% were considered with potential for application in biotechnology.

Keywords: Cellulase; Hydrolysis; Ducke Forest Reserve; Trichoptera.

______________________________________________________________________________________________

133
INTRODUÇÃO

A transformação de celulose em glicose como fonte de energia é altamente

eficiente quando realizada por insetos (cupins, besouros e insetos aquáticos), pois sua
principal fonte de alimentação é matéria vegetal (Sun e Zhou, 2009). Insetos aquáticos
fragmentadores, geralmente, se alimentam de tecido de plantas aquáticas vivas, madeira
e folhas em decomposição que se acumulam ao longo do curso d’água (Cummins et al.,
1989; Merritt e Cummins, 1996). Os fragmentadores exercem relevante papel em
ecossistemas aquáticos uma vez que convertem matéria orgânica grossa em partículas
menores, tornando-a disponível para outros grupos tróficos, tais como os invertebrados
coletores (Cummins et al., 1989). De acordo com Sinsabaugh (1985), as enzimas
utilizadas nos processos digestivos de insetos aquáticos, como Trichoptera e Plecoptera
são originárias de fungos associados. O trato intestinal dos insetos abriga uma ampla
variedade de microrganismos, uma vez no intestino, estes podem crescer e serem lisados
por enzimas ou excretados (Walker et al., 1999).

Os fungos filamentosos tem despertado o interesse para bioprospecção por

apresentarem crescimento rápido, facilidade nas condições de cultivo, por serem bons
produtores de enzimas extracelulares com grande potencial de utilização na indústria
(Simões & Tauk-Tornisielo, 2005). Estudos sobre a associação entre fungos e insetos
aquáticos tem contribuído sobre a biodiversidade fúngica e os mecanismos das
interações mutualísticas que ocorrem entre esse grupo e os insetos. Na Amazônia estes
estudos são ainda escassos frente a grande diversidade dos insetos neste bioma (e.g.
Rios-Velasquez et al., 2002, Alencar et al., 2003) devido ao pouco esforço amostral. No
entanto, estes estudos contribuem com o conhecimento sobre a biodiversidade fúngica,
fornecendo subsídios para compreensão de mecanismos de interações mutualísticas.

Assim, o objetivo deste estudo foi isolar e selecionar fungos filamentosos de

associados ao trato digestivo de insetos aquáticos visando à obtenção de linhagens
promissoras para produção de enzimas celulolíticas.

MATERIAL E MÉTODOS
Coleta dos insetos
A coleta foi realizada em igarapés da Reserva Florestal Ducke (RFD), localizada
na Rodovia Estadual AM-010, km-26, Manaus, AM (02°56’21” N, 59°57’43” O).

134
Foram coletados 30 larvas do gênero Phylloicus, estas foram mergulhadas com auxílio
de pinça em microtubo com 1 mL de álcool 70% por 30 segundos para desinfecção das
superfícies externas. Em seguida, foram retirados e transferidos para microtubo
contendo 1 mL de água destilada estéril, onde foram armazenados e transportados em
isopor com gelo até a realização dos procedimentos laboratoriais.
Obtençãos dos isolados fúngicos
As larvas de Phylloicus foram dissecadas em laboratório com auxílio de pinças
estéreis sendo os aparelhos digestórios retirados e transferidos para microtubos
contendo 1 mL de água destilada estéril foram homogeneizadas. Uma alíquota 100
microlitros de cada amostra foram espalhados por meio da técnica de spread-plate em
placas de Petri, em triplicata, contendo meio BDA (Batata Dextrose Ágar) e 0,1mg/L de
antibiótico cloranfenicol. Um total de 90 placas de Petri foram incubadas em estufa a
27 ºC por 7 dias. Transcorrido o tempo de incubação das placas, realizou-se a contagem
dos fungos crescidos e o isolamento dos mesmos por meio do subcultivo de cada um
dos isolados em placas novas de BDA.
Produção de celulases
A produção de enzimas celulases da classe endoglucanases foi avaliada a partir
do crescimento dos isolados fúngicos em meio sintético com carboximetilcelulose
(CMC) (NaNO3: 3,0 g.L-1; K2HPO4: 1,0 g.L-1; MgSO4: 0,5 g.L-1; KCl: 0,5 g.L-1;
FeSO4.7H2O: 10,0 mg.L-1; CMC: 10,0 g.L-1; ágar: 20,0 g.L-1) como única fonte de
carbono (Ruegger e Tauk-Tornisielo, 2004). As placas foram incubadas por 4 dias a 28
ºC e em seguida submetidas a choque térmico de 50 ºC em estufa por 16 horas. A
atividade enzimática foi verificada pela formação de halos de degradação do polímero,
os quais foram revelados a partir da incubação das placas em 10 mL de solução corante
de vermelho congo (2,5 g.L-1) em tampão Tris HCl 0,1 M, pH 8,0. Após 30 min a
solução foi descartada e as culturas foram lavadas com 5 mL de solução de NaCl 0,5 M
neste mesmo tampão (Nogueira e Cavalcanti 1996). Os ensaios foram realizados em
triplicatas.
Os diâmetros das colônias e dos halos produzidos foram medidos com auxílio de
um paquímetro (mm). A atividade enzimática foi expressa em índice enzimático (IE)
mediante a relação do diâmetro médio do halo de degradação e o diâmetro médio da
colônia (IE= dh/dc) (Nogueira e Cavalcante, 1996). As linhagens que apresentaram halo
de hidrólise foram consideradas como positivas para a presença de enzimas celulases e
as que alcançaram IE acima de 2,0 como potenciais linhagens para a aplicação

135
biotecnológica.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Todas as 90 placas obtidas das amostras dos intestinos foram analisadas quanto
ao crescimento fúngico e contabilizadas quanto ao número total de UFCs (Unidade
Formadora de Colônia). Um total de 2,95x10³ UFC/individuo foram estimados e 120
colônias foram isoladas. Para observação das estruturas reprodutivas realizou-se
microcultivo dos fungos isolados (Figura 1).

A1 A2

B1 B2

Figura 1. Colônias isoladas de intestino de Phylloicus. A1 e B1- Colônias puras;

A2 e B2 – Estruturas reprodutivas.

A tabela 1 apresenta os resultados obtidos após o cultivo dos fungos em meio

sintético contendo carboximetilcelulose (CMC) como única fonte de carbono. Dos 120
isolados, 70 foram avaliados nesse estudo, sendo o restante ainda em processo de
análise. O halo indicador da degradação da CMC, foi observada em 56 colônias, ou seja,
80% dos fungos estudados. Dentre estas 8,5% foram consideradas com potencial
biotecnológico por apresentarem um IE igual ou maior que 2,0.
Tabela 1. Atividade celulolítica dos fungos isolados de larvas de Phylloicus.
(Negativo = não houve formação de halo; Positivo = presença de halo de hidrólise).
Índice enzimático (máx -
Teste Celulase mín)
Negativo 8 -
Positivo 56 1,8 - 1,0
Positivo com potencial biotecnológico 6 2,9 - 2,0
Total 70 -

136
 Milano (2003) estudando larvas de Coleoptera (Insecta), observou que apenas
um dos isolados do intestino destas larvas apresentou atividade celulolítica com IE de
1,6. Estudos em busca por fungos produtores de celulases isolados de material em
decomposição em riachos demonstraram ter grande potencial, onde de 100 linhagens
testadas 69% apresentaram atividade celulolítica e 19% tiveram IE maior que 2,0 (Silva
et al., 2013). Diferentemente do presente estudo, onde 88,5% dos fungos analisados
formaram halo indicador de degradação de celulose com um IE máximo de 2,9. Esses
dados mostram que insetos podem ser mais uma fonte de busca para possíveis novas
celulases.

CONCLUSÕES
Os resultados preliminares obtidos nesse estudo demonstraram que há grande
potencial na produção de enzimas degradadoras de celulose por fungos associados ao
intestino de insetos aquáticos fragmentadores. No entanto, poucos estudos são
realizados buscando prospectar enzimas dessas fontes, sendo na literatura encontrado
uma maior procura em material vegetal.
A bioindústria tem grande interesse na procura por enzimas para biocatálise,
uma vez que reações mediadas por enzimas são alternativas eficazes a métodos
químicos, os quais geralmente são poluentes.
Dessa foram, pode-se destacar a importância da realização de mais estudos para
um maior conhecimento sobre a biodiversidade, funções exercidas por estes
microrganismos, bem como a busca por novas fontes de celulases.

AGRADECIMENTO
A Rede Bionorte-CNPq nº407843/2013-2 pelo financiamento do projeto de
pesquisa.

REFERÊNCIAS

ALENCAR, Y.B., RIOS-VELÁSQUEZ, C.M., LICHTWARDT, R.W.; HAMADA, N.,

2003. Trichomycetes (Zygomycota) in the digestive tract of artropods in Amazonas,
Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, vol. 98, pp. 799–810.
CUMMINS, K.W.; WILZBACH, M. A.; CATES, D.M.; PERRY, J. B.;
TALIAFERRO, W.B. 1989. Shredders and riparian vegetation. Leaf litter that falls into

137
streams influences communities of stream invertebrates. BioScience, vol. 39, pp. 24–30.
MERRITT, R.W.; CUMMINS, K.W., 1996. An introduction to the Aquatic Insects of
North America. 3rd Edition. Kendall/Hunt Publishing Company. xiii +. 862 p.
NOGUEIRA, E.B.S. e CAVALCANTI, M.A.Q., 1996. Cellulolytic fungi isolated from
processed oats. Revista de Microbiologia, vol. 27, pp. 7–9.
RIOS-VELÁSQUEZ, C.M.; HAMADA, N., 2002. Trichomycete fungi (Zygomycota)
associated with the digestive tract of Simulium goeldii Cerqueira & Nunes de Mello and
Simulium ulyssesi (Py-Daniel & Coscarón) (Diptera: Simuliidae) larvae, in Central
Amazônia, Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, vol. 97, no. 3, pp. 423–426.
SILVA, J.B.A.; FRANTZ, S.C.; MARQUES, A.K.; COELHO, C.M.; MORAIS, P.B.,
2015. Produção de enzimas extracelulares por fungos associados à decomposição de
materiais vegetais em riachos. Journal of bioenergy and food science, vol. 2, pp. 208–
212.
SIMÕES, M.L.G. e TAUK-TORNISIELO, S.M., 2005. Comparação da técnica
tradicional e do método turbidimétrico automatizado no cultivo em diferentes fontes de
carbono de fungos filamentosos isolados de solo de área de Caatinga. Holos
Environment, vol. 5, no. 2, pp. 94–103.
SINSABAUGH, R.L.; LINKINS, A.E.; BENFIELD, E.F., 1985. Cellulose digestion
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biofuels: an emerging and promising area of entomological science. Recent Advances in
Entomological Research, pp. 251–291.
WALKER, A.J., GLEN, D.M., SHEWRY, P.R., 1999. Bacteria associated with the
digestive system of the slug Deroceras reticulatum are not required for protein
digestion. Soil Biology and Biochemistry, vol. 31, pp. 1387–1394.

138
 Produção de pectina esterase e poligalacturonase por
Aspergillus sp.
Estefânia Carneiro Teles1; Danilo Vieira Carrijo1; Alex Fernando de Almeida1*;

1
Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, Universidade Federal do Tocantins.
Campus Universitário de Gurupi. *e-mail ([email protected])
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
O objetivo deste trabalho foi selecionar um meio de cultivo, utilizando resíduos
agroindustriais como fonte de carbono para a produção de pectinases por Aspergillus sp.
em condições submersas. Inicialmente, cinco meios de cultura propostos pela literatura
foram suplementados com 1% (m/v) pectina cítrica. Os maiores resultados foram
observados com meio Vogel para a produção de pectina esterase e poligalacturonase. A
utilização de resíduos agroindustriais como fonte de carbono foi avaliada em 72 e 120
horas de cultivo, a 28 oC, 180 rpm. Os maiores valores de atividade enzimática foram
observados após 120 horas, com bagaço de abacaxi como fonte de carbono, obtendo-se
1,90 U/mL e 2,50 U/mL de pectina esterase e poligalacturonase, respectivamente. A
linhagem de Aspergillus sp., isolada de jatobá-do-cerrado, apresentou potencial para a
produção de pectina esterase e poligalacturonase. As condições de cultivo, assim como
a composição dos meios de cultivo devem ser otimizadas visando aumentar a produção
de enzimas pectinolíticas.
Palavras-chave: Pectinase. Pectina cítrica. Meio Vogel.
______________________________________________________________________________________________

Production of pectin esterase and poligalacturonase by

aspergillus sp.

ABSTRACT
The aim of this work was to select a culture medium, using agroindustrial residues as
carbon source for pectinases production by Aspergillus sp. in submerged conditions.
Initially, five culture media proposed in the literature were supplemented with 1% (m/v)
citrus pectin. The highest values were observed with Vogel medium for pectin esterase
and polygalacturonase production. The use of agroindustrial residues as carbon source
was evaluated at 72 and 120 hours of cultivation, at 28 oC, 180 rpm. The highest values
of enzymatic activity were observed after 120 hours, with pineapple bagasse as carbon
source, obtaining 1.90 U/mL and 2.50 U/mL of pectin esterase and polygalacturonase,
respectively. The Aspergillus sp. strain isolated from jatobá-do-cerrado showed
potential for the production of pectin esterase and polygalacturonase. The culture
conditions as well as the composition of the culture media should be optimized in order
to increase the production of pectinolytic enzymes.
Keywords: Pectinase. Citrus pectin. Medium Vogel.

139
INTRODUÇÃO
A pectina é capaz de formar géis em soluções e é amplamente utilizada na
indústria de alimentos. Pode ser extraída através de diversas matérias primas, como
casca de frutas cítricas (Menezes et al., 2015). As enzimas pectinolíticas são produzidas
em diferentes combinações pelas plantas e por microrganismos como fungos, leveduras
e bactérias. As pectinases são amplamente utilizadas em indústrias alimentícias, como
na clarificação de sucos de frutas, melhorando a eficiência de filtração, no tratamento
preliminar da uva em indústrias vinícolas, na maceração, liquefação e extração de
tecidos vegetais, na fermentação de chá, café e cacau para melhorar a extração de óleos
vegetais, na extração de polpa de tomate e no tratamento e degomagem de fibras
naturais para as indústrias têxteis e de papel (Duchiron and Suneetha, 2011). O objetivo
deste trabalho foi avaliar a produção de enzimas pectinolíticas por uma linhagem de
Aspergillus sp. isolada de frutos de jatobá-do-cerrado, bem como utilizar fontes de
carbono de origem vegetal em condições submersas.

MATERIAL E MÉTODOS

Microrganismo e inóculo
A linhagem de Aspergillus sp. JT 102 foi isolada a partir de frutos do jatobá-do-cerrado.
A cepa é mantida em placas de Petri e tubos inclinados, contendo meio BDA 2% (batata
dextrose ágar), sob refrigeração a 4 oC, no LABAP - Laboratório de Biotecnologia de
Alimentos e Purificação de Produtos, Habite – Incubadora de Empresas de
Biotecnologia da UFT, campus universitário de Gurupi, da Universidade Federal do
Tocantins.
O inóculo foi preparado após o crescimento da linhagem em tubos de cultura
contendo BDA inclinado. Os conídios foram suspensos em solução salina 0,8% (m/v)
esterilizada. A contagem de células foi realizada em câmara de Neubauer para obter
uma concentração de 107 conídios/mL. Utilizou-se 1 mL dessa suspensão para inocular
os meios de cultura líquidos.

Seleção do meio de cultivo

Os cultivos foram preparados em frascos Erlenmeyer de 125 mL contendo 20 mL dos
meios de cultura. Foram avaliados 5 meios de cultivo: meio A (g/L): 5,5 de K2HPO4; 15

140
de KHPO4; 0,5 de MgSO4.7H2O; 0,2% Extrato de levedura; Meio B (g/L): MgSO4•H2O
0,14; K2HPO4 0,5; com substituição de CaCO3 5,0 por CaCl2•2H2O 7,2; 0,2% Extrato
de levedura; Meio C (g/L): NaH2PO4 12,0; KH2PO4 2,0; CaCl2•2H2O 0,03;
ZnSO4•7H2O 0,03; FeSO4•7H2O 0,005; 0,2% Extrato de levedura, Meio D (g/L):
NaH2PO4 12,0; KH2PO4 2,0; MgSO4•H2O 0,168; CaCl2 •2H2O 0,331; 0,2% Extrato de
levedura; Meio E (g/L): Solução salina de Vogel, 0,2% 2xtrato de levedura. Os meios
de cultivos foram suplementados com 1,0 % (m.v-1) de pectina cítrica e o pH ajustado a
6,0. Os meios foram esterilizados em autoclave durante 15 minutos a 121 ºC, inoculados
e mantidos na incubadora shaker a 28 ºC, 180 rpm durante 120 horas. Os cultivos foram
realizados em triplicata.

Seleção da fonte de carbono

Após a etapa de seleção do meio de cultivo foram testados 12 resíduos
agroindustriais como fonte de carbono: bagaço de abacaxi, farinha de batata doce, farelo
de trigo, casca de mandioca, casca de soja, farinha de bacaba, sabugo de milho, palha de
milho, bagaço da cana de açúcar, bagaço de laranja, casca de maracujá e casca de
banana. O meio de cultivo foi preparado e distribuído em frascos Erlenmeyers de 125
mL, cada um contendo 20 mL de meio e foram suplementados com 1,0 % (m.v-1) da
fonte de carbono. Foram realizados dois cultivos, nos tempos 72 e 120 horas. Os meios
foram esterilizados em autoclave a 121 ºC durante 15 minutos, inoculados e mantidos
na incubadora shaker a 28 ºC em 180 rpm. Os cultivos foram realizados em duplicata.

Obtenção dos extratos proteicos e biomassas

Os caldos fermentados foram filtrados utilizando bomba a vácuo para separação
dos extratos enzimáticos e biomassas. Os extratos obtidos foram armazenados a -4 ºC,
para posterior análise da atividade enzimática. As biomassas retidas no papel filtro
foram secas até peso constante em estufa com circulação de ar a 60 ºC. O valor da
biomassa seca foi utilizado para verificar a concentração de biomassa produzida em
cada cultivo (g.L-1).

141
RESULTADOS E DISCUSSÃO

Seleção do meio de cultura

O fungo Aspergillus sp. JT102 foi cultivado em diferentes meios de cultura para
verificar a produção de pectina esterase (PE) e poligalacturonase (PG). A maior
produção de pectina esterase (2,330 U/mL) e poligalacturonase (1,793 U/mL) foi obtida
utilizando o meio E (VOGEL, 1956). O meio de Vogel é composto por ácido cítrico,
ZnSO4, Fe(NH4)2(SO4)2, CuSO4, MnSO4, H3BO3, NaMoO4, Na3C6H5O7, KH2PO4,
NH4NO3, MgSO4, CaCl2, biotina. O meio de Vogel tem sido utilizado por diversos
autores para a produção de diversas enzimas como celulases, xilanase, lipases (KNOB
et al., 2013; ALMEIDA et al., 2013).

Tabela 1. Produção de pectina esterase e poligalacturonase utilizando diferentes meios

de cultivo submersos.
Biomassa Atividade Atividade
Meios de (g/L) PE PG
cultivo (U/mL) (U/ml)
A 12,175 0,337 0,125
B 13,732 0,064 0,122
C 10,077 0,118 0,049
D 14,697 0,085 0,146
E 8,434 2,330 1,793

A escolha da composição de sais para o crescimento microbiano e produção de

enzimas é um passo importante para a otimização de um processo fermentativo uma vez
que cada microrganismos apresenta exigências nutricionais distintas.

Seleção da fonte de carbono

As fontes de carbono que induziram a maior produção de enzimas PE e PG,
respectivamente, foram: bagaço de abacaxi (1,90 U/mL e 2,49 U/mL) e palha de milho
(1,36 U/mL e 1,53 U/mL) após 120 horas de cultivo. A produção de biomassa nos
cultivos pode estar relacionada com a produção de outras enzimas no meio de cultura
como celulases, xilanase que favorecem a liberação de monômeros de açúcar para o
crescimento microbiano.

142
 Tabela 2. Produção de pectina esterase e poligalacturonase diferentes biomassas como fontes
de carbono.
72 horas 120 horas
Fonte de carbono Biomassa PE PG Biomassa PE PG
(g/L) (U/mL) (U/mL) (g/L) (U/mL) (U/mL)
Bagaço de abacaxi 14,95 0,65 0,02 12,37 1,90 2,49
Farinha de batata doce 14,09 ND ND 13,77 0,41 0,18
Farelo de trigo 17,57 ND ND 13,76 0,49 0,18
Casca de mandioca 19,02 ND ND 13,55 0,42 0,01
Casca de soja 18,77 0,32 0,01 17,47 0,35 0,38
Farinha de bacaba 20,63 ND ND 17,20 0,47 0,21
Sabugo de milho 14,33 0,63 0,01 13,89 0,60 0,45
Palha de milho 16,88 ND ND 13,31 1,36 1,53
Bagaço cana de açúcar 19,58 0,70 0,02 18,96 0,46 0,407
Bagaço de laranja 14,40 0,61 ND 13,51 0,21 0,22
Casca de maracujá 11,16 0,28 0,02 14,08 0,48 0,54
Casca de banana 10,93 ND ND 11,58 0,72 0,43
Nota: PE – pectina esterase; PG – poligalacturonase; ND – não dectado.

Ezugwu et al. (2014) relatam a produção de pectinases por Aspergillus niger

utilizando cascas de abacaxi e laranja e a produção de pectinases por Aspergillus
fumigatus utilizando cascas de manga em fermentação submersa.

CONCLUSÕES
Conclui-se que o meio Vogel é eficiente na produção de pectinases por Aspergillus
sp. Nos cultivos utilizando resíduos agroindustriais como fonte de carbono, verificou-se
que o cultivo de 120 horas obteve maior produção de pectina esterase e
poligalacturonase, utilizando o bagaço de abacaxi como fonte de carbono. A produção
de pectinases utilizando fontes renováveis da agroindústria pode ser uma alternativa
viável para a produção de enzimas em condições submersas.

143
REFERÊNCIAS
ALMEIDA, A.F., TAUK-TORNISIELO, S.M.; CARMONA, E.C., 2013. Acid lipase
from Candida viswanathii: production, biochemical properties, and potential
application. BioMed Research International, 2013.EZUGWU, A. L.; EZIKE, T. C.;
IBEAWUCHI , A. N..; NSUDE, C. A.;
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Comparative studies on pectinases obtained from Aspergillus fumigatus and Aspergillus
niger in submerged fermentation system using pectin extracted from mango, orange and
pineapple peels as carbon sources. Nigerian Journal of Biotechnology, v. 28, n. 1, p. 26-
34, 2014.
KNOB, A., et al. Production , purification , and characterization of a major Penicillium
glabrum xylanase using brewer ’s spent grain as substrate . BioMed Research
International, 8 p., 2013.

VOGEL, H. J. A convenient growth medium for Neurospora crassa (medium N).

Microbiology Genetic Bulletin, v. 13, p. 42–43, 1956.

144
 Obtenção de biossólido de lodo de esgoto anaeróbio por
biolixiviação bacteriana
Franciele Pereira Camargo1; Paulo Sérgio Tonello2; André Cordeiro Alves dos Santos1; Iolanda Cristina
Silveira Duarte1*

1
Universidade Federal de São Carlos campus Sorocaba. *e-mail: [email protected]
2
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” campus Sorocaba.
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Uma das alternativas à disposição dos lodos de esgoto em aterros sanitários é sua
aplicação como fertilizantes, entretanto a presença de metais tóxicos pode restringir esta
destinação. A biolixiviação é uma tecnologia promissora, uma vez que é um processo
economicamente e ambientalmente vantajoso. A presente pesquisa teve como objetivo
avaliar a possibilidade de obtenção de biossólido por meio do tratamento de lodo de
esgoto anaeróbio pela técnica de biolixiviação. Para tanto, avaliou-se a influência da
coinoculação de duas espécies de bactérias acidófilas do gênero Acidithiobacillus: A.
ferrooxidans e A. thiooxidans na solubilização de Cd, Cr, Cu, Ni, Pb e Zn neste
material. Os metais foram determinados antes e após os ensaios de biolixiviação por
Espectrometria de Emissão Óptica com Plasma Acoplado Indutivamente (ICP-OES) e o
conteúdo de fósforo e nitrogênio foi determinado por espectrometria óptica e pelo
método de Kjeldahl, respectivamente. Os resultados de solubilização dos metais após 10
dias de incubação a 28°C foram 70,3% de zinco, 53,1% de níquel, 37,4% de cobre,
17,9% de cádmio, 12,6% de cromo e 8,1% de chumbo. Notou-se que o processo de
biolixiviação reduziu a concentração de nitrogênio em 22,8% e de fósforo em 1,2%.
Conclui-se que as características finais do lodo de esgoto anaeróbio obtido após o
tratamento indicam que este material possui potencial para ser utilizado como
fertilizante em solos agrícolas, uma vez que atende as normas exigidas no Estado de São
Paulo (Norma Técnica vigente P4.230) e também em países da Comunidade Europeia,
Canadá e Estados Unidos.

Palavras-chave: Metal pesado. Metal tóxico. Solubilização de metal. Tratamento de

águas residuárias. Biorremediação.
______________________________________________________________________________________________

Biosolid obtainment from anaerobic sewage sludge through bacterial bioleaching

ABSTRACT
One of the alternatives to the disposal of sewage sludge in landfills is its application as
fertilizer, though the presence of toxic metals can restrict this allocation. Bioleaching is
a promising technology, since it is an economically and environmentally advantageous
process. This research aimed to evaluate the possibility of obtaining biosolids through
the treatment of anaerobic sewage sludge by the bioleaching technique. The influence of
the coinoculation of two acidophilus bacteria of the Acidithiobacillus genus: A.
ferrooxidans and A. thiooxidans in the solubilization of Cd, Cr, Cu, Ni, Pb and Zn in
this material was evaluated. The metals determined in the sludge before and after the
bioleaching tests through Inductively Coupled Plasma - Optic Emission Spectrometry
(ICP-OES) and the phosphorus and nitrogen content was determined by optical
145
spectrometry and the Kjeldahl method, respectively. After 10 days of incubation at
28°C, were solubilized 70.3% of zinc, 53.1% of nickel, 37.4% of copper, 17.9% of
cadmium, 12.6% chromium and 8.1 % lead. It was observed that the bioleaching
process reduced the nitrogen concentration by 22.8% and phosphorus by 1.2%. Based
on the results obtained, it is concluded that the final characteristics of the anaerobic
sewage sludge obtained after the treatment indicate that this material has potential to be
used as fertilizer in agricultural soils, since it meets the standards required in the State
of São Paulo (Technical Standard in force P4.230) and also in countries of the European
Community, Canada and the United States.

Keywords: Heavy metal. Toxic metal. Metal solubilization. Wastewater treatment.

Bioremediation.
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Os sistemas de tratamento de esgoto têm como objetivo a minimização dos
impactos ambientais causados pelo seu despejo no ambiente, mas este mesmo processo,
por consequência, também pode gerar resíduos secundários, que devem ser dispostos
adequadamente (DU et al., 2015).
Devido às elevadas concentrações de nutrientes, o uso de lodo de esgoto em
campos de cultivo é uma alternativa viável, podendo substituir a adubação química, no
entanto, a presença de metais é o principal limitante dessa destinação (PATHAK;
DASTIDAR; SREEKRISHNAN, 2009). Para que o produto final obtido possa ser
aplicado como fertilizantes em solos agrícolas, como biossólido, além de matéria
orgânica e nutrientes ele deve conter uma baixa concentração de contaminantes, como
metais tóxicos, considerando as concentrações máximas de metais tóxicos permitidas,
as concentrações máximas de metais em solos agrícolas e também as cargas cumulativas
máximas de metais em solos pela aplicação de biossólidos (TSUTIYA, 2015).
No Estado de São Paulo, os limites máximos de metais permitidos nos
biossólidos foram baseados nos limites máximos permitidos nos Estados Unidos e
definidos na Norma P4.230 (CETESB, 1999), sendo esta baseada em análises de risco,
enquanto que a definição das normas da Comunidade Europeia e do Canadá, por
exemplo, utilizaram o conceito de não degradação do solo e do ambiente.
A biolixiviação é o processo que utiliza o efeito catalítico produzido pela
atividade metabólica dos micro-organismos oxidantes de ferro ou enxofre (PATHAK;
DASTIDAR; SREEKRISHNAN, 2009). A técnica de biolixiviação tem sido estudada
para remoção de metais em lodo de esgoto, sedimentos dragados de rios e solos, não
comprometendo suas propriedades como condicionante de solo e fertilizante (FANG et
al., 2011). Essa técnica tem se mostrado promissora devido a sua simplicidade em

146
relação às demais técnicas de tratamento de resíduos atualmente utilizadas, como alguns
métodos físicos (submissão a temperaturas elevadas, eletrorremediação, entre outros) e
químicos (adição de ácidos, substâncias iônicas e quelantes) e também é
economicamente mais viável (CAMARGO et al., 2016; PATHAK; DASTIDAR;
SREEKRISHNAN, 2009) que técnicas químicas tradicionais. A presente pesquisa teve
como principal objetivo avaliar a possibilidade de obtenção de biossólido por meio do
tratamento de lodo de esgoto anaeróbio pela técnica de biolixiviação.

MATERIAL E MÉTODOS
A amostra de lodo de esgoto anaeróbio foi coletada diretamente do reator
anaeróbio de manta de lodo e fluxo ascendente (UASB) em uma estação de tratamento
de esgoto do município de Porto Feliz-SP. As concentrações de nitrogênio total e de
fósforo total foram determinadas em triplicata de acordo com os métodos 4500-Norg e
4500B, respectivamente (APHA, 2005).
A determinação dos metais cádmio (Cd), cromo (Cr), cobre (Cu), níquel (Ni),
chumbo (Pb) e zinco (Zn) foi realizada em Espectrômetro de Emissão Óptica com
Plasma Acoplado Indutivamente (ICP-OES) após a digestão das amostras sólidas por
meio do método 3050B (EPA, 1996) e líquidas pelo método 3030E (APHA, 2005).
Os experimentos foram realizados em frascos de vidro contendo 445 mL de lodo
de esgoto autoclavado. No ensaio controle (EC) utilizou-se apenas lodo de esgoto
autoclavado e 2 g.L-1 de Fe2+ (como FeSO4.7H2O) e 2 g.L-1 enxofre elementar (S0) e no
ensaio de biolixiviação (EB) utilizou-se lodo de esgoto e 5% de cultura mista de
bactérias acidófilas (A. ferrooxidans e A. thiooxidans) como inóculo, além de 2 g.L-1 de
Fe2+ (como FeSO4.7H2O) e 2 g.L-1 enxofre elementar (S0) (ZHOU et al., 2013). Todos
os frascos foram incubados a 30°C sob agitação de 150 rpm por 10 dias. O coeficiente
de correlação e valor de P para os ensaios realizados foram estimados no software
Graph Pad Instat para o teste paramétrico ANOVA com intervalo de confiança de 95%.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na Figura 1 é possível notar que todos os elementos tiveram percentual de
solubilização maior no EB do que no EC. Este resultado está relacionado à acidificação
do EB causado pela atividade metabólica das bactérias acidófilas do gênero
Acidithiobacillus.
Os metais cobre (37,4%), níquel (53,1%) e zinco (70,3%) foram o que mais
solubilizaram se comparados ao EC, em que o percentual de solubilização foi de apenas

147
3,4; 5,2 e 3,2%, respectivamente. Para os metais cádmio (17,9%), cromo (12,6%) e
chumbo (8,1%) também houve maior solubilização em relação ao EC (12,7; 10 e 3,8%
de solubilização, respectivamente), porém a diferença entre os tratamentos foi menor.
Todos os tratamentos apresentaram diferença estatística significativa em relação ao EC
(p<0,001).

Figura 1- Percentual de solubilização de metais da fase sólida do lodo de esgoto.

Em relação às concentrações de nitrogênio total e fósforo total, há pouca

diferença entre o EB e o EC. A concentração de nitrogênio foi reduzida 26,7% no EC,
enquanto no EB houve 22,8% de perda deste nutriente. A perda de fósforo foi de 12,5%
para o EC e 1,2% para o EB.
Na Tabela 1 há uma comparação entre as concentrações máximas permissíveis
de metais no biossólido para uso agrícola em diferentes localidades, as concentrações
iniciais de metais no lodo de esgoto anaeróbio e as concentrações obtidas na fase sólida
do lodo de esgoto após o Ensaio de Biolixiviação. Nota-se que o lodo de esgoto
utilizado neste estudo encontrava-se ao início dos experimentos dentro dos limites das
concentrações máximas permitidas no Estado de São Paulo e nos Estados Unidos,
exceto para o elemento zinco. Entretanto, quando leis mais restritivas, de países que
favorecem mais os fatores ambientais, são levadas em consideração, como da
Comunidade Europeia e Canadá, percebe-se que todos os metais analisados, com
exceção do chumbo, estariam acima dos limites máximos permitidos.
Após o EB, o produto obtido atingiu as concentrações máximas permitidas para
o elemento zinco no Estado de São Paulo/Estados Unidos. Além disso, se encontra
dentro dos limites para os demais metais pelas exigências da Comunidade Europeia.

148
Tabela 1- Comparação entre as concentrações máximas permissíveis de metais no biossólido para uso
agrícola segundo diferentes legislações, as concentrações iniciais de metais no lodo de esgoto anaeróbio e
as concentrações obtidas na fase sólida do lodo de esgoto após o ensaio de biolixiviação.
Concentração máxima permitida por lei, mg.kg -1

Local Cd Cr Cu Ni Pb Zn

Concentração Inicial 21 620 2201 356 451 8217

Ensaio de Biolixiviação 17 542 1379 167 415 2439

São Paulo/Estados Unidos 85 - 4300 420 840 7500

Comunidade Europeia 20/40 - 1000/ 1750 300/ 400 750/ 1200 2500/ 4000

Canadá 20 - - 180 500 1850

CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos, conclui-se que as características finais do lodo
de esgoto anaeróbio obtido após o tratamento pela técnica de biolixiviação bacteriana
indicam que este material possui potencial para ser utilizado como
biossólido/fertilizante em solos agrícolas, uma vez que atende as normas exigidas no
Estado de São Paulo (Norma Técnica vigente P4.230) e também em países da
Comunidade Europeia, Canadá e Estados Unidos.

AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós Graduação em Biotecnologia e Monitoramento Ambiental
da UFSCar campus Sorocaba, ao Prof. Dr. André Henrique Rosa pela ajuda com a
análise de metais e ao Laboratório de Biohidrometalurgia da Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho” campus Araraquara pela concessão das cepas de
Acidithiobacillus. Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (número de processo 442833/2014-
8) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

REFERÊNCIAS

TSUTIYA, M.T., 2015. Metais pesados: o principal fator limitante para o uso agrícola

de biossólidos das estações de tratamento de esgotos. In 28º Congresso Brasileiro de

Engenharia Sanitária e Ambiental, 2015. Rio de Janeiro: ABES. pp. p.753- 761.

APHA 2005. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21. ed.

Washingtom DC: American Public Health Association.

149
EPA 1996. Method 3050B: Acid Digestion of Sediments, Sludges, and Soils. Revision 2.

CETESB, Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental, 1999. Norma P4.230:

Aplicação de lodos de sistemas de tratamento biológico em áreas agrícolas – Critérios

para projeto e operação, São Paulo.

CAMARGO, F.P; TONELLO, P., DOS SANTOS, A. C. A., DUARTE, I. C. S., 2016.

Removal of Toxic Metals from Sewage Sludge Through Chemical, Physical, and

Biological Treatments- a Review. Water, Air, and Soil Pollution, 227(12), p.433.

http://dx.doi.org/10.1007/s11270-016-3141-3

DU, F., FREGUIA, S., YUAN, Z., KELLER, J. and PIKAAR, I., 2015. Enhancing

Toxic Metal Removal from Acidified Sludge with Nitrite Addition. Environmental

Science and Technology, vol. 49, pp. 6257-6263. http://dx.doi.org/10.1021/es504507m

FANG, D., ZHANG, R., ZHOU, L. and LI, J., 2011. A combination of bioleaching and

bioprecipitation for deep removal of contaminating metals from dredged sediment.

Journal of Hazardous Materials, vol. 192, pp. 226-233.

http://dx.doi.org/10.1016/j.jhazmat.2011.05.008

PATHAK, A., DASTIDAR, M. G. and SREEKRISHNAN, T. R., 2009. Bioleaching of

heavy metals from sewage: a review. Journal of Environmental Management, vol. 90,

pp. 2343-2353. http://dx.doi.org/10.1016/j.jenvman.2008.11.005

ZHOU, J., ZHENG, G., ZHOU, L., LIU, F., ZHENG, C. and CHUNHONG, C., 2013.

The role of heterotrophic microorganism Galactomyces sp. Z3 in improving pig slurry

bioleaching. Environmental Techonology, vol. 34, pp. 35-43.

150
 Atividade antibacteriana de extratos fúngicos contra a
Xanthomonas vesicatoria
Gabrielle Vieira1, Luana Galvão Morão1, Marina Vitti Vianna1, Lara Durães Sette1, Henrique Ferreira1,
Maria Lúcia Carneiro Vieira2, Daiane Cristina Sass1*

1
Departamento de Bioquímica e Microbiologia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”, São Paulo, Brasil. *e-mail (autor para correspondência): [email protected]
2
Departamento de Genética Molecular de Plantas e Biotecnologia, Escola Superior de Agricultura Luiz de
Queiroz, USP, São Paulo, Brasil.

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Bactérias do gênero Xanthomonas afetam importantes culturas agrícolas no Brasil e o
controle dessas doenças é realizado por meio de práticas que tem efeito negativo na
saúde e ambiente, assim, tratamentos alternativos para esses fitopatógenos são
necessários. A mancha bacteriana é uma doença causada por Xanthomonas vesicatoria
em cultivos de tomates. O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito inibitório
de 36 extratos brutos produzidos por fungos, isolados de solo abaixo de madeira em
decomposição na Antártica, em X. vesicatoria. Os extratos intracelulares foram obtidos
por extração com metanol e os extratos extracelulares via extração com acetato de etila.
A análise da ação inibitória dos extratos foi realizada pelo método Resazurin Microtiter
Assay method (REMA). O controle positivo usado foi a canamicina e o controle
negativo consistiu de meio líquido inoculado com a bactéria. O crescimento bacteriano
foi verificado através da fluorescência da resazurina e os resultados mostraram que 7
extratos foram positivos, com inibição maior que 90%. A concentração inibitória
mínima para 90% de morte celular foi calculada para os extratos bioativos e os valores
variaram de 1,00 a 2,11 mg/mL.

Palavras-chave: Metabólitos, bioativos, micro-organismos, fitopatógeno, mancha

bacteriana
______________________________________________________________________________________________

Antibacterial activity of fungal extracts against Xanthomonas vesicatoria

ABSTRACT
Bacteria of the Xanthomonas genus affect important agricultural crops in Brazil and the
control of these diseases is carried out through practices that have a negative effect on
health and environment, thus, alternative treatments for these phytopathogens are
necessary. Bacterial spot is a disease caused by Xanthomonas vesicatoria in tomato
crops. The present study had as objective to evaluate the inhibitory effect of 36 raw
extracts produced by fungi isolated from soil below decomposing wood in Antarctica in
X. vesicatoria. Intracellular extracts were obtained by extraction with methanol and
extracellular extracts via extraction with ethyl acetate. The analysis of the inhibitory
action of the extracts was performed by the Resazurin Microtiter Assay method
(REMA). The positive control used was kanamycin and the negative control consisted

151
of liquid medium inoculated with the bacterium. Bacterial growth was verified by
resazurin fluorescence and the results showed that 7 extracts were positive, with
inhibition greater than 90%. The minimum inhibitory concentration for 90% cell death
was calculated for the bioactive extracts and values ranged from 1.00 to 2.11 mg/mL.

Keywords: Metabolites, bioactive, microorganisms, phytopatogen, bacterial spot.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
A busca por compostos antimicrobianos tem crescido devido ao surgimento de
novas doenças e ao desenvolvimento de mecanismos de resistência em patógenos aos
produtos atualmente no mercado (Anderson and Hughes, 2011). Nesse âmbito, os
fungos se destacam como uma importante fonte para novos compostos antimicrobianos
e, tendo sido submetidas a longos períodos de isolamento e baixos níveis de
perturbação, as comunidades microbianas antárticas se tornam alvo de grande interesse
científico e comercial (Clarke, 2003; Vincent, 2000). Estudos recentes demonstram o
grande potencial dessas comunidades para a produção de metabólitos secundários com
atividade biológica (Furbino et al., 2014; Gonçalves et al., 2015; Svahn et al., 2015).
O emprego de metabólitos bioativos de origem microbiana na agricultura é uma
alternativa que oferece impacto ambiental mínimo ou inexistente quando comparado aos
produtos químicos atualmente utilizados. Dentro desse cenário, os estudos de
metabólitos secundários tem ganhado destaque no combate a diversas espécies de
Xanthomonas (Spago et al., 2014; Encheva-Malinova et al., 2014; Silber et al., 2013).
A macha bacteriana, uma das doenças mais importantes da cultura do tomate no
Brasil, é causada por X. vesicatoria e tem causado grandes perdas no cultivo do tomate,
reduzindo a produtividade através da destruição do tecido foliar e derrubada dos frutos
em formação, além de comprometer o valor e qualidade comercial do produto (Lopes
and Quezado-Soares, 2000). O controle da doença é normalmente realizado pela adição
de produtos químicos cúpricos, erradicação das plantas contaminadas e uso de
variedades resistentes (Sanches et al., 2014; Lopes e Quezado-Soares, 2000). No
entanto essas medidas são ineficientes, levando à acumulação de metal no ambiente,
perdas de área plantada, suscetibilidade de variedades supostamente resistentes e
desenvolvimento de resistência dos fitopatógenos aos produtos empregados.
O presente estudo visa contribuir para a descoberta de novos compostos
produzidos por fungos isolados de solo da Antártica com potencial para atividade
inibitória contra a bactéria causadora da mancha bacteriana em tomates, X. vesicatoria.

152
MATERIAL E MÉTODOS
Dezoito fungos isolados de solo abaixo de madeira podre na Ilha Deception,
Antártica, foram inoculados em meio líquido malte 2% e incubados por 20 dias à 15ºC e
150 rpm. Em seguida a biomassa e o sobrenadante foram separados por filtração à
vácuo. Para obtenção dos extratos extracelulares os sobrenadantes foram submetidos à
extrações líquido-líquido com acetato de etila. Para obtenção dos extratos intracelulares
as biomassas foram submetidas à maceração com metanol.
Após a evaporação do solvente, os extratos foram dissolvidos em solução de
Dimetilsulfóxido (DMSO) 10% para concentração final de 30 mg/mL. Os extratos
contendo metabólitos secundários foram avaliados quanto à atividade antimicrobiana
contra X. vesicatoria através de ensaio em microplaca de resazurina (Resazurin
Microtiter Assay Plate – REMA), conforme descrito por Silva e Ferreira (2013). O
ensaio utilizou canamicina em concentração de 20 µg/mL como controle positivo (CP),
DMSO 1% como controle do veículo (CV) e concentração máxima dos extratos de 2,1
mg/mL. Todos os bioensaios foram realizados em triplicata.
A capacidade de inibição de cada extrato foi expressa pela porcentagem de
morte celular, calculada em relação ao controle negativo, os dados obtidos foram
utilizados para a determinação da MIC90, que é o valor mínimo de concentração da
substância necessário para inibir em 90% o crescimento das bactérias.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
A partir da metodologia descrita em materiais e métodos os 18 fungos
produziram 36 extratos (intracelulares e extracelulares).
Os extratos foram submetidos ao bioensaio de atividade antibacteriana e de
acordo com os resultados obtidos foi possível verificar que 3 extratos extracelulares
(produzidos pelos fungos 3MP, 6MP e 10.6MP) e 4 intracelulares (produzidos pelos
fungos 5MP, 10.1MP, 10.8MP e CMP) apresentaram atividade contra a X. vesicatoria,
com taxa de inibição do crescimento bacteriano superior a 90%. Os resultados obtidos
no bioensaio com estes extratos bioativos estão apresentados na Tabela 1.

153
Tabela 3. Porcentagem de inibição do crescimento in vitro de X. vesicatoria, cultivada
em meio líquido com diferentes concentrações dos extratos bioativos.
C (mg/mL) 3MPe 6MPe 10.6MPe 5MPi 10.1MPi 10.8MPi CMPi
2,100 90,14 97,71 93,62 98,04 98,20 97,68 98,07
1,050 12,13 11,10 0,00 7,88 22,72 0,09 97,11
0,525 0,00 0,15 0,00 0,00 2,61 0,00 9,38
0,263 0,00 0,01 0,00 0,00 0,09 0,00 2,79
0,131 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
0,066 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
0,033 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
0,016 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
e: extrato de origem extracelular; i: extrato de origem intracelular

Analisando a Tabela 1 é possível verificar que os extratos obtidos dos fungos

6MP, 5MP, 10.1MP, 10.8MP e CMP apresentaram resultados de inibição superiores a
do controle positivo, que foi de 97,63%. Os extratos dos isolados 3MP e 10.6MP
apresentaram atividade inibitória menor do que a do controle positivo, porém acima de
90%, com valores respectivos de 90,14% e 93,62%.
Com base nos dados adquiridos de atividade inibitória, apresentados na Tabela
1, esboçou-se uma curva de regressão polinomial para cada extrato bioativo e a partir da
equação da reta obtida, calculou-se o valor mínimo de concentração do extrato
necessário para inibir em 90% o crescimento das bactérias (MIC90), os dados estão
apresentados na Tabela 2.

Tabela 4. Valores das MIC90 obtidas para os extratos bioativos frente à espécie X.
vesicatoria. Extrato MIC90 (mg/mL)

3MPe 2,114
6MPe 2,027
10.6MPe 2,073
5MPi 2,029
10.1MPi 1,998
10.8MPi 2,042
CMPi 1,006
e: extrato de origem extracelular i: extrato de origem intracelular

De acordo com a Tabela 2, é possível verificar que seis extratos apresentaram a

MIC90 próxima à concentração máxima testada (2,1 mg/ml) e apenas o extrato
intracelular CMP apresentou a MIC90 menor de 1,0 mg/ml.

154
CONCLUSÕES
Foi possível concluir que dos 36 extratos testados, 7 apresentaram atividade
contra X. vesicatoria, com taxa de inibição bacterina superior a 90%, sendo que o
extrato intracelular produzido pelo fungo CMP foi o que apresentou o melhor resultado,
inibindo 90% do crescimento bacteriano em uma menor concentração. Por fim, os
extratos produzidos pelos fungos da Antártica apresentam componentes com potencial
atividade contra a X. vesicatoria, causadora da mancha bacteriana em tomates.

AGRADECIMENTO
FAPESP e a CAPES pelos auxílios financeiros.

REFERÊNCIAS

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155
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156
 Potencial inibitório contra Sclerotinia sclerotiorum utilizando
composto natural e semissintético

Guilherme Fonseca Reis¹*; Ricardo Augusto Alves da Silva¹; Tatiany Monique Nunes¹; Patricia Canteri
de Souza¹; Maria Isabel Balbi ¹; Ricardo Sergio de ¹; Luciano Aparecido Panagio¹

1
Instituição: Universidade Estadual de Londrina; *e-mail: [email protected]

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Sclerotinia sclerotiorum, conhecido como mofo branco, é um fungo necrotrófico que
ataca mais de 400 espécies de eudicotiledôneas economicamente importantes para o
mundo. Compostos são utilizados para a redução do crescimento fúngico nas culturas.
Entretanto, os fungos desenvolvem resistência aos defensivos agrícolas em cinco anos.
Somado a isso, muitos antifúngicos são tóxicos para seres vivos, inclusivamente o
homem. Por este panorama, novos compostos devem ser desenvolvidos para contornar a
ineficácia de alguns produtos e ainda, os novos compostos devem ser atóxicos ou
apresentar baixa toxicidade colateral. O objetivo deste trabalho foi utilizar o óleo
essencial de orégano (um composto natural) isoladamente e em combinação com
sinvastatina (composto semi-sintético) na redução do crescimento de S. sclerotiorum. A
sinvastatina é benéfica na redução de colesterol em seres humanos, mas também
apresenta ação antimicrobiana. Para averiguar a atividade antifúngica dos componentes,
utilizamos a técnica de, impregnação dos compostos isoladamente e conjugados em
ágar. Na impregnação isolada, a sinvastatina apresentou uma DE50 de 0.97 µg/mL e
uma DE80 de 1.95 µg/mL. O óleo de orégano apresentou uma DE50 de aproximadamente
0.0039% e uma DE80 de 0.0156%. Quando associados, a sinvastatina e o óleo de
orégano apresentaram uma DE80 4x e 6x, respectivamente, inferior se comparado a seu
uso isolado. Os resultados demonstram que o óleo de orégano e sinvastatina,
isoladamente ou conjugados, apresentam potencial para serem utilizados para
eliminação da fase miceliana do S. sclerotiorum. Novos experimentos estão em curso
verificando se óleo de oréganos e sinvastatina inibem a formação ou germinação de
escleródios.

Palavras-chave: Sclerotinia sclerotiorum, óleo de orégano, sinvastatina.

______________________________________________________________________________________________

Inhibotory potencial against Sclerotinia sclerotiorum using compounds natural and

semisyntetic

ABSTRACT
Sclerotinia sclerotiorum, also known as white mold, it’s a necrotrophic fungus that
affects up to 400 eudicotyledons species with economical importance. Several
agricultural techniques are used to reduce fungal growth in crops. However, records

157
demonstrate the resistance expression to the crops deffenses. Furthermore, many
antifungal compounds does not present selective toxicity, causing damage to humans.
From this point of view, non-toxic compounds must be developed to prevent side
effects. The objective of this work was to test the activity of oregano essential oil,
(isolated and in combination with simvastatin) in reducing to the growth of S.
sclerotiorum. Simvastatin has hypocholesterolemic effect in humans, but also an
antimicrobial activity. To inquire the antifungal activity of the compounds
aforementioned, we used the diffusion agar technique with the isolated and conjugated
compounds. Simvastatin isolated presented ED50 of 0.97 μg / mL and an ED80 of 1.95
μg / mL. Oregano oil presented ED 50 of approximately 0.0039% and an ED80 of
0.0156%. Associated, simvastatin and oregano oil showed a DE 80 4x and 6x,
respectively, compared to isolated. Taken together, the results show that both
compounds present properties against the mycelial form of S. sclerotiorum. New assays
are underway to determine if oregano oil and simvastatin inhibit development or
germination of sclerotia.

Keywords: Sclerotinia sclerotiorum, oregano oil, simvastatin.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
A agricultura comercial utiliza diversos defensivos agrícolas para o controle de
doenças e pragas. O uso indiscriminado de defensivos químicos, no curto prazo, é
benéfico aos produtores em termos econômicos (maior produtividade) mas, em longo
prazo, seleciona organismos resistentes a estes mesmos defensivos. A despeito dos
ganhos econômicos, muitos defensivos agrícolas podem ser prejudiciais ao meio
ambiente, podendo também causar graves riscos à saúde humana e de outros animais
(Dalio et al., 2012).

Em 2008 o Brasil ultrapassou os Estados Unidos se tornou detentor do título de

líder mundial no uso de agrotóxicos. De acordo com a ANVISA (Agência Nacional de
Vigilância Sanitária), em 2012, antre os defensivos agrícolas usuais no Brasil, os
fungicidas representam 14% do mercado. As plantas sofrem doenças causadas por
agentes infecciosos, denominados fitopatógenos. Dentre deles, podemos citar fungos,
bactérias, vírus e nematoides.

Dentre os fungos fitopatógenos encontra-se o Sclerotinia sclerotiorum, causador

da doença popularmente conhecida como mofo branco. S.sclerotiorum pode infectar
mais de 400 espécies, incluindo culturas importantes economicamente, como feijão,
soja e girassol (Azevedo et al, 2016). Possui a característica de sobreviver em condições
ambientais desfavoráveis, formando estruturas vegetativas densas, revestidas por
melanina denominados escleródios. Esta estrutura pode permanecer quiescente por anos

158
no solo e retoma o seu desenvolvimento normal quando as condições estão favoráveis
(Smith et al., 2015).

Os patógenos apresentam resistência a vários fungicidas disponíveis no

mercado. Sendo assim, é necessária a busca de novos fungicidas que sejam eficientes e
preferencialmente ambientalmente adequados.
O objetivo desta pesquisa é analisar a atividade antifúngica do óleo essencial de
orégano e da sinvastatina isoladamente e em conjugados contra S. sclerotiorum,
determinando a concentração de ambos os compostos que inibem 50% a 80% do
crescimento micelial do fungo.

MATERIAL E MÉTODOS
O microrganismo utilizado nesta pesquisa, S. sclerotiorum, foi cedido
gentilmente pela Professora Maria Balbi, do Laboratório de Fitopatologia –
Universidade Estadual de Londrina – Brasil. A cepa foi cultivada em tubos contendo
Batata Dextrose Ágar (HIMEDIA®, Mumbai, Índia), por um período de sete – dez dias
a 20 ± 2 °C e fotoperíodo de 12 h. Após seu cultivo, a cepa foi armazenada em glicerol
a 40% a -20 °C.

A sinvastatina foi adquirida comercialmente obtida pela Henan Topfond

Pharmaceutical Co. Ltda, Yicheng, Zhumadian, Henan, China. O composto está na
forma de pró-fármaco, e sua ativação ocorre através de hidrólise com NaOH 0,25 M à
37 °C durante 60 minutos. O pH foi ajustado até a faixa de 7,4 com HCl 0,25 M e
armazenada em -20 °C na concentração de 5000 µg/mL. O óleo essencial de orégano foi
adquirido comercialmente obtido pela Ferquima Indústria e Comércio Ltda, Vargem
Grande Paulista, São Paulo, Brasil. O composto está em forma de óleo essencial e foi
armazenado na temperatura de 4 – 7 °C.

Em uma placa de Petri de 90 mm, serão adicionados 19 mL de Ágar Batata

Dextrose (HIMEDIA®). No meio ainda fundente (temperatura aproximada de 45 °C),
serão adicionados 1 mL de sinvastatina ou óleo de orégano, em concentrações que
variam entre 1250 – 4.88 µg/mL e 20 – 0.078%, respectivamente. Após a solidificação
do meio de cultura, no centro da placa, será escavado um poço de 0,9 cm de diâmetro e
substituído por um disco micelial, previamente cultivado por uma semana. A placa será
incubada a temperatura de ± 20 ± 2°C com fotoperíodo de 12 h e retirada após o

159
controle positivo atingir a extremidade da placa. A obtenção dos dados será realizada
pela medição do crescimento micelial com o auxílio de um paquímetro.

Em uma placa de Petri de 90 mm, serão adicionados 18 mL de Ágar Batata

Dextrose (HIMEDIA®). Incluso ao ágar, em seu estado líquido em temperatura próxima
a 45 °C, 1 mL de sinvastatina e óleo de orégano, em concentrações a partir de 4 vezes
observadas em DE50 (dose eficaz de 50%), para ambos os compostos, serão
incorporadas. Após a solidificação, no centro da placa, será retirado um disco de 0,9 cm
de diâmetro e substituído por um disco micelial. A placa será armazenada a temperatura
de ± 20 ± 2 °C com fotoperíodo de 12 hs até o controle positivo atingir a extremidade da
placa.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Diante das metodologias descritas foi plotado um gráfico no programa Graphpad

Prim 5.0, onde demonstra a relação concentração da substância testada x crescimento
micelial da espécie fúngica.

Figura 1: Relação concentração x porcentagem de inibição em diferentes concentrações

de sinvastatina.

160
Figura 2: Relação concentração x porcentagem de inibição em diferentes concentrações
de óleo de orégano.

Figura 3: Relação concentração x porcentagem de inibição em diferentes concentrações

de sinvastatina e óleo de orégano conjugados.
A sinvastatina apresentou uma dose eficaz 80% de 1,95 µg/Ml de inibição do
crescimento micelial de S.sclerotiorum, o óleo de orégano em 0,015% também
apresentou uma dose eficaz aproximada de 80%. Quando associados os compostos
apresentaram efeitos inibitórios de 80% em concentrações de 4x e 6x mais inferiores
para a sinvastatin1a e o óleo de orégano respectivamente. A atividade sinérgica de dois
compostos produz o efeito maior do que a simples soma dos efeitos isolados de cada um
deles, o que pode levar a aumento da eficiência na redução do crescimento microbiano,
diminuição da toxicidade dos compostos, diminuição dos efeitos adversos, menor dose
terapêutica e redução da possível resistência microbiana (Van Vuuren and Viljoen,
2011).

CONCLUSÕES
Diante dos resultados descritos notamos ação antifúngica da sinvastatina e o óleo
essencial de orégano como S. sclerotiorum. Observamos um efeito sinérgico dos
compostos utilizados, esta relação promove uma melhora na eficiência do composto,
principalmente pela amplitude no mecanismo de ação dos compostos, reduzindo a
chance de expressão de resistência. Além disso, utilizou uma menor concentração das
substancias conjugadas, isso possibilita a baixa toxicidade. Mediante ao fato, podemos
demonstrar a aplicabilidade de nossos compostos extrapolando em outras escalas. Por
exemplo, podemos utilizar veículos para o armazenamento destas substâncias, como
embalagens ou até a utilização de defensivos agrícolas alternativos que podem ser

161
utilizados intercaladamente com os tradicionais.

REFERÊNCIAS
AZEVEDO, L, et al., 2016. White mold (Sclerotinia sclerotiorum), friend or foe:
Cytotoxic and mutagenic activities in vitro and in vivo. Food Research International,
vol. 80, pp. 27-35.

DALIO, R. J. D. et al., 2012. O triplo modo de ação dos fosfitos em plantas. Revisão
Anual de Patologia de Plantas, vol. 20, no. 1, pp. 206-243.

SMITH, M. E. et al., 2015. How many fungi make sclerotia? Fungal Ecology, vol. 13,
pp. 211–220.

VAN VUUREN, S and VILJOEN, A., 2011. Plant-based antimicrobial studies–methods

and approaches to study the interaction between natural products. Planta medica, vol.
77, no. 11, pp. 1168-1182.

162
 Produção de invertase por Aspergillus sp. em condições
submersas
Gustavo Carvalho do Nascimento1*; Ryhára Dias Batista 2; Mariana Carvalho Barbosa 2; Ezequiel
Marcelino da Silva¹, Alex Fernando de Almeida1
1
Habite – Incubadora de Empresas de Biotecnologia , Universidade Federal do Tocantins, Gurupi-TO,
Rua Badejós, chácaras 69/72, Zona Rural, CEP 77.402-970. *[email protected] (autor para
correspondência)
2
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal do
Tocantins, Palmas-TO.

______________________________________________________________________________________________

RESUMO

A enzima invertase tem como função a produção de açúcares invertidos que são muito
aplicados em diversos ramos da indústria, com destaque para a área de alimentos. Desta
forma, o objetivo do trabalho foi à produção de invertase por fungos filamentosos em
condições submersas utilizando diferentes fontes de carbono puras e complexas. Os
cultivos para a seleção dos fungos filamentosos e da fonte de carbono pura foram
realizados por 120 h e os cultivos para a seleção da melhor fonte de carbono complexa
foi realizada por 72 h e 120 h, todos a 30°C e 180 rpm. Entre as fontes puras, as que
mais se destacaram foram a rafinose e a inulina. Com relação às biomassas complexas,
o bagaço da coroa de abacaxi foi a fonte com a qual obteve-se os valores mais elevados
para atividade enzimática. Como as biomassas complexas empregadas nos testes foram
as que induziram maior atividade enzimática, os resultados trazem uma alternativa
viável para algumas destas, que geralmente são descartadas.

Palavras-chave: Fungos filamentosos, resíduos agroindustriais, fonte de carbono,

enzimas.
______________________________________________________________________________________________
Invertase production by Aspergillus sp. In underwater
conditions
ABSTRACT

The enzyme invertase has the function of producing inverted sugars that are widely
applied in various branches of the industry, especially the food area. Thus, the objective
of the work was to produce invertase by filamentous fungi under submerged conditions
using different pure and complex carbon sources. The cultures for the selection of the
filamentous fungi and the pure carbon source were carried out for 120 h and the cultures
for the selection of the best source of complex carbon were carried out for 72 h and 120
h, all at 30 ° C and 180 rpm. Among the pure sources, the most outstanding ones were
rafinose and inulin. In relation to the complex biomasses, the bagasse of the pineapple
crown was the source with which the highest values for enzymatic activity were
obtained. As the complex biomasses used in the tests were those that induced higher

163
enzymatic activity, the results provide a viable alternative for some of these, which are
generally discarded.

Keywords: Filamentous fungi, agroindustrial residues, carbon source, enzymes.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Enzimas têm por função catalisar reações no organismo, sendo assim
denominadas como catalisadores biológicos. Estas proteínas favorecem a ocorrência de
uma determinada reação, garantindo um alto rendimento na formação do produto e um
gasto energético menor. As enzimas têm ainda duas importantes características que são
a especificidade que possibilita a diferenciação de estruturas químicas semelhantes e a
capacidade de atuar em diversos níveis de temperatura (KULSHRESTHA et al., 2013).
As invertases são capazes de realizar a inversão de açúcares por meio da
hidrólise das ligações do tipo β- 1,2 da sacarose. Como resultado desta reação ocorre a
formação de D-frutose e D- glicose que são chamados de açúcares invertidos. Este tipo
de açúcar tem um potencial elevado para sua utilização na indústria de alimentos e
bebidas (NUNES et al., 2013). A hidrólise da sacarose da origem ao chamado xarope
invertido, que é formado por glicose e frutose em igual concentração. Este xarope faz
parte da formulação de diversos produtos alimentícios como compotas, doces, cremes
não cristalizantes e mel artificial. Sua atuação é de umectante, auxiliando na retenção de
umidade destes produtos (TASKIN et al., 2016).

MATERIAL E MÉTODOS
Foi realizada uma triagem para selecionar o fungo com maior potencial para
produção de invertase. Os fungos empregados neste teste foram inoculados em placas
de petri, contendo meio BDA e mantidos a 4ºC. Para a inoculação no meio de cultivo
submerso os fungos reativados foram incubados em estufa de crescimento biológico em
tubos inclinados com meio BDA por três dias, após este prazo, realizou-se o inóculo por
meio de uma suspensão de esporos com agua destilada. Um ml da suspensão de esporos
foi pipetado em erlenmeyers contendo meio de sais de Vogel (VOGEL, 1956). Como
fonte de carbono e nitrogênio utilizou-se inulina e extrato de levedura respectivamente.
O tempo de cultivo para a seleção teve duração de cinco dias, em shaker rotativo e as
condições de cultivo foram mantidas em 28ºC e 180 rpm de temperatura e agitação.
Com o termino da fermentação o caldo fermentado foi filtrado e armazenado a -12ºC
para posterior realização de atividade enzimática.

164
 Posteriormente realizou-se o teste para seleção da fonte de carbono pura onde
empregou-se somente o fungo selecionado anteriormente. As condições de cultivo para
realização de tal teste foram as mesmas empregadas para a seleção fúngica. Os extratos
proteicos filtrados utilizando, kitassato, funil de Buchner e bomba de vácuo e como
filtro tecido Musseline, armazenados a -12ºC. A utilização de fonte de carbono
complexa seguiu o mesmo protocolo das analise anteriores para inóculo, condições de
processo e fonte de nitrogênio, no entanto o cultivo foi realizado em três e cinco dias, o
procedimento para os extratos proteicos filtrados seguiu os procedimentos anteriores.
Incubou-se a biomassa fúngica retida nos filtros em estufas de secagem por 24 horas a
60ºC para pesagem e analise do peso seco.
Para atividade enzimática adicionou-se 800 µL de uma solução de sacarose 2%
com tampão Mcilvaine em pH 5,0 em tubos de ensaio. Os mesmos foram mantidos a
50°C por 5 minutos. Após este prazo adicionou-se 200 µL do extrato proteico nos tubos
contendo a solução de sacarose, foram retirados 200 µL da reação que foram pipetados
em tubos contendo 200 µL de solução de ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS) para cessar a
reação. Os 200 µL foram retirados em tempos de 0, 5 e 10 minutos após o inicio da
reação. Os tubos contendo DNS e a reação enzimática foram fervidos a 90°C por 5
minutos para que pudesse acontecer a reação de coloração, após o termino do tempo de
fervura, pipetou-se 2 ml de água destilada nos tubos. As leituras foram realizadas em
espectrofotômetro a 540 nm.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para a seleção do fungo o que se pode observar através dos resultados obtidos e
demonstrados na Tabela 1, é que o PC-4, apresentou os valores mais elevados tanto para
atividade enzimática 3,47 U/ml que foi tratado como o parâmetro principal, quanto para
parâmetros tidos como secundários, produtividade 0,46 U/h, rendimento 277,80 U/g. Os
demais testes foram realizados com o PC-4.

165
Tabela 1. Atividade enzimática e rendimento para triagem do fungo com maior
potencial para produção de invertase.
Fungo U/ml Yp/s Pp Peso
seco(g/L)
PC-1 1,86 163,17 0,27 5,72
PC-2 1,23 110,90 0,18 5,56
PC-3 1,06 95,20 0,16 2,67
PC-4 3,47 277,80 0,46 5,54
PC-5 1,96 151,82 0,25 5,37
PC-6 1,30 97,28 0,16 6,02
MC-1 N/D N/D N/D 1,64
MC-2 N/D N/D N/D 1,39
Rizhopus 1,76 171,15 0,29 1,75
QF-1 N/D N/D N/D 4,04
PR-12 0,91 70,83 0,12 5,77
Condições de cultivo: cultivos realizados em sais de Vogel, pH 6, a 180 rpm, 28 oC por
120 horas.
A Tabela 2 assim como a tabela anterior apresenta dados sobre atividade
enzimática, rendimento, produtividade e peso seco. A rafinose foi a fonte de carbono
pura, com a qual o PC-4 alcançou os melhores níveis de produção da enzima com
atividade enzimática de 1,26 U/ml, com destaque também para a inulina que obteve
atividade de 0,95 U/ml.

Tabela 2. Seleção da melhor fonte de carbono pura para indução de invertases.

Fonte de Carbono U/ml Yp/s Pp Peso seco(g/L)
Inulina 0,95 75,97 0,13 6,68
Lactose 0,12 13,27 0,02 6,30
Frutose 0,10 9,93 0,02 5,27
Glicose 0,62 47,75 0,08 5,61
Xilose 0,19 10,91 0,02 6,02
Celobiose 0,19 12,80 0,02 6,21
Maltose 0,40 19,11 0,03 6,27
Sorbitol 0,17 14,59 0,02 6,56

166
Glicerol 0,32 27,37 0,04 3,64
Rafinose 1,26 100,51 0,16 4,51
Celulose 0,28 23,80 0,04 9,51
Sacarose 0,23 17,47 0,03 6,79
Condições de cultivo: cultivos realizados em sais de Vogel, pH 6, a 180 rpm, 28 oC por
120 horas.

Figura 1. Produção de invertase utilizando fonte de carbono complexa (A) 3 dias e (B)
5 dias de cultivo

Na Figura 1 estão representados os dados para atividade enzimática e peso seco,

em cultivo utilizando fonte de carbono complexa em três e cinco dias. A coroa de
abacaxi demonstrou-se como a fonte que melhor induziu a produção de invertase nos
dois tempos de cultivo. Para o crescimento fúngico determinado pelo peso seco a palha
de milho superou as demais fontes. Sendo a atividade enzimática o parâmetro principal
para seleção da fonte de carbono, a coroa de abacaxi foi à fonte selecionada.

167
CONCLUSÕES
Dentre as fontes de carbono puras testadas a rafinose se destacou, e para as
fontes de carbono complexas o bagaço de abacaxi teve os valores mais elevados para
atividade enzimática de invertase. Comparando as fontes de carbono puras e complexas,
as ultimas foram superiores para indução da produção da enzima de interesse. Um
resultado interessante por oferecer uma utilidade para tais resíduos que normalmente
seriam descartados, podendo baratear os custos para obtenção de invertase para
indústria.
AGRADECIMENTO
Os autores agradecem a Universidade Federal do Tocantins e a incubadora de
empresas de base biotecnológica (HABITE) por proporcionar o desenvolvimento do
presente trabalho.

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VOGEL, H. J. A convenient growth medium for Neurospora crassa (medium N).

Microbiology Genetic Bulletim, vol. 13, p. 42–43, 1956.

168
 Produção de frutosiltransferase por Aspergillus sp em cultivo
submerso
Gustavo do Nascimento¹; Ryhára Batista2; Rafael Silva1; Ezequiel M. da Silva3; Alex de Almeida1*

1
Habite – Incubadora de Empresas de Biotecnologia, Universidade Federal do Tocantins, Gurupi-TO, Rua
Badejós, chácaras 69/72, Zona Rural, CEP 77.402-970. *[email protected]
2
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal do Tocantins,
Palmas-TO
3
Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, Universidade Federal do Tocantins, Gurupi-TO
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Os frutooligossacarídeos têm ampla aplicação industrial com destaque na indústria de
alimentos. Frutooligossacarídeos são usados na produção de alimentos funcionais, pois
apresentam características prébióticas. As frutosiltransferases (FTase) são capazes de
formar açúcares invertidos e frutooligossacarídeos, respectivamente. Neste trabalho, o
objetivo foi a produção de frutosiltransferase por uma linhagem de Aspergillus sp.
isolada de frutos em conserva, avaliando tanto fontes de carbono puras quanto fontes
complexas de origem agroindustriais. Entre as fontes de carbono puras, a rafinose foi a
fonte de carbono pura que melhor induziu a produção das enzimas de FTase (3,07
U/mL). A utilização de resíduos agroindustriais promoveu maior produção de FTase
(17,36 U/mL) após 5 dias de cultivo utilizando bagaço da coroa de abacaxi. A utilização
de resíduos agroindustriais é uma alternativa viável para a produção de FTase e a coroa
de abacaxi um resíduo com pouca aplicação em processos industriais, o que favorece a
redução nos custos da produção da enzima.

Palavras-chave: frutooligossacarídeos, frutosiltrasferases e resíduos agroindustriais.

______________________________________________________________________
Fructosyltransferases production by Aspergillus sp. under submerged culture
ABSTRACT
Fructooligosaccharides have broad industrial applications with prominence in the food
industry. Fructooligosaccharides are used in the production of functional foods, since
they have prebiotic characteristics. The fructosyltransferases (FTase) are able to
produce inverted sugars and fructooligosaccharides, respectively. In this work, the aim
was to produce of fructosyltransferase by Aspergillus sp. strain isolated from syrup
fruits, evaluating both pure carbon sources and complex sources of agroindustrial
residues. Among the pure carbon sources, raffinose was the pure carbon source that best
induced the production of FTase enzymes (3.07 U/mL). The use of agroindustrial
residues promoted higher FTase production (17.36 U/mL) after 5 days of cultivation
using pineapple crown. The use of agroindustrial residues is a viable alternative for the
production of FTase and the pineapple crown is a residue with little application in
industrial processes, which favors the reduction in the costs of the enzyme production.

Key words: Fructooligosaccharides; fructosyltransferases; agroindustrial residues

______________________________________________________________________________________________

169
INTRODUÇÃO

Frutosiltransferases são responsáveis pela produção de frutooligossacarideos

(FOS). Estas enzimas atuam clivando as ligações β-1,2 de uma molécula de sacarose e
realizando a transferência de uma molécula de frutose para um aceptor final. Este
aceptor pode ser outra molécula de sacarose, gerando como produtos finais FOS e
glicose (MUNIZ-MÁRQUEZ et al., 2015). Os FOS apresentam uma gama de
aplicações tanto para fins farmacêuticos como para diagnósticos. Também possuem
funções nutritivas, como os oligômeros de frutano, que são formados por três unidades
de frutose que se ligam a sacarose por ligações do tipo β-1,2. Os principais
frutooligossacarideos produzido são, 1- kestose, nistose e 1 fructofuranosilnistose
(GANAIE; GUPTA, 2014).
Frutosiltransferases podem ser produzidas por bactérias, leveduras e fungos
filamentosos. Entre os fungos filamentosos, o gênero Aspergillus possui grande
aplicação em processos fermentativos visando a produção destas enzimas devido sua
adaptação para se desenvolver em ambientes ricos em compostos sacarolíticos
(KULSHRESTHA et al., 2013). Este trabalho teve como objetivo avaliar a produção de
frutosiltransferase por uma linhagem de Aspergillus sp. isolada de frutos de pêssego em
calda, utilizando fontes de carbono puras e resíduos agroindustriais.

MATERIAL E MÉTODOS
Microrganismos e condições de cultivo

A linhagem de Aspergillus sp. foi isolada de frutos de pêssegos em calda e

mantida em meio batata-dextrose-ágar. A linhagem foi reativada me tubos inclinados
contendo o mesmo meio de cultivo por 3 dias, a 30°C. Uma suspensão de esporos de
106 esporos/mL foi preparada e 1 mL da suspensão foi utilizada para inocular os meios
de cultivo. Os cultivos foram realizados em frascos Erlenmeyer (125 mL) contendo 20
mL de meio de Vogel (VOGEL, 1956), suplementado com 1% de fonte de carbono e
0.2% de extrato de levedura. O pH foi ajustado para 6,0. Os meios foram esterilizados
em autoclave e após inoculados foram mantidos por 5 dias, a 28°C e 180 rpm.

170
Suplementação com fonte de carbono pura

Os cultivos foram preparados adicionando-se 1% (m/v) de fontes de carbono

puras: frutose, glicose, rafinose, celulose, celobiose, sorbitol, inulina, sacarose, maltose,
lactose e xilose para avaliar as características indutiva ou constitutiva da enzima.

Suplementação com resíduos agroindustriais

Os cultivos foram preparados adicionando 1% (m/v) dos seguintes resíduos

agroindustriais: bagaço da coroa de abacaxi, farinha de batata doce, bagaço de cana de
açúcar, sabugo de milho, casca de mandioca, casca de soja, farelo de soja, palha de
milho, casca de bacaba, sorgo e farelo de trigo. Os cultivos foram realizados nas
mesmas condições anteriores, no período de 3 e 5 dias.

Atividade enzimática

A atividade de FTase foi realizada seguindo a metodologia descrita por

(RAWAT et al., 2015). Formulou-se uma solução de sacarose 20% com tampão acetato
de sódio em pH 5,0. Desta solução pipetou-se 400 μL em tubos de ensaio. A reação foi
iniciada com a adição de 100 μL do extrato proteico nos tubos contendo a solução de
sacarose. Os tubos foram mantidos em banho maria a 50°C por 1 hora. Para
interrromper a reação ferveu-se a mesma por 10 minutos em temperatura de 90°C. Em
seguida, 10 μL da solução reagida foram pipetados em tubos contendo 1 ml da solução
de GOD-POD (glicose oxidase peroxidase) e levou-se novamente ao banho maria a uma
temperatura de 37 °C por 10 minutos. A leitura da absorbância foi realizada em
espectrofotômetro a 510 nm. Uma unidade de enzima foi definida como a quantidade
enzima que libera um micromol de produto por minuto de reação.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Efeito de fontes de carbono puras
Na Tabela 1 são apresentados os resultados para a produção de
frutosiltransferase (FTase). O uso de rafinose como fonte de carbono promoveu uma
produção de 3,07 U/ml, enquanto que a inulina de 1,47 U/ml. O rendimento e a
produtividade destas fontes de carbono foram 143,34 U/g e 0,24 U/), respectivamente.

171
Tabela 1. Fontes de carbono puras usadas para a produção Ftases por Aspergillus sp.

Fonte de Carbono Peso seco FTase

(g/L) U/ml
Inulina 6,68 1,47
Lactose 6,30 0,16
Frutose 5,27 0,40
Glicose 5,61 0,92
Xilose 6,02 0,45
Celobiose 6,21 0,54
Maltose 6,27 1,09
Sorbitol 6,56 0,54
Glicerol 3,64 0,82
Rafinose 4,51 3,07
Celulose 9,51 0,17
Sacarose 6,79 0,47

Nunes et al. (2013) demonstram resultados onde a inulina obteve o melhor

resultado como indutor na síntese desta enzima a partir de E. nidulans, já para
Aspergillus nidulans a sacarose se destacou como melhor fonte de carbono. Rustiguel et
al (2015) avaliaram a produção de invertase por Aspergillus phoenicis, com três tipos de
fontes de carbono pura, glicose, sacarose e rafinose, com destaque para a rafinose.

Efeito de fontes de carbono complexas

A Tabela 2 apresenta valores para produção de FTase após 3 e 5 dias de cultivo,

bem como a produção de biomassa fúngica. A maior produção de FTase foi observada
utilizando coroa de abacaxi após 3 e 5 dias de cultivo (13,38 U/mL e 17,36 U/mL,
respectivamente). O farelo de trigo foi a segunda melhor fonte de carbono para a
produção de FTase após 5 dias de cultivo (14,42 U/mL), seguido da farinha de batata
doce (12,19 U/mL). O bagaço de cana de açúcar promover a maior produção de FTase
após 3 dias de cultivo (11,54 U/mL).

172
Tabela 2. Resíduos agroindustriais usados para a produção de FTases por Aspergillus
sp.
3 dias 5 dias
Fonte de carbono Biomassa U/ml Biomassa U/ml
(g/L) (g/L)
Coroa de abacaxi 6,70 13,38 7,88 17,36
Farinha de Batata doce 5,24 4,28 5,76 12,19
Farelo de soja 5,61 9,40 5,21 9,82
Casca de bacaba 9,80 0,12 9,99 0,80
Sabugo de milho 9,04 9,47 9,08 10,19
Farelo de trigo 6,47 9,00 6,78 14,42
Casca de soja 9,67 0,12 10,57 1,21
Bagaço de cana-de-açúcar 9,10 11,54 9,93 9,57
Sorgo 5,71 3,52 6,48 5,92
Casca de mandioca 6,78 4,60 6,34 5,61
Palha de milho 10,98 0,29 11,63 3,25

Muniz-Marquez et al. (2016) realizaram estudos para obtenção de FTases por A.

oryzae, onde também se analisou o melhor tempo para produção em intervalos de 2
dias. O melhor tempo de cultivo foi de 42 horas. O meio de cultivo utilizado no artigo
foi água mel que é um liquido rico em açúcares, que é extraído de uma planta conhecida
como Maguey originária do México, a fermentação foi conduzida em estado sólido.
Mussato e Teixeira (2010) avaliaram a produção de FTase por A. japonicus em
fermentação em estado sólido, onde foram testadas 3 diferentes fontes de carbono:
sabugo de milho, café sobreiro e silverskin. O melhor resultado obtido no trabalho foi
para o sabugo de milho.

CONCLUSÕES
A rafinose foi a fonte de carbono pura que melhor induziu a produção das
enzimas de FTase por Aspergillus sp. PC-4. As fontes de carbono complexas
alcançaram valores muito superiores as fontes de carbono puras, sendo a alternativa
mais viável para obtenção de tais enzimas, o que é interessante por se tratarem de
resíduos agroindustriais que normalmente seriam descartados, podendo diminuir os
custos da produção em larga escala que normalmente é elevado. O bagaço de abacaxi se
mostrou uma boa fonte de carbono para produção de FTases. O melhor tempo de cultivo
para a FTase é de 5 dias.

173
REFERÊNCIAS
GANAIE, M. A.; GUPTA, U. S. Recycling of cell culture and efficient release of
intracellular fructosyltransferase by ultrasonication for the production of
fructooligosaccharides. Carbohydrate Polymers, v. 110, p. 253–258, 2014.

KULSHRESTHA, S. et al. Invertase and its applications - A brief review. Journal of

Pharmacy Research, v. 7, n. 9, p. 792–797, 2013.
MUNIZ-MÁRQUEZ, D. B. et al. Enhancement of fructosyltransferase and
fructooligosaccharides production by A. oryzae DIA-MF in Solid-State Fermentation
using aguamiel as culture medium. Bioresource Technology, v. 213, p. 276–282, 2015.

MUSSATTO, S. I.; TEIXEIRA, J. A. Increase in the fructooligosaccharides yield and

productivity by solid-state fermentation with Aspergillus japonicus using agro-industrial
residues as support and nutrient source. Biochemical Engineering Journal, v. 53, n. 1, p.
154–157, 2010.

NUNES, J. et al. Production of Invertases by Anamorphic (Aspergillus nidulans) and

Teleomorphic (Emericela nidulans) Fungi under Submerged Fermentation Using Rye
Flour as Carbon Source. v. 2013, n. September, p. 421–429, 2013.

RUSTIGUEL , C. B.; JORGE , J. A.; GUIMARÃES , L . H. S. Characterization of a

thermo -tolerant mycelial fructofuranosidase from Aspergillus phoenicis under
submerged fermentation using wheat bran as carbon source . Biocatalysis and
Agricultural Biotechnology, v. 4, n. 3, p. 362–369, 2015.

VOGEL, H. J. A convenient growth medium for Neurospora crassa (medium N).

Microbiology Genetic Bulletim, vol. 13, p. 42–43, 1956.

174
 Prospecção química de Nodulisporium sp: otimizaçao das
condições de cultivo
Iatã do Carmo Mendonça1*; Alana Evangelista Honório1; Dulce Helena Siqueira Silva1

1
Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) – Instituto de
Química, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. *e-mail: [email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Considerando a variedade de compostos encontrados em produtos de origem
natural, o estudo da biodiversidade de um país é de interesse tanto científico quanto
econômico. Dessa forma um melhor conhecimento dos ecossistemas marinhos é
essencial para o desenvolvimento de diversas áreas da ciência, já que estes apresentam
biodiversidade comparável às florestas tropicais. Os organismos marinhos exibem
características bioquímicas diferenciadas apresentando grande potencial para
bioprospecção, levando possivelmente a descoberta de novas substâncias com
atividades biológicas, importantes para o desenvolvimento de novos agentes
terapêuticos. As algas vermelhas por exemplo destacam-se dentre os seres aquáticos,
sendo conhecidas como as maiores produtoras de compostos halogenados, apresentando
diversos metabólitos secundários com atividades biológicas. Assim como muitos
organismos, estas algas podem apresentar relação de simbiose com fungos, conhecidos
como endofíticos, sendo estes também uma importante fonte de substâncias bioativas.
Levando em consideração a importância do estudo de organismos marinhos e os estudos
realizados anteriormente pelo grupo de pesquisa, este trabalho apresentou como
objetivo aprofundar a prospecção química do fungo endofítico do gênero
Nodulisporium, isolado anteriormente da alga vermelha Asparagopsis taxiformis,
buscando otimizar a produção de dois metabólitos secundários de interesse, a N-(2-
feniletil)acetamida e o (2E,6E)Nona-2,6,8-trieno-4,5-diol através da variação de alguns
fatores na metodologia utilizada para o crescimento do mesmo. Assim pode-se observar
após analises dos extratos por cromatografia líquida de alta eficiência e comparação
com um padrão, constituído por uma mistura das substancias de interesse, que o extrato
obtido pelo cultivo do fungo em meio de malte por 28 dias apresentou maior produção
dos compostos desejados.

Palavras-chave: Fungos, marinho, Otimização, N-(2-feniletil)acetamida, (2E,6E)Nona-

2,6,8-trieno-4,5-diol.
______________________________________________________________________________________________

Chemystry prospection of Nodulisporium sp: growth conditions optimization

ABSTRACT
Seeing the variety of compounds found in natural products, study the
biodiversity of our country have great matter on scientific and economic field.
Therefore, research marine ecosystems it is essential to development of many areas,
since the marine environment has a biodiversity comparable to tropical forests.
175
Moreover, marine organisms exhibit distinct biochemistry character, showing great
potential for bioprospecting, leading possibly to the development of new therapeutic
compounds. The red algae for example stand out as producer of halogenated substances,
with many biological active secondary metabolites. Besides that, as many organisms,
algae could exhibit a symbiotic relationship with endophytic fungus, there are also
important as source of bioactive compounds. Seeing the importance of marine
organisms research, and the previous studies of this research group, this work have as
target increase the chemistry prospection of the endophytic fungus Nodulisporium sp,
isolated previous from the red algae Asparagopsis taxiformis, looking for optimize the
production of two secondary metabolites diversifying some factors of the methodology
used on the fungus growth. So it can be noted by the analysis of the extracts in High-
performance liquid chromatography and using a pattern, made by the mixing of the two
compounds of interest, that the extract obtained of the fungus growth in malt for 28
days show better results.
Keywords: Fungus, marine, optimization, N-(2-phenylethyl)acetamide, (2E,6E)Nona-
2,6,8-triene-4,5-diol.
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
A grande diversidade estrutural e bioatividade de substâncias obtidas a partir de
produtos de origem natural representam fatores importantes para seu uso no
desenvolvimento de fármacos e outros bioprodutos. (Bolzani, 2016)
Além das plantas, outros organismos como fungos, insetos, organismos
marinhos e bactérias são também fontes importantes de substâncias biologicamente
ativas, sendo que a maioria dos fármacos em uso clínico são de origem natural ou foram
desenvolvidos por síntese química planejada a partir de ou inspirada em produtos
naturais. (Barreiro and Bolzani, 2009). Dentre estes organismos as algas recebendo
destaque devido a sua biodiversidade, sendo comparável à observada nas florestas
tropicais, esta riqueza de espécies torna as algas fonte de uma enorme variedade de
estruturas químicas com potencial elevado para descoberta de novos fármacos.
(Machado et al., 2010).
As algas vermelhas (Rhodophyta) por exemplo são reconhecidas como as
maiores produtoras de substâncias halogenadas no meio marinho, destacando-se como
uma fonte de novos produtos naturais. Amplamente distribuídas em mares temperados-
quentes e tropicais do mundo, o gênero compreende mais de 130 espécies
morfologicamente complexas. (Pereira, 1999)
Juntamente aos organismos marinhos os fungos endofíticos, encontrados em
simbiose com plantas e algas, tem-se destacado na produção de metabólitos bioativos.
Sabe-se que alguns destes seres são capazes de produzir metabólitos característicos de

176
seus hospedeiros, sendo uma propriedade importante para a utilização de produtos
naturais já que pode levar a redução da coleta de plantas ou algas que apresentem
crescimento lento ou ameaça de extinção. Além disso a fermentação microbiana como
meio de produção de substâncias bioativas apresenta muitas vantagens sobre a
utilização de plantas ou algas, em vista da possibilidade de variações nas condições de
cultivo, buscando otimizar vias biossintéticas desejadas, maior facilidade em aumentar a
produção e melhor resposta a técnicas rotineiras de cultura. (Specian et al., 2015)
Diversas substâncias naturais de uso terapêutico já foram identificadas e isoladas
de espécies de fungos, como por exemplo penicilinas e cefaloporinas, utilizadas como
antibióticos, a mevinolina um agente redutor de colesterol, bleomicinas, daunorubicinas
e análogos utilizados como agentes antitumorais, entre outras. Além disso os fungos
filamentosos, grupo no qual estão incluídos os fungos endofíticos, têm como
característica a capacidade de biossintetizar uma grande quantidade de metabólitos
secundários, podendo ser 73% mais produtivo que outras classes de microrganismos.
(Cafêu et al., 2005)
Em um trabalho realizado anteriormente no grupo de pesquisa a mestra Camila
Souza Santos verificou a produção e identificou em mistura duas substancias
produzidas pelo fungo Nodulisporium sp, a N-(2-feniletil)acetamida e o (2E, 6E) Nona-
2,6,8-trieno-4,5-diol, moléculas importantes pois estudos envolvendo compostos
semelhantes relataram atividades biológicas como antimicrobiana, no caso de algumas
ariletilamidas (Maskey et al., 2002), e inibitória contra a enzima isocitrato-liase,
antifúngica contra cândida albicans e citotóxica frente a células de carcinoma de cólon
para alguns poliois alifáticos insaturados, isolados da bactéria Streptomyces sp (Bae et
al., 2013). Porém, os compostos não apresentaram massa significativa, dificultando seu
isolamento e impedindo a realização de testes biológicos. Com base nessas informações
este trabalho visa identificar como variações no meio e no tempo de cultivo podem
afetar a produção de metabolitos secundários, bem como das substâncias citadas a cima,
buscando aumentar a produção das mesmas facilitando os estudos químicos e
biológicos.

MATERIAL E MÉTODOS

Para realização do planejamento experimental as variáveis escolhidas foram:

tempo de fermentação (7, 14, 21 e 28 dias) e meio de cultivo líquido pobre e rico em

177
nutrientes, respectivamente, (Czapeck e Extrato de Malte), totalizando 8 experimentos
realizados em duplicata.
O fungo Nodulisporium sp foi cultivado em placas de Petri contendo PDA e
incubada por 7 dias a 25oC, a fim de se obter maior massa micelar.
Após este período, 1/3 de cada placa foi inoculado em frascos de Erlenmeyers de
500 mL (5 cm diâmetro) contendo 200 mL de meio de cultivo, sendo mantidos sob
temperatura de 25oC, em modo estático.
Ao final dos períodos de crescimento, separou-se o micélio do caldo fermentado
através do processo de filtração a vácuo. O caldo foi submetido à três partições
líquido/líquido com acetato de etila (AcOEt). Após evaporação do solvente foram
obtidos os extratos brutos, que em seguida foram submetidos a etapa de preparo de
amostra (clean-up). Todas as amostras foram preparadas na concentração 2 mg.ml-1 e
analisados por CLAE-DAD, visando obter os perfis químicos dos mesmos, podendo
assim, comparar a produção metabólita do fungo em diferentes condições de
crescimento.
As análises foram realizadas em coluna analítica Luna Phenomenex tipo octadecil
silano (C-18) e eluição em gradiente H2O/MeOH (95:050:100) por 40 min.,
permanecendo nesta condição por mais 10 min., com fluxo de 1,0 mL/min. e
comprimento de onda de 254 nm.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Ao analisarmos os resultados obtidos dos cultivos da linhagem AT-02, verificou-
se que os perfis químicos dos extratos se mostraram semelhantes, apresentando diversos
picos com mesmo tempo de retenção e espectros de UV/Vis ( Figura 1). A principal
diferença entre os extratos se deu quanto a intensidade dos picos. Ao observar, por
exemplo, o pico eluido no tempo de retenção 31,5 minutos nota-se um aumento
significativo na sua produção conforme aumentamos o tempo de fermentação, o que nos
ajuda a confirmar que, a variação dos parâmetros propostos afeta consideravelmente a
produção metabólica do micro-organismo em estudo.

178
Figura 2: Cromatogramas correspondentes aos diferentes extratos obtidos pela variação do meio
de cultivo e tempo de crescimento do fungo Nodulisporium sp e à mistura utilizada como
padrão para identificação das substancias de interesse.

A fim de verificar se houve produção/aumento dos compostos N-(2-feniletil)

acetamida e (2E, 6E) Nona-2,6,8-trieno-4,5-diol, comparou-se os cromatogramas dos
extratos com o da mistura das substancias obtida no trabalho realizado anteriormente.
Pode-se observar que a mistura eluiu em 16,03 minutos, sendo possível confirmar a
presença dessas substancias em todos os experimentos realizados além de significativas
variações em relação a suas quantidades.
Assim, visando maior produção das substâncias de interesse, o cultivo do fungo
em Extrato de Malte fermentado por 28 dias foi selecionado para o cultivo em escala
ampliada de forma a evitar gastos desnecessários de tempo e material, poupando recurso
e diminuindo o impacto ambiental da pesquisa.

CONCLUSÕES
Os resultados obtidos demonstraram que as diferentes metodologias utilizadas
neste trabalho resultaram em variações na concentração e quantidade de metabolitos
secundários produzidos, demonstrando assim a importância de verificar as melhores
condições de cultivo para cada micro-organismo. Além disso, foi possível confirmar
que o uso de planejamento experimental é uma ferramenta excelente para otimização da
produção de compostos bioativos de interesse com maior reprodutibilidade dos
experimentos e melhora nos resultados obtidos. Estes resultados demonstram ainda a
importância da investigação das algas marinhas e seus fungos associados, uma vez que
estes ainda foram pouco estudados e podem trazer grandes avanços no âmbito da
pesquisa brasileira.

AGRADECIMENTO: Biota, Capes, CEPID

179
REFERÊNCIAS

BAE, M., et al, 2013. Separacenes A–D, novel polyene polyols from the marine
Actinomycete, Streptomyces sp. Marine Drugs, vol. 11, no. 8, pp. 2882-2893.

BARREIRO, E. J. and BOLZANI, V. S., 2009. Biodiversidade: fonte potencial para a

descoberta de fármacos. Química Nova, vol. 32, no. 3, pp. 679-688.

BOLZANI, V. S., 2016. Biodiversidade, bioprospecção e inovação no Brasil. Ciencia e

Cultura, vol. 68, no. 1, pp. 4-5.

CAFÊU, M. C. et al, 2005. Substâncias antifúngicas de Xylaria sp., um fungo endofítico

isolado de Palicourea marcgravii (Rubiaceae). Química Nova, vol. 28, no. 6, pp. 991-
995.

MACHADO, F. L. da S. et al, 2010. Atividade biológica de metabólitos secundários de

algas marinhas do gênero Laurencia. Revista Brasileira de Farmacognosia, vol. 20, no.
3, pp. 441-452.

MASKEY, R. P., et al, 2002. Phytotoxic arylethylamides from limnic bacteria using a
screening with microalgae. Journal of Antibiotics, vol. 55, no. 7, pp. 643-649.

PEREIRA, R. C.; TEIXEIRA, V. L., 1999. Sesquiterpenos das algas marinhas

Laurencia lamouroux (Ceramiales, Rhodophyta). 1. Significado ecológico. Química
Nova, vol. 22, pp. 369-374.

SPECIAN, V. et al, 2015. Metabólitos Secundários de Interesse Farmacêutico

Produzidos por Fungos Endofíticos. Journal of Health Sciences, vol. 16, no. 4, pp. 345-
351.

180
 Caracterização da atividade tanásica produzida por fungos
isolados da biomassa

Isabela Teresa Santos Corrêa1, Boutros Sarrouh1

1
Universidade Federal de São João del-Rei. E-mail: [email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
O estudo da enzimologia abrange uma vasta gama de enzimas de origem animal e
vegetal, contudo as de origem microbiana apresentam grande potencial para aplicação
industrial, já que podem ser produzidas em larga escala, via processos fermentativos.
Contudo, a produção destas exigem o isolamento e identificação de microrganismos
capazes de produzir de forma eficiente o bioproduto de interesse. O objetivo deste
trabalho foi obter a avaliação da atividade enzimática e caracterização da tanase
produzida por Fusarium sp. e Aspergillus sp. isolados a partir da casca de café. As
cepas foram cultivadas meio a fermentação submersa utilizando meio mineral
suplementado com ácido tânico 1%, a 28ºC e 180 rpm durante 10 dias. Em intervalos de
24 horas as amostras foram recolhidas para obtenção do extrato enzimático bruto. A
quantificação foi feita meio a técnica de precipitação de proteína modificada e o
sobrenadante foi lido a 260 nm. Uma unidade de enzima tanase equivale a 1 μmol.mL-1
min-1 de ácido gálico. Pelos resultados obtidos observou-se que, Fusarium sp.
apresentou uma atividade tanásica de 1,5±0,032 U/mL após 8 dias de fermentação,
enquanto Aspergillus sp. alcançou valor máximo de 1,2 ± 0,003 U/mL após 5 dias. Por
fim, foi feita a caracterização da enzima frente a diferentes variações de pH e
temperatura, da cepa de melhor produtividade, obtendo melhor produção tanásica de
1,88±0,009 U/mL em pH ideal 5,0 e 1,61±0,019U/mL em temperatura de 40°C. Então,
conclui-se que tais fungos apresentam um potencial promissor para a produção da
tanase, utilizada em diferentes processos biotecnológicos indústrias.

Palavras-chave: Tanase, Casca de café, Fusarium sp, Aspergillus sp.

______________________________________________________________________________________________

Characterization of the tannase activity produced by fungi isolated from biomass

ABSTRACT
The study of enzymology encompasses a wide range of enzymes of animal and
vegetable origin, but those of microbial origin present great potential for industrial
application, since they can be produced in large scale, via fermentative processes.
However, the production of these requires the isolation and identification of
microorganisms capable of efficiently producing the bioproduct of interest. The
objective of this work was to obtain the evaluation of the enzymatic activity and
characterization of the tannase produced by Fusarium sp. and Aspergillus sp. isolated
from the coffee husk. The strains were grown under submerged fermentation using
mineral medium supplemented with 1% tannic acid at 28 ° C and 180 rpm for 10 days.
At 24 hour intervals the samples were collected to obtain the crude enzyme extract.

181
Quantification was done using the modified protein precipitation technique and the
supernatant was read at 260 nm. One unit of enzyme tannase is equivalent to 1
μmol.mL-1 min-1 of gallic acid. From the results obtained it was observed that,
Fusarium sp. showed a tanase activity of 1.5 ± 0.032 U / mL after 8 days of
fermentation, while Aspergillus sp. reached a maximum value of 1.2 ± 0.003 U / mL
after 5 days. Finally, the enzyme characterization was performed against different pH
and temperature variations of the best yield strain, obtaining a better tanase yield of 1.88
± 0.009 U / mL at ideal pH 5.0 and 1.61 ± 0.019U / ML at 40 ° C. Therefore, it is
concluded that such fungi present a promising potential for the production of the
tannase, used in different biotechnological processes industries.

Keywords: Tannase, Coffee husk, Fusarium sp., Aspergillus sp.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Diversas técnicas e produtos biotecnológicos vem possuindo aplicações nas mais
diferentes áreas como a da saúde, indústria, ambiente e agropecuária. As enzimas, por
exemplo, são excelentes bioprodutos que podem ser originados dos mais diversos tipos
de animais, vegetais e micro-organismos, sendo utilizados nos mais variados processos
biológicos existentes. A tanase mais especificamente é uma enzima que hidrolisa ésteres
e ligações laterais de taninos hidrolisáveis, como o ácido tânico, gerando glicose e ácido
gálico (Battestin, 2004).
Na natureza encontra-se uma ampla gama de fungos capazes de produzir
enzimas de interesse biotecnológico, tais fungos permitem o isolamento e seleção de
linhagens fúngicas com grande potencial biotecnológico. Dessa forma, o objetivo deste
trabalho foi a avaliação da atividade enzimática da tanase produzida por fungos
filamentosos isolados a partir da casca de café, bem como a caracterização da mesma
frente a diferentes valores de pH e temperatura.

MATERIAL E MÉTODOS

Produção de extratos enzimáticos por fermentação submersa

As colônias dos fungos previamente isolados e inoculados em placas foram
inoculados retirando discos com diâmetros de 7 mm de cada placa e colocados em
erlenmeyers de 250 mL contendo 100 mL de meio líquido mineral e ácido tânico 1%
(p/v) como única fonte de carbono. O meio mineral foi composto de KH2PO4 0,7%
(p/v), NaH2PO4 0,4% (p/v), MgSO4 0,02% (p/v), (NH4)2SO4 0,1% (p/v) e extrato de
levedura 0,06% (p/v) o qual foi previamente autoclavado a 120 atm. por 15 min. Os
frascos foram colocados em um agitador sob temperatura de 28 ºC e rotação de 180

182
rpm. As amostras da fermentação foram coletadas com o auxílio de uma micropipeta,
em intervalos de, aproximadamente, 24h durante 10 dias de fermentação. As mesmas
foram transferidas para um microtubo tipo eppendorf, e centrifugadas a 10.000 xg
durante 5 min. O extrato enzimático bruto foi obtido a partir do sobrenadante e
encaminhado para análise posterior.

Quantificação da atividade da enzima tanase

A atividade tanásica dos extratos enzimáticos brutos foi quantificada utilizando a
técnica de precipitação de proteína modificada (Deschamps; Otuk; Lebeault, 1983). A
mistura da reação foi formada por 250 μL de ácido tânico 1% (p/v) e 250μL do extrato
enzimático da cultura em tampão de fosfato de pH 6,0. A mistura foi incubada a 40◦C
durante 30 min em um banho Maria. A reação foi parada adicionando uma solução de 1
mL de 2% (c/v) de albumina de soro bovino (BSA) antes da incubação. Todos os tubos
foram conservados à temperatura ambiente por 20 min e centrifugados a 3.000 xg
durante 20 min. Posteriormente, a leitura da absorbância do sobrenadante foi feita em
espectrofotômetro (Bioespectro SP 22®), a 260 nm. As concentrações do ácido gálico,
produzido pela hidrólise do ácido tânico, foram calculadas utilizando uma curva padrão
de ácido gálico previamente construída. Uma unidade de enzima (U) corresponde a
liberação de 1 µmol de ácido gálico por mL por min sob condições padrões de ensaio.
Todos os experimentos foram realizados em duplicata.

Caracterização da enzima tanase produzida pelos fungos isolados.

Efeito do pH e temperatura na atividade enzimática
A especificidade da enzima foi estudada frente a diferentes valores de pH entre
4,0 e 8,0. A variação do pH foi realizada utilizando os tampões fosfato-fosfato a 0,2M
para a caracterização da enzima. O ensaio foi realizado conforme descrito no item da
quantificação da enzima, alterando apenas o pH do tampão na qual o ensaio foi
incubado.
Por sua vez, a atividade da enzima tanase foi avaliada nas temperaturas de 30 a
60°C. Analogamente, o ensaio foi realizado conforme descrito no item da quantificação
da enzima, alterando apenas a temperatura na qual o ensaio foi incubado.

183
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O método da fermentação submersa foi utilizado para os estudos cinéticos, tendo
como parâmetros o crescimento celular e a quantidade de enzima produzida pelos
microrganismos. Iniciou-se o experimento determinando a atividade da enzima tanase
dos fungos Fusarium sp. e Aspergillus sp. presentes no meio de crescimento. No perfil
da curva de crescimento dos fungos (Figuras 1), observa-se uma rápida adaptação dos
mesmos no meio líquido enriquecido com ácido tânico 1%.

Figura 1: Produção de tanase por Fusarium sp. e Aspergillus sp. em função do

tempo de cultivo.

Segundo a Figura 1 observou-se que, a produção da enzima tanase pelo fungo

Fusarium sp. foi máxima após 8 dias de fermentação, sendo que a sua atividade
enzimática foi de 1,5±0,032 U/mL. Da mesma forma, a máxima atividade de tanase
produzida pelo fungo Aspergillus sp. foi alcançada após 5 dias do cultivo, apresentando
um valor de 1,2 ± 0,003 U/mL. A partir dos resultados obtidos observou-se que, o
fungo Fusarium sp. obteve uma atividade tanásica 25% maior que a atividade máxima
observada no caso do fungo Fusarium sp.
Conforme apresentado pela literatura, Riul, (2011) relatou que os fungos que
apresentaram maiores produções enzimáticas extracelulares foram Aspergillus phoenicis
com 0,42 U/mL e Aspergillus ochraceus com 0,39 U/mL. Segundo Costa, (2012)
Aspergillus sp. apresentou por fermentação em estado sólido atividade de 1,44 U/mL
em folhas de jamum e 0,36 U/mL em casca de café.
Posteriormente foi feito a caracterização enzimática do fungo de gênero

184
Fusarium sp., a cepa que mostrou uma melhor produção da enzima tanase. Os dados
obtidos sob diferentes valores de pH e temperatura nos ensaios estão representados na
Tabela 1.

Tabela 1: Atividade enzimática da tanase obtida a partir do fungo Fusarium sp. em diferentes
valores de pH e temperatura.
pH Atividade Tanásica (U/mL) Temperatura (ºC) Atividade tanásica (U/mL)
4 1,14±0,013 30 1,44±0,006
5 1,88±0,009 40 1,61±0,019
6 1,50±0,011 50 1,40±0,021
7 0,96±0,019 60 1,36±0,012
8 0,89±0,023

A Figura 2 descreve a influência do pH e temperatura na atividade enzimática da

tanase.

Figura 2: Caracterização da tanase em distintas variações de temperatura e pH, respectivamente.

Pode-se observar analisando a Tabela 1 e a Figura 2, que a enzima tanase

presente no extrato enzimático apresentou atividades máximas de 1,88 ± 0,009 U/mL e
1,61 ± 0,019 U/mL em pH ótimo de 5,0 e temperatura ótima de 40°C, respectivamente.
Segundo Lekha e Lonsane (1997), as tanases são proteínas ácidas com pH ótimo
em torno de 5,5. Da mesma forma Sabu et al. (2005) também descreveram um pH ótimo
inicial de 5,5 para a produção de tanase por Aspergillus niger ATCC 16620. Por sua
vez, em relação a temperatura, Pinto (2003) observou temperatura ótima entre 32 e 40ºC
utilizando Aspergillus niger 3T5B8. Da mesma forma, uma temperatura ótima de 40ºC

185
foi observada em Aspergillus caespitosum, Penicillium charlesii e Penicillium
crustosum.

CONCLUSÕES
Conclui-se que os fungos Fusarium sp. e Aspergillus sp., isolados de uma fonte
lignocelulósica, a casca de café, apresentaram uma atividade tanásica promissora após 8
e 5 dias de cultivo, com atividade tanásica de 1,5±0,032 e 1,2±0,003 U/mL
respectivamente. Visando alcançar condições ótimas de atividade, a caracterização da
enzima em estudo exibiu pH ótimo de 5,0 com atividade de 1,88±0,009 U/mL e
temperatura de 40ºC com atividade de 1,61 ±0,019 U/mL.

REFERÊNCIAS

BATTESTIN, V., 2004. Produção, purificação, caracterização e aplicação da tanase

de Paecilomyces Variotii. Campinas. Universidade Estadual de Campinas. 99 p. Tese de
Doutorado em processos enzimáticos.

COSTA, P. N., 2012. Otimização da produção de tanase por Aspergillus sp. em

fermentação em estado sólido (FES). Lavras. Universidade Federal de Lavras. 73 p.
Dissertação de mestrado em enzimologia.

DESCHAMP, A., OTUK, G. and LEBEAULT, J. 1983. Production of tannase and

degradation of chestnut tannin by bacteria. J. Ferment. Technol. 61, 55-59. Available
from: http:// scielo.br/scielo.php?script=sci_nlinks&ref=000074&pid=S1516-
8913199900030001400007&lng=en

RIUL, A. J., 2011. Purificação e Caracterização Bioquímica de Tanases Produzidas

pelo Fungo Filamentoso Aspergillus phoenicis. Araraquara. Universidade Estadual
Paulista 116 p. Dissertação de Mestrado em biotecnologia.

LEKHA, P.K.; LONSANE, B.K., 1997. Production and application of tannin acyl
hydrolase: state of the art. Advances in Applied Microbiology, v. 44. 215-260 p.

PINTO, G.A.S., 2003 Produção de tanase por Aspergillus niger. Rio de Janeiro.
Universidade Federal do Rio de Janeiro. 208 p. Tese de Doutorado em Tecnologia de
Processos Químicos e Bioquímicos.

186
 Produção de β-Glicosidase por bactérias das amêndoas do
Theobroma cacao.

Jean Maurício Leão Pinheiro1; Gyorgy Ronaldo Sampaio Ferreira2; Claudio David Mendes Gibson3*
José Messias Perdigão do Santos Junior4;

1
Universidade Federal do Pará. [email protected]
2
Universidade Federal do Rio de Janeiro.
3
Universidade da Amazônia.
4
Universidase Federal do Pará

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Atualmente pouco se tem conhecimento da detecção de enzima β-glicosidase utilizando
o cacau (Theobroma cacao) como fonte. O objetivo dessa trabalho é avaliar o potencial
biotecnológico das bactérias lácticas do cacau de diferente mesorregiões do estado do
Pará e fazer a detecção da enzima de diferentes tempos de fermentação. Para o
isolamento bacteriano utilizou-se amostras do 2º ao 7º dia de fermentação e a
inoculação foi realizada em meio de cultura seletivo MRS ágar 36ºC/48h. Após o
isolamento foram realizados testes de Gram e catalase para caracterização da bactérias.
Para a detecção da enzima, transferiu-se a colônias para placas de Petri contendo LB
ágar com 0,1% de esculina sesquihidratada, 0,05% de citrato de ferro (III) amoniacal e
2% de ágar. A cada 24h era analisado a produção de enzima, que se dá pela formação de
um halo negro envolta da colônia bacteriana, devido a hidrolise da esculina. Apenas
28,8% das colônias achadas, produziram o halo de BGL sendo a bactéria de número 59
de maior halo, com 6,4 cm de diâmetro.

Palavras-chave: cacau, enzima, forasteiro, biotecnologia.

______________________________________________________________________________________________

Detection of β-Glycosidase produced by bacteria isolated during the fermentation

of Theobroma cacao almond.
ABSTRACT
Currently little is known about the detection of β-glucosidase enzyme using cocoa
(Theobroma cacao) as the source. The objective of this work is to evaluate the
biotechnological potential of the lactic acid bacteria of cacao from different

187
mesoregions of the state of Pará and to detect the enzyme of different fermentation
times. For the bacterial isolation samples were used from the 2nd to the 7th day of
fermentation and the inoculation was carried out in medium of selective culture MRS
agar 36ºC / 48h. After isolation, Gram and catalase tests were performed to characterize
the bacteria. For detection of the enzyme, colonies were transferred to Petri dishes
containing LB agar with 0.1% sesquihydrate esculin, 0.05% ammoniacal iron (III)
citrate and 2% agar. Every 24 hours the production of enzyme was analyzed, which
occurs by the formation of a black halo enveloped by the bacterial colony, due to the
hydrolysis of esculin. Only 28.8% of the colonies found produced the halo of BGL
being the bacterium of number 59 of greater halo, with 6.4 cm of diameter.

Keywords: cocoa, enzyme, forasteiro, biotechnology

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
As bactérias lácticas na fermentação do cacau, são resposnsaveis por degradar o
açúcar da polpa e converter ácido citrico e málico em ácido láctico (Mozzi et al., 2010).
E são constituidas por um grupo de bactérias gram positivas, na forma de cocos ou
bacilos, catalase negativa não patogênica e anaeróbias facultativas (Axelsson, 2004)
A β-Glicosidase (β-D-gluciside glucohidrolase, EC 3.2.1.21) pode ser
encontrada em bactérias, fungos, plantas e animais. Esta enzima exerce funções
fundamentais em muitos processos biológicos. Em microorganismos celulolíticos, o
BGL está envolvido na indução da celulase e na hidrólise da celulose (Tomme et al.,
1995). Normalmente, todos os microorganismos celulolíticos são produtores de β-
Glicosidases. A BGL possuem ampla especificidade de substrato e exercem papéis
indispensáveis à natureza, incluindo a fragmentação de flavonóides glicosilados em
plantas (Singhania and Patel, 2017).
O presente trabalho teve como objetivo isolar as bactérias encontradas nas
amêndoas de cacau de 3 regiões do Pará e em 7 dias de fermentação. A caracterização
foram segundo sua morfologia e coloração de Gram e teste de catalase e sua produção
de enzimas como a β-glicosidase em placa.

MATERIAL E MÉTODOS
Para o presente estudo foram coletados sementes de cacau da variedade
Forasteiro no período de agosto à outubro de 2015, oriundos de três municípios

188
paraenses distintos: Placas que está situado na mesorregião do Baixo Amazonas,
Medicilândia situado na mesorregião da Transamazônica e Tomé-Açú situado na
mesorregião do Nordeste Paraense.
A Fermentação ocorreu logo após a quebra dos frutos de cacau e remoção das
sementes e da polpa. Em seguida a polpa foi homogeneizada de forma manual para
obter a massa de cacau. Após esse processo, preencheu-se o local de fermentação
comumente conhecido como cocho, onde ocorreu a fermentação por uma semana.
Realizaram-se as retiradas de 300g de amostras em todos os dias de fermentação
de forma asséptica e armazenadas embalagem de plástico estéril sob refrigeração a -
18°C. Porém o primeiro revolvimento ocorreu a partir 48 horas de fermentação para
escoação do mel e aeração.
TABELA 1. Tempo de fermentação
Revolvimento Descrição Fermentação
1° 48 h após o preenchimento do cocho 3° dia
2° 24 h após o primeiro revolvimento 4° dia
3° 24 h após o segundo revolvimento 5° dia
4° 24 h após o terceiro revolvimento 6° dia
5° 24 h após o quarto revolvimento 7° dia
Fonte: elaborado pelo autor
Após a realização das 7 coletas de diferentes dias de fermentação, a amostra foi
transportada até Belém-PA e as análises foram desenvolvidas no Centro de Valorização
Agroalimentar e Compostos Bioativos da Amazônia (CVACBA).
Para o isolamento das bactérias ácido lácticas, foram necessário 25g do cacau e
se realizou a diluição seriada até 10-7 e em seguida, aplicou-se a técnica de semeadura
por superfície em meio ágar MRS transferindo-se 0,1 ml de cada diluição e
homogeneizada com alça de Drigalski. Para a incubação, utilizou-se jarras de
anaerobiose onde se armazenou as placas de Petri com o meio MRS Ágar e juntamente
com o kit de anaerobiose à 36 °C por 48h. (Papalexandratou et al., 2011).
Coloração diferencial de Gram. Preparou-se um esfregaço da cultura da seguinte
forma: Sobre uma lâmina de vidro colocou-se uma gota da solução de água glicerinada
à 10%, onde emulsionou-se uma alçada da colônia com o auxílio da alça de platina. A
fixação é feita passando a lâmina de brevemente sobre a chama do bico de Bünsen até
secar (Silva et al., 2001).

189
 Gram Negativa – As células são descolorizadas por solução de álcool-acetona e
assumem uma cor rosa à cor vermelha contrastada com o corante safranina. Gram
Positiva – As células retêm o corante cristal violeta e permanecem roxas a azul-escuro
(Woodland, 2004).

O Teste de catalase foi realizado, retirando-se as colônias com auxílio de uma alça
metálica e homogeneizar em solução de Peróxido de Hidrogênio (H2O2) a 3% (v/v) em
uma lâmina de vidro. Formação de bolhas de gás indica reação de catalase positiva, isso
acontece quando o oxigênio molecular é libertado na reação. As bactérias lácticas não
reagem com o Peróxido de Hidrogênio, isto é, não possuem a enzima catalase (Peh and
Pyah, 2014).

Para a detecção de bactérias produtoras de β-Glicosidase. Após o

isolamentos das colônias, transferindo do meio MRS e inoculando em placas de Petri
contendo ágar LB (Luria-Bertani). A composição do meio incluiu 0,1% de esculina
sesquihidratada, 0,05% de citrato de ferro (III) amoniacal e 2% de ágar. Em seguida,
para o crescimento bacteriano, as placas foram incubadas em estufa à temperatura de
36º C. A produção de BGL é identificada pelo surgimento de halo escuro ao redor da
colônia. Isso se deve à clivagem enzimática da esculina, conforme a reação ilustrada na
figura 1. A avaliação do desenvolvimento da colônia e formação de halo foi realizada a
cada 24 horas de incubação.

FIGURA 1. Reação de hidrólise da Esculina, aplicada para detecção de atividade

enzimática da β-glicosidase.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Das 52 colônias encontradas, apenas 15 colônias (28,8%) distribuídas em 3
municípios diferente, hidrolisaram a esculina e evidenciada através dos halos de β-
glicosidases, no qual mediu-se o diâmetro. As tabelas 2, 3 e 4 mostram a detecção de
halo da enzima das 3 regiões distintas, produzidas por bactérias do cacau. De todos os

190
halos formados a maioria foi por bactéria com o formato de bacilo e apenas uma com o
formato cocos.
TABELA 2. Município de Tomé-Açú
Dia de MO Catalase Gram Morfologia Crescimento BGL
fermentação (horas) (cm)
3º 3 - + Bacilo 48 2,1
4 - + Bacilo 24 2,3
4º 10 + - Bacilo 48 2,6
18 + - Cocos 48 1,3

TABELA 3. Município de Medicilância

Dia de MO Catalase Gram Morfologia Crescimento BGL
fermentação (horas) (cm)
2º 31 - + Bacilo 48 1,5
32 - + Bacilo 24 1,5
33 - + Bacilo 24 1,3
36 - + Bacilo 48 1,5
37 - + Bacilo 48 2,2
4º 42 - + Bacilo 24 3,6

TABELA 4. Município de Placas

Dia de MO Catalase Gram Morfologia Crescimento BGL
fermentação (horas) (cm)
4º 59 - + Bacilo 24 6,4
60 - + Bacilo 24 3,1
61 - + Bacilo 24 1,7
7º 75 - + Bacilo 24 2,5
76 - + Bacilo 24 2,3

Todas as regiões tiveram bactérias formadoras de BGL no 4º dia de fermentação

do cacau. Em relação a coloração de Gram, a maioria encontrada foi de Gram negativo
e o formato de bacilo, sendo características de Lactobacillus. A bactéria de número 59
demonstrou ser excelente produtora da enzima BGL, onde, em 24 horas produziu um
halo de 6,4 cm de enzima, evidenciado na figura 2.
FIGURA 2. Presença/ausência da hidrolise da esculina

191
CONCLUSÕES
Atualmente existem poucos estudos que avaliem a produção da enzima BGL por
bactérias ácido lácticas ou que associem a produção dessa enzima com o cacau.
De acordo com os resultados, demonstrou-se ter potência biotecnológico e sendo
possível produzir a enzima β-Glicosidase a partir de bactérias ácido-lácticas do cacau.
Sendo essa por sua vez, uma bactéria muito resistente a pH baixos.

REFERÊNCIAS
AXELSSON, L., 2004. Lactic acid bacteria: classification and physiology. In:
SALMINEN, S; LAHTINEN, S.; OUWEHAND A.C. and WRIGHT A.V. Lactic acid
bacteria: microbiology and functional aspects. New York: Marcel Decker. 30 p.
MOZZI F., RAYA R. R. and VIGNOLO G. M., 2010. Biotechnology of lactic acid
bacteria: novel applications. Wiley-Blackwell, Ames, IA. 383 p.
PEH, K. K and PYAR, H., 2013. Characterization and identification of (Lactobacillus
acidophilus) using biolog rapid identification system. International Journal of
Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 6v. pp. 189-193.
PAPALEXANDRATOU, Z. VRANCKEN, G. and DE VUYST, L., 2011. Spontaneous
organic cocoa bean box fermentations in Brazil are characterized by a restricted
species diversity of lactic acid bacteria and acetic acid bacteria. Food Microbiol. pp.
964-973.
SILVA, N; JUNQUEIRA, V. C. A and SILVEIRA, N. F. A.,2001. Manual de métodos
de analises microbiológicas de alimentos. São Paulo: Editora Varela, 2 ed. 317 p.
SINGHANIA, R.R and PATEL, A.K., 2017. Capítulo 5: Industrial Enzymes: b-
Glucosidases. In. Current Developmentsin Biotechnology and Bioengineering. Edited
by Ashok Pandey, Sangeeta Negi. The Boulevard, Langford Lane, Kidlington, Oxford
OX, United Kingdom.
TOMME P.R; WARREN A.J. and GILKES N.R., 1995. Cellulose hydrolysis by
bacteria and fungi. Advances in Microbial Physiology.
WOODLAN, J., 2004. Bacteriology – chapter 5. in NWFHS Laboratory Procedures
Manual, 2ed. pp. 1 – 44.

192
 Avaliação da atividade dos metabólitos secundários contra
Xanthomonas vesicatoria

Jelena Purić1; Morao, L. G.1; Inforsato, F. J. 1; Sette, L. D. 1; Ferreira, H. 1; Vieira, M.L.C.2; Santos, A.
M.1; Sass, D. C.1*

1
Departamento de Bioquímica e Microbiologia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”, São Paulo, Brasil. 2Departamento de Genética Molecular de Plantas e Biotecnologia, Escola
Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, USP, São Paulo, Brasil. *e-mail: [email protected]

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RESUMO
A mancha bacteriana, causada por Xanthomonas vesicatoria é uma das doenças mais
importantes da cultura do tomate. O controle químico da mancha bacteriana tem sido
feito com antibióticos para uso em agricultura e produtos à base de cobre. No entanto,
vários relatos apontam para a baixa eficiência dos mesmos, tendo como uma possível
causa o aparecimento de indivíduos resistentes nas populações bacterianas, assim como
a acumulação de material químico no ambiente, e consequentemente perdas de área
plantada. Uma alternativa no controle da X. vesicatoria é a descoberta de novos
compostos produzidos por fungos isolados de sedimentos marinhos da Antártica. Nesse
sentido, os metabólitos secundários foram obtidos utilizando 39 fungos filamentosos
isolados de sedimentos marinhos da Antártica com potencial atividade contra X.
vesicatoria. Os fungos foram inoculados nos frascos Erlenmeyer contendo 2% de meio
líquido de malte e mantidos durante 20 dias sob agitação constante (150 rpm) a 15°C. A
biomassa microbiana e o sobrenadante foram separados. O sobrenadante foi submetido
a extracção líquido-líquido com acetato de etila para extração de metabolitos
secundários extracelulares. A fracção orgânica foi concentrada e submetida a bioensaio
contra X. vesicatoria, utilizando o ensaio em microplaca com resazurina (REMA). A
partir dos dados obtidos nesta análise, foi determinado que 8 amostras apresentaram
atividade significativa contra a bactéria, com uma percentagem média de inibição do
crescimento bacteriano de 96,12%, superior ao controle positivo utilizado no teste
(Canamicina) que foi de 94,02%.

Palavras-chave: Metabólitos secundário, mancha bacteriana, tomate, bioatividade.

______________________________________________________________________________________________

Secondary metabolites produced by fungi from Antartica and evaluation of

activity against Xanthomonas vesicatoria

ABSTRACT
The bacterial spot caused by Xanthomonas vesicatoria is one of the most important
diseases of the tomato crop. Chemical control of the bacterial spot has been made with

193
antibiotics for use in agriculture and copper-based products. However, several reports
point to the low efficiency of the same, having as a possible cause the emergence of
resistant individuals in bacterial populations, as well as the accumulation of chemical
material in the environment, and consequently losses of planted area. An alternative in
the control of X. vesicatoria is the discovery of new compounds produced by fungi
isolated from Antarctic marine sediments. In this sense, secondary metabolites were
obtained using 39 filamentous fungi isolated from Antarctic marine sediments with
potential activity against X. vesicatoria. The fungi were inoculated into Erlenmeyer
flasks containing 2% malt liquid medium and kept for 20 days under constant stirring
(150 rpm) at 15°C. The microbial biomass and the supernatant were separated. The
supernatant was subjected to liquid-liquid extraction with ethyl acetate for extraction of
extracellular secondary metabolites. The organic fraction was concentrated and
submitted to bioassay against X. vesicatoria using the resazurin microplate assay
(REMA). From the data obtained in this analysis, it was determined that 8 samples
presented significant activity against the bacterium, with a mean percentage of
inhibition of bacterial growth of 96.12%, higher than the positive control used in the test
(Kanamycin), which was 94, 02%.

Keywords: Secondary metabolites, bacterial spot, tomato, bioactivity.

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INTRODUÇÃO
Xanthomonas são bactérias Gram-negativas fitopatogênicas distribuídas
mundialmente e são responsáveis por doenças em diversas espécies vegetais
economicamente importantes (Ryan et al., 2011; Rodriguez et al., 2012). Espécies do
gênero Xanthomonas podem ser facilmente espalhadas em água, pela movimentação de
material infectado, tais como sementes ou plantas de propagação, e por meios
mecânicos, tais como ferramentas de poda infectados. Ao entrar em contacto com um
hospedeiro suscetível, as bactérias entram através de feridas ou aberturas naturais das
plantas, como um modo para infectar (Ritchie, 2002). No Brasil muitas doenças
causadas por bactérias fitopatogênicas do gênero Xanthomonas afetam culturas de
grande importância econômica e social tais como: citros, mandioca, tomate, feijão,
maracujá, cana-de-açúcar (Ryan et al., 2011; Rodriguez et al., 2012).
A mancha bacteriana, causada por X. vesicatoria é uma das doenças mais
importantes da cultura do tomate para o processamento industrial no Brasil (Malavolta
Junior, 2004). Esta doença tem causado grandes perdas no cultivo do tomate reduzindo
a produtividade pela destruição de tecido foliar e pela derrubada de frutos em formação,
além de comprometer a qualidade e o valor comercial dos frutos (Lopes e Quezado-
Soares, 2000).
O controle químico da mancha bacteriana tem sido feito com antibióticos para
uso em agricultura e produtos à base de cobre (Lopes e Quezado-Soares, 2000). No

194
entanto, vários relatos apontam para a baixa eficiência dos mesmos, tendo como uma
possível causa o aparecimento de indivíduos resistentes nas populações bacterianas
(Nascimento et al. 2013), assim como a acumulação de material químico no ambiente, e
consequentemente perdas de área plantada.
Considerando a necessidade atual de novas alternativas no controle a X.
vesicatoria que visam substituir os produtos químicos ao mesmo tempo minimizar
danos ao meio ambiente.
A adaptabilidade dos fungos às condições oceânicas na Antártica pode ser
considerada um ponto de interesse no campo da biotecnologia marinha, uma vez que as
condições nestes ambientes extremos podem contribuir para a descoberta de moléculas
ainda desconhecida produzidas por esses micro-organismos.
O conhecimento da sua diversidade fúngica e o potencial biotecnológico destes
micro-organismos são de extrema relevância e estratégico para o conhecimento da
dinâmica dos ecossistemas antárticos e para a obtenção de compostos naturais de valor
agregado (Pikuta et al., 2007). Dessa maneira o presente trabalho apresenta a obtenção
de metabólitos secundários produzidos por fungos isolados de sedimentos marinhos da
Antártica e avaliação antibacteriana destes metabólitos contra a bactéria X. vesicatoria,
causadora da mancha bacteriana no tomate.

MATERIAL E MÉTODOS
Neste trabalho foram utilizados 39 fungos filamentosos isolados de sedimentos
marinhos coletados na Antártica. Os fungos foram replicados em placas de Petri
contendo meio malte 2% e incubados em B.O.D. à 15ºC por 10 dias e transferidos para
frascos Erlenmeyer contendo o meio líquido malte 2% e foram mantidos pelo período
de 20 dias em agitação constante (150 rpm) a 15ºC.
Após crescimento fúngico, a biomassa microbiana e o sobrenadante (meio
metabólico) foram separados. O sobrenadante foi submetido à extração líquido-líquido
com acetato de etila para extração de metabólitos secundários extracelulares. Após a
evaporação do solvente da fração orgânica, as amostras (extratos extracelulares) foram
submetidas aos bioensaios contra a bactéria X. vesicatoria.

O bioensaio antibacteriano foi realizado empregando o ensaio em microplaca de

96 poços com resazurina (REMA) (Silva e Ferreira, 2013). Para controle do veículo foi
utilizado dimetilsulfóxido 1%, controle positivo a Canamicina e controle negativo

195
apenas inóculo. Nos demais poços foram testados diferentes concentrações dos extratos.
A inibição do crescimento bacteriano foi medida através da emissão fluorescência
ocasionada pela transformação da resazurina em resorufina, sendo que os dados foram
obtidos pelo espectrofotômetro de fluorescência. Todos os testes foram realizados em
triplicata.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Conforme descrito em materiais e métodos foram produzidos extratos
extracelulares de 39 fungos. Estes extratos foram submetidos ao bioensaio, a fim de
verificar qual dos extratos apresentava atividade antibacteriana contra a X. vesicatoria.
Os resultados obtidos mostraram que dos 39 extratos testados 9 apresentaram uma
porcentagem média de inibição do crescimento bacteriano maior que 90%, como pode
ser observado na Tabela 1, que apresenta as porcentagens de inibição do crescimento de
X. vesicatoria obtidas para os 9 extratos bioativos na concentração de 3,0 mg/mL.

Tabela 1. Porcentagem de inibição do crescimento bacteriano dos extratos bioativos

Código do Média de inibição de
fungo células (%)
2B-1C115IIII 95,82
4A-1C115IIII 94,70
3A-1C315IIII 97,03
2A-1C1III 96,35
6DC415I 96,08
3A-1C215IIIIC 97,81
2D-3C115IIII 96,98
6DC215IIII 94,24
5B-1C315IIII 94,01

Observando a Figura 1, que apresenta a média de inibição de células (%)

obtidas pelos extratos em relação à média de inibição de células do controle positivo
(%), é possível verificar também que 8 extratos apresentaram porcentagens de inibição
maior que o controle positivo que foi de 94,02%.

196
Figura 1. Média de inibição celular (%) dos extratos bioativos em relação com a média
de inibição celular do controle positivo.

CONCLUSÕES
Dentre os 39 extratos extracelulares estudados 9 produziram atividade
significativa contra X. vesicatoria e 8 extratos apresentaram inibição do crescimento de
X. vesicatoria maior que o controle positivo.
Considerando que a composição dos extratos não foi ainda identificada, os
resultados obtidos revelam quais extratos contém compostos químicos potencialmente
ativos contra X. vesicatoria.

REFERÊNCIAS
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198
 Diversidade bacteriana do solo após desastre ambiental em
Mariana, Minas Gerais.
João Paulo Campos Moura Cavalcante1*; Helena Lima Santiago¹; Lívia Fidelis Carneiro Silva¹; Marliane
Cássia Soares da Silva²; Maria Catarina Megumi Kasuya²; Marcos Rogério Tótola³, Cynthia Canêdo da
Silva4
1
Laboratório de Genética Molecular de Bactérias – (LGMB/BIOAGRO), Universidade Federal de Viçosa
(UFV). *[email protected],.
2
Laboratório de Associações Micorrízicas (BIOAGRO), UFV.
³ Laboratório de Biodiversidade e Biotecnologia para o Meio Ambiente (LBBMA), UFV.
4
Professora Orientadora, Departamento de Microbiologia (DMB) – LGMB/BIOAGRO, UFV.
__________________________________________________________________________________________

RESUMO
O rompimento da barragem de rejeitos de mineração de ferro em Mariana (MG),
resultou em um dos maiores desastres ambientais no Brasil. Aproximadamente 60
milhões de metros cúbicos de rejeitos de mineração foram liberados na bacia do Rio
Doce causando uma série de impactos diretos e indiretos ao longo de 663 Km. Até o
momento, a comunidade microbiana presente nas regiões foi pouco abordada em
estudos. O objetivo deste trabalho foi avaliar se a diversidade bacteriana e indicadores
químicos do solo foram alterados após o desastre ambiental. A coleta de amostras de
solo foi realizada no distrito de Paracatu de Baixo, município de Mariana, em áreas
afetadas pela onda de rejeitos e em áreas de mata natural. Após a extração do DNA
realizou-se o sequenciamento da região do gene RNAr 16S pela plataforma Illumina
Mi-seq. Os dados obtidos foram analisados utilizando-se Uchime, MG-RAST e PAST.
Houve significativa redução da diversidade bacteriana nas regiões afetadas em
comparação com as regiões de mata natural e alterações em padrões químicos do solo.

Palavras-chave: Rejeito de mineração; Metagenômica; Impacto ambiental; Shannon;

__________________________________________________________________________________________

Bacterial diversity in soils after environmental disaster in Mariana, Minas Gerais.

ABSTRACT

The colapse of the iron tailings dam in Mariana (MG), resulted in one of the biggest
environmental disasters in Brazil. Approximately 60 million cubic meters of mining
tailings were released in the Rio Doce basin causing a series of direct and indirect
impacts along 663 km. Until now, the microbial community present in the regions was
little studied. The aim of this study was to evaluate if the bacterial diversity and and the
chemistry parameter was changed after the environmental disaster. Soil samples were
collected in the district of Paracatu de Baixo, Mariana, in regions affected by the tailings
wave and in natural forest areas. After DNA extraction, the 16S RNAr gene region was
sequenced by the Illumina Mi-seq platform. The data obtained were analyzed using
Uchime, MG-RAST and PAST. There was a significant reduction of bacterial diversity
in the affected regions compared to natural forest regions and changes in soil chemical
patterns were observed
Keywords: Mine tailings; Metagenomics; environmental impact; Shannon;
___________________________________________________________________________________________

199
INTRODUÇÃO
O rompimento da barragem de rejeitos de mineração de ferro no município de
Mariana (MG) ocasionou um dos piores desastres ambientais já ocorridos no Brasil. A
onda de rejeitos de mineração de aproximadamente 60 milhões m³ liberada na bacia
hidrográfica do Rio Doce destruiu por completo dois distritos resultando em 19 mortes,
a remoção de mais de 1619 hectares de mata atlântica nativa, entre outros impactos
diretos e indiretos ao longo dos 663 Km percorridos (IBAMA., 2015).
Desde o rompimento, diversas medidas foram adotadas para a avaliação dos
impactos causados pelo rompimento como forma de buscar subsídios para a
implementação de programas de recuperação frente ao passivo ambiental deixado.
Entretanto, muito pouco tem se abordado sobre a comunidade microbiana dos solos nas
regiões afetadas, conhecimento este que pode ser essencial para o sucesso de programas
de revegetação e recuperação dos ecossistemas. O objetivo deste trabalho foi avaliar se
a diversidade bacteriana e indicadores químicos do solo foram alterados após o desastre
ambiental.
MATERIAL E MÉTODOS
A coleta de amostras de solo foi realizada no dia 3 de março de 2016, distrito de
Paracatu de Baixo, município de Mariana, zona da mata do estado de Minas Gerais e
segundo distrito afetado pela onda de rejeitos. Duas áreas foram escolhidas para a
coleta, uma de mata natural e outra área anteriormente de mata natural mas que teve a
sua vegetação removida pela onda de rejeitos.
A amostragem foi realizada segundo Faoro et al. (2010) e Li et al. (2015) com
algumas modificações. Foram realizados transeptos de 50 metros, coletando três
amostras compostas, numa profundidade de 0 a 15 cm com aproximadamente 0,5 Kg.
As amostras foram acondicionadas em sacos plásticos, armazenadas sob refrigeração e
levadas ao laboratório onde foram peneiras e armazenadas. Cada ponto de amostragem
foi georreferenciado com auxílio de um aparelho GPS (Garmin).

Uma amostra composta de cada região foi utilizada para as análises das
propriedades químicas do solo, realizados nos laboratórios do Departamento de Solos
da Universidade Federal de Viçosa (UFV).

O DNA das amostras foi extraído a partir de 0,5 g de cada amostra de solo,
utilizando o Kit Nucleospin Soil (Macherey-Nagel Laboratories), de acordo com as
recomendações do fabricante. O DNA obtido foi analisado em eletroforese em gel de

200
agarose 1,0 %, visualizado em transiluminador (Applied Biosystems) e o DNA
quantificado por Nanodrop (Thermo Scientific).

O DNA extraído foi sequenciado pela plataforma Illumina Miseq após

amplificação da região V4 do gene rRNA 16S e utilizando os primers 515f-806r, ambos
os processos, de amplificação e sequenciamento, foram executados de acordo com os
protocolos propostos por Caporaso et al. (2012).

Os dados de sequenciamento obtidos pela plataforma Illimina MiSeq foram por

analisados pelas plataformas Uchime (http://www.drive5.com/) e carregados para o
servidor MG-RAST (MetaGenome Rapid Annotation using Subsystem Technology,
http://metagenomics.anl.gov/) sendo analisados pela pipeline padrão do servidor utilizando
o banco de dados SILVA (https://www.arb-silva.de/).

Índices de diversidade de Shannon, Margalef e dominância de Simpsom foram

gerados e demais análises estatísticas foram calculados através do software PAST
(HAMMER; HARPER; RYAN., 2001).

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados das análises químicas do solo mostraram um aumento de quase
sete vezes na quantidade de ferro na região na qual a onda de rejeitos passou, também
foi verificada a diminuição da matéria orgânica e o aumento do pH (Tabela 1). O
aumento do pH é conhecido fator que limita o crescimento microbiano, diminuindo a
eficiência da revegetação da área (Olivares et al., 2013). A diminuição da matéria
orgânica, pode ser explicada pois quase a totalidade da vegetação presente foi lixiviada
pela onda de rejeitos nas regiões afetadas.
Tabela 1. Resultados da análise química* das amostras de solo coletadas nas áreas que
houve deposição do rejeito e de mata natural, não afetada.
Rejeito Mata Rejeito Mata
pH (água) 7,6 6,1 Na 11 5,1
(mg/dm3)
Ca+2 (cmol/dm3) 0,5 5,1 ISNa (%) 8,39 0,31
K(mg/dm3) 7 130 M.O. 0,9 5,7
(dag/Kg)
CTC(t) 0,6 6,9 Zn 2,5 4,6
(cmol/dm3) (mg/dm3)
CTC(T) 0,6 11 Fe(mg/dm3) 129,3 18,9
(cmol/dm3)
Mg+2(cmol/dm3) 0 1,5 Mn(mg/dm) 117,5 90,9
SB(cmol/dm3) 0,6 6,9 S 4,2 26,9
* Métodos de análise: P-Na-K-Fe-Zn-Mn-Cu, extrator Mehlich I; pH em água; B-extrator de água quente, SB – soma das bases
trocáveis, H + Al – Extrator Acetato de cálcio 0,5 mol/L; Ca-Mg-Al, extrator KCl 1 mol/L; V= índice de saturação de bases, ISNa –

201
índice de saturação de sódio; M.O- Matéria orgânica, oxidação de Na2 Cr2 4N + H2SO4; P-rem=fósforo remanescente; S- extrator
fosforo monocálcico em ácido acético.

A diversidade dos micro-organismos avaliada através do sequenciamento do

gene RNAr 16S foi avaliada a partir dos índices de diversidade de Shannon, Margalef e
dominância de Simpson com três amostras para as regiões de mata natural e rejeito,
sendo utilizado o nível de OTU (Unidade taxonômica operacional) (Tabela 2). Como
esperado, o teste “T de diversidade” do programa Past mostrou significativa redução da
diversidade bacteriana na área afetada pelo rejeito. Essa redução, pode ser justificada
em parte pela drástica mudança no ambiente, já que anteriormente se tratava de uma
área de mata e passou a ser uma região de solo exposto com restos de rejeito de
mineração.
O resultado aqui observado diverge do que foi observado por Segura et al.
(2016), que ao avaliar a diversidade de micro-organismos, por meio de técnicas
dependentes de cultivo, da região de Bento Rodrigues, também afetada pela onda de
rejeitos de mineração, não encontrou diferença significativa entre áreas afetadas e não
afetadas. Entretanto, nossos resultados concordam com outros trabalhos quando
concluem que a atividade mineradora reduz a diversidade microbiana, principalmente a
do Domínio Bacteria (QUADROS et al., 2016; ESCOBAR et al., 2015; Li et al., 2015).
Tabela 2. Índices de dominância de Simpson, diversidade de Shannon e Margalef por
áreas de Mata natural e área de solo exposto com rejeitos de mineração.
Solo/Rejeito Solo/Mata

Simpson 0,7992 0,891

Shannon 2,88 3,406

Margalef 37,6 39,59

A redução da diversidade microbiana pode trazer como consequência a redução

ou perda de diversos serviços ecossistêmicos como a ciclagem de nutrientes, essencial
para a recuperação de ambientes degradados como a bacia do Rio Doce (Jung et al.,
2016; Smith et al., 2015).
A análise das mudanças na região utilizando-se de técnicas moleculares de
avaliação da diversidade é uma ferramenta importante para monitoramento da
recuperação, como destacado por Mohapatra et al. (2011) e Escobar et al. (2015).
Resultados de estudos em áreas afetadas por rejeitos da atividade mineradora relatam

202
que sem intervenções, essas áreas podem levar séculos para se aproximarem de áreas
naturais conservadas. Medidas como a revegetação podem auxiliar a recuperação da
diversidade microbiana, entretanto mesmo esta pode levar entre 20 e 90 anos para fazer
com que a diversidade de micro-organismos se aproxime das áreas não afetadas (Li et
al., 2014; Quadros et al., 2016; Li et al., 2015).

CONCLUSÕES
A diversidade de bacteriana foi diminuída de maneira significativa no solo nas
regiões afetadas pelo rejeito de mineração liberado da barragem da Samarco.
AGRADECIMENTOS
À Fundação de amparo a pesquisa de Minas Gerais, FAPEMIG, pelo
financiamento das atividades do projeto “Monitoramento da diversidade microbiana e
seleção de micro-organismos para favorecer o repovoamento vegetal” do qual este
estudo faz parte. À CAPES e ao CNPQ pelo financiamento das bolsas e auxílios
recebidos pelos autores do presente estudo.
REFERÊNCIAS
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203
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p. 3532–3547.

204
Comunidade microbiana em solos com aplicação de vinhaça e
tebutiurom
João Vitor França Pirola1; Alessandra Baroni Rodrigues Neves1; Mírian Alves de Faria1; Paulo Renato
Matos Lopes1*
1
Faculdade de Ciências Agrárias e Tecnológicas, UNESP - Universidade Estadual Paulista, Câmpus de
Dracena. Rodovia Comandante João Ribeiro de Barros, km 651, CEP 17900-000, Dracena, Brasil.
*[email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
O presente trabalho avaliou o efeito da adição de vinhaça associada ao herbicida
tebutiurom na comunidade microbiana em amostras de solos cultivados com cana-de-
açúcar por manejo orgânico. Os resultados para bactérias e fungos totais revelaram o
impacto negativo em praticamente todos os tratamentos propostos pela aplicação de
tebutiurom juntamente com vinhaça em diferentes volumes. Além disso, quando
adicionados ao solo separadamente, o número de UFC para os grupos analisados
também foi reduzido em comparação à amostra controle. Portanto, concluiu-se que o
herbicida tebutiurom e a vinhaça, associados ou não, causam um impacto direto na
biomassa microbiana do solo.
Palavras-chave: Cana-de-açúcar, herbicida, manejo orgânico, micro-organismos e
resíduo.
______________________________________________________________________________________________

Microbial community in soils with vinasse and tebuthiuron application

ABSTRACT
It was evaluated the effect of vinasse addition associated with herbicide tebuthiuron in
microbial community of soils samples cultivated with sugarcane by organic
management. The results for bacteria and fungi revealed negative impact in practically
all treatments proposed by tebuthiuron application with vinasse in different volumes. In
addition, CFU number was also reduced in relation to control samples even when
vinasse and tebuthiuron were added separately. Therefore, it was concluded that the
herbicide tebuthiuron and vinasse, associated or not, have a direct impact on the soil
microbial biomass.
Keywords: Sugarcane, herbicide, organic management, microorganisms and residue.
______________________________________________________________________________________________

205
INTRODUÇÃO
A cana-de-açúcar é de suma importância para o agronegócio brasileiro, onde
ocupa uma área de 8.654 mil hectares e tendo uma produção de 665.586,2 mil toneladas
na safra 2015/16. A previsão da safra 2016/2017 é de aproximadamente 694.544,8 mil
toneladas, dentro disso tem o estado de São Paulo como maior expoente, representando
55% da produção (CONAB, 2017).
Contudo, a produção de cana-de-açúcar é afetada pela presença de plantas
daninhas. Deste modo, faz-se necessário seu controle com herbicidas, cuja utilização
aumentou atualmente pela proibição do uso de fogo na colheita (Toniêto et al., 2016).
Dentre os compostos mais aplicados no Brasil na cultura da cana-de-açúcar, encontra-se
o tebutiurom, um herbicida pré-emergente e de ação sistêmica que age sob 25 tipos de
plantas daninhas (Tomlin, 1997).
Além disso, a crescente produção de álcool combustível gerou um aumento no
volume de resíduos, visto que para cada litro de álcool, há a geração média de 13 litros
de vinhaça. Uma alternativa como destinação deste resíduo é sua aplicação na lavoura
que se denomina fertirrigação (Orlando Filho, 1981). Esta prática se deve aos benefícios
como o fornecimento de nutrientes para as plantas e o aumento da comunidade
microbiana (Camargo, 1954).
O cultivo da cana-de-açúcar geralmente é caracterizado pelo manejo
convencional, porém se observa uma crescente mundial e também nacional na utilização
do manejo orgânico para lavouras canavieiras (Evangelista et al., 2013). Neste sentido,
há diferenças nos atributos biológicos pelos diferentes sistemas de manejos que
distinguem suas qualidades como, por exemplo, a biomassa microbiana do solo (Balota
et al., 2003). Este parâmetro é sensivelmente afetado quando submetido a fatores de
estresse, refletindo em alterações na densidade, diversidade e atividade das populações
microbianas (Pankhurst and Lynch, 1994).
Portanto, o trabalho teve como finalidade avaliar o efeito da adição de vinhaça
e/ou tebutiurom na comunidade de bactérias e fungos totais em amostras de solos
cultivados com cana-de-açúcar por manejo orgânico.

MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado na Faculdade de Ciências Agrárias e Tecnológicas
(FCAT) da Universidade Estadual Paulista (UNESP), câmpus de Dracena.

206
 O solo cultivado com cana-de-açúcar e de manejo orgânico foi coletado na
fazenda Jacutinga (Planeta Verde) em Lucélia-SP. As amostras foram coletadas até no
máximo 30 cm de profundidade do perfil do solo. Posteriormente, as amostras de solo
foram peneiradas, homogeneizadas e acondicionadas em recipiente plástico.
A vinhaça foi coletada na usina sucroenergética Caeté, localizada em Paulicéia-
SP, e acondicionada em um galão plástico. Já o herbicida tebutiurom foi adquirido em
estabelecimento comercial em Dracena-SP na forma do produto comercial
Combine® 500SC (Dow AgroSciences Industrial Ltda).
Foram preparadas amostras de solo para contagem de unidades formadoras de
colônias (UFC) de bactérias e fungos totais. Conforme a Tabela 1 abaixo, os seis
tratamentos foram propostos de acordo com a dose de tebutiurom recomendada pelo
produto comercial (TBT) e o volume de vinhaça comumente utilizado na lavoura
canavieira (VV), segundo Lourencetti et al. (2012).

Tabela 1. Composição dos tratamentos em solo de manejo orgânico

Tratamentos TBT VV
Solo (controle) - -
TBT 1x 1,0x -
VV 1x - 1,0x
TBT 1x + VV 1x 1,0x 1,0x
VV 2x - 2,0x
TBT 1x + VV 2X 1,0x 2,0x

A quantificação da comunidade microbiana para os dois grupos foi determinada

pela contagem de UFC no método Pour Plate. Na Tabela 2, estão apresentados os
grupos microbianos, os meios de cultura, as diluições e as condições de incubação.

Tabela 2. Parâmetros de inoculação e incubação dos micro-organismos

Grupo microbiano Meio de cultura Diluições Incubação
-4 -5
Bactérias PCA 10 e 10 35 ºC por 48 h
Fungos totais BDA 10-3 e 10-4 28 ºC por 120 h

Os dados para cada tratamento foram analisados efetuando-se a análise de

variância pelo teste de Tukey a 5,0% de probabilidade para a comparação de médias.
Utilizou-se para a análise estatística o software Microcal Origin 8.0.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados demonstraram um comportamento semelhante para o número de
UFC de bactérias e fungos totais para o solo de manejo orgânico cultivado com cana-de-
açúcar (Figuras 1 e 2 e Tabela 3).

207
 Inicialmente para bactérias (Figura 1 e Tabela 3), observa-se que o solo controle
teve menor quantidade de UFC apenas para o tratamento “TBT 1x + Vinhaça 1x”.
Quando comparado às amostras com uma dose de TBT e de vinhaça separados, o solo
controle teve uma maior quantidade de colônias bacterianas. Assim, revelou-se um
impacto negativo destes compostos na comunidade de bactérias.
No entanto, quando associado os dois produtos no solo, o valor de UFC para
bactérias por grama de solo foi de 143*104, sendo maior que o tratamento controle
(94*104 UFC.g-1 solo). Além disso, quando adicionado o dobro do volume vinhaça (VV
2x), a comunidade bacteriana também foi reduzida.

160
150
140
10 *UFC bactérias. g-1 solo

130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
4

30
20
10
0
ole 1x x
VV 1 x + VV 1
x x
VV 2 x + VV 2
x
contr TBT
Solo TBT
1
TBT
1

Tratamentos
Figura 1. Número de UFC de bactérias nos tratamentos realizados.

30
28
26
103*UFC fungos.g-1 solo

24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
ole 1x x
VV 1 x + VV 1
x x
VV 2 x + VV 2
x
contr TBT
Solo TBT
1
TBT
1
Tratamentos

Figura 2. Número de UFC de fungos totais nos tratamentos.

Com relação ao grupo fúngico (Figura 2 e Tabela 3), observa-se que o solo
controle teve a maior quantidade de UFC entre todos os tratamentos. Entretanto, não

208
houve diferença significativa em comparação com “TBT 1x” e “VV 1x”. Associando
“TBT 1x + VV 1x”, foi demonstrada uma redução na comunidade de fungos totais
significativamente diferente.
Igualmente aos dados para bactérias, os tratamentos com duas vezes o volume de
vinhaça (“VV 2x” e “TBT 1x + VV 2x”) foram aqueles com menor número de colônias
para fungos totais.

Tabela 3. Análise de variância nos dados de UFC com diferentes doses de tebutiurom e
volumes de vinhaça em solos cultivados com cana-de-açúcar
104*UFC bactérias /g solo 103*UFC fungos totais /g solo
Solo controle 94,00±4,243 a 19,33±8,505 a
TBT 1x 46,67±2,517 b 15,67±4,041 a
VV 1x 52,33±10,970 b 10,33±1,528 ab
TBT 1x + VV 1x 143,00±4,243 c 4,00±1,000 b
VV 2x 39,00±14,799 b 2,00±1,000 b
TBT 1x + VV 2x 52,00±13,435 ab 3,33±0,577 b
*letras minúsculas representam diferença significativa das médias entre os tratamentos nas colunas. (teste de
Tukey a 0,05% de probabilidade)

Portanto, foi demonstrado o impacto inicial do herbicida tebutiurom e da

vinhaça na comunidade microbiana, revelando o efeito negativo destes compostos na
biomassa microbiana do solo (Pankhurst and Lynch, 1994). Apenas no tratamento “TBT
1x + VV 1x” para bactérias teve maior quantidade de colônias em relação ao solo
controle.
Estes resultados diferenciam-se dos estudos de Camargo (1954), no qual a
presença de vinhaça proporcionou um maior crescimento fúngico, e de Santos et al.
(2009), em que a aplicação de vinhaça aumentou imediatamente as colônias de fungos e
após 120 dias a comunidade bacteriana.

CONCLUSÕES
Concluiu-se que, excetuando-se o tratamento com uma dose de tebutiurom e um
volume de vinhaça, estes compostos causam impactos diretos na formação de colônias
de bactérias e fungos totais imediatamente após sua aplicação.

AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Pró-Reitoria de Pesquisa (PROPe/UNESP), às empresas
Usina Caeté (Paulicéia-SP) e Planeta Verde (Lucélia-SP) pela disponibilidade na coleta

209
das amostras de solo e vinhaça e também ao GAIA (Grupo de Ação de Impactos
Ambientais) da FCAT/UNESP, câmpus de Dracena.

REFERÊNCIAS
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Fertility of Soils, vol. 38, no. 1, pp. 15-20.
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vinhaça. Boletim nº 9, Instituto Zimotécnico da ESALQ, Piracicaba, 44 p.
CONAB - COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO, 2017 [viewed 22
February 2017]. Produtos e Serviços. Safras. Séries históricas - Cana-de-açúcar
[online]. Brasília. Available from:
http://www.conab.gov.br/conteudos.php?a=1252&t=2&Pagina_objcmsconteudos=2#A_
objcmsconteudos
EVANGELISTA, C.R.; PARTELLI, F.L.; FERREIRA. E.P.B. and PIRES, F.R., 2013.
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LOURENCETTI, C.; DE MARCHI, M.R.R. and RIBEIRO, M.L., 2012. Influence of
sugar cane vinasse on the sorption and degradation of herbicides in soil under controlled
conditions, Journal of Environmental Science and Health, Part B, vol. 47, pp. 949-958.
ORLANDO FILHO, J., 1981. Sistema de aplicação de vinhaça em cana-de-açúcar.
Revista Álcool & Açúcar, vol.1, no.1, pp.28-36, 1981.
PANKHURST, C.E. and LYNCH, J.M., 1994. The role of the soil biota in sustainable
agriculture. In: PANKHURST, C.E.; DOUBE, B. M.; GUPTA, V.V.S.R. and GRACE,
P.R. (Ed.). Soil biota: management in sustainable farming systems. Melbourne: Elsevier
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SANTOS, T.M.C.; SANTOS, M.A.L.; SANTOS, C.G.; SANTOS, V.R. and
PACHECO, D.S., 2009. Efeito da fertirrigação com vinhaça nos microrganismos do
solo. Revista Caatinga, vol. 22, pp.155-160.
TOMLIN, C., 1997. The pesticide manual: A world compendium. 10a ed. British Crop
Protection Council and Royal Society of Chemistry, Thornton Heath.
TONIÊTO, T.A.P.; DE PIERRI, L.; TORNISIELO, V.L. and REGITANO, J.B., 2016.
Fate of tebuthiuron and hexazinone in green-cane harvesting system. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, vol. 64, no. 20, pp. 3960–3966.

210
 Vinho de jabuticaba: análise físico-química e cariotipagem
das leveduras
Juliana A. Pires1*; Erika M. R. Gutierrez1; Daniela D. Nascimento1; Marcia N. C. Harcer1

1
Faculdade de Tecnologia Dep. “Roque Trevisan” de Piracicaba. *e-mail: [email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
O objetivo deste trabalho foi a fabricação de vinhos de jabuticaba visando a criação de
um produto novo para o mercado de bebidas fermentadas com qualidade superior. Antes
da fermentação utilizou-se metabissulfito de sódio para controle microbiano e a
fermentação ocorreu por dez dias. Realizou-se as análises físico-químicas de teor
alcoólico, acidez total e volátil, cinzas e análise de DNA por PCR das leveduras do pé
de cuba e industriais. Conclui-se que possível um desenvolvimento de uma nova bebida,
com parâmetros físico-químicos dentro da legislação, e também que o método utilizado
de controle microbiano e de higienização durante o processamento garantiu apenas o
crescimento das leveduras de panificação utilizadas.

Palavra-chave: bebida fermentada, Plinia cauliflora, análise de DNA

______________________________________________________________________________________________

Wine of Brazilian grape tree: physical-chemical analysis and karyotyping of yeasts

ABSTRACT
The objective of this work was the manufacture of Brazilian grape tree wines aiming the
creation of a new product for the market of fermented beverages with high quality.
Before the fermentation, sodium metabisulfite was used for microbial control and
fermentation occurred for ten days. Was made physicochemical analyzes of alcoholic
content; total and volatile acidity; ashes and were carried out DNA analysis by PCR of
the alcoholic yeast and industrial yeast. It was concluded that it is possible to develop a
new beverage with physico-chemical parameters within the legislation, and also that the
method used for microbial control and hygiene during processing guaranteed only the
growth of bakery yeast used.

Keywords: fermented beverage, Plinia cauliflora, DNA analysis.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
A jabuticaba é uma fruta tropical, tipicamente brasileira, sendo originária da
região centro-sul (SASSO et al., 2010). Popularmente apreciada por suas características

211
sensoriais in natura, mas também pela utilização em produtos processados como
geleias, licores e bebidas fermentadas (MACHADO et al., 2013).
Apesar da designação vinho referir-se segundo a Lei 5.823 de 14 de novembro
de 1973 (BRASIL, 1988b) como “bebida proveniente da fermentação alcoólica de
mosto de uva sã, fresca e madura”, é permitido pela Lei 7.678 de 8 de novembro de
1988 a produção de vinhos de outras frutas (BRASIL, 1988a), desde que se indique o
nome da fruta no rótulo após a palavra vinho, como por exemplo vinho de jabuticaba.
Qualquer fruta que contenha níveis razoáveis de açúcar é possível de se produzir
um bom vinho, com sabores característicos de cada fruta (CORAZZA et al., 2001).
Como a jabuticaba é uma fruta com características físico-químicas parecidas
com as uvas, como taninos e antocianinas presentes em suas cascas, porém em maior
quantidade e presença de açúcares fermentescíveis, sendo passível de fermentação e de
produção de um bom vinho (CORAZZA et al., 2001; GUEDES, 2009; FORTES, 2012).
O objetivo deste trabalho foi a fabricação de vinhos de jabuticaba visando a
criação de um produto novo para o mercado de bebidas fermentadas com qualidade
superior. Tendo como parâmetros características físico-químicas e cariotipagem da
levedura.

MATERIAL E MÉTODOS
Preparo do vinho
Os frutos de jabuticaba foram colhidos nas árvores pertencentes a Fazenda
Areião, localizada na cidade de Piracicaba no interior de São Paulo. O mosto para o
vinho tinto de jabuticaba foi preparado segundo Fortes (2012). Utilizou-se 24,82 Kg de
jabuticabas maduras previamente higienizadas e 595g de leveduras da espécie
Saccharomyces cerevisiae. A correção da quantidade de sólidos solúveis foi realizada
com adição de sacarose até atingir 22°Brix, sendo utilizados 2,7 Kg de açúcar no total.
Também foi adicionado 2,4g de metabissulfato de potássio, para controle bacteriano.
A temperatura foi controlada para ficar entre 28 a 30°C. As cascas das
jabuticabas permaneceram em contato com o mosto durante toda a fermentação
alcóolica, que durou 10 dias, e a remontagem foi feita 2 vezes ao dia, para evitar o
avinagrar (RIZZON and MANFROI. 1994; GUERRA et al.. 2009).
O vinho foi envasado em garrafas de 255mL de material inerte devidamente
esterilizadas em água fervente. Foram retiradas amostras das leveduras permanecentes
ao pé de cuba.

212
Análises físico-químicas
As análises acidez total e cinzas segundo as Normas do Instituto Adolfo Lutz
(2008). O Teor Alcóolico foi mensurado através do ebuliômetro (NOGUEIRA, 2003).
Para Acidez Volátil foi utilizado o REDUTEC, para a extração de toda substância
volátil contida nas amostras de vinho tinto de jabuticaba (PEREIRA, 2003).

Análise das leveduras por PCR

As leveduras utilizadas na fermentação (pé de cuba) foram colhidas e postas em
placas de petri com meio rico em açúcar para crescimento e o mesmo foi feito com as
leveduras industrializadas adquiridas em estabelecimento comercial da mesma marca e
lote utilizadas na fermentação.
Após o crescimento foram retiradas pequenas amostras das colônias e as mesmas
foram estriadas em placas com meio YPD. Depois do estriamento foi retirada as
amostras das placas e transferência para o tubos com meio de cultura líquido com
propósito de multiplicação. Retirou-se 1,5mL do meio de cultura líquido (solução
celular) e transferido para eppendorfs que foram centrifugados em rotação de 3000 rpm
por 5 min para a sedimentação das células. Descartou-se o sobrenadante e acrescentou-
se mais 1,5mL da solução celular. Depois mais uma vez foi centrifugado e o
sobrenadante descartado.
Para análise de Extração de DNA, foi utilizada a metodologia de CTAB (Doyle,
Doyle, 1987).
A reação de PCR do DNA genômico das leveduras com 4 pares de primers
específicos para caracterização molecular de cepas (CARVALHO-NETTO et al., 2012),
será feita para um volume final de 20µL.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na Tabela 1 é possível averiguar os resultados das análises físico-químicas,

estando dentro do valor descrito na legislação Brasileira de vinhos descrita na forma da
Portaria nº 229, de 25 de outubro de 1988 (BRASIL, 1988).

213
Tabela 1: Resultados obtidos nas análises físico-químicas das amostras de vinho de
jabuticaba pronto e após envase.
Vinho de Parâmetros da legislação Brasileira*
Jaabuticaba mínimo máximo
Acidez Total (%) 5,59 5,5 13
Acidez Volátil(%) 0,75 - 2,0
Teor alcoólico (ºGL) 11 7 14
Cinzas (%)) 0,44 - 1,5
*Fonte: Portaria nº 229, de 25 de outubro de 1988

Resultados das análises de 5 amostras isoladas na análise de PCR estão

apresentadas na figura 1. Pode-se observar que o padrão de bandas obtido da análise
com os primers P1 (Figura 1a), P2 (Figura 1b), P3 (Figura 1c) e P4 (Figura 1d), o
padrão de bandas foi semelhante para todas as amostras (1 a 5). Com base nestes
resultados, pode-se concluir que a levedura não foi substituída ao longo de um ciclo de
produção do vinho de jabuticaba, também não foi detectado qualquer contaminação no
processo com leveduras selvagem.

Figura1: Padrão de bandas dos primers P1 (a) e P2 (b), a 54ºC, e P3 (c) e P4 (d), a
57ºC, das amostras 1 a 5 de levedura remanescente da produção de um vinho de
jabuticaba utilizando-se levedura comercial Fleishmann, para caracterização molecular,
comparados com o padrão de peso molecular (PM).

Para que se tivesse um padrão de comparação da levedura resultante da

fermentação do vinho de jabuticaba, em comparação coma levedura comercial
Fleishmann, amostra da embalagem usada foi coletada e analisada através de
caracterização molecular. Resultados das análises de 5 amostras isoladas estão
apresentadas na figura 2. Pode-se observar que o padrão corresponde ao padrão obtido
coma as amostras de leveduras remanescentes da produção do vinho de jabuticada,
comprovando que a levedura Fleishman de pão foi capaz de permanecer no processo e
produção do vinho e que não foram detectadas leveduras selvagens nesse processo.

214
 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 PM

a b

Figura 2. Padrão de bandas dos primers P1 (a) e P2 (b), a 54ºCdas amostras 1 a 5 de

levedura comercial Fleishmann, para caracterização molecular, comparados com o
padrão de peso molecular (PM).

CONCLUSÕES

Conclui-se que possível um desenvolvimento de uma nova bebida, com

parâmetros físico-químicos dentro da legislação, e também que o método utilizado de
controle microbiano e de higienização durante o processamento garantiu apenas o
crescimento das leveduras de panificação utilizadas.

REFERÊNCIAS

AOAC - ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official

methods of analysis of AOAC International. 16 ed., v.2. Washington: AOAC, 1995

BRASIL (a) Lei nº 7.678, de 08 de Novembro de 1988. Art. 9°. Available

from:<http://www.uvibra.com.br/legislacao_lei7678.htm>

BRASIL (b) Portaria nº 229, de 25 de outubro de 1988. Ministro de Estado da

Agricultura. Available from:<http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:
DTLrVbz2BXIJ:www2.agricultura.rs.gov.br/uploads/126989498929.03_enol_p_229_
88_mapa.doc+&cd=3&hl=pt-BR&ct=clnk&gl=br>

CARVALHO-NETTO, O.V.; et. al. High specificity PCR-based molecular markers for
the efficient monitoring of yeast cell populations during bioethanol production. London:
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CORAZZA, M. L.; RODRIGUES, D. G.; NOZAKI, J. Preparação e Caracterização do

vinho de laranja. Quim. Nova, v.24, n. 4., p. 449-452, 2001

DOYLE, J.J.T.; DOYLE, J. L. Isolation of plant DNA from fresh tissue Focus, v. 12, p.
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FORTES, G. A. C. Análise multiparimétrica da qualidade dos frutos, mostos e vinhos

de jabuticaba. Goiania: Instituto de Química, Universidade Federal de Goiás, 2012

215
GUEDES. M. N. S. Diversidade de acessos de jabuticabeira sabará em diamantina por
meio de caracterização biométrica e físico-química dos frutos e fisiológica das
sementes. Diamantina: Universidade Federal do Jequitinhonha, 2009

GUERRA, C.C. et al., Conhecendo o essencial sobre uvas e vinhos. Documento n. 48,
Bento Gonçalves, jun. 2009

INSTITUTO ADOLFO LUTZ, Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. Métodos

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MACHADO, A.M.R. et al., Identificação de Antocianinas na Casca de Jabuticaba

Liofilizada. In: XVIII Encontro Nacional de Analistas de Alimentos, São Paulo,13, set.
2013.

NOGUEIRA, A. et al. Análise dos indicadores físico-químicos de qualidade da sidra

brasileira. SEMINA: Ciências Agrárias, Londrina, v. 24, n,2 p. 289-298, jul.-dez. 2003.
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PEREIRA, N. E. et al. Compostos secundários em cachaças produzidas no estado de

Minas Gerais. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v.27, n°5, out. 2003.

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RIZZON, L. A.; MANFROI, L.. Fermentação. Sistema de produção de vinho tinto.

Embrapa,. São Paulo, 1994. Available from:
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nhoTinto/fermentacao.htm> Acessado em: 15 fev. 2017.

216
 Fungos micorrízicos nativos e nutrição do morangueiro em
sistemas orgânicos

Juliana Cristina Scotton1*; Diego Fontebasso Pelizari Pinto1; Amália Aparecida Busoni Campos1; Wesley
Luiz Fialho Costa1, Sérgio Kenji Homma1

1
Centro de Pesquisa Mokiti Okada. *[email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
O objetivo do trabalho foi avaliar as possíveis relações entre os fungos micorrízicos
nativos e a resposta nutricional no morangueiro, cultivado sob dois sistemas de
produção orgânica. No tratamento com manejo orgânico convencional (OC) foi feito o
preparo do solo com 2 t.ha-1 de fertilizante orgânico Magmaton®, 1 t.ha-1 de fertilizante
organomineral Biorin®, 1 t.ha-1 bokashi e 4 t.ha-1 de cama de poedeira. Enquanto que
no tratamento com manejo orgânico natural (ON) foi aplicado apenas 2 t.ha-1 de
bokashi. Os resultados demonstraram associações significativas entre as variáveis
analisadas (p<0,01). A colonização micorrízica correlacionou-se negativamente com S e
B, enquanto os teores de glomalina facilmente extraível foram afetados negativamente
pelos teores de P e Ca. Para a variável esporo não houve associação significativa com
nenhum elemento avaliado. O maior aporte de adubo no sistema, mesmo que de
procedência orgânica, diminui a colonização e atividade dos fungos micorrízicos
arbusculares nativos do solo.

Palavras-chave: adubação orgânica, micorrizas, morangueiro.

______________________________________________________________________________________________

Native mycorrhizal fungi and strawberry nutrition in organic

systems

ABSTRACT
This work objective was to evaluate the possible relations between the native
mycorrhizal fungi and the nutritional response in strawberry cultivated under two
systems of organic production. In the treatment with conventional organic management
(OC) the soil was prepared with 2 t.ha-1 of Magmaton® organic fertilizer, 1 t.ha-1 of
Biorin® organomineral fertilizer, 1 t.ha-1 bokashi and 4 t.ha-1 of poultry litter. Whereas
the treatment with natural organic management (ON) only 2 t.ha-1 of bokashi were
applied. The results showed significant associations between the analyzed variables
(p<0,01). Mycorrhizal colonization correlated negatively with S and B, and the contents
of easily extractable glomalin were negatively affected by P and Ca contents. There was
no significant association with any evaluated elements for the spore variable. The higher
fertilizer input in the system, even from organic source, decreases the colonization and
activity of arbuscular mycorrhizal fungi native of the soil.

Keywords: organic fertilization, mycorrhizae, strawberry.

______________________________________________________________________________________________

217
INTRODUÇÃO
Os fungos micorrízicos arbusculares (FMA) desempenham importante papel na
aquisição de nutrientes para as plantas (Cardoso et al., 2010), especialmente em
modelos ecológicos de produção, onde há uma maior dependência dos processos
biológicos do solo para o equilíbrio e produtividade do sistema.
No cultivo orgânico é permitido o uso de diversos tipos de adubos. Entretanto,
sabe-se que a adubação em grandes quantidades, mesmo de procedência orgânica, pode
provocar desiquilíbrio nutricional na planta e inibir a atividade dos FMA, que possuem
taxa de crescimento inversamente proporcional ao aporte desses insumos (Trindade et
al., 2000).
O objetivo do trabalho foi avaliar as possíveis relações entre os fungos
micorrízicos nativos e a resposta nutricional no morangueiro, cultivado sob dois
sistemas de produção orgânica.

MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido em Latossolo Vermelho eutrófico. A
caracterização química de fertilidade do solo foi: pH = 6,3; MO = 39 g kg; P = 43 mg
dm-3; Ca = 84 mmolc dm-3; Mg = 22 mmolc dm-3; K = 5,0 mmolc dm-3; H+Al = 18
mmolc dm-3; CTC = 129 mmolc dm-3; V% = 86% (Raij et al., 2001). O experimento foi
instalado em área comercial de produção orgânica de morango (Fragaria x ananassa),
em Atibaia–SP. O ensaio foi composto por dois tratamentos: manejo orgânico
convencional (OC) e manejo orgânico natural (ON). No preparo de ambas as áreas, o
solo foi gradeado e foi plantado milho para a produção de fitomassa, sendo incorporado
ao solo no florescimento. Posteriormente, foi realizado o transplantio das mudas de
morango. Os tratamentos estão demonstrados conforme abaixo (Tabela 1).

Tabela 1 – Adubos orgânicos e suas respectivas dosagens utilizados nos tratamentos,

manejo orgânico convencional (OC) e manejo orgânico natural (ON).
Composto Fertilizante orgânico Fertilizante Cama de
bokashi Magmaton® organomineral Biorin® poedeira
Tratamentos
(3% N, 3% P e
(3% N) (--) (18% P2O5 e 15% Ca)
3% K)
------------ t.ha-1 ------------
OC 1 2 1 4
ON 2* 0 0 0
*1 t.ha-1 de bokashi foi incorporado ao solo junto com o milho e 1 t.ha -1 antes do transplante das mudas.

218
 Aos oito meses após o transplantio, foi realizada a amostragem. Inicialmente
retirou-se a parte aérea da planta do morangueiro para determinação de macro e
micronutrientes, e posteriormente, solo e raiz na profundidade de 0-20 cm, para
avaliação de colonização micorrízica (COL), número de esporos viáveis (ESP) e
glomalina facilmente extraível (EE-BRSP).
A COL foi avaliada pelo método da clarificação e coloração das raízes (Phillips
and Hayman, 1970), seguida de contagem em placa de Petri (Giovannetti and Mosse,
1980). O ESP foi determinado pela técnica de peneiramento úmido (Gerdemann and
Nicholson, 1963), seguida de centrifugação em água e sacarose 70% (Jenkins, 1964).
A extração de EE-BRSP seguiu a metodologia de Wright and Updahyaya
(1998), com quantificação segundo Bradford (1976). A avaliação dos teores minerais da
parte aérea do morango foi realizada de acordo com Malavolta et al. (1997).
Os dados foram submetidos à correlação de Pearson a 1% de probabilidade.
Adicionalmente foi realizada análise de componentes principais (PCA).

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados demonstraram associações significativas entre as variáveis
analisadas (p<0,01). A COL correlacionou-se negativamente com enxofre (S) e boro
(B), enquanto os teores de EE-BRSP foram afetados negativamente pelas concentrações
de fósforo (P) e cálcio (Ca). Para a variável esporo não houve associação significativa
com nenhum elemento avaliado (Tabela 1).

Tabela 1 – Coeficiente de Pearson (R) para correlações entre colonização micorrízica

(COL), número de esporos viáveis (ESP) e glomalina facilmente extraível (EE-BRSP) e
teores minerais da parte aérea na cultura do morango.
Correlações N P K Ca Mg S Fe Mn Cu Zn B
COL -0,12 -0,27 -0,43 -0,06 -0,17 -0,59 -0,20 0,43 -0,38 -0,11 -0,64
ESP 0,20 0,29 -0,05 -0,06 -0,25 0,16 0,23 -0,10 0,06 0,10 -0,38
EE-BRSP 0,42 -0,72 -0,27 -0,55 0,20 -0,17 -0,24 0,15 0,15 -0,41 -0,31
Valores em negrito indicam correlações significativas a 1% de probabilidade.

A medida que os teores de S e B aumentam na planta a colonização micorrízica

diminui. Pouco se sabe sobre o papel dos FMA na absorção de enxofre e boro
(Marschner, 2012). No entanto, a adubação fosfatada favorece a disponibilidade de S,
pois o P apresenta maior energia de ligação e desloca o S adsorvido no solo, deixando-o

219
mais disponível (Alvarez V et al., 2007). Neste sentido, os resultados demonstram que
os FMA são inibidos em altas concentrações de S, assim como ocorre com P (Cardoso
et al., 2010). O OC recebeu um aporte de 310 kg ha-1 de P2O5 contra 20 kg ha-1 do ON.
Ruuhola and Lehto (2014) demonstraram acúmulo transitório de B nas raízes de
Betula pendula inoculadas com ectomicorrizas e fertilizadas com o elemento, resultando
em captação foliar em fase posterior. Dessa forma, o acúmulo de B nas raízes, quando
em endomicorrizas, pode também contribuir para inibição da colonização.
Os resultados para EE-BRSP indicam que quanto maior teor de P e Ca na planta,
menor a produção da proteína. O OC recebeu maior aporte de P e Ca (Biorin® e cama
de poedeira). Fatores que afetam a simbiose micorrízica influenciam na produção desta
proteína no solo (Sousa et al., 2012). A inibição da associação micorrízica em solos com
alta fertilidade já é bem conhecida (Cardoso et al., 2010). Como consequência há um
decréscimo nas taxas de produção da proteína, sendo encontrado menores teores em
solos com altas concentrações de P, Ca e SO4-2 (Purin and Klauberg Filho, 2010).
A análise de componentes principais (Figura 1), por meio das elipses em torno
de cada tratamento, demonstram que o ON apresentou maior variação dos dados em
comparação com o OC.

Figura 1 – Análise de componentes principais (PCA) entre as variáveis microbiológicas

e de teores minerais da parte aérea na cultura do morango.

3
OC
2
17 Mg
B
S
,3 1
EE-BRSP Fe
% N
Component 2

Cu
-6,4 -4,8 -3,2 -1,6 Mn K
1,6 3,2 4,8
-1 Zn
ESP P
Ca
COL -2

-3

-4 ON
-5

Component 1 26,4%
Sistemas orgânicos de produção apresentam maior heterogeneidade em termos
de microbiota do solo (Lupatini et al., 2017), pois apresentam alta dependência dos
atributos biológicos, conforme verificado no ON. Assim, verifica-se que os manejos

220
orgânicos nem sempre asseguram que as funções biológicas do solo sejam executadas,
sendo importante a escolha criteriosa de insumos que serão aplicados no sistema.

CONCLUSÕES
O maior aporte de adubo no sistema, mesmo que de procedência orgânica,
diminui a colonização e atividade dos fungos micorrízicos arbusculares nativos do solo.

REFERÊNCIAS

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222
 Fungos da Antártica: Metabólitos bioativos contra
Xanthomonas citri subsp. citri.
Juliano Henrique Ferrarezi1; Gabrielle Vieira1; Marina Vitti Vianna1; Luana Galvão Morão1; Lara Durães
Sette1; Henrique Ferreira1; Daiane Cristina Sass1*

1
Instituto de Biociências de Rio Claro-UNESP. *[email protected]

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
O Brasil se destaca na agricultura, principalmente na citricultura, sendo o maior
produtor mundial de laranja. Esta grande produção está relacionada à sua grande
extensão territorial e ao clima propício para produção da fruta. Ao mesmo tempo, o
clima do país é ideal para o desenvolvimento da bactéria Xanthomonas citri subsp. citri,
causadora da doença cancro cítrico. Esta doença ataca todas as principais variedades de
citros de importância econômica, causando perdas nos pomares do mundo todo.
Atualmente, utiliza-se de pulverização de bactericidas contendo metais pesados para
controle da doença, porém tendo em vista o grande dano ambiental causado
principalmente devido ao acúmulo de cobre no solo, torna-se necessária a busca de
alternativas sustentáveis de combate ao cancro cítrico. Neste sentido, metabólitos
secundários de origem microbiológica despertam grande interesse como alternativa aos
produtos químicos, devido a seu grande potencial fitossanitário. Este trabalho teve como
objetivo investigar o potencial de atividade antibacteriana dos metabólitos secundários,
produzidos por fungos isolados do solo abaixo de barra de ferro na Ilha Deception
(Antártica), frente à Xanthomonas citri subsp. citri., causadora do cancro cítrico em
frutas cítricas. Para isto, foram utilizados 22 fungos que produziram 44 extratos
(intracelulares e extracelulares), todos os 44 extratos foram submetidos ao teste de
inibição de crescimento bacteriano. Oito extratos apresentaram atividade antibacteriana
significativa contra a Xanthomonas citri subsp. citri.

Palavras-chave: Cancro cítrico; Metabólitos Secundários; Bioatividade

______________________________________________________________________________________________

Antarctic’s Fungi: Bioactive Metabolites against Xanthomonas citri subsp. citri.

ABSTRACT
Brazil stands out in agriculture, especially in citriculture, being the world's largest
orange producer. This large production is related to its big territorial extension and the
favorable climate for the fruit production. Concurrently, the climate of the country is
ideal for the development of the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri, which causes
citrus canker disease. This disease attacks all main citrus varieties of economic
importance, causing losses in orchards all around the world. Nowadays, bactericide
sprays containing heavy metals are used to control the disease, but in view of the great
environmental damage mainly caused by the accumulation of copper in the soil, it is
necessary to search for sustainable alternatives to fight citrus canker. In this sense,

223
microbiological secondary metabolites arouse great interest as an alternative to
chemicals, due to its great phytosanitary potential. The objective of this work was to
investigate the antibacterial activity potential of the secondary metabolites of
filamentous fungi isolated from the soil below an iron bar in Deception Island
(Antarctica), against Xanthomonas citri subsp. citri, causer of citrus canker in citrus
fruits. In order to do that, we used 22 fungi that produced 44 extracts (intracellular and
extracellular), all of the 44 extracts were submitted for bacterial growth inhibition tests.
Eight extracts showed significant bioactivity against Xanthomonas citri subsp. citri.

Keywords: Citrus canker; Secondary Metabolites; Bioactivity

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
O Brasil é um dos maiores produtores agrícolas do mundo devido a suas
condições climáticas e ampla dimensão territorial. Durante a década de 80 devido ao
investimento no setor agrícola o Brasil passou a ser também o maior produtor de citros
do mundo (Amorin, 2015). O Estado de São Paulo se destaca na produção de laranja
(Almeida and Passos, 2011). Porém, bem como todas as demais culturas, a citricultura é
frequentemente afetada por diversas doenças, comprometendo sua produtividade
(Sanches et al., 2014). Assim, torna-se necessária a busca por formas de prevenir e
controlar essas doenças nos pomares.
Uma das doenças que atacam todas as espécies de citros é o cancro cítrico,
causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri. A bactéria é disseminada por
ventos e chuvas e entra nos tecidos através de estômatos, hidatódios e ferimentos
(Gottwald et al., 2002), causando lesões circulares, salientes de cor castanho e aspecto
eruptivo, podendo atingir folhas, frutos e ramos (Amaral, 2003).
Em geral, o controle desta doença se da por meio de aplicações regulares de
bactericidas, porém, estes produtos costumam ter em sua constituição metais pesados,
principalmente cobre, o que é muito danoso para o meio ambiente, devido a sua
toxicidade e seu acúmulo pela cadeia trófica (Rocha e De Azevedo, 2015). Como
alternativa menos danosa, tem sido proposta a utilização de metabólitos secundários no
combate ao cancro cítrico (Murate et al., 2015). Essas substâncias são produzidas em
resposta a estresses ambientais (Knight et al., 2006) e podem ter caráter antimicrobiano.
Alguns estudos (Svahn et al., 2015; Furbino et al., 2014) evidenciam o potencial de
fungos do ambiente antártico para fins fitossanitários.
Dessa forma, este trabalho apresenta a avaliação de bioatividade de extratos
brutos produzidos por fungos filamentosos isolados do solo abaixo de barra de ferro na
Antártica contra a bactéria X. citri subsp. citri, sendo que alguns destes extratos já foram

224
avaliados em um estudo preliminar apresentando resultados promissores (Ferrarezi,
2016).

MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados 22 fungos filamentosos isolados de solo coletado na Ilha
Deception (Antártica) em novembro/dezembro de 2013. Os fungos, até então
preservados em ultracongelamento a -80°C foram reativados em placa contendo meio
de cultura malte (2%) sólido e estéril. Após crescimento foram submetidos à
fermentação em shaker, em meio malte (2%) líquido durante 21 dias.
A biomassa foi separada do sobrenadante. A biomassa foi triturada com metanol,
originando extratos intracelulares. O sobrenadante foi submetido à extração liquido-
líquido com acetato de etila, para obtenção dos extratos extracelulares.
A análise de atividade antibacteriana contra a X. citri subsp. citri foi realizada
pelo método REMA (resazurin microtiter assay) em placas de 96 poços (Silva e
Ferreira, 2013). Para controle do veículo foi utilizado dimetilsulfóxido 1%, controle
positivo a Canamicina e controle negativo apenas inóculo. Nos demais poços foram
testados diferentes concentrações dos extratos. A inibição do crescimento bacteriano foi
medida através da emissão fluorescência ocasionada pela transformação da resazurina
em resorufina, sendo que os dados foram obtidos pelo espectrofotômetro de
fluorescência. Todos os testes foram realizados em triplicata.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
A partir da metodologia descrita em materiais e métodos foram produzidos 44
extratos (22 intracelulares e 22 extracelulares). Primeiramente com o objetivo de
selecionar os extratos bioativos foi realizado um teste inicial com os 44 extratos,
utilizando quatro concentrações de cada extrato (2100; 1050; 525 e 262,5 µg/ml).
Os resultados obtidos neste teste mostraram que 8 extratos inibiram, em no
mínimo 90%, o crescimento bacteriano. Sendo que estes 8 extratos são origem
extracelular, isto provavelmente está associado ao fato desses metabólitos serem
lançados no meio ambiente para impedir a competição por nutrientes com outros
microrganismos.
Os 8 extratos foram submetidos a uma nova avaliação antibacteriana, seguindo o
mesmo protocolo, entretanto neste teste foram adicionadas mais quatro concentrações
dos extratos (131,2; 65,6; 32,8 e 16,4 µg/ml). Com os resultados obtidos neste último

225
teste foi possível esboçar um gráfico de regressão polinomial, onde a equação da reta
gerada foi utilizada para calcular a concentração inibitória mínima de cada extrato para
inibir o crescimento de 90% da X. citri subsp. citri (MIC90). Os valores de MIC90
obtidos, para cada extrato, estão apresentados na Tabela 1.
Tabela 1. Valores de MIC90 para os oito extratos avaliados contra a X. citri subsp. citri.
Códigos dos MIC 90
Extratos (μg/mL)
E3 2009,26
E6 285,29
E8 1995,73
E16 805,40
E19 1714,07
E20 784,44
E21 600,88
E22 1995,74

Quatro dos oito extratos apresentaram a MIC90 próxima à concentração

máxima testada (2100 µg/ml) (E3, E8, E19 e E22), ou seja, não demonstram resultados
significativos em menores concentrações. Os extratos E6, E16, E20 e E21 apresentaram
resultados melhores, sendo E6 o extrato que apresentou a menor MIC90 (258,29 µg/ml)
e inibição do crescimento bacteriano maior que 90% em três concentrações testadas.
Tendo em vista que as amostras em questão se tratam de extratos brutos, é possível que
os testes apenas com os compostos responsáveis pela atividade bacteriana, em cada
extrato, apresentem resultados de MIC90 ainda mais satisfatórios.

CONCLUSÕES
Podemos concluir que oito dos 22 fungos filamentosos produziram extratos
brutos extracelulares com potencial de bioatividade contra X. citri subsp. citri, inibindo
o crescimento bacteriano de forma significativa (>90%) quando comparados à
Canamicina, com destaque para a amostra E6 que possui a menor MIC90, ou seja,
menor concentração de extrato bruto necessária para inibir 90% do crescimento da X.
citri subsp. citri. Assim, este trabalho demonstra do ponto de vista biotecnológico a
importância de pesquisas no ramo de metabólitos secundários para fins fitossanitários.

226
AGRADECIMENTO
Agradeço a FAPESP pelo apoio financeiro.

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228
 Seleção de meios de cultivo para produção de poli(3-
hidroxibutirato)
Karine Laste Macagnan1; Mariane Igansi Alves2; Leonardo Zanetti Fonseca1; Matheus Marques Torres1,
Camila Rios Piecha1; Lígia Furlan3; Patrícia Diaz de Oliveira1, Angelita da Silveira Moreira1,2,3*, Claire
Tondo Vendruscolo1

1
Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas.
2
Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, Universidade Federal de Pelotas.
3
Centro de Ciências Químicas, Farmacêuticas e de Alimentos, Universidade Federal de Pelotas.
*[email protected]
__________________________________________________________________________________________

RESUMO
Poli(3-hidroxibutirato) ou P(3HB) é um biopolímero biodegradável acumulado no
citoplasma de alguns microrganismos como inclusões de poliésteres. O custo de
produção de P(3HB) pode ser diminuído aumentando-se as concentrações celulares e
poliméricas, utilizando-se combinações adequadas de nutrientes no meio de cultivo e
matéria-primas mais baratas como componentes de meio. Objetivou-se avaliar o efeito
de diferentes meios de cultivo (F4, BEI e MM) e fontes de carbono (glicose, sacarose e
glicerol), na fase de produção de polímero, utilizando-se a bactéria acumuladora
Ralstonia solanacearum. Para a fase de inóculo utilizou-se o meio de cultivo Yeast Malt
adicionado de sacarose (35 g/L). Na fase de produção de P(3HB) foram avaliados
diferentes meios minerais - F4 (meio controle), BEI e MM - e diferentes fontes de
carbono - glicose, sacarose e glicerol - na concentração de 40 g/L. Os processos foram
conduzidos em frascos Erlenmeyers de 500 mL em incubador agitador orbital, 32 ºC e
agitação de 250 e 200 rpm, durante 24 h e 72 h, respectivamente. Avaliou-se a
concentração de biomassa pela análise de massa celular seca (MCS) e o acúmulo de
P(3HB). Os melhores resultados para MCS foram obtidos utilizando-se o meio MM
adicionado de glicose (4,8 g/L) ou sacarose (5,7 g/L). O acúmulo de P(3HB) médio foi
46,8% utilizando-se o meio MM adicionado de sacarose. O meio MM possibilitou os
melhores resultados [MCS e %P(3HB)], tanto usando glicose como sacarose.
Palavras-chave: Biopolímero, Bioprocesso, Polihidroxialcanoato, Ralstonia
solanacearum.
______________________________________________________________________________________________
Selection of culture media for poly(3-hydroxybutyrate) production

ABSTRACT
Poly(3-hydroxybutyrate) [P(3HB)] is a biodegradable biopolymer accumulated in the
cytoplasm of some microorganisms as inclusions of polyesters. The cost of production
to the P(3HB) can be lower by increasing cellular and polymer concentrations with
suitable combinations of nutrients in the culture medium and cheaper raw materials as
media components. The objective was to evaluate the effect of different culture media
(F4, BEI and MM) and carbon sources (glucose, sucrose and glycerol) in the polymer
production phase whit Ralstonia solanacearum RS bacterium. In the inoculum phase
was added 35 g/L sucrose on the Yeast Malt culture medium. In the production phase of
P(3HB), were evaluated the mineral medium, F4 (control medium), BEI and MM as the

229
carbon sources, glucose, sucrose and glycerol in the concentration of 40 g/L. The
experiments were carried out in 500 mL Erlenmeyer flasks and shaking at 250 and 200
rpm for 24 h and 72 h, respectively in an orbital shaker incubator, at 32 °C. The biomass
concentration was evaluated by dry cell weight (DCW) analyses and accumulation of
P(3HB). The best results for DCW were for the medium MM added glucose (4.8 g/L) or
sucrose (5.7 g/L). The average P(3HB) accumulation was 46.8% with the MM medium
added sucrose. However, the MM medium allowed the best results of DCW and
P(3HB), with both glucose and sucrose.

Keywords: Biopolymer, Bioprocess, Polyhydroxyalkanoate, Ralstonia solanacearum.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
O crescente interesse científico pela área ambiental, associado ao ainda crescente
consumo de plásticos, têm tornado necessário a pesquisa e o desenvolvimento de
substitutos ecologicamente corretos. E uma das principais linhas de pesquisa desses
novos materiais que tem despertado interesse é a obtenção de biopolímeros
biodegradáveis, produzidos por microrganismos com o uso de fontes renováveis, com
características térmicas e mecânicas relevantes que permitam a sua industrialização
(Vinhas et al., 2007). Por possuir propriedades físicas comparáveis ao polipropileno
(PP), o polihidroxibutirato P(3HB) é o plástico biopolimérico mais estudado dentre os
polihidroxiacanoatos (PHAs).
O processo de síntese do P(3HB) ocorre, normalmente, em duas etapas:
crescimento celular utilizando meio de cultura complexo, seguida de uma fase de
produção de polímero, a qual ocorre sob a condição de excesso de fonte de carbono e,
geralmente, associada à limitação de um nutriente essencial como P, Fe, Mg ou N
(Khanna e Srivastava, 2005). O rendimento polimérico varia muito, em função do
microrganismo produtor, dos meios utilizados e das condições operacionais; podem ser
citadas produções de 2,39 a 63,0 g/L do polímero (Kulprecha et al., 2009; Atlic et al.,
2011).
O P(3HB) ainda é considerado de custo elevado, o que limita seu uso.
Entretanto, o custo de produção por biotecnologia microbiana pode ser diminuído
aumentando-se o acúmulo polimérico intracelular e/ou a concentração celular no caldo
para produzir uma quantidade maior de polímero, adequando-se a combinação de
nutrientes no meio de cultivo, ou ainda utilizando matérias-primas mais baratas como
componentes de meio (Kulprecha et al., 2009). O objetivo deste trabalho foi avaliar o
efeito de diferentes meios de cultivo (F4, BEI e MM) e de diferentes fontes de carbono

230
(glicose, sacarose e glicerol) na fase de produção de polímero pela bactéria acumuladora
Ralstonia solanacearum RS.

MATERIAL E MÉTODOS
Microrganismo, meios de cultivo e condições operacionais
A linhagem de Ralstonia solanacearum RS utilizada foi cedida pelo Laboratório
de Bacteriologia da FAEM, UFPel. A bactéria está sendo preservada por meio das
técnicas de liofilização e repiques mensais em Nutritive Yeast Agar (NYA) (Schaad
et.al, 2001), e estocadas sob congelamento a -80 °C e refrigeração a 4 °C.
Para a fase de inóculo foi utilizado o meio de cultivo Yeast Malt (YM) (Jeanes,
1974), composição demonstrada na tabela 1, adicionado de sacarose na concentração de
35 g/L, pH 6,0, adicionado de óleo de arroz 1 mL/L. O inóculo, com DO600nm 20, foi
produzido a partir de pré-inóculos formados pela suspensão de células frescas oriundas
de cultivos multiplicativos, crescidos em placas com meio sólido NYA durante 72 h a
32 ºC. Na fase de produção de P(3HB) foram avaliados 3 diferentes meios minerais,
denominados F4 (meio de cultivo controle), BEI (Oliveira et al., 2010) e MM (Atlic,
2011), composições também demonstradas na tabela 1, adicionados de solução de
oligoelementos (Oliveira et al., 2010) e de óleo de arroz (Irgovel®), ambos 1 mL/L.
Além disso, foram avaliadas 3 diferentes fontes de carbono - glicose, sacarose e glicerol
- na concentração de 40 g/L, em pH 7,0. Os processos foram conduzidos em frascos
Erlenmeyers de 500 mL, em incubador agitador orbital, 32 ºC e agitação de 200 rpm,
durante 24 h para o inóculo e 250 rpm e 72 h para a fase de produção.

Tabela 1. Composição dos meios de cultivo para produção de P(3HB) em g/L.

YM F4 BEI MM
Ácido Cítrico - 0,2 - -
Citrato de Sódio - 4,0 - -
Cloreto de Cálcio - - - 0,02
Extrato de Levedura 2,7 - 0,2 -
Extrato de Malte 2,7 - - -
Fosfato de Potássio Dibásico - - 13,62 -
Fosfato de Potássio Monobásico - - 2,0 1,5
Fosfato de Sódio - - - 4,5
Peptona 4,5 - - -
Sulfato de Amônio - - - 1,5
Sulfato de Magnésio - - 2,7 0,2
Triptose - - 2,0 -
Ureia - 3,0 - -

231
 Determinação de crescimento celular e acúmulo de P(3HB)
O crescimento celular foi avaliado pela análise de massa celular seca (MCS)
determinada por gravimetria e expressa em g/L. Para determinação do acúmulo de
P(3HB), o polímero foi extraído, segundo metodologia de extração química utilizando
MCS e clorofórmio na proporção 40:1 (v/m), e quantificado por gravimetria (Macagnan
et al., 2017). As médias foram analisadas estatisticamente pelo teste de Tukey p<0,05 no
programa Statistix 8.0.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados para MCS e porcentagem de P(3HB), após 72h de cultivo, estão
representados nas figuras 1 e 2, respectivamente.
Os melhores resultados para MCS foram obtidos utilizando-se o meio MM
adicionado de glicose (4,8 g/L) ou sacarose (5,7 g/L). Embora os meios de cultivo
estudados sejam bastante distintos em composição, a principal diferença do meio MM é
a presença de sulfato de amônio como fonte de nitrogênio, não contido nos outros
meios. Apesar da ureia, presente no meio de cultivo F4, ser uma fonte de nitrogênio de
baixo custo e ser muito utilizada na literatura, a cepa pode apresentar baixa eficiência
em utilizá-la, o que explica o baixo desenvolvimento e multiplicação celular quando
utilizou-se esse meio de cultivo. A ureia é uma pequena molécula polar não carregada e,
em contraste com o sulfato de amônia, que existe na forma iónica, a taxa de absorção de
ureia através da membrana celular é menos dependente do pH e mais rápida. O uso de
uma fonte de nitrogênio barata como a ureia pode reduzir o custo de produção de
P(3HB) se a cepa bacteriana puder utilizá-la eficientemente (Bormann et al., 1998).
Porém, melhores resultados foram encontrados utilizando-se o sulfato de amônio no
meio MM e extrato de levedura, no meio BEI.
Para o acúmulo de P(3HB), as médias variaram entre 33,8 a 46,8 %, utilizando-
se o meio MM adicionado de glicerol e sacarose, respectivamente. Pode-se verificar,
ainda, que o acúmulo de polímero foi similar para as fontes de carbono testadas nos
meios F4, BEI e MM, com exceção do meio MM adicionado de glicerol em que a
porcentagem foi menor. O mesmo perfil foi observado para a concentração de biomassa,
em que as fontes de carbono não diferiram estatisticamente para o mesmo meio de
cultivo. Isso pode ter acontecido devido à diferença de disponibilidade e tipo de fonte de
nitrogênio em cada meio de cultivo.

232
 Figura 1. Massa celular seca (g/L) após 72h de cultivo nos meios de produção
F4, BEI e MM adicionados de glicose, sacarose ou glicerol.

Figura 2. Rendimento em porcentagem de P(3HB) após 72h de cultivo nos

meios de produção F4, BEI e MM adicionados de glicose, sacarose ou glicerol.

CONCLUSÕES
O meio de cultivo selecionado para pesquisas futuras é o meio MM adicionado
da fonte de carbono sacarose, pois apresentou melhores resultados nas análises
realizadas, concentração de biomassa e P(3HB).

REFERÊNCIAS

ATLIĆ, A., KOLLER, M., SCHERZER, D., KUTSCHERA, C., GRILLO-

FERNANDES, E., HORVAT, P., CHIELLINI, E., and BRAUNEGG, G., 2011.
Continuous production of poly([R]-3-hydroxybutyrate) by Cupriavidus necator in a

233
multistage bioreactor cascade. Applied Microbiology Biotechnology, vol. 91, pp. 295–
304.http://dx.doi.org/10.1007/s00253-011-3260-0
BORMANN, E.J., LEIBNER, M., and BEER, B., 1998. Growth-associated production
of polyhydroxybutyric acid by Azotobacter beijerinckii from organic nitrogen substrate.
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http://dx.doi.org/10.1016/j.procbio.2004.01.053
KULPREECHA, S., BOONRUANGTHAVORN, A., MEKSIRIPORN, B. AND
THONGCHUL, N., 2009. Inexpensive fed-batch cultivation for high poly(3-
hydroxybutyrate) production by a new isolate of Bacillus megaterium. Journal of
Bioscience and Bioengineering, vol. 107, no. 3, pp. 240–245.
MACAGNAN, K.L., RODRIGUES, A.A., ALVES, M.I., FURLAN, L.,
KESSERLINGH, S.M., MOURA, A.B., OLIVEIRA, P.D., McBRIDE, A.J.A.,
MOREIRA, A.S. and VENDRUSCOLO, C.T., 2017. Simplified recovery process of
Ralstonia solanacearum-synthesized polyhydroxyalkanoates via chemical extraction
complemented by liquid-liquid phase separation. Química Nova, vol. 40, no. 2, pp. 125-
130. http://dx.doi.org/10.21577/0100-4042.20160162
OLIVEIRA, C., 2010. Produção de polihidroxibutirato: bioprospecção de Beijerinckia
sp. da coleção de bactérias do Laboratório de Biopolímeros do CDTec - UFPel.
Pelotas: Universidade Federal de Pelotas. 96 p. Dissertação de Mestrado em
Biotecnologia.
REDDY, C.S.K., GHAI, R., RASHMI, T. and KALIA, V.C., 2003.
Polyhydroxyalkanoates: an overview. Bioresource Technology, vol. 87, no. 2, pp. 137-
146. http://dx.doi.org/10.1016/S0960-8524(02)00212-2
SCHAAD, N.W., JONES, J.B. and CHUN, W., 2001. Laboratory guide for
identification of plant pathogenic bacteria. APS Press. 373 p.
VINHAS, G.M., ALMEIDA, Y.M.B. and LIMA, M.A.G.A., 2007. Estudo das
propriedades e biodegrabilidade de blendas de poliéster/amido submetidas ao ataque
microbiano. Química Nova, vol. 6, pp. 1587-1598. http://dx.doi.org/10.1590/S0100-
40422007000700016

234
 Produção de poli(3-hidroxibutirato) por Ralstonia
solanacearum sob diferentes condições salinas
Karine Laste Macagnan1; Mariane Igansi Alves2; Matheus Marques Torres1, Camila Rios Piecha1;
Patrícia Diaz de Oliveira1, Lígia Furlan3, Angelita da Silveira Moreira1,2,3*, Claire Tondo Vendruscolo1

1
Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas.
2
Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, Universidade Federal de Pelotas.
3
Centro de Ciências Químicas, Farmacêuticas e de Alimentos, Universidade Federal de Pelotas.
*[email protected]
_____________________________________________________________________________________________
RESUMO
Poli(3-hidroxibutirato) ou P(3HB) é um biopolímero plástico biodegradável acumulado
no citoplasma bacteriano de alguns microrganismos como inclusões lipofílicas. Em
relação a Ralstonia solanacearum, há pouca informação disponível na literatura sobre a
influência da concentração de sal no crescimento celular e na produção de polímero.
Assim, o objetivo deste estudo foi analisar a influência de diferentes concentrações de
sal, tanto no crescimento celular quanto na produção de P(3HB) da cepa RS. Para a fase
de inóculo utilizou-se o meio de cultivo Yest Malt adicionado de sacarose na
concentração de 35 g/L. Na fase de produção de P(3HB) adicionou-se diferentes
concentrações de sal (0, 5, 50 e 100 g/L) ao meio mineral MM acrescido de sacarose 40
g/L. Os processos foram conduzidos em frascos Erlenmeyers de 500 mL, em incubador
agitador orbital, a 32 ºC e agitação de 200 rpm, durante 72 h. Foram avaliadas a
concentração de biomassa por densidade óptica (DO600nm), massa celular seca (MCS) e
rendimento de P(3HB). A adição de altas concentrações de sal (50 e 100 g/L) no meio
de produção resultou em baixo rendimento de biomassa e de polímero em todos os
tempos. Já a adição de baixa concentração (5 g/L) não ocasionou diferença significativa
em relação ao tratamento controle, sem adição de sal, para as análises de DO600nm,
rendimentos de MCS e de P(3HB) nos tempos de 48 e 72h; valores intermediários
merecem ser avaliados. R. solanacearum RS comportou-se como halotolerante.

Palavras-chave: Biopolímero, Bioprocesso. Polihidroxialcanoato, Cloreto de sódio,

biomassa.
______________________________________________________________________________________________
Selection of culture media for poly(3-hydroxybutyrate) production

ABSTRACT
Poly(3-hydroxybutyrate) or P(3HB) is a biodegradable plastic biopolymer accumulated
in the bacterial cytoplasm of some microorganisms as lipophilic inclusions. Regarding
Ralstonia solanacearum, there is a little information available in the literature on the
influence of salt concentration on cell growth and on polymer production. Thus, the
main purpose of this study was to analyze the influence of different salt concentrations,
on the cell growth as well on the production of P(3HB) of the RS strain. In the inoculum
phase was added 35 g/L sucrose on the Yest Malt culture medium. In the production
phase of P(3HB), salt concentrations from 0, 5, 50 and 100 g/L were added to the
mineral medium MM containing 40 g/L of sucrose. The experiments were carried out in

235
500 mL Erlenmeyer flasks and shaking at 200 rpm for 72 h with an orbital shaker
incubator at 32 °C. The biomass concentration was evaluated by optical density
(OD600nm), as well the dry cell weight (DCW) and yield of P(3HB). The addition of high
salt concentrations (50 and 100 g/L) on the production medium resulted in low biomass
and polymer yields at all the times for this study. However, the addition of low
concentration (5 g/L) did not cause significant difference in relation to the control
treatment, without salt addition, to the OD600nm analyzes, DCW and P(3HB) yields on
times of 48 and 72h; intermediate values which ones were deserve should be
evaluated.

Keywords: Biopolimer, Bioprocess, Sodium chloride, Polyhydroxyalkanoate, Ralstonia

solanacearum.
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
O crescente interesse científico pela área ambiental, associado ao ainda crescente
consumo de plásticos, têm tornado necessário a pesquisa e o desenvolvimento de
substitutos ecologicamente corretos. E uma das principais linhas de pesquisa desses
novos materiais que tem despertado interesse é a obtenção de biopolímeros
biodegradáveis, produzidos por microrganismos com o uso de fontes renováveis, com
características térmicas e mecânicas relevantes que permitam a sua industrialização
(Vinhas et al., 2007).
Polihidroxialcanoatos (PHAs) são acumulados no citoplasma bacteriano como
inclusões de poliésteres insolúveis em água e utilizados como material de reserva de
energia e carbono. Esses bioplásticos se degradam completamente em curto período de
tempo pela ação enzimática de microrganismos e sob condições apropriadas no meio
ambiente, sendo esta a principal característica desses materiais; além disso, são
termoplásticos e biocompatíveis ao ser humano (Reddy et al., 2003).
Por possuir propriedades físicas comparáveis ao polipropileno (PP), o poli(3-
hidroxibutirato [P(3HB)] é o biopolímero mais estudado dentre os PHAs. O processo de
síntese de P(3HB) ocorre, normalmente, em duas etapas: crescimento celular, utilizando
meio de cultura complexo, seguida de uma fase de produção de polímero, a qual ocorre
sob a condição de excesso de fonte de carbono e, geralmente, associada à limitação de
um nutriente essencial como P, Fe, Mg ou N (Khanna e Srivastava, 2005).
A Ralstonia solanacearum é uma bactéria Gram-negativa em forma de bacilo.
Naturalmente habitante do solo e da água, é aeróbica e não formadora de esporos. Os
isolados virulentos não possuem flagelos e são imóveis, enquanto os isolados
avirulentos têm alta motilidade, possuindo de 1 a 4 flagelos. Cresce em temperatura
entre 25 a 35 °C, variando de acordo com os isolados; acumula P(3HB) como reserva de

236
carbono e energia e é tolerante a sais (Mehan et al., 1994). Os halófilos constituem um
grupo versátil de microrganismos caracterizados pela sua necessidade de ambientes
hipersalinos onde NaCl constitui o componente de sal predominante (Kogej et al.,
2007). A maioria dos autores distingue três tipos de bactérias halófilas: halotolerante
(toleram 0 a 15% de NaCl), halófilos moderados (requerem 1 a 15% de NaCl) e
halófilos extremos (requerem 15 a 30% de NaCl) (Quillaguana´n et al., 2006).
O custo da produção biotecnológica de P(3HB) pode ser diminuído mehorando-
se o rendimento do processo, mediante aumento da concentração celular dos cultivos e
do acúmulo polimérico intracelular (Kulprecha et al., 2009). Em relação a Ralstonia
solanacearum, dispõem-se de pouca informação sobre a influência da concentração de
sal no crescimento e na produção de polímero. Assim, objetivou-se analisar a influência
de diferentes concentrações de NaCl (0, 5, 50 e 100 g/L) na concentração celular e na
produção de P(3HB) por Ralstonia solanacearum RS na fase de produção.

MATERIAL E MÉTODOS

Microrganismo, meios de cultivo e condições operacionais

A linhagem de Ralstonia solanacearum RS utilizada foi cedida pelo Laboratório
de Bacteriologia da FAEM, UFPel. A bactéria está sendo preservada por meio das
técnicas de liofilização e repiques mensais em Nutritive Yest Agar (NYA) (Schaad et.al,
2001) estocadas sob congelamento a -80 °C e refrigeração a 4 °C.
Para a fase de inóculo foi utilizado o meio de cultivo Yest Malt (YM) (Jeanes,
1974), adicionado de sacarose 35,0; pH 6,0, adicionado de óleo de arroz 1 mL/L. O
inóculo foi produzido a partir de pré-inóculos formados pela suspensão de células
frescas obtidas a partir de cultivos multiplicativos, crescidos em placas com meio sólido
NYA durante 48 h a 32 ºC. Na fase de produção de P(3HB) foi utilizado o meio de
cultivo MM composto em g/L de cloreto de cálcio 0,02; fosfato de potássio monobásico
1,5; fosfato de sódio 4,5; sulfato de amônio 1,5; sulfato de magnésio 0,2 (Atlic, 2011), e
sacarose 40,0, adicionado de solução de oligoelementos (Oliveira et al., 2010) e de óleo
de arroz 1 mL/L. Além disso foi adicionado cloreto de sódio nas concentrações de 0, 5,
50 e 100 g/L em pH 7,0.
Os processos foram conduzidos em frascos Erlenmeyers de 500 mL em
incubador agitador orbital, 32 ºC e agitação de 200 rpm, durante 24 h para o inóculo e
250 rpm e 72 h para a fase de produção.

237
 Determinação de crescimento celular e acúmulo de P(3HB)
As análises foram realizadas com amostras coletadas nas 24, 48 e 72h de cultivo.
O crescimento celular foi avaliado pela concentração de biomassa (DO600nm), medida
por espectrofotometria a 600 nm, e pela concentração de massa celular seca (MCS),
determinada por gravimetria. Para determinação do acúmulo de P(3HB), o polímero foi
extraído segundo metodologia de extração química utilizando MCS e clorofórmio na
proporção 40:1 (v/m) (Macagnan et al., 2017). As médias foram analisadas
estatisticamente pelo teste de Tukey p<0,05 no programa Statistix 8.0.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados para DO600nm e rendimento de MCS e porcentagem de P(3HB),
após 24, 48 e 72h de cultivo, estão representados nas figuras 1 e 2, respectivamente. Os
melhores resultados para DO600nm foram obtidos com o tratamento controle,
independentemente do tempo utilizado (13,0 a 15,3) e no tempo de 72 h utilizando-se 5
g/L de sal no meio de cultivo (14,6). Para a MCS o melhor tratamento foi o meio de
cultivo sem adição de sal nos tempos de 48 e 72 h, obtendo-se 3,9 g/L e 4,1 g/L,
respectivamente.

Figura 1. Densidade Óptica e Massa celular seca em 24, 48 e 72h de cultivo no

meio de produção MM adicionado de NaCl nas concentrações de 0 (controle), 5, 50 e
100 g/L.

O rendimento de P(3HB) foi maior quando utilizou-se 5 g/L de NaCl no tempo

de 72 h, quando a bactéria acumulou 47% do seu peso em polímero. Porém, não diferiu
estatisticamente dos acúmulos de 41,3 e 45% obtidos no tratamento controle nos tempos
de 48 e 72 h, respectivamente, e também não diferiu dos acúmulos de 39,0 e 41,9%
238
obtidos nas 24 e 48h do mesmo tratamento. Através desses resultados pode-se observar
que a adição de NaCl não proporcionou o aumento da multiplicação celular e do
acúmulo polimérico; em alguns tempos de cultivo a adição de baixa concentração de sal
apenas não diferiu estatisticamente do tratamento controle. Já a adição de 50 ou 100 g/L
influenciou negativamente, tanto no crescimento celular quanto no acúmulo de P(3HB).

Figura 2. Rendimento de P(3HB) em 24, 48 e 72h de cultivo no meio de

produção MM adicionado de NaCl nas concentrações de 0 (controle), 5, 50 e 100 g/L.

CONCLUSÕES
A adição de baixa concentração de NaCl (5 g/L) no meio de cultivo não
ocasionou diferenças significativas em relação ao tratamento controle para as análises
de DO600nm, e rendimentos de MCS e de P(3HB) nos tempos de 48 e 72h de cultivo. Já a
adição de altas concentrações de sal (50 e 100 g/L) resultou em baixo rendimento de
biomassa e de polímero. R. solanacearum RS comportou-se como micro-organismo
halotolerante.

REFERÊNCIAS

ATLIĆ, A., KOLLER, M., SCHERZER, D., KUTSCHERA, C., GRILLO-

FERNANDES, E., HORVAT, P., CHIELLINI, E., and BRAUNEGG, G., 2011.
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4261–4273. http://dx.doi.org/10.1099/mic.0.2007/010751-0
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THONGCHUL, N., 2009. Inexpensive fed-batch cultivation for high poly(3-
hydroxybutyrate) production by a new isolate of Bacillus megaterium. Journal of
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Ralstonia solanacearum-synthesized polyhydroxyalkanoates via chemical extraction
complemented by liquid-liquid phase separation. Química Nova, vol. 40, no. 2, pp. 125-
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Pelotas: Universidade Federal de Pelotas. 96 p. Dissertação de Mestrado em
Biotecnologia.
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240
VINHAS, G.M., ALMEIDA, Y.M.B. and LIMA, M.A.G.A., 2007. Estudo das
propriedades e biodegrabilidade de blendas de poliéster/amido submetidas ao ataque
microbiano. Química Nova, vol. 6, pp. 1587-1598. http://dx.doi.org/10.1590/S0100-
40422007000700016

241
 Acumulação de lipídio e produção de lipase por
Candida viswanathii
Kleydiane B. Dias1; Lucas P. da Silva1; Alex F. Almeida1*; Bruno S. A. F. Brasil2

1
Universidade Federal do Tocantins, Campus Universitário de Gurupi, TO. *[email protected]
2
EMBRAPA Agroenergia, Brasilia -DF.

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RESUMO
Este estudo objetivou avaliar as condições de cultivo para a produção de lipase e
acúmulo de lipídio pela levedura Candida viswanathii utilizando diferentes fontes de
carbono e condições limitantes de nitrogênio em cultivos submersos. A maior produção
de lipase foi observada utilizando azeite de oliva (26,78 U/mL), enquanto que a maior
acumulação de lipídio ocorreu com trioleína (44,6%). A adição de glicose ao meio de
cultivo causou repressão na produção de lipase, mas aumentou a acúmulo de lipídio,
provavelmente devido ao excesso de carbono e condições limitantes de nitrogênio. A
avaliação do perfil dos ácidos graxos revelou predominância de ácido oleico, obtendo
porcentagem de 69,31% usando trioleína como fonte de carbono. Conclui-se que a
linhagem C. viswanathii pode ser considerada como uma linhagem oleaginosa capaz de
acumular altas concentrações de lipídios intracelular e simultaneamente produzir altos
níveis de lipase.

Palavras-chave: Levedura, azeite de oliva, triacilglicerol

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Lipid accumulation and lipase production by

Candida viswanathii

ABSTRACT
This study aimed to evaluate the culture conditions for lipase production and lipid
accumulation by Candida viswanathii using different carbon sources and limiting
conditions of nitrogen in submerged cultures. The highest lipase production was
observed using olive oil (26.78 U/mL), while the highest lipid accumulation occurred
with triolein (44.6%). Addition of glucose to the culture medium caused repression of
lipase production, but increased lipid accumulation, probably due to excess of carbon

242
sources and nitrogen limiting conditions. The evaluation of the fatty acid profile showed
a predominance of oleic acid, obtaining a percentage of 69.31%, using triolein as carbon
source. It is concluded that the C. viswanathii strain can be considered as an oleaginous
strain capable of accumulating high concentrations of intracellular lipids and
simultaneously producing high levels of lipase.

Keywords: Yeast, olive oil, triacylglycerol.

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INTRODUÇÃO
Lipases (E.C. 3.1.1.3) são enzimas responsáveis por catalisar a hidrólise de
óleos e gorduras em diglicerídeos, monoglicerídeos, ácidos graxos livres e glicerol em
condições aquosas, mas também podem facilitar reações como esterificação e
transesterificação, na presença de solventes orgânicos. Algumas de suas aplicações são
na indústria de detergentes, processamento de couro, em cosméticos, perfumaria,
produção de biocombustíveis, química fina, indústria de papel e celulose, alimentos
humanos e animais, diagnósticos médicos e produtos farmacêuticos (BARRIUSO et al.,
2016).
Algumas espécies microbianas, além de produzirem lipases, tem potencial em
sintetizar e armazenar quantidades relevantes de lipídios em sua biomassa (CHANG et
al., 2015). Microrganismos que armazenam teores de óleo em cerca de 20% de sua
biomassa são considerados microrganismos oleaginosos. Leveduras oleaginosas
apresentam grande potencial na produção de lipídios em função da sua alta taxa de
acúmulo. Os lipídios acumulados podem ser utilizados em diversos segmentos, como
geração de produtos especiais - lubrificantes e polímeros, ou produtos de base -
biocombustíveis. Este trabalho teve como objetivo avaliar as condições de cultivo para a
produção de lipase e acúmulo de lipídio pela levedura Candida viswanathii utilizando
diferentes fontes de carbono em condições submersas.

MATERIAL E MÉTODOS
Microrganismo e condições de cultura

A levedura C. viswanathii é mantida no Laboratório de Biotecnologia, Análise

de alimentos e produtos de purificação (LABAP), Habite – Incubadora de Empresas de
Base Biotecnológica, Universidade Federal do Tocantins, Gurupi-TO. As culturas
periódicas foram realizadas em tubo inclinado ágar extrato de malte e incubadas a 28
243
°C, durante 72 horas. O inóculo foi preparado em solução de NaCl a 0,85%, e
padronizado para 107 células por ml.
Os cultivos foram realizados em frascos de Erlenmeyer de 125 ml contendo 20
ml de meio de Sais de Vogel (VOGEL, 1956). As culturas foram suplementadas com
fontes de carbono e nitrogênio. Os cultivos foram autoclavados a 121°C durante 20 min,
inoculados com 1 ml do inóculo padronizado e mantidos a 180 rpm, a 28 ° C durante 72
horas. O extrato bruto foi obtido por centrifugação do caldo fermentado a 7500 g a 4°C
durante 15 min. O sobrenadante foi recolhido e utilizado para quantificação de enzima e
proteína. As biomassas foram lavadas com água destilada e centrifugadas para remover
o meio de cultura residual. As biomassas foram secas a 60 °C em estufa até peso
constante.

Atividade de lipase

A atividade de lipase foi determinada utilizando palmitato de p-nitrofenila (p-

NPP) como substrato (ALMEIDA et al., 2013). A absorbância foi medida a 405 nm e a
atividade foi determinada de acordo com a curva padrão feita com ρ-nitrofenol
(coeficiente de extinção molar de pNP: 1,8 x 104 M-1 cm-1). Os controles foram
preparados sem enzima. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a
quantidade de enzima que libera 1 µmol de ρNP por ml por min.

Determinação de lipídio microbiano

A extração de lipídios foi realizada após a biomassa ter sido seco a 60 °C,
utilizando o método de Folch (FOLCH et al., 1956). O teor total de lipídio foi
determinado por gravimetria.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
A linhagem C. viswanathii foi analisada quanto ao potencial em produzir lipase
e acumular lipídios em cultivos submersos utilizando diferentes fontes de carbono de
origem lipídica (Figura 1). As fontes lipídicas tributirina (4:0) e trioleína (18:1) foram
escolhidas devido a sua composição no triacilglicerol, enquanto que as fontes de lipídios
renováveis, azeite de oliva, óleo de linhaça e óleo de girassol foram escolhidas por
comporem em seus triacilgliceróis 79% de ácido oleico, 66% ácido linoleico (18:2 cis-
∆9,12) e 53% de ácido linolênico (18:3 cis-∆6,9,12). O perfil dos ácidos graxos presentes

244
nos triacilgliceróis pode influenciar diretamente no crescimento microbiano e na
produção de lipase.

27

24
Biomassa (g/L), Lipase (U/mL),
21

18
Lipidio (g/L)

15

12

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Figura 1. Efeito de fontes de carbono puras e complexas sobre o crescimento de C.
viswanathii, produção de lipase e acumulação de lipídio. Legenda: (■) Biomassa; (■)
Lipase; (■) Lipídio.

A linhagem de C. viswanathii foi capaz de se desenvolver em todos os

triacilgliceróis analisados apresentando os maiores valores de biomassa seca com
trioleína e óleo de girassol (7,75 g/L e 7,57 g/L, respectivamente) e o menor
crescimento com tributirina (1,56 g/L). A maior produção de lipase foi observada com
azeite de oliva (26,78 U/mL) seguido por trioleína (24,60 U/mL). O maior acúmulo de
lipídio intracelular foi observado com a fonte de lipídio puro trioleína (3,45 g/L), que
correspondeu a 44,57% do peso seco da biomassa. O acúmulo de lipídio utilizando
fontes renováveis de óleo de linhaça, azeite de oliva e óleo de girassol não apresentou
diferença significativa (~2,7 g/L).

O perfil dos ácidos graxos produzidos por C. viswanathii são apresentados na

Tabela 1. Observa-se que a linhagem produziu 86,06% de ácidos graxos insaturados e
13,94% de ácidos graxos saturados do total de lipídios acumulados pela linhagem. Este
percentual de acumulação de lipídios insaturados indica que esta linhagem apresenta
grande potencial para a aplicação em processos para produção de lipídios com apelo
para a produção de alimentos funcionais. O ácido oleico foi produzido em maior
quantidade (69,31%) com relação aos demais ácidos graxos insaturados. O ácido oleico

245
pertence à família ômega-9, que é usado como precursor para a síntese de colesterol
HDL.

Parâmetros (%) Nomenclatura Trioleína

Lipídio total 25,35 ± 1,89
Ácido graxo saturado 13,94 ± 0,40
Ácido graxo insaturado 86,06 ± 2,87
Ácido mirístico C 14:0 n.d.
Ácido palmístico C 16:0 10,80 ± 0,28
Ácido palmitoléico C 16:1 ∆cis-9 1,19 ± 0,05
Ácido esteárico C 18:0 3,14 ± 0,12
Ácido oleico C 18:1∆cis-9 69,31 ± 2,33
Ácido vacênico C 18:1 ∆trans-11 1,80 ± 0,05
Ácido linoleico C 18:2 ∆cis-9,12 12,55 ± 0,40
Ácido linolênico C 18:3 ∆cis-6,9,12 0,79 ± 0,03
Ácido eicosadienóico C 20:2 ∆cis-11,14 0,42 ± 0,01
Tabela 1. Perfil dos ácidos graxos produzidos por C. viswnanathii em condições
submersas.

CONCLUSÕES
O cultivo da linhagem em diferentes substratos hidrofóbicos para a produção de
lipase e acumulação de lipídio mostrou que a linhagem de C. viswanathii pode ser
classificada como uma linhagem pertencente ao grupo dos microrganismos oleaginosos,
Este é o primeiro estudo que relata a produção e acumulação de lipídios por esta
linhagem. Os lipídios produzidos por C. viswanathii possui grande potencial para seu
uso como suplementos alimentares. Estudos envolvendo o controle fisiológico para a
produção de lipase e acumulação de lipídios em outros substratos hidrofóbicos e com
resíduos agroindustriais devem ser realizados para otimizar a co-produção destes
metabólitos e aprofundar o entendimento nos mecanismos de biotransformação dos
lipídios dos substratos em lipídios microbianos.

REFERÊNCIAS

ALMEIDA, A. F.; TAUK-TORNISIELO, S. M.; CARMONA, E. C. Acid lipase from

Candida viswanathii: Production, biochemical properties, and potential application.
BioMed Research International, v. 2013, 2013.

BARRIUSO, J, et al, Structural traits and catalytic versatility of the lipases from the
Candida rugosa-like family: A review, Biotechnology Advances, 2016.

246
CHANG, Y, H, et al, Microbial lipid production by oleaginous yeast Cryptococcus sp,
in the batch culturas using corncob hydroysate as carbono source, Biomass and
Bioenergy, v. 72, p, 95-103, 2015.

Folch, J.; Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and
purification of total lipids from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry, v.
226, p. 450–497, 1957.

VOGEL, H. J. A convenient growth medium for Neurospora crassa (medium N).

Microbiology Genetics Bulletin, vol. 13, p. 42–43, 1956.

247
 Avaliação da composição de micro-organismos de lodo de
esgoto durante o processo de biorremediação

Lais Roberta Deroldo Sommaggio1*; Flávio A. Oliveira2; Carlos Emílio Levy2; Dânia Elisa Christofoletti
Mazzeo1,3; Maria Aparecida Marin-Morales1

1
Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, UNESP, Rio Claro. *[email protected]
2
Departamento de Patologia Clínica, Faculdade de Ciências Médicas, UNICAMP, Campinas
3
Departamento de Química Analítica, Instituto de Química, UNESP, Araraquara.
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RESUMO
O lodo de esgoto (LE) é um resíduo proveniente de Estações de Tratamento de Esgoto,
que tem potencial para uso agrícola, devido à sua composição rica em matéria orgânica
e nutrientes. No entanto, o LE pode apresentar substâncias potencialmente tóxicas para
os seres vivos e o ambiente. A biorremediação é uma tecnologia amplamente
empregada para descontaminação de resíduos tóxicos, por utilizar de micro-organismos
capazes de decompor e/ou modificar poluentes. A identificação dos micro-organismos
presentes nesse processo é de extrema importância, já que os mesmos podem ser
utilizados para a otimização da biorremediação. Dessa forma, este trabalho buscou
identificar os micro-organismos presentes nas diferentes amostras de LE e suas misturas
com solo(S) e casca de arroz(CA). As amostras biorremediadas foram: LE puro (LEP);
LE misturado com S (LE+S) e LE misturado com S e CA (LE+S+CA), durante 3(T1) e
6(T2) meses. As análises microbiológicas foram realizadas antes do início da
biorremediação e em T1 e T2. Amostras foram semeadas em placas de Petri contendo
diferentes meios de cultivo e incubadas por 7 dias. A identificação foi realizada pelo
aparelho PhoenixTM – BD Biosciences. Os resultados mostraram 18 gêneros de
bactérias e 4 de fungos, que se alternaram ao longo do tempo. O gênero Pseudomonas e
a família Bacillaceae apresentaram representantes em todas as amostras analisadas.
Também foi observado uma predominância de bactérias aeróbias em todos os períodos e
amostras testadas. Dessa forma, este estudo demonstra a importância do monitoramento
microbiológico para a avaliação da sucessão microbiana presente na biorremediação do
LE.
Palavras-chave: Resíduo sólido; biorremediação; sucessão microbiológica; casca de
arroz
______________________________________________________________________________________________

Microbial composition assessment of sewage sludge during the bioremediation

process
ABSTRACT
Sewage sludge (SS) is a residue derived from Sewage Treatment Plants with
agricultural use potential due to its rich composition in organic matter and nutrients.
However, SS can present potentially toxic substances to living beings and the
environment. Bioremediation is a widely applied technology to decontaminate toxic

248
residues by using microorganisms capable of decompose and/or modify pollutants. The
identification of the microorganisms that are present in this process is of extreme
importance, once they can be used to the enhancement of the bioremediation. Thus, this
work aimed to identify the microorganisms present in different SS samples and their
mixtures with soil (S) and rice hulls (RH). The bioremediated samples in this study
were: pure SS (PSS); SS combined with S (SS+S) and SS combined with S and RH
(SS+S+RH), during 3 (T1) and 6 (T2) months. The microbiological analyses were
performed before the beginning of the bioremediation and in T1 and T2. Samples were
sowed in Petri dishes containing different types of Agar and incubated for 7 days. The
identification was performed by PhoenixTM – BD Biosciences. The results showed 18
genres of bacteria and 4 of fungi, which were alternated along the period. Pseudomonas
and Bacillaceae family presented representatives in all analyzed samples. It was also
observed a dominance of aerobic bacteria in all periods and tested samples. Therefore,
this study demonstrates the importance of microbiological monitoring for an evaluation
of the microbial succession in SS bioremediation.
Keywords: Solid waste; Bioremediation; Microbiological succession; Rice hull
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
O lodo de esgoto (LE), um resíduo gerado em Estações de Tratamento de Esgoto
(ETE), está diretamente relacionado com o aumento da industrialização e urbanização
(KHAN et al., 2013). A utilização do LE como fertilizante agrícola, devido à sua
composição rica em matéria orgânica e nutrientes, tem se mostrado uma opção
vantajosa de destinação desse resíduo, tanto do ponto de vista econômico quanto
ambiental (GIANICO et al., 2013). No entanto, o LE pode conter compostos tóxicos,
como metais, compostos orgânicos perigosos e micro-organismos patogênicos,
altamente prejudiciais aos organismos expostos (PARAIBA and SAITO, 2005).

Pensando nos benefícios que o LE possa trazer para a agricultura, esforços tem
sido direcionado para o desenvolvimento de novas tecnologias que possam minimizar a
toxicidade deste resíduo (TAS, 2010). Dentre elas, o processo de biorremediação tem
sido largamente utilizado para a descontaminação de resíduos tóxicos, por utilizar
tratamentos biológicos na extração/transformação de compostos perigosos presentes no
ambiente (SEMPLE et al., 2003). Uma estratégia da biorremediação é a bioestimulação,
que consiste na adição de agentes estimulantes, como nutrientes e oxigênio, para
impulsionar o desenvolvimento da microbiota autóctone (MAZZEO et al., 2014). A
casca de arroz é um resíduo agroindustrial, que pode atuar como um bom agente
descompactante e contribuir para a aerobiose do sistema, devido à sua constituição
fibrosa.

249
 Em ambientes naturais, as bactérias são os principais organismos que atuam nos
processos de biodegradação dos contaminantes (WATANABE, 2001). A identificação
dos micro-organismos biodegradadores é uma etapa muito importante, pois fornece
informações sobre quais micro-organismos estão presentes no sistema, dando assim a
possibilidade de magnificá-los e, consequentemente, de melhorar a velocidade do
processo de biorremediação.
Dessa maneira, este trabalho buscou identificar os micro-organismos presentes
no LE e em suas misturas com solo e casca de arroz, visando compreender a sucessão
microbiológica envolvida em cada etapa do processo de biorremediação.

MATERIAL E MÉTODOS
O LE de origem doméstica foi coletado, em 2014, na ETE Praia Azul da cidade
de Americana (São Paulo/Brasil). As amostras foram preparadas com LE, solo de
textura argilosa, coletado no Jardim Experimental da UNESP (Rio Claro, São
Paulo/Brasil) e casca de arroz. O arroz foi utilizado como agente descompactante para
permitir uma melhor aeração.
As amostras foram preparadas nas seguintes associações e proporções: LE puro
(LEP); LE+solo (LE+S: 3:1 – v/v); LE+solo+casca de arroz (LE+S+CA: 3:1:1 – v/v).
As misturas foram dispostas em cubas de aço inox (14 L), mantidas no Jardim
Experimental da UNESP (Rio Claro), em local coberto e sob temperatura ambiente. Os
períodos escolhidos para avaliação da biorremediação foram: tempo zero (T0),
momento do preparo das associações; tempo 1 (T1) e tempo 2 (T2), referente aos
períodos de 3 e 6 meses de biorremediação/bioestimulação, respectivamente.
Para a identificação dos micro-organismos, após cada período estudado, foram
adicionados, individualmente, 1 g de cada uma das amostras (LEP; LE+S e LE+S+CA)
em 100 mL de solução salina estéril. Para a avaliação da diversidade de micro-
organismos nas amostras, 10 μL dessa solução foi semeada, por esgotamento, em placas
de Petri contendo Ágar Sangue, Ágar MacConkey, Ágar Sabouraud ou Cromoágar
UriSELECT 4 (Bio-Rad Laboratories, Marnes-La-Coquete, França). As placas foram
incubadas a 35ºC, exceto as de Ágar Sabouraud, que foram mantidas a temperatura
ambiente, por 7 dias. Os micro-organismos foram isolados e, inicialmente, identificados
por meio de testes bioquímicos convencionais. Posteriormente, esses micro-organismos
foram reidentificados por meio do equipamento de automação PhoenixTM – BD
Biosciences.

250
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados mostraram prevalência de 18 gêneros de bactérias e 4 gêneros de
fungos (Figura 1). As bactérias comuns em todas as amostras, nos três diferentes
tempos, foram Bacilos gram positivos (BGP), Bacilos gram negativos não
fermentadores (BGN-NF) e enterobactérias. A adição de casca de arroz e/ou solo ao LE
parece ter contribuído para uma alteração na diversidade microbiana, pois foram
encontrados gêneros e espécies específicas, não observadas para a amostra de LEP.
Viñas et al. (2005) também notaram uma alternância da comunidade bacteriana em seus
estudos realizados antes e após a adição de nutrientes nas amostras, comprovando que
diferentes grupos filogenéticos podem estar associados com as diferentes fases da
degradação.

A presença da espécie Acinetobacter lwoffii foi observada para as três diferentes

amostras estudadas (LEP, LE+S e LE+S+CA), apenas no período inicial, indicando que
tal espécie pode ter atuado apenas no início do processo de biorremediação. Abdel-El-
Haleem (2003) afirma que algumas espécies de Acinetobacter estão envolvidas com a
biodegradação de muitos compostos, como o fenol, o óleo bruto, a acetonitrila, e
também com a remoção de metais pesados. Essas características destacam a espécie
como um organismo de grande importância para o ambiente.

Representantes do gênero Pseudomonas estavam presentes em todas as amostras

analisadas, independente do período de biorremediação amostrado. O mesmo também
foi observado para alguns representantes da família Bacillaceae, onde o gênero Bacillus
foi o mais prevalente em todas as amostras testadas. Também foi observada uma
diversidade de enterobactérias, já esperado pela própria origem do LE, que persistiram
por todo o período do estudo (6 meses). Esses resultados corroboram os resultado
obtidos por Mazzeo et al. (2015), que também encontraram algumas espécies de
enterobactérias nas associações que continham LE, mesmo após 6 meses de
biorremediação.

Em relação aos fungos, estes estiverem presentes em todos os tempos estudados.

O gênero Penicillium e um fungo anemófilo, que foi isolado, mas não identificado,
foram comum às três amostras avaliadas. Embora os fungos apresentem crescimento
mais lento, quando comparados com as bactérias (LEITÃO, 2009), eles também atuam
com eficiência na degradação ou deterioração de uma grande variedade de materiais

251
(SINGH et al., 2011). Por essa razão, esses micro-organismos devem também
considerados nas avaliações microbiológicas.
A utilização de micro-organismos adaptados ao poluente alvo melhora a
efetividade da biorremediação (EL FANTROUSSI and AGATHOS, 2005). Dessa
forma, a identificação dos micro-organismos presentes nas amostras é de extrema
relevância para a compreensão do processo e pela possibilidade de isolamento e
utilização dos mesmos para ensaios futuros.
Figura 1: Caracterização microbiológica das amostras de LEP, LE+S e LE+S+CA, em três períodos
distintos: T0 (momento da mistura das associações) e após 3 (T1) e 6 (T2) meses de biorremediação.
BGN-NF: Bacilo gram negativo não fermentador; BGP: Bacilo gram positivo

CONCLUSÕES
Nas análises microbiológicas, foi observado que a via de degradação
preferencial do LE foi a aeróbia, com uma predominância de espécies bacterianas. Além
disso, este estudo demonstrou a importância da realização de monitoramento
microbiológico nos processos de biorremediação do LE, para se obter informações
importantes sobre a sucessão microbiológica da biodegradação. Esses dados permitem

252
otimizar o processo de biodegradação, por exemplo, por magnificação dos micro-
organismos específicos de cada etapa do processo.
REFERÊNCIAS

ABDEL-EL-HALEEM, D. Acinetobacter: environmental and biotechnological

applications. African Journal of Biotechnology, vol.2, pp. 71-74, 2003.EL
FANTROUSSI , S. and AGATHOS, S. N. Is bioaugmentation a feasible strategy for
pollutant removal and site remediation. Current Opinion in Microbiology, vol. 8, pp.
268-275, 2005.
GIANICO, A., BRAGUGLIA, C.M., MASCOLO, G. and MININNI, G. Partitioning of
nutrientes and micropollutants along the sludge treatment line: a case study.
Environmental Science and Pollution Research, vol.20, pp.6256-6265, 2013.
KHAN, S., WANG, N., REID, B.J., FREDDO, A. and CAI, C. Reduced
bioaccumulation of PAHs by Lactuca sativa L. grown in contaminated soil amended
with sewage sludge and sewage sludge derived biochar. Environmental Pollution, vol.
175, pp. 64-68, 2013.
LEITÃO, A. L. Potential of Penicillium species in the bioremediation field.
International Journal of Environmental Research and Public Health, vol. 6, pp. 1393 -
1417, 2009.
MAZZEO, D. E. C., FERNANDES, T. C. C., LEVY, C. E., FONTANETTI, C. S. and
MARIN-MORALES, M. A. Monitoring the natural attenuation of a sewage sludge
toxicity using the Allium cepa test. Ecological Indicators, vol. 56, pp. 60-69, 2015.
PARAIBA, L.C and SAITO, M.L. Distribuição ambiental de poluentes encontrados em
lodos de esgoto. Pesquisa Agropecuária Brasileira, vol.40, no.9, pp.853-860, 2005.
SEMPLE, K. T., MORRISS, A. W. J. and PATON, G. I. Bioavailability of hydrophobic
organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis.
European Journal of Soil Science, vol. 54, pp. 809-818, 2003.
SINGH, A., PARMAR, N. and KUHAD, R.C. Bioaugmentation, Biostimulation and
Biocontrol. Springer, vol. 28, pp.364, 2011.TAS, D.O. Respirometric assessment of
aerobic sludge stabilization. Bioresource Technology, vol.101, pp.2592-2599, 2010.
VINÃS, M., SABATÉ, J., ESPUNY, M. J. and SOLANAS, A. M. Bacterial Community
Dynamics and Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Degradation during

253
Bioremediation of Heavily Creosote-Contaminated Soil. Applied Environmental
Microbiology, vol. 71, pp. 7008-7018, 2005.
WATANABE, K. Microorganisms relevant to bioremediation. Current Opinion in
Biotechnology, vol. 12, pp. 237-241, 2001.

254
 OSMAC: Ferramenta útil para a exploração racional da
microbiota subterrânea associada a Senna spectabilis.
Laura V. Simões1*; Victor D. Pavani1; Ian Castro-Gamboa1;

1
Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) – Instituto de
Química, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. *E-mail: [email protected]

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Nos últimos anos, com a diminuição na descoberta de novos fármacos de origem de
produtos naturais, novas fontes de exploração têm surgido, como exemplo a rizosfera e
suas interações microbianas, assim como novas abordagens de estudo estão sendo
aplicadas, como a quimiometria e a OSMAC (One Strain MAny Compounds). Dentro
deste contexto, este trabalho visou o estudo metabolômico do fungo Rhinocladiella
similis, que possui escassos estudos na literatura, pertencente à rizosfera da planta Senna
spectabilis, a qual contém uma vasta variedade de metabólitos com propriedades
farmacológicas. Assim, foi realizado o planejamento fatorial de crescimento do fungo,
visando encontrar as melhores condições de cultivo para a maior variedade de produção
de metabólitos secundários. Os cultivos foram extraídos com acetato de etila e os
extratos foram analisados por CLAE-DAD. Os dados das análises quimiométricas
revelaram que a presença de luz, ausência de agitação sob incubação em um período de
21 dias, foram as condições de cultivo que resultaram em uma maior variedade de
metabólitos.

Palavras-chave: Rhinocladiella similis, rizosfera, quimiometria

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OSMAC: An useful tool for the rational exploration from underground microbiota
associated to Senna spectabilis.
ABSTRACT
In recent years, with the decrease in the discovery of drugs from natural products, new
sources of exploration have been emerged, such as the rhizosphere and its microbial
interaction. New approaches to rationally explore it have been applied, such as
chemometrics and OSMAC (One Strain MAny Compounds). In this context, this work
aimed for the metabolomic study from the fungus Rhinocladiella similis isolates from
the rhizosphere of the plant Senna spectabilis. Studies related to this fungus are still
scarce, even though representatives of this species present a wide variety of metabolites
with pharmacological properties. Therefore, a factorial planning was conducted aiming
a bettering of the fungus growth, towards the best growing conditions for the greater
variety of secondary metabolites production. The experiments were extracted with ethyl
acetate and analyzed by HPLC-DAD. Data from chemometrics analyses revealed that
the presence of light, absence of agitation under incubation in a period of 21 days were
the culture condition that resulted in a great variety of metabolites.

Keywords: Rhinocladiella similis, rhizosphere, chemometrics

255
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Produtos naturais sempre foram uma importante fonte de novos compostos
químicos bioativos, porém, nos últimos anos a descoberta de novos fármacos tem
decrescido, em virtude do conhecimento dos principais quimiotipos produzidos por
plantas e o uso de abordagens reducionistas que incentivam a pesquisa por mecanismos
químicos e farmacológicos em nível molecular (VERPOORTE; CHOI; KIM, 2005).
Para solucionar esse problema, a química de produtos naturais tem buscado alternativas
por fontes naturais ainda pouco exploradas, como exemplo, a rizosfera e suas interações
microbianas, associando ainda novas metodologias de pesquisa, como a OSMAC (One
Strain MAny Compounds), que estimula a variabilidade química, e a quimiometria, que
permite a análise dos complexos processos multifatoriais e sua interpretação
(NICHOLSON; LINDON, 2008).
Dentro dessa perspectiva de exploração por novas fontes e uso de novas
técnicas, o estudo metabolômico do fungo Rhinocladiella similis, pertencente à
rizosfera da planta Senna spectabilis, propõem uma nova fonte para enriquecer os dados
das relações moleculares presentes em matrizes exóticas da planta, a qual se destaca
pela vasta gama de atividades farmacológicas, como antibacteriana, citotóxica,
antifúngica, antioxidante e hepatoprotetora (SELEGATO et al., 2017).

MATERIAL E MÉTODOS
Para realizar a exploração dos metabólitos secundários produzidos pelo fungo
Rhinocladiella similis, foi aplicado o planejamento fatorial, com seleção de três
variáveis de cultivo: luz, agitação e dias de incubação. Esses três parâmetros foram
testados em dois níveis diferentes: ausência de luz ( -1) e presença de luz (+1); ausência
de agitação (-1) e presença de agitação (+1); 21 dias de cultivo (-1) e 28 dias de cultivo
(+1), gerando, portanto, 8 ensaios, dos quais foram feitas duplicatas, resultando em 16
experimentos, conforme mostrado na Tabela 1.
Tabela 1: Condições de crescimento dos ensaios feitos.
nº Agitação(A) Luz(L) Dias(D)
1 1 1 1
2 1 1 1
3 1 1 -1
4 1 1 -1
5 1 -1 -1
6 1 -1 -1
7 1 -1 1

256
 8 1 -1 1
9 -1 -1 -1
10 -1 -1 -1
11 -1 1 1
12 -1 1 1
13 -1 -1 1
14 -1 -1 1
15 -1 1 -1
16 -1 1 -1

Seguindo o planejamento fatorial, foram preparados 16 frascos contendo 300 mL

do meio de cultivo PDB que foram posteriormente autoclavados por 20 minutos. Em
seguida, o fungo foi incubado nos fracos e foram mantidos à temperatura de 21 ºC. Os
meios submetidos à agitação, permaneceram na frequência de 23 Hz. Após o período de
incubação, procedeu-se à filtração à vácuo e a extração líquido–líquido (ELL) dos
metabólitos, utilizando três porções de 100 mL de acetato de etila (AcOEt) para cada
300 mL de filtrado. Posteriormente, o solvente extrator (AcOEt) foi destilado em
evaporador rotatório à vácuo, obtendo-se os extratos brutos, que foram submetidos à
corrida cromatográfica CLAE-CAD para obtenção dos perfis cromatográficos.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após obtenção dos perfis cromatográficos de cada extrato, foi quantificado o
número total de bandas cromatográficas (picos) com o objetivo de encontrar a condição
de cultivo que resulta em maior quantidade de metabólitos secundários produzidos pelo
fungo. Este estudo foi feito, calculando-se os efeitos de primeira, segunda e terceira
ordem dos parâmetros estudados no número total de picos do cromatograma. Os
valores obtidos estão apresentados na Tabela 2. A partir dos efeitos calculados, foi
produzido o gráfico da Figura 1.

Tabela 2: Efeitos de primeira, segunda e terceira ordem do número de picos.

Efeitos: nº picos
1ª ordem 2 ª ordem 3 ª ordem
Agitação (A) Luz (L) Dias (D) A+L A+ D L+D A+L+D
-32,875 7,125 -11,375 -11,375 -10,375 5,125 16,625

257
Figura 1: Efeitos de primeira, segunda e terceira ordem das variáveis selecionadas. E
1, E2, E3: efeito de primeira, segunda e terceira ordem respectivamente. A : agitação, L
: luz e D: dias.

Os dados apresentados na Figura 01 revelam que o efeito mais expressivo foi o

E1A, com variação entre o nível baixo (-1) e alto (+1) de aproximadamente -33, o que
indica que a ausência de agitação influência positivamente na quantidade de metabólitos
secundários produzidos pelo fungo.
Para auxiliar na análise, também foram construídos os gráficos de superfície
mostrados na Figura 2.

Figura 2: Gráficos de superfície do número de picos totais do cromatograma em

função da agitação e luz (a), agitação e luz (b) e quantidade de dias de cultivo e luz (c)

Os gráficos de superfície mostram que o maior número de picos foi obtido na

combinação da presença de luz (+1), menor quantidade de dias de cultivo (-1) e

258
ausência de agitação (-1), resultado assim, como opção de melhor condição de cultivo,
os ensaios 15 e 16. O perfil cromatográfico destes ensaios está ilustrado na Figura 03.

Figura 3: Perfil químico de R. similis obtido por análise em CLAE-DAD.

A partir das condições de cultivo otimizadas, é possível fazer uma comparação

entre os perfis cromatográficos da condição otimizada e o anterior ao tratamento
quimiométrico, que foi obtido da incubação sob agitação, na presença de luz em um
período de 28 dias (Figura 4).

Figura 4: Comparação entre os perfis cromatográficos obtidos por análise em CLAE-

DAD para o extrato bruto otimizado e o das condições iniciais.

Os dados apresentados na Figura 4, revelam que o cultivo nas condições

otimizadas resultou na produção de maior número de picos cromatográficos , ou seja,
maior número de metabólitos secundários.

259
CONCLUSÕES
O estudo do planejamento fatorial realizado permitiu a obtenção dos melhores
parâmetros de cultivo do fungo Rhinocladiella simillis que resultam em maior número
de metabólitos secundários produzidos. Isto é fundamental para desenhos experimentais
posteriores que visem processo de desreplicação de substância conhecidas e etapas de
“scale-up” de substâncias com atividades biológicas promissoras.

AGRADECIMENTO
Ao NuBBE (Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos

Naturais) e ao IQ-UNESP pela infraestrutura e plataforma instrumental. L.V.S agradece

à FAPESP (Processo 2016/04004-9) pela bolsa concedida. Á CAPES e CNPq

(processo: CNPq [449523/2014-4] - MCTI/CNPQ/Universal 14/2014 - Faixa B) e ao

Centro de Pesquisa e Inovação em Biodiversidade e Fármacos – CIBFar – (FAPESP

processo 2013/07600-3).

REFERÊNCIAS

VERPOORTE, R.; CHOI, Y.H.; KIM, H.K., 2005. Ethnopharmacology and systems

biology: A perfect holistic match. Journal of Ethnopharmacology, vol. 100, pp. 53–56,

http://dx.doi.org /10.1016/j.jep.2005.05.033.

NICHOLSON, J. K.; LINDON, J. C., 2008. Metabonomics. Nature, vol. 455, pp. 1054-

1056.

SELEGATO, D. M. et al, 2017. Update: Biological and Chemical Aspects of Senna

spectabilis. J. Braz Chem. Soc., vol. 28, no 3, pp 415-426.

http://dx.doi.org/10.21577/0103-5053.20160322

260
 Influência de biocarvão e rizosfera na microbiota do ciclo do
metano em solo amazônico

Leandro Fonseca de Souza1*; Johnny Carlos Campos Cedano2; Jessica Adriele Mandro1; Newton Paulo
de Souza Falcão2; Siu Mui Tsai1

1
Laboratório de Biologia Celular e Molecular - Centro de Energia Nuclear na Agricultura – Universidade
de São Paulo *e-mail: [email protected]
2
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia.

RESUMO
O metano é um gás de efeito estufa 25 vezes mais potente que o CO2 em seu potencial
de reter calor. Sua concentração atmosférica tem aumentado nos últimos 100 anos, e
atividades agrícolas respondem por parte significativa deste incremento.
Microrganismos são fonte (arquéias metanogênicas) e dreno (bactérias metanotróficas)
biológicos do gás, sendo possível investigar estes grupos através de genes como mcrA
(metanogênicas) e pmoA (metanotróficas). Compreender como o biocarvão influencia
esses microrganismos e qual o efeito da rizosfera em solos amazônicos contribui com
informações para tomada de decisões sobre práticas sustentáveis de manejo do solo.
Neste sentido, experimento com aplicação de distintas concentrações de biocarvão há 10
anos, foi avaliado com plantio de feijão-caupi e o DNA total de solo e rizosfera
utilizado para qPCR dos genes mcrA (mlas-F, mcrA-R) e pmoA (A189-F e MB661-R).
Observou-se que o uso de biocarvão em concentração alta (120 t/ha) aumentou
significativamente a abundância de metanogênicas e reduziu a abundância de
metanotróficas. Entretanto, a rizosfera nestes solos levou a uma redução da abundância
de metanogênicas independente da concentração de carvão utilizada (40, 80 ou 120
t/ha). Assim, sugere-se que a rizosfera de feijão-caupi exerce uma redução significativa
da comunidade metanogênica em solos remediados com biocarvão, nas condições
avaliadas, sendo recomendada a manutenção de cobertura vegetal sobre áreas que
utilizem esta prática agrícola. Novos testes estão em avaliação para confirmação destes
resultados.
Palavras-chave: agricultura tropical, GEE, metanogênese, metanotrofia, qPCR

Influence of biochar and rhizosphere on methane cycle microbiota in Amazonian

soil

ABSTRACT
Methane is a greenhouse gas 25 times as strong as CO2 in its potential to heat retention.
Its atmospheric concentration has increased in the last 100 years, and agricultural
production has contributed to this increase. Microorganisms are a biological source
(methanogenic archaea) and sink (methanotrophic bacteria) in methane cycle, and it is
possible to investigate these biological groups through studies of genes such mcrA

261
(methanogenic) and pmoA (methanotrophic). Understanding how the biochar influences
these microorganisms and the effect of rhizosphere in the Amazon region contribute
with decision-making process for sustainable practices in soil management. In this
context, an experiment with the application of different concentrations of biochar 10
years ago was evaluated with cowpea culture and the total DNA from soil and
rhizosphere used for qPCR of genes mcrA (mlas-F, mcrA-R) and pmoA (A189-F and
MB661-R). It was realized that the use of high concentration of biochar (120 t/ ha)
significantly increased the abundance of methanogens and reduced abundance of
methanotrophs in soil. Nonetheless, the rhizosphere in these soils led to a reduction in
methanogens abundance to pre-application levels, not depending on biochar
concentration (40, 80 or 120 t/ ha). The results suggest that the cowpea rhizosphere
exerts a significant reduction of the methanogenic community in soils remediated with
biochar, in evaluated conditions, as soon it is recommended the maintenance of vegetal
cover in areas with biochar application.

Keywords: tropical agriculture, GHG, methanogenesis, methanotrophy, qPCR

INTRODUÇÃO
Atividades agrícolas respondem por aproximadamente 50% das emissões
globais de metano. Este gás, 20 vezes mais potente que o CO2 em seu potencial de
efeito estufa, é produto natural da ação de arquéias metanogênicas e tem como único
dreno biológico bactérias metanotróficas.
As funções bioquímicas relacionadas aos processos de produção e assimilação
do metano são conhecidas e dois genes destas vias são comumente utilizados como
marcadores funcionais em estudos ambientais: mcrA (methyl-coenzima M redutase), na
produção de metano, e pmoA (metano monooxigenase), em sua assimilação.
Práticas agrícolas que incrementam fertilidade do solo têm sido investigadas
com objetivo de reduzir emissões de metano, como ocorre com o uso de biocarvão (BC)
(principalmente em culturas alagadas). O biocarvão é o produto da queima de materiais
orgânicos sob baixa concentração de oxigênio (pirólise), e se distingue do carvão por
seu uso para melhorar as condições do solo (LEHMANN et al., 2011). Em trabalhos
recentes HAN et al. (2016) e REDDY et al. (2014) avaliaram o efeito da adição de
biocarvão ao solo sobre a emissão de metano e sobre a abundância de metanotróficas.
Ainda que partindo de solos e/ou culturas e ambientes distintos, todos observam
redução da emissão de metano no solo e aumento da abundância de metanotróficas.
A rizosfera influencia a comunidade microbiana do solo em sua atividade,
abundância e composição, impactando diretamente a emissão de Gases do Efeito Estufa
(GEEs) dos solos. Trabalhos investigando culturas de arroz, uma das maiores fontes

262
antropogênicas de emissão de metano, apontam para um aumento da comunidade de
metanotróficas nesta região (HAN et al., 2016; WU; MA; LU, 2009).
Neste contexto, biocarvão e rizosfera de feijão foram avaliados em sua
influência sobre a comunidade microbiana associada ao ciclo do metano, buscando
compreender como a prática de uso de biocarvão e a presença de rizosfera influenciam
metanogênicas e metanotróficas, analisando a abundância destes microrganismos
através de genes marcadores de funções ecológicas.

MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado em estação experimental do Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus/AM (02°37’12’’ S, 060°02’ 27’’ W), em
Latossolo Amarelo distrófico típico “LA d”. A aplicação de BC foi realizada no período
de fevereiro a março de 2006, 10 anos antes deste experimento. O biocarvão foi obtido
por meio da coleta de resíduo da produção de carvão das carvoarias da região
metropolitana de Manaus, moído e peneirado a 2mm. Utilizou-se delineamento em
blocos casualizados com quatro repetições em esquema fatorial 4x4, sendo quatro níveis
40, 80 e 120 e a testemunha 0 t ha-1 de BC na parcela principal, totalizando 16
tratamentos e 4 repetições. O plantio de feijão-caupi (variedade BRS Novaera,
inoculada com Bradyrhizobium sp. INPA 3-11b) foi realizado por semeadura direta e
tamanho da parcela principal foi de 10 x 10 m e as secundarias foram de 5,0 m x 5,0 m,
com área útil de 7 m2.
Coleta do Solo
Para cada tratamento, cinco plantas foram escolhidas aleatoriamente e o solo
aderido diretamente às raízes foi removido cuidadosamente com auxílio de espátulas,
separado dos fragmentos de biocarvão, homogeneizado, acondicionado em tubos de
polipropileno e imediatamente armazenados a – 20ºC.
Solos adjacentes às plantas de feijão foram coletados em área distante a 10m do
local do experimento e entre si, com e sem adição de biocarvão, na camada de 0-10cm
(cinco pontos homogeneizados).
Extração de DNA total e quantificação por PCR (qPCR) dos genes pmoA e
mcrA
O DNA total do solo de cada tratamento e controles foi extraído em duplicata
com o kit PowerLyzer PowerSoil DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories), de acordo
com o protocolo fornecido pelo fabricante. A quantidade e qualidade das amostras de

263
DNA foi analisada em espectrofotômetro Nanodrop 2000c (Thermo Fisher Scientific)
com densidade ótica de 260 nm.

A técnica de PCR quantitativo em tempo real (qPCR) foi utilizada para

quantificar os genes associados ao ciclo do metano mcrA e pmoA (Tabela 1) a partir das
amostras de DNA total do solo. Para cada gene, foi construída uma curva padrão entre
10 e 10⁷, obtido previamente por PCR a partir de isolados DSMZ (Deutsch Collection of
Microorganism and Cell Cultures). A técnica foi realizada em triplicata para cada
amostra no equipamento StepOne Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems),
com um volume final de 10 μL, contendo 5 μL do SYBR ® Green ROX qPCR (Thermo
Fisher Scientific), 1 μL de cada primer (5 pmols), 1 μL de DNA (10 ng/μL), 0,2 μL de
BSA a 20 mg/mL (Thermo Fisher Scientific) e 1,8 μL de água ultrapura (Milli-Q)
autoclavada.⁠

Tabela 1: Primers, sequência e condições de reação

Análise dos dados

As quantificações obtidas foram analisadas quanto a diferenças estatísticas
utilizando os testes t-student, para comparações Rizosfera x Solo Adjacente e ANOVA
(analysis of variance) com teste post-hoc tukey hsd, para comparação entre mais de dois
tratamentos, utilizando programa PAST.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A abundância de microrganismos associados tanto à metanogênese, quanto à

metanotrofia, sofre influência de práticas agrícolas, tanto pela rizosfera como pelo uso
de biocarvão. A abundância de arquéias metanogênicas é aumentada no solo rizosférico,
sem adição de biocarvão (Fig. 1a), porém a abundância de metanotróficas é reduzida
(Fig. 1b). Isto implica que a rizosfera pode contribuir com emissões de CH4 nestes
solos. Este efeito pode estar associado às condições de anaerobiose e maior umidade do
solo rizosférico, necessárias para produção de metano, além da disponibilização de

264
amônia (competidor com metano pelo sítio da monooxigenase) (PHILIPPOT et al.,
2009).

Quantificação dos genes mcrA e pmoA em solo rizosférico sob uso de biocarvão

Figura 1: Quantificação dos genes mcrA (a) e pmoA (b) em solo rizosférico amazônico sob cultivo de
feijão caupi e uso de biocarvão. R = Rizosfera, A = Solo Adjacente, B = Solo com adição de biocarvão
na concentração 120 t/ha. Asterisco representa diferenças estatísticas significativas (P > 0,01).

A adição de biocarvão a concentrações de 120 t/ha, nas condições avaliadas,

leva a um aumento significativo da abundância de arquéias metanogênicas, porém não
altera significativamente a comunidade metanotrófica. Isto indica que o uso de
biocarvão nesta concentração pode levar a aumento das emissões de CH 4 a partir do
solo. Todavia, a rizosfera do solo com biocarvão reduz a abundância de metanogênicas
significativamente a valores próximos ao observado em solo natural (Fig. 1a). A
presença de rizosfera regula as comunidades de metanogênicas e metanotróficas
mantendo-as nos mesmos valores de abundância, sem distinção significativa entre as
três concentrações de biocarvão aplicadas (ANOVA, α = 0,05). Este resultado ressalta a
importância da cobertura vegetal através da rizosfera na mitigação de emissão de
metano a partir de solos agrícolas, ainda que distintas espécies tragam diferentes
contribuições ao processo.
Na ausência de rizosfera, o solo favorece bactérias metanotróficas, o que permite
inferir capacidade de assimilação de metano natural. Esta resposta está ligada à presença
de oxigênio no solo, que é tanto requerida no desenvolvimento das metanotróficas
quando restritiva ao desenvolvimento de metanogênicas. A adição de biocarvão leva a
um aumento da abundância de metanogênicas/ metanotróficas em mais de 15 vezes, à
medida que eleva também a capacidade de campo do solo e favorece o desenvolvimento
destes microrganismos (NESBIT; BREITENBECK, 1992). Este aumento, no entanto,
pode ser mitigado pela rizosfera, capaz de reduzir esta relação a valores próximos ao
observado em solos naturais.

265
CONCLUSÕES

O uso de biocarvão em altas concentrações (120 t/ha) pode favorecer o aumento

da comunidade metanogênica e a redução da comunidade metanotrófica nas condições
avaliadas. No entanto, manter cobertura vegetal sobre a área leva a uma redução da
comunidade metanogênica para níveis de um solo sem adição de biocarvão, devido ao
efeito da rizosfera que atua como fator mitigador.

AGRADECIMENTO
Às instituições CAPES, CNPq e FAPESP pelo financiamento da pesquisa e
bolsas de estudo concedidas.

REFERÊNCIAS
(ANGEL; CLAUS; CONRAD, 2012; COSTELLO; LIDSTROM, 1999; HOLMES et al., 1999; STEINBERG; REGAN, 2008)

HAN, X. et al., 2016. Mitigating methane emission from paddy soil with rice-straw
biochar amendment under projected climate change. Scientific Reports, vol. 6, no.
24731, pp. 1-10. <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27090814>.

LEHMANN, J. et al., 2011. Biochar effects on soil biota - A review. Soil Biology and
Biochemistry, 19th International Symposium on Environmental Biogeochemistry. vol.
43, no. 9, p. 1812–1836. doi:10.1016/j.soilbio.2011.04.022

NESBIT, S. P.; BREITENBECK, G. A., 1992. A laboratory study of factors influencing

methane uptake by soils. Agriculture, Ecosystems & Environment, vol. 41, no. 1, pp.
39–54, . http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/016788099290178E.

PHILIPPOT, L. et al., 2009. Spatial patterns of bacterial taxa in nature reflect ecological
traits of deep branches of the 16S rRNA bacterial tree. Environmental Microbiology,
vol. 11, no. 12, pp. 3096–3104. doi:10.1111/j.1462-2920.2009.02014.x/abstract.

REDDY, K. R. et al. Enhanced Microbial Methane Oxidation in Landfill Cover Soil

Amended with Biochar. Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering,
vol. 140, no. 9, pp. 4014047, 2014. doi:10.1061/(ASCE)GT.1943-5606.0001148.

WU, L.; MA, K.; LU, Y., 2009. Rice roots select for type I methanotrophs in rice field
soil. Systematic and Applied Microbiology, vol. 32, no. 6, pp. 421–428
http://doi.org/10.1016/j.syapm.2009.05.001.

266
 Seleção de bactérias ácido láticas da silagem de capim
Mombaça (Panicum maximum) baseada nas suas
propriedades funcionais in vitro
Lorena Resende Oliveira Amaral1*; Paola de Oliveira Maciel1; Claudia Cristina Auler do Amaral Santos1

1
Universidade Federal do Tocantins. *[email protected] (autor para correspondência)
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Os inoculantes na forma de bactérias produtoras do ácido lático são aditivos capazes de
reduzir a perda de matéria seca, limitar fermentações secundárias, aumentar o valor
nutritivo e a estabilidade aeróbia do material ensilado. Desta forma, o presente estudo
teve como objetivo isolar e selecionar potenciais bactérias ácido-láticas (BAL) com
características probióticas da silagem de capim Mombaça (Panicum maximum). Foram
isoladas 101 bactérias em meios PCA e MRS e estas, foram submetidas a testes
morfológicos e fisiológicos para seleção de estirpes com características específicas de
BAL. Oito estirpes da silagem de capim Mombaça e 2 estirpes isoladas de inoculante
comercial (controle) foram submetidas a testes in vitro para seleção de potenciais BAL
probióticas. Dentre estas, foi possível observar que 60% dos isolados conseguiram
sobreviver em valores de pH=3,0. No pH=2,0, 80% dos isolados mantiveram a
população de células viáveis acima de 6,77 Log UFC/mL e a resistência a bile foi
variável entre as estirpes. Além disso, observou-se que os isolados apresentaram uma
superfície celular hidrofílica (70%), com características ácidas (80%). Dessa forma, foi
possível selecionar estirpes com potencial para serem utilizadas na produção de
inoculantes específicos para a silagem de capim Mombaça, que apresentem
características funcionais benéficas a saúde dos ruminantes.

Palavras-chave: BAL; Ensilagem; Nutrição de ruminantes; Probióticos; Sucessão

microbiológica.
______________________________________________________________________________________________

Selection of lactic acid bacteria from Mombasa silage grass

(Panicum maximim) based on in vitro functional properties

ABSTRACT
Lactic acid bacteria inoculants are additives that reduce the loss of dry matter, limiting
secondary fermentation, improving the nutritional value and the aerobic stability of
silage. In this way, the objective of this study was isolate and select potential lactic acid
bacteria (LAB) with probiotic characteristics in Guinea grass silage (Panicum
maximum). 101 bacteria were isolated in PDA, PCA and MRS mediam and its were
submitted to morphological and physiological tests for selection of strains with specific
characteristics of LAB. Eight strains of Mombasa grass silage and 2 strains isolated
from commercial inoculant (control) were submitted to in vitro tests for selection of
potential probiotic LAB. Between them, it was possible to observe that 60% of isolates
were able to survive on values of pH=3.0. At pH=2.0, 80% of the isolates maintained

267
the population of viable cells above 6.77 Log CFU/mL and the resistance to bile was
variable among the strains. In addition, it was observed that the isolates showed a
hydrophilic cell surface (70%), with acid characteristics (80%). In this way, it was
possible to select strains with potential to be used in the production of specific
inoculants for grass silage Mombasa, presenting beneficial functional characteristics to
ruminants health.

Keywords: LAB, Ensiling, ruminant nutrition, probiotics, microbial succession.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
A conservação de forrageiras na forma de silagem é uma das alternativas que
garante o fornecimento de material fibroso e de alta qualidade aos ruminantes durante
os períodos de escassez de alimento. Embora existam diversos tipos de forrageiras,
como por exemplo, o milho, o sorgo, a cana-de-açúcar, o girassol e o capim-elefante,
que são comumente utilizados para a produção de silagem, a obtenção de forragem
conservada de gramíneas tropicais perenes, como a de capim Mombaça tem se mostrado
viável e segura para o consumo de ruminantes (Vieira et al., 2010).
No Brasil, os resultados do uso de aditivos presentes no mercado sobre a
qualidade das silagens ainda não são satisfatórios (Zopollatto; Daniel; Nussio, 2009). A
falta de respostas favoráveis na maioria dos estudos envolvendo o uso de aditivos
bacterianos em regiões de clima tropical possivelmente está vinculada à utilização de
inoculantes contendo cepas isoladas de plantas forrageiras de clima temperado (Rufino,
2014). Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi selecionar bactérias ácido-
láticas (BAL) da silagem de capim Mombaça (Panicum maximum) que sejam
potencialmente probióticas.

MATERIAL E MÉTODOS
As análises foram realizadas no LABAP (Laboratório de Biotecnologia/Análise
de Alimentos e Purificação de Produtos), na Habite – Incubadora de Empresas de
biotecnologia da Universidade Federal do Tocantins (UFT), Câmpus de Gurupi. As
amostras foram obtidas da empresa SPI confinamentos, localizada nas proximidades da
BR-242, km 382, Zona Rural, Gurupi-TO. Foram coletadas 3 amostras aleatórias do silo
recém-aberto e 2 amostras da pilha separada para uso diário em dezembro de 2015.
As amostras foram avaliadas utilizando meios de cultura seletivos comerciais
(MRS, PCA e MacConkey) para cada grupo de microrganismos potencialmente
presente na silagem de capim Mombaça (Bactérias ácido láticas, bactérias mesófilas

268
aeróbias e enterobactérias). O isolamento de bactérias ácido-láticas presentes no
inoculante comercial (SIL-ALL 4X4®) também foi realizado e estas foram utilizadas
como controle durante a realização dos testes in vitro das potenciais BAL probióticas.
Após a caracterização morfológica das colônias, os isolados bacterianos purificados dos
meios comerciais MRS e PCA foram submetidos a testes de coloração diferencial de
Gram, método KOH de Halebian et al. (1981), catalase, oxidase, motilidade e
esporulação (Holt et al., 1994). E então, testes específicos foram realizados com as
potenciais BAL: Resistência a diferentes valores de pH (7.2 - controle, 3.0 e 2.0)
(PRASAD et al., 1999); Tolerância a sais biliares (0%-controle, 1% e 2%) (Mishra e
Prasad, 2005; Menconi et al., 2014); Hidrofobicidade da superfície celular (adaptado de
Barbosa et al., 2005) e teste de coexistência (adaptado de Guo et al., 2010).

RESULTADOS E DISCUSSÃO
A população de potenciais BAL foi maior (6,85 Log UFC/g) quando comparada
com os outros grupos microbianos. Entretanto, sua diferença em relação a bactérias
mesófilas aeróbias e enterobactérias não foi significativa (0,06 Log UFC/g e 1,11 Log
UFC/g, respectivamente). Isso nos mostra que durante as fases de estabilização e
deterioração aeróbia da silagem de capim Mombaça, a população de BAL não foi
suficiente para impedir o crescimento de microrganismos indesejáveis.
Dos isolados presentes no ágar MRS, 27,6% apresentaram as seguintes
características: Gram positivas, catalase negativas, raramente com motilidade e não
formadoras de esporos; e foram selecionadas para a realização de testes específicos para
selecionar cepas de potenciais probióticos. A tolerância ao ácido e à bile foi estudada
para prever a sobrevivência das bactérias selecionadas após a alimentação animal. Os
resultados mostraram que em baixos valores de pH, as bactérias selecionadas (27,6%)
perderam viabilidade em uma faixa que variou de 0,70% a 36,8%, ou seja, as células
viáveis de todos os isolados foram afetadas pela alta acidez, principalmente no pH=2,0.
Os resultados mostraram também que, dos 10 isolados selecionados, 60% exibiram
tolerância ao pH=3,0, durante 3h. E no pH=2,0, 80% dos isolados mantiveram a
população de células viáveis acima de 6,77 Log UFC/mL.
A tolerância a sais biliares tem sido considerada uma condição para colonização
e atividade metabólica das bactérias no intestino do hospedeiro, além disso, estes sais
podem influenciar a microbiota intestinal agindo como molécula antimicrobiana
(Menconi et al., 2014). Nas concentrações de 1 e 2% de Oxbile houve uma variação na

269
susceptibilidade dos isolados, que é esperada, já que esta propriedade é específica entre
espécies e estirpes (Gilliland; Staley; Bush, 1984). Os isolados do inoculante comercial
apresentaram resistência distinta nos teores de 1 e 2% de bile. A concentração de 1% de
oxbile favoreceu o crescimento do isolado SIL1 até o tempo 3h e após este período,
ocorreu uma redução de 29,7% nas células viáveis. E as células do isolado SIL2
mantiveram constante para as 2 concentrações (1% e 2%) para todos os períodos de
tempo (0, 3 e 12h). Os isolados SPI10 e SPI12 (isolado do capim Mombaça) foram os
microrganismos que apresentaram maior resistência a diferentes concentrações de bile,
com quedas de células viáveis menores que 1,0 Log UFC/mL nas duas concentrações de
bile nos três períodos de tempo avaliados. Entretanto, o isolado SPI12.1 não conseguiu
sobreviver a diferentes concentrações de bile (1 e 2%).
A determinação da adesão de microrganismos a hidrocarbonetos estima a
capacidade das estirpes em aderir à células epiteliais, que é uma das características
importantes das BAL probióticas (Dhewa et al., 2008). A hidrofobicidade em solvente
apolar (xilol) das bactérias selecionadas variaram em uma faixa entre 0,1% - 34,3%, ou
seja, 70% das estirpes testadas demonstraram uma superfície hidrofílica. Em solvente
ácido (clorofórmio) a hidrofobicidade dos isolados variou em uma faixa de 6,36% -
40,78% e em solvente básico (acetato de etila), obteve-se uma variação de 15,39% -
83,65%. Estes dados nos mostram que as potenciais BAL isoladas apresentam afinidade
a solventes básicos e um caráter ácido, sendo forte aceptoras de elétrons. O caráter ácido
da superfície celular dos isolados pode estar associado à presença de polissacarídeos
ácidos e neutros, proteínas e também ao ácido teicóico, que são determinantes para que
ocorra a interação da bactéria e o seu ambiente. Além disso, eles podem influenciar
indiretamente as propriedades de adesão das bactérias, através da modificação das
propriedades físico-químicas da parede celular bacteriana (Burgain et al., 2014).
O teste de coexistência foi conduzido para determinar se os isolados
selecionados podem ser co-cultivados. Os isolados testados não mostraram antagonismo
uns com os outros. Desta forma, os mesmos poderão ser analisados posteriormente em
processos fermentativos mistos, o que é vantajoso, pois multi-espécies e multi-cepas de
bactérias ácido-láticas probióticas podem apresentar uma melhor colonização no trato
gastrointestinal como também podem combinar diferentes mecanismos de ação de
forma sinérgica e assim, melhorar o processo de fermentação (Timmerman et al., 2004).

CONCLUSÕES

270
 A partir deste trabalho, foi possível obter cepas de potenciais BAL, que poderão
ser utilizadas para a produção de inoculantes específicos a silagem de capim Mombaça
e que são potencialmente estirpes probióticas, devido aos resultados obtidos pelos testes
in vitro. As potenciais BAL probióticas conseguiram resistir a valores de pH=3,0, fator
interessante tanto para a utilização delas em futuras fermentações, como também para
prever a resistência das cepas no rúmen. E como, as cepas isoladas não apresentaram
antagonismo entre si, as mesmas poderão ser testadas em co-cultivos na fermentação da
silagem.

AGRADECIMENTO
À UFT, pelo apoio financeiro, o LABAP (Laboratório de Biotecnologia/Análise
de Alimentos e Purificação de Produtos) e a Habite – Incubadora de Empresas de
Biotecnologia da Universidade Federal do Tocantins (UFT), Câmpus de Gurupi, por
disponibilizarem o espaço do laboratório para a realização dos experimentos.

REFERÊNCIAS

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272
 Potencial micotoxigênico de fungos isolados de solos de vinha
Luísa Freire1*; Fabiana Reinis Franca Passamani2; Guilherme Prado3; Giuliano Elias Pereira4, Luís
Roberto Batista2

1
Universidade Estadual de Campinas. *[email protected]
2
Universidade Federal de Lavras.
3
Fundação Ezequiel Dias.
4
Embrapa - Semiárido.

______________________________________________________________________________________________
RESUMO
A incidência de fungos nas uvas varia de acordo com a região vinícola, práticas
agrícolas, condições climáticas, colheita, variedade das uvas e da microbiota presente no
solo. Nesse sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar a diversidade de fungos do
gênero Aspergillus e Penicillium produtores de micotoxinas isolados de solo de vinha
da região tropical semiárida do Brasil. Utilizou-se o Método Plug Ágar em
Cromatografia de Camada Delgada para avaliar o potencial toxigênico de Aspergillus.
Para avaliar a produção de citrinina por Penicillium utilizou-se o Método Agar Creme
de Coco. A incidência fúngica nos solos dos vinhedos variou de 2,34 x 10³UFC/g a 4,35
x 104UFC/g. As espécies identificadas foram: A. aculeatus, A. japonicus, A.
carbonarius, A. niger, A. niger Agregado, A. foetidus, A. ochraceus, A. parasiticus, A.
flavus, A. sojae, P. citrinum, P. sclerotiorum, P. implicatum, P chrysogenum e P.
corylophilum. Todos os isolados de A. carbonarius, 18,18% de A. niger, 14,29% de A.
niger Agregado e 60% de A. ochraceus foram produtores de ocratoxina A (OTA).
Todos A. parasiticus foram produtores de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, enquanto que
apenas 14,28% de A. flavus foram produtores de aflatoxina B1, B2. 98,67% de P.
citrinum foram produtores de citrinina. A incidência de fungos variou de acordo com o
solo da vinha. A presença destas espécies indica a sua ocorrência natural em áreas de
vinho.

Palavras-chave: Aflatoxina. Citrinina. Ocratoxina A. Uvas. Viticultura.

______________________________________________________________________________________________

Mycotoxigenic potential of fungi isolates of vineyard soil

ABSTRACT
The incidence of fungi in grapes varies depending on the variety, the wine
region, agricultural practices, weather conditions, the harvest and microbiota present in
the soil. In this sense, the objective of this study was to evaluate the diversity of
Aspergillus and Penicillium fungi mycotoxin producers isolated from vineyard soil of
the semi-arid tropical region of Brazil. To evaluate the toxigenic potential of
Aspergillus, we used the Agar Plug Method on Thin Layer Chromatography and to
assess the production of citrinin by Penicillium we used the Coconut Cream Agar
Method. Contamination of vineyard soil ranged from 2.34 x 10³CFU/g to 4.35 x
104CFU /g. The species found were A. aculeatus, A. japonicus, A. carbonarius, A.
niger, A. niger Agregado, A. foetidus, A. ochraceus, A. parasiticus, A. flavus, A. sojae,

273
P. citrinum, P. sclerotiorum, P. implicatum, P chrysogenum and P. corylophilum. All
isolates of A. carbonarius, 18.18% of A. niger, 14.29% of A. niger Aggregate and 60%
of A. ochraceus were OTA producers. All A. parasiticus were producers of B1, B2, G1
and G2 aflatoxins, whereas only 14.28% of A. flavus were producers of B1, B2
aflatoxin. 98.67% of P. citrinum were citrinin producers. It was observed that the fungi
incidence vary according to the vineyard soil. The presence of identified species shows
that are naturally present in wine areas.

Keywords: Aflatoxin. Citrinin. Grapes. Ochratoxin A.Viticulture.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
As uvas (Vitis vinifera L.) estão sujeitas à contaminação por micro-organismos
presentes no ambiente da lavoura, colheita e na elaboração dos vinhos. Estes, estão
naturalmente presentes na camada superior do solo de cultivo das videiras e são
carreados para os cachos, podendo se desenvolver nas bagas (Leong et al., 2006). No
entanto, têm-se observado que a incidência destes fungos e os níveis de produção de
micotoxinas variam em função da variedade das uvas, da região vitivinícola, das
práticas agrícolas adotadas, das condições climáticas, da safra e do processo de
elaboração dos vinhos.
O principal fungo filamentoso responsável pela podridão da uva é Botrytis
cinerea, um patógeno que danifica as bagas e tem um efeito prejudicial nas
propriedades organolépticas das uvas e seus derivados. No entanto, a maioria dos
estudos sobre fungos filamentosos em uvas tem-se concentrado nos gêneros Aspergillus
e Penicillium, os quais também causam podridão nas uvas, tornando-as secas e com
aspecto enrugado e têm sido associados à deterioração de uvas e produção de
micotoxinas (Rousseaux et al., 2014). Nesse sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar
a diversidade de fungos do gênero Aspergillus e Penicillium produtores de micotoxinas
isolados de solo de vinha da região tropical semiárida do Brasil.

MATERIAL E MÉTODOS
Área de estudo e amostragem
Foram coletadas doze amostras de solos em que são cultivadas as variedades de
uvas: Barbera, Cheni Blanc, Moscato Itália, Moscato Canelli, Ruby Cabernet, Syrah,
Tempranillo e Touriga Nacional na safra 2014/2 na região vitivinícola do Vale do
Submédio São Francisco. Um transecto diagonal ao longo do vinhedo foi traçado e as
amostras de solo foram coletadas no entorno de três plantas equidistantes (P1, P2, P3)
desprezando-se as extremidades. Quatro subamostras (p1, p2, p3, p4) foram retiradas na

274
profundidade de 10 cm, em um raio de 20 cm no entorno da planta. As subamostras
foram homogeneizadas formando uma amostra composta em cada ponto.
Análise micológica dos solos de cultivo de uvas (Vitis vinifera L.)
Para o plaqueamento dos solos utilizou-se a técnica de diluição seriada em meio
de cultura DG-18 – Ágar Dicloran Glicerol a 18% (HIMEDIA®). As placas foram
incubadas a 25°C por sete dias, e os resultados foram expressos em unidades
formadoras de colônia de fungos filamentosos (UFC/g), conforme Pitt e Hocking
(1997).
Identificação fenotípica das espécies de fungos dos gêneros Aspergillus e
Penicillium
A partir das culturas puras, foram identificados os fungos do gênero Aspergillus
e Penicillium de acordo com Klich (2002) e Pitt (2000). Os isolados foram incubados
em meios de cultura CYA - Ágar Czapek Levedura (SYNTH) a 25ºC e a 37ºC e MEA -
Ágar Extrato de Malte (ACUMEDIA) a 25ºC. Após sete dias de incubação foram
observadas as características macroscópicas e microscópicas dos fungos filamentosos.
Avaliação do potencial toxigênico de fungos do gênero Aspergillus
O potencial micotoxigênico dos fungos foi avaliado através do método de Plug
Agar em cromatografia de camada delgada conforme Filtenborg e Frisvad (1980). Os
isolados considerados produtores de ocratoxina A (OTA) e Aflatoxinas B1, B2, G1 e
G2 apresentaram um fator de retenção e um spot de fluorescência semelhante ao do
padrão.
Detecção da produção de citrinina por fungos do gênero Penicillium
A avaliação da produção de citrinina foi realizada pelo método de Ágar Creme
de Coco segundo Mohamed et al. (2013). Os isolados considerados produtores de
citrinina apresentaram fluorescência verde-amarelo intenso ao redor da colônia.
Análises estatísticas
Para avaliar se houve diferença na frequência de ocorrência de Aspergillus e
Penicillium nos solos de vinha utilizou-se uma análise de variância (ANOVA), com um
teste a posteriori de Tukey.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

275
1 Percentual de contaminação por fungos pertencentes aos gêneros
Aspergillus e Penicillum em solos de vinha
A presença de fungos do gênero Aspergillus e Penicillium foi detectada em todas
as amostras de solos analisadas (Gráfico 1) e sua densidade variou de 2,34x10³ UFC/g a
4,35x104 UFC/g.

Gráfico 1- Densidade de incidência de fungos do gênero Aspergillus e Penicillium nas

amostras de solos de vinha. Letras diferentes mostram diferença estatística significante a
p<0,05
O solo é considerado um inóculo para as uvas, já que antes da suscetibilidade
das bagas os fungos precisam sobreviver no vinhedo. Fatores como a atividade de água
e temperatura afetam a sobrevivência dos esporos destes fungos, influenciando no
inóculo inicial quando as uvas se tornam suscetíveis (Bellí et al., 2005). A
contaminação das bagas pode estar relacionada com a dispersão dos esporos do solo,
através do ar, para as bagas. Porém, segundo Garbeva et al. (2004), as interações entre
as plantas e solo são complexas, com ambos exercendo efeito sofre a comunidade
microbiana.
2 Incidência de fungos dos gêneros Aspergillus e Penicillum em solos de vinha
Foram isolados um total de 508 fungos do gênero Aspergillus e Penicillium a
partir de solos de cultivo de uva viníferas da região do Vale do Submédio São
Francisco. Destes, 68,70% pertencentes ao gênero Aspergillus e 31,30% ao gênero
Penicillium.
Aspergillus Seção Nigri foram encontrados em todos os solos avaliados,
Aspergillus Seção Flavi em 83,33% e Aspergillus Seção Circumdati em apenas 46,67%
dos solos. A. niger foi a espécie de maior incidência, seguido por P. citrinum, estando
ambos presentes em todas as amostras. Aspergillus aculeatus foram isolados em todas
as amostras, exceto no solo de cultivo da variedade Moscato Itália 1. Já A. japonicus foi

276
encontrado em apenas 33,33% das amostras avaliadas. Aspergillus niger Agregado, A.
foetidus, A. ochraceus, A. parasiticus, A. flavus, A. sojae, P.sclerotiorum, P.
implicatum, P chrysogenus e P. corylophilum também estavam presentes nos solos de
vinhedo, porém em baixa frequência e sua distribuição variou de acordo com as
amostras.
3 Capacidade toxigênica de espécies dos gêneros Aspergillus e Penicillum
Das espécies pertencentes à Seção Nigri, 24,23% foram produtoras de OTA.
Aspergillus carbonarius mostrou-se a única espécie 100% produtora, enquanto as
espécies A. japonicus, A. aculeatus e A. foetidus não mostraram habilidade para
produção desta toxina. 18,18% das cepas de A. niger e 14,29% das cepas de A. niger
Agregado também foram produtores de OTA. Dos isolados de A. ochraceus, 60% foram
produtores de OTA. A porcentagem de cepas de A. ochraceus produtores de OTA
relatada na literatura é bastante variável, variando de 10 a 54,5% (Abarca et al., 2001;
Pitt e Hocking, 1997).
Dos 56 Aspergillus Seção Flavi isolados, todos os A. parasiticus (4) foram
produtores de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, enquanto que apenas 14% de A. flavus
foram produtores de aflatoxina B1, B2. Além disto, nenhum A. sojae foi produtor de
toxina. Estas espécies não são consideradas membros comuns da micobiota das uvas e
estudos conduzidos em países mediterrâneos reportaram baixa incidência das mesmas
(Martínez-Culebras; Ramon, 2007; Medina et al., 2005).
Todos os P. citrinum foram produtores de citrinina, no entanto, esta toxina tende
a ser degradada no processo de fermentação ao longo da elaboração de vinhos, não
conferindo um risco potencial para à saúde do consumidor (Rousseaux et al., 2014).

CONCLUSÕES
A. carbonarius e P. citrinum foram as principais espécies produtoras de
micotoxinas, o que indica que estas espécies sejam responsáveis pela contaminação de
uvas por micotoxinas no Vale do Submédio São Francisco.

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279
 Tolerância de Stenotrophomonas acidamiliphila a ácido
ferúlico
Maitê Bernardo Correia dos Santos ; Guillermo Ladino Orjuela ; Eleni Gomes
1* 1 1

Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”, Departamento de microbiologia - Laboratório

1

de Bioquímica e Microbiologia Aplicada - IBILCE-UNESP/ Campus de São José do Rio Preto-SP

*e-mail (autor para correspondência): [email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Na produção de bioetanol, pré-tratamentos que tem como objetivo extrair a lignina da
biomassa tornando os açucares disponíveis, geram uma série de compostos fenólicos
que exercem efeitos tóxicos, dentre eles o ácido ferúlico. Os quais para eliminação têm
sido utilizados métodos físicos, químicos e biológicos. Entre os biológicos, os
microrganismos e/ou suas enzimas podem ser aplicados para diminuir os níveis de
toxicidade ou até para a mineralização total do composto. A cepa bacteriana
Stenhotrophomonas acidamiliphila, relatada como degradadora de compostos
aromáticos, foi cultivada em meio nutritivo na presença de ácido ferúlico sob as
concentrações de 100 mg L , 200 mg L , 300 mg L , 400 mg L e 500 mg L , incubados
-1 -1 -1 -1 -1

durante 22 horas, numa incubadora orbital a 30ºC e agitação de 150 rpm, com o intuito
de observar o crescimento na presença deste composto e estipular a tolerância da cepa.
Os resultados mostraram que até a concentração de 300 mg L , quando comparado com
-1

o controle, não há inibição do crescimento, e acima de 400 mg L já é notável o prejuízo -1

ao crescimento. A cepa demonstrou níveis de tolerância acima dos relatados na

literatura para estirpes bacterianas testadas em tais condições.

Palavras-chave: Bioetanol, inibidor, composto fenólico, tolerância, detoxificação.

______________________________________________________________________________________________

Tolerance of Stenotrophomonas acidamiliphila to ferulic acid

ABSTRACT
In the bioethanol production, pre-treatments aim to extract lignin from biomass and
release fermentable sugars, generating a series of phenolic compounds that exert toxic
effects, among them the ferulic acid. Physical, chemical and biological methods have
been used to eliminate phenolic compounds. Among the biological methods,
microorganisms and / or their enzymes can be applied to decrease the levels of toxicity
or even to the total phenolic compounds mineralization. The bacterial strain,
Stenhotrophomonas acidamiliphila, reported as degrading of aromatic compounds, was
cultivated in nutrient medium in the presence of ferulic acid with concentrations of 100
mg L , 200 mg L , 300 mg L , 400 mg L and 500 mg L , incubated for 22 hours in an
-1 -1 -1 -1 -1

orbital incubator at 30°C and 150 rpm, in order to observe the growth in the presence of
this compound and stipulate the tolerance of the strain. The results showed that under
concentrations of 300 mg L , when compared to the control, there is no growth
-1

inhibition, and above 400 mg L , growth impairment is notable. The strain demonstrated
-1

ferulic acid tolerance in levels above those reported in the literature.

Keywords: Bioethanol, inhibitor, phenolic compound, tolerance, detoxification.

______________________________________________________________________________________________
280
INTRODUÇÃO
Os principais componentes dos materiais lignocelulósicos são celulose,
hemicelulose e lignina. Os dois primeiros correspondem aos polímeros de açúcar,
aproveitáveis para os processos de fermentação alcoólica ou para obtenção de outros
bioprodutos. A lignina, por outro lado, corresponde a um polímero fenilpropano,
constituído por alcoóis p-cumaril, coniferílico, sinapílico. A constituição aromática e as
ligações éter conferem a esse composto elevada estabilidade frente a agentes químicos e
biológicos, o que torna a molécula altamente recalcitrante (Campbell and Sederoff,
1996).
Quando da utilização do material lignocelulósico para a produção de bioetanol,
essa característica constitui uma barreira para a obtenção dos açúcares fermentescíveis,
sendo necessário que tal biomassa seja submetida a processos de pré-tratamento e
hidrólise, a fim de quebrar suas estruturas e adaptá-las a formas acessíveis por enzimas
para fermentação e bioconversão, liberando diversos compostos fenólicos como
resíduos de degradação da lignina (Adeboye et al., 2014).
A composição dos compostos fenólicos formados durante o pré-tratamento
depende tanto da espécie da planta como do método de pré-tratamento. Em geral, a
mistura resultante é normalmente constituída por ácidos fenólicos, aldeídos fenólicos,
alcoóis fenólicos e cetonas fenólicas, todas eles inibidores das células, impactando
diretamente na produtividade do etanol de S. cerevisiae (Larsson et al., 1999).
Determinados compostos fenólicos, tais como o ácido ferúlico (ácido 4-hidroxi-
3-metoxicinâmico), podem ser assimilados e convertidos por S. cerevisiae, no entanto
existem concentrações nas quais a mesma não pode sobreviver, inibindo ainda enzimas
importantes para a sacarificação como a β-glucosidade. O ácido ferúlico é um dos
ácidos fenólicos mais abundantes na matéria lignocelúlosica, existindo de forma livre
ou ligada covalentemente a lignina e outros polímeros da planta como a hemicelulose
(Adeboye et al., 2014).
Para a eliminação destes compostos os métodos biológicos apresentam-se como
uma alternativa eficiente e sustentável, o gênero Stenotrophomonas é metabolicamente
versátil e ocorre ubiquamente no ambiente (Ryan et al., 2009). Muitas espécies de
Stenotrophomonas vêm sendo isoladas de ambientes diversos e implantadas na
degradação de uma gama de compostos aromáticos orgânicos e inorgânicos (Batisson et
al., 2007; Dwivedi and Singh; 2010).
Dessa forma, este estudo procedeu-se com a finalidade de identificar a
capacidade de Stenotrophomonas acidamiliphila tolerar a presença de ácido ferúlico,
sendo a mesma isolada em solo com registro de contaminação por hidrocarbonetos
aromáticos, em São José do Rio Preto, São Paulo.

MATERIAL E MÉTODOS

Microrganismo

Foi utilizada a cepa bacteriana de Stenotrophomonas acidamiliphila, depositada

em coleção do Laboratório de Bioquímica e Microbiologia Aplicada do Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE), da Universidade Estadual Paulista
“Júlio Mesquita Filho”.

281
 Meio de cultivo

Meio nutritivo “Lysogeny broth” (LB) (Bertani, 1951): Glicose 0,2%, Cloreto de
sódio 0,1%, triptona 1% e extrato de levedura 0,5%.

Cultivo
O pré-inóculo foi preparado em meio nutritivo, o qual foi incubado a 30°C, a
150 rpm, densidade óptica analisada em espectrofotômetro (DO 600>0,9). Dessa
suspensão, foi utilizado 0,2 mL para inocular cada unidade experimental.
O cultivo ocorreu em erlenmeyers contendo 15 mL de meio liquido nutritivo
com adição de ácido ferúlico sob as concentrações de 100 mg L , 200 mg L , 300 mg L
-1 -1 -

1
, 400 mg L e 500 mg L , em triplicatas; com controles biótico (sem a adição de ácido
-1 -1

ferúlico) e abiótico (sem a adição do microrganismo), incubados numa incubadora

orbital a 30ºC e agitação de 150 rpm, durante 22 horas.
O crescimento foi mensurado através de alíquotas de 0,2 mL a cada 2 horas
analisadas em espectrofotômetro (DO 600nm), modelo leitor de microplacas
SpectraMax Plus 384.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Comparando as unidades experimentais com o controle biótico foi possível
observar que não houve crescimento na presença de ácido ferúlico sob a concentração
de 500 mg L , e observando-se que o crescimento sob a concentração de 400 mg L
-1 -1

apresenta uma maior fase lag o que representa prejuízo ainda que a mesma apresente
crescimento significante após este retardo. Nas unidades experimentais com
concentração de 100 mg L , 200 mg L e 300 mg L a cepa apresentou crescimento
-1 -1 -1

inalterado em relação ao controle biótico (figura 1). A tolerância apresentada pela cepa
ultrapassa a concentração de ácido ferúlico para inibição do crescimento de
microrganismos proposta por outros trabalhos para estirpes bacterianas (Larsson et al.,
2000; Lemos et al., 2014).

Figura 1. Crescimento de Stenotrophomonas acidamiliphila na presença de ácido ferúlico.

282
CONCLUSÕES
Conclui-se, nas condições deste estudo, que a cepa apresenta tolerância
significante até concentração de 300 mg L de ácido ferúlico, pois o crescimento não
-1

sofre alterações em relação ao controle biótico. Tais resultados evidenciam a

necessidade da continuidade deste estudo a fim de identificar possíveis vias de
degradação do ácido ferúlico, uma vez que tal microrganismo é relatado como
degradador de compostos aromáticos.

REFERÊNCIAS

ADEBOYE, Peter Temitope, BETTIGA, Maurizio and OLSSON, Lisbeth, 2014. The
chemical nature of phenolic compounds determines their toxicity and induces distinct
physiological responses in Saccharomyces cerevisiae in lignocellulose hydrolysates.
AMB Express [online]. 2014. Vol. 4, p. 46. DOI 10.1186/s13568-014-0046-7.

BATISSON, Isabelle, PESCE, Stéphane, BESSE-HOGGAN, Pascale, SANCELME,

Martine and BOHATIER, Jacques, 2007. Isolation and characterization of diuron-
degrading bacteria from lotic surface water. Microbial ecology [online]. November
2007. Vol. 54, no. 4, p. 761–70. [Accessed 8 January 2016]. DOI 10.1007/s00248-007-
9241-2.

BERTANI, G, 1951. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by

lysogenic Escherichia coli. Journal of bacteriology [online]. September 1951. Vol. 62,
no. 3, p. 293–300. [Accessed 26 October 2014]. Available from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/

CAMPBELL, M. M. and SEDEROFF, R. R., 1996. Variation in Lignin Content and

Composition (Mechanisms of Control and Implications for the Genetic Improvement of
Plants). Plant physiology [online]. January 1996. Vol. 110, no. 1, p. 3–13.

DWIVEDI, S and SINGH, BR, 2010. Isolation and characterization of

butachlor‐catabolizing bacterial strain Stenotrophomonas acidaminiphila JS‐1 from soil
and assessment of its. Letters in applied… [online]. 2010. Available from:
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1472-765X.2010.02854.x/full

LARSSON, S, QUINTANA-SÁINZ, A, REIMANN, A, NILVEBRANT, N O and

JÖNSSON, L J, 2000. Influence of lignocellulose-derived aromatic compounds on
oxygen-limited growth and ethanolic fermentation by Saccharomyces cerevisiae.
Applied biochemistry and biotechnology [online]. 2000. Vol. 84–86, p. 617–32.

LARSSON, Simona, PALMQVIST, Eva, HAHN-HÄGERDAL, Bärbel, TENGBORG,

Charlotte, STENBERG, Kerstin, ZACCHI, Guido and NILVEBRANT, Nils-Olof,
1999. The generation of fermentation inhibitors during dilute acid hydrolysis of
softwood. Enzyme and Microbial Technology [online]. February 1999. Vol. 24, no. 3–4,
p. 151–159. [Accessed 31 May 2015]. DOI 10.1016/S0141-0229(98)00101-X.

LEMOS, Madalena, BORGES, Anabela, TEODÓSIO, Joana, ARAÚJO, Paula,

MERGULHÃO, Filipe, MELO, Luís and SIMÕES, Manuel, 2014. The effects of ferulic
and salicylic acids on Bacillus cereus and Pseudomonas fluorescens single- and dual-

283
species biofilms. International Biodeterioration & Biodegradation [online]. January
2014. Vol. 86, p. 42–51. [Accessed 29 July 2015]. DOI 10.1016/j.ibiod.2013.06.011.

RYAN, R P, MONCHY, S, CARDINALE, M, TAGHAVI, S, CROSSMAN, L,

AVISON, M B, BERG, G, VAN DER LELIE, D and DOW, J M, 2009. The versatility
and adaptation of bacteria from the genus Stenotrophomonas. Nat Rev Microbiol
[online]. 2009. Vol. 7, no. 7, p. 514–525. DOI 10.1038/nrmicro2163.

284
 Qualidade microbiológica de salgado recheado com
hambúrguer vegano artesanal

Marcia Nalesso Costa Harder1*; Luciane Regina de Siqueira Barrichello1; Gabriela de Jesus Oliveira1;
Rosana Maria de Oliveira Freguglia1; Érika Maria Roel Gutierrez1

1
Faculdade de Tecnologia de Piracicaba “Dep. Roque Trevisan” – FATEC Piracicaba. *e-mail (autor para
correspondência): [email protected]

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Os hambúrgueres vegetarianos surgiram como opção para quem não é adepto ao
consumo de carne. Podem ser preparados de várias formas e costumam agradar a todos
os gostos. Como uma opção de alimentação saudável, pode ser formulado a base de
grão-de-bico, lentilha, ervilha e até feijão, opções ricas em proteínas. Este trabalho teve
como objetivo elaborar um salgado vegano utilizando massa com fermentação natural e
avaliar as condições sanitárias do produto, através das análises microbiológicas. A
massa do salgado foi elaborada a partir de fermentação natural, o hambúrguer foi
elaborado a partir de grãos e temperado. De acordo com os parâmetros microbiológicos
determinados por lei, os resultados encontrados em 24h de incubação, apresentaram
ausentes para bactérias totais, fungos e leveduras e Staphilococcus aureus e ausência de
formação de gás para Coliformes totais. Em 48h de incubação, foram determinados
6,2x104 UFC.mL-1 para bactérias totais, <103 UFC.mL-1 para fungos e leveduras,
ausente para S. aureus e ausência de formação de gás para Coliformes totais. Os
resultados obtidos atestam a qualidade microbiológica do produto, que apresentou
condições sanitárias satisfatórias, respeitando os padrões estabelecidos pela legislação,
não somente pelos valores nutricionais, mas quanto às condições higiênicas que
propiciem segurança alimentar e saúde ao consumidor.

Palavras-chave: alimento vegetariano, fermentação natural, grãos, análise

microbiológica
______________________________________________________________________________________________

Microbiological quality of salted stuffed with artisan vegan hamburger

ABSTRACT
Vegetarian burgers have emerged as an option for those who are not adept at consuming
meat. They can be prepared in a variety of ways and are usually to suit all tastes. As a
healthy eating option, it can be formulated based on chickpeas, lentils, peas and even
beans, choices that are rich in protein. The aim of this work was to elaborate a vegan
salty using a natural fermentation mass and to evaluate the health conditions of the
product through microbiological analyzes. The salty mass was elaborated from natural
fermentation, the hamburger was prepared from grains and seasoned. According to

285
microbiological criteria adjusted by law, the results found in 24h incubation were absent
for total bacteria, fungi and yeast and Staphilococcus aureus and absence of gas
formation for total Coliforms. In 48h of incubation, 6.2x104 CFU.mL-1 was determined
for total bacteria, <103 CFU.mL-1 for fungi and yeasts, absent for S. aureus and absence
of gas formation for total Coliforms. The results obtained attest to the microbiological
quality of the product, which presented satisfactory sanitary conditions, respecting the
standards established by the legislation, not only for the nutritional values, but also for
the hygienic conditions that provide food safety and consumer health.

Keywords: vegetarian food, natural fermentation, grains, microbiological analysis.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Não é fácil atender às necessidades de consumidores vegetarianos e aqueles que
desejam adotar a alimentação vegetariana. As dietas vegetarianas, quando bem
planejadas, como todas as dietas devem ser, promovem crescimento e desenvolvimento
adequados e podem ser adotadas em todos os ciclos da vida, inclusive por atletas, na
gestação, infância e terceira idade (SLYWITCH, 2012).
A indústria vem trabalhando para produzir em escala comercial a “carne
análoga”, que irá funcionar como um substituto à carne e ao peixe (CALLIMACI,
2016). Tem benefícios a nível ambiental e nutricional, sendo dois aspetos apreciados
pelo consumidor. Comparativamente com a proteína animal a “carne análoga” não
contém colesterol, tem menos gordura total e saturada, é rica em substâncias protetoras
(antioxidantes, fitoquímicos e fibras) e aminoácidos essenciais (VALE, 2016).
Os hambúrgueres vegetarianos remetem ao seu análogo, tanto em aparência,
quanto em sabor e, surgiram como opção para quem não é adepto ao consumo de carne,
mas, hoje em dia, também são muito consumidos pelo público em geral. Podem ser
preparados de várias formas e costumam agradar a todos os gostos.
Como apresentado acima, possuem baixo teor de gorduras saturadas em sua
composição, e utilizam opções como grão-de-bico, lentilha, ervilha e até feijão em sua
formulação, como alternativas saudáveis e ricas em proteínas.
A contaminação de alimentos por micro-organismos pode ocorrer desde o início
da produção da matéria prima ou em qualquer outra etapa do processamento. Para
alimentos destinados ao consumo humano a ANVISA estabeleceu a RDC nº 12
(BRASIL, 2001) que determina padrões microbiológicos sanitários para alimentos.

286
 Justificado pela potencial demanda de mercado, este trabalho teve como objetivo
desenvolver um salgado vegano utilizando massa com fermentação natural e avaliar as
condições sanitárias do produto, através das análises microbiológicas.

MATERIAL E MÉTODOS
A elaboração do produto foi desenvolvida no Laboratório de Tecnologia de
Alimentos da Fatec Piracicaba “Dep. Roque Trevisan”, localizado em Piracicaba-SP.
Foram adotados todos os procedimentos de BPF (Boas Práticas de Fabricação), desde a
etapa de obtenção da massa do salgado e do hambúrguer utilizado no recheio.
A massa do salgado foi elaborada a partir de uma fermentação natural, adaptado
de Honorato de Jesus et al. (2016), com o crescimento, apesar de mais lento devido a
ação dos micro-organismos, mais homogêneo, deixando a massa mais leve.
O hambúrguer foi elaborado a partir de grãos (soja – 33,33%, feijão – 33,33% e
lentilha 33,33%) obtidos no comércio local de Piracicaba-SP e, levados ao Laboratório
de Tecnologia de Alimentos da Fatec Piracicaba, onde foram processados.
Primeiramente os grãos foram colocados de molho, principalmente para
eliminação de taninos e depois cozidos com água até atingir o ponto de maciez
desejado. Após esta etapa foram temperados de acordo com as características de um
hambúrguer tradicional de carne, sendo utilizadas proporções iguais (33,33%) de cada
grão.
A análise microbiológica do produto foi realizada no produto final, salgado
assado segundo critérios definidos pela Resolução RDC no (ANVISA, 2001). Foram
determinados: Fungos e leveduras (YPD), Bactérias totais (NA), Staphilococcus aureus
(BPA) e presença de coliformes totais através da técnica de tubos múltiplos
(OLIVIERA et al., 2015).

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados experimentais da avaliação microbiológica do salgado de
hambúrguer são apresentados na Tabela 1.

287
Tabela 1 - Análise microbiológica do salgado de hambúrguer
Tempo Bactérias Totais Fungos e Leveduras Staphilococcus Coliformes
(h) (NA)1 (YPD)2 aureus Totais
3
(BPA) (CL)4
24 ------ ------ Ausente Ausência
de
formação
de gás.
48 6,2x104 UFC.mL-1 <103 UFC.mL-1 Ausente Ausência
de
formação
de gás.
Negativo
para
Coliformes
Totais
1 2 3 4
Nutriente Agar; Yeast Peptone Dextrose; Baird-Parker Agar; Caldo Lactosado.

Para os fungos e leveduras, o plaqueamento seguiu a técnica de superfície, sendo

cada diluição realizada em triplicada. As placas apresentaram crescimento inferior a 30
colônias nas placas de menor diluição (10-2).
Para bactérias utilizou-se a técnica de plaqueamento por profundidade, com as
diluições em triplicata. As colônias observadas foram avaliadas através do teste de gram
e foram classificadas como “gram positivo”. Ainda assim, foi realizada avaliação para
presença de S. aureus, se apresentando ausente, o que garante a segurança do produto
do ponto de vista da presença deste micro-organismo.
A determinação de bactérias totais foi realizada mais como um parâmetro de
comparação entre outros produtos elaborados por fermentação natural, porém ele não
está solicitado pela resolução da ANVISA (2001). A análise de coliforme total teve
como resultado negativo para Coliformes totais e, por se tratar de um indicador, não foi
necessário analisar Salmonella sp.
Os resultados obtidos atestam a qualidade microbiológica do salgado de
hambúrguer pois estão dentro das normas definidas pela à RDC nº 12/2001 (BRASIL,
2001). O produto apresentou condições sanitárias satisfatórias. Do ponto de vista das
determinações estabelecidas em lei pela ANVISA, os alimentos se apresentaram
seguros, de boa qualidade e respeitam os padrões estabelecidos pela legislação, não
somente pelos valores nutricionais, mas quanto às condições higiênicas que propiciem
segurança alimentar e saúde ao consumidor.

288
 CONCLUSÕES
De acordo com os resultados apresentados, pode-se concluir que é possível obter
um alimento vegano a partir das condições de fermentação natural e, pela avaliação
microbiológica pode-se observar que as condições de BPF exigidas em legislação foram
atendidas satisfatoriamente.
Enfim, conclui-se que foi elaborado um alimento que atende a um mercado
diferenciado atendendo as qualidades exigidas de consumo.

REFERÊNCIAS
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA. Resolução RDC nº 12,
de 2 de janeiro de 2001. Regulamento técnico sobre os padrões microbiológicos para
alimentos e seus Anexos I e II. Diário Oficial da República Federativa do Brasil,
Brasília, Distrito Federal, n. 7, 10 Jan. 2001. Seção 1, p. 45-53.

CALLIMACI, G. 2016. Carne análoga - Sebenta teórica, GAC-Ingredientes & Produtos

Alimentares.

OLIVEIRA, N.M.; REZENDE, M.P.G.; CARDOSO, I.L., 2015. Determinação de

coliformes termotolerantes e totais nas mãos de pescadores amadores. REB, vol. 8, no.
1, pp 138-145.

HONORATO DE JESUS, J. et al., 2016. Padaria como instrumento motivador para o

ensino da química orgânica. Revista Científica FAEMA, vol. 7, no. 1, pp. 178-188, jul.
2016.

SLYWITCH, E., 2012. Guia alimentar de dietas vegetarianas para adultos. 66p.

VALE, D.P.R., 2016. Carne análoga: Desenvolvimento e criação de

formulações/receitas portuguesas e internacionais como substituição à carne/peixe. 75
p. Lisboa: Universidade de Lisboa, 75 p. Dissertação de Mestrado em Engenharia
Alimentar.

289
 Caracterização da endoglucanase usando casca de café como
substrato
Maria Júlia Flores Fernandes Dias Leandro ; Boutros Sarrouh
1 1

Departamento de Química, Biotecnologia e Bioprocessos –DQBIO, Universidade Federal de São João

1

del-Rei, Campus Alto Paraopeba. Ouro Branco, Minas Gerais, Brasil.

E-mail (autor para correspondência): [email protected]

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
As biomassas vegetais, tais como a casca do café, são resíduos lignocelulósicos
constituídos de hemicelulose, lignina e celulose. Uma solução sustentável para a
eliminação final destes resíduos é a sua utilização como fonte de energia renovável. Este
estudo propõe caracterizar e avaliar a atividade celulolítica do fungo Trichoderma sp.
isolado da madeira para hidrólise da casca de café, liberando açúcares fermentáveis e
visando a produção de etanol de segunda geração. O processo de bioconversão da casca
requer pré-tratamentos mecânicos e químicos, como moagem e hidrólises ácida, alcalina
e enzimática. O fungo isolado foi cultivado em fermentação submersa, sob agitação a
28°C e 180 rpm, utilizando meio mineral (0,7% de KH2PO4, 0,4% de NaH2PO4,
0,02% de MgSO4, (NH4)2SO4 0,1%), 0,06% de extrato de levedura e casca de café a
2% (p/v) como única fonte de carbono. Amostras foram coletadas em intervalos de 24
horas durante 11 dias, centrifugadas e submetidas ao método do ácido dinitrosalicílico
(DNS) para determinação da atividade da endoglucanase através de seu potencial na
liberação de açúcares redutores. Observou-se uma rápida adaptação do fungo isolado ao
meio contendo casca de café e máxima produção da enzima endoglucanase após 8 dias
de fermentação com atividade enzimática de 0,2408655 ± 0,00000 UI / mL em
condições ótimas de 50°C e pH 5. Os resultados obtidos demonstraram atividade
celulolítica promissora do fungo isolado para uso futuro na produção de etanol de
segunda geração.

Palavras-chave: Atividade celulolítica, Temperatura, pH, Fungo.

______________________________________________________________________________________________

Characterization of endoglucanase using coffee husk as substrate

ABSTRACT
Vegetal biomasses, such as coffee husk, are lignocellulosic residues basically composed
of hemicellulose, lignin and cellulose. A sustainable solution for the final disposal of
this waste is its usage as a source for renewable energy. This study proposes to
characterize and evaluate the cellulolytic activity of Trichoderma sp. fungus, isolated of
wood for coffee husk hydrolysis to release fermentable sugars aiming at the second
generation ethanol production. The bioconversion process of the husks requires
mechanical and chemical pretreatments, like grinding, acid hydrolysis, alkaline hydrolysis
and enzymatic hydrolysis. The isolated fungus was cultivated in a submerged fermentation
using coffee husk 2% (w/v) as the sole carbon source, and placed in a shaker under 28°C
and 180 rpm. The mineral medium consisted of 0.7% KH2PO4, 0.4% NaH2PO4, 0.02%
MgSO4, (NH4)2SO4 0.1% and yeast extract 0.06%. Samples were collected in 24 h intervals

290
for 11 days and were centrifuged and submitted to the method of dinitrosalicílico acid
(DNS) to determine endoglucanase activity through its potencial in the release of reducing
sugars. Was observed a fast adaptation of the isolated fungus to the medium containing
coffee husk, and maximum production of endoglucanase enzyme after 8 days of
fermentation with an enzymatic activity of 0.2408655 ± 0.00000 IU/mL under optimal
conditions of 50°C and pH 5. The obtained results demonstrated a promising
cellulolytic activity of the isolated fungus for future use in the production of second
generation ethanol.

Keywords: Cellulolytic activity, Temperature, pH, Fungi.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
As celulases são um complexo de enzimas extracelulares que atuam
sinergicamente, produzidas por microrganismos que hidrolisam a celulose, o polímero
natural mais abundante na natureza. Elas são divididas em três classes: as
endoglucanases que quebram as ligações glicosídicas das cadeias de celulose criando
novos terminais, as exoglucanases que agem sobre os terminais gerando a celobiose, e
por último as β-glucosidases que hidrolisam a celobiose a glicose. As celulases têm
numerosas utilizações: no processamento de café, na indústria têxtil, na composição de
detergentes e na produção de papel e celulose. Sua utilização permite o uso de biomassa
celulósica como matéria-prima para a produção de etanol.
Percival Zhang et al. (2006) afirmam que a biomassa lignocelulósica é o mais
abundante recurso biológico renovável da terra, devido a isso e a sua composição existe
uma tendência mundial para a hidrólise enzimática de materiais lignocelulósicos,
buscando açúcares fermentescíveis para a produção de bioetanol em larga escala. A
expectativa é de que o mercado de celulases pode ser superior a 400 milhões de dólares
por ano com a possível utilização das enzimas na hidrólise de palha de milho nos
Estados Unidos da América para a produção de etanol de biomassa.
Sendo assim, esse trabalho teve como objetivo avaliar e caracterizar a atividade
enzimática da endoglucanase produzida pelo fungo isolado da madeira atacada pela
podridão branca, visando a sua aplicação na transformação de resíduos fibrosos em
bioprodutos de valor.

MATERIAL E MÉTODOS

Produção de extratos enzimáticos por fermentação submersa e

determinação da atividade da Enzima Endoglucanase
Primeiramente foram isoladas e cultivadas, em meio sólido, colônias de
Trichoderma sp. isolado da madeira, conhecido popularmente como fungo da podridão
branca. O isolado apresenta coloração branca. As culturas foram mantidas em placas
contendo o meio BDA.
Para a inoculação do fungo isolado em meio líquido, contendo a casca de café
como única fonte de carbono, três fragmentos de ágar contendo hifas do fungo em
estudo foram retirados de uma placa de petri com auxílio de uma espátula. Em seguida,
os mesmos foram inoculados em Erlenmeyers de 125mL contendo 50mL de meio
líquido mineral e casca de café 2% (p/v). O meio mineral foi composto de (p/v):
KH2PO4 0,7%, NaH2PO4 0,4%, MgSO4 0,02%, (NH4)2SO4 0,1% e extrato de
levedura 0,06%. O meio foi previamente autoclavado a 121 °C por 15 min. Os frascos
foram incubados em shaker sob temperatura de 28°C e agitação de 180rpm durante onze

291
dias, a cada 24 horas foram coletadas amostras dos inóculos com o auxílio de uma
micropipeta e transferidas para um microtubo tipo eppendorf e centrifugadas durante 20
minutos, a 4ºC e rotação de 10000 xg.
A atividade de Endoglucanase foi determinada em função da sua capacidade de
degradação da casca de café, sendo os açúcares redutores liberados foram quantificados
pelo método do ácido dinitrosalicílico (DNS). Foram retirados 0,250mL do extrato
enzimático bruto do fungo e colocados em tubos de ensaio contendo 0,250mL de
carboximetilcelulose. Para o controle, adicionou-se 0,250mL de tampão acetato 0,1M
pH 4,8, em substituição do extrato enzimático. Os tubos foram colocados em banho-
maria a 50°C por 30 minutos. Em seguida, adicionou-se nos tubos de ensaio 0,75 mL da
solução de DNS que posteriormente foram submetidos a banho fervente de 100°C por 5
minutos, seguidos de mais 5 minutos em banho de gelo para encerrar a atividade
enzimática. Finalmente os tubos foram completados com 3,75mL de água destilada. A
leitura da absorbância foi feita em espectrofotômetro a 540 nm e os valores de
absorbância foram convertidos em quantidades equivalentes de glicose a partir de curva
padrão previamente construída; considerando que 1 Unidade Internacional (IU) equivale
a 1 μmol de glicose liberada por minuto.

Caracterização enzimática
A atividade da enzima Endoglucanase foi caracterizada submetendo o extrato
enzimático bruto obtido no dia de cultivo que apresentou a melhor atividade durante o
teste de crescimento do fungo isolado. As condições utilizadas para os ensaios de
caracterização foram a temperatura de 40 a 70ºC e pH de 3,0 a 6,0. Os testes foram
realizados conforme descrito no item anterior, alterando-se a temperatura em que o
ensaio foi incubado por 30 minutos no caso de caracterização do efeito da temperatura
sobre a atividade enzimática. Já a avaliação do efeito do pH foi realizada utilizando
tampões de fosfato-citrato nos valores de 3,0, 4,0, 5,0 e 6,0.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Esse estudo teve como objetivo avaliar o crescimento celular e a produção da
enzima endoglucanase produzida pelo fungo isolado. A Figura 1 mostra a curva da
velocidade da reação enzimática, representada pela atividade da enzima Endoglucanase
em função do tempo de cultivo.

Figura 1- Cinética enzimática da endoglucanase produzida por Trichoderma sp.

Conforme mostrado na Figura 1, observou-se uma rápida adaptação do fungo

isolado no meio de cultivo utilizando a casca de café como única fonte de carbono. O
mesmo apresentou uma atividade celulolítica máxima de 0,24±0,00 UI/mL, após oito
dias de fermentação.

292
 Aguiar and Menezes (2000), ao utilizar Aspergillus niger IZ-9 após sete dias de
incubação, utilizando bagaço de cana de açúcar como único substrato, obtiveram
valores de atividade de Endoglucanase de 0,2 UI/ml, valores próximos ao observado
com o fungo estudado neste trabalho.
A caracterização da atividade enzimática celulolítica em relação às condições
ótimas de pH e temperatura foi realizada utilizando os extratos enzimáticos brutos
obtidos após o oitavo dia de cultivo por ter apresentado a maior atividade enzimática,
conforme mostrado na Figura 1.
Os dados obtidos neste estudo na caracterização da Endoglucanase em relação à
variação de temperatura e pH estão apresentados na Figura 2.

Figura 2 – Efeito do pH e da temperatura na atividade de Endoglucanase

expressada nos extratos brutos do fungo isolado da madeira.

Observou-se que em pH 3 e 4 não houve aumento significativo na atividade

enzimática da Endoglucanase do fungo de podridão branca, por outro lado em pH 5 a
mesma alcançou uma atividade máxima de 0,16±0,0085 UI/mL, utilizando tampão
fosfato-citrato.
Observa-se também que a temperatura da reação teve uma influência direta na
atividade enzimática da Endoglucanase do fungo isolado. Dessa forma constatou-se
uma atividade enzimática máxima de 0,24 UI/ml±0,00 a uma temperatura ótima de
50°C. Por outro lado, observou um decréscimo da mesma a uma temperatura de 60°C
alcançando um valor mínimo de 0,0994941±0,0068 UI/mL a 70°C.

CONCLUSÕES
A produção da enzima Endoglucanases pelo fungo da podridão branca em
fermentação submersa alcançou um valor máximo de 0,24±0,00 UI/mL após oito dias
de fermentação. Os extratos enzimáticos brutos submetidos às diferentes condições de
temperatura e pH, apresentaram uma atividade endoglicolítica máxima a uma
temperatura de 50°C e pH 5. Os resultados obtidos foram semelhantes aos encontrados
na literatura para outros fungos que apresentam atividade celulolítica e demonstraram
uma atividade celulolítica promissora visando uso futuro do fungo de podridão branca,
isolado da madeira, na produção de etanol de segunda geração.

AGRADECIMENTO
Agradecemos ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e
Tecnológio (CNPq) e a Fundação de Amparo á Pesquisa do Estado de Minas Gerais
FAPEMIG).

293
REFERÊNCIAS

Agência Embrapa de Informação Tecnológica – ageitec [Acesso em 10/02/2017]

Disponível em:
http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/gestor/tecnologia_de_alimentos/arvore/CONT00
0fid5sgif02wyiv80z4s473v6o7sud.html.
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http://dx.doi.org/10.5380/cep.v18i1.1125.
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Celulases na Hidrólise de Resíduos Agroindustriais. Quim. Nova, vol. 33, no. 1,
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FREITAS, W. L. C., 2016. Estudo da casca de café como matéria prima em processos
fermentativos. Lorena: Universidade de São Paulo. 118p. Tese de Doutorado em
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PERCIVAL ZHANG, Y.H., HIMMEL, M.E. and MIELENZ, J.R., 2006. Outlook for
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24, no. 5, pp. 452-481. http://dx.doi.org/10.1016/j.biotechadv.2006.03.003.
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newly isolated strain of Mucor circinelloides. Process Biochemistry, vol. 39, no. 12, pp.
1871-1876. http://dx.doi.org/10.1016/j.procbio.2003.09.013.

294
 Fungos Antárticos: Bioatividade contra Xanthomonas
vesicatoria e Xanthomonas axonopodis pv. manihotis
Mariana Gabriela Fonseca1; Gabrielle Vieira1; Jelena Purić1; Marina Vitti Vianna1; Luana Galvão
Morão1; Lara Durães Sette1; Henrique Ferreira1; Maria Lucia Carneiro Vieira2; Daiane Cristina Sass1*
1Departamento de Bioquímica e Microbiologia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, São Paulo,
Brasil. 2Departamento de Genética Molecular de Plantas e Biotecnologia, Escola Superior de Agricultura Luiz de
Queiroz, USP, São Paulo, Brasil. *e-mail: [email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Bactérias do gênero Xanthomonas são agentes causadores de fitopatologias em diversas
culturas, dentre elas a mancha bacteriana do tomate e pimentão e a bacteriose da
mandioca, causando perdas significativas nas safras. Como alternativa ao combate
químico atualmente empregado, diversos estudos apontam o uso de extratos advindos
de metabólitos secundários produzidos por outros tipos de micro-organismos. O
presente trabalho apresenta resultados de testes contra Xanthomonas vesicatoria e
Xanthomonas axonopodis pv. manihotis, causadoras, respectivamente, da mancha
bacteriana e da bacteriose, de extratos metabólicos produzidos por trinta fungos
coletados na Ilha Rei George, Antártica. No total foram testados 47 extratos, sendo 30
intracelulares e 17 extracelulares. O extrato intracelular com maior ação bioativa contra
Xanthomonas vesicatoria indicou 88,27% de células mortas. Dentre os extratos
extracelulares, os resultados apontaram 95,19 % de células mortas contra X. axonopodis
pv. manihotis, e um segundo extrato apontou 95,19% e 92,49% de inibição das bactérias
X. axonopodis pv. manihotis e X. vesicatoria, respectivamente.

Palavras-chave: mandioca; tomate; fitopatologias; bioatividade; metabólitos

secundários.
______________________________________________________________________________________________

Antarctic Fungi: Bioactivity against Xanthomonas vesicatoria and Xanthomonas

axonopodis pv. manihotis
ABSTRACT
Bacteria of the genus Xanthomonas are agents that cause phytopathologies in diverse
cultures, among them the bacterial spot of the tomato and pepper and the cassava
bacterial blight, causing significant losses in the crops. As an alternative to the currently
chemical combat, several studies point to the use of extracts derived from secondary
metabolites produced by other types of microorganisms. The present work presents test
results against Xanthomonas vesicatoria and Xanthomonas axonopodis pv. manihotis,
that cause, respectively, the tomato and pepper bacterial spot and cassava bacterial
blight, of metabolic extracts produced by thirty fungi collected on King George Island,
Antarctica. In total, 47 extracts were tested, 30 of which were intracellular and 17
extracellular. The intracellular extract with the highest bioactive action against X.
vesicatoria indicated 88.27% of dead cells. Among the extracellular extracts, the results

295
indicated 95.19% of dead cells against X. axonopodis pv. manihotis, and a second
extract with 95.19% and 92.49% inhibition of the X. axonopodis pv. manihotis and X.
vesicatoria, respectively.

Keywords: cassava; bacterial blight; bioactivity; phytopatologies, secondary

metabolities.
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Dentre os inúmeros cultivos de importância econômica produzidos no Brasil,
encontram-se os da mandioca, pimentão e tomate. Todavia, muitas fitopatologias
acometem as safras, levando a perdas de parte ou toda a colheita.
Causada por X. axonopodis pv. manihotis, a bacteriose tem sido encarada como
a principal doença da mandioca, sobretudo no Sul, Sudeste e Centro-Oeste brasileiros.
Quando acometida pela doença, a planta tem folhas, folíolos, pecíolos e feixes
vasculares afetados, ocasionando a sua morte. O combate à enfermidade ainda não conta
com nenhum tipo de agente químico ou bioativo, sendo a utilização de variedades
resistentes a medida mais eficiente para o controle da bacteriose, aliada a práticas
culturais como a utilização de manivas sadias e a adequação das épocas de plantio
(Souza and Fialho, 2003).
Já a mancha bacteriana, causada por X. vesicatoria, é uma das doenças mais
devastadoras e de difícil combate que acomete as safras de pimentão e tomate. Quando
em condições favoráveis, o patógeno ataca folhas, frutos e caules do hospedeiro, no
entanto, seu controle torna-se praticamente impossível, levando a perdas de safras
inteiras. Atualmente o controle químico baseia-se na aplicação de antibióticos e de
produtos à base de cobre, contudo, o uso indiscriminado tem levado ao surgimento de
estirpes resistentes de bactérias, além de acarretar em riscos ambientais e para a saúde
humana (Lopes and Quezado-Soares, 2000).
Devido à falta de recursos eficazes, atualmente aplicados, no combate e controle
da bacteriose e mancha bacteriana, tem-se buscado alternativas que respondam por
melhor desempenho, menor impacto ambiental e baixo risco para o consumo humano.
Dentre as possibilidades recentemente propostas, está a utilização de metabólitos
secundários produzidos por outros micro-organismos no combate a doenças bacterianas
causadas por diversas espécies do gênero Xanthomonas (Murate et al., 2015), além de
estudos que destacam o potencial antimicrobiano, para fins fitossanitários, de extratos
de fungos advindos da Antártica (Svahn et al., 2015).

296
 O presente trabalho apresenta os resultados obtidos da análise do potencial de
ação antibacteriana de metabólitos secundários extraídos de fungos filamentosos da
Antártica, frente às espécies bacterianas X. axonopodis pv. manihotis e X. vesicatoria.

MATERIAL E MÉTODOS
Trinta fungos filamentosos, coletados na Ilha Rei George, na Antártica, foram
reativados e submetidos a fermentação em shaker, em meio malte (2%) líquido, por 21
dias. Em seguida, a biomassa foi separada do sobrenadante por filtração a vácuo e
macerada com metanol (CH3OH), originando os extratos intracelulares. Os extratos
extracelulares foram obtidos do sobrenadante resultante da filtração por extração
líquido-líquido, utilizando acetato de etila (C4H8O2) como solvente. A evaporação dos
solventes foi feita em evaporador rotativo a vácuo e, em seguida, os extratos foram
dissolvidos em solução de dimetilsulfóxido – DMSO- (C2H6OS).
Os bioensaios com os extratos seguiram o método REMA (resazurin microtiter
assay), previamente proposto por Silva and Ferreira (2013). O protocolo descrito pelos
autores, entretanto, refere-se à aplicação para X. citri subsp. citri, assim foi realizada
uma checagem de validade do método para X. vesicatoria e X. axonopodis pv.
manihotis. As células bacterianas de interesse, previamente cultivadas em placas de
Petri contendo meio nutriente ágar (2%), foram inoculadas em meio nutriente (2%)
líquido e submetidas à agitação em shaker a 29 °C, 200 rpm, por 18 horas. Após este
período, foi realizada medida de densidade óptica (D.O.) por espectrofotometria (λ =
600 nm). A D.O. foi então ajustada para concentração igual a 0,8. A partir deste
inóculo, foram realizadas diluições em 12 microtubos de centrífuga contendo solução
salina NaCl (0,9%). As quatro primeiras diluições foram desconsideradas, e a partir da
quinta diluição, foi realizado plaqueamento em meio nutriente ágar (2%) e incubado em
B.O.D a 29 °C por 12 horas. Em seguida, foi realizada a contagem de unidades
formadoras de colônia e comparadas com o proposto no protocolo REMA de Silva and
Ferreira (2013).
Para aplicação dos bioensaios pela metodologia REMA, utilizou-se microplaca
de 96 poços, sendo quatro deles preenchidos com canamicina para controle positivo
(CP), outros quatro com DMSO 2% para controle do veículo (CV) e oito poços
contendo inóculo bacteriano ajustado a D.O. = 0,8 para controle negativo (CN).
Dezesseis poços foram preenchidos com diferentes extratos em concentração 2100 µg

297
por mL, a partir dos quais foram realizadas três diluições dos mesmos. Após receberem
o inóculo bacteriano, as placas foram incubadas por 18 horas, seguindo-se a aplicação
da resazurina. Após duas horas da aplicação do corante nas placas mantidas a 29°C, a
inibição do crescimento bacteriano foi medida através de emissão de fluorescência.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram produzidos 30 extratos intracelulares e 17 extracelulares a partir de 30
fungos filamentosos coletados na Ilha Rei George, na Antártica. No total, 47 extratos
fúngicos foram submetidos a testes contra X. axonopodis pv. manihotis e X. vesicatoria.
A validação do protocolo REMA, de Silva and Ferreira (2013), foi confirmada para
ambas as Xanthomonas de interesse. Dessa maneira os bioensaios contra as X.
axonopodis pv. manihotis e X. vesicatoria foram realizados.
Os extratos foram enumerados de 1 a 47, sendo os de 1 a 30 intracelulares e de
31 a 47 extracelulares. Os resultados dos bioensaios realizados com os extratos, na
concentração máxima de 2100 µg/ml, contra X. axonopodis pv. manihotis e X.
vesicatoria estão apresentados na Tabelas 1 e 2, respectivamente.

Tabela 1: Resultados, em porcentagens de células mortas, para os extratos intracelulares (1-30),

na concentração de 2100 µg/ml, contra X. axonopodis pv. manihotis e X. vesicatoria.
X.axonopodis X. axonopodis pv.
Extrato X. vesicatoria Extrato X. vesicatoria
pv. manihotis manihotis
1 25,85 27,04 16 39,95 54,14
2 65,31 88,27 17 25,83 11,59
3 51,74 18,37 18 0,00 3,63
4 23,73 5,08 19 0,00 18,96
5 57,93 11,82 20 16,30 33,23
6 49,68 18,73 21 13,61 9,36
7 24,41 4,79 22 31,67 15,37
8 65,39 18,66 23 0,00 18,46
9 48,35 46,00 24 33,52 23,34
10 30,33 30,17 25 0,00 15,31
11 41,48 42,60 26 33,52 0,00
12 50,38 24,36 27 0,00 9,42
13 49,10 13,71 28 0,00 4,91
14 47,77 13,94 29 0,00 10,29
15 29,09 13,21 30 0,00 47,22

298
Tabela 2: Resultados, em porcentagens de células mortas, para os extratos extracelulares (31-
47), na concentração de 2100 µg/ml, contra X. axonopodis pv. manihotis e X. vesicatoria.
X. axonopodis X. axonopodis
Extrato X. vesicatoria Extrato X. vesicatoria
pv. manihotis pv. manihotis
31 0,00 6,65 40 0,00 15,95
32 0,00 0,18 41 14,29 20,55
33 95,19 92,49 42 0,00 0,00
34 37,94 0,00 43 0,00 0,00
35 41,93 6,60 44 0,00 0,00
36 0,00 53,39 45 95,19 50,72
37 0,00 11,20 46 41,49 0,56
38 0,00 2,83 47 41,93 41,91
39 5,87 6,47

Analisando a Tabela 1 é possível verificar que dentre os extratos intracelulares, o

extrato 2 foi o que apresentou o melhor resultado frente a X. vesicatoria, com 88,27%
de inibição de crescimento celular, enquanto que o extrato 8 obteve 65,39% de inibição
frente a X. axonopodis pv. manihotis. Já para os extratos extracelulares (Tabela 2), o
extrato 45 inibiu em 95,19 % o crescimento celular de X. axonopodis pv. manihotis e o
extrato 33 inibiu significativamente o crescimento bacteriano frente às duas
Xanthomonas, apresentando 95,19% e 92,49% de inibição das bactérias X. axonopodis
pv. manihotis e X. vesicatoria, respectivamente.
Considerando que a composição dos extratos testados ainda não foi identificada,
os resultados revelam que os mesmos contêm compostos químicos ativos contra X.
axonopodis pv. manihotis e X. vesicatoria, requerendo assim a separação e identificação
dos constituintes desses extratos, além de uma nova análise da atividade antibacteriana.

CONCLUSÕES
A partir dos dados apresentados neste trabalho foi possível concluir que os
fungos coletados na Ilha Rei George na Antártica produziram extratos com compostos
químicos ativos contra X. axonopodis pv. manihotis e X. vesicatoria. Estudos como
estes apresentam caráter preliminar, mas se mostram como uma opção considerável do
ponto de vista biotecnológico na obtenção futura de metabólitos bioativos com
importância agronômica.

299
AGRADECIMENTOS
Agradeço às agências de fomento FAPESP e CAPES pelo apoio financeiro
cedido.

REFERÊNCIAS

LOPES, C.A. and QUEZADO-SOARES A.M., 2000. Doenças causadas por bactérias

em tomate. In: ZAMBOLIM, L; VALE, F.X.R.; COSTA, H. (ed).Controle de doenças

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MURATE, L.S., DE OLIVEIRA, A.G., HIGASHI, A.Y., BARAZETTI, A.R.,

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FERREIRA, M.R., CELY, M.V.T., NAVARRO, M.O.P., DE FREITAS, V.F.,

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v. 6, p. 295-303, 2015.

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antifungal metabolite amphotericin B. Fungal Biology and Biotechnology. v. 2, p. 1-8.

300
 Bioacumulação de cobre no biofilme perifítico e seu impacto
ecológico.

Mariana Lopes de Sousa1*; Sheila Cardoso da Silva ², Marcelo Luís Martins Pompêo 1

1
Universidade de São Paulo - Instituto de Biociências / Laboratório de Limnologia.
Rua do Matão,321 - Trav. 14., Butantã - São Paulo – SP.

²Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - Campus Experimental de Sorocaba.

Avenida Três de Março, 511- Aparecidinha – Sorocaba – SP.

*[email protected].

________________________________________________________________________________________

RESUMO
O cobre apesar de ser um elemento naturalmente encontrado em ambientes
aquáticos, também é um contaminante com sério potencial bioacumulador. O perifíton
por sua vez, na forma de um biofilme formado por diversos microrganismos é a base
das cadeias alimentares aquáticas, e porta de entrada para o cobre em níveis tróficos
superiores. A partir de testes com o biofilme perifítico cultivado em laboratório foi
estudado o potencial de bioacumulação do cobre nessa comunidade, bem como sua
relação com a produção primária através do peso seco livre de cinzas. Em laboratório,
foi observado que nas concentrações até 0,06 mg/L não houve indícios de
bioacumulação, mas a partir disso o cobre se acumulou no biofilme, aumentando de
acordo com a concentração utilizada. Já a biomassa apresentou um maior crescimento
inicial, que cessou a partir da concentração onde se iniciou a bioacumulação. Logo, o
biofilme perifítico se mostrou uma ferramenta eficiente para avaliação da contaminação
por cobre em ambientes aquáticos.

Palavras-chave: Microalgas, ecotoxicologia, toxicidade, cadeias alimentares.

________________________________________________________________________________________

Bioaccumulation of copper on periphytic biofilm and its ecological impact

ABSTRACT
Despite being naturally found in aquatic environments, copper is a serious contaminant,
with a high bioaccumulation potential. Periphyton, on the other hand, is a biofilm
composed of several microorganisms and basis of aquatic food chains. For this reason,
it is the way copper uses to enter the food chain and bioaccumulates in higher trophic
levels. Using ecotoxicological tests with periphytic biofilm, it was observed the copper
bioaccumulation in this community and its relation with ash free dry mass weight. It
was observed that in concentrations up to 0.06 mg/L of copper, there was no
bioaccumulation. But after this point, copper accumulated in biofilm, according to the
concentration used in water. There was a higher ash free dry mass weight initially, but

301
after the point bioaccumulation started it stopped. Therefore, periphytic biofilm was an
efficient tool in order to study the bioaccumulation of copper in aquatic environments.

Keywords: Microalgae, ecotoxicology, toxicity, food chain.

_________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
O cobre é uma substância essencial para o funcionamento dos organismos, na
forma de micronutriente. Entretanto, em excesso, torna-se um contaminante que causa
diversos danos (JORDÃO et al., 1990). Sua entrada em ambientes aquáticos é alta e
diversificada, sendo resultante de efluentes industriais, lixiviação de agrotóxicos, e da
própria descarga direta por meio do seu uso como algicida (DORES & DE-
LAMONICA-FREIRE, 2001; SAMPAIO et al., 2013). Apenas nos reservatórios de São
Paulo, estima-se que o uso chega a 480 toneladas/ano. O cobre excedente se acumula no
sedimento, sendo liberado na coluna d´água, e continuando biodisponível para os
organismos (ZAGATTO, 1995).
No caso de ambientes lênticos, como lagos e reservatórios, grande parte da
produção primária provém do perifíton. Essa comunidade é composta por bactérias,
fungos, microalgas e outros microrganismos, formando um biofilme muitas vezes
espesso e com capacidade de concentrar nutrientes e consequentemente contaminantes
(FELISBERTO & MURAKAMI, 2013). Devido a sua alta palatabilidade e facilidade de
pastejo (HORNE & GOLDMANN, 1994), os contaminantes, como no caso o cobre,
entram na cadeia trófica, causando danos em cascata (RAI et al., 1998). Este trabalho
procurou avaliar a capacidade do biofilme perífítico em bioacumular cobre, mediante
testes laboratoriais. Também foi avaliada a relação entre o peso seco livre de cinzas e o
total de cobre bioacumulado, de maneira a inferir os possíveis danos causados por esse
tipo de contaminação.

MATERIAL E MÉTODOS
O inóculo de perifíton foi obtido num lago dentro do Instituto de Biociências da
Universidade de São Paulo (São Paulo - Brasil). Esse material foi transferido para um
aquário de 50 L contendo meio LC Oligo (ABNT, 2011) e lâminas de vidro para
colonização. Após 20 dias as lâminas homogeneamente colonizadas pelo biofilme
foram expostas a diferentes concentrações de cobre, em dois diferentes experimentos.
Inicialmente foram testadas as concentrações entre 0,013 mg/L até 0,15 mg/L, e em

302
seguida o intervalo entre 0,15 mg/L até 2,0 mg/L. Esses valores foram baseados na
legislação brasileira de qualidade de água (CONAMA, 2011) e no trabalho
desenvolvido por Zagatto (1995). Após 15 dias de exposição o material foi retirado com
ajuda de um pincel e separado em alíquotas para as análises.
Para o peso seco livre de cinzas (POMPÊO & MOSCHINI-CARLOS, 2003), o
material correspondente foi transferido para cadinhos previamente calcinados, e secos
até estabilização do peso. Após isso o material foi calcinado e a diferença entre o peso
das cinzas e o peso seco anotada.
Já a bioacumulação de cobre no biofilme foi avaliada através de análise em
espectrofotômetro (DEAN, 2003, com adaptações). Toda vidraria utilizada para a
análise foi previamente lavada em banho de ácido nítrico 10% por 24 h, e depois
lavadas três vezes em água ultrapura. As amostras então foram transferidas para
béqueres de vidro contendo 2,0 mL de HNO3 (1N) e 5,0 mL de HCl (1N). As amostras
foram aquecidas em banho de areia (90ºC), até que o volume fosse reduzido à 20 mL,
normalizadas para 50 mL e filtradas. Após isso, foi feita a leitura em espectrofotômetro
de absorção atômica (Thermo Scientific S Series - AA Spectrometer).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

De acordo com a Figura 1, foi observado que nas concentrações iniciais (0,013
mg/L e 0,06 mg/L) não houve bioacumulação de cobre. Portanto, não ocorreram
maiores danos ao biofilme. É importante notar que a primeira concentração utilizada é a
recomendada pela lei de águas (CONAMA, 2011) para águas de abastecimento tipo 3.
A partir de 0,1 mg/L foi notada bioacumulação no biofilme, aumentando
proporcionalmente de acordo com a concentração á que a comunidade foi exposta. O
máximo encontrado foi de 0,026 mg de cobre por cm² de biofilme.

303
Figura 1: Peso seco livre de cinzas e cobre bioacumulado no biofilme.

Considerando a quantidade total de cobre utilizada nos ensaios, multiplicada

pela concentração média encontrada nas amostras onde ocorreu bioacumulação, é
possível dizer que todo o cobre disponível na água foi incorporado ao biofilme. Essa é
uma característica comum do perifíton em acumular nutrientes, chegando a ficar mais
concentrado que o meio á sua volta. De acordo com Felisberto & Murakami (2013), o
cobre pode se acumular tanto nas células quanto na mucilagem das algas ou nos
exopolissacarídeos bacterianos.
Quanto ao peso seco livre de cinzas, este variou entre as amostras. Foi
observado que a adição de cobre (0,013 mg/L), coincidiu com o aumento médio da
biomassa, entretanto, a partir do ponto onde foi identificada bioacumulação (0,1 mg/L),
a produção primária média cai. Porém, mesmo a concentração mais alta utilizada (2,0
mg/L), esse valor não difere significativamente do controle, apesar de apresentar forte
bioacumulação. Isso ocorre devido à tolerância da comunidade ao cobre.
A concentração de 1,0 mg/L de cobre pode ser encontrada em zonas de descarga
de efluentes industriais ou de mineração, visto que é a concentração máxima permitida
pela lei de águas (CONAMA, 2011). Logo a ingestão desse biofilme pelo zooplâncton
ou pequenos peixes implica diretamente na entrada do cobre na cadeia alimentar (RAI
et al., 1998), podendo chegar ao ser humano.

304
CONCLUSÕES
O perifíton cultivado em laboratório se mostrou satisfatório para analisar a
bioacumulação de cobre. Foi possível perceber que a partir de 0,1 mg/L a
bioacumulação se torna perceptível, chegando a 0,026 mg/cm² quando o biofilme é
exposto a 2,0 mg/L de cobre. A produção primária na forma de peso seco livre de cinzas
foi menor a partir do ponto onde foi notada bioacumulação, provavelmente por efeito da
contaminação. Como concentrações altas de cobre podem ser encontradas em áreas de
descargas de efluentes industriais ou mineração, é possível dizer que sua bioacumulação
no biofilme é problemática aos ecossistemas aquáticos.

AGRADECIMENTO
CAPES e FAPESP pelo apoio financeiro.

REFERÊNCIAS

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306
 Agitação e aeração do inóculo visando maior produção de
P(3HB)
Mariane Igansi Alves1; Karine Laste Macagnan2; Camila Rios Piecha2; Ligia Furlan3, Patrícia Diaz de
Oliveira2; Angelita da Silveira Moreira3*

1
Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial - Universidade Federal de Pelotas.
2
Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Biotecnologia- Universidade Federal de Pelotas
3
Centro de Ciências Farmacêuticas, Químicas e de Alimentos- Universidade Federal de Pelotas
*[email protected]

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Plásticos convencionais são polímeros derivados de petróleo têm despertado
preocupação devido a sua rápida descartabilidade, a lenta degradação e por não
reagirem quimicamente com a maioria das substâncias, provocando problemas nos
aterros sanitários, dificultando a troca de gases e a decomposição de outros compostos.
Polihidroxialcanoatos (PHA) são polímeros plásticos de origem biológica,
biodegradáveis e para os quais se utilizam fontes de carbono renováveis na sua síntese.
O Poli(3-hidroxibutirato) [P(3HB)] é o biopolímero mais estudado dentre os PHAs.
Ralstonia solanacearum RS é uma bactéria que acumula P(3HB) ainda na fase de
obtenção do inóculo. Neste trabalho, avaliou-se a Densidade Óptica (DO600), Biomassa
Celular Seca (BCS) e Rendimento de polímero pela modificação da combinação de
agitação e aeração na fase final de obtenção do inóculo, realizada em biorreator, visando
o aumento da concentração de biomassa e do rendimento do bioplástico. Incubou-se as
células em meio YM e a 32 °C, em biorreator de bancada com capacidade de 8L durante
24 h. As combinações de agitação e aeração utilizadas foram 150 rpm e 0,3 vvm (T1),
200 rpm e 0,65 (T2) e 250 rpm e 1 vvm (T3). Ouve diferença significativa positiva,
entre todas as variáveis dependentes, causada pelo aumento na agitação/aeração; os
maiores valores foram DO600 17,38; BCS 4,96 g/L e P(3HB) 42,60%. Análises
complementares devem ser realizadas para verificar o rendimento na fase de produção.

Palavras-chave: Bioplástico, Poli(3-hidroxibutirato), Fermentação, Ralstonia

solanacearum RS
______________________________________________________________________________________________

Agitation and aeration of the inoculum aiming at higher production of P(3HB)

ABSTRACT
Conventional plastics which are polymers derived from petroleum due to their fast
disposability, slow degradation and failure to react chemically with most substances,
causing problems in landfills, and also difficulty to exchange gases and decompose
other compounds have aroused many concerns to the environment.
Polyhydroxyalkanoates (PHA) are plastic polymers from biological source,
biodegradable and for which renewable carbon sources are used in their synthesis.
Poly(3-hydroxybutyrate) [P(3HB)] is the most studied biopolymer among the PHAs.
Ralstonia solanacearum RS is a bacterium that accumulates P(3HB) still in the stage of

307
obtaining the inoculum. In this work, the Optical Density (DO600), Dry Cell Biomass
(BCS) and Polymer yield were evaluated by modifying the combination of parameters,
agitation and aeration, in the final stage of obtaining the inoculum. The experiments
were carried out in a bioreactor, aiming to increase the biomass concentration and the
yield of the bioplastic. Cells were incubated in YM medium and at 32 0C in 8 L
capacity, in a bench scale bioreactor for 24 h. The agitation and aeration parameters
combinations were 150 rpm and 0.3 vvm (T1), 200 rpm and 0.65 (T2) and 250 rpm and
1 vvm (T3). There was a significant positive difference among all the dependent
variables caused by the increase in agitation / aeration parameters; The highest values
were DO600 17.38; BCS 4.96 g/L and P(3HB) 42.60%. Further analyzes should be
performed to verify the yield at the production stage.

Keywords: Bioplastic, Poly(3-hydroxybutyrate), Fermentation, Ralstonia

solanacearum RS
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
O consumo de plásticos não biodegradáveis per capita no mundo no ano de
2015 foi de 45Kg/habitante, e no Brasil, o valor foi de 46Kg/habitante. Embora o
consumo per capita de produtos plásticos no Brasil possa ser considerado modesto em
comparação ao consumo dos países desenvolvidos, já que em 2005 o consumo local era
de cerca de 25% do consumo per capita dos habitantes do Nafta (Estados Unidos,
Canadá e México) e da Europa, sua perspectiva de crescimento no consumo entre 2005
e 2015, de 100%, é igualada apenas aquela da Europa Oriental. Porém, mesmo após
esse crescimento ocorrer, o consumo per capita brasileiro deverá alcançar apenas 33%
do consumo nos países desenvolvidos (Silva et al., 2004).
O crescente interesse científico e popular pela área de preservação ambiental,
associado ao da área industrial pela continuidade do crescimento de consumo de
plásticos, têm tornado necessários à pesquisa e o desenvolvimento de substitutos
ecologicamente corretos. Neste aspecto, a utilização de biopolímeros está se tornando
cada vez mais interessante como alternativa à substituição de plásticos convencionais,
devido a sua principal característica- a biodegrabilidade - e os produtos que a reação de
degradação gera - água (H2O) e gás carbônico (CO2) (Luvizetto, 2007).
Em geral, a otimização das condições de fermentação tem provado ser bem
sucedida em melhorar substancialmente o rendimento do produto e a produtividade de
muitos processos biológicos (Choi et al., 1996). Dado que a síntese de P(3HB) é
conhecida por ser favorecida por estresses ambientais, tais como limitação de nutrientes
essenciais como nitrogênio, fosfato ou oxigênio (Braunegg et al., 1998) tal estratégia
vem sendo amplamente utilizada.

308
 Ralstonia solanacearum é um bacilo Gram-negativo amplamente distribuído em
nossa região, naturalmente habitante do solo e da água. Favoravelmente, é aeróbico e
não formador de esporos, e os isolados virulentos são aflagelados e imóveis, enquanto
os avirulentos têm alta motilidade. É tolerante a sais e cresce em ampla faixa de
temperatura, de 25 a 35 °C, de acordo com o isolado, e acumula P(3HB) como reserva
de carbono e energia (Mehan et al., 1994).
Como em trabalhos anteriores com Ralstonia solanacearum cepa RS, realizados
em incubador agitador orbital (shaker) verificou-se que o microrganismo é capaz de
acumular P(3HB) ainda na fase de inóculo, sem a necessidade de restrição de nutrientes,
objetivou-se, com o presente trabalho, iniciar o estudo de aumento de escala de
produção de inóculo e da influência da combinações dos parâmetros aeração e agitação
no processo fermentativo em biorreator de bancada, visando o aumento na concentração
de biomassa e no acúmulo de P(3HB) por Ralstonia solanacearum RS.

MATERIAL E MÉTODOS
Utilizou-se a linhagem Ralstonia solanacearum RS, cedida pelo Laboratório de
Bacteriologia da FAEM, UFPel. A bactéria foi primeiramente incubada a 32 ˚C, durante
24 h, em meio sólido Nutritive Yeast Agar (AYN) (extrato de levedura: 3 g/L; extrato de
malte: 3 g/L; glicose: 10 g/L; peptona: 5 g/L) (Schaad et al., 2001). Depois, as células
foram suspensas em meio líquido YM modificado (extrato de levedura: 2,7 g/L; extrato
de malte: 2,7 g/L; peptona: 4,5 g/L; sacarose: 35,0 g/L) (Jeanes, 1974); porções de 200
mL da suspensão bacteriana foram colocados em frascos de Erlenmeyers de 500 mL. As
condições de incubação foram 32 ºC e 200 rpm durante 24 h; após, as células foram
diluídas em meio líquido YM modificado até atingirem densidade óptica (DO) inicial de
0,5 abs. Para a fase de produção de 8 L, foi utilizado um biorreator de bancada
(BIOSTAT®B), pH 6, onde foram analisadas 3 diferentes combinações de agitação e
aeração, sendo 150 rpm e 0,3 vvm (T1), 200 rpm e 0,65 vvm (T2) e 250 rpm e 1 vvm
(T3); utilizou-se um volume de 20 % de pré-inóculo com DO600 de 0,5 mantendo-se as
demais condições. Para a determinação da DO, em 600 nm, em espectrofotômetro da
GE®, modelo Ultrospec 10; a determinação da biomassa celular seca (BCS), os cultivos
foram transferidos para tubos Falcon e submetidos a centrifugação em centrífuga
Kendro®, modelo Sorvall RC- 6, a 10000 g por 15 min a 4 ˚C; o sobrenadante foi
desprezado e o pellet de biomassa seco em estufa à temperatura de 56 ˚C por 48 h
(Macagnan et al., 2017). Para a extração de polímero, a biomassa celular seca (BCS) foi

309
submetida à agitação com clorofórmio na proporção 40:1 v/m na temperatura de 58 °C.
Transferiu-se a solução para funil de decantação e adicionou-se 40 partes de água
destilada. Em seguida, repousou-se para a separação de fases e transferiu-se a fase
orgânica para placa de Petri semi-fechada. Armazenou-se em capela de exaustão de
gases, para a evaporação lenta do solvente e formação dos biofilmes (Macagnan et al.,
2017). Após sua obtenção, os biofilmes foram pesados para o cálculo de rendimento,
que foi expresso em porcentagem. A análise estatística foi realizada com auxílio do
programa Statistix 9, utilizando o Teste de Tukey a 0,05.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados obtidos densidade óptica, biomassa celular seca e rendimento de
polímero oriundos da produção na fase de inóculo realizada em biorreator, com
diferentes condições de aeração e agitação, pode ser observado na Tab. 1
Tabela 1. Densidade Óptica (DO), Biomassa Seca Celular (BSC) e Rendimento de
polímero obtidos a partir de diferentes condições de aeração e agitação
Tratamentos DO±DP (600nm) BCS±DP (g/L) Rendimento (%)
T1 8,81c±0,01 2,16c±0,16 21,96c±0,9
T2 16,03b±0,27 2,56b±0,52 36,49b±0,5
T3 17,38a±0,03 4,96a±0,11 42,60a±1,5
T1: 150 rpm e 0,3 vvm; T2: 200 rpm e 0,65 vvm; T3: 250 rpm e 1 vvm. Letras
sobrescritas iguais na mesma coluna significam que não há diferença estatística pelo
Teste de Tukey (T> 0,05).
Pode-se observar, pela Tabela 1, que em relação aos resultados das análises
realizadas no presente estudo, que todos as variáveis dependentes foram significativa e
positivamente afetadas; o T3, caracterizado pela combinação dos maiores valores, 250
rpm de agitação e 1 vvm de aeração, ocasionou o melhor resultado frente aos demais
tratamentos.
A principal diferença entre os processos fermentativos em agitador incubador
orbital e em biorreator reside no fornecimento de oxigênio e velocidade de agitação; no
agitador incubador orbital não é possível o controle do fornecimento ou da taxa de
oxigênio dissolvido e as velocidades de agitação são menores. Trabalhos encontrados na
literatura não relatam os parâmetros usados na produção do inóculo em biorreator, fato
esse que seria importante para padronizar o processo desde o início.
Ao realizar a produção no inóculo no agitador incubador orbital, Macagnan
(2017, dados não publicados), obteve uma DO de 20,6 abs, BCS de 5,35 g/L e um

310
rendimento de 45,6% de polímero. Os resultados obtidos pelo autor com os encontrados
no presente trabalho não diferem estatisticamente, assim, pode-se perceber que o
aumento de escala para a produção do inóculo pode ser realizada com sucesso.
Kulpreecha e colaboradores (2009) avaliaram o efeito do pH (6,0; 7,0 e 8,0) e da
concentração de oxigênio dissolvido (OD) (40, 60 e 80% de saturação) no meio de
cultivo usado em fermentação em batelada de Bacillus megaterium BA-019 na fase de
produção. Para o rendimento de biomassa o melhor resultado (9,7 g/L) foi obtido na
fermentação sem controle de pH e com nível de DO saturado de 60%, porém não diferiu
estatisticamente do resultado obtido com pH 8,0 e saturação de 80% (9,5 g/L).
Faccin e colaboradores (2013) avaliaram a transferência de oxigênio submetendo
o cultivo de Bacillus megaterium DSM 32 na fase de produção a diferentes agitações
(100, 200, 300, 400, 500 e 600 rpm). O maior rendimento de P(3HB), 62%, foi obtido
com a agitação de 200 rpm.

CONCLUSÕES
O aumento da escala de produção do inóculo para 8 L foi realizada com sucesso.
O aumento combinado nas variáveis independentes agitação e aeração ocasionou, em
todos os níveis estudados, desejável aumento nos parâmetros analisados. Os maiores
valores de DO600, BCS e rendimento de P(3HB) foram obtidos com a combinação 250
rpm e 1 vvm, que ocasionou a maior aeração. Maiores estudos, ampliando-se o número
de combinações dos parâmetros agitação e aeração devem ser realizados, inclusive na
fase de produção.

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38, pp. 131-172

312
Análise micrográfica de Poli(3-hidroxibutirato) após ensaio de
degradação em solo

Matheus Marques Torres1*; Mariane Igansi Alves2; Karine Laste Macagnan1; Cristiane Raubach
Ratmann3; Angelita da Silveira Moreira2; Claire Tondo Vendruscolo2; Patrícia Diaz de Oliveira1

1
Núcleo de Biotecnologia, Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas,
Pelotas – RS, Brasil.
2
Núcleo de Ciência e Te cnologia de Alimentos – Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade
Federal de Pelotas, Pelotas – RS, Brasil.
3
Núcleo de Engenharia de Materiais, Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de
Pelotas, Pelotas – RS, Brasil.
*e-mail (autor para correspondência): [email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Devido a atual situação mundial de descarte e demasiada acumulação de lixo, a procura
e pesquisa sobre materiais biodegradáveis têm crescido consideravelmente. O presente
trabalho aborda um importante substituinte de plásticos derivados de petróleo: o Poli(3-
hidroxibutirato) [P(3HB)]. Embora biodegradável, a velocidade de degradação do
P(3HB) é variável e dependente de características do próprio polímero e do ambiente de
descarte, principalmente do tipo e concentração de microrganismos presentes no solo. O
trabalho discorre sobre um experimento de degradação em solo, realizado com P(3HB)
produzido em laboratório pelo microrganismo Ralstonia solanacearum. Foram
utilizados quatro tratamentos para o ensaio de degradação, sendo: (1) solo esterilizado
(controle negativo); (2) solo esterilizado inoculado com Ralstonia solanacearum; (3)
solo esterilizado inoculado com Bacilus megaterium; (4) solo não esterilizado (controle
positivo). A avaliação da degradação foi por analise gravimétrica, expressa como % de
perda de massa, e por análise micrográfica. O estudo demonstrou que o tratamento sem
processos de esterilização foi o mais efetivo na degradação polimérica devido a
variedade da microbiota existente em solo, e que tal degradação é visível não somente
macroscopicamente como microscopicamente.

Palavras-chave: P(3HB), Ralstonia solanacearum, Bacillus megaterium, micrografia,

biodegradável
______________________________________________________________________________________________
Micrographical analysis of Poly (3-hydroxybutyrate) after soil degradation test

ABSTRACT
Due to the current worldwide disposal situation and too much garbage accumulation,
demand and research on biodegradable materials has grown considerably. The present
work addresses an important substitute for petroleum-based plastics: Poly (3-
hydroxybutyrate) [P (3HB)]. Although biodegradable, the rate of degradation of P
(3HB) is variable and dependent on characteristics of the polymer itself and the
environment of disposal, especially the type and concentration of microorganisms
present in the soil. The work is based on a soil degradation experiment carried out with
P (3HB) produced in the laboratory by the microorganism Ralstonia solanacearum.

313
Four treatments were used for the degradation test: (1) sterilized soil (negative control);
(2) sterilized soil inoculated with Ralstonia solanacearum; (3) sterilized soil inoculated
with Bacilus megaterium; (4) non-sterile soil (positive control). The evaluation of the
degradation was by gravimetric analysis, expressed as% loss of mass, and by
micrographic analysis. The study demonstrated that the treatment without sterilization
processes was the most effective in the polymer degradation due to the variety of the
microbiota in soil, and that such degradation is visible not only macroscopically but also
microscopically.

Keywords: P(3HB), Ralstonia solanacearum, Bacillus megaterium, micrography,

biodegradable.
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Plásticos derivados do petróleo têm uma grande incidência na sociedade atual.
Devido suas características físicas, é muito comum seu uso em vários ramos industriais
(PITT et al. 2011). Mas apesar de seu uso recorrente ser benéfico, quando a questão é
analisada sob o ponto de vista ecológico, plásticos derivados de petróleo podem se
tornar um problema crescente. Ao serem descartados erroneamente, os plásticos
petroquímicos se acumulam no meio ambiente e, devido a sua baixa degradabilidade,
poluem tanto os ecossistemas terrestres quanto os aquáticos. Mesmo nos lugares
corretos de descarte, sua acumulação se faz de forma demasiada, sobrecarregando
aterros sanitários (RÓZ 2003).
Muitos materiais biodegradáveis têm sido estudados para contornar o problema
em questão. Uma das alternativas são os Polihidroxialcanoatos (PHAs), polímeros que,
por serem de origem microbiana, possuem um grande potencial degradativo em
ambientes biologicamente favoráveis (SUDESH et al., 2000). Dentre os PHAs, um dos
mais pesquisados é o Poli(3hidroxibutirato), um polímero microbiano de reserva
intracelular e que possui muitas características semelhantes ao polipropileno, um dos
plásticos petroquímicos mais utilizados mundialmente (SUDESH et al., 2000).
Diferentes P(3HB)s variam quanto à massa molar e índice de cristalinidade; e essas
diferenças interferem na velocidade de degradação após descarte em ambiente
favorável. Fatores ambientais, como umidade, pH do solo, tipo e concentração
microbiana também possuem grande influência na velocidade de degradação, que
quanto maior, melhor.
Objetivou-se avaliar, quantitativa e qualitativamente, a influência da inoculação
das bactérias acumuladoras de P(3HB) Ralstonia solanacearum e Bacillus megaterium
no processo biodegradativo em solo.

314
MATERIAL E MÉTODOS
O P(3HB)-RS foi produzido no Laboratório de Biopolímeros (UFPel) por
fermentação submersa com a bactéria Ralstonia solanacearum cepa RS e a metodologia
de síntese e extração do polímero segundo Macagnan et al. (2017).
Após a extração, a solução do polímero dissolvido foi então vertida em placas de
Petri semiabertas, para lenta evaporação do solvente e formação do filme. Os corpos de
prova de P(3HB), de aproximadamente 3,5 cm2, foram pesados e individualizados em
envelopes de tecido de poliéster medindo 5x6 cm, enterrados em triplicata e retirados
nos períodos de tempo de 20, 40, 60, 80 e 100 dias.
O experimento de degradação foi conduzido em casa de vegetação, com
mensuração de temperatura máxima e mínima. Os recipientes utilizados foram
sementeiras plásticas com células individualizadas, com dimensões de 6,5 x 6,5 x 6,0
cm, contendo aproximadamente 130 g de solo. O solo, adquirido no comércio local,
possuía em sua constituição 25,00% de argila e 5,38% de massa orgânica, com pH 7,64,
capacidade de retenção de água de 45,00%, mantido com essa proporção de umidade.
Quatro tratamentos foram utilizados: (T1) solo esterilizado, (T2) solo esterilizado e
acrescido de inóculo de R. solanacearum cepa RS, (DO600 10,8) (T3) solo esterilizado e
acrescido de inóculo de B. megaterium cepa CN3 (DO600 5,8), e (T4) solo natural.
Para obtenção dos inóculos utilizados nos tratamentos 2 e 3, foram realizados
repiques multiplicativos em meio Nutrient Yeast Agar (NYA) a 32ºC e 36 ºC por 24h,
respectivamente, para R. solanacearum cepa RS e Bacillus megaterium cepa CN3; após,
as células foram transferidas para frascos Erlenmeyers com 200 mL de meio Yeast Malt
(YM) e incubados nas temperaturas anteriores a 150 rpm, por 24 h.
Após serem retiradas do solo, as amostras de P(3HB) foram lavadas com àgua
destilada e secas em estufa a 56 °C por 24 horas. Após o processo de secagem, as
amostras foram analisadas quanto a sua perda de massa por gravimetria. A
caracterização microestrutural foi realizada em um microscópio eletrônico de varredura
por emissão de campo Carl Zeiss Supra 35-V, e conduzida à temperatura ambiente.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Tabela 1 apresenta os percentuais de degradação obtidos no transcorrer de 100
dias de ensaio de biodegradação. É possível inferir que o T4 e o T1 foram os mais
distantes em taxa de degradação. Enquanto a esterilização do T1 extinguiu toda a
microbiota presente responsável pelo processo degradativo, a não esterilização do T4

315
possibilitou a existência de uma microbiota ampla e diversificada, que resultou na maior
degradação. A ocorrência da pequena degradação em T1 é decorrente do fato que,
embora a condição inicial do solo tenha sido a esterilidade, o mesmo acaba
desenvolvendo uma nova microbiota, em função do contato com a atmosfera e água de
irrigação não estéreis. Yew et al.(2006) obtiveram 50% de biodegradação de P(3HB)
comercial (Produzido pela Biocycle©) em 40 dias, o que foi alcançado nesse estudo
para o T4. Entre T3 e T2, o mais efetivo foi o T3, evidenciando que a bactéria B.
megaterium é um degradador de P(3HB) mais efetivo.

Tabela 1. Perda de massa dos filmes de P(3HB) RS submetidos à biodegradação em

solo em diferente tratamentos.
Tempo Percentual de perda de massa (%)
(dias) T1 T2 T3 T4
20 3,49C 7,24BC 12,51B 19,22A
40 10,22C 12,03C 36,09AB 49,25A
60 23,85D 26,03CD 49,72B 77,32A
80 26,97CD 37,94C 65,34B 89,74A
100 28,56D 33,33C 88,07B 100A
*(T1) solo estéril; (T2) solo estéril inoculado com R. solanacearum cepa RS; (T3) solo
estéril inoculado com B. megaterium cepa CN3; (T4) solo não estéril. Letras
sobrescritas diferentes, na mesma linha representam diferenças significativas.

Na análise das micrografias (figura 1) observa-se, em todos os tratamentos,

biodegradação aos 60 dias, evidenciada pelas extensões das fraturas e a porosidade que
aumentam consideravelmente. No tempo 0, a micrografia revela as porosidades iniciais
do polímero sem qualquer tipo de degradação, produzidos devido ao método de
preparação dos filmes por evaporação. No T1 (solo inicialmente estéril) observa-se uma
estrutura mais compacta, enquanto que nos corpos dos demais tratamentos as
superfícies são mais porosas e irregulares, principalmente no T4. Imagens semelhantes
foram apresentadas por Wang et al. (2013), em que a degradação foi realizada
utilizando inóculos de Pseudomona medoncina aplicados diretamente nas amostras e o
mesmo perfil de biodegradação foi verificado.

316
 Tempo 0 T1 T2 T3 T4

Mi
.....
cro
...
gra
.....
fia
s

Fot
ogr
afi
as

Figura 1. Imagens das micrografias (aumento 200 x) e fotografias dos corpos de prova
submetidos a diferentes tratamentos, em 60 dias de biodegradação. T1 solo estéril; T2
solo estéril inoculado com R. solanacearum cepa RS; T3 solo estéril inoculado com B.
megaterium cepa CN3; T4 solo não estéril. Letras sobrescritas diferentes, na mesma
linha representam diferenças significativas.

As fotografias, obtidas na análise macroscópica, corroboram com a taxa de

degradação e perda de massa ocorrida. Com o aumento da degradação, a fragmentação
da amostra é evidente, como na amostra T4, que se encontra totalmente particulada. A
cor também é um parâmetro importante, visto que onde ocorreu a menor degradação
(T1) a cor e opacidade se assemelham à amostra do tempo 0.

CONCLUSÕES
O P(3HB) RS é biodegradado em um ambiente microbiologicamente favorável,
na presença de microrganismos degradadores desse polímero. Ambas bactérias
inoculadas, R. solanacearum e B. megaterium, podem ser consideradas como potenciais
degradadoras de P(3HB), sendo B. megaterium mais eficiente para o P(3HB) testado.

REFERÊNCIAS

LOPES, V.C.P., 2011. Foto e biodegradação de pebd, phb e suas blendas. Rio Claro:
Universidade estadual Paulista. 101 p. Tese de Mestrado em Ciências Biológicas.

317
MACAGNAN, K. L; RODRIGUES, A. A; ALVES, M. I; FURLAN, L;
KESSERLINGHC, S. M; MOURA, A. B; OLIVEIRA, P. D; MCBRIDE, A. J. A;
MOREIRA, A. S; VENDRUSCOLO, C. T. 2017. Simplified Recovery Process Of
Ralstonia Solanacearum-Synthesized Polyhydroxyalkanoates Via Chemical Extraction
Complemented By Liquid-Liquid Phase Separation. Química Nova, vol. 40, no. 2, p. 125
-130. http://dx.doi.org/10.21577/0100-4042.20160162.
MACHADO, M. L. C. (2008). Estudos das propriedades mecânicas e térmicas do
polímero biodegradável poli-3-hidroxibutirato (PHB) e de compósitos PHB/pó de
madeira. Tese de Doutorado, Biotecnologia, Universidade de São Paulo, São Paulo.PITT
, F. D., BOING, D., BARROS, A. A. C. Desenvolvimento histórico, científico e
tecnológico de polímeros sintéticos e de fontes renováveis. 2011. Revista da UNIFEBE,
Brusque. RÓZ, A. L.,2003 . O futuro dos plásticos: biodegradáveis e fotodegradáveis.
Polímeros, vol. 13, no. 4, pp. E4-E5. https://dx.doi.org/10.1590/S0104-
14282003000400003
SAW-PENG YEW, HUI-YING TANG, KUMAR SUDESH, 2006. Photocatalytic
activity and biodegradation of polyhydroxybutyrate films containing titanium dioxide.
Polymer Degradation and Stability , vol. 91, pp. 1800 -1807. http://dx.doi.org/10.1016/j.
polymdegradstab.2005.11.011.SUDESH, K., ABE, H., DOI, Y., 2000. Synthesis,
structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters. Progress in
Polymer Science, vol. 25, no. 10, pp. 1503–1555. http://dx.doi.org/10.1016/S0079-6700(
00)00035-6WANG, Z., LIN, X., AN, J., REN, C. and YAN, X., 2013. Biodegradation of
Polyhydroxybutyrate Film by Pseudomonas mendocina DS04-T. Polymer-Plastics
Technology and Engineering, vol. 52, no. 2, pp. 195-199. http://dx.doi.org/10.1080/
03602559.2012.735738

318
 Determinação de metanol em biorreatores anaeróbios por
NIRS-SVM
Maurílio Gustavo Nespeca1*, Caroline Varella Rodrigues1, Kamili Oliveira Santana1, José Eduardo de
Oliveira1

1
Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), Araraquara,
São Paulo, Brasil. *[email protected].

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Nos últimos anos, estudos têm mostrado a possibilidade da aplicação de espectroscopia
no infravermelho próximo (NIRS) associada a ferramentas quimiométricas no
monitoramento de digestores anaeróbios. Neste trabalho, foi desenvolvido um método
rápido de determinação de metanol em biorreatores de produção de hidrogênio por
NIRS. Utilizou-se 108 amostras de biorreatores alimentados com glicerol bruto
originado do processo de transesterificação de óleos e gorduras residuais para produção
de biodiesel. A concentração de metanol nas amostras foi determinada por
cromatografia em fase gasosa e usada como valor de referência no método
quimiométrico. Desenvolveu-se o modelo de predição através de regressão por Máquina
de Vetores Suporte (SVM) e este foi avaliado pelas figuras de mérito: exatidão,
precisão, linearidade e tendência. O modelo apresentou-se linear (rvalidação = 0,9580) e
sem tendência significativa, porém com baixa exatidão (RMSEP = 504 mg L-1) e
precisão (602 mg L-1), comprometendo a quantificação de metanol em baixas
concentrações. Apesar da baixa exatidão e precisão, a alta correlação entre os valores
medidos e preditos permitiu a aplicação de NIRS como método de varredura para
obtenção de informação do processo fermentativo de forma rápida, de baixo custo e sem
gerar resíduos para o meio ambiente.

Palavras-chave: monitoramento de biorreator; glicerol bruto; bio-hidrogênio; análise

multivariada; infravermelho próximo
______________________________________________________________________________________________

Determination of methanol in anaerobic bioreactors by NIRS-SVM

ABSTRACT
In recent years, studies have shown the possibility of applying near infrared
spectroscopy (NIRS) associated with chemometric tools in the monitoring of anaerobic
digesters. In this study, we developed a fast method to determinate methanol in H2-
production bioreactors using NIRS. We used 108 samples from bioreactors fed with
crude glycerol from transesterification process of waste cooking oil for biodiesel
production. The concentration of methanol in the samples was determined by gas
chromatography and used as reference value in the chemometric method. The prediction
model was developed through the Support Vector Machine (SVM) regression and then
evaluated by figures of merit: accuracy, precision, linearity and bias. The model was

319
linear (rvalidation = 0.9580) and had no significant bias, but presented low accuracy
(RMSEP = 504 mg L-1) and precision (602 mg L-1), compromising the quantification of
methanol in low concentrations. Despite the low accuracy and precision, the high
correlation between the measured and predicted values allowed the application of NIRS
as a scanning method to obtain information of the fermentation process quickly, low
cost and without generating waste to the environment.

Keywords: bioreactor monitoring; crude glycerol; biohydrogen; multivariate analysis;

near infrared.
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, o uso de glicerol bruto na fermentação anaeróbia tem ganhado
atenção devido à produção de hidrogênio como energia limpa e produtos de valor
agregado na fase líquida (Liu et al., 2013). Altos rendimentos de hidrogênio tem sido
reportados utilizando-se glicerol puro como substrato, porém, o custo para sua
purificação é elevado.
O metanol é uma das principais impurezas presentes no glicerol bruto
proveniente da produção de biodiesel e sua concentração depende do processo de
transesterificação. Sua presença no biorreator é considerada como um efeito inibitório
para o crescimento microbial e pode interferir na rota de geração de H2 (Rossi et al.,
2011). Assim, a determinação deste analito no digestor anaeróbio é tão relevante quanto
o monitoramento de ácidos graxos voláteis (VFA) e outros metabólitos.
A otimização de bioprocessos é frequentemente limitada à incapacidade de
medir a concentração de produtos em tempo hábil que permita ajustes no processo. A
determinação de álcoois e VFA são usualmente realizada por cromatografia líquida de
alta eficiência (HPLC) ou cromatografia em fase gasosa (GC), porém, estes métodos
requerem preparação da amostra, equipamento de alto valor, manutenção e técnicos
bem capacitados (Holm-Nielsen et al., 2008). Visto que a otimização do bioprocesso
requer uma aquisição de dados mais rápida, surge a necessidade de um método analítico
simples, rápido, de baixo custo e que necessite de pequeno volume de amostra para
monitoramento de biorreatores. Todos estes requisitos podem ser encontrados através
aplicação da espectroscopia na região do infravermelho próximo (NIRS) associada a
métodos quimiométricos.
Estudos já demonstraram o potencial de NIRS para o monitoramento de VFA
em digestores anaeróbios para produção de biogás, incluindo diferentes matérias-primas
(Holm-Nielsen et al., 2008). A aplicação de NIRS é dependente de métodos de

320
calibração multivariados, como Mínimos Quadrados Parciais (PLS) e Máquinas de
Vetor Suporte (SVM), e de valores de referência precisos e exatos para fornecer
modelos apropriados para predição. Após o desenvolvimento do modelo de predição, se
as figuras de mérito (FOM), tal como exatidão, precisão, linearidade, tendência, etc,
apresentarem valores aceitáveis, o modelo poderá ser aplicado em análises de rotina.
Uma vez que digestores anaeróbios podem diminuir a produtividade, serem
severamente perturbados ou até mesmo pararem a produção permanentemente devido à
falta de monitoramento apropriado, este trabalho objetivou o desenvolvimento de um
método NIRS para determinação de metanol em reatores anaeróbios alimentados com
glicerol bruto para produção de hidrogênio.

MATERIAL E MÉTODOS
As amostras utilizadas neste estudo procederam de dois estudos sobre a
aplicação de glicerol bruto como substrato em reatores fermentativos anaeróbios em
batelada para a geração de H2 e tratamento de resíduo. No Estudo A (Rodrigues et al.,
2016), os biorreatores foram inoculados com lodo granular proveniente de um reator
UASB (Upflow anaerobic sludge blanket) termofílico, utilizado no tratamento de
vinhaça da Usina São Martinho, localizado em Pradópolis – SP e, no Estudo B (Santana
et al., 2016), de um reator UASB da avícola DAKAR, localizada na cidade de Tietê –
SP. A biomassa e o meio líquido do efluente dos biorreatores foram separados por
centrifugação (9.000 rpm por 10 min) e, finalmente, o meio líquido foi filtrado por uma
membrana de 0,22 µm de porosidade para a análise de VFA e álcoois. As operações dos
biorreatores dos Estudos A e B estão descritas detalhadamente nas referências citadas
acima.
A concentração de metanol no meio líquido foi determinada conjuntamente aos
VFA (ácidos acético, propiônico, butírico, isobutírico, valérico, isovalérico e capróico)
e álcoois (etanol, n-propanol e n-butanol) através de GC. Os analitos foram extraídos
através de um amostrador headspace (AOC-5000 Plus, Shimadzu) e analisados em um
cromatógrafo (GC 2010, Shimadzu) equipado com detector de ionização de chama,
injetor split/splitless, coluna capilar de sílica fundida (dimensões 30m x 0.32mm x 3.0
mm, RTX-1, Restek). O forno foi programado inicialmente a 45 °C por 1 min seguido
por uma rampa de 50 °C min-1 até a temperatura final de 250 °C, mantida por 3 min.
Três curvas analíticas foram desenvolvidas para abranger a faixa de concentração de
metanol de 10 mg L-1 – 30000 mg L-1.

321
 Os espectros NIR das amostras foram obtidos em um espectrômetro Nicolet
6700 FT-IR (Thermo Scientific) com acessório de esfera de integração, Smart NIR
Integrating. Analisou-se 97 amostras do Estudo A, 11 do Estudo B e 31 soluções PYG
(com e sem glicerol bruto). Para cada amostra, utilizou-se apenas 0,5 mL para preencher
o espaço da cubeta de caminho ótico de 0,2 mm. Os espectros foram coletados na faixa
de comprimento de onda 10.000 – 4.000 cm-1 em uma resolução de 4 cm-1.
O modelo de predição de metanol foi desenvolvido pelo método de regressão
por SVM utilizando-se o software MATLAB (versão R2013a) e PLS Toolbox (versão
7.9.3). As amostras foram separadas em: 102 para calibração e 47 para validação. O
modelo foi desenvolvido com a faixa espectral completa e dados centrados na média. As
principais figuras de mérito, como exatidão, precisão, linearidade e tendência, foram
avaliadas de acordo com a ASTM 1655-05 (2012).

RESULTADOS E DISCUSSÃO
O glicerol bruto utilizado nos reatores anaeróbios em batelada apresentou teor de
metanol de 15,85% (v/v). A concentração de metanol nas amostras do Estudo A e B
variou entre 43 – 2.670 mg L-1 e 122 – 19.863 mg L-1, respectivamente.
Quando os metabólitos estão em meio aquoso, as bandas características de cada
composto ficam sobrepostas pelas bandas atribuídas principalmente à água (5.400 –
4.600 cm-1 e 7.300 – 6.500 cm-1), contudo a sensibilidade às ligações de hidrogênio na
região NIR permite a quantificação de álcoois e ácidos carboxílicos (Gemperline, 2006).
O modelo de predição foi desenvolvido de forma simples, sem algoritmos de
seleção de variáveis, exclusão de regiões espectrais ou transformadas matemáticas, além
dos dados centrados na média e compressão pelo método PLS. Na Tabela 1, são
apresentados os valores medidos e preditos da concentração de metanol de algumas
amostras de validação e seus resíduos.
Tabela 1 - Valores medidos e preditos de concentração e resíduos.
Concentração de metanol (mg L-1)
Amostra de validação
Medida Predita Resíduo
2 424 479 55
13 2037 2113 76
17 1594 1837 243
24 1801 1870 69
42 9932 10503 571
50 0 23 23
51 0 -10 -10

322
 Os erros da modelagem resultaram em valores de RMSEC e RMSEP iguais a,
respectivamente, 334 mg L-1 e 504 mg L-1. A análise de quinze replicatas de seis
amostras resultou em precisão de 602 mg L-1. Apesar da baixa exatidão e precisão, o
modelo apresentou boa linearidade, apresentando coeficientes de determinação e
correlação acima de 0,90 (R2calibração = 0,9871; R2validação = 0,9178; rcalibração = 0,9935; e
rvalidação = 0,9580), e nenhuma tendência significativa (tbias = 0,77; tcrítico = 2,01).
As bandas intensas da água levaram a um modelo com baixa seletividade e razão
Sinal/Ruído. Outros fatores que podem ter contribuído para a falta de precisão e
exatidão foram a heterogeneidade da amostra; valores de referência inexatos; e
mudanças na constituição química. Estudos encontrados na literatura também
mostraram problemas de baixa exatidão na predição de outros compostos, contudo a
varredura do processo fermentativo foi eficaz com uso de NIRS (Holm-Nielsen et al.,
2008). Diferentemente das análises realizadas pelos métodos convencionais, a análise
NIR é rápida, de custo relativamente baixo e permite a aquisição de dados em tempo
real, portanto, fornece um monitoramento eficiente do digestor anaeróbio.

CONCLUSÕES
O uso de NIRS junto ao método de regressão SVM possibilitou a análise de
metanol em biorreatores alimentados com glicerol bruto de forma rápida, com baixo
custo e sem gerar resíduos para o meio ambiente. Essas vantagens somadas à
necessidade de um volume pequeno de amostra permitirão uma coleta maior de dados,
resultando em um monitoramento mais eficaz do processo fermentativo. Ou seja, o
método NIRS aliado a um método convencional, GC ou HPLC, fornecerá informações
essenciais para melhor compreensão e aprimoramento de biorreatores para produção de
H2.

AGRADECIMENTO
À CAPES e ao Centro Multidisciplinar de Pesquisa em Combustíveis,
Biocombustíveis, Petróleo e Derivados (CEMPEQC).

REFERÊNCIAS

ASTM E1655-05, 2012. Standard Practices for Infrared Multivariate Quantitative

323
Analysis.
GEMPERLINE, P., 2006. Practical Guide To Chemometrics, Second Edition. pp. 89.
HOLM-NIELSEN, J.B., LOMBORG, C.J., OLESKOWICZ-POPIEL , P. and
ESBENSEN, K.H., 2008. On-line near infrared monitoring of glycerol-boosted
anaerobic digestion processes: Evaluation of process analytical technologies.
Biotechnology and Bioengineering, vol. 99, no. 2, p. 302–313. DOI 10.1002/bit.21571.
LIU, B., CHRISTIANSEN, K., PARNAS, R., XU, Z. and LI, B., 2013. Optimizing the
production of hydrogen and 1,3-propanediol in anaerobic fermentation of biodiesel
glycerol. International Journal of Hydrogen Energy, vol. 38, no. 8, p. 3196 –3205. DOI
10.1016/j.ijhydene.2012.12.135.
RODRIGUES, C.V., SANTANA, K.O., NESPECA, M.G., OLIVEIRA, J.E. and
MAINTINGUER, S.I ., 2016. Crude glycerol by transesterification process from used
cooking oils: Characterization and potentialities on hydrogen bioproduction.
International Journal of Hydrogen Energy, vol. 1. DOI 10.1016/j.ijhydene.2016.06.209.
ROSSI , D.M., COSTA, J .B., SOUZA, E.A., PERALBA, M.C.R., SAMIOS, D. and
AYUB, M.A.Z., 2011. Comparison of different pretreatment methods for hydrogen
production using environmental microbial consortia on residual glycerol from biodiesel.
International Journal of Hydrogen Energy,vol. 36, no. 8, p. 4814–4819. DOI 10.1016/j.
ijhydene.2011.01.005.
SANTANA, K.O., RODRIGUES, C.V., NESPECA, M.G., OLIVEIRA, J.E. and
MAINTINGUER, S.I., 2016. Produção biológica de gás hidrogênio a partir de glicerol
bruto e esgoto sanitário. Ciência & Tecnologia: Fatec-JB. Vol. 8, p. 1–14. Available
from: http://www.citec.fatecjab.edu.br/index.php/files/article/viewFile/677/pdf

324
Identificação de macrofungos encontrados no Extremo Sul da
Bahia
Michele Bonfim Santos1; Bianca Vicente Figueiredo1; Jorge Luiz Fortuna2*

1
Discentes do curso de Ciências Biológicas. Universidade do Estado da Bahia (UNEB), Campus X.
Teixeira de Freitas-BA. Bolsistas de Iniciação Científica pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado
da Bahia (FAPESB) e pelo Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica (PIBIC),
respectivamente.
2
Professor Adjunto da área de Microbiologia. Laboratório de Microbiologia. Universidade do Estado da
Bahia (UNEB), Campus X. Teixeira de Freitas-BA. *[email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
A identificação preliminar de macrofungos visa contribuir para o conhecimento da área
estudada, fornecendo dados para futuros estudos específicos a serem realizados no
mesmo local. Este trabalho teve como objetivo realizar identificação preliminar de
fungos poliporoides encontrados em um fragmento de Mata Atlântica no município de
Teixeira de Freitas no Extremo Sul da Bahia. As coletas foram realizadas em um
fragmento florestal remanescente da Mata Atlântica, com aproximadamente 30 ha, onde
se localiza o Programa Arboretum de Conservação e Restauração Florestal. Neste
fragmento florestal foram delimitadas seis parcelas de 125 m2 (5,0 m x 25,0 m). As
coletas dos macrofungos foram realizadas a cada dois meses no ano de 2015. Todo
material foi transportado para o Laboratório de Microbiologia do Campus X da
Universidade do Estado da Bahia (UNEB). Foram identificadas as seguintes famílias de
macrofungos: Polyporaceae; Hymenochaetaceae.; Sarcoscyphacea; Agaricaceae;
Ganodermataceae; Clavulinaceae.

Palavras-chave: Fungo; Cogumelo; Micologia; Poliporoides.

______________________________________________________________________________________________

Identification of macrofungus found in the Extreme South of Bahia

ABSTRACT
The preliminary identification of macrofungus aims to contribute to the knowledge
about these organisms with data for future studies in the same location. The present
study describes the results of the preliminary identification of polyporous fungi in an
Atlantic Forest fragment in the municipality of Teixeira de Freitas, south Bahia state,
Brazil. Collections were carried out in a 30-ha Atlantic Forest fragment that is part of
the Arboretum Program of Forest Conservation and Reforestation. Six quadrats (125
m2, 5.0 m x 25.0 m) were outlined in the 30-ha and collections were carried out every
two months in 2015. All material was transported to Laboratory of Microbiology,
Campus X, Universidade do Estado da Bahia (UNEB). The following families of the
macrofungus were identified: identified: Polyporaceae; Hymenochaetaceae.;
Sarcoscyphacea; Agaricaceae; Ganodermataceae; Clavulinaceae.

Keywords: Fungus; Mushroom; Mycology; Polyporous Fungi.

______________________________________________________________________________________________

325
INTRODUÇÃO
Os fungos são componentes primordiais para os ecossistemas, estes organismos
são encontrados em qualquer local do ambiente, sendo grande a diversidade dos fungos
existentes.
Segundo Silva e Coelho (2006) os fungos são importantes para manutenção de
uma floresta, já que neste meio ambiente ocorre grande deposição de material vegetal
como troncos, galhos e folhas, pois possuem enzimas capazes de degradar e reciclar
essa matéria orgânica disponibilizando os produtos da degradação para ação de outros
microrganismos e o crescimento de outras plantas e eventualmente de animais. Sendo
assim, Amazonas (2003) afirmou que, além de evitar a depleção de nutrientes, estes
fungos melhoram a estrutura do solo e facilitam o reflorestamento.
Hyde e Hawksworth (1997) determinaram que o baixo conhecimento micológico
está associado, principalmente, aos poucos estudos realizados nas florestas tropicais que
por sua vez, abrigam a maior diversidade do planeta. Para Blackwell (2011) a falta de
conhecimento de novas espécies se dá porque a maior parte das regiões tropicais do
mundo não foi amplamente inventariada e acredita-se que existem inúmeras espécies
ainda não conhecidas nessas áreas.
Portanto, as atividades dos fungos na natureza são tão necessárias para a
continuidade da existência do planeta, quanto são aquelas desempenhadas pelos
organismos produtores (Silva e Coelho, 2006).
Neste contexto, o estudo da micota para o conhecimento do fragmento de Mata
Atlântica na região é de extrema importância, e a identificação preliminar de
macrofungos visa contribuir para o conhecimento da área estudada, fornecendo dados
para futuros estudos específicos a serem realizados no mesmo local.
Esta pesquisa teve como objetivo coletar e identificar a diversidade de espécies de
macrofungos em um fragmento de Mata Atlântica localizado no Programa Arboretum
em Teixeira de Freitas-BA, região do Extremo Sul da Bahia.

MATERIAL E MÉTODOS
A área de estudo é um fragmento florestal remanescente da Mata Atlântica, com
aproximadamente 30 ha, que pertence ao Programa Arboretum de Conservação e
Restauração Florestal, localizado na região do Extremo Sul da Bahia no município de
Teixeira de Freitas (17º34’S e 39º43’O). Pertence ao domínio ecológico da Mata
Atlântica, com Floresta Ombrófila Densa. Neste fragmento florestal foram delimitadas
326
seis parcelas, sendo que cada uma com área de 125 m2 (5,0 m x 25,0 m), que foram
identificadas e localizadas através de GPS.
As coletas dos macrofungos foram realizadas a cada dois meses no ano de 2015.
Em campo foram realizados registros fotográficos dos fungos antes e após coleta e
anotações das suas principais características (tamanho, cor, substrato, odor, etc.).
Os espécimes coletados foram acondicionados individualmente em sacos de
papel, para que o material não se danificasse. Todo material foi transportado para o
Laboratório de Microbiologia do Campus X da Universidade do Estado da Bahia
(UNEB).
No laboratório os espécimes foram visualizados em estereoscópio (lupa) para
maiores detalhes das estruturas. Também foram feitas análises das microestruturas do
basidioma e novamente fotografados. Para a análise das microestruturas do basidioma,
foram feitos cortes transversais à mão livre sob microscópio estereoscópico, utilizando
lâminas de aço inoxidável. Foram realizados cortes dos basidiomas (contexto, tomento e
tubos) à mão livre, foram fixados em lâminas e lamínulas nas soluções de KOH 2-3%,
Floxina 1%, e Melzer (Teixeira, 1995) para observação microscópica.
As análises das características macroscópicas foram baseadas em caracteres
diagnósticos de acordo com a literatura científica da área de macrofungos (Alves et al.,
2012; Braga-Neto, 2006; Evert e Eichhorn, 2013; FPFP, 2008; Lazarotto et al., 2014;
Pires et al., 2014).
Os espécimes foram desidratados em estufa botânica a temperatura de 40°C por
um período máximo de 24 horas. Os macrofungos, após a secagem, foram preservados
em temperatura ambiente e de congelamento no Laboratório de Microbiologia do
Campus X da UNEB para estudos posteriores.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Ao todo foram identificados 14 macrofungos, cinco em nível de espécie e nove
em nível de gênero, distribuídos em seis diferentes famílias, sendo elas: (1)
Polyporaceae: Coriolopsis caperata; Trametes membranacea; Trametes cingulata;
Fomitopsis spp.; Polyporus spp.; Tyromyces spp.; Daedalea spp. (Figura 1); (2)
Hymenochaetaceae: Fuscoporia gilva; Phellinus piptadeniae; Phylloporia ssp.; (3)
Sarcoscyphacea: Cookeina spp.; (4) Agaricaceae: Marasmius ssp.; (5)
Ganodermataceae: Amauroderma spp.; (6) Clavulinaceae: Clavulina ssp. (Figura 2).

327
Figura 1. Fungos da família Polyporaceae encontrados em um Figura 2. Macrofungos encontrados em um fragmento de Mata
fragmento de Mata Atlântica no Extremo Sul da Bahia: (A-B) Atlântica no Extremo Sul da Bahia: (A) Fucosporia gilva; (B)
Daedalea spp.; (C-D) Trametescingulata; (E-F-G) Phellinus piptadeniae; (C) Phylloporia spp.; (D) Cookeina
Trametesmembranacea; (H-I) Fomitopsis spp. spp.; (E) Marasmius spp.; (F) Amauroderma spp.; (G)
Clavulina spp.

O fragmento de Mata Atlântica no qual foram realizadas as coletas passa por um

processo de reconstituição natural da sua flora, possuindo uma vasta quantidade de
serapilheira, árvores e troncos em processo de decomposição. Dos macrofungos
coletados e identificados foi possível observar que a grande maioria foi recolhida sobre
esses substratos, presentes em abundância no fragmento. Levando em consideração o
estágio natural de recuperação desse fragmento, Maia et al (2012) consideram que os
basidiomicetos atuam na decomposição da matéria orgânica, fato este que contribui para
a fertilização do solo, promovendo o crescimento e a manutenção das espécies que ali
vivem.
Os fungos poliporoides pertencem ao filo basidiomycota, sendo basidiomicetos
macroscópicos que se caracterizam por apresentar o himenóforo tubular (Gilbertson e
Ryvarden, 1986; Alexopoulos et al., 1996). Esses fungos também são conhecidos
popularmente como orelhas-de-pau devido ao hábito do basidioma e possuem grande
capacidade de degradar a lignina e/ou celulose e hemicelulose presentes na madeira
(Newell et al., 1996; Anagnost, 1998). Outra característica desses fungos é a presença
de poros na parte inferior do basidioma, diferente dos cogumelos que possuem lamelas
aderidas ao píleo.
A família Polyporaceae é bastante representativa, pois indica maior número de
espécies. Em outros estudos realizados anteriormente no Brasil (Vásquez, 2013;
Abrahão et al., 2009) mostram o indicativo predominante dessa família de fungos.
A presença dos fungos das famílias Hymenochaetaceae e Ganodermataceae foi
influenciada pela sazonalidade climática, principalmente no período de estiagem na área
estudada. Nos meses de estiagem (novembro a março), aumentou a frequência das
coletas destas famílias, sendo raro encontrar espécimes de outras famílias. Nos meses

328
chuvosos (maio a setembro), foi possível coletar com certa frequência os fungos da
família Agaricaceae.
Foi observado que nas estações de seca as famílias de fungos com características
mais resistentes eram favorecidas e, em contrapartida, os fungos denominados frágeis
não prevaleciam. Tal fato ocorre pois os fungos da família Agaricaceae geralmente
possui basidiomas frágeis, de consistência carnosa, muitas vezes putrescentes, tornando-
os muito mais sensíveis às mudanças climáticas e variações de umidade.
Essas espécies descritas no estudo foram as primeiras identificadas
preliminarmente neste fragmento de Mata Atlântica localizado no município de Teixeira
de Freitas no Extremo Sul Baiano.

CONCLUSÕES
O levantamento de dados obtidos a partir dessa pesquisa servirá de base para
novos estudos, já que o mesmo é pioneiro na região que se localiza este fragmento de
Mata Atlântica. Com a realização deste trabalho tornou-se possível a ampliação do
conhecimento da micodiversidade no fragmento de Mata Atlântica do Extremo Sul
Baiano. Porém, os fatores climáticos e a degradação por influência humana dificultam
tanto a coleta quanto a própria identificação.

AGRADECIMENTOS
Ao Programa Arboretum de Conservação e Restauração Florestal, localizado no
município de Teixeira de Freitas-BA, por permitir a realização da pesquisa em sua área.
Ao Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica (PIBIC) e à Fundação
de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) pelas bolsas de iniciação
científica.

REFERÊNCIAS
ABRAHÃO M. C. et al. 2009. Poliporoides (Basidiomycota) em fragmentos de mata no
perímetro urbano de São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil. Revista Brasil. v. 32, n.
3, p. 427-440
ALEXOPOULOS, C. J.; MIMS, C. W.; BLACKWELL, M. 1996. Introductory
Mycology. New York: John Wiley & Sons.
ALVES, G. C. et al. 2012. Primeiro relato de Agaricales no município de São Gabriel,
RS, Brasil. Caderno de Pesquisa. Série Biologia. v. 24, n. 2, p. 7-20.

329
AMAZONAS, M. A. L. A. et al. 2001. Envenenamento por Chlorophyllum molybdites
no Paraná. In: 3º Congresso Brasileiro de Micologia. Águas de Lindóia-SP. Anais... São
Paulo: Sociedade Brasileira de Micologia, p. 49.
ANAGNOST, S. E. 1998. Light Microscopic Diagnosis of Wood Decay. Iawa Journal
v. 19, n. 2, p. 141-167.
BLACKWELL, M. 2011. The Fungi:1, 2, 3. 5.1 million species? American Journal of
Botany. v. 98, n. 3, p. 426-438.
BRAGA-NETO, R. 2006. Guia de Morfoespécies de Fungos de Liteira da Reserva
Ducke. Manaus: Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA).
EVERT, R. F.; EICHHORN, S. E. 2013. Raven. Biology of Plants. 8. ed. New York: W.
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FPFP (Federação dos Produtores Florestais de Portugal). 2008. Guia de Campo –
Cogumelos Silvestres. Lisboa: FPFP.
GILBERTSON, R. L.; RYVARDEN, L. 1986. North American Polypores. v. 1. Oslo:
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biodiversity of microfungi. Biodiversity of Tropical Microfungi. p. 141-156.
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sistemas florestais no noroeste do estado do Rio Grande do Sul, Brasil: Floresta
Estacional Decídua e monocultura de eucalipto. Hoehnea. v. 41, n. 2, p. 269-275.
MAIA, A. K. B.; TORRES FILHO, J.; CHAVES, J. T. L. 2012. Importância dos
basidiomicetos como decompositores da matéria orgânica para biodiversidade da
Floresta Nacional do Araripe. Anais... IV Encontro Universitário da UFC no Cariri.
Juazeiro do Norte-CE. 17 a 19 de dezembro de 2012. Universidade Federal do Ceará. p.
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PIRES, E. Z. et al. 2014. Biodiversidade de basidiomicetos encontrados em um
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Biotecnológicas. São Paulo: Instituto de Botânica.
TEIXEIRA, A. R. 1995. Métodos para Estudos das Hifas do Basidiocarpo de Fungos
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VÁSQUEZ, V. M. 2013. Fungos com poros: (Hymenochetalales e Polyporales) do
Parque Estadual da Cantareira (PEC), São Paulo, SP, Brasil. 429 p. Dissertação
(Mestrado). Instituto de Botânica da Secretaria de Estado do Meio Ambiente. São
Paulo-SP.

330
 Otimização da produção de xilanases por Aspergillus hortai
em estado sólido
Michel Ricardo Gracioli1*; Cárol Cabral Terrone1; Juliana Montesino Freitas Nascimento1; Eleonora
Cano Carmona1
1
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP. *e-mail: [email protected]

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Neste trabalho, foram avaliados os efeitos isolados e sinérgicos da temperatura e do pH
na produção de xilanases por uma linhagem de Aspergillus hortai cultivada em estado
sólido (FES) por meio de Metodologia de Superfície de Resposta (MSR) baseada em
Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR). A análise de regressão múltipla
dos dados experimentais foi aplicada, gerando um modelo quadrático para a resposta da
atividade xilanase, o qual revelou serem significativos para a produção das enzimas,
apenas os efeitos lineares das variáveis. A significância estatística do modelo foi
avaliada por ANOVA (teste F). A produção máxima de xilanase de 8,72 U/mL (101,15
U/g) de substrato seco foi obtida em pH 4,5 e temperatura de 30°C (pontos centrais),
correspondendo a um aumento de 2,5 vezes na atividade enzimática.

Palavras-chave: xilanases, Delineamento Composto Central, Metodologia de Resposta

de Superfície, pH, temperatura.
______________________________________________________________________________________________

Optimization of xylanase production by Aspergillus hortai in solid state

ABSTRACT
In this work, isolated and synergistic effects of temperature and pH on the production of
xylanases by an Aspergillus hortai strain cultivated in solid state fermentation (SSF)
were evaluated by using Response Surface Methodology (RSM) based on Central
Composite Design (CCD). A multiple regression analysis of the experimental data was
applied generating a quadratic model for the response of xylanase activity which
revealed that only the linear effects of the variables influenced significantly the xylanase
production. The statistical significance of the model was evaluated by ANOVA (F test).
The maximum xylanase production of 8,72 U/mL (101,15 U/g) of dry substrate was

331
obtained at pH 4,5 and temperature of 30°C (central points) which corresponds to an
increase of 2.5-fold in enzyme activity.

Keywords: Xylanase, Central Composite Design, Response Surface Methodology, pH,

Temperature.
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
As xilanases (E.C. 3.2.1.8) formam o principal grupo de hemicelulases capazes
de atuar na hidrólise da xilana, a principal hemicelulose presente na parede celular das
plantas, liberando xilooligossacarídeos. Tais enzimas têm amplo emprego em diversos
setores da indústria, incluindo a produção de cosméticos, de alimentos, de
biocombustíveis, de ração animal, na clarificação de sucos e vinhos, no
biobranqueamento de papel e celulose e no tratamento de resíduos, cujas áreas
movimentam bilhões de dólares anualmente. Um fator limitante na obtenção de
xilanases, porém, é o seu elevado custo de produção; para testes em pequena escala, a
xilana purificada pode ser utilizada como substrato indutor, mas, para processos em
escala industrial, o seu uso aumenta muito o custo final de produção das enzimas,
podendo inviabilizar o bioprocesso. Em vista disso, o emprego de resíduos
lignocelulósicos como o sabugo de milho, produzidos em grande quantidade pela
agroindústria brasileira, como substrato para a fermentação microbiana, vem se
mostrando bastante interessante, tendo em vista o seu alto potencial como indutor da
produção de enzimas, compostos de alto valor agregado, e o baixo custo de obtenção.
Neste contexto, desenvolveu-se este trabalho, que teve por objetivo a otimização da
produção de xilanases por Aspergillus hortai cultivado em meio sólido de forma estática
por meio de Metodologia de Superfície de Resposta baseada em Delineamento
Composto Central Rotacional.

MATERIAL E MÉTODOS
Cultivo e manutenção do fungo. A linhagem de A. hortai foi cultivada em meio
sólido de Vogel (VOGEL, 1956), contendo farelo de trigo como fonte de carbono (1,5%
m/v) e ágar (1,5% m/v) e mantida a 40°C em incubadora BOD por 7 dias. Após este
período, foi transferido para geladeira a 4°C e repicado periodicamente. Para a
preparação das suspensões de esporos, a linhagem foi cultivada conforme descrito
acima e, após os 7 dias de crescimento, os conídios foram suspensos em água destilada

332
e sua concentração foi ajustada para 5x106 conídios/mL sendo, esta suspensão, utilizada
como inóculo.
Obtenção das preparações enzimáticas. Para obtenção das preparações
enzimáticas, 1 mL da suspensão de conídios foi inoculada em meio contendo 5,0 g de
sabugo de milho umidificado com 19 mL de solução de Vogel 2% (v/v) pH 5,0, e
cultivado por 4 dias a 35 ºC. Após esse período, foram adicionados 50 mL de água
destilada às culturas, que foram agitadas e filtradas a vácuo em funil de Büchner
obtendo-se, assim, um filtrado livre de células e micélio, que foi congelado e utilizado
como fonte de proteínas e enzimas extracelulares.
Determinação da atividade xilanase e proteínas totais. A atividade xilanase foi
determinada pela dosagem de açúcares redutores liberados, usando o reagente de ácido
3,5-dinitrosalicílico (ADNS) e xilose como padrão. A determinação de proteínas totais
extracelulares foi feita de acordo com Lowry et. al (1951), utilizando soroalbumina
bovina (SAB) como padrão.
Planejamento experimental e superfícies de resposta . Para a análise dos efeitos
do pH e da temperatura na produção de xilanases foi desenvolvido um Delineamento
Composto Central Rotacional (DCCR ) 2² com três repetições no ponto central ,
totalizando 11 experimentos (Tabela 1). Os resultados dos ensaios de atividade
enzimática e proteínas totais dos experimentos foram submetidos à análise estatística
utilizando o software Estatística 7.0, no qual também foram elaboradas superfícies de
resposta de interação entre as variáveis.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
O DCCR foi realizado com o intuito de avaliar os efeitos individuais e conjuntos
entre pH e temperatura de cultivo na produção das xilanases a fim de permitir a sua
otimização. Na Tabela 1 estão descritas as condições experimentais do planejamento
com os valores codificados, reais e de atividade obtidos em cada ensaio.

333
 Tabela 1. Matriz do planejamento experimental. Valores
codificados, reais e de atividade de cada ensaio.
x y Atividade
Ensaios
(pH) (temperatura ºC) (U/ml)
1 -1 (3,45) -1 (26,4) 4,548
2 +1 (5,56) -1 (26,4) 6,535
3 -1 (3,45) +1 (33,5) 5,843
4 +1 (5,56) +1 (33,5) 9,330
5 -1,41 (3,00) 0 (30,0) 4,645
6 +1,41 (6,00) 0 (30,0) 8,697
7 0 (4,50) -1,41 (25,0) 4,558
8 0 (4,50) +1,41 (35,0) 7,557
9 0 (4,50) 0 (30,0) 8,285
10 0 (4,50) 0 (30,0) 10,142
11 0 (4,50) 0 (30,0) 9,975

Com base nos dados da matriz do planejamento, observa-se que, no geral, o

micro-organismo apresentou melhor atividade em meios mais ácidos, com valores de
pH entre 4,5 e 5,56 (experimento 4, 10 e 11) e em temperaturas variando entre 30,0 e
33,5 ºC. A partir desses dados, foram realizadas as análises de regressão múltipla, de
significância, e o estudo de interação entre as variáveis.
Os coeficientes de regressão para a produção de xilanase estão descritos na
Tabela 2. A análise dos P-valores mostrou que apenas a interação entre as duas variáveis
não demonstrou efeito significativo em um intervalo de 90% de confiança, sendo o pH,
a variável de maior influência na produção da enzima (p -valor = 0,001923).

Tabela 2. Análise de regressão múltipla das variáveis do planejamento.

Coef. Regressão Erro t (5) p-valor
Efeitos
Padrão
Média 9,46646 0,384608 24,61325 0,000002
X 1,40235 0,235877 5,94523 0,001923
X² -1,35124 0,281463 -4,80078 0,004880
Y 1,04304 0,235877 4,42196 0,006879
Y² -1,65984 0,281463 -5,89720 0,001994
XxY 0,37494 0,333085 0,311424 -0,29624
Intervalo de confiança de 90%. X: pH; Y: temperatura (°C).

334
 Com a eliminação o parâmetro não significativo para a produção, obteve-se a
equação ajustada do modelo:

Xilanase (U/ml) = 9,46 + 1,40X - 1,35X² + 1,04Y - 1,65Y² Eq. 1

A ANOVA dos resultados (Tabela 3) permitiu afirmar que o modelo obtido foi
de boa qualidade (Fcalc superior a Ftab) para um nível de confiança de 90%. Além
disso, o coeficiente de correlação bastante alto (R2 de 0,94) indicou um ajuste
satisfatório dos dados na resposta de produção de xilanases.

Tabela 3. ANOVA para a produção de xilanases por A. hortai cultivado em estado

sólido.
Fonte de variação SQ GL QM F calculado
Regressão 44,4046 4 11,1011 23,95
Resíduo 2,7812 6 0,4635
F ajuste 0,6696 4 0,1674 0,15
Erro puro 2,1115 2 1,0557
Total 47,1858 10 4,7185
SQ: soma dos quadrados; GL: graus de liberdade; QM: quadrados médios; R2: 0,94;
Ftab: 3,18.

Para melhor visualização dos resultados, foi elaborada a curva de superfície

de resposta e as curvas de contorno da atividade enzimática em função da
temperatura e do pH de cultivo (Figura 1).

Figura 1. Superfície de resposta e curvas de contorno da atividade enzimática em função

da temperatura e do pH de cultivo.

335
 A análise das curvas de superfície e de contorno mostra que os maiores valores
de resposta foram encontrados para os pontos centrais - pH 4,5 e temperatura de 30ºC -
levando a um valor predito de aproximadamente 9,46 U/ml, o qual, apresentou boa
correlação com o valor real obtido de 8,72 U/ml, representando um aumento
aproximado de 2,5 vezes na produção das xilanases como resultado da otimização do
processo.

CONCLUSÕES
A aplicação do delineamento experimental permitiu a identificação dos efeitos
significativos e não significativos individuais e conjuntos da temperatura e do pH sobre
a produção das xilanases, possibilitando a obtenção de um modelo preditivo para a
atividade e a construção de superfícies de respostas que permitiram identificar as
melhores condições de cultivo do micro-organismo para a produção de xilanases.

REFERÊNCIAS

LOWRY, O.H., ROSEBROUGH, N.J., FARR, A.L. and RANDALL, R.J., 1951.

Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry,

vol. 193, pp. 265-275, 1951. http://www.jbc.org/content/193/1/265.full.pdf.

VOGEL, H.J., 1956. A convenient growth medium for Neurospora (Medium N).

Microbiology and Genetic Bulletin, vol. 13, pp. 42-43.

336
 Ação do cloranfenicol em bactérias presente no mosto
Milca Ribeiro de Brito do Carmo 1; Geisa Alves da Silva2*; Elvio Mora Júnior2; Thais Domingues da
Silva2; Maria do Socorro Mascarenhas Santos3; Margareth Batistote4

1
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, Tecnologia em Produção Sucroalcooleira.
2
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, Ciências Biológicas. *[email protected]
3
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, Pós-Graduação de Recursos Naturais.
4
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, Docente de Química Industrial.
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
O Brasil possui condições favoráveis e fundamentais capazes de fazer com que o
bioetanol venha a se tornar um dos pilares do mercado nacional de combustíveis
renováveis e o Estado de Mato Grosso do Sul, por possuir condições propicias para o
desenvolvimento da cultura de cana de açúcar vem se tornando um polo agroindustrial
deste segmento. Entretanto, um dos problemas deste processo é a contaminação o que
acarreta problemas no rendimento da produção de etanol pelas leveduras. Neste
contexto, o presente estudo visa avaliar os parâmetros químicos do mosto e realizar teste
antibiograma em bactérias isoladas deste substrato durante a safra de 2015. As análises
de pH foram realizadas com pHmetro e a condutividade por condutivimetro, ambos de
bancada. Para o teste de antibiograma utilizou-se 1,0mL da cultura bacteriana diluída
em 9,0mL de solução salina (0,85%) estéril utilizando a escala 0,5 de MacFarland e 0,1
mL destas amostras foram adicionadas em placa de Petri no meio sólido Müeller Hinton
e espalhadas com um swab onde foram dispostos discos impregnados com 10μL de
antibiótico cloranfenicol na concentração (0,003 mg mL-1) e incubadas à 37ºC durante
24 horas em estufa. Após o período de incubação, as placas foram retiradas e avaliados
os halos de inibição. Os resultados de pH e condutividade entre os meses de agosto e
outubro diferiram dos demais e no teste de antibiograma cerca de 70% das bactérias se
mostraram ser susceptíveis ao antibiótico cloranfenicol.

Palavras-chave: contaminação; antibiograma; fermentação.

______________________________________________________________________________________________

Action of chloramphenicol in bacteria present in the must

ABSTRACT
Brazil has favorable and fundamental conditions capable of making bioethanol become
one of the pillars of the national market for renewable fuels and the State of Mato
Grosso do Sul, as it has favorable conditions for the development of sugar cane
Becoming an agroindustrial pole of this segment. However, one of the problems of this
process is the contamination, which causes problems in the yield of ethanol production
by the yeasts. In this context, the present study aims to evaluate the chemical parameters
of the must and to perform antibiotic tests on bacteria isolated from this substrate during
the harvest of 2015. The pH analyzes were performed with pHmetro and conductivity
by Condutivimetro both bench. For the antibiogram test 1.0 ml of the bacterial culture
diluted in 9.0 ml of sterile saline solution (0.85%) was used using the 0.5 scale of
MacFarland and 0.1 ml of these samples were added in Petri dish In the Müeller Hinton
solid medium and scattered with a swab where discs were impregnated with 10μL

337
chloramphenicol antibiotics in concentration (0.003 mg mL-1) and incubated at 37ºC for
24 hours in an oven. After the incubation period, the plates were withdrawn and the
inhibition halos were evaluated. The results of pH and conductivity between the months
of August and October differed from the others and in the antibiotic test about 70% of
the bacteria showed to be susceptible to the antibiotic chloramphenicol.

Keywords: contamination; antibiogram; fermentation.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
O etanol brasileiro tem despertado a atenção de países desenvolvidos, por ser
uma fonte de energia renovável e economicamente viável. O Brasil possui condições
favoráveis e fundamentais capazes de fazer com que este biocombustível venha a se
tornar um dos pilares do mercado nacional de combustíveis renováveis (CERQUEIRA
LEITE et al., 2009) e, o Estado de Mato Grosso do Sul, por possuir condições propicias
para o desenvolvimento desta cultura vem se tornando um polo agroindustrial deste
segmento, o sucroenergético.
A produção deste setor está pautada no etanol, no açúcar e mais recente na
cogeração de energia, na qual se mostra autossuficiente. A agroindústria do etanol
apresenta-se como um celeiro de inovações, contudo, ainda possui gargalos, pois
consiste em um processo que não transcorre em condições assépticas, o que leva a
contaminação, que por vezes advém da própria matéria-prima podendo ser oriundas do
transporte e das instalações industriais (CEBALLOS-SCHIAVONE, 2009) que não são
higienizadas e que causam danos ao processo, tais como: consumo de açúcar, formação
de goma, floculação do fermento, inibição e queda da viabilidade das leveduras devido
às toxinas e ácidos orgânicos excretados no meio por bactérias (NOBRE; HORII;
ALCARDE, 2007).
Os principais contaminantes que interferem no processo fermentativo são as
bactérias Gram-positivas dos gêneros Lactobacillus, Bacillus e Leuconostoc, sendo que
Lactobacillus e Bacillus estão sempre presentes na fermentação industrial e dependendo
de sua concentração, comprometem o rendimento do processo fermentativo (NAVES et
al.,2010). Para o controle da contaminação são utilizados antibióticos dentre eles os
mais aplicados nas usinas são a monensina e a penicilina (JAY, 2012).
De acordo com Ibelli (2015) e Ribeiro (2010), o pH é um fator significativo para
as fermentações industriais devido ao controle da contaminação bacteriana que é
considerada como um agente estressante e pode acarretar perdas no rendimento
fermentativo ao seu efeito sobre o crescimento da levedura, taxa de fermentação e

338
formação de subprodutos. Outro fator químico está relacionado com a condutividade,
que conforme Jackson et al. (2008), é um indicativo rápido da presença de elementos no
caldo de cana, em especial o potássio, sódio, cálcio e magnésio, pois quando em
quantidade na solução podem interferir no processo fermentativo.
Neste contexto, este estudo visa avaliar os parâmetros químicos do mosto e
realizar testes antibiograma em bactérias isoladas deste substrato durante a safra de
2015.

MATERIAL E MÉTODOS
Coleta das amostras e análise de pH e condutividade
Foram coletadas amostras de mosto do processo fermentativo entre os meses de
abril a outubro de 2015, e transportados em frascos estéreis à temperatura de 4ºC para o
Laboratório de Microbiologia Ambiental e Industrial – LAMAI da Unidade
Universitária de Glória de Dourados-MS/UEMS. Para a análise do pH, foi retirada
50mL do mosto sendo analisada com o auxílio de um pHmetro e a condutividade por
um condutivimetro.
Isolamento de Bactérias
Para o isolamento das bactérias foi realizada uma diluição seriada de 1x10 -1 a
1x10-6 em solução salina (0,85%) e 100μL de cada diluição foi inoculada em placas de
Petri contendo o meio sólido Müeller Hinton e espalhadas com o auxílio de uma alça de
Drigalski. O plaqueamento foi conduzido em triplicata, incubado em estufa na
temperatura de 37ºC. Para este estudo foi isolada e purificada somente as colônias de
bactérias que apresentaram maior frequência durante a safra 2015.
Teste da Atividade Antimicrobiana
Para o teste antimicrobiano uma colônia do isolado foi crescida em meio líquido
Infusão de Cérebro e Coração (BHI) e incubadas na temperatura de 37ºC por 24 horas.
O teste foi realizado com 1,0mL desta cultura diluída em 9,0mL de solução salina
(0,85%) estéril utilizando a escala 0,5 de MacFarland e 0,1 mL da amostra foi
adicionada em placa de Petri no meio sólido Müeller Hinton e espalhada com uma
swab, sobre as quais foram colocados discos impregnados com 10μL do antibiótico
cloranfenicol na concentração (0,003mg mL-1) sendo incubadas em estufa à 37ºC
durante 24 horas. Após o período de incubação, as placas foram retiradas e avaliados em
relação à formação de halos de inibição.
RESULTADOS E DISCUSSÃO

339
 As amostras de mosto utilizadas neste estudo apresentaram variações quanto aos
parâmetros avaliados, sendo a menor variação de pH 4,9 no mês de abril e a maior no
mês de outubro, 5,8. A menor condutividade elétrica de 6,15 no mês setembro e a maior
7,50 mS/cm a 25°C, no mês de junho (Tabela 1).
A maioria dos microrganismos apresenta uma faixa estreita de pH, na qual
crescimento e formação de produto ocorrem a altas velocidades e desta forma ele é
controlado na maioria das fermentações. Embora haja exceções, bactérias usualmente
crescem no intervalo de pH de 4,0 a 8,0; leveduras de 3,0 a 6,0; e os mofos de 3,0 a 7,0.
O pH relativamente baixo do caldo, oriundo das moendas, favorece as espécies
consideradas acidófilas de gêneros como Leuconostoc e Lactobacillus, por outro lado,
altas temperaturas associadas ao pH favorecem o crescimento de alguns microrganismos
termófilos esporulados (CHERUBIN, 2003).
A análise de condutividade é um indicativo rápido e indireto da presença de íons
no caldo de cana, em especial o potássio, sódio, cálcio e magnésio, pois quando em
solução alteram a condutividade elétrica do meio (JACKSON et al., 2008). A
condutividade elétrica é uma propriedade que depende expressivamente da temperatura.
Devido a isso, os dados de condutividade elétrica devem ser acompanhados da
temperatura na qual foi medida (PINTO, 2007).

Tabela1.Análises físico-químicas do mosto durante os meses da safra/2015.

Mês pH Condutividade (mS/cm a 25ºC)

Abril 4,9 7,48
Maio 5,0 7,45
Junho 5,2 7,50
Julho 5,0 7,45
Agosto 5,8 6,40
Setembro 5,4 6,15
Outubro 5,8 6,25
Fonte: Elaborado pelo autor

Na análise do teste de antibiograma 70% das bactérias isoladas se mostraram

susceptível ao antibiótico cloranfenicol e 30% não apresentaram susceptilidade ao
mesmo (Figura 1). Segundo Singleton and Sainsbury (2006) para um antibiótico ser
efetivo, necessita alcançar seu alvo, matando o microrganismo ou impedindo seu
crescimento e multiplicação, o cloranfenicol, pode inibir a síntese de proteínas

340
consequentemente inibindo a realização das funções básicas do microrganismo
causando sua morte (GUILFOILE and ALCAMO, 2007).

Figura 1. Teste da atividade antimicrobiana causada pelo antibiótico cloranfenicol

meses da safra/2015.

CONCLUSÕES
Nos meses de agosto, setembro e outubro os valores do pH e de condutividade
diferiram dos demais meses.
Em relação ao antibiótico cloranfenicol as bactérias mostraram ser 70%
susceptível a sua ação.

REFERÊNCIAS
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341
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342
Bioestimulação de lodo de esgoto por meio de bagaço de cana-
de-açúcar e borra de café
Mileni N. Souza1; Flávio A. Oliveira2; Carlos E. Levy2; Maria A. Marin-Morales1; Mary Rosa R.
Marchi3; Dânia E. C. Mazzeo1,3*

1
Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, UNESP, Rio Claro. *e-mail: [email protected]
2
Departamento de Patologia Clínica, Faculdade de Ciências Médicas, UNICAMP.
3
Departamento de Química Analítica, Instituto de Química, UNESP, Araraquara.
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Frente à crescente produção de lodo de esgoto (LE) e sua composição rica em matéria
orgânica e nutrientes, tem sido proposta a sua utilização como aditivo agrícola,
possibilitando a redução de custos para sua disposição, a possibilidade de substituição
de fertilizantes sintéticos, além da reciclagem de nutrientes. No entanto, o LE pode
conter substâncias tóxicas, que inviabilizariam o seu uso. Portanto, esse trabalho propôs
o tratamento do LE aeróbio, de origem sanitária, por meio do processo de
biorremediação, utilizando bagaço de cana-de-açúcar e borra de café como agentes
bioestimulantes. A efetividade do processo foi avaliada por meio de bioensaios com
Allium cepa, caracterizando o potencial ecotoxicogenético do LE, nos períodos de 0 e 2
meses de bioestimulação. A identificação dos microrganismos envolvidos no processo
revelou uma variação na composição microbiana entre as amostras, ao longo dos
períodos testados, com predominância de bactérias. Após dois meses, notou-se que a
adição de solo ou solo com bagaço foi eficiente na detoxificação do LE, eliminando
resultados significativos para todos os efeitos encontrados no período inicial. No
entanto, não foi possível observar resultados satisfatórios para a borra, pois mesmo após
dois meses de bioestimulação, os efeitos tóxicos ainda estiveram presentes.

Palavras-chave: Biorremediação; Allium cepa; toxicidade; composição microbiana.

______________________________________________________________________________________________

Biostimulation of sewage sludge by means of sugarcane bagasse and coffee grounds

ABSTRACT
Due to the increasing production of sewage sludge (SS) and its composition rich in
organic matter and nutrients, its use as agricultural additive has been proposed, allowing
the reduction of costs for its disposal, the possibility of replacing synthetic fertilizers,
besides nutrients recycling. However, the SS may contain toxic substances, which
would make it unfeasible. Therefore, this work proposed the treatment of aerobic SS, of
sanitary origin, by means of bioremediation process, using sugarcane bagasse and
coffee grounds as bio-stimulating agents. The effectiveness of the process was evaluated
by means of bioassays with A. cepa, characterizing the ecotoxicogenetic potential of the
SS, in periods of 0 and 2 months of biostimulation. The microbiological identification
involved in the process revealed a variation in the microbial composition of the
samples, during the periods tested, with a predominance of bacteria. After two months,

343
the addition of soil or soil with bagasse proved to be efficient in the detoxification of the
SS, eliminating significant results for all the effects found in the initial period.
However, it was not possible to observe satisfactory results for the coffee grounds, since
even after two months of biostimulation, toxic effects were still present.

Keywords: Bioremediation; Allium cepa; Toxicity; Microbial composition.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
O lodo de esgoto (LE) é um resíduo resultante do processo de tratamento de
efluentes, o qual, por sua produção crescente e possível constituição tóxica, apresenta
um potencial altamente danoso ao ambiente (PATHAK et al. 2009). Contudo, devido
sua alta concentração de matéria orgânica e nutrientes, seu aproveitamento como
fertilizante agrícola é bastante promissor(ÇIFCI et al., 2013).
A biorremediação, por ser uma tecnologia de baixo custo e eficiente na
degradação de substâncias tóxicas, vem sendo proposta para promover a detoxificação
do LE, possibilitando uma aplicação segura deste resíduo em solos agrícolas (MAZZEO
et al., 2015). O aproveitamento de resíduos agroindustriais e domésticos como agentes
estimulantes é bastante interessante, pois possibilita a melhoria da biorremediação sem
acarretar em um aumento nos custos do processo (SELLAMI et al., 2008).
A espécie A. cepa é um dos vegetais mais utilizados para avaliar danos
ecotoxicogenéticos induzidos por contaminantes, além de ser um excelente organismo
testepara avaliação de processos de biorremediação (MIRANDA et al., 2013).
Desse modo, esse trabalho buscou avaliar a efetividade do processo de
biorremediação na redução da toxicidade do LE aeróbio, por meio do bioensaio com A.
cepa. Adicionalmente, pretende-se comparar a eficiência do bagaço de cana-de-açúcar e
da borra de café como agentes bioestimulantes do processo de detoxificação do LE.

MATERIAL E MÉTODOS
Obtenção do lodo de esgoto, agentes bioestimulantes e preparo das amostras
As amostras de LE foram fornecidas pela ETE Praia Azul, responsável pelo
tratamento de esgoto sanitário do bairro Praia Azul, da cidade de Americana – SP. Esta
ETE realiza o processo de tratamento convencional, por lodo ativado, produzindo cerca
de 115m³ de LE aeróbio por mês, com um teor de sólidos em torno de 25%.
Os agentes bioestimulantes empregados neste estudo como descompactantes e
estimulantes do processo de detoxificação do LE foram: a) bagaço de cana-de-açúcar

344
(BAG), adquirido em indústrias sucroalcooleiras, após moagem da cana, seco e triturado
grosseiramente; e b) borra de café (BO), obtida em cafeterias, após preparo da bebida.
A diluição das amostras foi feita com solo (S) coletado no Jardim Experimental
da UNESP - Rio Claro, de textura argilosa e condutividade elétrica de 146,7 µS/cm.
As amostras estudadas foram preparadas em proporções volumétricas, como
segue: LE + S (3:3 – v/v); LE + S + BAG (3:3:1 – v/v/v); LE + S + BO (3:3:1 – v/v/v).
Ensaio de detoxificação das amostras de LE
O estudo foi desenvolvido em escala piloto, acondicionando as amostras,
individualmente, em caixas de aço inox, mantidas no Jardim Experimental, em local
coberto, sob temperatura ambiente. O experimento foi realizado em triplicata. Os
períodos escolhidos para avaliação da biorremediação foram de 0 (T0) e 2 meses (T1).
Após cada período, uma parte das amostras foi coletada para a identificação dos
microrganismos e verificação do seu potencial tóxico, por meio do ensaio de A. cepa.
Caracterização dos microrganismos degradadores
O isolamento dos microrganismos foi realizado seguindo o protocolo descrito
por Mazzeo et al. (2015). A quantificação se deu pela contagem de UFC (Unidade
Formadora de Colônia), referente a 1 g do material original. Os microrganismos foram
identificados por meio do equipamento de automação BD PhoenixTM – Biosciences.
Bioensaio com A. cepa
O ensaio foi realizado em triplicata, com 50 sementes de A. cepa (variedade Baia
Periforme; 2n=16) submetidas à germinação em placas de Petri individuais contendo as
amostras especificadas anteriormente. As placas foram incubadas a 22°C, com
fotoperíodo de 12h, por 7 dias. Após germinação, as sementes germinadas foram
contabilizadas e coletadas. As raízes previamente fixadas foram lavadas com água
destilada, hidrolisadas e submetidas à metodologia de Feulgen, para a confecção de
lâminas com o meristema radicular. Os controles negativo e positivo foram realizados
em água ultra pura e em metilmetano sulfonato a 10 mg/L, respectivamente. No T0,
também foi realizado tratamento controle com o solo puro utilizado para a diluição das
misturas testadas, além do LE puro, para comprovar sua toxicidade inicial.
Para a avaliação da eficiência do processo de biorremediação, foram
considerados os parâmetros: a) índice de germinação; b) citotoxicidade, caracterizada
pelo índice mitótico; c) índice de aberrações cromossômicas (perdas, quebras, pontes,
atrasos e aderências cromossômicas nas diferentes fases da divisão celular) e
anormalidades nucleares (broto nuclear, núcleo lobulado, célula polinucleada); d)

345
presença de MN (micronúcleo). Foram analisadas cerca de 500 células por lâmina,
sendo 15 lâminas para cada tratamento (5 por triplicata), em cada um dos períodos. A
análise estatística foi realizada por meio do teste ANOVA (índice de germinação) e
Mann-Whitney a 0,05 de nível de significância, utilizando o programa BioEstat 5.3.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em relação à caracterização microbiológica, o LE estudado apresentou apenas 2
espécies fúngicas. Dentre as bactérias encontradas, foi possível identificar 3 espécies
pertencentes ao grupo das enterobactérias (Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae,
Klebsiella pneumonia), 4 bacilos não fermentadores (Acinetobacter baumannii,
Alcaligenes faecalis, Pseudomonas putida, Pseudomonas sp) e 2 bactérias gram-
positivas não identificadas. A incorporação de agentes estimulantes ao LE promoveu
um decréscimo do número de espécies de bactérias para o T0. No entanto, esta
diversidade foi reestabelecida após 2 meses. Um efeito contrário foi observado para os
fungos, onde houve um aumento da diversidade para o T0 e uma posterior
predominância de uma única espécie de zigomiceto para o T1. Esses resultados indicam
que os materiais testados podem contribuir para aumento da diversidade microbiana do
LE, possivelmente, por promover uma melhor aeração, além de acréscimo da umidade e
nutrientes nas misturas (PANDEY et al., 2000; KASONGO et al., 2011).
Quanto aos ensaios ecotoxicogenéticos, ao avaliar o índice de germinação, foi
possível observar que, no T0, houve diminuição significativa da germinação para as
amostras de LE e LE+S+BO (Tabela 1). Além disso, a amostra L+S+BO promoveu
inibição do crescimento das radículas, impossibilitando a confecção de lâminas para
análise da citotoxidade, aberrações cromossômicas e nucleares e MN. No entanto, esses
parâmetros foram normalizados após dois meses (T1). Estudos realizados por Martins et
al. (2016) também indicaram uma inibição da germinação de sementes de A. cepa
causada por LE. Esses resultados indicam que o LE pode exercer um efeito prejudicial,
demonstrando que seu uso como fertilizante agrícola não é viável sem que este receba
tratamento de detoxificação prévio.
Nenhum efeito citotóxico significativo foi observado para as amostras, em
ambos os períodos testados. Contudo, todas as amostras analisadas induziram resultados
significativos para aberrações cromossômicas, anormalidades nucleares e MN no T0,
indicando alto potencial de danos celulares à espécie A. cepa (Figura 1). Porém, no T1,
valores significativos foram encontrados apenas para presença de MN para L+S+BO.

346
 Tais resultados indicam que, para os períodos testados, o BAG mostrou-se um material
mais promissor para ser empregado no processo de detoxificação do LE. ANACLETO
et al. (2017) também descreveram o BAG como sendo um agente bioestimulante
eficiente para ser empregado em ensaios de detoxificação de resíduos sólidos.

Tabela 1. Índice de germinação (%) de sementes de A. cepa expostas às diferentes misturas de LE.
Amostra CN CP SOLO LE LE+S+BA LE+S+BO LE+S
82,6 ± 34,0 ± 86,6 ±
T0 80,6 ± 3,78 91,3 ± 2,30 90,0 ± 0.57 36,0 ± 7,21*
3,05 9,84 3,05
74,6 ± 92,0 ±
T1 71,3 ± 2,12 N.A. N.A. 66,0 ± 14,84 83,3 ± 2,12
2,12 0,70
* estatisticamente significativo (p<0,05); N.A.: amostra não avaliada para o período; CN: controle negativo; CP:
controle positivo; LE: lodo de esgoto; S: Solo; BA: bagaço de cana-de-açúcar; BO: borra de café.

Figura 1. Frequência de alterações genotóxicas em A. cepa, induzidas por diferentes misturas de

LE, antes (T0) e após (T1) bioestimulação.A. Presença de aberrações cromossômicas; B. Presença
de micronúcleo. * estatisticamente significativo (p<0,05).

CONCLUSÕES
Neste estudo, as bactérias pareceram atuar como os principais agentes
degradadores. Embora ambos os agentes bioestimulantes tenham contribuído para o
aumento da população microbiana das amostras, em termos toxicológicos, o bagaço de
cana foi mais efetivo por reduzir significativamente a toxicidade do LE.

AGRADECIMENTOS
FAPESP - Processos n° 2016/19604-1; 2014/14123-0.

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348
 Densidades de Enterococcus sp em praia do Litoral Norte
Paulista
Mirella Massonetto1; Vanessa da Costa Andrade2; Wagner FerreiraVilano1; Ana Júlia Fernandes Cardoso
de Oliveira1
1
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Campus do Litoral Paulista
*[email protected]
2
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Campus de Rio Claro
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
A ocupação desordenada nas áreas litorâneas atrelada a precariedade no tratamento de
esgoto local, resulta em um importante impacto ambiental e em um problema de saúde
pública. Devido a isso, as praias recreacionais passaram a ser monitoradas pela
CETESB e qualificadas segundo a densidade de bactérias fecais em suas águas. O
gênero Enterococcus sp é indicador de contaminação fecal por colonizarem o trato
gastrointestinal de mamíferos e ideal no caso de águas salinas e salobras, justamente por
sobreviverem em alta salinidade. O objetivo desse estudo foi monitorar e comparar a
densidade de Enterococcus sp na água e também no sedimento, a fim de se estabelecer
uma comparação entre esses parâmetros. As amostras foram submetidas a Técnica de
Membrana Filtrante, utilizou-se meio seletivo para o gênero em questão e as colônias
foram confirmadas por meio de Enterococcosel caldo. Os resultados revelaram que
assim como a água, o sedimento também encontra-se contaminado, porém com índices
muitos superiores ao aquático na maioria dos meses de coleta e testes estatísticos
demonstraram que essa diferença é significativa. O sedimento oferece nutrientes,
permite a fixação desses microrganismos e retém calor, aumentando suas chances de
sobrevivência; outra questão é o contato dos banhistas com esse sedimento, uma vez
que é na areia seu maior tempo de permanência. Esse contato prolongado pode
desencadear desde dermatites até gastroenterites severas, principalmente no verão, por
isso é tão imprescindível a criação de uma legislação específica para estabelecimento de
padrão qualidade da balneabilidade de uma forma mais completa.

Palavras chave: contaminação, areia, bactéria, praia, balneabilidade

______________________________________________________________________________________________

Enterococcus sp. densities in the beach at São Paulo North Coast

ABSTRACT
The disorderly occupation of coastal regions and the absence of basic sanitation, results
in serious environmental impacts, besides presenting a serious risk to the population.
Contaminated recreational beaches may expose bathers to serious public health risks
(e.g. pathogenic microorganisms). Due to the use of beaches in a recreational way,
CETESB began to qualify them according to the densities of fecal bacteria present in
the water. The genus Enterococcus sp is a bioindicator of fecal contamination by
colonizing the gastrointestinal tract of mammals and ideal in the case of saline and
brackish waters, especially because they survive in high concentrations of salt. The

349
present study aimed to monitor and compare the density of Enterococcus sp. in water
and sediment samples. The Membrane Filtering Technique was used to count bacteria
using mEnterococcus agar for selective growth and Enterococcosel Broth for
confirmation. The results showed that both the water samples as well as the sediment
samples were contaminated. The sediment samples showed higher densities and
significant (p≤0.05) when compared to water. Sediments provide nutrients, fixes
microorganisms and retains heat, increasing your chances of survival. Another issue is
the contact of the bathers with this sediment, since they stay most of the time in the
sand, which exposes them to several pathogens. Based on the results obtained, it is
important to note that the legislation for sediment is a public health problem.

Keywords: contamination,sand, bacteria, beach, bathability

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Áreas costeiras estão altamente impactadas pela ausência de planejamento e falta
de infraestruturas relacionadas ao saneamento básico. Esse grande volume de efluentes
despejado no ambiente marinho torna necessária a avaliação e monitoramento das águas
utilizando padrões físico-químicos e biológicos (Abessa et al., 2012; Kacar et al., 2016).
No Estado de São Paulo, o monitoramento de praias recreacionais é realizado pela
Companhia Ambiental do Estado de São Paulo (CETESB) que segue normas da
Organização Mundial da Saúde (OMS), estabelecendo como parâmetro o índice de
coliformes totais, que abrange a densidade de Escherichia coli e do gênero
Enterococcus, sendo esse último o mais indicado para estudos em águas salinas, pois
suportam salinidades maiores e pH 9,6. Esses organismos são considerados importantes
indicadores de contaminação fecal por dois fatores: são patogênicos e são presentes no
trato gastrointestinal humano (CETESB, 2012; Berg et al., 2013; CETESB, 2013).

O monitoramento das águas é importante para a saúde pública, uma vez que
pode haver transmissão de doenças infecciosas pela exposição direta aos
microrganismos (Solo-Gabriele et al., 2016). Sendo assim, a preocupação com a
qualidade das águas também deve ser estendida aos sedimentos do supralitoral, uma vez
que há maior permanência de banhistas e também possuem características favoráveis a
sobrevivência das bactérias. Entretanto, a legislação no Estado de São Paulo não prevê
parâmetros qualitativos para os sedimentos (Sato et al., 1998; Wheeler et al., 2003;
Hortellani et al., 2008; Pinto et al., 2012 e Andrade et al., 2015).

Assim, o objetivo do presente estudo foi monitorar a densidade de bactérias do

gênero Enterococcus sp em amostras de água e sedimento na praia da Enseada, litoral
350
Norte de São Paulo, a fim de comparar os resultados e verificar se há diferença
significativa entre a contaminação de ambos locais, prevendo outros parâmetros de
qualificação para as praias de uma maneira mais completa.

MATERIAL E MÉTODOS

As amostras foram coletadas em dois pontos: próximo ao costão rochoso (Ponto

1) e outro na porção central (Ponto 2), na Praia da Enseada, localizada na Baía do
Flamengo(S 23° 29' 50,0'’/ W 45º 04' 58,9''), no município de Ubatuba (São
Paulo).Foram coletadas amostras de água do mar a 1 m de profundidade, armazenadas
em frascos estéreis. Amostras de sedimento seco e úmido, foram coletadas com o
auxílio de uma espátula estéril e armazenadas em sacos plásticos estéreis. As amostras
foram mantidas sob refrigeração até seu processamento no Laboratório de
Microbiologia Marinha (UNESP – CLP).

Em frascos estéreis com 180mL de água destilada foi adicionado 20 g de

sedimento e colocados sob agitação por 5 minutos para a remoção das bactérias aderidas
ao sedimento e no caso das amostras de água, houve apenas homogenização.
Posteriormente, foi realizada a Técnica de Membrana Filtrante nos volumes de 10 e
50mL para ambas as amostras (APHA, 2012). Após a filtração, as membranas foram
colocadas em placas Millipore, contendo ágar mEnterococcus e incubadas por 48 horas
a 37ºC ± 1ºC. Colônias com coloração vermelho-amarronzado foram contadas e foram
submetidas a teste de confirmação com Caldo Enterococcosel. As densidades foram
expressas em Unidades Formadoras de Colônia (UFC) por 100 mL para as amostras de
água e, UFC por g para sedimento. Para as análises estatísticas foi utilizado o software
Past, sendo o teste de Levene para verificar a homocedasticidade dos dados, e Kruskal-
Wallis (p ≤ 0.05) para análise de variância.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Segundo os resultados (figura 1) nenhum dos índices de água ficou acima do

previsto pela legislação, não atingindo 1000 UFC ao longo de todo período, no dois
pontos de amostragem, classificando a praia como própria para banho. Diferentemente
dos índices apresentados pelos sedimentos, que estiveram superiores aos da água na
maioria dos meses de coleta; assim como no estudo realizado por Heaney et al.(2014),
não foi a qualidade da água que surpreendeu nos resultados, mas sim o sedimento, por
abrigar uma diversidade maior de microrganismos patogênicos e em uma densidade

351
maior. O mesmo estudo estabeleceu uma relação entre os banhistas doentes e a
balneabilidade, evidenciando um problema não apenas ambiental, mas de saúde pública
e Murray (1990) descreveu que Enterococcus sp é o principal causador de infecções
hospitalares graves por serem resistentes a antibióticos. O sedimento seco apresentou h
picos de densidade, corroborando com os estudos conduzidos por Wheeler et al. (2003)
e de Solo-Gabriele et al. (2016) que evidenciaram o sedimento como excelente local
para sobrevivência desses organismos.

Figura 1: Densidade de Enterococcus sp. no ponto 1 ( próximo ao costão rochoso-

esquerda), e ponto 2 ( região central da praia- direita) referente a água, sedimento
seco e úmido
Houve uma diferença significativa nas densidades de Enterococcus sp. na água
e, principalmente, no sedimento seco entre os dois pontos de coleta (Ponto 1-
p=0,00572; Ponto 2- p = 0,00486).

Apesar de haver estudos que apontem os sedimentos como importante parâmetro

a ser analisado para contribuir na avaliação da balneabilidade das praias, a legislação
Paulista ainda não prevê índices para monitorá-las. Segundo o trabalho de Pinto &
Oliveira (2012) bem como, Whitman et al. (2014), o monitoramento realizado hoje nas
praias, é incompleto, uma vez que estudos que utilizaram o sedimento (seco e úmido)
como parâmetro de comparação para a densidade de Enterococcus revelaram uma
discrepância entre a quantidade desses organismos, cujas concentrações no sedimento
seco eram mais elevadas do que na água do mar.

CONCLUSÃO

A alta densidade de Enterococcus no sedimento e na água revela a importância

de políticas públicas que visem sanar o problema, tratando de maneira adequada o
efluente doméstico, bem como estabelecer metas de curto e médio prazo, como uma
legislação específica para o padrão de qualidade dos sedimentos das praias
recreacionais.

352
REFERÊNCIAS
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354
 Biodegradação em solo cultivado com cana-de-açúcar com
tebutiurom e vinhaça

Mirian Alves de Faria1, Alessandra Baroni Rodrigues Neves1; João Vitor França Pirola1, Paulo Renato
Matos Lopes1*; Ederio Dino Bidoia2

1
Faculdade de Ciências Agrárias e Tecnológicas, UNESP - Universidade Estadual Paulista, Câmpus de
Dracena. Rodovia Comandante João Ribeiro de Barros, km 651, CEP 17900-000, Dracena, Brasil. 2
Instituto de Biociências de Rio Claro, UNESP – Universidade Estadual Paulista, Câmpus de Rio Claro.
*[email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
O tebutiurom é um herbicida largamente utilizado no cultivo de cana-de-açúcar no
território nacional. Nestas lavouras, também há geralmente aplicação de vinhaça como
fertirrigação devido ao seu alto teor de matéria orgânica e nutrientes. O objetivo deste
estudo foi avaliar a biodegradação microbiana em solo de cultivo de cana-de-açúcar
com aplicação de diferentes doses de vinhaça associadas ou não ao tebutiurom. Os
resultados revelaram que a adição de vinhaça promoveu um aumento na produção de
CO2 nas amostras de solo, sugerindo aumento da atividade metabólica da biomassa
microbiana. Por outro lado, a presença do herbicida tebutiurom não influenciou
significativamente na taxa de CO2 evoluído nos sistemas.

Palavras-chave: fertirrigação, herbicida, respirometria, resíduo.

______________________________________________________________________________________________

Biodegradation in soil cultivated with sugarcane with tebuthiurom and vinasse

ABSTRACT
Tebuthiuron is a herbicide widely used in Brazilian sugarcane crops. Also, there is
vinasse application fertigation due to its high content of organic matter and nutrients.
The objective of this study was to evaluate the microbial biodegradation in sugarcane
cultivation soil with different vinasse doses associated or not with tebutiurom. The
results showed that vinasse addition promoted an increase in CO2 production, which
suggested a higher metabolic activity of microbial biomass. On the other hand, the
herbicide tebutiurom did not significantly influence CO2 rates evolved in systems.
Keywords: Fertigation, herbicide, respirometry, residue.

355
INTRODUÇÃO
O tebutiurom (1-(5-tert-butil-1,3,4-tiadiazol-2-il)-1,3-dimetilureia) é um dos
herbicidas mais usados no cultivo da cana-de-açúcar no Estado de São Paulo (Negrisoli
et al., 2005, 2007). É um herbicida seletivo, com ação sistêmica e pertencente ao grupo
químico das ureias substituídas. Sua utilização está relacionada a aplicações em pré-
emergência visando o controle de 25 plantas daninhas na lavoura canavieira e também
em pastagens, sendo absorvido preferencialmente pela raiz (Tomlin, 1994).
Entretanto, o tebutiurom apresenta algumas características de importância
ecológica, como alta persistência no solo, com meia vida de até 15 meses; toxicidade
moderada a extrema (Rodrigues and Almeida, 2011); baixa capacidade sortiva no solo
(Koskinen et al., 1996); e alta solubilidade em água, que apontam para o seu elevado
potencial de lixiviação no solo (Oliveira et al., 2001).
Sabe-se que a vinhaça é um resíduo da produção de álcool que, por seu alto teor
de matéria orgânica e sua riqueza nutricional, tem sido utilizada na fertirrigação da
lavoura de cana-de-açúcar. (Canellas et al., 2003).
Alguns autores observaram que a adição da matéria orgânica tem aumentado a
degradação de várias moléculas, apoiando seus resultados no aumento da atividade e
biomassa microbiana (Costa, 1992; Vroumsia et al., 1996). Outros, porém, observaram
a maior persistência de moléculas em solos com maiores teores de matéria orgânica, que
foi explicado em função da maior adsorção (Luchini, 1987; Gaillardon, 1997). Tais
dados sugerem que a associação entre o herbicida tebutiurom e a vinhaça podem trazer
consequências benéficas à lavoura e ao meio ambiente.
Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a biodegradação microbiana em solo
de cultivo de cana-de-açúcar com aplicação de diferentes doses de tebutiurom em
associação com vinhaça.

MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado na Faculdade de Ciências Agrárias e Tecnológicas
(FCAT) da Universidade Estadual Paulista (UNESP), câmpus de Dracena.
Foram coletados solo de cultivo de cana-de-açúcar e vinhaça na usina Caeté no
município de Paulicéia-SP. As amostras de solo foram coletadas até 30 cm de
profundidade, sendo posteriormente peneiradas, homogeneizadas e acondicionadas em
recipientes plásticos.

356
 O herbicida tebutiurom foi adquirido em estabelecimento comercial em
Dracena-SP (produto comercial Combine® 500SC - Dow AgroSciences Industrial
Ltda).
O delineamento experimental foi fatorial 2x4 (Tabela 1), sendo analisados duas
doses de tebutiurom (TBT – zero e 1,0x), de acordo com a recomendação do fabricante,
e quatro volumes de vinhaça (VV – zero; 0,5x; 1,0x e 2,0X). O volume vinhaça (VV)
referiu-se à dose geralmente utilizada para aplicação na lavoura canavieira, segundo
Lourencetti et al. (2012).

Tabela 1. Composição dos sistemas para análise da biodegradação

Sistemas TBT VV
S1 - -
S2 1,0x -
S3 - 0,5x
S4 1,0x 0,5x
S5 - 1,0x
S6 1,0x 1,0x
S7 - 2,0x
S8 1,0x 2,0x

A análise de biodegradação dos tratamentos foi realizada pelo método

respirométrico de Bartha e Pramer (1965), baseado na Norma Técnica L6.350 da
CETESB (1990) e na NBR 14283 (ABNT, 1999). No entanto, a determinação da
produção de CO2 foi realizada segundo Faria et al. (2013).
Os respirômetros foram montados utilizando potes plásticos em triplicata,
mantidos fechados e incubados a 28 °C. A determinação da atividade microbiana foi
realizada até 91 dias.
Os dados experimentais de produção máxima de CO2 acumulado no período
foram analisados efetuando-se a análise de variância pelo teste de Tukey a 5,0% de
probabilidade para a comparação de médias. Neste caso, foi utilizado o software
Microcal Origin 8.0.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados da produção de CO2 nos sistemas e análise estatística no tempo
final (91 dias) estão apresentados na Figura 1 e Tabela 1, respectivamente.

357
Figura 1. Produção acumulada de CO2 em cada sistema pelo tempo de incubação.

Tabela 2. Análise de variância da produção de CO2 acumulada em 91 dias nos

diferentes sistemas.

Produção de CO2 acumulado

em 91 dias
S1 6644,25±353,83 a
S2 5797,51±808,27 a
S3 9095,35±724,69 b
S4 8665,12±400,27 b
S5 8785,11±779,63 b
S6 10078,08±850,95 b
S7 15526,49±1136,88 c
S8 17159,41±133,72 c
*letras minúsculas representam diferença
significativa das médias entre os tratamentos.
(teste de Tukey a 0,05 de probabilidade)

A adição de vinhaça promoveu um aumento na respiração dos micro-organismos

no solo, sendo que os tratamentos com duas vezes o volume (S7 e S8) obtiveram os
valores mais altos de produção acumulada de CO2. Em contrapartida, quando ausente de
vinhaça (S1 e S2), os índices de CO2 nos respirômetros foram os mais baixos. Esses
resultados sugerem que a adição de matéria orgânica ao solo por meio de vinhaça
promoveu aumento da atividade metabólica da biomassa do solo. Para confirmar se
houve aumento da biomassa microbiana é necessária a realização de testes de contagem
de UFC do solo (Costa, 1992; Vroumsia et al., 1996).
No entanto, deve-se ressaltar que os sistemas com 0,5x VV (S3 e S4) e com 1,0x
VV (S5 e S6) não apresentaram diferença significativa após 91 dias de incubação
(Tabela X).
358
 Pela Figura 1, foi demonstrado que a adição de tebutiurom ao solo não
influenciou significativamente a produção de CO2 nos sistemas. Este fato foi
evidenciado pela ausência de diferença significativa na comparação entre os sistemas
S1-S2, S3-S4, S5-S6 e S7-S8 (Tabela 1).

CONCLUSÕES
Portanto, foi demonstrado que a adição do herbicida tebutiurom não alterou o
metabolismo microbiano no solo. Por outro lado, houve aumento da produção de CO2
na presença de vinhaça, sugerindo aumento da biodegradação. No entanto, é necessária
a realização de testes de ecotoxicidade nas amostras de solo para comprovar o processo
eficiente de biorremediação.

AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Pró-Reitoria de Pesquisa (PROPe/UNESP), às empresas
Usina Caeté (Paulicéia-SP) e Planeta Verde (Lucélia-SP) pela disponibilidade na coleta
das amostras de solo e vinhaça e também ao GAIA (Grupo de Ação de Impactos
Ambientais) da FCAT/UNESP, câmpus de Dracena.

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359
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360
 Metabólitos de Schinus terebinthifolius com potencial
antimicrobiano
Mírian Lobo Sáber;1* Jéssica Aparecida Ribeiro2; Luana das Neves Silva2; Tuany Alcebiades do Santos2

1
Docente da Universidade do Vale do Sapucaí - Curso de Ciências Biológicas.
*e-mail (autor para correspondência): [email protected]
2
Discente da Universidade do Vale do Sapucaí – Curso de Ciências Biológicas.
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Avaliar a ação antimicrobiana dos óleos essenciais e extratos etanólicos da casca e
folhas da planta Schinus terebinthifolius (aroeira vermelha). Foram coletadas casca e
folhas frescas da planta S. terebinthifolius. O material vegetal coletado foi então
separado para a secagem em estufa, para obtenção do óleo essencial através da
destilação por arraste a vapor, e para obtenção do extrato etanólico da planta foram
trituradas as estruturas da planta e após o procedimento, foram introduzidas um volume
de 15 ml de álcool 70% para cada 1g de material vegetal. A técnica utilizada no estudo
foi disco de difusão em ágar Muller-Hinton frente aos microrganismos: Escherichia coli
(ATCC 13048), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Candida parapsilosis (ATCC
20019). O estudo sobre o efeito antimicrobiano dos óleos essenciais da Schinus
terebinthifolius provou uma pequena ação antimicrobiana para E. coli, S. aureus e C.
parapsilosis. Já os extratos etanólicos provaram alta atividade antimicrobiana para todos
os microrganismos testados.

Palavras-chave: Ação antimicrobiana; aroeira vermelha; óleo essencial; extrato

etanólico.
______________________________________________________________________________________________

Schinus terebinthifolius metabolites with antimicrobial potential

ABSTRACT
To evaluate the antimicrobial action of the essential oils and ethanolic extracts of the
bark and leaves of the plant Schinus terebinthifolius (red aroeira). Fresh bark and leaves
were collected from the S. terebinthifolius plant. The collected plant material was then
separated for drying in an oven, to obtain the essential oil by steam distillation, and to
obtain the ethanolic extract of the plant, the plant structures were crushed and after the
procedure, a volume of 15 ml of alcohol 70% for each 1g of plant material. The
technique used in the study was diffusion disc in Muller-Hinton agar against the
microorganisms: Escherichia coli (ATCC 13048), Staphylococcus aureus (ATCC
25923) and Candida parapsilosis (ATCC 20019). The study on the antimicrobial effect
of the essential oils of Schinus terebinthifolius proved antimicrobial little action for E.
coli, S. aureus and C. parapsilosis. On the other hand, the ethanolic extracts proved
high antimicrobial activity for all tested microorganisms.

Keywords: Antimicrobial action; red aroeira; essential oil; ethanol extract.

______________________________________________________________________________________________

361
INTRODUÇÃO
A descoberta dos antimicrobianos foi um grande avanço para a medicina,
reduzindo a morbidade e mortalidade de doenças infecciosas (Aschbacher, 1978). Os
antimicrobianos são substâncias naturais ou sintéticas que atuam sobre microrganismos
inibindo seu crescimento ou causando sua morte (Saez-Llorens, 2000). Estes devem ser
prescritos de forma racional, baseado em diagnósticos concretos. O uso excessivo pode
acarretar a problemas sérios a saúde. (Fiol et al., 2010).
As propriedades antimicrobianas de substâncias presentes em extratos e óleos
essenciais produzidos pelas plantas são reconhecidas há séculos. (Jansen apud Scheffer
and Baerheim, 1987). Os extratos de plantas como óleos essenciais ou extratos com
solventes apresentam substâncias inibidoras de patógenos e além destes serem
inofensivos ao meio ambiente apresentam maior eficácia à ação dos antimicrobianos
sintéticos, pois não liberam resíduos e são totalmente naturais (Bonett et al., 2012).
A Escherichia coli habita no intestino humano, e em alguns casos, podem
causar infecções, causando diarreia ou infecção urinária. Além disso, a presença desses
microrganismos, em elevada concentração nos alimentos, indica uma possível
contaminação fecal (FRANCO, 2002).
O Staphylococcus aureus é um importante patógeno devido à sua virulência,
resistência aos antimicrobianos para várias doenças, incluindo doenças sistêmicas,
infecções cutâneas, infecções oportunistas e intoxicação alimentar (LOWRY, 1998).
O gênero Candida estão cada vez mais comuns em pacientes com sistema
imunológico baixo, estas infecções apresentam um grande custo para os hospitais, pois
aumentam o tempo de internação do paciente, além de causarem elevada mortalidade
(ALANGADEN, 2011; PATTERSON, 2005).
O objetivo deste trabalho foi comparar a ação antimicrobiana do óleo essencial
com o extrato etanólico das diferentes partes da planta Schinus terebinthifolius: casca e
folha. Essa espécie foi escolhida devido à escassez de pesquisas comprovando seu efeito
sobre patógenos.

MATERIAL E MÉTODOS
Folhas e cascas da Schinus terebintifollius foram coletadas e encaminhadas para
o laboratório de botânica da universidade Vale do Sapucaí e seco em estufa a 50°c por
cinco dias. Após a secagem do material vegetal, foram pesadas 100g de cada material
vegetal, trituradas e inseridas em 1 litro de água. A extração do óleo essencial foi feita

362
por arraste à vapor por baixa pressão descrito por Koketsu e Gonçalves (1991). Foi
extraído de 6 kg de folhas, 5 ml de óleo essencial, e de 5kg de cascas, 2ml de óleo
essencial.
Para a obtenção do extrato etanólico, o material vegetal já processado foi
separado em liquidificador até a obtenção de um pó granuloso de cheiro forte.
Utilizando o método e Costa et al, (2014) com algumas modificações, sendo assim, para
cada 1g de planta, adicionamos 15 ml de álcool 70%, sendo utilizados no total 25g da
planta e 375 ml de álcool. A mistura foi feita em frasco à temperatura ambiente, em
agitação durante um período de 7 dias e outro com agitação de 30 dias, para evitar o
contato com a luz, todos os frascos foram tampados e vedados com papel alumínio.
Após os dias de agitação, os extratos etanólicos de Schinus terebinthifolius
foram filtrados em bomba a vácuo e o líquido etanólico foi acondicionado em frasco de
vidro. Para a evaporação do álcool foi utilizado o Rota vaporizador e após esse processo
foram acondicionadas em vidro âmbar levados a estufa durante dois dias.
Os microrganismos utilizados na pesquisa foram cepas de Escherichia coli
(ATCC 13048), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Candida parapsilosis (ATCC
20019). Após o crescimento prévio de 12h, 100µl de cada cepa microbiana foram
depositadas nas placas de petri e com auxílio da alça de Drigalski foi espalhado todo
inoculo pelo meio de crescimento. Em seguida, na técnica do disco difusão, utilizamos
discos de papel filtro Whatman n° 1, onde cada disco foi umedecido com 10µl de óleo
essencial e extratos da Schinus terebintifollius.
Para a placa controle foram inoculados 100µl do inoculo com discos de papel
filtro umedecidos com 10µl de água destilada. Após o procedimento as placas foram
incubadas em estufa a 35°C durante um período de 24 horas. Após a incubação foi
realizada a leitura do resultado obtendo a medida dos halos somando estes na horizontal
e vertical calculando à média.
Para as análises estatísticas foi utilizado o software Assistat (Statistical
Assistance), versão 7.7 beta, criado pelo professor Doutor Francisco de A. S. e Silva, da
Universidade Federal de Campina Grande, através do teste de Tukey.

RESULTADOS
A pesquisa realizada com diferentes partes da S. terebinthifolius demonstrou que
os extratos etanólicos obtiveram maior ação antimicrobiana quando comparada ao óleo
essencial, como pode ser observada na Tab. 1.

363
 Tabela 1 – Média dos halos (cm) obtidos pelos óleos essenciais e extratos etanólicos da
planta S. terebinthifolius frente aos microrganismos E. coli, S. aureus e C. parapsilosis.
ÓLEO ESSENCIAL EXTRATO ETANÓLICO
Folha Casca Folha 7 dias Folha 30 dias Casca 7 dias Casca 30 dias
Microrganismos Média do Média do Média do Média do Média do Média do halo
halo (cm) halo (cm) halo (cm) halo (cm) halo (cm) (cm)
E. coli 0,55 0,50 1,0 1,4 0,52 0,4
S. aureus 0,10 0,20 1,3 1,1 0,6 0,5
C. parapsilosis 0,10 0,10 1,1 1,4 0,50 0,60

Frente aos resultados apresentados na Tab. 1, pode-se verificar que houve

inibição em todos os microrganismos testados com extratos etanólicos e óleo essencial
de Schinus terebinthifolius. Destacando o extrato etanólico da folha como maior
inibidor microbiano, frente aos patógenos Escherichia coli, Staphylococcus aureus e
Candida parapsilosis.

DISCUSSÃO
Segundo Delgado-Adamez et al. (2012), extratos brutos de espécies vegetais
podem muitas vezes apresentar ação antimicrobiana mais efetiva contra patógenos
devido ao sinergismo entre os constituintes bioativos que são extraídos pelo solvente,
uma vez que substâncias isoladas podem alterar suas propriedades na presença de outras
substâncias.
A atividade antimicrobiana de óleos essenciais e extratos de plantas medicinais
tem sido comprovada em muitos estudos realizados em países com flora diversificada
(SILVA et al 2010; CARVALHO 2013), e segundo Degaspari et al. (2004), todas as
partes da Schinus terebintifolius são medicinais e várias dessas propriedades estão
associadas a presença de polifenóis na planta, como apigenina, ácido elágico e
naringina, associados as propriedades antioxidantes.
O presente estudo demonstrou que os microrganismos Escherichia coli,
Staphylococcus aureus e Candida parapsilosis, sofreram ação inibidora frente aos
extratos testados. Estudo semelhante de Guerra et al. (2000) demostrou que extratos de
Schinnus terebinthifolius apresentou inibição bacteriana e fúngica.
Como podemos observar no estudo realizado tanto o óleo essencial quanto o
extrato inibiu o crescimento bacteriano do patógeno Escherichia coli, corroborando com

364
Greatti (2014) que demonstrou que os extratos da folha e o óleo essencial de pimenta-
rosa (Schinus terebintifolius) inibiram o crescimento da Escherichia coli.
Alves et al. (2009) também confirmaram as atividades bacteriostática e
bactericida in vitro da aroeira frente a Streptococcus mitis, Streptococcus sobrinus e
Streptococcus sanguis e Lactobacillus casei, e Gundidza et al. (2009) identificou
atividade antimicrobiana frente à Pseudomonas aeruginosas, Staphylococcus aureus e
E. coli, antifúngica frente à Cândida albicans, Aspergillus niger e Aspergillus flavus e
atividade antioxidantes do óleo essencial das folhas de aroeira em diferentes
concentrações.
Analisando os resultados desta pesquisa podemos perceber que alguns dos
resultados diferem dos demais autores, podendo ser justificado. Gundidza et al. (2009),
cita que as diferenças na composição química de S. terebinthifolius desenvolvendo-se
em diferentes países ou regiões podem justificar as diferenças encontradas quanto as
suas atividades antibacteriana, antifúngica e antioxidante. Justificando os resultados
diferentes de outros estudos.

CONCLUSÃO
A partir deste estudo, é possível concluir que o óleo essencial da casca e folha,
da Schinus terebinthifolius (aroeira vermelha) possui uma pequena atividade
antimicrobiana contra os microrganismos Escherichia coli (ATCC 13048),
Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Candida parapsilosis (ATCC 20019). Já o
extrato etanólico obtido da planta, houve inibição em todos os microrganismos testados.

AGRADECIMENTO
Aos técnicos dos Laboratórios de Biologia da Universidade do Vale do Sapucaí
pelo apoio ao realizar este trabalho, José Donizeti Reis, Hellen Vanessa Pereira e
Eliakim José de Souza Lopes.

REFERÊNCIAS

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365
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366
 Identificação, por desreplicação, de ácidos orgânicos
produzidos por Fusarium oxysporum
Natália Carolina Vieira¹*; Ian Castro-Gamboa¹

1
Instituto de Química – UNESP– Campus de Araraquara *e-mail :[email protected]
______________________________________________________________________________________________
RESUMO
Atualmente os micro-organismos recebem grande atenção por serem fontes de produção
de produtos naturais. Neste contexto, a desreplicação é uma técnica de trabalho que nos
auxilia na identificação de compostos, pertencentes a extratos brutos, sem a necessidade
de isolamento. Nesse trabalho tivemos como foco a técnica CG-EM para identificar
metabólitos produzidos pelo fungo Fusarium oxysporum isolado da rizosfera de Senna
spectabilis. O estudo por CG-EM nos trouxe a possibilidade de identificação de quatro
ácidos orgânicos produzidos por ele com auxílio de bases de dados específicas. O
extrato bruto do fungo foi derivatizado e analisado por CG-EM e, os metabólitos
encontrados tiveram seus índices de retenção comparados com as bases de dados NIST
e GMD. E também foi realizado um estudo dos perfis de fragmentação desses
compostos.

Palavras-chave: Produtos naturais; Senna spectabilis; CG-EM; rizosfera;

______________________________________________________________________
Identification, by dereplication, of organic acids produced by Fusarium oxysporum

ABSTRACT
Currently microorganisms receive great attention because they are sources of production
of natural products. In this context, dereplication is a technique that assists in the
identification of compounds within a crude extract without requiring isolation. In this
work we focused on GC-MS data to identify metabolites produced by Fusarium
oxysporum, a fungus isolated from the rhizosphere of Senna spectabilis. The study by
GC-MS brought us the possibility of identifying four organic acids produced by it with
the aid of specific databases. The crude extract of the fungus was derivatized and
analyzed by GC-MS, and the detected metabolites had their retention indexes compared
to the NIST and GMD databases. A study of the fragmentation pathways obtained for
these compounds was also carried out.

Keywords: Natural products; Senna spectabilis; GC-MS; rhizosphere;

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Os fungos são inseridos dentro da química de produtos naturais como fonte de
produção de metabólitos primários e secundários importantes industrialmente. Mas,
atualmente apenas cerca de 1% dos micro-organismos podem ser estudados devido à
dificuldade de cultivá-los por técnicas laboratoriais. Porém, existem inúmeros
metabólitos biologicamente ativos e eficazes contra diversas doenças, produzidos por

367
micro-organismos capazes de serem cultivados (Newman and Cragg, 2013). Partindo
dessa premissa e, devido à alta atividade biológica evidenciada na planta Senna
spectabilis, principalmente relacionada aos seus alcalóides piperidínicos (Silva et al.
(2010)) surgiu o interesse em estudar micro-organismos relacionados a sua rizosfera de
forma a tentar descobrir alguma relação dos metabólitos produzidos por seus micro-
organismos que expliquem alguma co-relação com a biossíntese desses metabólitos na
planta. Dentre os micro-organismos isolados de sua rizosfera, Fusarium oxysporum foi
um dos fungos em estudo neste trabalho. Ele encontra-se comumente no solo sendo
conhecido por ser patógeno a plantações, causando prejuízos à agricultura (Gordon and
Martyn, 1977). O gênero Fusarium é também capaz de ser patógeno ao ser humano
(Antequera et al.(2015)). Mas apesar de toda sua patogenicidade, espécies de Fusarium
são muito conhecidas por produzirem compostos com atividades biológicas promissoras
(Mahapatra and Banerjee (2012)). Esse contexto torna esse gênero importante como
fonte de estudos, o que nos inspirou a desenvolver e aplicar a desreplicação de seu
extrato. A desreplicação é uma técnica que ajuda a diferenciar, dos extratos de alta
complexidade os compostos já conhecidos daqueles possíveis compostos desconhecidos
e interferentes sem a necessidade de isolamento (Lang et al., 2008). Para tanto, várias
técnicas combinadas de separação e detecção são utilizadas, visando à comparação dos
conjuntos de dados obtidos com bases de dados (Cordell et al., 1996).

MATERIAIS E MÉTODOS
O fungo foi cultivado em meio líquido czapek (previamente autoclavado) e
incubado a 25°C durante 28 dias em modo estático. Após esse período, seu micélio foi
filtrado e o meio aquoso submetido a uma extração líquido-líquido com acetato de etila.
O extrato foi então concentrado em rotaevaporador a pressão reduzida. O extrato bruto
foi derivatizado para sua análise por CG-EM: Metoximação: 5-10mg da amostra foram
solubilizados em 80µl de uma solução de metoxiamina em piridina (20mg/ml)
adicionou-se mais 100µl de piridina e aqueceu-se em banho-maria a 30°C por
90min.Sililação: Na amostra metoximada adicionou-se 200µl de MSTFA e aqueceu-se a
37°C/30min.A amostra foi então filtrada com microfiltro de 0,22µm e transferida para
vial com insert. Para as análises por CG-EM utilizou-se cromatógrafo a gás Shimadzu
QP-2010 com interface com um espectrômetro de massas. A coluna utilizada foi a
EN5MS (30 m x 0,25 µm x 0,25 mm). A temperatura do forno foi: 120 °C (3 min), 3
°C/min, 320 °C (10 min) até 79.67 min. A temperatura do injetor foi 260 °C. Modo de

368
 injeção: splitless/split (Grob). Gás de arraste: hélio. Condições EM: temperatura da
fonte de íons e interface de 250 °C, modo de IE a 70 eV, faixa das massas de m/z 40-
600 u. Utilizou-se o software Shimadzu GCMS solution Ver. 2.61, os índices de
retenção foram calculados pela equação de Van den Dool e Kratz, utilizando um padrão
de hidrocarbonetos analisados nas mesmas condições dos extratos, que em seguida
foram comparados com as bases de dados NIST e GMD.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
A figura 1 mostra o cromatograma de íons totais para o extrato bruto derivatizado
de Fusarium oxysporum. E a tabela 1 mostra as informações dos ácidos orgânicos
identificados. Pode-se observar uma diferença, entre o índice de retenção calculado e os
disponíveis na base de dados, muito pequena, confirmando as estruturas, bem como
seus perfis de fragmentação. As figuras 2-6 ilustram as propostas de fragmentação dos
metabólitos.

Figura 1–Cromatograma de íons totais do extrato bruto do fungo Fusarium oxysporum.

Tabela 1 - Dados CG-EM para o fungo Fusarium oxysporum.

Similaridade
Fragmentos
Tr IR (Literatura) IR (calculado) ΔIR Composto com o software
m/z
(%)
6.336 1314 1304,533 9,466 (1) ácido butanodióico 117; 173; 247 93
(2) ácido p-
15.963 1629 1623,887 5,113 193; 267 91
hidroxibenzóico
117; 201; 285;
29.682 2053 2043,883 9,117 (3) ácido hexadecanóico 90
313
117; 145; 201;
35.491 2248 2241,708 6,292 (4) ácido octadecanóico 84
341
IR: Índice de retenção; Tr: Tempo de retenção.

369
Figura 2–Fragmentogramas dos compostos silidados a) ácido butanodióico,b) ácido p-
hidroxibenzóico, c) ácido hexadecanóico, d) ácido octadecanóico.

Figura 3- Proposta de fragmentação do ácido butanodióico siliado.

Figura 4 - Proposta de fragmentação do ácido p-hidroxibenzóico siliado.

370
 Figura 5 - Proposta de fragmentação do ácido hexadecanóico siliado.

Figura 6 - Proposta de fragmentação do ácido octadecanóico siliado.

CONCLUSÕES
Técnicas acopladas como CG-EM associadas a bases de dados são capazes de nos
ajudar a identificar metabólitos em uma matriz complexa sem a necessidade prévia de
isolamento, como sugere a técnica de desreplicação. Porém o grande desafio do estudo
por desreplicação em extrato de micro-organismos são as bases de dados que ainda não
contemplam informações suficientes sobre metabólitos relacionados a essas fontes.

371
Essas bases acomodam, em sua grande maioria, metabólitos de plantas, sendo esse o
grande desafio a vencer para o estudo de micro-organismos.

REFERÊNCIAS

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1996. The dereplication of plant – derived natural products. Studies in Natural Products
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CAVALHEIRO, A. J.; BOLZANI, V. da S.; PIVATTO, M.; YOUNG, M. C. M.;
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Espectalina, cassina e análogos semissintéticos como potenciais candidatos a fármacos
para o tratamento da doença de Alzheimer. Revista Virtual de Química, vol. 2, no. 1, pp.
38-46. http://dx.doi.org/10.5935/1984-6835.20100005

372
 Ação da temperatura durante o processo fermentativo
Nislene Pires dos Santos1, Margareth Batistote2
1
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, Pós-Graduação de Recursos Naturais.*[email protected]
2
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, Docente de Química Industrial.
__________________________________________________________________________________________

RESUMO
A produção do etanol no Brasil é derivada de tecnologias de primeira geração, onde a
sacarose extraída da cana de açúcar é fermentada por leveduras para produção de etanol.
Este estudo visou avaliar a capacidade fermentativa e a produção de bioetanol de
leveduras industriais em diferentes temperaturas. Foi utilizado o meio YPD esterilizados
como pré-inoculo a 30°C por 10 horas. Após o crescimento foi feito a recuperação da
biomassa por centrifugação, a qual foi utilizada nos os ensaios fermentativos que foram
realizados em mosto e incubados nas temperaturas de 30 e 40°C, alíquotas foram
retiradas para análise dos parâmetros fermentativos como viabilidade, biomassa açúcar
residual, e etanol em diferentes tempos de fermentação. A levedura Red Star apresentou
queda da viabilidade e biomassa, quando cultivada a 40°C. Em relação a produção de
etanol a levedura Red Star obteve a maior produção de etanol na temperatura de 40°C,
já a catanduva-1 mostrou ser sensível a ação da temperatura, propiciando uma perda na
capacidade fermentativa.

Palavras-chave: fermentação; mosto; microrganismo

____________________________________________________________________________________________
Temperature action during the fermentation process
ABSTRACT
The Brazil's ethanol is produced by means of first generation technologies that utilize
sucrose extracted from sugarcane fermented by yeast in the process of production. This
study aims was to analyze the fermentative capacity and bioethanol production of
industrial yeasts at different temperatures. Was utilized YPD medium sterilized as pre-
inoculum at 30°C for 10 hours. After the growth, biomass recovery was performed by
centrifugation, which was used in the fermentation tests that were made in must and
incubated at temperatures of 30 and 40°C, and aliquots of this material was used for
obtaining parameters such as viability, biomass, sugar Residual, and ethanol at different
fermentation times. The Red Star yeast presented viability drop and biomass when
grown at 40°C. In relation to ethanol production, the Red Star yeast obtained the highest
ethanol production at 40°C, and Catanduva-1 showed to be sensitive to the temperature
action, leading to a loss in fermentation capacity.

Keywords: fermentation, must; microorganism

INTRODUÇÃO
O etanol é uma fonte de energia renovável que compõe a matriz energética do
Brasil, na qual é o segundo maior produtor de etanol ficando atrás apenas dos Estados
Unidos sendo que acordo com Leite and Leal (2007). A indústria de produção etano e

373
açúcar compõe 2,3% da Produto Interno Bruto (PIB), sendo responsável por gerar 4,5
milhões de empregos no país. Ainda o etanol combustível representa quase 50% do
volume total de combustível consumido por carros (Basso et al., 2011).
A produção do etanol brasileiro é derivada de tecnologias de primeira geração,
onde uma simples fonte de açúcar, proveniente da extração da cana de açúcar, a
sacarose, é fermentada por leveduras como produto primário o etanol (Brow et al.,
2013). Entre diversos microrganismos produtores de etanol destaca Saccharomyces
cerevisiae (Ma and Liu, 2010). No entanto para o sucesso de uma fermentação bem
sucedida garantindo o bom rendimento e um produto de qualidade, faz-se necessário
conhecer o perfil fermentativo das linhagens de leveduras com potencial biotecnológico
para a produção de etanol.
Diante do contexto o estudo visa avaliar o perfil fermentativo de linhagens de
leveduras indústrias cultivada em mosto a base de caldo de cana na concentração de
22ºBrix em diferentes temperaturas, bem como avaliar a produção de biomassa,
viabilidade celular, consumo de açúcar e produção de etanol.

MATERIAL E MÉTODOS
Para o preparo do pré-inoculo, foi utilizado o meio YPD 2%, contendo (1,0%
(m/p-1) de extrato de levedo; 1,0% (m/p-1) de peptona; 2,0% (m/p-1) glicose), com pH
ajustado para 5,0 (ácido clorídrico 1N), esterilizados em autoclave 120ºC por 20
minutos. Para o inoculo utilizou 0,10g de leveduras liofilizadas, Catanduva-1 e Red
Star, os frascos de erlenmeyers contendo as leveduras foram incubados em “shaker” por
10h na temperaturas de 30ºC a 250 rpm. Após o crescimento as células, foram coletadas
centrifugadas a (800g, 20min), ressuspendida e lavadas por três vezes consecutivas em
solução salina (0,85%) estéril, a uma concentração de 10 mg/mL massa úmida.
A fermentação foi realizada em mosto, o qual foi calibrado com o auxílio de um
sacarímetro na concentração de 22°Brix sem correção do pH, em frascos de erlenmeyers
de 125 mL, contendo 50 mL do substrato estéril. A biomassa obtida foi reinoculada no
meio fermentativo e incubada em “Shaker” a 250 rpm nas temperaturas de 30ºC e 40ºC,
em diferentes tempos de fermentação, alíquotas foram retiradas para análise dos
parâmetros fermentativos. As análises do crescimento celular foram realizadas através
de medidas espectrofotométricas a 570nm, correlacionada com curva de calibração. A
determinação da viabilidade celular foi acompanhada através do método de coloração
com azul de metileno (Lee et al.,1981). O Consumo dos açúcares redutores totais (ATR)

374
foi determinado através do método do ácido 3,5 – dinitrosalicílico – DNS (Miller,
1959).
A concentração do etanol foi determinada no cromatógrafo a gás CG 3900 com
detector de ionização de chama (Varian), utilizando uma coluna capilar de sílica fundida
de 30m de comprimento (ZB-5). A condição cromatográfica empregada foi: volume de
injeção 1μL, razão de split 1:20 e temperatura do forno de 90ºC. As temperaturas do
injetore do detector foram de 240ºC. As amostras foram filtradas em ultrafiltra de
0,22μm.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na análise dos parâmetros fermentativos os dados mostraram-se semelhante na
avaliação da viabilidade celular, na qual as leveduras Catanduva-1 e Red Star
apresentaram uma taxa de viabilidade em torno de 85%, para a avaliação da biomassa a
levedura Red Star obteve a maior crescimento de 20 mg/mL no transcorrer do tempo de
25 horas de fermentação, enquanto a Catanduva-1 a apresentou a menor produção de 13
mg/mL no mesmo tempo de fermentação, na temperatura de 30°C (Figura A).
No entanto na temperatura de 40°C as leveduras apresentaram uma cinética de
crescimento diferente. Na qual a Catanduva-1 obteve a maior taxa de viabilidade celular
de 75%, e a linhagem Red Star apresentou uma queda na viabilidade ficando em torno
de 28%. Quanto a produção de biomassa, a levedura Catanduva-1 obteve uma produção
de 15 mg/mL no tempo de 25 horas de fermentação enquanto, entretanto a levedura Red
Star apresentou a maior produção de 16 mg/mL no tempo de 20 horas de fermentação,
porém apresentando uma queda de 12 mg/mL no tempo de 60 horas de fermentação
(Figura B). Os dados mostraram que na temperatura de 30ºC as linhagem estudadas
apresentaram uma performance fermentativa eficiente, no entanto na temperatura de
40ºC, as leveduras apresentaram queda nos parâmetros fermentativos analisados em
destaque para a linhagem Red Star, mostrando ser sensível a alta temperatura.
Estudos realizados por Ramos et al. (2013), utilizando sessenta e seis cepas de
Sacchormyces cerevisiae isoladas de destilaria e de frutas, avaliaram a influência das
temperaturas sobre as leveduras (30°, 37º e 42°C). Os resultados apresentaram dois
grupos de leveduras, um grupo composto por vinte e uma cepas as quais se mostraram
mais resistentes as condições submetidas, e quarenta e cinco cepas de leveduras se
mostraram mais sensível a temperatura mais elevada (42ºC). Segundo Batistote et al.
(2010), as temperatura ideais para a fermentação industrial ocorrem entre a faixa de 30°

375
e 40°C. No entanto as temperaturas elevadas pode acarretar em perda da viabilidade
celular e biomassa, podendo comprometer o rendimento fermentativo.

Figura 1:Avaliação dos parâmetros fermentativos da levedura Catanduva-1, sendo

representados pelos símbolos, abertos (□) viabilidade celular e (○) biomassa e Red Star
fechado (■) viabilidade celular e (●) biomassa, nas temperaturas de 30°C (A) e 40°C
(B), em diferentes tempos de fermentação.

A avaliação da produção de etanol e o consumo de açúcar em diferentes

temperaturas e tempo de fermentação estão apresentados na (tabela 1). Os dados
mostram que a linhagem Red Star cultivada na temperatura de 40ºC apresentou a maior
produção de etanol de 5,0% (v/v) e o menor consumo de açúcar em 40 horas de
fermentação. A Catanduva-1 apresentou uma pequena perda na produção de etanol de
1,0 (v/v) em relação a temperatura de 40ºC mostrando ser mais sensível a ação do
estresse celular nas condições analisadas.
Em resultados apresentados por Moreira et al. (2015), leveduras industriais
cultivadas em mosto a base de caldo de cana nas concentrações de Brix (12º, 15º, 24º e
30º) na temperatura de 30ºC, obtiveram maior produção de etanol na concentração de
15º Brix (8,5% (v/v)). Em nossos estudos, possivelmente o tempo prolongado de
fermentação tenha afetado o rendimento fermentativo das leveduras, levando a uma
queda da produção de etanol.

376
Tabela 1: Valores médios para produção de etanol e consumo de açúcar em mosto a
base de caldo de cana na concentração de 22° Brix em diferentes temperaturas.

Linhagens Tempo de Etanol Açúcar Residual

Fermentação (h) (%) (%)
Temperatura de 30°C
Catanduva-1 20 3,2 33
40 4,5 10
Red Star 20 3,0 40
40 5,0 10
Temperatura de 40°C
Catanduva-1 20 2,8 35
40 3,5 10
Red Star 20 3,0 35
40 5,0 10

CONCLUSÕES
Na avaliação dos parâmetros fermentativos analisados as leveduras apresentaram
semelhança quando cultivada na temperatura de 30°C, no entanto a levedura Red Star
mostrou-se mais sensível quando exposta à temperatura de 40°C, acarretando em perda
de viabilidade, apesar perda dos parâmetros analisados na temperatura de 40°C. A
levedura Red Star obteve da maior produção de etanol nesta temperatura, consumindo
praticamente todo o substrato do meio. A levedura catanduva-1 mostrou ser sensível a
ação da temperatura, propiciando uma perda na capacidade fermentativa, apesar de
apresentar maior resistência à temperatura mais elevada.

REFERÊNCIAS

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377
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378
 Atividade antibacteriana de filmes de gelatina e zeólita
clinoptilolita-Ag
Patricia Hubner1*; Nicoly Donati1; Luci Kelin de Menezes Quines1; Isabel Cristina Tessaro2; Nilson
Romeu Marcilio1
1
Laboratório de Processamento de Resíduos (LPR), Departamento de Engenharia Química (DEQUI),
Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).
2
Laboratório de Separação por Membranas (LASEM), Departamento de Engenharia Química (DEQUI),
Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).
*e-mail (autor para correspondência): [email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Curativos utilizados no tratamento de feridas crônicas e queimaduras devem apresentar
características antimicrobianas. Compostos de prata são utilizados há muito tempo
como antissépticos, mas apresentam alguns problemas relacionados à sua forma de
liberação. A fim de controlar essa liberação, os íons Ag+ podem ser imobilizados em
suportes, como por exemplo, zeólitas naturais, que por sua vez devem estar dispersas
em um filme polimérico. Nesse contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar a
propriedade antibacteriana de filmes produzidos à base de gelatina, adicionados de
zeólitas impregnadas com íons prata. Os filmes foram produzidos por técnica de
casting, com 10 % (m/v) de gelatina, 25 % (v/v) de glicerol e diferentes concentrações
de zeólitas. Então, foi realizado um ensaio antibacteriano de difusão em placas de Petri
com a bactéria Staphylococcus aureus e uma amostra de filme disposta sobre a bactéria
espalhada em ágar PCA, de forma a verificar a atividade antibacteriana dos filmes
produzidos. Os resultados demonstraram que a ação antibacteriana é devida aos íons
prata e que os filmes que contêm concentrações iguais ou superiores a 0,5 % de
clinoptilolita-Ag apresentam atividade antibacteriana. Dessa forma, conclui-se que os
filmes têm potencial para serem utilizados como curativos.

Palavras-chave: filmes, gelatina, glicerol, clinoptilolita, prata.

____________________________________________________________________________________________

Antibacterial activity of gelatin and clinoptilolite-Ag zeolite films

ABSTRACT
Dressings used for wound and burn treatment may present antimicrobial characteristics.
Silver compounds are used for many years as antisseptics, but have some problems
related to its liberation form. In order to control the Ag+ release, ions may be
immobilized into supports, for example, natural zeolites that may be scattered in a
polymeric film. Therefore, this work aim to evaluate the antibacterial property of gelatin
based films that contain zeolites impregnated with silver ions. The films were produced
by casting technique with gelatin 10 % (w/v), glycerol 25 % (v/v) and different zeolite
concentrations. So, it was realized an antibacterial test of Petri plates diffusion with
Staphylococcus aureus bacteria and a film sample was disposed on the scattered
bacteria on the agar PCA surface, aiming to evaluate the antibacterial activity of
produced films. The results demonstrate that the antibacterial action is due to the silver
ions and films containing concentrations equal or higher than clinoptilolite-Ag 0.5 %

379
showed antibacterial activity. Thus, concludes that the films have potential to be used as
dressings.

Keywords: films, gelatin, glycerol, clinoptilolite, silver.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
A utilização de compostos de prata como antissépticos é explorada há muito
tempo, tanto para fins medicinais quanto para aplicação em embalagens, mas emergiu
recentemente como um composto viável para o tratamento de infecções em feridas
abertas, queimaduras e úlceras crônicas (Marx, Barillo 2014; Santos 2014). No entanto,
são encontrados alguns problemas nesses tratamentos, como a dificuldade de controlar a
liberação desses íons, a ocorrência de manchas na pele e a necessidade frequente de
remoção e reaplicação de medicamentos como o creme dermatológico sulfadiazina de
prata, amplamente utilizado em queimaduras suscetíveis a infecções (Barbosa et al.,
2016; Fajardo et al., 2013; Jeong et al., 2014). Devido a essas dificuldades, muitas
pesquisas estão sendo realizadas acerca da utilização de suportes de liberação
controlada da Ag+, tais como partículas porosas e filmes. Dentre esses se destacam as
zeólitas e os filmes de biopolímeros biodegradáveis que atuam como matrizes
poliméricas para essas partículas (Barbosa et al., 2016; Yassue-Cordeiro et al., 2015).
As zeólitas apresentam potencial para serem utilizadas nesse tipo de aplicação,
principalmente em decorrência das suas propriedades, tais como alta porosidade,
estabilidade térmica e química, elevada área superficial e capacidade de troca iônica
(Auerbach, Carrado, Dutta 2003; Luz 1995). A gelatina, por sua vez, é um biopolímero
biodegradável de alta massa molar, obtida através da hidrólise do colágeno, que
apresenta boas propriedades funcionais, baixo custo e é abundantemente disponível
(Keenan 1998; Mark 2013). Por ser uma proteína, a gelatina apresenta vasta diversidade
molecular em sua composição e, em virtude dessa diversidade, pode ocorrer à formação
de diferentes ligações químicas (Mark 2013; Bailey, Paul 1998; Hanani 2016). Além
disso, as suas propriedades, tais como capacidade de formação de gel e filmes,
capacidade de absorção de água e capacidade de emulsificação, são favoráveis para sua
aplicação no desenvolvimento de filmes (Fan, Yang, Yang, Peng, Hu 2016; Taylor,
Djagny, Wang, Xu 2010).
Nesse sentido, o objetivo deste trabalho é avaliar a atividade antimicrobiana de
filmes à base de gelatina, com a adição de zeólitas impregnadas com íons prata para a
liberação controlada de Ag+ diretamente no local de interesse.

380
MATERIAL E MÉTODOS
A preparação dos filmes foi feita hidratando a gelatina na concentração de
10 % (m/v) em água destilada a temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, a
solução foi aquecida a 45 °C e mantida sob agitação a 200 rpm em shaker por
30 minutos, adicionou-se o plastificante glicerol na concentração de 25 % (v/v) e a
solução foi novamente agitada, nas mesmas condições anteriores, por mais 15 minutos
para ocorrência das reações de plastificação. Por fim, foi adicionada a zeólita
clinoptilolita impregnada com aproximadamente 15,5 mgAg+ gzeólita-1 à solução
formadora de filme, nas concentrações de 0,1, 0,5, 1, 3 e 5 % (m/v) (Barbosa et al.,
2016, Santos, 2014, Boschetto, 2009). Além disso, este ensaio antibacteriano foi feito,
também, com um filme contendo 10 % de gelatina e 25 % de glicerol sem zeólitas, e
com um filme contendo 5 % (m/v) de zeólita clinoptilolita não impregnada com íons
prata.
Após a preparação, a suspensão formadora de filme foi disposta em placas de
Petri (d = 9 cm) mantendo uma gramatura constante de 20 gramas (Hosseini et al.,
2015, 2016) e submetida à secagem em estufa de circulação forçada de ar DeLeo A3-
DL-SED (DeLeo Equipamentos Laboratoriais, BR) a 35 ºC por 24 horas (Martucci et
al., 2012). Após a secagem, os filmes foram armazenados em câmara de umidade
controlada contendo solução saturada de nitrato de magnésio.
Para a avaliação da atividade antibacteriana dos filmes, utilizou-se a bactéria
Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e foram suspensas alçadas da bactéria em
solução 0,1 % (m/v) de peptona bacteriológica (BD Biosciences, US). A suspensão
bacteriana foi homogeneizada em vórtex K45-2810 (Kasvi, BR) e 0,1 mL foram
espalhados em placas de Petri contendo ágar PCA (Plate Count Agar, Merck Millipore,
DE) previamente preparado e solidificado. Após a dispersão da solução bacteriana nas
placas com ágar, uma amostra circular com 3 cm de diâmetro de cada um dos filmes
preparados foi colocada no centro de cada placa de Petri e estas foram incubadas em
incubadora BOD (Biochemical Oxygen Demand) Tecnal TE381 (Tecnal Equipamentos
Científicos, BR) a 30 °C por 48 horas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
O ensaio antibacteriano realizado para os filmes de gelatina teve como objetivo
avaliar a quantidade de clinoptilolita-Ag necessária para que o filme apresentasse
atividade antimicrobiana. Assim, as concentrações de zeólita a serem incorporadas aos

381
filmes foram selecionadas de acordo com a literatura, na qual se pode observar que, para
os casos em que os autores utilizaram concentrações de zeólita-Ag em torno de 0,1 ou
0,2 % ocorreu fraca inibição bacteriana ou não ocorreu inibição e ainda, na maioria dos
casos, a inibição passou a ser percebida ao se utilizar concentrações maiores do que
0,5 % de zeólita-Ag (Boschetto 2009; Fernández et al., 2010; Santos 2014).
Na Figura 1 estão apresentadas as imagens dos resultados dos testes
antibacterianos.

Figura 1 – Ensaios antibacterianos para os filmes com 10 % de gelatina, 25 % de glicerol e (a) 0,1 %, (b)
0,5 %, (c) 1 %, (d) 3 %, (e) 5 % de clinoptilolita-Ag, (f) sem zeólita e (g) 5 % de clinoptilolita.

Pode-se perceber que para os filmes sem zeólitas (Figura 1.f), com clinoptilolita
não impregnada com íons Ag+ (Figura 1.g) ou para os filmes com 0,1 % de
clinoptilolita-Ag na sua composição (Figura 1.a), não ocorre a inibição da bactéria
Staphylococcus aureus, pois não é formado um halo de inibição bacteriana e há
crescimento de colônias da bactéria inclusive sob o filme.
Em contrapartida, para as demais concentrações de clinoptilolita-Ag na
formulação do filme (Figura 1.b a Figura 1.e), se percebe a formação de um halo de
inibição em torno do filme, porém, não se percebe um aumento no diâmetro deste halo
com o aumento da concentração de clinoptilolita-Ag na formulação do filme, pelo
contrário, aparentemente os diâmetros são similares. Dessa forma, é possível concluir

382
que a atividade antibacteriana do filme é devida à presença de íons prata na sua
composição e que estes estão sendo liberados da estrutura da zeólita e do filme, agindo
como bactericida e, ainda, percebe-se que a atividade antibacteriana ocorre para
concentrações iguais ou maiores do que 0,5 % de clinoptilolita-Ag na composição do
filme. Entretanto, para as concentrações estudadas, não se observa uma mudança
expressiva no diâmetro do halo formado em torno dos filmes, sendo necessária a
realização de um ensaio antimicrobiano quantitativo para verificar as diferenças entre a
inibição causada por cada uma das concentrações de clinoptilolita-Ag na composição do
filme.

CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos conclui-se que a atividade antibacteriana do
filme é devida à presença de íons prata na sua composição e que estes estão sendo
liberados da estrutura da zeólita e do filme, agindo como bactericida e, ainda, percebe-
se que a atividade antibacteriana ocorre para concentrações iguais ou maiores do que
0,5 % de clinoptilolita-Ag na composição do filme. Os resultados deste estudo
demonstram que os filmes de gelatina com clinoptilolita impregnada com íons prata têm
potencial para serem aplicados como curativos, atuando como agente antibacteriano.

AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (Capes) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq) pelo apoio financeiro para realização deste trabalho.

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384
 Avaliação da atividade β-glicosídica de fungo isolado da
madeira
Rafaela Castro1; Leidilene Andrade1; Isabela Corrêa1; Thamires Durso1; Boutros Sarrouh1,2
1
Federal University of São João del Rei, Department of Chemistry, Biotechnology and Bioprocess
Engineering.
2
Federal University of São João del Rei, Post-graduate Program “Technologies for Sustainable
Development”
*e-mail (autor para correspondência): [email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
A utilização de processos enzimáticos vem se ampliando no mercado industrial devido
ao potencial operacional e sustentável das enzimas. Todavia é necessário a redução do
custo de produção. O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de produção de β-
glicosidases por um fungo filamentoso isolado a partir da casca de madeira, bem como a
caracterização desta enzima frente à variação de condições de pH e temperatura.
Inicialmente, inoculou-se o fungo em meio líquido mineral enriquecido com CMC 2%
(p/v). A atividade β-glicosídica do fungo isolado foi determinada pela técnica de p-
nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (pNPβG) 0,001 M em tampão fosfato-citrato 0,1 M pH
5,0. Para a caracterização da atividade enzimática, foram testados os parâmetros de pH e
temperatura, os quais variaram de 4 a 8 e de 30 a 70°C, respectivamente. Após 4 dias de
cultivo, obteve-se como resultado atividades enzimáticas máximas de 10,1259 ± 0,3797
U/mL e 51,8370 ± 0,8904 U/mL em pH ótimo de 5,0 e temperatura de 60°C,
respectivamente. Conclui-se que o fungo em estudo apresentou um potencial promissor
para a produção da enzima β-glicosidases, a qual possui uma importante aplicação na
produção biotecnológica de etanol 2G.

Palavras-chave: β-glicosidase, atividade enzimática, fungo de podridão branca, etanol

2G

Evaluation of the β-glycosidic activity of fungus isolated from wood.

ABSTRACT
The use of enzymatic processes has been increasing in the industrial market due to the
operational and sustainable potential. However, it is necessary to reduce its cost of
production. The objective of this work was to evaluate the production capacity of β-
glycosidases by a filamentous fungus isolated from the wood bark, as well as the
characterization of this enzyme against the variation of pH and temperature conditions.
Initially, the isolated fungus was inoculated in a mineral liquid medium enriched with
2% (w/v) CMC. The β-glycosidic activity of the isolated fungus was determined by the
0,001 M p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPβG) technique in 0.1 M phosphate-
citrate buffer pH 5.0. For the characterization of the enzymatic activity, the parameters
of pH and temperature were tested, which varied from 4 to 8 and from 30 to 70 ° C,
respectively. After 4 days of cultivation, maximum enzymatic activities of 10,1259 ±

385
0.3797 U / mL and 51.8370 ± 0.8904 U / mL were obtained at optimum pH of 5.0 and
temperature of 60 ° C, respectively. It is concluded that the fungus in study presented a
promising potential for the production of the enzyme β-glycosidases, which has an
important application in the biotechnological production of 2G ethanol.

Keywords: β-glucosidase, enzymatic activity, white rot fungi, ethanol 2G.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
As celulases desempenham papel essencial na hidrólise da ligação β-1,4-
glicosídica da celulose, componente da parede celular das plantas (HENRISSAT, 1991).
Elas são classificadas em três grandes grupos de acordo com seu local de atuação:
endoglucanases; exoglucanases e β-glicosidases (LYND et al., 2002). As β-glicosidases,
cujo nome sistemático é β-glicosídeo gluco-hidrolase (EC 3.2.1.21), hidrolisam
celobiose e oligossacarídeos solúveis com grau de polimerização menor que sete
unidades em glicose (LYND et al., 2002).
Os fungos possuem diversas aplicações biotecnológicas devido a atividade
metabólica dos mesmos, sendo utilizados tanto para a síntese de seus metabólitos
quanto na produção de enzimas que possuem funções degradativas (BENNETT, 1998).
Cepas isoladas de fungos filamentosos são capazes de produzir enzimas que possuem
aplicação na maioria dos processos biotecnológicos (PUNT et al., 2002).

MATERIAL E MÉTODOS
Para o teste em meio líquido utilizou-se erlenmeyers de 150 mL contendo 50 mL
de meio líquido mineral e Carboximetilcelulose (CMC) 2% (p/v). O meio mineral foi
constituído por KH2PO4 0,7%; NaH2PO4 0,4%; MgSO4 0,02%; (NH4)2SO4 0,1% e
extrato de levedura 0,06% (SINGH et al, 2009, modificado), o qual foi autoclavado a
121°C por 15 min. Realizou-se o inóculo em duplicata, retirando-o com o auxílio de
uma espátula, três discos de aproximadamente 1 cm de diâmetro de uma placa de Petri
contendo colônias crescidas do fungo isolado e transferiu-os para os erlenmeyers
contendo o meio mineral. Os frascos foram colocados em um shaker sob temperatura de
28°C e rotação de 180 rpm. Em intervalos de 24 horas durante 11 dias, com auxílio de
uma micropipeta, as amostras foram coletadas e transferidas para micro tubos tipo
Eppendorf ®. Em seguida, as mesmas foram centrifugadas sob rotação de 10.000 rpm
por 20 min. à fim de obter o extrato enzimático bruto.
Para determinar a atividade β-glicolítica foi utilizada a técnica de p-nitrofenil-β-
D-glicopiranosídeo (pNPβG). Inicialmente, adicionou-se 1,2 mL de pNPβG a 0.001M

386
nos tubos de ensaios em um banho-maria a 30°C por 10 min. Em seguida, acrescentou-
se 0,3 mL dos extratos enzimáticos brutos em tampão fosfato-citrato 0,1 M a pH 5,0. Os
tubos foram colocados em banho-maria a 30°C por 30 min. A reação foi interrompida
ao acrescentar 1,5 mL da solução de bicarbonato de sódio 0,5M. Em seguida realizou-se
a leitura a 420 nm em espectrofotômetro (Bioespectro SP 220).
A especificidade da enzima foi estudada frente a diferentes valores de pH entre
4,0 e 8,0, utilizando os tampões fosfato-fosfato a 0,2M. Da mesma forma, avaliou-se a
atividade β-glicolítica nas temperaturas de 30 a 70°C para a sua caracterização. Para
ambos os ensaios utilizou-se os protocolos conforme supracitado alterando apenas as
condições de pH e temperatura nas quais os ensaios foram realizados.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Inicialmente foi construída uma curva padrão que relaciona os valores de
absorbância e de concentração de açucares obtidos, representada pela concentração do
p-nitrophenol liberado após a hidrólise enzimática (Figura 1), considerando que 1
Unidade Internacional (IU) equivale a 1 μmol de p-nitrophenol produzido por minuto.

Figura 1: Curva Padrão de β-glicosidase – Absorbância em função da concentração de

p nitrofenol (g/L).

Os ensaios de atividade enzimática tiveram início pela determinação da atividade

β-glicosídica do fungo isolado. Conforme apresentado na Figura 2, observou-se uma
rápida adaptação do fungo no meio líquido enriquecido com CMC 2% (p/v). Nota-se
que uma atividade β-glicolisídica máxima de 12,9685±0,2357 U/mL foi alcançada após
4 dias de cultivo. A atividade mínima foi de 1,7302±0,3055 após 24 h de cultivo, como
esperado, visto que o fungo se encontrava na fase de adaptação ao meio de crescimento.

387
 Figura 2: Produção da enzima β-glicosidase por fungo isolado a partir da casca de
madeira em função do tempo de cultivo.

Os dados obtidos sob diferentes valores de pH nos ensaios de caracterização da

atividade β-glicolítica estão mostrados na Figura 3.

Figura 3: Efeito do pH na atividade da enzima β-glicosidase produzida no extrato

bruto do fungo.

Segundo os resultados obtidos na Tabela 1 e na Figura 3, percebeu-se que a

enzima β-glicosidase, presente no extrato enzimático, apresentou uma atividade máxima
de 10,1259 ± 0,3797 U/mL em pH ótimo de 5,0. Sendo assim, um decaimento
significativo da atividade enzimática foi observado em valores de pH superiores a 5.
Em relação a temperatura, a a Figura 4 apresenta a variação da atividade
enzimática de β-glicosidase em sob diferentes valores de temperatura.

388
 Figura 4: Efeito da temperatura na atividade β-glicolítica presente no extrato
enzimático bruto do fungo isolado.

De acordo com os resultados obtidos na Tabela 2 e na Figura 4, notou-se que a

enzima β-glicosidase apresentou uma atividade máxima de 51,8370 ± 0,8904 U/mL a
uma temperatura ótima de 60°C.
Segundo Marco (2007), o fungo Trichoderma harzianum isolado da madeira
apresentou uma atividade enzimática máxima em pH 5,0. Da mesma forma, Silva
(2016) obteve uma atividade β-glicosídica máxima a pH 5,0 e temperatura 65ºC,
utilizando o fungo Myceliophthora heterothallica. Almeida (2009) encontrou valores
de pH ótimo para esta enzima na faixa de 4,5 a 5,0 e temperatura ótima de 60 °C para o
fungo Trichoderma versicolor TRAM01.

CONCLUSÕES
O fungo de podridão branca isolado da casca de madeira foi capaz de produzir a
enzima β-glicosidase. Segundo os resultados obtidos, foi observada uma atividade β-
glicolítica máxima de 10,1259 ± 0,3797 U/mL e 51,8370 ± 0,8904 U/mL em pH ótimo
de 5,0 e temperatura ótima de 60°C, respectivamente, após 4 dias de cultivo. Portanto,
através desse estudo pôde-se perceber um promissor potencial na utilização do fungo
isolado em processos biotecnológicos, especialmente na produção de etanol 2G.

REFERÊNCIAS

BENNETT, J.W., 1998. Mycotechnology: the role of fungi in biotechnology. Journal of

biotechnology, Amsterdam, vol. 66, no. 2-3, pp. 101-107.

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Poderosa ferramenta na indústria. Revista Ciência Hoje. vol. 41, no. 242, pp. 28-33.

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HONDEL, C., 2002. Filamentous fungi as cell factories for heterologous protein

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SINGH, R.; VARMA, A. J.; LAXMAN R.S. and RAO, M., 2009. Hydrolysis of

cellulose derived from steam exploded bagasse by Penicillium cellulases: Comparison

with commercial cellulose. Bioresource Technology. no.100, pp.6679–6681.

390
 Produção de xilanase por Fusarium oxysporum utilizando
resíduos agroindustriais
Ryhára Dias Batista1*; Isabella de Moraes Guimarães2; Tallyta Santos Teixeira2; Claudia Cristina Auler
do Amaral Santos2; Alex Fernando de Almeida2

1
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal do
Tocantins, Palmas-TO, *[email protected] (autor para correspondência)
2
Habite – Incubadora de Empresas de Biotecnologia, Universidade Federal do Tocantins, Gurupi-TO,
Rua Badejós, chácaras 69/72, Zona Rural, CEP 77.402-970.

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
As enzimas xilanolíticas são muito utilizadas comercialmente, porém o elevado custo da
produção dificulta a sua aplicação devido o substrato xilano purificado ser
extremamente caro. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um meio de
cultivo utilizando resíduos agroindustriais para a produção de xilanase em condições
submersas. A seleção da melhor fonte de carbono a partir de resíduos agrícolas foi
realizada utilizando tegumento de soja, casca de mandioca, coroa de abacaxi, palha de
milho, casca de arroz, bacaba, bagaço de cevada e sabugo de milho. Os cultivos foram
realizados por 132 h, 30°C e 180 rpm. A palha de milho apresentou a melhor condição
para a produção de xilanase (12,57 U.mL-1). O delineamento Plackett e Burman foi
utilizado para rastrear as fontes de nutrientes importantes do meio para produção de
xilanase. Desta forma, a ureia e o sulfato de magnésio foram selecionadas e utilizadas
em um Delineamento Composto Central Rotacional, alcançando a produção de 26,57
U.mL-1. Assim, a produção de xilanase por Fusarium oxysporum pode ser otimizada
utilizando palha de milho como fonte de carbono, sendo um resíduo de baixo custo e
encontrado em grandes quantidades.

Palavras-chave: Xilanase. Resíduos agroindustriais. Atividade enzimática. Plackett &

Burman. DCCR.
______________________________________________________________________________________________

Xylanase production by Fusarium oxysporum using

agricultural wastes

ABSTRACT
Xylanolytic enzymes are widely used commercially, but the high cost of production
makes your application difficult because the purified xylan substrate is extremely
expensive. In this way, the objective of this study was develop culture medium using
agricultural waste for the production of xylanase under submerged conditions. The
selection of the best carbon source from agricultural waste was carried out using
soybean husk, cassava peel, pineapple crown, corn straw, rice husk, bacaba, barley
bagasse and corncob. The cultures were carried out during 132 h, 30°C and 180 rpm.

391
Corn straw presented the best conditions for xylanase production (12.6 U.mL-1).
Plackett and Burman design was used to screen the important nutrients sources for the
production of xylanase. Thus, urea and magnesium sulphate were selected and used in a
Design Central Composite Rotational, reaching the production of 26.57 U.mL-1. So, the
xylanase production by Fusarium oxysporum can be optimize using corn straw, a low
cost waste found in large quantities.

Keywords: Xylanase. Agricultural waste. Enzymatic activity. Plackett & Burman.

CCRD.
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
A hemicelulose é o segundo maior componente da parede vegetal depois da
celulose. Ela compreende um grupo de polissacarídeos heterogêneos, representando 20-
35% do peso seco total da biomassa. A hidrólise enzimática deste material por enzimas
hemicelulolíticas é a abordagem mais promissora para obter altos rendimentos de
produtos vitais para o sucesso econômico. As enzimas xilanolíticas são capazes de
hidrolisar a hemicelulose e podem ser obtidas por uma grande variedade de
microrganismos, entre os quais os fungos filamentosos se destacam. Um exemplo de
fungo filamentoso muito utilizado é o Fusarium oxysporum (Uday et al., 2015; Prema,
2010).
As xilanases são muito utilizadas comercialmente em processos de bioconversão
de material lignocelulósico ou resíduos agro-industriais, bio-branqueamento na indústria
do papel, melhoria da textura e volume de pão, clarificação de suco e vinho, melhoria
do valor nutricional de estoque de alimentos para animais, extração de óleo vegetal, café
e amido. A sua produção é normalmente realizada por fermentação submersa, devido à
facilidade de controle durante o processo de fermentação aeróbia. Porém, o elevado
custo de produção destas enzimas dificulta a sua aplicação devido o substrato xilano
purificado ser extremamente caro. Uma alternativa para a redução do custo da produção
é possível pela utilização de resíduos agrícolas de baixo custo (Irfan et al., 2015; Uday
et al., 2015). Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a produção de
xilanase por F. oxysporum em diferentes biomassas agroindustriais e estimar a
quantidade de enzimas produzidas a partir da melhor composição química do meio de
cultivo em condições submersas.

MATERIAL E MÉTODOS
A linhagem de F. oxysporum foi isolada a partir de frutos de pequi no
Laboratório de Biotecnologia de Alimentos e Purificação de Bioprodutos, da

392
Incubadora de Empresas de Base Biotecnológica do Campus Universitário de Gurupi,
Universidade Federal do Tocantins/TO, e é mantida em meio ágar sais de Vogel,
contendo farelo de trigo (Vogel, 1956). Os repiques foram realizados periodicamente,
em tubos inclinados e placas de Petri, mantidos a 30 °C durante 7 dias e posteriormente
utilizados ou armazenados a 4ºC.
Os cultivos submersos foram realizados em Erlenmeyers de 125 mL contendo 20
mL de meio suplementar basal proposto por Mandel e Weber (1969) e 1% de biomassa
vegetal como fonte de carbono, tais como: tegumento de soja, casca de mandioca, coroa
de abacaxi, palha de milho, casca de arroz, bacaba, bagaço de cevada e sabugo de
milho. Estas foram previamente moídas em moinhos de facas e peneiradas com
granulação máxima de 1 mm. Após o período de incubação, o caldo fermentado foi
separado da biomassa por filtração em papel de filtro (diâmetro de 12,5 cm) com auxílio
de funil de Buchner, kitassato e bomba de vácuo e posteriormente o caldo fermentado
foi utilizado para análise da atividade xilanolítica.
Foi utilizado o delineamento experimental Plackett & Burman (1946) e as
variáveis independentes testadas foram: concentração de KH2PO4; (NH4)2SO4; Ureia;
MgSO4.7H2O; CaCl2; peptona de carne; Extrato de levedura e Tween-80.
Posteriormente utilizou-se o Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR), onde
as variáveis utilizadas foram Ureia e MgSO4.7H20. Os resultados foram analisados
utilizando software STATISTICA versão 10, cujos valores foram submetidos a análise
variância (ANAVA). OS resultados foram expressos em médias de 3 experimentos
independentes seguidas de desvio padrão e para as médias foram aplicado teste de
Scott-Knott, com nível de 5% de significância através do sistema computacional
ASSISTAT. Os resultados foram apresentados em forma de gráficos e tabelas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Seleção da melhor fonte de carbono para produção da xilanase
A maior produção de xilanase (p<0,05) foi obtida no meio contendo palha de
milho (12,57 U.mL-1), com rendimento igual a 1306,94 U.g-1 e produtividade igual a 2,0
U.g-1.h-1 (Tabela 1).

393
Tabela 1 - Produção de xilanase utilizando diferentes resíduos agroindustriais como
fonte de carbono.

Atividade de xilanase
Fonte de carbono U.ml-1 Yp/s Pp
Tegumento de Soja 0,96d 64,02d 0,10d
Casca de arroz 0,05d 31,50d 0,05d
Bacaba 0,40d 43,27d 0,07d
Casca de mandioca 0,18d 17,96d 0,03d
Sabugo de milho 1,53c 150,90c 0,23c
Bagaço de cevada 2,73c 231,96c 0,35c
Coroa de abacaxi 5,80b 583,63b 0,90b
Palha de milho 12,57a 1306,94ª 2,00a
Incubado por um período de 132 horas, 30 °C e 180 rpm
Letras iguais não se diferenciam pelo teste de Scott-Knott a 5%.
U total: U.ml−1× volume da extração

Plackett & Burman

As variáveis significativas foram a Ureia e MgSO4.7H2O, onde a primeira teve
um efeito positivo, ou seja, o aumento na quantidade dessa fonte de nitrogênio pode
aumentar a produtividade da enzima. Por outro lado, MgSO4.7H2O um efeito negativo,
ou seja, quanto menor for à quantidade do sal usado no meio, melhor será para atividade
enzimática (Figura 1). Desta forma, essas variáveis foram selecionadas para serem
avaliadas em DCCR, e as outras variáveis que não foram significativas no processo
foram mantidas de acordo com o meio basal (Mandel e Weber, 1969).

394
 Curvatura
(3) Ureia
(4) MgSO4.7H2O
(1) KH2PO4
(7) Extrato de levedura
(6) Peptona
(2) (NH4)2SO4
(5) CaCl2
(8) Tween 80
(mg/L)
p=0,05
Figura 1- Gráfico de pareto dos efeitos das variáveis independentes sobre a
variável resposta atividade enzimática xilanase.

DCCR
Na Figura 2, percebe-se que a variável ureia teve efeito negativo, enquanto a
variável MgSO4.7H2O, teve efeito positivo, ou seja, nas menores concentrações de ureia
e maiores concentrações de MgSO4.7H2O, apresentou um ponto ótimo para maiores
produção da enzima xilanase. Tais efeitos foram significativos, ao nível de 5%, na
indução da produção da enzima, sob condições submersas, 30°C a 180 rpm.

Figura 2 - Superfície de resposta para produção de xilanase influenciada pela interação

entre Ureia e MgSO4.7H2O.

395
CONCLUSÕES
No presente trabalho, a palha de milho apresentou-se como um resíduo ideal
para a produção de xilanase utilizando o fungo F. oxysporum, em condições submersas.
A palha de milho é uma fonte de baixo custo, sustentável e encontrada em grandes
quantidades após a colheita do milho. A otimização dos nutrientes do meio de cultivo
pode aumentar a produção de xilanse em 111,4%.

AGRADECIMENTO
Os autores agradecem a Embrapa Agroenergia, Brasília/DF pela identificação do
fungo Fusarium oxysporum utilizada neste estudo.

REFERÊNCIAS
IRFAN, M., et al. Optimization of process parameters for xylanase production by
Bacillus sp. in submerged fermentation. Journal of Radiation Research and
AppliedSciences, p.1-9, 2015.

MANDEL, M.; WEBER, J. The production of cellulases. Advances in Chemistry

Series. v. 95, p. 391- 414, 1969.

PLACKETT, R. L.; BURMAN, J. P. The design of optimum multifactorial

experiments. Biometrika, 33, p. 305-325, 1946.

PREMA, P. Xylanases. In: Pandey, A. et al. Enzyme Technology. New York: Springer,
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UDAY, U. S. P., et al. Classification, mode of action and production strategy of

xylanase and its application for biofuel production from water hyacinth.
International Journal of Biological Macromolecules, p. 1-14, 2015.

VOGEL, H. J. A convenient growth medium for Neurospora crassa (medium N).

Microbiology Genetic Bulletim, v. 13, p. 42–43, 1956.

396
 Detoxificação de lodo de esgoto por meio de bioestimulação

Samantha S. Silveira1; Flávio A. Oliveira2; Carlos E. Levy2; Maria A. Marin-Morales1; Mary Rosa R.
Marchi3; Dânia E. C. Mazzeo1,3*

1
Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, UNESP/Rio Claro. *[email protected]
2
Departamento de Patologia Clínica, Faculdade de Ciências Médicas, UNICAMP.
3
Departamento de Química Analítica, Instituto de Química, UNESP/Araraquara.

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
O lodo de esgoto (LE) é o resíduo final do tratamento de efluentes realizado nas
estações de tratamento de esgoto (ETE). O LE, por conter uma grande quantidade de
matéria orgânica e nutrientes, apresenta um alto potencial agronômico. No entanto, a
ocorrência de substâncias tóxicas pode impedir o seu uso agrícola. Assim, o presente
trabalho teve como objetivo propor uma tecnologia eficiente e de baixo custo para
detoxificar o LE, a fim de reutilizá-lo como fertilizante agrícola. O LE anaeróbio
estudado foi proveniente da ETE Carioba (Americana – SP), a qual trata esgoto
doméstico e industrial por meio de filtro biológico. Como agentes bioestimulante e
descompactante, foram utilizados borra de café e bagaço de cana-de-açúcar. Misturas
contendo solo e LE; solo, LE e borra; solo, LE e bagaço foram biorremediadas por
períodos de 0 e 2 meses. A caracterização dos microrganismos envolvidos no processo
indicaram uma predominância bacteriana e revelaram que os materiais empregados
como bioestimulantes atuaram no aumento da diversidade microbiana. A eficiência do
processo na detoxificação do LE, avaliada por meio de ensaio com Allium cepa,
mostrou que a borra de café foi o único material estudado capaz de reduzir,
significativamente, todos os parâmetros ecotoxicogenéticos avaliados (citotoxicidade e
danos ao DNA). Desse modo, a tecnologia aqui empregada parece ser bastante
satisfatória para a transformação de um resíduo potencialmente tóxico, como o LE, em
aditivo agrícola.

Palavras-chave: Biorremediação, resíduo sólido, Allium cepa, toxicidade, Bacillus sp.

______________________________________________________________________________________________

Detoxification of sewage sludge by means of biostimulation

ABSTRACT

Sewage sludge (SS) is the final residue of effluent treatment carried out at wastewater
treatment plants (WWTP). As SS contains a great amount of organic matter and
nutrients, it presents a high agronomic potential. However, the occurrence of toxic
substances may prevent its agricultural use. Thus, the present work aimed to propose an
efficient and low cost technology to detoxify the SS in order to reuse it as agricultural
fertilizer. The studied SS came from the WWTP Carioba (Americana - SP), which treats
domestic and industrial sewage by means of biological filter. Coffee grounds and
sugarcane bagasse were used as biostimulating and decomposing agents. Mixtures

397
containing soil and SS; Soil, SS and bagasse; Soil, SS and coffee grounds were
bioremediated for periods of 0 and 2 months. The characterization of the
microorganisms involved in the process indicated a bacterial predominance and showed
that the materials used as biostimulants acted increasing the microbial diversity. The
efficiency of the SS detoxification process, evaluated by means of Allium cepa assay,
showed that coffee grounds were the only studied material capable of significantly
reducing all the ecotoxicogenetic parameters evaluated (cytotoxicity and DNA damage).
Thus, the technology employed here appears to be quite satisfactory for the
transformation of a potentially toxic residue, such as SS, in an agricultural additive.

Keywords: Bioremediation, solid waste, Allium cepa, toxicity, Bacillus sp.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
O lodo de esgoto (LE) é o resíduo sólido final gerado a partir do tratamento das
águas residuárias nas Estações de Tratamento de Esgoto (ETEs). Devido à grande parte
de sua composição ser constituída por matéria orgânica e nutrientes, vem sendo
sugerida a sua utilização como fertilizante e recondicionante de solos. No entanto, a
possível presença de contaminantes tóxicos pode impossibilitar seu uso agrícola, frente
aos riscos de contaminaçaõ ambiental, da saúde humana e da biota associada (ROIG et
al., 2012).
Uma opção para detoxificação do LE é a biorremediação, tecnologia de baixo
custo que consiste em utilizar microrganismos para degradar compostos tóxicos
transformando-os em não tóxicos (BAMFORTH and SINGLETON, 2005). A
incorporação de agentes bioestimulantes ao processo de biorremediação tende a
estimular o crescimento da microbiota e, assim, reduzir a carga tóxica em um menor
período de tempo (MAZZEO et al., 2014).
Para avaliar o potencial tóxico do LE, bem como verificar a eficiência do
processo de biorremediação, vem sendo proposto o uso de bioensaios, sendo a espécie
A. cepa muito indicada para essa finalidade (MAZZEO et al., 2015).
Assim, este trabalho propôs o desenvolvimento de uma metodologia eficiente e
de baixo custo, com o emprego de microrganismos, para a detoxificação de LE, por
meio da associação com resíduos agroindustriais (bagaço de cana-de-açúcar) e
doméstico (borra de café). Adicionalmente, a segurança toxicológica do produto final
obtido (aditivo agrícola) foi avaliado por meio do ensaio com o organismo teste Allium
cepa.

398
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta e preparo das amostras
O LE anaeróbio utilizado nesse estudo foi coletado na ETE Carioba, localizada
na cidade de Americana – SP. Esta ETE recebe esgoto sanitário e industrial, tratando-o
por meio de filtros biológicos. O lodo gerado corresponde a cerca de 420 ton/mês, com
teor de sólidos entre 36- 38%.
Como agentes descompactantes e estimulantes do processo de biorremediaçaõ
do LE foram utilizados o bagaço de cana-de-açúcar (BAG) e a borra de café (BO). Para
diluição das amostras foi utilizado solo (S) de textura argilosa coletado no Jardim
Experimental da UNESP, Campus Rio Claro.
Inicialmente, o projeto foi desenvolvido em escala piloto, acondicionando as
amostras em caixas de aço inox (24 cm de largura X 20cm de altura X 30 cm de
comprimento), mantidas no Jardim Experimental da UNESP de Rio Claro, em local
coberto e sob temperatura ambiente. O experimento foi desenvolvido em triplicata.
As amostras estudadas foram preparadas utilizando proporções volumétricas dos
diferentes materiais, como segue: LE+S (3:3 – v/v); LE+S+BAG (3:3:1 – v/v/v); LE
+S+BO (3:3:1 – v/v/v). Essas amostras foram dispostas, individualmente e em triplicata,
em cubas de inox, mantidas em local coberto à temperatura ambiente, por períodos de 0
e 2 meses. Após cada período, uma parte das amostras foi coletada para caracterização
microbiológica e verificação do seu potencial tóxico pelo teste de A. cepa.
Avaliação da toxicidade do LE por meio do organismo teste A. cepa
Para a realização dos bioensaios, cerca de 50 sementes de A. cepa foram
submetidas à germinação em placas de Petri, contendo cada uma das amostras, por um
período de 5 dias a 22C. Após coleta e fixação, as raízes foram submetidas à reação de
de Feulgen, para coloração e posterior preparo das lâminas com a região meristemática
das raízes. Os controles negativo e positivo foram feitos com água ultrapura e
metilmetano sulfonato a 10 mg/L, respectivamente.
Foram analisadas, em microscópio de luz, 5 lâminas de cada amostra, para
cada triplicata, contabilizando 500 células aleatórias por lâmina, totalizando 7500
células por tratamento (15 lâminas/tratamento). Para avaliação do efeito citotóxico foi
contabilizado a quantidade de células em divisão (índice mitótico). A avaliação de danos no
DNA foi quantificado por meio de dois marcadores: presença de anormalidades
cromossômicas e nucleares (como perdas, quebras, pontes e aderências cromossômicas,
broto e ponte nuclear); e micronúcleo (MN).
399
 A análise estatística foi realizada por meio do teste não-paramétrico de Mann
Whitney a 0,05 de nível de significância.
Quantificação e identificação dos microrganismos degradadores
A caracterização microbiológica das amostras foi realizada seguindo o
protocolo proposto por Mazzeo et al. (2015). Após isolamento e quantificação das UFC
(Unidades Formadoras de Colônia), os microrganismos foram identificados pelo
equipamento de automação BD PhoenixTM – Biosciences.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
O LE puro inibiu completamente a germinação das sementes, impedindo a
confecção das lâminas para essa amostra e, consequentemente, a avaliação dos
parâmetros ecotoxicogenéticos. Martins et al. (2016) também observaram resultados
semelhantes em relação à ação inibitória da amostra bruta de LE sobre a germinação de
sementes de A. cepa. No entanto, as misturas testadas não induziram efeitos
significativos na germinação das sementes de A. cepa, indicando que a diluição com
solo ou agentes estimulantes já foi suficiente para eliminar o efeito tóxico do LE.
Em relação ao efeito citotóxico (Figura 1 A), observou-se que a amostra de
S+LE foi a única que induziu efeitos significativos, antes do início do processo de
bioestimulação (T0), o qual foi normalizado no T1.
Quanto à avaliação da indução de danos ao DNA, não foram obtidos resultados
significativos para a presença de micronúcleos em nenhum dos tratamentos e períodos
testados. Contudo, pela análise de aberrações cromossômicas e anormalidades nucleares
(Figura 1 B), foi possível observar que todas as amostras estudadas induziram alterações
em quantidades significativas para o tempo inicial (T0). Após 2 meses de
bioestimulação, resultados significativos continuaram a ser observados para esse mesmo
parâmetro, com exceção da amostra LE+S+BO. Tal fato indica que para o período
estudado de bioestimulação, a borra de café parece ser um agente mais efetivo no
processo de detoxificação do LE do que o bagaço de cana. Estudos realizados por
Christofoletti et al. (2013) também revelaram o potencial do LE não tratado na indução
de aberrações cromossômicas em A. cepa e uma diminuição desse efeito após 30 dias de
biorremediação. Assim, nota-se que embora, inicialmente, o LE caracteriza-se em um
resíduo potencialmente perigoso, após receber tratamento adequado, este pode vir a
constituir um material bastante promissor para fins agrícola.

400
Figura 1. Efeito citotóxico (A) e presença de aberrações cromossômicas e anormalidades nucleares (B)
em células meristemáticas de A. cepa, induzidos por LE, antes (T0) e após bioestimulação (T1).
*Estatisticamente significativo (p< 0,05).

A análise microbiológica do LE anaeróbio estudado mostrou a presença de 8

espécies de bactérias, pertencentes aos grupos das enterobactérias (Escherichia
coli, Morganella morganii, Proteus vulgaris), dos bacilos gram-negativos não
fermentadores (Alcaligenes faecalis, Pseudomonas putida, Shewanella putrefaciens) e
dos bacilos gram-negativos fermentadores, naõ pertencente à famiĺ ia Enterobacteriaceae
(Aeromonas hydrophila, Aeromonas sobria). Apenas 1 espécie de fungo foi encontrada
para essa amostra, classificado por seu aspecto leveduriforme.
A adição de bagaço de cana-de-açúcar e borra de café ao LE favoreceu um
aumento do crescimento de espécies fúngicas após 2 meses de bioestimualção.
Adicionalmente, esses agentes também contribuíram para o aparecimento de bactérias
gram-positivas (Bacillus sp), as quais vem sendo reconhecidas como eficientes
degradadoras de poluentes ambientais (YU et al., 2013; MAZZEO et al., 2015).

CONCLUSÕES
Com a integralização deste trabalho, pode-se observar que o processo de
bioestimulação, com incorporação da borra de café, pode trazer resultados positivos, até
mesmo a curto prazo, em relação à descontaminação do LE, tornando-o um promissor
aditivo agrícola. Embora o bagaço de cana-de-açúcar não tenha apresentado eficiência
na detoxificação do lodo, tanto ele quanto a borra de café favorecem o aumento da
diversidade microbiana das amostras.

REFERÊNCIAS

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402
 Isolamento de microrganismos do sistema digestivo do peixe
Curimbatá
Samille H. Pereira1*; Neusiane Renata Silva1; Luiz Gustavo M. Silva2; Boutros Sarrouh 1,2

1
Federal University of São João del Rei, Department of Chemistry, Biotechnology and Bioprocess
Engineering. *email: [email protected]
Federal University of São João del Rei, Post-graduate Program “Technologies for Sustainable
2

Development”.
___________________________________________________________________________________________

RESUMO
O estudo de microrganismos para obtenção de enzimas de interesse biotecnológico se
torna uma alternativa promissora devido à utilização de diversas fontes energéticas,
apresentando uma grande variedade de vias metabólicas e a capacidade em produzir e
degradar vários compostos orgânicos e inorgânicos. Este trabalho teve por objetivo
isolar microrganismos do sistema digestivo de peixe Curimbatá (Prochilodus lineatus) e
avaliar qualitativamente a expressão das enzimas tanase, celulase e fenoloxidase pelos
mesmos. Foram isoladas 5 cepas de microrganismos, sendo 4 bactérias e uma levedura.
As colônias apresentaram índices enzimáticos (IE) promissores para a produção das
enzimas estudadas. No teste da atividade tanásica a bactéria BE2 mostrou um IE
máximo de 1,6. Por outro lado, a levedura LE1 apresentou um IE máximo de 8,5,
mostrando dessa forma o seu potencial de aplicação em diversos processos
biotecnológicos como, por exemplo, degradação de materiais lignocelulósicos para a
produção de biocombustíveis.

Palavras-chave: enzimas industriais, Prochilodus lineatus, isolamento de

microrganismos, atividade enzimática.
______________________________________________________________________________________________

Isolation of microorganisms from the digestive system of Curimbatá fish

ABSTRACT
The study of microorganisms to obtain enzymes of biotechnological interest is
considered to be a promising alternative due to the use of several energetic sources,
presenting a great variety of metabolic pathways and the capacity to produce and to
degrade several organic and inorganic compounds. The present work aimed to isolate
microorganisms from the Curimbatá fish (Prochilodus lineatus) digestive system and
qualitatively evaluate the expression of the enzymes tanase, cellulase and phenoloxidase
by the same. Five strains of microorganisms were isolated, 4 bacteria and one yeast. The
colonies presented promising enzymatic indexes (IE) for the production of the enzymes
in study. In the test of the tanase activity the bacterium BE2 showed a maximum IE of
1.6. On the other hand, LE1 yeast reached a maximum IE of 8.5, thus showing its
potential for application in several biotechnological processes, such as degradation of
lignocellulosic materials for the production of biofuels.

403
Keywords: Industrial enzymes, Prochilodus lineatus, isolation of microorganisms,
enzymatic activity
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
O Brasil possui um potencial significativo para a piscicultura, devido a sua
grande extensão territorial e a grande quantidade de águas doces (SOUZA et al., 2013).
Os microrganismos isolados de ambientes aquáticos apresentam um alto
potencial biotecnológico, a utilização de enzimas digestivas como catalisadores de
processos industriais é de fundamental importância para a obtenção de produtos de alta
qualidade e de maior valor agregado através da utilização de tecnologias limpas, e em
sintonia com as necessidades tecnológicas, de mercado e de preservação ambiental que
norteiam os processos produtivos internacionais. Os peixes Curimbatás são abundantes
e correspondem a maior parte da biomassa ictiológica de grandes massas de água
(BULLER, 2004; CASTRO, VARI, 2011).
As enzimas apresentam características que se destacam quando comparadas aos
catalizadores químicos devido a sua especificidade pelo substrato ou por uma reação
bioquímica (MONTEIRO, SILVA, 2009).
Este trabalho teve como objetivo o isolamento de microrganismos do sistema
digestivo de peixe Prochilodus lineatus além de avaliar a expressão das enzimas tanase,
celulase e fenoloxidase pelos mesmos.

MATERIAL E MÉTODOS
O trato digestivo do peixe Curimbatá foi conservado em solução salina 0,85%. A
partir desta solução, foram realizadas diluições seriadas decimais. De cada diluição,
retirou-se 100µl e transferiu-se para placas de Petri contendo meio Ágar Nutriente. Em
seguida foi realizado o teste de coloração de Gram para a diferenciação dos
microrganismos isolados.
Para avaliar a atividade enzimática, foi realizado um teste em meio enriquecido
com ácido tânico visando a quantificação da atividade tanasica. Para a avaliação da
atividade celulolítica, os microrganismos isolados foram crescidos em meio enriquecido
com carboximetilcelulose (CMC) 1¨% (p/v). Da mesma forma, foi avaliada a produção
da enzima fenoloxidase pelos microrganismos isolados. Os mesmos foram incubados
em meio ágar malte acrescido de ácido gálico. Após 5 dias de cultivo, mediu-se o
diâmetro dos halos formados em volta das colônias, comprovando dessa forma a ação

404
hidrolíticas das enzimas expressadas. Os índices enzimáticos foram determinados pela
razão entre o diâmetro dos halos formados e o diâmetro das colônias cultivadas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após a etapa de cultivo e isolamento dos microrganismos, foram obtidas
colônias puras de cinco cepas diferentes. Estas foram denominadas com os seguintes
códigos: BI1 (bactéria 1 isolada do intestino), BI2 (bactéria 2 isolada do intestino), BI3
(bactéria 3 isolada do intestino), LE1 (levedura 1 isolada do estômago) e BE2 (bactéria
2 isolada do estômago), conforme observado na Figura 1.

Figura 1. Cepas de microrganimos isolados do intestino e estômago do peixe

Curimbatá

Por meio da coloração de Gram (Figura 2), foi possível dividir as colônias
encontradas em dois grandes grupos, as Gram-positivas e as Gram-negativas. Observou-
se uma heterogeneidade entre as bactérias, visto que duas pertencem às Gram-positivas
(BI1 e BE2) e duas às Gram-negativas (BI2 e BI3). Ao realizar esse teste também foi
possível observar que a colônia de LE1 apresentou-se ser uma levedura, devido à
estrutura morfológica e o tamanho das suas células.

Figura 2. Visualização microscópica da coloração de Gram dos microrganismos

isolados.

405
 Após a incubação das cepas isoladas no meio sintético enriquecido com ácido
tânico foi possível observar a formação de halos de coloração castanha nas colônias
BI1, BI3 e LE1, comprovando a atividade enzimática tanáisca (Figura 3.a). Após a
incubação das cepas isoladas no meio sintético enriquecido com 1% (p/v) de CMC, foi
possível observar a formação de halos de descoloração da solução vermelho congo
0,1% (p/v) pelas colônias de BI1, BI2, BI3, LE1 e BE2, mostrando dessa forma a
expressão da enzima celulase (Figura 3.b). No teste da enzima fenoloxidase, houve
formação de halos de coloração âmbar apenas na cepa LE1 (Figura 3.c).

a b

Figura 3. Linhagens dos microrganismos isolados do intestino e estômago do peixe

Curimbatá após 5 dias de incubação, onde (a) meio sintético enriquecido contendo
ácido tânico , (b) meio sintético enriquecido contendo CMC e (c) meio sintético
contendo ácido gálico.

Os índices enzimáticos calculados nos testes enzimáticos encontram-se

apresentados na Tabela 1. Segundo Lealem e Gashe (1994) para considerar um
microrganismo bom produtor de enzimas extracelulares o seu índice enzimático (IE)
deve ser maior ou igual a 2. No teste da atividade tanásica nenhuma das cepas
apresentou este índice, porém conforme apresentado na Figura 3, a cepa que mostrou
maior IE foi a bactéria BE2 (Tabela 1), apresentando um potencial para produção desta
enzima.

406
Tabela 1. Índices enzimáticos calculados para os microrganismos isoladas do intestino e
estômago do peixe Curimbatá

Atividade Atividade Atividade

Colônias
tanásica celulísica fenoloxidase
BI1 1,5 3,72 -
BI2 - 1,5 -
BI3 1,25 6,25 -
LE1 - 8,5 -
BE2 1,6 6,25 2,8

De acordo os indices enzimaticos (IE) apresentados na Tabela 1, observou-se

que todas as cepas isoladas apresentaram um bom rendimento para produção da enzima
celulase, com destaque para os microrganismos BI3, LE1 e BE2, que foram capazes de
produzir um IE maior que 2,0 (Lealem e Gashe, 1994). A levedura LE1 apresentou um
máximo IE de 8,5, mostrando dessa forma o seu alto potencial para produção dessa
enzima.

CONCLUSÕES
O isolamento de microrganismos a partir de resíduos provenientes da indústria
pesqueira mostrou-se ser uma alternativa sustentável para a produção de enzimas de
interesse biotecnológico. As enzimas estudadas neste trabalho possuem aplicações em
diversos processos biotecnológicos como, por exemplo, degradação de materiais
lignocelulósicos para a produção de biocombustíveis, tratamentos de efluentes, indústria
alimentícia e síntese de compostos químicos de interesse industrial.

REFERÊNCIAS

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407
BULLER, N. B, 2004. Bacteria from fish and other aquatic animals: a practical
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bacterium isolated from fermenting tef (eraglostis tef). Journal of Applied Bacteriology,
vol. 77, no.1, pp. 348-352.

408
 Presença de Candida sp e R. mucilaginosa na Baía Araçá
Sonia Assami Doi1*; Maria Carolina Canali1; Daiane Raquel Polezel1; Ana Julia Fernandes Cardoso de
Oliveira2
1
- Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Aplicada, Instituto de Biociência da UNESP de Rio
Claro, Rio Claro-SP, Brasil. * E-mail: [email protected].
2
- Programa de pós-graduação em Biodiversidade Aquática, Universidade Estadual Paulista (UNESP São
Vicente).
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Este estudo teve como objetivo quantificar quatro espécies de Candida (Candida
albicans, C. tropicalis, C. glabrata e C. krusei) e Rhodotorula mucilaginosa em água e
sedimentos da Baía do Araça e correlacionar suas densidades com os fatores ambientais.
As densidades microbianas nas amostras foram obtidas pela técnica da Membrana
Filtrante. As densidades das leveduras foram mais elevadas no sedimento
comparativamente as obtidas para água. Verificou-se elevada densidade de C. tropicalis
seguido de R. mucilaginosa e C. albicans. Dentre os parâmetros ambientais, a
temperatura apresentou correlação negativa com C. tropicalis e C. krusei diferindo da R.
mucilaginosa que resultou ter correlação positiva. As altas densidades obtidas para estas
leveduras no ambiente podem estar relacionados com descargas de materiais
contaminados e poluídos na região.
Palavra-Chave: levedura, mangue, microrganismo, contaminação.
______________________________________________________________________________________________

Presence of Candida sp and R. mucilaginosa in Araçá Bay

ABSTRACT
This study aimed to quantify the four Candida species (Candida albicans, C. tropicalis,
C. glabrata and C. krusei) and Rhodotorula mucilaginosa in water and sediment of the
Araça Bay and to correlate your density with environmental factors. The microbial
density of the samples were obtained by the of Filter Membrane Technique. The yeast
densities were higher in the sediment compared to those obtained for water. It was
detected a high density of C. tropicalis followed by R. mucilaginosa and C. albicans.
Among the environmental parameters, C. tropicalis and C. krusei presented negative
correlation with a temperature, contrary of R. mucilaginosa that resulted in a positive
correlation. High values of these yeasts without environment may be related to
contaminated and polluted materials in the region.
KEYWORD: yeast, mangrove, microrganism, contamination.
______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
A Baía do Araçá mantém um dos últimos remanescentes de manguezal do litoral
de São Sebastião, abriga alta diversidade biológica e está exposta a diferentes tipos de
ação antrópica como ocupações irregulares, efluentes domésticos, instalação de uma

409
dragagem para o emissário submarino e pela proximidade do Porto de São Sebastião
(Amaral et al., 2010).
As leveduras são microrganismos encontrados tanto em ambientes aquáticos
como terrestres, sendo em sua maioria saprófitas e algumas parasitas oportunistas
(Brandão et al., 2010). A diversidade e sobrevivência das espécies dependem dos
fatores bióticos e abióticos do ambiente (Hagler, 2006).
Espécies de Candida foram observadas em ambientes que recebiam grande
quantidade de esgoto doméstico, provavelmente entraram nos corpos d’água carreados
pela chuva (Brandão et al., 2010). Estas espécies fazem parte da flora normal do trato
alimentar e membranas mucocutâneas de seres humanos, mas também pode causar
doenças como micose superficial ou invasiva (Odds, 1988). C. albicans é a mais
freqüentemente isolada e a principal causa de infecção (Cheng et al., 2012). Espécies
como C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei, C. guillermondii e C. glabrata isoladas
de ambientes aquáticos têm sido descritos como patógenos oportunistas e agentes
etiológicos de candidíase (Brandão et al., 2010).
As espécies de Rhodotorula são de natureza generalizada e pode ser isolada a
partir de uma variedade de fontes, como a água do mar superficial e profundos (Kutty
and Philip, 2008), sedimento (Loureiro et al., 2011) entre outros. R. mucilaginosa foi
descrito como sendo uma espécie comum envolvida em infecções humanas (Arendrup
et al., 2014) e é muito resistente à ambientes extremos (Starmer and Lachance, 2011).
Devido à importância em relação à contaminação ambiental e patogenicidade da
levedura, este trabalho teve como objetivo determinar as densidades de Candida sp e
Rhodotorula mucilaginosa na água e no sedimento da Baía do Araçá, correlacionando-
as com os parâmetros físico-químicos.

MATERIAL E MÉTODOS
Realizou-se análise da presença de quatro espécies de levedura Candida e da
Rhodotorula mucilaginosa da água e sedimento na região entremarés da Baía do Araçá,
em maré alta. Foram realizados 8 coletas em 10 pontos de monitoramento. Dados físico-
químicos temperatura (T°C), salinidade, pH e oxigênio dissolvido (OD) foram
mensurados no local. As águas e os sedimentos superficiais foram coletados e
processados no laboratório de Microbiologia Marinha (MICROMAR) localizado na
UNESP – São Vicente, SP. Amostragem do sedimento foi realizada de acordo com
protocolo de Oliveira and Pinhata (2008).

410
 A determinação da densidade foi utilizada a Técnica de Membrana Filtrante
(APHA, 2005) e incubados em meio de cultura cromogênico HiChrome a 35±2°C por
40-48h. O uso de um meio seletivo e diferencial permitiu a diferenciação em nível de
espécies através da coloração e da morfologia das colônias: Candida albicans, Candida
tropicalis, Candida glabrata e Candida krusei, seguindo protocolo do fabricante.
Dentre as colônias analisadas, as de coloração laranja avermelhadas foram
isoladas em meio PDA (Potato Dextrose Agar). As colônias que mantiveram a
coloração foram realizadas confirmação da espécie através da identificação molecular
no Laboratório de Microbiologia do Centro de Estudos de Insetos Sociais na
UNESP/Rio Claro.
Os resultados das densidades foram expressos como Unidades Formadoras de
Colônias da água em 100 ml (UFC.100 ml-1) e do sedimento 100 g (UFC.100 g-1).
Utilizou-se o programa Past para análise estatística. Foi aplicado o teste não
paramétrico Kruskall-Wallis (p<0,05), Correlação de Spearman entre os parâmetros
ambientais com a densidade das leveduras.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em relação aos parâmetros ambientais, a temperatura média foi de 25,76°C, o
nível de pH mantiveram-se com pouca variação mensurando de 7,26 a 8,53, igualmente
para a salinidade, apresentando média de 26,07. Os valores do OD (mg.L-1) variaram de
4,01 a 6,92 e a salinidade manteve inferior a 30 em todas as amostragens. Estes fatores
físico-químicos corroboram com a sobrevivência, adaptabilidade e estabelecimento dos
microrganismos. Mueller et al. (2007) citaram que a salinidade é um parâmetro que está
diretamente relacionado com a distribuição das espécies de mangue.
A densidade de microrganismos no sedimento foi maior para todas as espécies
analisadas comparado com as encontradas na água. Alta densidade de leveduras é
encontrada em sedimento aquático com a maior parte da população na camada
superficial (Meyers and Ahearn, 1974) do que os presentes na água (Pagnocca et al.,
1989) provavelmente por ocorrer a movimentação ocasionado pela maré e chuva.
Verificou-se que a Candida albicans foi detectado em todas as amostragens,
tanto na água como no sedimento. Apesar da C. krusei não ter sido frequente nas
amostragens, apresentou um pico elevado de contaminação no sedimento em alguns
pontos analisados. A C. glabrata foi a levedura que menos se observou em todo o
trabalho, apresentando a menor densidade entre as leveduras analisadas. Apesar da C.

411
tropicalis não ter sido observada em todas as amostragens, foi a levedura que
apresentou elevada quantidade, tanto na água como no sedimento (1,40x103 UFC 100-1
mL e 2,46x103 UFC.100-1g, respectivamente) (Figura 1).
As colônias isoladas em meio PDA e que mantiveram a coloração laranja
avermelhadas foram identificadas molecularmente como da espécie Rhodotorula
mucilaginosa (KT945095.1).

Figura 1: Valores médios das leveduras analisados na água (UFC 100mL-1) e no

sedimento (UFC 100g-1), e os seus erros padrões. Na água: CAA - Candida albicans;
CKA - C. krusei; CGA - C. glabrata; CTA - C. tropicalis; RmA – Rhodotorula
mucilaginosa. No sedimento: CAS – C. albicans; CKS - C. krusei; CGS - C. glabrata;
CTA - C. tropicalis; RmS – R. mucilaginosa.

Semelhantes resultados foram descritos por Loureiro et al. (2011) que isolou
elevadas quantidades das espécies de C. krusei, C. glabrata além de Rhodotorula sp. no
sedimento do mangue de Barra das Jangadas (PE). Estudos ambientais documentaram a
presença de Rhodotorula sp., Aureobasidium pullulans, Candida krusei na água e
sedimento de lagos e rios da Bacia do Rio Doce no Sudeste do Brasil (Medeiros et al.,
2012).
Hagler et al (1986) referem as leveduras Candida encontradas nos sedimentos de
um estuário do Rio de Janeiro são prevalentes de águas poluídas e esgotos domésticos.
Em outros estudos, C. tropicalis e C. krusei foram as espécies que mais se destacaram
nas comunidades em águas limpas, independente de ser marinho ou dulcícola (Kutty
and Philip, 2008).

412
 Pelo teste de correlação Spearman, C. tropicalis apresentou correlação negativa
para os parâmetros ambientais estudados, sendo que a temperatura foi o que mais
influenciou na densidade (r = -0,47), ao contrário de R. mucilaginosa que foi positiva (r
= 0,47), demonstrando que a temperatura foi o fator que influenciou no resultado deste
trabalho.
Houve diferença significativa (p<0,001) pelo teste Kruskal-Wallis entre as
densidades dos microrganismos estudados e material amostrado. Este trabalho resultou
em altas densidades de Candida tropicalis na água e R. mucilaginosa no sedimento que
podem estar relacionados com a contaminação fecal por fontes humanas e animais
homeotérmicos.

CONCLUSÕES
Apesar da espécie C. albicans ter sido observado em todas as amostragens, C.
tropicalis foi o que apresentou maior densidade em ambos os materiais analisados.
Verificaram-se elevadas densidades de leveduras no sedimento em relação ao
encontrado na água. Existência de altas densidades de levedura da espécie Candida sp e
Rhodotorula mucilaginosa na água e sedimento na região representa um resultado
preocupante pois estas leveduras apresentam patogenicidade e riscos à saúde humana
como para os organismos locais. Necessidade de programa de monitoramento e
legislações ambientais em relação às leveduras.

AGRADECIMENTO
Bolsa: CNPq. Apoio Institucional: MICROMAR/UNESP SV e UNESP RC.

REFERÊNCIAS

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414
 Microbiolização de sementes com bactérias diazotróficas
isoladas de milho
Stevan Ricardo Bordignon1; Camila Kiritani1; Valdionei Giassi1*

1
Centro de Pesquisa Mokiti Okada, filial da Fundação Mokiti Okada, Ipeúna/SP, CEP 13537-000, Brasil.
*
e-mail (autor para correspondência): [email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
O trabalho prospectou cepas de bactérias diazotróficas nativas da cultura do milho e
avaliou o potencial de cada uma como rizobactéria promotora do crescimento de plantas
(RPCP). Foram isoladas sete cepas e caracterizadas pela produção de ácido indolacético
(AIA) e fixação biológica de nitrogênio (FBN). Dentre as cepas, AZM05 foi o maior
produtor de AIA (86,0 µg.mL-1) e AZM04 o maior fixador de Nitrogênio (41,0 µg.mL-
1
). Após, foi realizada a microbiolização de sementes de milho com a associação da
cepa AZM04 com as outras seis. As associações AZM04+AZM06, AZM04+AZM07 e
AZ-Comercial apresentaram os melhores resultados na promoção do crescimento
vegetal.

Palavras-chave: Zea mays, fixação biológica de nitrogênio, AIA, RPCP.

______________________________________________________________________________________________

Seeds microbiolization with diazotroph bacteria isolated from maize

ABSTRACT
It prospected strains of corn crop natives diazotroph bacterias and evaluate its potential
as plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR). Seven strains were isolated and
characterized by IAA production and biological nitrogen fixation (BNF). Among the
strains, AZM05 was the greatest IAA producer (86.0 µg.mL-1) and AZM04 the higher
nitrogen fixer (41.0 µg.mL-1). After, was performed the maize seeds microbiolization
with the association of AZM04 strain with the other six. The AZM04+AZM06,
AZM04+AZM07 associations and AZ-Comercial exhibited the best plant growth
promotion results.

Keywords: Zea mays, biological nitrogen fixation, IAA, PGPR.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO

O milho (Zea mays) é uma gramínea cultivada e comercializada no mundo todo

e alvo de massivos programas de melhoramento produtivo. Todavia, poucos desses
focam em estratégias para a eficiência na absorção de nutrientes, o que beneficiaria
tanto regiões de solos pobres, quanto na redução do uso de fertilizantes (Gilbert, 2016).

415
Se por um lado, o processo de domesticação e melhoramento proporcionou frutos e
sementes maiores, por outro, negligenciou mecanismos que proporcionam a interação
planta-rizobactérias promotoras do crescimento vegetal. Além disso, a transição para
um sistema agrícola provocou a homogeneização microbiológica do solo, impactando
drasticamente em interações benéficas neste ambiente (Pérez-Jaramillo et al., 2016).
Bactérias diazotróficas, como o gênero Azospirillum, são de vida livre e comuns na
rizosfera de cereais e gramíneas, capazes de metabolizar nitrogênio de diversas fontes,
executam sua fixação biológica, além de produzir auxina, influenciando na nutrição e
crescimento vegetal (Steenhoudt e Vanderleyden, 2000).

Competem novas pesquisas para entender melhor e aplicar a associação planta-

rizobactéria. Este trabalho se propôs a prospectar cepas de bactérias diazotróficas
nativas da cultura do milho, caracterizar sua capacidade direta de influenciar o
crescimento das plantas e, via microbiolização, selecionar os melhores isolados para
potenciais usos na agricultura.

MATERIAL E MÉTODOS

Parâmetros in vitro

Prospecção de bactérias diazotróficas. Para a obtenção das cepas bacterianas,

primeiramente, foi coletada a mucilagem de raízes adventícias de milho experimental
ZMG-01 em cultivo orgânico nove semanas após o plantio no Centro de Pesquisa
Mokiti Okada (CPMO), Ipeúna-SP. As bactérias diazotróficas presentes na amostra
foram isolados em meio NFb e purificados a partir de plaqueamentos sucessivos
(Döbereiner et al., 1995).

Produção de AIA. Inicialmente, as cepas foram cultivadas em 50 mL de meio

de cultura Kasvi® Tryptic Soy Broth acrescido de 1 g.L-1 de triptofano. Cada frasco
recebeu 100 µL de suspensão bacteriana (1,0 x 107 células.mL-1) e, mantidas sob
agitação a 150 rpm por 48 h à 28°C. Uma alíquota de 2 mL da cultura foi centrifugada a
4000 rpm por 15 min. Posteriormente, em 1,5 mL do sobrenadante adicionou-se 1,5 mL
de reagente de Salkowski (Patten e Glick, 2002). Após 20 minutos, ocorreu a leitura em
espectrofotômetro a 530 nm para a quantificação do fitormônio (Asghar et al., 2002).
Foi utilizado delineamento inteiramente casualizado, com três repetições por cepa.

416
 Fixação Biológica de Nitrogênio. As cepas isoladas foram cultivadas em tubos
de ensaio 20x 70 mm, com 10 mL de meio de cultura NFb (Döbereiner et al., 1995).
Cada tubo foi inoculado com 100 µL de suspensão (1,0 x 108 células.mL-1). Como
controle, foi utilizado o meio de cultura sem micro-organismos. As culturas foram
incubadas à 28°C por 7 dias (Kuss et al., 2007). A quantificação de nitrogênio procedeu
pelo método semi-micro Kjeldahl (Malavolta et al., 1997). Foi utilizado um
delineamento inteiramente casualizado, com três repetições por cepa.

Parâmetros in vivo

Microbiolização de sementes. Este experimento foi conduzido conforme

metodologia adaptada de Amorim e Melo (2002). Sementes de milho Biomatrix ®
BM3061 foram desinfestadas em solução 0,7 % de hipoclorito de sódio durante 5 min e
lavadas em água deionizada estéril. Após 2 horas à 25°C, as sementes foram imersas em
suspensões de 1,0 x 108 células.mL-1 por 15 min, compostas pela cepa isolada (AZM04)
e associações, compondo os tratamentos. Após 2 horas, foi semeada uma semente por
tubete (150 cm3) contendo substrato composto de solo e areia (1:1). A testemunha
consistiu de sementes desinfestadas e imersas em água deionizada estéril. O controle
positivo (AZ-Comercial) consistiu do uso de produto comercializado à base de
Azospirillum (1,0 x 108 células.mL-1). Vinte dias após o plantio, o diâmetro do caule foi
mensurado com paquímetro digital e as plantas foram secas a 105°C por 24h para
avaliar a massa seca da raiz e da parte aérea. Foi utilizado um delineamento
inteiramente casualizado, com 13 repetições por tratamento.

Todos os dados obtidos foram submetidos à análise da variância ANOVA, sendo

as médias comparadas entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade através
do software estatístico SISVAR (Ferreira, 2000).

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram isoladas sete cepas de bactérias diazotróficas. Dos parâmetros avaliados
in vitro, a produção de Ácido Indol-acético apresentou resultados entre 48 e 86 µg.mL-1
sendo o isolado AZM05 o maior produtor (Tabela 1). As concentrações são maiores que
as apresentadas por Kuss et al. (2007). A fixação biológica de Nitrogênio ocorreu em
todas as cepas e as que mostraram melhor desempenho foram AZM04 e AZM03 com
41,06 e 37,80 µg.mL-1, respectivamente. Valores semelhantes foram expostos por Kuss

417
et al. (2007). Os resultados demonstram a capacidade dos isolados em promover o
crescimento vegetal, pois essas características influenciam diretamente na nutrição e
fisiologia da planta (Glick, 2012).

Tabela 1 – Caracterização das cepas pela produção de AIA e fixação biológica de Nitrogênio
(N).
Linhagem AIA (µg.mL-1) N (µg.mL-1)
AZM05 86,08 a1 13,06 b1,2
AZM04 74,28 b 41,06 a
AZM01 74,24 b 29,86 a
AZM02 59,45 c 25,66 a
AZM06 58,12 c 17,26 b
AZM03 53,81 c 37,80 a
AZM07 48,03 c 17,73 b
Controle 0,17 d 9,80 b
CV (%) 9,63 18,85
1
Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de
probabilidade. 2Dados transformados (X^0,5).

A fim de avaliar a promoção do crescimento vegetal in vivo, foi realizada a

microbiolização das sementes de milho combinando a cepa AZM04 com as outras seis
cepas isoladas, no intuito de encontrar associação benéfica que pudesse favorecer o
crescimento da cultura do milho. Selecionou-se a linhagem AZM04 por apresentar os
melhores resultados in vitro na biofixação de nitrogênio e relativamente boa produção
de AIA. Com os resultados obtidos (Tabela 2), verificou-se que as combinações
AZM04+AZM06, AZM04+AZM07 e AZ-Comercial proporcionaram aumento
significativo nos três parâmetros avaliados in vivo, quando comparadas ao controle. Os
resultados condizem com a literatura, onde a associação com bactérias diazotróficas
beneficia o crescimento vegetal (Steenhoudt e Vanderleyden, 2000).
As demais combinações proporcionaram maior crescimento vegetal que o
controle, embora não significativo. O fato da baixa promoção de crescimento pode ser
devido a três fatores: por diferentes modos de ação das bactérias envolvidas, por
competição entres as cepas, ou pela combinação entre cepas não ter sido adequada. Se
existisse sinergismo entre as cepas, os resultados possivelmente teriam se mostrado
mais favoráveis ao crescimento da planta, conforme cita Giassi et al. (2016).

418
 Tabela 2 – Massa seca da parte aérea, massa seca da raiz e diâmetro do caule de sementes de
milho BM3061 microbiolizadas com combinações de cepas de bactérias diazotróficas.
Massa Seca Parte Massa Seca Diâmetro do
Tratamentos
Aérea (g) Raiz (g) Caule (cm)
AZM04 + AZM06 0,2391 a1 0,3121 a 4,84 a
AZ-Comercial 0,2196 a 0,2658 a 4,58 a
AZM04 + AZM05 0,2063 a 0,2677 a 4,43 b
AZM04 + AZM07 0,1984 a 0,2855 a 4,66 a
AZM04 + AZM02 0,1858 b 0,2894 a 4,42 b
AZM04 + AZM01 0,1775 b 0,2971 a 4,26 b
AZM04 + AZM03 0,1769 b 0,2806 a 4,23 b
AZM04 0,1699 b 0,2573 a 4,29 b
Controle 0,1633 b 0,2776 a 4,25 b
CV (%) 26,49 16,40 10,00
1
Médias seguidas de mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5%.

CONCLUSÕES
A cepa AZM05 foi a maior produtora de AIA (86,0 µg.mL-1) e AZM04 a maior
fixadora de nitrogênio (41,0 µg.mL-1). As melhores combinações de cepas na promoção
do crescimento de plantas de milho foram AZM04+AZM06, AZM04+AZM07 e AZ-
Comercial. Trabalhos a campo são necessários para comprovar a eficiência dos
mesmos.

AGRADECIMENTO
Ao Centro de Pesquisa Mokiti Okada filial da Fundação Mokiti Okada, pelo
apoio financeiro.

REFERÊNCIAS

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419
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GLICK, B.R. 2012. Plant Growth-Promoting Bacteria: Mechanisms and Applications.
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nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and
ecological aspects. FEMS Microbiology Reviews, vol. 24, no. 4, p. 487-506.

420
 Seleção de fungos filamentosos produtores de celulases e
otimização da produção enzimática

Tarcisio Michael Ferreira Soares de Oliveira1*; Barbhara Mota Marinho1; Vivian

Machado Benassi2.

1
Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri – Campus Janaúba,
Instituto de Engenharia, Ciência e Tecnologia, Janaúba, Minas Gerais, Brasil.
2
Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri – Campus Diamantina,
Instituto de Ciência e Tecnologia, Diamantina, Minas Gerais, Brasil.
*e-mail: [email protected]
______________________________________________________________________

RESUMO
A biomassa lignocelulósica é constituída principalmente por celulose, hemicelulose e
lignina. A conversão da celulose em açúcares passíveis de fermentação é realizada por
enzimas celulolíticas, como: CMCase, Avicelase e FPase. O presente trabalho teve
como objetivo analisar a produção das CMCase, Avicelase e FPase e a ação enzimática
sob a biomassa lignocelulósica, além de definir parâmetros físico-químicos para uma
melhor produção de celulases. Os fungos filamentosos isolados da palha da cana-de-
açúcar proveniente da Usina São judas Tadeu – Sada Bio-Energia (Jaíba-MG) foram
cultivados em meio Khanna modificado, em pH 5, por 4 dias, à 30 ºC, de forma
estacionária, sendo os ensaios enzimáticos realizados para FPase e para a CMCase e
Avicelase. Foram isolados um total de seis fungos: Mucor (3.2TA), Neurospora
(3.3TA), Aspergillus (3.5TA), Mucor (3.4TA), Aspergillus 3.7TA e Mucor (3.8TA) ,
destes apenas três mostraram-se como potenciais produtores das celulases, sendo esses:
Aspergillus (3.7TA), Aspergillus (3.5TA) e Neurospora (3.3TA),. Observou-se que o
Aspergillus (3.7TA) apresentou melhor produção celulolítica no meio CP associado
com sais Welson, empregando o extrato de levedura e o farelo de trigo como fonte de
nitrogênio e de carbono, respectivamente, durante sete dias, à 30°C.

Palavras-chave: Enzimas, Aspergillus, CMCase, FPase, Avicelase.

______________________________________________________________________

Selection of filamentous fungi producer of cellulases and optimization of the

enzymatic production

ABSTRACT
The lignocellulosic biomass consists mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. The
conversion of cellulose into sugars susceptible to fermentation is performed by
cellulolytic enzymes, such as: CMCase, Avicelase and FPase. The present work aimed
to analyze the production of CMCase, Avicelase and FPase and the enzymatic action
under the lignocellulosic biomass, in addition to defining physicochemical parameters
for a better production of cellulases. The filamentous fungi isolated from sugarcane
straw from the São Judas Tadeu-Sada Bio-Energia (Jaíba-MG) plant were grown in
modified Khanna medium at pH 5 for 4 days at 30ºC in a stationary manner , And

421
enzymatic assays were performed for FPase and for CMCase and Avicelase. A total of
six fungi were isolated: Mucor (3.2TA), Neurospora (3.3TA), Aspergillus (3.5TA),
Mucor (3.4TA), Aspergillus 3.7TA and Mucor (3.8TA), of these only three were
potential Producers of cellulases, such as: Aspergillus (3.7TA), Aspergillus (3.5TA) and
Neurospora (3.3TA). It was observed that Aspergillus (3.7TA) presented better
cellulolytic production in the CP medium associated with Welson salts, using the yeast
extract and wheat bran as nitrogen and carbon source, respectively, for seven days at
30°C.
Keywords: Enzymes, Aspergillus, CMCase, FPase, Avicelase.
______________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
No Brasil a agricultura é a principal atividade econômica, dessa forma observa-
se uma grande quantidade de resíduos e subprodutos agrícolas que porventura não
possuem nenhuma ou pouca aplicação (Pirota et al., 2015). Essa biomassa
ligonocelulósica é considerada material de partida para muitos processos industriais, a
qual é constituída por microfibras de celulose incorporada na matriz de hemicelulose
reticulada e lignina (Baramee et al., 2015).
A celulose caracteriza-se por ser um homopolímero de glicose; enquanto que a
hemicelulose é uma cadeia altamente ramificada de xilose e arabinose, que contém
também glicose, manose e galactose; e a lignina, um polímero amorfo de fenil e
unidades de propanoide (Basso et al., 2010).
Devido à complexidade da biomassa lignocelulolítica, faz-se necessário a ação
de sistemas enzimáticos para degradação desses compostos, tais como as celulases que
consiste em enduglucanases, celobiohidrolases (exoglucanase) e β-glucosidase, que
atuam sinergicamente na conversão da celulose em glicose (Delabona et al., 2016).
Esse trabalho objetivou analisar a produção celulolítica de fungos filamentosos
previamente isolados da palha da cana-de-açúcar proveniente da Usina São judas Tadeu
– Sada Bio-Energia (Jaíba-MG). Bem como, após a padronização do micro-organismo
para estudo, otimizar as condições de cultivo do mesmo para uma maior produção
enzimática.

MATERIAL E MÉTODOS
Determinação dos parâmetros físico-químicos do cultivo do Aspergillus sp. 3.7TA
Analisou-se a produção celulolítica cultivando os fungos filamentosos
previamente isolados da palha da cana-de-açúcar na usina de álcool e açúcar São Judas
Tadeu – SADA Bio-Energia e Agricultura LTDA (Jaíba-MG), em meio de cultura CP

422
(Peixoto et al., 2003), e após a determinação do fungo para desenvolvimento do
trabalho, o mesmo foi cultivado no meio CP com diferentes soluções de sais do meio:
(1) os próprios sais do meio CP (0,03% (m/v) de KH2PO4 e 0,05% (m/v) de
MgSO4.H2O); (2) meio CP sem sais com solução de sais do meio SR modificado (0,3%
(m/v) KH2PO4 e 0,24% (m/v) MgSO4.7H2O); (3) meio CP sem sais com 0,05% (m/v)
de sais Wesson; e (4) sais do meio CP acrescidos de sais Wesson. Os meios foram
mantidos durante quatro dias em estufa bacteriológica, de forma estacionaria, à 30 °C.
Para analisar a influência do tempo de cultivo e da fonte de nitrogênio inoculou-
se Aspergillus sp.TA3.7 em meio submerso CP sem sais, acrescido de 0,05% (m/v) de
sais Wesson, tendo o farelo de trigo como fonte de carbono, utilizando-se (1) 0,8%
(m/v) de extrato de levedura ou (2) 0,8% (m/v) de peptona. Os meios foram mantidos
em estufa bacteriológica, sob condição estática, à 30ºC, durante dez dias, sendo
retirados os meios a cada 24 horas.
Para avaliar a influência de diferentes fontes de carbono, o fungo Aspergillus
sp.3.7TA foi cultivado em meio submerso CP sem sais, acrescido de sais Welson,
contendo extrato de levedura como fonte de nitrogênio, sendo mantidos por seis dias em
estufa bacterológica, à 30ºC. As fontes de carbono (0,375g), avaliadas foram: Farinha
de Chia Fito Alimentos®, Farinha de Linhaça Fito Alimentos®, Farelo de Trigo Fito
Alimentos®, Farelo de Aveia Fito Alimentos®, Farinha de Trigo Integral Fito
Alimentos®, Farinha de Aveia Quaker®, Fubá Sinhá®, Bagaço de cana-de-açúcar,
Farinha de Trigo Vilma®, Farinha de Rosca, Palha da Bananeira, Fibra do Coco e
Extrato de Soja Viver Bem®; para controle utilizou-se o meio de cultura que não
continha fonte de carbono.
Determinação das atividades enzimáticas
A atividade da CMCase foi realizada utilizando-se o substrato CM-celulose
SIGMA® 2% em tampão citrato de sódio 100 mM, pH 4,8, enquanto que a atividade da
Avicelase foi determinada utilizando o Avicel Fluca® 1% em tampão citrato de sódio
100 mM, pH 4,8, segundo Miller (1959), à 55oC. Em relação à atividade da Filter
Paperase (FPase) utilizou-se Papel Filtro Whatman No 1 (1,0 x 6,0 cm) como substrato
de acordo com a metodologia de Ghose (1987). O método foi previamente padronizado
por uma curva padrão de glicose (0,1 a 1,0 mg/mL), sendo a unidade de atividade (U)
definida como a quantidade de enzima que hidrolisa um μmol de substrato por minuto,
nas condições de ensaio. A atividade total (U total) = μmol/mL x volume do filtrado.

423
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Observou-se que a partir do material coletado foram isolados seis distintos
micro-organismos, dos quais o fungo Aspergillus sp. 3.7TA apresentou melhor
produção enzimática em relação aos outros, com atividade de CMCase de 9,2 U totais,
Avicelase 3,0 U totais e FPase 3,7 U totais, seguido do micro-organismo Aspergillus sp.
3.5TA com uma atividade CMCase de 9,20 U totais, e FPase de 3,70 U totais..
Avaliando a influência dos sais no meio de cultura, pode-se visualizar que a
maior atividade celulolítica foi obtida cultivando o micro-organismo em meio CP sem
sais acrescido de 0,05% (m/v) de sais Welson, com 15,22 U totais de atividade
CMCase; 2,882 U totais de Avicelase e atividade da FPase foi de 5,95 U total.
Em relação à fonte de nitrogênio do meio de cultura, o extrato de levedura
mostrou-se uma melhor fonte indutora da produção enzimática pelo Aspergillus
sp.3.7TA em comparação à peptona. A atividade CMCase no sétimo dia de cultivo do
fungo foi de 23,15 U totais, FPase foi de 4,73 U totais, e Avicelase 1,71 U totais, com
extrato de levedura, enquanto que, utilizando-se peptona as atividades foram de
CMCase 21,25 U totais, FPase 3,81 e Avicelase 0,74 U totais.
Dessa forma, pode-se determinar que entre o sétimo dia de crescimento do fungo
com o extrato de levedura como fonte de nitrogênio, a CMCase, FPase e Avicelase
apresentaram atividades significativas quando comparadas aos demais dias de
fermentação. Esses resultados corroboram com os obtidos por Sales e colaboradores
(2010), os quais avaliaram as melhores condições para produção das celulases pelo
fungo Aspergillus aculeatus utilizando-se o bagaço de cana-de-açúcar residual como
fonte de carbono.
Por fim, analisaram-se diferentes fontes de carbono indutoras da produção de
celulases pelo fungo Aspergillus sp. 3.7TA, dentre as quais pode-se observar que tanto
para a atividade da FPase quanto para a atividade da CMCase, o farelo de trigo foi a
melhor fonte de carbono, obtendo uma atividade de 5,519 U totais e 23,327 U totais,
respectivamente, entretanto, a atividade da Avicelase foi maior quando utilizado a fonte
de carbono farelo de aveia como indutora do crescimento do micro-organismo, obtendo
4,370 U totais, o farelo de trigo apresentou a quarta melhor atividade com 1,474 U
totais. Pode-se inferir que ambas as atividades das celulases obtidas foram
expressivamente superiores às encontradas nas outras fontes de carbono.
Esses resultados corroboram com os observados por Rodríguez-Zúñigae
colaboradores (2011) que concluiu que a produção celulolítica por Aspergillus niger na

424
fermentação em estado sólido de farelo de trigo foi superior, quando comparada com o
bagaço de cana-de-açúcar e farelo de soja. Albano (2016) afirma que o uso do farelo de
trigo é a fonte de carbono ideal para a alta produtividade de celulases e xilanases obtidas
a partir da fermentação, uma vez que além de utilizada como fonte de carbono é vista
como uma excelente fonte de nitrogênio, sendo de fácil acesso e baixo custo.

CONCLUSÃO
A linhagem Aspergillus (3.7TA) mostrou-se promissora com uma potencial
produtora de celulases, sendo ideal para uma futura aplicação tecnológica, na área de
biocumbistvéis e indústria de papel.

REFERÊNCIAS
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426
 Influência do meio na produção de biossurfactante pela
Rhodotorula mucilaginosa

Thamirys G. C. Sousa1; Taís A. Pinheiro2; Hugo A. Camargo3; Elias B. Tambourgi1; Lara D. Sette4;
Adalberto Pessoa Jr.5; Vicelma L. Cardoso2; Ubirajara Coutinho-Filho2; Edgar Silveira3*

1
Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química.
2
Universidade Federal de Uberlândia, Faculdade de Engenharia Química.
3
Universidade Federal de Uberlândia, Instituto de Genética e Bioquímica.
4
Universidade Estadual Paulista Campus Rio Claro, Departamento de Bioquímica e Microbiologia.
5
Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas.
* [email protected]

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Os surfactantes biológicos são metabolitos, produzidos por microrganismos, que
apresentam baixa toxicidade, são biodegradáveis e biocompatíveis. O presente trabalho
teve como objetivo analisar a influência das fontes de carbono e nitrogênio na produção
do biossurfactante pela levedura Rhodotorula mucilaginosa. Para analisar a produção
do biossurfactante realizou-se índice de emulsificação em óleo mineral e teste de tensão
superficial. Observou-se que para a fontes de carbono os melhores resultados obtidos
para ambos os testes foi, extrato de levedura, extrado de abacaxi e de caju. Para as
fontes de nitrogênio, peptona e sulfato de amônia foram selecionadas. Após a seleção
das melhores fontes de carbono e nitrogênio é possível traçar planejamentos com a
intenção de otimizar a produção do surfactante biológico, utilizando resíduos
agroindustriais como fonte de carbono.

Palavras-chave: Biossurfactante, leveduras, fermentação, abacaxi, caju.

______________________________________________________________________________________________

Influence of the source of carbon and nitrogen in the production of biosurfactant

by Rhodotorula mucilaginosa

ABSTRACT
Biological surfactants are metabolites, produced by microorganisms, that presentation
low toxicity, are biodegradable and biocompatible. The present work had as objective to
analyze the influence of carbon and nitrogen sources on the production of the
biosurfactant by the yeast Rhodotorula mucilaginosa. In order to analyze the
biosurfactant production, mineral emulsification index and surface tension test were
performed. It was observed that for carbon sources the best results obtained for both
tests were yeast extract, pineapple extract and cashew. For the sources of nitrogen,

427
peptone and ammonium sulfate were selected. After the selection of the best sources of
carbon and nitrogen, it is possible to draw up experimental planning with the intention
of optimizing the production of biological surfactant, using agroindustrial residues as
carbon source.

Keywords: Biosurfactant, yeast, fermentation, peniapple, cashew.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Surfactantes são moléculas anfipáticas. Devido esta característica apresentam
propriedades, como: redução da tesão superficial e interfacial de misturas imiscíveis, da
concentração crítica de micelas, entre outras particularidades que os tornam alvos de
estudo e interesse de diversas modalidades industriais (Ghojavand et al. 2008, Banat et
al. 2000).
Os Biosurfactantes são biomoléculas produzidas por microrganismos que
apresentam, praticamente todas as características dos surfactantes sintéticos, além disso,
possuem baixa ou nenhuma toxicidade, alta biodegrabilidade, biocompatibilidade e
especificidade, e a maioria se mantém estável em condições ambientais extremas (Desai
and Banat, 1997). Existem diversos tipos de biosurfactantes, sua classificação é baseada
nas propriedades físico-químicas, (Cameotra et al., 2010).
O crescente interesse das indústrias na melhoria da produção de biossurfactantes
promoveu o aumento da investigação do uso de resíduos agroindustriais, como resíduos
do processamento de caju e abacaxi, para a composição dos meios de cultura. O abacaxi
(Ananas comosus) é extensivamente cultivado no Brasil (Silveira et al., 2009), durante o
processo industrial, a coroa, as folhas e o caule são removidos antes do processamento.
De acordo com dados do IBGE de 2010, no Brasil a região nordeste é onde se encontra
maior quantidade de indústrias de beneficiamento da castanha de caju (Anacardium
occidentale), sendo os estados do Ceará e Piauí os maiores produtores. Anualmente são
produzidas cerca de 200 mil toneladas de amêndoas e 2 milhões de toneladas de
pedúnculo.
O presente trabalho teve como objetivo determinar a influência das fontes de
carbono e nitrogênio sobre a produção de biossurfactante pela levedura Rhodotorula
mucilaginosa.

428
MATERIAL E MÉTODOS

Resíduos agroindustriais
Os resíduos agroindustriais de abacaxi (Ananas comosus) e caju (Anacardium
occidentale) foram adquiridos nos mercados locais. Os resíduos de abacaxi constaram
basicamente de casca e folhas do abacaxizeiro e, os resíduos de caju basicamente do
pedúnculo do fruto do cajueiro.

Obtenção dos microrganismos

A levedura da Antártica, Rhodotorula mucilaginosa, codificada por L69, é
proveniente da coleção de culturas da Divisão de Recursos Microbianos do Centro
Pluridisciplinas de Pesquisas Químicas, Biológicas Agrícolas da Universidade Estadual
de Campinas (CPQBA/Unicamp).

Influencia da fonte de Carbono e Nitrogênio na produção de biossurfactante

O microrganismos foi inoculado em frascos Erlenmeyers de 200 mL contendo meio
YPD modificado para seleção de fonte de carbono e nitrogênio. A seleção de fonte de
carbono foi realizada pela substituição da glicose por fontes alternativas: acetato de
sódio, citrato de sódio, glicose, sacarose, peptona, extrato de levedura, extrato de
abacaxi e extrato de caju, em uma quantidade suficiente para atingir a mesma
quantidade de açúcares redutores do meio YPD, ou seja, 10 g/L. A fonte de nitrogênio
foi realizada substituindo o extrato de levedura e peptona, pelos seguintes compostos:
citrato de amônio, nitrato de amônio, sulfato de amônio, peptona e extrato de levedura,
na concentração de 2 g/L. Na composição dos meios também utilizou uma solução
salina contendo: 10 g/L de NaCl, 5 g/L de Na2HPO4, 2 g/L de KH2PO4 e 0,2 g/L de
MgSO4.7H2O. A fermentação foi realizada durante 56 horas a 15 ºC.

Índice de emulsificação (E24)

O índice de emulsificação foi determinado a partir da metodologia descrita por
Cai et al. (2014), a qual consiste na mistura de solução aquosa livre de células do caldo
fermentativo com o óleo mineral, na proporção de 1:1. A mistura foi agitada
vigorosamente num vortex durante dois minutos à temperatura ambiente e deixada em
repouso por 24 horas. A taxa de emulsificação foi calculada pela divisão da altura da
parte emulsificada pela altura total e a razão multiplicada por 100.
429
Tensão Superficial
Para análise da tensão superficial, utilizou-se 10 ml da amostra da solução
aquosa livre de células do caldo fermentativo. O método utilizado foi o do anel de du
Noüy (1925), com o tensiômetro modelo K6 (Krüss GmbH, Humburgo, Alemanha), à
temperatura ambiente.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
As figuras abaixo demonstraram os resultados de tensão superficial e índice de
emulsificação em óleo mineral, com a finalidade de selecionar as melhores fontes de
carbono e nitrogênio para a levedura L69.

a b

Figura 1: Tensão supeficial (mN.M-1) e índice de emulsificação em óleo mineral (%), da levedura L69 a.
em diferentes fontes de Carbono; b. Em diferentes fontes de nitrogênio. Legenda: Colunas representam
os resultados da tensão superficial e os ■ representam os dados do índice de emulsificação.

Observando a figura 1a é possível determinar que os melhores resultados para

índice de emulsificação foram obtidos pelos meios contendo como fontes de carbono a
glicose, o extrato de abacaxi e o de caju, quando comparados ao meio padrão YPD e os
demais meios testados, sendo que os três obtiveram índices acima de 60%. Em relação
ao segundo teste, análise da tensão superficial, os melhores meios foram: peptona,
extrato de levedura e caju, obtendo 45, 43 e 43 mN.m-1, respectivamente.
Uma análise estatística foi realizada comparando os dados do extrato de abacaxi
e de caju e comprovou-se que eles são estatisticamente iguais, portanto a utilização de
qualquer um produz resultados semelhantes nos testes realizados. Com isso, os meios
selecionados por apresentarem o melhor desempenho nos dois testes foram o de abacaxi
e de extrato de levedura. A preferência pela utilização do meio obtido através dos
resíduos de abacaxi ao produzido a partir do pedúnculo do caju, deve-se pela praticidade

430
de encontrar o primeiro, sendo uma fruta tipica da região Sudeste, que pode ser obtida
em qualquer época do ano, com uma maior facilidade quando comparada ao caju. O
extrato de levedura foi selecionado por ser o que apresentou uma maior redução da
tensão superficial, sendo esse um dos principais testes para produção de biossurfactante.
Na figura 1b, estão representados os dados referentes aos meios para análise das
melhores fontes de Nitrogênio. Para o teste de índice de emulsifcação, os melhores
meios foram: nitrato de amônia, sulfato de amônia e peptona, com 65, 60 e 62 %,
respectivamente. Em relação ao teste de tensão superficial, os melhores resultados, com
48,5 e 46 mN.m-1, foram dos meios sulfato de amônia e peptona, nesta ordem. Ao
avaliar o desempenhos dos três melhores meios (nitrato de amônia, sulfato de amônia e
peptona) nos dois ensaios considerados, optou-se por selecionar como fontes de
nitrogênio mais promissoras, o sulfato de amônia e peptona, por conterem dados
satisfatórios em ambos testes.

CONCLUSÕES
A partir destes resultados, selecionou-se as melhores fontes de carbono e nitrogênio,
sendo elas: extrato de abacaxi, extrato de levedura, peptona e sulfato de amônia. Os
próximos passos incluem a execução de um planejamento experimental 2n-1, para
identificar as melhores concentrações de cada composto.

AGRADECIMENTO

Agradeço a Fapemig/CNPq/Capes/Fapesp pelos auxílios financeiros.

REFERÊNCIAS

BANAT, I.M., MAKKAR, R.S., CAMEOTRA, S.S., 2000. Potential commercial

applications of microbial surfactants. Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 53,

pp. 495-508.

431
CAI, Q., ZHANG, B., CHEN, B., ZHU, Z., LIN, W., CAO, T., 2014. Screening of

biosurfactante producers from petroleum hydrocarbon contaminated sources in cold

marine environments. Marine pollution bulletin, vol. 86, pp. 402-410.

CAMEOTRA, S.S., MAKKAR, R.S., KAUR, J., MEHTA, S.K., 2010. Synthesis of

biosurfactants and their advantages to microorganisms and mankind. Adv Exp Med Biol,

vol. 672, pp. 261–280.

DESAI, J.D. and BANAT, I.M., 1997. Microbial production of surfactants and their

commercial potentials. Microbiology and Molecular Biology Reviews, vol. 61, pp. 47-

64.

DU NOÜY, P.L., 1925. An Interfacial Tensiometer for Universal Use. The

Journal of General Physiology, vol. 7, pp. 625-633.

GHOJAVAND, H., VAHABZADEH, F., ROAYAEIB, E., SHAHRAKI, A. K., 2008.

Production and properties of a biosurfactant obtained from a member of the Bacillus

subtilis group (PTCC 1696). Journal of Colloid and Interface Science, vol. 324, pp.

172-176.

SILVEIRA, E., MARQUES, P. P., SILVA, S. S., LIMA-FILHO, J. L., PORTO, A. L.

F., TAMBOURGI, E.B., 2009. Selection of Pseudomonas for industrial textile dyes

decolourization. International Biodeterioration & Biodegradation, vol. 63, no. 2, pp.

230-235.

432
 Produção de enzimas lignocelulolíticas em lodo branco por
diferentes Aspergillus
Thiago Machado Pasin1*, Rosymar Coutinho de Lucas1, 2, Ana Sílvia de Almeida Scarcella1, Yuri Heck
da Silva2, Jorge Henrique Almeida Betini2, João Atílio Jorge2, Maria de Lourdes Teixeira de Moraes
Polizeli2
1
Departamento de Bioquímica e Imunologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP, Ribeirão
Preto, SP.
2
Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, USP, Ribeirão
Preto, SP.
*e-mail: [email protected]
______________________________________________________________________________________________
RESUMO
Nas indústrias de papel ocorre a geração de um efluente denominado lodo branco, cuja
composição consiste em celulose, lignina e hemicelulose. A produção de enzimas
lignocelulolíticas utilizando-se de resíduos industriais é uma estratégia para a hidrólise
de biomassa a fim de produzir bioetanol. Assim, este trabalho teve como objetivo
avaliar a produção de enzimas lignocelulolíticas por diferentes Aspergillus cultivados
neste resíduo. O cultivo foi em meio mínimo, pH 6,5, com 1% de Lodo Branco "in
natura" (LBIN), lavado com água (LBLA) e tratado com HCl (LBHCl). O inóculo foi
feito com 107 esporos/mL, cultivado a 30°C, 120 rpm, durante 5 dias. A cada 24 horas
foram coletados 2 mL das amostras. A atividade enzimática foi realizada após
incubação do extrato bruto com 1% de substratos naturais e 2 mM dos sintéticos, a
50°C, 60 minutos. Os extratos de A. brasiliensis e A. niveus cultivados em LBIN
durante 120 horas, apresentaram alta produção de β-glucosidases, além disso, A. niveus
e A. clavatus apresentaram produção de xilanases, nestas mesmas condições. Quando
em LBHCl, A. brasiliensis e A. clavatus apresentaram boa produção de xilanases, β-
xilosidases e β-glucosidases. O extrato de A. clavatus cultivado em LBLA apresentou
produção de xilanase e β-glucosidase, já o extrato de A. niveus apresentou produção de
xiloglucanase, β-glucosidase e celobiohidrolase, enquanto que em LBHCl, A. niveus foi
capaz de produzir xilanase, endoglucanase, β-glucosidase e celobiohidrolase. Esses
dados sugerem o grande potencial da produção de enzimas lignocelulolíticas no lodo
branco com potencial de aplicação biotecnológica.

Palavras-chave: Aspergillus brasiliensis; Aspergillus clavatus; Aspergillus niveus;

Aplicação biotecnológica; Bioetanol.
_____________________________________________________________________
Production of lignocellulolytic enzymes in paper sludge by different Aspergillus

ABSTRACT
In the paper industry occurs the generation of a specific effluent, called paper sludge.
This sludge has in its composition cellulose, lignin and hemicellulose. The production
of lignocellulolytic enzymes using industrial waste is a strategy for the biomass
hydrolysis in order to produce bioethanol. Thus, this work aimed to evaluate the
production of lignocellulolytic enzymes by different Aspergillus grown in the paper
sludge. The culture was done in minimal medium, pH 6.5, with 1% paper sludge “in

433
natura” (PSIN), washed with water (PSW) and treated with HCl (PSHCl). The inoculum
was performed with 107 spores/mL, cultivated at 30°C, 120 rpm, for 5 days. Every 24
hours were collected 2 mL of the sample. The enzymatic activity was performed after
the incubation of the crude extract with 1% natural and 2 mM of synthetic substrates, at
50°C, for 60 minutes. The extracts of A. brasiliensis and A. niveus cultivated in PSIN
for 120 hours showed high production of β-glucosidases, in addition, A. niveus and A.
clavatus presented xylanases production under the same conditions. When cultivated in
PSHCl, A. brasiliensis and A. clavatus showed good production of xylanases, β-
xylosidases and β-glucosidases. The extract of A. clavatus cultivated in PSW showed
good production of xylanase and β-glucosidases, the extract of A. niveus showed
production of xyloglucanase, β-glucosidase and cellobiohydrolase, whereas in PSHCl,
A. niveus was able to produce xylanase, endoglucanase, β-glucosidase and
cellobiohydrolase. These data suggest the great potential of lignocellulolytic enzymes
production in the paper sludge with potential of biotechnological application.

Keywords: Aspergillus brasiliensis; Aspergillus clavatus; Aspergillus niveus;

Biotechnology application; Bioethanol.
______________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Os micro-organismos são muito estudados mundialmente, dentre eles estão os
fungos com sua capacidade de produzir diferentes enzimas. Eles são considerados
atrativos por diversas razões, dentre elas, a rapidez com que eles se reproduzem em
larga escala em métodos pré-estabelecidos de cultivo (Hatti-Kaul, 2004).
Os resíduos lignocelulósicos são considerados uma das principais fontes de
matéria orgânica do planeta, apresentando como vantagem a facilidade de obtenção e
grande abundância na natureza (Monte, 2009). Estes resíduos consistem,
principalmente, de três diferentes tipos de polímeros: celulose, hemicelulose e lignina,
que estão associados entre si. Enzimas fúngicas capazes de hidrolisar celulose e
hemicelulose têm sido comumente descritas na literatura, sendo necessário um
complexo enzimático que envolve a ação sinérgica das mesmas para que haja a
degradação dos polímeros de maneira eficiente (Zhang and Lynd, 2004). Estas enzimas
são produzidas por diversas bactérias e fungos, sendo os gêneros Trichoderma e
Aspergillus os mais relatados (Prasetyo and Park, 2013).
O lodo branco é um resíduo lignocelulósico decorrente da produção da pasta de
madeira nas fábricas de papel. Ele é constituído por restos de matérias primas e trata-se
de um efluente de coloração que varia de um tom cinza claro a um branco gelo, é
conhecido também pelo nome de lodo secundário. Ele representa uma promissora fonte
de matéria-prima para o cultivo e produção de enzimas fúngicas, além de um grande
potencial de utilização na produção do bioetanol por meio da bioconversão. Este resíduo

434
contém, tipicamente, em torno de 25 a 75% de carboidratos com equilíbrio de lignina,
agentes de enchimento e argilas inertes. Em contraste com praticamente todos os
materiais celulósicos nativos, uma fração significante do lodo branco não necessita de
pré-tratamento para produção de etanol por possuir pouca lignina, obtendo um
rendimento perto do teórico, que é alcançado por meio da hidrólise enzimática (Lynd et
al., 2001). Observando-se a potencialidade de utilização deste resíduo lignocelulósico
na obtenção de açúcares fermentescíveis para a produção do etanol de segunda geração,
este trabalho teve como objetivo avaliar a produção de enzimas lignocelulolíticas por
Aspergillus brasiliensis, Aspergillus clavatus e Aspergillus niveus quando cultivados no
lodo branco, visando obter enzimas capazes de hidrolisarem este resíduo com a geração
de grandes quantidades de açúcares redutores.
MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Microbiologia e Biologia
Celular do Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de
Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo– SP – Brasil.
Micro-organismos utilizados
Os fungos utilizados neste trabalho (Aspergillus brasiliensis, Aspergillus
clavatus e Aspergillus niveus) pertencem à micoteca do Laboratório de Microbiologia e
Biologia Celular do Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia Ciências e
Letras de Ribeirão Preto - USP.
Manutenção dos fungos em laboratório
A manutenção dos fungos foi realizada inoculando-se os esporos dos fungos em
meio de cultura ABD (ágar batata dextrose) autoclavados a 1,5 atm, por 20 minutos.
Foram realizados repiques periódicos mantendo-se A. brasiliensis e A. clavatus em
estufa a 30°C e A. niveus a 37°C, por aproximadamente 5 dias, conservando as cepas
em geladeira.
Pré-tratamento do lodo branco
O lodo branco foi triturado e utilizado em três condições diferentes: “in natura”
(LBIN), lavado com água (LBLA) e tratado com HCl (LBHCl). Na condição “in
natura” ele foi utilizado sem pré-tratamento; já na condição LBLA o lodo foi lavado em
água corrente até que seu pH chegasse a 7,0; o pré-tratamento com HCl (LBHCl) foi
feito conforme descrito por Gurram et al. (2015).

435
 Figura 01. (A) Amostras de lodo
branco (I) “In natura” e (II) tratado com HCl. (B) Microscopia eletrônica de varredura do lodo branco “in
natura”. Fotografia: J.H.A. Betini.

Cultivo dos fungos em fermentação submersa e determinação das atividades

enzimáticas
Os fungos foram cultivados em frascos Erlenmeyers de 250 mL, com 50 mL de
meio mínimo (Barratt et al., 1965), pH 6,5, sendo utilizado como fonte de carbono o
Lodo Branco 1% nas três diferentes condições já descritas. O inóculo foi feito com uma
solução de 107 esporos/mL, incubados a 30°C para A. brasiliensis e A. clavatus e 37°C
para A. niveus, com agitação de 120 rpm, durante 5 dias. A cada 24 horas foram
coletados 2 mL das amostras.
Os ensaios enzimáticos foram realizados em micro reações utilizando-se 15 µL
do extrato bruto, 25 µL dos substratos naturais e sintéticos. Os substratos naturais
utilizados foram: 1% linear arabinan, xilana beechwood, xiloglucano, locust bean gum
e carboximetilcelulose (CMC), acrescidos de 10 µL de tampão acetato de sódio, 50
mM, pH 5,0. A reação foi incubada a 50ºC, por 60 minutos. Os açúcares redutores
resultantes foram determinados de acordo com o método de DNS (Miller, 1959). Os
substratos sintéticos utilizados foram: 2 mM PNP-α-L-arabinofuranosídeo, PNP-β-D-
xilopiranosídeo, PNP-β-D-glucopiranosídeo e PNP-β-D-celobiosídeo, sob as mesmas
condições de reação já descritas. Após a incubação com os substratos sintéticos a 50ºC,
por 60 minutos foram adicionados 50 µL de Na2CO3. A definição da atividade
enzimática foi feita na forma de atividade relativa.
Reprodutibilidade dos resultados
Todos os experimentos foram realizados em triplicatas experimentais.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foi possível observar uma boa produção de β-glucosidases pelo fungo A.
brasiliensis após 120 horas de experimento nos cultivos com LBIN e LBHCl, além

436
disso, em LBHCl também foi observada a produção de xilanase e β-xilosidase. A.
clavatus apresentou produção de xilanases, após 120 horas de experimento, nas três
condições de cultivos, e em LBLA e LBHCl, no mesmo tempo de cultivo, foi observada
a produção de β-glucosidases, com LBHCl houve também a produção de β-xilosidase.
O fungo A. niveus demonstrou alta produção de β-glucosidases em LBHCl, além disso,
em LBIN e LBHCl houve produção de xilanases, já quando cultivado em LBLA
apresentou uma alta produção de xiloglucanase e celobiohidrolase. Uma grande
quantidade de endoglucanases e celobiohidrolase também foi observada quando o fungo
foi cultivado em LBHCl, conforme apresentado na Tabela 01.
Tabela 01. Produção de enzimas lignocelulolíticas por A. brasiliensis, A.
clavatus e A. niveus em 120 horas de experimento.
Atividades enzimáticas (%)
Abn Abf Xl B-glu B-xil Man Xeg EG CB
Fungos Condições
A. LBIN 0 0 0 50,0 0 0 0 0 0
brasiliensis LBLA 0 0 0 0 0 0 0 0 0
LBHCl 0 0 10,0 30,0 100 0 0 0 0
LBIN 0 0 80,0 0 0 0 0 0 0
A. clavatus LBLA 0 0 77,0 20,0 0 0 0 0 0
LBHCl 0 0 100 37,5 30,0 0 0 0 0
LBIN 0 0 1,3 25,0 0 0 0 0 0
A. niveus LBLA 0 0 0 50,0 0 0 100 0 83,3
LBHCl 0 0 2,6 100 0 0 0 100 100
As siglas Abn, Abf, Xl, B-glu, B-xil, Man, Xeg, EG e CB correspondem a Arabinanase,
Arabinofuranosidase, Xilanase, B-glucosidase, B-xilosidase, Mananase, Xiloglucanase, Endoglucanase e
Celobiohidrolase.
Como foi observado, LBHCl foi a condição que levou a uma maior produção de
diferentes enzimas lignocelulolíticas, este resultado pode ser explicado pela ação do
HCl, o qual reage quimicamente com o carbonato de cálcio gerando cloreto de cálcio,
gás carbônico e água como produtos desta reação. O cloreto de cálcio, por se tratar de
um sal, é facilmente removido durante a etapa de lavagem com água. Estas substâncias
(CaCO3 e CaCl2) presentes no lodo “in natura” impedem a produção de enzimas pelos
fungos, assim como a hidrólise enzimática e a remoção destas substâncias através do
HCl, proporciona uma área superficial aumentada para o acesso e assimilação do
substrato pelos fungos (Gurram et al., 2015). Assim, a concentração e a variedade de
enzimas produzidas são maiores, devido à utilização completa dos materias
lignocelulolíticos presentes, levando ao crescimento e a produção das enzimas
necessárias para o desenvolvimento dos fungos.

437
 Estes resultados se mostram inovadores já que não existem relatos na literatura
da produção de enzimas de interesse biotecnológico por fungos do gênero Aspergillus,
utilizando-se como substrato o lodo branco. A utilização do lodo branco diminui os
custos do processo de tratamento deste resíduo, minimizando os impactos ambientais
causados, além de gerar produtos com um alto valor agregado e com grande potencial
de aplicação na produção do bioetanol, conforme já foi descrito por Gurram et al.
(2015).
CONCLUSÕES
O cultivo e a produção de enzimas lignocelulolíticas em lodo branco por A.
brasiliensis, A. clavatus e A. niveus possui um grande potencial biotecnológico, uma
vez que estes fungos demonstraram um bom crescimento em 120 dias de experimento,
além de obterem uma elevada produção de enzimas com potencial de aplicação na
produção do bioetanol.
AGRADECIMENTO
CAPES, CNPq e FAEPA
REFERÊNCIAS
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stocks of Aspergillus nidulans. Genetics, vol. 52, pp. 233–246.
GURRAM, R.N.; AL-SHANNAG, M.; LECHER, N.J.; DUNCAN, S.M.; SINGSASS,
E.L.; ALKASRAWI, M., 2015. Bioconversion of paper mill sludge to bioethanol in the
presence of accelerants or hydrogen peroxide pretreatment. Bioresour. Technol, vol.
192, pp. 529-539. http://dx.doi.org/ 10.1016/j.biortech.2015.06.010.
HATTI-KAUL, R., 2004. Enzyme production. In: Encyclopedia of Life Support
Systems (EOLSS), Biotechnology, vol. 5, pp. 21-62. http://www.eolss.net/.
LYND, L.R.; LYFORD, K.; SOUTH, C.R.; VAN WALSUM, P.; LEVENSON, K.,
2001. Evaluation of paper sludge for amenability to enzymatic hydrolysis and
conversion to ethanol. Tappi J. Peer Rev. Paper, vol. 84, pp. 1-19.
http://imisrise.tappi.org/TAPPI/Products/01/FEB/01FEB50.aspx
MILLER, G.L., 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing
sugar. Anal. Chem, vol. 31, no. 3, pp. 426-428.
MONTE, J.R., 2009. Sacarificação da polpa celulósica do bagaço de cana-de-açúcar
com celulases e xilanases de Thermoascus aurantiacus. Lorena: Universidade de São
Paulo. 138 p. Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Industrial.
PRASETYO, J. and PARK, E.Y., 2013. Waste paper sludge as a potential biomass for
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http://dx.doi.org/10.1007/s11814-013-0003-1.
ZHANG, Y.H.P. and LYND, L.R., 2004. Toward an aggregated understanding of
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438
 Atividade antimicrobiana de frações de Cambará sobre
microbiota de morango
Victoria de Moraes Gonçalves1; Júlia Borin Fioravante1; Camila Rios Piecha2; Patrícia Diaz de Oliveira2;
Claire Tondo Vendruscolo2, Angelita da Silveira Moreira3*

1
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos (PPGCTA-UFPel).
2
Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Núcleo de Biotecnologia (CDTec-UFPel).
3
Centro de Ciências Químicas, Farmacêuticas e de Alimentos (CCQFA-UFPel).
*e-mail: [email protected]

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
O Brasil se destaca com elevadas perdas de frutas e hortaliças na fase pós-colheita. Com
a finalidade de minimizar essas perdas, principalmente em culturas suscetíveis a
doenças de campo, como o morango, o desenvolvimento de novas tecnologias é
necessário. Revestimentos e filmes comestíveis e biodegradáveis à base de
polissacarídeos, além de reduzir a perda de massa e a atividade respiratória dos frutos,
podem ainda serem adicionados de antimicrobianos e antioxidantes naturais com a
finalidade de reduzir a degradação dos frutos pelo ataque de microrganismos
patogênicos e inibir o escurecimento enzimático de frutos in natura e minimamente
processados. O cambará (Moquiniastrum polymorphum) possui resultados promissores
já descritos na literatura para importantes atividades biológicas, como antimicrobiana,
anti-inflamatória, anticâncer, entre outras. O objetivo desse trabalho foi testar a
atividade antimicrobiana das frações diclorometano, acetato de etila, butanol e a fração
aquosa, nas concentrações de 50 e 25 mg/mL, obtidas a partir do extrato etanólico das
partes aéreas de M. polymorphum frente à microbiota total de morangos em processo de
decomposição, pelo teste de difusão em disco. Somente a fração aquosa apresentou
halos de inibição com tamanhos médios de 8 mm, enquanto o controle da fração não
apresentou halo de inibição; as demais frações não apresentaram potencial
antimicrobiano, enquanto que os solventes inibiram a microbiota total. Os resultados
obtidos são satisfatórios para o viés de aplicação na indústria de alimentos, já que a
fração aquosa possibilita uma fácil solubilização na matriz dos revestimentos e filmes
sem a presença de resíduos tóxicos nos produtos pretendidos.

Palavras-chave: Perdas pós-colheita; Halo de inibição; Extratos; Fração aquosa.

______________________________________________________________________________________________

Antimicrobial activity of Cambará fractions on strawberry microbiota

ABSTRACT
Brazil stands out with high losses of fruits and vegetables in the post-harvest phase. In
order to minimize these losses, especially in crops susceptible to field diseases, such as
strawberries, the development of new technologies is necessary. Edible and
biodegradable coatings and films based on polysaccharides, besides reducing the mass

439
loss and respiratory activity of the fruits, can also be added with antimicrobials and
natural antioxidants in order to reduce the degradation of the fruits by the attack of
pathogenic microorganisms and to inhibit The enzymatic darkening of fruits in natura
and minimally processed. The Cambará (Moquiniastrum polymorphum) has promising
results already described in the literature for important biological activities, such as
antimicrobial, anti-inflammatory, anticancer, among others. The objective of this work
was to test the antimicrobial activity of the dichloromethane, ethyl acetate, butanol and
aqueous fractions at concentrations of 50 and 25 mg / mL, obtained from the ethanolic
extract of the aerial parts of M. polymorphum against total microbiota of strawberries in
process of decomposition, by the disc diffusion test. Only the aqueous fraction showed
inhibition halos, with mean sizes of 8 mm, while the fraction control did not present
inhibition halo; the other fractions showed no antimicrobial potential, but the solvents
inhibited the total microbiota. The results obtained are satisfactory for the purpose of
application in the food industry, since the aqueous fraction allows an easy solubilization
in the matrix of coatings and films without the presence of toxic residues in the desired
products.

Keywords: Post-harvest losses; Inhibition halo; Extracts; Aqueous fraction.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
As maiores taxas de perdas de frutas e hortaliças pós-colheita são representadas
pelo Brasil, em torno de 35-40%, enquanto os Estados Unidos estimam perdas de
apenas 16% (Assis et al., 2012). Para a redução das perdas pós-colheita, o
desenvolvimento de novas tecnologias são necessárias (Borges et al., 2013).
Usualmente, os procedimentos de conservação aplicados à frutas e hortaliças estão
relacionados a condições de frio e boas práticas de armazenamento. Contudo, a
biotecnologia vem ganhando destaque no desenvolvimento de revestimento comestíveis
e filmes biodegradáveis que elevam o tempo de conservação, favorecendo o comércio
(Assis et al., 2009; Borges et al., 2013).
Os biofilmes à base de políssacarídeos naturais têm se destacado como uma
nova categoria com grande potencial de aplicação como revestimentos comestíveis e
protetores para frutas e legumes pós-colheita, in natura ou minimamente processadas,
com a finalidade de conservação e prolongamento da vida útil dos alimentos (Borges et
al., 2008). A finalidade desses revestimentos é reduzir a perda de massa, a atividade
respiratória dos frutos e o contato com o meio externo, preservando e prolongando suas
características fisiológicas originais (Vega et al., 2013). Os revestimentos ainda podem
atuar inibindo o escurecimento enzimático, que costuma afetar os frutos minimamente
processados, e podem apresentar potencial bactericida e fungicida (Moraes et al., 2007).

440
 O morango é suscetível a doenças de campo e pós-colheita, resultando em
perdas significativas para o mercado, superiores a 50%. O uso de embalagens bioativas
na forma de revestimentos comestíveis é promissor para minimizar as perdas pós-
colheita e aumentar a vida útil desses alimentos (Vargas et al., 2008; Vega et al., 2013).
Uma alternativa para o mercado de embalagens funcionais é o uso de
antimicrobianos naturais, visando a tendência atual de busca por alimentos mais
saudáveis (Moraes et al., 2007). Vários compostos têm tido seu potencial
antimicrobiano analisado dentro desse conceito. O Cambará (Moquiniastrum
polymorphum), uma árvore da família Asteraceae, amplamente distribuída no Brasil,
possui resultados promissores em relação aos potenciais antioxidante e antimicrobiano
(Moreira et al., 2000; Piornedo et al., 2011) e apresenta níveis seguros de toxicidade
(David et al., 2014). Porém, a literatura é escassa quanto a sua aplicação na indústria
alimentícia.

MATERIAL E MÉTODOS
Material vegetal - As partes aéreas de Moquiniastrum polymorphum (Cambará)
foram coletadas em março de 2015, em propriedades rurais distantes de atividades
industriais e da circulação de automóveis. Propriedade localizada no 9° distrito de
Pelotas, Monte Bonito – RS. As partes aéreas da planta foram previamente secas em
estufa com circulação de ar forçada a 35°C e trituradas em moinho de facas. Assim, o
material vegetal foi armazenado em sacos de papel pardo, para proteção contra umidade
e luz, até a utilização.
Preparo do extrato - O extrato etanólico foi preparado por maceração a partir
das partes aéreas de Moquiniastrum polymorphum (Cambará), numa proporção de 20%
de material vegetal em relação ao solvente. A extração por maceração ocorreu durante
35 dias, à temperatura ambiente, sob abrigo da luz e agitação manual ocasional. Com a
finalidade de promover o esgotamento dos compostos bioativos a serem extraídos da
planta, o solvente foi trocado três vezes, sendo a primeira troca após 15 dias de extração
e as demais, a casa 10 dias. Ao final dos 35 dias de maceração as alíquotas foram
reunidas e concentradas em evaporador rotativo. O extrato concentrado obtido, chamado
de extrato bruto (F0), foi ressuspenso em água destilada e em seguida, fracionou-se a
mistura por partição com solventes de polaridades crescentes. As frações diclorometano
(F1), acetato de etila (F2) e n-butanol (F3) foram reconcentradas no evaporador rotativo

441
e ressuspensas/rediluídas em seus próprios solventes, na concentração de 50 mg/mL e
25 mg/mL. A fração aquosa (F4) não passou por liofilização prévia ao uso.
Preparo do inóculo - Os morangos foram adquiridos no comercio local de
Pelotas – RS, e armazenados no Laboratório de Biopolímeros da Universidade Federal
de Pelotas em condições ambiente não controladas, como temperatura e umidade,
durante aproximadamente 5 dias. Em seguida do surgimento de contaminação
microbiológica na superfície dos frutos procedeu-se com o preparo do inóculo a partir
de 25 g de frutos dispersos em 225 mL de água peptonada 0,1%. Homogeneizou-se a
mistura, e preparou-se diluições seriadas até a 104, para avaliar a microbiota total dos
frutos.
Difusão em disco - Para avaliação do potencial antimicrobiano do extrato bruto
e das frações de M. polymorphum, preparou-se discos estéreis de papel, impregnados
com 5 µL de amostra. Os discos foram dispostos sobre placas de Petri contendo uma
alíquota de 100 µL do inóculo preparado anteriormente, espalhado sobre Ágar Batata
Dextrose (BDA) acidificado com ácido tartárico 10%.
Os solventes usados para fracionamento do extrato, assim como o DMSO
(dimetilsulfóxido) usado para auxiliar na solubilização das amostras, foram usados
como controle negativo frente a microbiota total de morangos. As placas foram
incubadas a 25 °C durante 5 dias, e os resultados expressos em função da medida em
milímetros dos halos de inibição formados ao redor dos discos de papel.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
A concentração do inóculo preparado a partir dos frutos contaminados foi de
1,6x106 UFC/mL. Apenas a fração aquosa apresentou halos de inibição, com tamanhos
médios de 8 mm, nas concentrações testadas. Quanto aos solventes usados como
controle negativo, butanol foi o que apresentou maior toxicidade frente a microbiota
total dos frutos, com formação de halo total apresentando 11 mm como tamanho médio,
já o DMSO, o acetato de etila, o diclorometano e o etanol apresentaram pequenos halos
de inibição com tamanhos médios de 6,7 mm, 7 mm, 7,5 mm e 8,5 mm
respectivamente, enquanto a água não apresentou halo de inibição.
Uma vez que a água, usada como controle, não apresentou a formação de halos
de inibição frente a microbiota total dos frutos e a fração aquosa do extrato de M.
polymprphum foi a única fração que apresentou potencial atividade antimicrobiana com
a formação de halos de inibição, os resultados mostram que a atividade está relacionada
442
aos compostos bioativos extraídos na fração aquosa, não tendo o solvente interferido no
resultado. Moreira et al. (2000) identificou o aminoácido não proteico 4-N-metil-
hidroxiprolina como o principal componente da fração aquosa e do extrato bruto desse
vegetal anteriormente denominado Gochnatia polymorfa.
O potencial antimicrobiano de extratos de M. polymorphum também foi
estudado por Stefanello (2006), os resultados mostram que na concentração de 5 mg/mL
os extratos das folhas (hexano, diclorometano e etanol) apresentaram fraca atividade
antimicrobiana frente a cepas de Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans, com
halos de inibição em torno de 6 a 7 mm. Já o extrato dos ramos com diclorometano e o
extrato etanólico das cascas se mostraram ativos frente as Micrococcus luteus, S. aureus
e S. epidermidis, com halos de inibição variando de 7 a 12 mm. Quando testados os
extratos frente a bactérias Gram-, nenhum deles apresentou potencial inibição
(Stefanello, 2006).

CONCLUSÕES
A fração aquosa de M. polymorphum teve potencial atividade antimicrobiana.
Como seu solvente é a água, isto a torna um candidato potencial à aplicação e filmes e
coberturas para alimentos, pois não ocorrerão problemas de solubilização em matrizes
poliméricas hidrossolúveis, nem permanência de resíduos tóxicos.

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444
 Metabólitos secundários de Alternaria sp., fungo endofítico
isolado das folhas de Serjania lethalis A. St.Hil
Viviane de Cassia Pereira Abdalla1*; Ana Carolina Alves dos Santos2; Sergio Kakazu3; Paulo Cezar
Vieira2; Sonia Cristina Juliano Gualtieri1

1
Universidade Federal de São Carlos. Departamento de Botânica *[email protected]
2
Universidade Federal de São Carlos. Departamento de Química
3
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Centro de Estudos de Insetos Sociais

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
A prospecção de metabólitos secundários de fungos endofíticos é uma importante
ferramenta no estudo de substâncias bioativas provenientes de fontes naturais. Assim,
este trabalho teve como objetivo isolar e identificar metabolitos produzidos por
Alternaria sp. Para isso, cultivou-se o micro-organismo em meio Czapek enriquecido
com 2% de extrato de levedura durante 21 dias. Após este período a incubação foi
interrompida, o micélio foi separado da fase liquida por filtração a vácuo e foi feita uma
partição líquido-líquido do filtrado (meio de cultura) com acetato de etila.
Posteriormente a fase orgânica foi seca em rotaevaporador e assim foi obtido o extrato
de acetato de etila. Este extrato foi fracionado em coluna de sílica de fase normal e as
frações foram analisadas por meio de espectrometria de massas (CLAE-EM) e
ressonância magnética nuclear (RMN). Assim foram identificados o ácido indol-3-
carboxílico e as dicetopiperazinas ciclo prolina-leucina, ciclo prolina-valina e ciclo
prolina isoleucina.
Palavras-chave: Fungos endofíticos; cromatografia; espectrometria de massas;
ressonância magnética nuclear.
______________________________________________________________________________________________

Secondary metabolites of Alternaria sp. endophytic fungi isolated from Serjania

lethalis A. St.Hil leaves

ABSTRACT
Prospection of secondary metabolites of endophytic fungi is an important tool for the
study of bioactive compounds from natural sources. Thus, this work aimed to isolate
and identify some metabolites produced by Alternaria sp. For this, the microorganism
was cultivated in Czapek enriched with 2% yeast extract for 21 days. After this period

445
the incubation was stopped, the mycelium was separated from liquid phase by vacuum
filtration and a liquid-liquid partition of the filtrate (culture medium) was perfomed with
ethyl acetate. Afterwards the organic phase was dried in a rotary evaporator and the
ethyl acetate extract of the culture medium was obtained. This extract was fractionated
on a normal phase silica column and the fractions were analyzed by mass spectrometry
(LC-MS) and nuclear magnetic resonance (NMR). Thus indole-3-carboxylic acid and
the diketopiperazines cyclo proline-leucine, cyclo proline-valine and cyclo proline-
isoleucine were identified.

Keywords: Endophytic fungi; Chromatography; Mass spectrometry; Nuclear Magnetic

Resonance.

______________________________________________________________________________________________

INTRODUÇÃO
Fungos endofíticos são micro-organismos que vivem assintomaticamente dentro
de tecidos de plantas sem causar prejuízos às mesmas (Kharwar et al., 2011). De uma
mesma planta podem ser isoladas centenas de espécies de fungos, porém apenas uma
espécie será específica ao hospedeiro (Tan & Zou, 2001). O gênero Alternaria é
conhecido por ser patógeno, saprófito e endofítico de diversas espécies vegetais
(Thomma, 2003). Até o momento algumas substâncias como altertoxinas A e C
(Berestetskiy et al., 2015), tagetolona, tagetenolona, tyrosol, zinniol, ácido p-
hidroxibenzóico (Ângulo et al., 2001), anhidromevalonolactona, tyrosol, (R)-(-)-
mevalonolactona e cicloglicilprolina, (Varejão et al., 2013) foram reportadas como
metabólitos do gênero Alternaria. Assim, visando dar continuidade aos estudos de
prospecção de metabólitos secundários produzidos pelo fungo Alternaria sp. realizou-se
o estudo do perfil químico deste em meio de cultura líquido (Czapek enriquecido com
2% de extrato de levedura).

MATERIAL E MÉTODOS
Isolamento do fungo

O fungo Alternaria sp. foi isolado de folhas sadias de Serjania lethalis, coletadas
no Cerrado da Universidade Federal de São Carlos-SP Brasil.

As folhas coletadas foram inicialmente lavadas com água corrente.

Posteriormente, em câmara asséptica, foram imersas em uma solução de detergente e

446
água por 10 minutos, seguida de imersão em água por 3 minutos, hipoclorito 1% por 10
minutos, etanol 70% por 3 minutos, água destilada por 3 minutos, sendo que este
processo foi repetido por 4 vezes. A água da última lavagem foi inoculada em placa de
Petri com meio de cultura a fim de garantir a esterilização da microbiota epifítica da
folha (Petrini et al, 1992)

Extração do DNA Genômico, PCR e sequenciamento da região ITS

Foram adicionados 600 uL de Breaking Buffer às placas de Petri contendo o

fungo isolado. Em seguida, à solução contendo esporos foram adicionadas pérolas de
vidro e colocadas em vortex por 30 segundos. Posteriormente foram incubadas a 70º C
por 30 minutos. Em seguida foram adicionados 200 uL de fenol-clorofórmio 1:1,
colocados em vortex por 10 minutos e centrifugados por 10 minutos. O sobrenadante foi
transferido para outro Eppendorf e a ele foram adicionados 200 uL de clorofórmio,
posteriormente foram centrifugados e o sobrenadante foi retirado e adicionado a 800 uL
de isopropanol. As amostras permaneceram por 30 minutos em freezer -80º C e em
seguida foram centrifugadas. O pellet obtido foi lavado com etanol 70% e
ressuspendido em 50 uL de água MiliQ.

Foram amplificadas as regiões ITS1 e ITS4 (White et al., 1990). A reação de

PCR foi composta por 1 µL de DNA fúngico, 5 µL de Tampão 5X; 2 µL de MgCl 25
mM; 2 µL de primer ITS1 (CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA) (2 µM); 2 µL de
primer ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) (2 µM); 2,5 µL de dDNTP; 0,2 µL de
Taq (5 U/mL) e 9,3 µL de água. O volume final da reação foi de 25 µL. O programa
utilizado consistiu em uma desnaturação inicial de 94º C por 5 minutos, seguida de 94º
C por 1 minuto; 55º C por 45 minutos; 72º C por 1 minuto com uma extensão final de
72ºC por 10 minutos. O ciclo foi repetido por 30 vezes. A amplificação da região ITS
foi confirmada pela corrida dos produtos de PCR em gel de agarose 1,5% em
eletroforese com 1 × Tris-acetate EDTA e o marcador 1 kb DNA ladder (Huang et al.,
2008).

Purificação do ITS amplicon, sequenciamento dos genes ITS e purificação da

reação de sequenciamento

Os produtos amplificados foram purificados misturando-se a cada reação 0.05

µL da enzima Exonuclease I, 0,5 µL de Fast AP e 2.45 µL de água. O programa
utilizado no termociclador foi 37 ºC por 30 minutos para ativar a enzima e 80ºC por 10

447
minutos para desativar a enzima. Para a reação de sequenciamento foram utilizados os
reagentes Big Dye 3.1; Save Money; Primer, DNA amplificado e água MiliQ. As
sequências foram obtidas através do sequenciador Sanger Method in an ABI 3500
Capillary Automated Sequence Machine. A reação de sequenciamento foi purificada
utilizando-se EDTA 125mM, Acetato de Sódio 3M e Etanol 100% e ressuspendida em
Hi Di Formamida (Applied Biosystems).

Análises das sequências

As sequências foram alinhadas utilizando-se o programa BioEdit e analisadas no

programa ITScan (Ferro et al., 2014) database utilizando-se a ferramenta BLAST.

Preparação dos extratos, isolamento e identificação dos metabólitos secundários

O fungo Alternaria sp. foi cultivado em placas de Petri com meio de cultura
BDA (Batata, Dextrose e Agar). Após o crescimento em placas de Petri por 7 dias,
plugs do fungo foram transferidos para 30 Erlenmeyers de 500 mL contendo 250 mL
de meio de cultura Czapek enriquecido com 2% de levedura. Os Erlenmeyers foram
incubados a 25ºC em modo estático e agitados a cada 3 dias. Um Erlenmeyer contendo
apenas meio de cultura foi mantido como controle negativo. Após o 21º dia de
incubação, filtrou-se o conteúdo dos Erlenmeyers a vácuo, separando-se o micélio do
meio de cultura. O meio de cultura foi particionado com acetato de etila (3X de 100
mL) e em seguida, a fase orgânica concentrada a vácuo em rotaevaporador, gerando o
extrato de acetato de etila. O mesmo procedimento foi realizado com o controle
negativo. O fracionamento do extrato (2g) foi feito em coluna de sílica de fase normal.
Os eluentes utilizados foram: - hexano; hexano: acetona (9:1 v/v) - hexano: acetona (8:2
v/v) hexano: acetona (7:3 v/v); hexano: acetona (1:1 v/v); hexano: acetona (3:7 v/v);
acetona ; acetona: metanol (7:3 v/v); acetona: metanol (1:1 v/v); acetona: metanol (3:7
v/v); metanol. As frações obtidas foram secas e analisadas por cromatografia de camada
delgada (CCD) e quando necessário foram feitas cromatografias líquidas de alta
eficiência (CLAE). Os metabólitos puros foram analisados e identificados por
cromatografia líquida acoplada a espectroscopia de massas (CLAE-EM) e ressonância
magnética nuclear (RMN).

RESULTADOS E DISCUSSÃO
O DNA do isolado de Alternaria sp.foi extraído eficientemente. Através da
amplificação da região ITS (Internal Transcribed Spacer) por PCR e sequenciamento foi

448
 obtido um fragmento de 453 pares de bases (pb). O fragmento obtido foi submetido à
análise no ITScan e observou-se que o isolado mostrou uma similaridade de 100 % com
os fungos do gênero Alternaria. Embora o tamanho do fragmento obtido tenha se
mostrado insuficiente para identificar a espécie foi possível à identificação do isolado
como pertencendo ao gênero Alternaria.
As principais classes de metabólitos secundários produzidas pelo gênero
Alternaria consistem em substâncias nitrogenadas, esteróides, terpenóides, quinonas e
fenóis (Lou et al., 2013). As substâncias isoladas neste trabalho contribuem com melhor
conhecimento dos metabólitos secundários produzidos por esta espécie.
Através dos procedimentos cromatográficos utilizados foi possível isolar até o
momento quatro metabólitos a partir do extrato de acetato de etila de Alernaria sp. Estes
metabólitos foram analisados por CLAE-EM e RMN, permitindo a identificação de
quatro substâncias: ácido- indole-3- carboxílico (Figura 1a) e as dicetopiperazinas ciclo
prolina-leucina (Figura 1b); ciclo prolina-valina (Figura 1c) e ciclo prolina-isoleucina
(Figura 1d).

a) c) d)
b)

Figura 1. Metabólitos secundários produzidos pelo fungo Alternaria sp. a) ácido-indole-3-

carboxílico (b) Ciclo prolina-leucina (c) ciclo prolina-valina (d) ciclo prolina-isoleucina

CONCLUSÕES
Até o momento foram isolados quatro metabólitos secundários do fungo
endofítico Alternaria sp. sendo eles ácido- indole-3- carboxílico, ciclo prolina-leucina,
ciclo prolina-valina e ciclo prolina- isoleucina, que irão contribuir com o conhecimento
do perfil químico da espécie. O potencial fitotóxico destas substâncias está sendo
investigado.
AGRADECIMENTO. Os autores agradecem às agências de fomento CAPES
(Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior), CNPq (Conselho
Nacional de Pesquisa) e FAPESP (Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao
Paulo).

449
REFERÊNCIAS

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450
 Seleção de espécies de Aspergillus e Penicillium produtores de
enzimas aplicadas na indústria de alimentos

Wesley de Oliveira Mendes1; Sirlei Cristina de Souza 1*; Vanessa Maria Pereira1; Lorena Dutra Silva1;
Fátima Maria de Souza Moreira1; Luís Roberto Batista1
1
UFLA, Departamento de Ciências dos Alimentos *[email protected]
______________________________________________________________________________________________

RESUMO
As enzimas atuam em diversos setores industriais, e dentre os organismos capazes de
produzir essas enzimas, destacam-se os fungos dos gêneros Aspergillus e Penicillium. O
objetivo deste estudo foi realizar o screening da produção das enzimas amilases, lipases,
celulases e proteases. Para os testes enzimáticos foram testados 14 fungos identificados
e 21 fungos não identificados, e estes foram inoculados em meios de cultura à base de
diferentes substratos. Após a incubação, foi estimado o Índice Enzimático. Dentre os
fungos identificados, dois isolados produziram amilases, sete produziram celulases, 11
apresentaram produção de lipases e nenhum dos fungos identificados apresentou
produção de proteases. No caso dos fungos não identificados, 1 isolado produziu
amilases, 6 produziram lipases, 11 produziram celulases, nenhum dos isolados produziu
enzimas proteolíticas e 7 não produziram enzimas nos testes realizados.
Palavras-chave: Aspergillus, biotecnologia, Penicillium.
______________________________________________________________________________________________

Selection of Aspergillus and Penicillium species producing enzymes applied in the

food industry

ABSTRACT
The enzymes act in several industrial sectors, and among the organisms capable of
producing these enzymes, the fungi of the genus Aspergillus and Penicillium stand out.
The objective of this study was to realize the screening production of the enzymes
amylases, lipases, cellulases and proteases. For the enzymatic tests, 14 identified fungi
and 21 unidentified fungi were tested, and these were inoculated in culture media based
on different substrates. After incubation, the Enzymatic Index was estimated. Among
the fungi identified, two isolates produced amylases, seven produced cellulases, 11
presented lipases production and none of the fungi identified showed protease
production. In the case of unidentified fungi, 1 isolate produced amylases, 6 produced
lipases, 11 produced cellulases, none of the isolates produced proteolytic enzymes and 7
did not produce enzymes in the tests performed.
Keywords: Aspergillus, biotecnology, Penicillium.
______________________________________________________________________________________________

451
INTRODUÇÃO
As enzimas são catalisadores biológicos que atuam na diminuição da energia
necessária para a ativação de uma dada reação, fazendo com que a obtenção dos
produtos gerados por esta ocorra em um menor tempo (Leningher, 2006). A atividade
enzimática está intimamente ligada às características das proteínas que compõe a
enzima, sendo responsável por suas propriedades e especificidade (Campbell, 2000). E
dentre os diversos organismos capazes de sintetizar enzimas durante seus processos
metabólicos, destacam-se os microrganismos, que apresentam uma série de vantagens
em relação à outros organismos no que diz respeito à atividade enzimática. (Silva 2015;
Cortez, 2017).
Diante dos inúmeros microrganismos produtores de enzimas, destacam-se os
fungos, principalmente os fungos dos gêneros Aspergillus e Penicillium. Os fungos dos
gêneros citados ganham relevância, pois são conhecidos por uma ampla produção de
metabólitos, como ácidos orgânicos, antibióticos, corantes e enzimas (Bulakhov, 2017).
São diversas as enzimas utilizadas na indústria alimentícia, dentre elas, destacam-se as
amilases, proteases, lipases e celulases. As amilases são utilizadas em produtos de
panificação e produção de xaropes, as proteases são utilizadas na produção de
amaciantes de carnes, as lipases são utilizadas na panificação, na obtenção de ácidos
graxos essenciais e na incorporação de antioxidantes em óleos, as celulases são
utilizadas na extração de componentes, e na extração e clarificação de sucos.
Diante da ampla utilização de enzimas em diversos processos de fabricação de
produtos alimentícios, o objetivo deste trabalho é avaliar e selecionar fungos vindos de
solo, capazes de produzir enzimas de interesse, através de screening enzimático. Além
disso, tal avaliação tem importância por adotar metodologias rápidas e baratas de
seleção qualitativa de fungos filamentosos produtores de enzimas.

MATERIAL E MÉTODOS
Local de realização do trabalho
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Micologia e Micotoxinas de
Alimentos (LAMIT), no departamento de Ciências dos Alimentos (DCA), na
Universidade Federal de Lavras (UFLA-MG). As amostras de solo utilizadas foram
cedidas pela empresa VALE e foram retiradas da região da cidade de Brumadinho –
MG.
Identificação dos fungos dos gêneros Aspergillus e Penicillium

452
 Para obtenção dos microrganismos foram realizadas diluição seriada (10-1 a 10-
4) seguido de plaqueamento em superfície em meios de cultura DRBC e DG18 (25°C/5-
7 dias). Após o desenvolvimento das colônias, as que apresentaram macromorfologias
distintas foram isoladas em MA 2%. Os meios utilizados para identificação morfológica
foram MEA e CYA (25°C) e CYA (37°C). Após sete dias foram realizadas medições
das colônias, observação de suas características e micrometrias em lâminas, onde os
dados encontrados foram utilizados nas chaves de identificação descritas por KLICH
(2002) e PITT (2002).
Screening enzimático
Após a identificação, o teste enzimático foi efetuado, com o intuito de averiguar
quais enzimas seriam produzidas por cada isolado. O teste foi efetuado através da
alteração do substrato presente no meio de cultura, para determinação de produção de
amilases, o meio de cultura foi constituído de amido solúvel. No caso das proteases, o
meio tinha como substrato a gelatina, e na determinação de produção de enzimas
lipolíticas foi utilizado o Tween 20 para que este atuasse como substrato (Sierra, 1957).
Por fim, a fim de determinar isolados capazes de sintetizar celulases, o meio de cultura
foi preparado à base de carboximetilcelulose (CMC). Cada isolado foi inoculado nos
meios de cultura citados, por cinco dias em estufa B.O.D, a 25ºC.Vale ressaltar, que os
isolados não identificados também foram avaliados quanto à produção enzimática.
Índice enzimático (I.E)

Após o período de incubação, nota-se a presença de halo ao entorno da colônia

no caso de produção enzimática, e no caso de não produção de enzimas o halo estará
ausente. Para a observação do halo pode ser necessário a utilização de reveladores,
como no caso dos meios para determinação de produção de amilases e celulases, nos
quais se utiliza o lugol como revelador. Há também casos em que o uso de reveladores é
dispensável, como na determinação de atividade proteolítica e lipolítica, que são
caracterizadas pela presença de halo visível sem a utilização de reveladores, no caso de
produção destas enzimas. O Índice Enzimático é uma medida semi-quantitativa
(Hankin; Anagnostakis, 1975) resultante da seguinte relação: I.E = diâmetro do halo de
degradação ÷ diâmetro da colônia. Dessa forma, o maior índice enzimático representa
uma maior produção enzimática.

453
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Tabela 1: Índices Enzimáticos dos isolados identificados.

Índice Enzimático (mm)

XEspécie
Amilases Proteases Lipases Celulases

A. niger 1,1 ND 1,4 ND

A. niger agregado ND ND 1,5 ND

A. foetidus 1,05 ND 1,26 ND

A. parasiticus ND ND ND 1,4

A. tubingensis ND ND 1,57 ND

A. aculeatus ND ND 1,57 ND

P. restrictum ND ND ND ND

P. janthinellum ND ND 1,36 1,93

P. multicolor ND ND 1,6 ND

P. spinulosum ND ND 1,17 1,78

P. citrinum ND ND 1,2 1,47

P.simplicissimum ND ND 1,3 1,2

P. decumbens ND ND 1,47 1,4

P. brevicompactum ND ND ND 1,71
ND: Não detectado
Entre os fungos identificados, avaliou-se somente produção significativa de
lipases e celulases com destaque para Penicillium multicolor que apresentou maior
produção de lipases, e para a espécie Penicillium janthinellum que apresentou o maior
índice de produção de celulases. Somente dois isolados produziram amilases, mas com
baixos índices, tal fato pode estar associado aos microrganismos serem nativos do solo,
onde há uma maior abundância de material celulósico e pobre em amido. No caso da
produção de proteases, nenhum isolado identificado apresentou atividade proteolítica,
possivelmente em decorrência de o crescimento ter sido promovido em um meio de
cultura com um substrato muito restrito.

454
 Como mencionado anteriormente, o screening foi também realizado com os
isolados não identificados (morfotipos). Os isolados não identificados podem apresentar
estruturas complexas, ou características não contempladas pela chave de identificação
utilizada, dificultando o processo de identificação do fungo, entretanto, decidiu-se
aplicar os testes enzimáticos uma vez que podem auxiliar em uma posterior
identificação baseada em técnicas mais avançadas, além de que tais espécies poderiam
apresentar potencial biotecnológico.

Tabela 2: Índices enzimáticos dos isolados não identificados

Índice Enzimático (mm)
Morfotipo
Amilases Proteases Lipases Celulases
P. sp w 01 ND ND 1,75 ND
P. sp w1 ND ND 2 1,42
P. sp w2 ND ND ND ND
P. sp w4 ND ND 1,88 1,39
P. sp w5 ND ND ND ND
P. sp w7 ND ND ND 2,13
P. sp w8 ND ND ND ND
P. sp w9 ND ND ND 1,09
P. sp w10 ND ND ND 1,17
P. sp w11 ND ND 1,75 ND
P. sp w12 ND ND ND 1,13
P. sp w13 ND ND 1,18 1,64
P. sp w14 ND ND 1,29 ND
P. sp w15 ND ND ND ND
P. sp w16 ND ND ND ND
P. sp w17 1,13 ND ND 2
P. sp w18 ND ND ND 1,87
P. sp w19 ND ND ND 1,6
P. sp w20 ND ND ND ND
P. sp w21 ND ND ND 1,35
P. sp w22 ND ND ND ND
ND: Não detectado

Em relação aos fungos dos gêneros Aspergillus e Penicillium não identificados,

somente um isolado produziu amilases, possivelmente pela mesma razão citada

anteriormente, nenhum dos isolados apresentou atividade proteolítica certamente pelo

meio de cultivo restritivo. Obtiveram-se resultados nas análises de produção de enzimas

455
lipolíticas e celulósicas, que em alguns casos, apresentaram maiores índices quando

comparados aos resultados dos fungos identificados.

CONCLUSÕES

Diante do exposto, infere-se que os fungos isolados do solo apresentam

potencial biotecnológico de interesse da indústria de alimentos. Os fungos identificados

e não identificados apresentaram potencial enzimático significativo somente para as

enzimas lipases e celulases

AGRADECIMENTO

VALE, CAPES, FAPEMIG, CNPq

REFERÊNCIAS

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Penicillium verruculosum Glucoamylase for Production of Enzyme Preparations with
Enhanced Cellulase Performance. PloS one, vol. 12, no. 1, p. 1-13
CAMPBELL, M. K.2000. Bioquímica. Porto Alegre: Artmed. 149 p.
CORTEZ, D. V.; CASTRO, H. F.; ANDRADE, G. S.S., 2017. Potential catalytic of
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decomposition of plant materials in streams. Journal of bioenergy and food science, v. 2, n.
4, pp. 15- 20.

456
Novel culture medium SPsA (sweet potato-sucralose-agar) for
optimal growth of bacteria and filamentous fungi
Alessandro Lucas do Nascimento Santos1; Matheus Gomes Lessa Feijó1; Raysa Moreira Gama de Souza1;
Daniel Rocha Cordeiro1, Joelma Benigna da Silva Cândido1, Iana Karla dos Santos Ribeiro1, Cícero
Eduardo Ramalho Neto2
1
Molecular Genetics and Proteomics Laboratory – GEMPRO, Federal University of Alagoas
[email protected]
2
Researcher Pos-doc UFAL/CNPq

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
Nutrients prepared for microorganism growth in laboratories are called culture medium.
They are nutritional formulations that serve as natural or artificial substrates intended
mainly for fungi and bacteria culture and also some types of viruses. The semi synthetic
medium PDA (potato-dextrose-agar), consisting of known and unknown components,
has been widely used for centuries in laboratories and clinics around the world. The
development of an alternative and more efficient culture medium, less laborious/time-
consuming and notably cheaper is an innovation which could lead to a revolution of
microbes growing in laboratories. Basically it contains sweet potatoes, sucralose and
agar (for solid media). The procedures are the same applied for PDA using, however,
higher amount of starch with only 150g of sweet potatoes and 20 times less carbon
source per liter. The results revealed a substantial increase in the performance and speed
of growing in all tested fungi and bacteria species. We conclude that this medium is an
efficient alternative protocol to grow microorganisms in laboratories. It is practical,
easier to prepare and also affordable considering the availability and commercial value
of the components in the market.

Keywords: Culture Medium, Sweet Potatoes, Microbiology, Applied Biotechnology,

Sucralose.

Support: Ufal

457
 Sugarcane harvesting systems alter rhizosphere bacterial
communities
Aline Giovana da França1*; Leandro Nascimento Lemos1; Andressa Monteiro Venturini1; Fabiana de
Souza Cannavan1; Caio Augusto Yoshiura1; Siu Mui Tsai1

1
Cell and Molecular Biology Laboratory, Center for Nuclear Energy in Agriculture, University of São
Paulo.*[email protected]

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT

The soil is considered the most diverse and important existing ecosystem. Land-use,
harvesting systems, management, coverage and other factors are associated with
alternations in microbial communities. This includes rhizosphere, as plants can release
different compounds on the surrounding soil so that it can presents unique environments
for microorganisms. However, few studies have been made using sugarcane systems
models to evaluate the impact of harvesting systems on soil microbial communities.
This research examined the bacterial communities present in rhizosphere and bulk soils
in a mesocosm experiment established from green and burnt sugarcane fields and
evaluated through terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) and
metagenomic sequencing. The structure of the bacterial communities exhibited a
separation between the rhizosphere and bulk soils for both managements, altering their
biological parameters. Bulk soils communities from green sugarcane presented higher
richness and diversity than from burnt sugarcane. Nevertheless, rhizosphere
communities from burnt sugarcane undergone an increase of richness and diversity.
These changes include an increase in the relative abundance of Actinobacteria and
decrease of Proteobacteria and Bacteroidetes phyla. Nineteen Actinobacteria families
responded to sugarcane harvesting systems. We hypothesize that these alterations may
be associated with antibiotic production by plants in rhizosphere region. The next step
of this study will be measure the antibiotic genes to validate these results.

Keywords: Bacteria, Agricultural systems, Metagenomic sequencing.

Support: FAPESP, CAPES, CNPq.

458
 Evaluation of the mechanisms of degradation of
lignocellulosic biomass by the basidiomycete fungus
Laetiporus sulphureus
Ana Carolina Piva de Oliveira1,2*; Thiago Augusto Gonçalves1,2, Gabriela Felix Persinoti1, Fabio Squina3
1
Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE). *e-mail: [email protected]
2
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Instituto de Biologia (IB).
3
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) – Faculdade de Engenharia Química (FEQ).

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
Genome, transcriptome and secretome data are important tools to better understand the
organism biology. In this study we analyzed the differential gene expression of brown
rot fungi Laetiporus sulphureus grown in sugar cane bagasse (RAW) and glucose
(GLU) after 24 hours using the RNA-seq approach.
A total of 12.000 transcripts were identified from the fungus transcriptome and all
sequences were compared to the dbCAN database to identify CAZy family members
(http://www.cazy.org). The CAZy is a database that describes enzymes that degrade,
modify, or create glycosidic bonds. The results indicated the expression of 110
CAZymes, including genes required for saccharification of lignocellulose, distributed in
51 families of Glycoside Hydrolases, 16 Glycosyl Transferases, 15 Auxiliary Activities,
9 Carbohydrate Binding Modules, 1 Polysaccharide Lyase and 1 Carbohydrate Esterase.
From Auxiliary Activities family, five genes were differentially identified in RAW in
relation to GLU: pyranose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase (AA3),
peroxidase (AA2) and an AA9. In general, the high expression of genes encoding AA2
and AA9 are not common features in brown rot fungi, indicating a wide diversity of
wood degradation mechanisms by these fungi. The transcriptome analyzes performed
has provided insights on biomass degradation capability of this fungi.

Key words: RNA sequencing, secretome, brown rot fungi, biomass.

Apoio Financeiro: Instituto de Biologia (Unicamp), Capes, CNPEM, FAPESP

459
 Experimental evolution with budding yeast: getting high on
ethanol
Ana Paula Jacobus1; Ewerton Rohwedder2; Jeferson Gross1*
1
Institute for Research in Bioenergy, UNESP, Rio Claro
2
Luiz de Queiroz College of Agriculture (ESALQ), USP, Piracicaba.
*[email protected]:
______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
Adaptive laboratory evolution protocols are valuable tools to select for industrial
relevant traits in yeasts. One important trait sought in industrial yeasts is their tolerance
to high ethanol titers present at the end of very high gravity fermentations, such as for
the production of ethanol as biofuel. We conducted an ethanol survival adaptive
experiment with S. cerevisiae PE-2 by submitting four haploid yeast populations to
harsh ethanol treatments for two hours at 32 °C, followed by a recovery period in an
ethanol-free medium (2-4 days). Cycles of shock/recovery were reinterred with
increasing ethanol content. Starting from an initial shock of 19% (v/v) ethanol (during
which most of the cells died), adaptation progressed through about 70 cycles of
shock/recovery. At the end of the experiment, the four populations were well adapted to
shocks of 28-30% (v/v) ethanol. Competition assays between the evolved populations
and the ancestor show a clear pattern of antagonistic pleiotropy, in which the evolved
strains have much higher fitness than the progenitor to tolerate ethanol shocks, however
are largely outcompeted by the ancestor under normal growth conditions and even
during propagation at 8% (v/v) ethanol. Whole genome sequencing (Illumina MiSeq
platform) suggests a prominent role of trehalose accumulation and RAS/PKA
phosphorelay inhibition in the mechanisms of tolerance to ethanol shocks. Molecular
genetic analysis of key mutations found during whole genome sequencing are currently
underway and will allow a fine understanding of the evolution process.

Keywords: Yeast, Trehalose, Genomics, Ethanol, Evolution.

Support: FAPESP 2013/15743-9.

460
 Sex, alcohol and Darwin: experimental evolution of ethanol
tolerance with fission yeast

Ana Paula Jacobus1; Ewerton Rohwedder2; Jeferson Gross1*

1
Institute for Research in Bioenergy, UNESP, Rio Claro *[email protected]:
2
Luiz de Queiroz College of Agriculture (ESALQ), USP, Piracicaba.

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
Ethanol tolerance of the fission yeast Schizosaccharomyces japonicus was challenge in
our lab by two experimental evolution protocols. First, three clonal and three sexual
populations were propagated (serial transfers) side-by-side for about 2600 generations
under rising ethanol content in the liquid medium. Sex (sporulation) was induced every
150 generations in the sexual lineages. At the end of the experiment, sexual populations
tolerated propagation on 10% (v/v) ethanol, in contrast to the paucity of growth
displayed by the clonal lineages under the same condition. Second, three clonal and
three sexual populations were submitted to harsh ethanol treatments for two hours at 32
°C, followed by recovery in an ethanol-free medium (2-4 days). Cycles of
shock/recovery were reinterred with increasing ethanol content (17% upward).
Remarkably, while one clonal populations is stuck in a low fitness maximum of 25-27%
(v/v) ethanol tolerance, sexual lineages displayed a fast rise in adaptation and have scale
up to a maximum of 63% (v/v). A constitutive mating/sporulation mutant phenotype
underpins the extraordinary adaptation of the sexual populations; i. e., without any
induction, cells undergo a full sexual cycle (mating-meiosis-sporulation) and at the end
release spores that survive the ethanol challenge while vegetative cells perish.
Surprisingly, two clonal populations also developed a constitutive sporulation
phenotype (although mating and meiosis are clearly not present), similarly experiencing
a rapid increase in fitness (currently tolerating about 34-40% v/v ethanol). Genome
sequencing data from all experimental populations is helping us to understand the
genetic basis of their ethanol hyper-tolerant phenotypes.

Keywords: Yeast, Stress, Genomics, Fermentation, Evolution.

Support: Projeto FAPESP 2013/15743-9.

461
 Screening of fungal isolates from Amazon soil
Ana Carolina Glória de Oliveira1; Larissa Aparecida Gonçalves1; Heloiza Ferreira Alves do Prado1*

¹UNESP, Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”, Campus de Ilha Solteira.
*[email protected]

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
Amylases are enzymes that hydrolyze the reserve carbohydrate, starch. Alpha-amylase
is an enzyme that hydrolyzes the α-1,4 bonds of the starch molecule, releasing short
oligosaccharides chain. It is an enzyme with great application in the industrial sector,
mainly in the food industries. Considering the great microbial diversity in different
national biomes, the present study aimed to isolate microorganisms with potential in the
α-amylase production from the Amazon soil. Soil samples were diluted by decimal
dilution in 0.1% peptone water. Then, 100 μL aliquots were distributed by surface
plating under Petri dishes containing sabouraud dextrose agar with 0.5 g L-1
chloramphenicol. The plates were incubated in an oven at 35 °C. After fungal colonies
growth it were transferred to another Petri dish containing the same culture medium, to
purify the culture and then stored in tubes with inclined agar. The enzymatic activity
was determined by the dextrizing method. Twelve filamentous fungi were isolated and
cultivated under solid-state cultivation using wheat bran as substrate. Cultivation was
carried in 250 mL-Erlenmeyr flasks with 5 g of wheat bran moistened with 10 mL of
nutrient solution. The flasks were inoculated with 5 disks of fungal growth for 72 hours.
After the growth the crude enzymatic solution was extracted using 50 mL of deionized
water and used for the enzymatic determination. The isolates AC 17.1A, AC 6.3A and
AC 6.1A showed the highest amylolytic activity with 140.0±6.45, 140.0±17.20 and
124.0±37.5 U mL-1, respectively, indicating potential in amylase production.

Keywords: amylase, solid state cultivation, microbial enzymes, production.

Support: CAPES

462
 Endophytic Bacteria Associated to Tabebuia roseo-alba:
A Promissing Source of Bioactive Metabolites
Ana Claudia Ruela1*; Nadja Fernanda Gonzaga Serrano1; Paulo Teixeira Lacava1; Cristina Paiva Sousa1.
1
Federal University of São Carlos, São Carlos, SP, Brazil. *E-mail: [email protected]
______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
The Brazilian tropical savanna is a biome characterized by plants with unique
characteristics from which endophytic microorganisms can be isolated. Some authors
have shown efficient production of secondary metabolites of endophytic
microorganisms associated with Tabebuia spp. The objective of this study was to
characterize the endophytic bacteria associated with Tabebuia roseo-alba tree, with
biotechnological potential for the production of antimicrobial compounds and enzymes.
A single colony of bacterial TR-1 was grown in YSP2 medium for 48 hours at 37 ° C.
Subsequently, this culture was inoculated into 200 ml of YSP2 for 120 hours. Then the
samples were filtered on a 0.22 μm membrane and lyophilized. The organic fractions
(OF) were separated and concentrated in vacuo and used for the antimicrobial assay.
The presence of antimicrobial activity was determined by the formation of zones of
inhibition around disks. The assay was performed against Staphylococcus aureus,
Candida albicans and Escherichia coli. To assess the presence of extracellular enzymes,
the disks were filled with 10 μl of these fractions and then plated on medium
supplemented with different carbon sources. The plates were analyzed for the formation
of degradation halos after 48 h (amylases, proteases, cellulases and pectinases) and 240
hours (lipase and esterase). The results showed antimicrobial activity, inhibiting the
growth of E. coli and C. albicans, and enzymatic activity of lipase and esterase. The
results showed that an endophytic bacterium associated with T. alba produced bioactive
antimicrobial compounds that can be used for biotechnological applications.
Keyword: Endophytic Microorganisms, Secondary Metabolites, Tabebuia spp.
Support: CAPES

463
 Toxicity of water soluble elements evaluated by yeast
metabolism
Ana Paula Maria da Silva*1; Jessica Aparecida Ferrarezi1; Felipe Gabriel Andrino 1;Marcos Yasuo

Kamogawa1; Simone Possedente de Lira1; Keila Maria Roncato Duarte2.; Luiz Humberto Gomes 1

1
ESALQ/USP, Laboratory of Chemistry of Natural Products, Department of Exact Sciences. *e-mail:
[email protected].
2
IZ, Center for Research in Genetics and Animal Reproduction, Nova Odessa, SP, Brazil.
______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
Due to the great expansion of cities and their unbridled growth and industrialization,
water contamination has been rapidly increasing, resulting in uncontrolled dumping in
rivers and soils, posing a threat to human and environmental health. The objective of
this work is to demonstrate the use of Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) as
bioindicator of the presence of toxic compounds in water, by measuring metabolic
activity through conversion of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) to 1,3,5-
triphenyl formazan (TPF). This yeast toxicity test (YTOX) is based on the rapidity of
this microorganism defense mechanism on exposure to toxic agents, associated with
TTC reagent main property, which is initially colorless and becomes red once it is
reduced to TPF by dehydrogenases and reductases as result of normal metabolism of
yeast. The high homology between yeast and superior eukaryotes allows us to evaluate
relevant aspects related to toxic effects of the compounds evaluated in this methodology
with human biology. Besides being easy to maintain in laboratory conditions and
resistant to small environmental variations, S. cerevisiae is a good bioindicator for
toxicity testing. The results of YTOX with different metals (copper, iron, zinc, cadmium
and aluminum) showed greater sensitivity compared to the results presented by the
germination toxicity test performed with cucumber seeds, and proving that yeast
provides a more refined analysis.

Keywords: Yeast, Metals, TTC / TPF, Bioindicator and Toxicity.

Support: CAPES and FAPESP 2013/12834-3.

464
 Stringent response and fatty acid starvation: Importance and
implications towards drug development
Andre Arashiro Pulschen1*; Diego Emiliano Sastre.1 Frederico José Gueiros-Filho.1
1
Instituição. Instituto de Química, Departamento de Bioquímica, Universidade de São Paulo
*e-mail: [email protected]

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT

Bacterial adaptation towards environmental stress, mainly starvation, relies on the

stringent response, which involves production of the alormone (p)ppGpp. In cells
incapable of producing (p)ppGpp (named ppGpp(0) strains), cells are unable to stop
their metabolism during starvation conditions. It was decided to investigate what
happens to cells that are not able to stop their metabolism when starved for fatty acids,
using the gram-positive model B. subtilis. Fatty acid starvation was performed by using
the antibiotic Cerulenin or conditional mutants for fabF gene. It was observed that wild-
type strains block their cell growth and reduced their cell size and maintain cell
viability. With the absence of (p)ppGpp (using a ppGpp(0) strain, bearing deletions in
all RSH-coding genes), cells are incapable of stopping growth. As a consequence, cells
cannot reduce their size, membrane potential and integrity collapses and cells die, as a
consequence of continuous growth without being capable of synthetizing new
membranes. Data showed that (p)ppGpp plays a key role for B. subtilis adaptation
towards fatty acid starvation and cellular stress. Notably, the bacteriostatic drug Cerulenin
was turned into a bactericidal compound upon lack of (p)ppGpp. Results highlighted the
importance of ppGpp to bacterial physiology and survival in the environment as also
described in metabolic dysregulation that occurs in ppGpp(0) strains. Threfore, it was
demonstrated the potential of targeting ppGpp for new drug development, since the
absence of this nucleotide has dire consequences to bacterial homeostasis and stress
survival.

Keywords: ppGpp, stringent response, B. subtilis, membrane potential, cell death,

antimicrobials

Support: Fapesp 2014/26528-4

465
 Search for the role of eIF5A in endoplasmic reticulum stress
using large-scale proteomic GFP screen in budding yeast
Angélica Hollunder Klippel1*; Natália Moreira Barbosa1; Mariana Marchi Santoni1; Cleslei Fernando
Zanelli1; Sandro Roberto Valentini1
1
Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho"-
UNESP de Araraquara *([email protected])

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
The translation factor 5A (eIF5A) is highly conserved in Archaea and eukaryotes
and is essential for cell viability. Although it was initially suggested a function for
eIF5A in the translation initiation, it was in the elongation step that eIF5A function was
better demonstrated. Recent data from our research group revealed a possible role for
eIF5A in the secretory pathway and endoplasmic reticulum (ER) translocation. In
addition, it has been suggested an activation of the ER stress response upon eIF5A
depletion in mammalian cells. Based on that, it was tested the behavior of a yeast eIF5A
mutant in the presence of dithiothreitol (DTT) and tunicamycin, both ER stress
inducing-drugs. Interestingly, the eIF5A mutant is sensitive to DTT and resistant to
tunicamycin. So, to try to understand the mechanism which leads to the difference in
phenotypes, it was performed a large-scale proteomic screen with those ER stress
inducing-drugs using the ORF-GFP collection of Saccharomyces cerevisiae crossed
with the eIF5A mutant through the synthetic genetic array methodology. Fluorescence
intensities from each individual colony were assayed using a scanning fluorimager to
reveals the differential GFP expression. In the presence of DTT, it was observed 461
differentially expressed genes, with an enrichment for those involved in regulation and
progression of cell cycle. On the other hand, for the tunicamycin it was observed 298
differentially expressed genes, with an enrichment for those involved in vacuole
organization, vesicle-mediated transport and microautophagy. Further analysis using an
more quantitative method will be done to confirm these results.

Keywords: Saccharomyces cerevisiae, yeast genetics, ER stress inducing-drugs, SGA,

Fluorescent protein
Support: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo-FAPESP

466
 Diversity of the genus Penicillium isolated from Quadrilatero
Ferrifero soil
Anielli Souza Pereira1*; Sirlei Cristina de Souza1; Lorena Dutra Silva1; Michele de Oliveira Aragão1;
Suemis Maria Parenti de Souza1; Luis Roberto Batista1; Sara Maria Chalfoun de Souza2; Fátima Maria de
Souza Moreira1
1
Universidade Federal de Lavras. *e-mail: [email protected]
2
EPAMIG
______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT

Soil is considered a mosaic of microhabitats due to its complexity, becoming one of the
main ecosystems for the development of microbial populations. However, almost
nothing is known about its fungal diversity. In this context, the objective was to identify
species of the genus Penicillium of mining area soil. Two soil samples were collected in
the Quadrilátero Ferrífero region. To obtain the microorganisms, dilutions were made
(10-1 to 10-4), followed by plating on surface of media DRBC and DG18. After the
development of the colonies, those that presented distinct macromorphologies were
isolated in MA 2%. The media used for morphological identification were MEA and
CYA at 25°C and CYA at 37°C. After seven days, the colonies were measured; their
characteristics were observed and micrometric data were analyzed and compared with
identification keys. It was obtained a total of 294 isolates of Penicillium, which were
grouped into 61 different morphotypes, being able to identify 9 at species level. The
unidentified morphotypes were stored for subsequent molecular identification. The
predominant morphotype was sp 44 (13.26%), followed by sp 04 (9,18%), sp 01
(6,46%) and sp 26 (6,12%) and the others. Eight isolates showed the production of
pigments ranging from brown (P. aurantiogriseum), orange (P. multicolor), red (P.
purpurogenum, Penicillium sp 23) and yellow (Penicillium sp 17, 18, 19 and 20). The
results that were found may help with the information of the Quadrilátero Ferrífero
region’s mycobiota as well as to point out potential species for biotechnological
applications.

Keywords: microbial population, biotechnological potential, mining area, pigments

production

Support: CNPQ, CAPES, FAPEMIG, VALE S.A.

467
Production and purification of ligninolytic enzymes by Mucor
racemosus CBMAI 847

Bruna Soares Dionizio1*; Dulce H. F. de Souza1

1
Federal University of São Carlos, São Paulo, Brazil. Chemistry Department. * [email protected]

ABSTRACT

Fungi from the marine environment are potential source of ligninolytic enzymes. The
degradation of lignin by fungi is performed by extracellular enzymes such as laccase
(Lac), manganese peroxidase (MnP) and lignin peroxidase (LiP). The search on the
biodegradation of wood and agricultural residues focuses on thermostable biocatalysts.
In this context the production and partial purification of ligninolytic enzymes of marine
Mucor racemosus was evaluated. M. racemosus was grown in saline malt extract
medium at 28°C under stationary condition for 7 days. Then Sabouraud dextrose
medium was added and the agitation was adjusted to 150 rpm. At each 24 hours the
enzymatic activity in culture medium was evaluated for using ABTS 1 mM substrate,
H2O2 0.1 mM and MnSO4 20 mM in sodium acetate buffer 20 mM pH 5.0 for 15 days.
The crude extract was precipitated with 70% ammonium sulfate and the pellet was
resuspended in acetate buffer and subjected to anion exchange chromatography (HiTrap
QFF column) in the ÄKTA (GE) system. Chromatographic eluates were monitored by
ABTS activity assay and denaturant electrophoresis, SDS-PAGE. Maximum activity of
oxidase was obtained between the 6th and 8th day of culture (±13 U/mg). Oxidase
activity was observed both in void and in salt gradient eluted fractions. SDS-PAGE
showed different protein profile, evidencing the presence of different isozymes. The
enzymes and respective specific activity currently undergoes characterization (physico-
chemical, kinetic and mass spectrometry).

Keyword: marine-derived fungi, ligninolytic enzymes, Mucor racemosus, enzymatic

purification.

Support: Capes

468
 Temperature influence on lipase activity of Trichoderma
harzianum immobilized on Celite
Bruna,Akemia Kakiuchi1,2, Vitoria de Jesus Luqueti1,2, Sérgio Henrique Gonçalves Chaves1,3, Breylla de
Campos1, Valéria Marta Gomes do Nascimento 1
1
Universidade Estadual Paulista (UNESP) – Faculdade de Ciências e Letras de Assis. Av. Dom Antonio,
2100. CEP: 19850-900 - Assis/SP, Brasil. *E-mail: [email protected]
2
Escola Estadual Lourdes Pereira, Assis, SP
3
Escola Estadual Carlos Alberto de Oliveira, Assis, SP

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
Lipases are enzymes belonging to the group of hydrolases and catalyze the conversion
of triacylglycerols to free fatty acids and glycerol. However, lipases are distinguished by
the ability to catalyze not only hydrolysis reactions, but also synthesis in aqueous-
restricted media, a property that has increased the potential for the industrial application
of these enzymes. The lipase behavior at different temperatures is one of the essential
parameters for the industrial application of this enzyme. The objective of this work was
to study the effect of temperature on the activity of lipase produced by Trichoderma
harzianum LBBIO-TH1 immobilized on Celite. The microorganism was cultured in
shaken flasks in culture medium whose formulation was determined previously. The
enzyme was immobilized on Celite and used in the enzymatic activity assays. The
enzymatic activity was determined by the hydrolysis of p-nitrophenyl palmitate. The
influence of temperature on the enzyme will be evaluated by measuring the enzymatic
activity at temperatures between 20 and 60 ° C. The activity of the culture supernatant
was 1.2 U / mL. For the immobilization, 48 U of enzyme and 10 g of Celite were used.
The enzyme was completely adsorbed and no enzymatic activity was detected in the
wash buffer. The immobilized enzyme showed activity of 7.6; 9.2; 24; 20 and 44 U / g
Celite, at temperatures of 20.30, 40.50 and 60 ° C, respectively. These results indicate
that the immobilization provided an increase in the enzymatic activity in relation to the
free enzyme, in addition to a protective effect on the temperature action, since fungal
lipases generally do not withstand temperatures between 50 and 60 ° C.

Keywords: industrial application, hydrolysis.

469
 Optimization of β-glucanase production using wastewater
from the pulp industry
Bruna Letícia Martins1*; Luana do Amaral Bovi2; Cynthia Barbosa Rustiguel3; Geisiany Maria de
Queiroz-Fernandes1.
1
Universidade do Sagrado Coração- Pro-Rectory of Research and Post-Graduation (PRPPG), Master's
Program in Environmental Science and Technology, Bauru/SP. *e-mail: [email protected]
2
Universidade do Sagrado Coração- Pro-Rectory of Research and Post-Graduation (PRPPG), Center for
Health, Biomedicine, Bauru/SP.
3
Department of Biology, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto - USP/SP.
______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
The pulp industry is responsible for the production of a large volume of wastewater.
These wastewaters are generated after the chemical bleaching with chlorine stage,
which brings concern due to its toxic nature. The use of byproducts in fermentative
processes to obtain the enzymes has shown promising results, contributing significantly
to production with less cost. The β-glucanases are enzymes that acts in the hydrolysis of
the β-glucans, a polysaccharide constituent of the cell wall of plants and
microorganisms. These enzymes have a great biotechnological potential. The aim of the
study was to optimize the production of fungal β-glucanase using alkaline wastewater
generate from the second bleaching stage of a pulp industry. The enzymatic production
was realized by submerged liquid fermentation using Aspergillus niger (IOC / CCFF
3998) in the culture medium described in the literature with the addition of the
wastewater. The optimized parameters the wastewater concentration (2 to 82%) and
production period (2 to 14 days) were determined and statistically analyzed by factorial
experiment (23). The results were analyzed for protein concentration by Bradford
method, β-glucanase activity was determined using laminarin as substrate and specific
activity (U/mg) was determined by the ratio of protein concentration (mg/mL) and β-
glucanase activity (U/min/mL). It was observed that the wastewater favored the
production in low concentration (2 to 42%) in association with long periods of
cultivation (8 to 14 days). These results are significant because they propose an
alternative for the wastewater reuse, which could be toxic to the environment.

Keywords: enzyme, Aspergillus niger, agroindustrial waste, factorial experiment

470
 Oleyl oleate synthesis by lipase from Burkholderia lata
LBBIO-BL02
Bruno Henrique de Oliveira1,2*, Jérôme Lecomte2, Pierre Villeneuve2, Valéria Marta Gomes do
Nascimento 1,3
1
Universidade Estadual Paulista (UNESP) – Instituto de Biociências de Rio Claro. Av. 24 A,1515. CEP:
13506-900 - Rio Claro/SP, Brasil. *E-mail: [email protected]
2
Centre de Recherche Agronomique Pour le Développement (CIRAD)/SupAgro, UMR IATE F-34060,
Montpellier, France.
3
Universida Estadual Paulista (UNESP) - Faculdade de Ciências e Letras de Assis, Dpto. de Ciências
Biológicas. Av. Dom Antônio, 2100. CEP: 19806-900 – Assis/SP, Brasil.

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
The oil from the jojoba plant (Simmondsia chinensis) is the main biological source of
wax esters for commercial applications since the global ban on whaling. Although it has
a multitude of potential applications, the use of jojoba oil is restricted; the main obstacle
to its large-scale use is its high cost and regional and seasonal availability. Thus,
attempts to synthesize wax esters with low cost raw material and shorter time have
become very important. The oleyl oleate (C36H68O2) is known as the main component of
jojoba oil and has high added value. In this study, we describe the esterification capacity
of B. lata LBBIO-BL02 lipase for oleyl oleate synthesis. The esterification reactions of
oleic acid (100 mmol/L) with oleyl alcohol catalyzed by B. lata lipase were performed
using different alcohol/fat acids molar ratio (1:2, 1:1 and 3:1), at 55 °C using n-Hexane.
Esters and free fatty acids were analyzed by gas chromatography (GC). The fatty
alcohol concentration had no significantly influence to the reaction yield, even in the
molar ratio 1:2 the yield was 45% due to the total alcohol consumption. At the molar
ratios 3:1 and 1:1 the yield reached 84 and 87% after 30 minutes of reaction,
respectively. These results demonstrate the potential of B. lata lipase in bioprocesses to
obtain high added value esters.

Keywords: esterification, oleic acid, jojoba oil.

Support: CAPES (Proc. 6545/2015-07); FAPESP Processo 2014/25361-9

471
 Comparison of the fumigation-extraction and radiation-
extraction methods in the evaluation of microbial biomass C
in cave soil.
Caio César Pires de Paula1*; Mirna Helena Regali Seleghim
1
Departamento de Ecologia e Biologia Evolutiva, Universidade Federal de São Carlos, SP.
*[email protected]
______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT

Soil microbial biomass carbon (MBC) is usually estimated by the fumigation-extraction

(FE) method, based on carbon extraction from fumigated and non-fumigated soil
samples after 24 h with chloroform. This method is not efficient for some
microorganisms and the chloroform is highly toxic to humans. Microwave radiation
may be an alternative to chloroform in the breakdown of the microbial cells. Our
objective was to compare the MBC in cave soil using the FE and the radiation-
extraction (RE) methods. Four samples (10.0 g of soil), collected in São Bernardo III
cave (São Domingos, GO), were submitted to FE method (50.0 mL chloroform; 24 h)
and to RE method (800 J g-1 soil, 11 seconds) to estimate the MBC. The parametric t-
test was used to compare means. The Fligner Killen test was used to evaluate the
homogeneity of variance in the data obtained for each method. The mean amount of
MBC was 217.47 mgC g-1 soil (FE) and 219.61 mgC g-1 soil (RE). There was not a
significant difference between the values obtained in both methods (p = 0.91). The
coefficient of variance of the data was 17.27 (FE) and 0.96 (RE). Although the values of
MBC were similar for the two methods, with RE the coefficient of variance in the soil
samples were lower. So, we conclude that the RE method may be the most adequate to
estimate the MBC, because it offers the following advantages: less variation of data;
shorter time to apply the methodology and lower toxicity to researchers.

Keywords: microbial biomass; subterranean environment; fumigation, radiation; soil.

472
 Marker assisted selection for Pseudocercospora griseola
resistance in common beans
Caléo Almeida1; Gabriel Bonfante1*; Lucas Rossi Lazaretti Novo 1; Alisson Fernando Chiorato 2; Luciana
Lasry Bechimol-Reis1*.
1
Instituto Agronômico, Centro de Recursos Genéticos, Campinas, SP. *email: [email protected]
2
Instituto Agronômico, Centro de Grãos e Fibras, Campinas, SP.

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
The angular leaf spot, caused by Pseudocercospora griseola, is one of the most
important diseases in common beans. Molecular markers can be used as a tool for the
early selection of resistant genotypes. The goal of this work was to undertake the
molecular evaluation of resistance to angular leaf spot in the BC1 AND277 x IAC--
Millennium (Andean x Mesoamerican). Microsatellites and SCARs were genotyped.
The SSR GATS11b previously located at the core of the ALS10.1UC QTL presented
andean alleles, in heterozygous state. The PvM22 also co-located with GATS11b in
Pv10, presented the same allele profile of GATS11b and IAC137 markers, and probably
is in the same region of the core of Pv10, being a very conserved region, with block
behavior and segregation distortion. The SSR-IAC 134 marker, which flanked QTL
ALS2.1UC, presented atypical profile compared to the other amplified SSRs, since it
showed no heterozygotes at all, and most of the genotypes presented IAC-Millennium
alleles (recurrent parent) for this locus. Three SCARs were also amplified: the SH13,
associated with the Phg-1 gene, and the SAA19, showed superiority of Andean alleles,
and the SAB16 had superiority of mesoamerican alleles, the latter two being associated
with the Phg-3 gene. A new molecular selection will be performed in F3BC2 to
evidence the loss or fixation of the same alleles, once most of the loci were in
heterozigous state. We hope to select cultivars with superior resistance by molecular
assessment correlated to the phenotypical evaluation of the disease severity.

Keywords: Angular leaf spot, Breeding, Phaseolus vulgaris

Support: FAPESP and CNPq/PIBIC.

473
 Amino acid supplementation under industrial yeast on
sugarcane bagasse hydrolyzate

Camila de Souza Varize1*; Mariane Soares Raposo1; Renata Maria Christofoleti-Furlan1; Carolina Tieppo
Camarozano1; Osni Florêncio Junior1; Thalita Peixoto Basso1; Elisangela de Souza Miranda1; Ricardo
Luiz Dalia1; Luiz Carlos Basso1.
1
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz | USP *e-mail: [email protected]

_____________________________________________________________________________
ABSTRACT

Inhibitors present in the hydrolyzate is one of the main factors causing

deleterious effects in yeasts, its can act directly on cell functions, depreciating growth,
and ethanol productivity. Studies have demonstrated the beneficial effect of some
supplemental amino acids (AAs) related to tolerance and general stress response of S.
cerevisiae. In this study, we aimed to evaluate the supplementation effect of 20 AAs on
the growth of S.cerevisiae CAT-1 in sugarcane bagasse hydrolyzate. Growth curves
were performed in a TECAN spectrophotometer (D.O. 570nm), by incubation of
microplates under a 2-hour intervals readings at 30°C, till 36 hours. It was added: 10 μl
of inoculum, 20 μl of amino acid (200 mg.L-1 aminic N) and 90 μl of media (105.20 g.L-
1
Glucose, 26.05 g.L-1 Xylose, 1.05 g.L-1 Arabinose, 0.65 g.L-1 Formic acid, 6.68 g.L-1
acetic acid, 0.08 g.L-1 HMF, 1.53 g.L-1 Furfural, etanol 2,54%, 5.11 g.L-1 YNB without
(NH4)2SO4 and a.a., 321.80 mg.L-1 Urea, 708.27 mg.L-1 (NH4)2SO4, 30.08 μg.L-1 Biotin,
30.08 μg.L-1 Folic Acid and 150.38 μg.L-1Riboflavin) to each microplate well. His, Gly,
Asn, Pro and Gln promoted significantly higher growth than the control (0.646). Among
them, His (0.813) and Gly (0.757) showed higher growth than all the others. The μmax
data revealed that His demonstrated higher values over all. The Cys 0.025, Asp 0.022
and Glu 0.02 depreciated growth significantly. It can be concluded that the
supplementation of some AAs is related to higher growth in the evaluated media.

Keywords: Hydrolyzate inhibitors; 2nd Generation Ethanol; Histidine; Cell yeasts;

Stress in fermentation.

Support: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

474
 Time-course proteomics during Aspergillus nidulans growth
on pre-treated sugarcane bagasse and straw
César Rafael Fanchini Terrasan1; Fabiano Jares Contesini1; Jaqueline Aline Gerhardt1; Marcelo Ventura
Rubio1; Mariane Paludetti Zubieta1; André Ricardo de Lima Damásio1*

Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Instituto de Biologia – IB, Departamento de

1

Bioquímica e Biologia Tecidual. Rua Monteiro Lobato, 255 – Cidade Universitária, Campinas - SP,
Brazil. 13083-862. *[email protected]

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
Saprophytic filamentous fungi have extraordinary capacity for producing huge
quantities of extracellular proteins, allowing them to metabolize a broad variety of
polymeric substrates. Large amounts of residual sugarcane straw and bagasse constitute
poorly managed by-products which could be explored for second-generation ethanol
(E2G) production. The enzymatic deconstruction of plant cell walls corresponds to a
main bottleneck for E2G viability, both in economic and process efficiency aspects. The
objective of this work was to evaluate the order of enzyme secretion during A. nidulans
growth, which may be playing an important role in substrate degradation. The fungus
was grown in minimal medium supplemented with Avicel, glucose, steam-exploded
sugarcane bagasse and straw during 24, 72 and 120 h. Extracellular proteins
(secretomes) were analyzed by mass spectrometry in an Orbitrap analyzer. Among the
301 identified proteins 165, 192, 156 and 207 proteins were identified in cultivations
with Avicel, bagasse, glucose and straw, respectively. About 38 proteins were commonly
identified in Avicel, bagasse and straw, and 47 were commonly identified in bagasse and
straw. Considering all identified proteins, 126 corresponded to Carbohydrate Active
Enzymes (CAZymes: 78 Glycosyl Hydrolases, 6 Pectin Lyases, 15 Carbohydrate
Esterases and 27 Auxiliary Activities). The highest protein secretion was observed with
Avicel and straw. In relation to the growth period, the general trend was an increase in
protein secretion with Avicel and straw, while a decrease was observed with bagasse and
glucose. The results showed high potential of the fungus in producing CAZymes and
gave support in targets selection for further functional studies.

Palavras-chave: CAZymes, extracellular proteins, mass spectrometry, plant-cell

degrading enzymes

Support: São Paulo Research Foundation (FAPESP: 2012/20549-4 and 2016/16306-0).

The authors acknowledge the Mass Spectrometry Laboratory at Brazilian Biosciences
National Laboratory, CNPEM, Campinas, Brazil for their support with the mass
spectrometry analysis.

475
 Endoglucanase activity in digestive organs content of
Teredinidae

Daniela Toma de Moraes Akamine1; Daniel de Almeida Cozendey da Silva1; Gabriela de Lima Câmara1;
Thayane Vieira Carvalho1; Michel Brienzo2*

1
Laboratory of Biotechnology (Labio), Metrology Applied to Life Science Division - National Institute of
Metrology, Quality and Technology (Inmetro), Duque de Caxias - RJ, Brazil;
2
Bioenergy Research Institute (IPBEN), Universidade Estadual Paulista (UNESP), Rio Claro-SP, Brazil.
e-mail: [email protected]

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ABSTRACT
Cellulolytic enzymes have been studied in several organisms, such as insects and
molluscs, which can have enzymes endogenously produced or by symbiotic
microorganisms. These enzymes are responsible for breakdown the lignocellulose
material that organisms feed upon, probably with the aim of assimilating the sugars and
nutrients. Moreover, organisms such as teredinids grow up inside of wood and the wood
process perhaps could be related to creating growing space. Endo-β-1,4-glucanase
activity was detected in different organs of the Teredinidae bivalves, including gill and
digestive organs content. The organs of digestive tract and gills were separated, with the
objective to avoid the contamination and each organ had your content separated from
the tissue. The extracts and macerated organs were used to measure the endoglucanase
activity. All the endoglucanase extracts, from organs tissue and contents, showed
maximum activity at 40°C. The maximum activity was observed at pH 5.5 for all the
extracts, except for Intestine tissue that was at pH 6. Moreover, some of the extracts
showed a different profile of the activity as a pH influence, suggesting different
enzymes distribution over the digestive system of the teredinids. The results suggest
further studies as potential to investigate endoglucanase genes from the Teredinidae and
also isolate the microorganism for cellulases screening.

Keywords: Neoteredo reynei; cellulases; wood digestion; endo-β-1,4-glucanase;

optimum activity.

Support: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ);

Brazilian Council for Research and Development (CNPq) (Prometro grant number
550,105/2012–8); Program of Human Resources Formation from Petrobrás (PFRH-
103).

476
 Evaluation of riboswitch theo/metE for gene silencing in
Xanthomonas citri

Danilo Bueno1; Henrique Ferreira1*

Instituição: Universidade Estadual paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Instituto de Biociências/Rio

1

Claro *e-mail: [email protected]

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ABSTRACT
Genetic evaluation of any organism, especially of bacteria, requires tools to enable DNA
alteration with subsequent characterization of emerging phenotypes. Among the
techniques used, expression platforms based on riboswitches represent an excellent
alternative that enable the modulation of gene expression without the need to
remove/insert a coding DNA from/into an organism. Riboswitches can directly control
gene expression at the transcription or the translational levels by just operating on the
RNA coding for a characteristic, and being the switch itself part of this RNA (cis
action): depending on a stimulus, the riboswitch will adopt a structural conformation
allowing (“ON” state) or not (“OFF” state) the progress of transcription or translation.
Our main goal is prove that the riboswitch theo/metE is an efficient tool genetic to
control the expression gene in Xanthomonas citri. Here, we generated three mutants of
Xac with the sequence parA-riboswitch-parB integrated in their genomes, and when
grown in culture medium with theophylline, these mutants will able to abort the
transcription of the parB gene due to riboswitch theo/metE action. The success of this
construction may lead to a disruption of chromossomic segregation in this
microorganism, and the use of riboswitch will be important to new studies involving
ORF genes in Xanthomonas citri, relevant for the survival of this species.

Keywords: Riboswitch, sintetic biology, citrus canker.

Support: FAPESP e CNPq.

477
 Evaluation of the use of commercial biomass for the
treatment of wastewater of a sugar and alcohol industry
Danilo Augusto Polezel1*; Júlio César Zambelle1; Marcelo Zaia Gregório1;
1
Water Tech Soluções Ambientais Ltda. *e-mail: [email protected]
______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
The production of sugar and alcohol represents an impact on the management of water
resources in Brazil, due to the quantities of wastewater generated. If such effluents are
not treated and be used in fertigation or dumped into water bodies, they may
contaminate groundwater or affect the survival of the aquatic ecosystem. The action of
microorganisms degrading the pollutants and using them as a source of nutrients is an
outlet for wastewater treatment. Therefore, the aim of this study was to evaluate the
efficiency of a commercial biomass composed of sugarcane molasses as substrate and
microorganisms Lactobacillus plantarum and Saccharomyces cerevisiae, used in the
wastewater treatment of a sugar and alcohol industry in the city of Jacarezinho / PR,
compound of a system of lagoons, through COD, pH, sedimented and suspended solids,
aiming at reducing the organic matter load during the period from June 2016 (beginning
of biomass application) to December 2016 (end of harvest). The initial and final average
parameters showed high efficiency in the removal of suspended solids from 1,039.05
mg/L to 99.61 mg/L, sedimentable solids from 13.96 mL/L to 0.1 mL /L, increase in
value of pH from 5.6 to 7.9 and removal of the organic load of this water, measured as
COD, decreasing from 4,033.90 mg/L to 207,67 mg/L, presenting values according to
the established by the legislation. The use of commercial biomass presented an
economically viable and sustainable alternative to reduce the disposal of wastewater
from the alcohol and sugar industry in the environment.

Keywords: Biodegradation. Sustainable. Microorganisms. Pollutants.

478
 New hydrazones: Promising compounds against
Mycobacterium tuberculosis

Débora Leite Campos1*, Caio Sander Paiva Silva1; Paula Carolina de Souza1; Pedro Ivo da Silva Maia2;
Fernando Rogério Pavan1.

1
Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” –
Araraquara, SP. Laboratório de Pesquisa em Tuberculose. *e-mail (autor para correspondência):
[email protected]
2
Departamento de Química, Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba-MG, Brazil
______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT

Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis. In

2015, 6.1 million new TB cases were reported to WHO. This situation justifies the
intensive research for new drugs capable to treat TB. Another reason is to find
molecules capable of acting on the two metabolic states that the bacterium may assume
after infection (active and latent), since in current therapy only few drugs are capable to
do that. The aim of this study was to evaluate the potency of four hydrazones (14, 15,
16 and 18) against the bacillus in these different situations. REMA and LORA assays
were used to verify the activity of these compounds against active and latent bacteria,
respectively. It was obtained the Minimal Inhibitory Concentration (MIC 90) that is the
concentration capable of inhibiting 90% of the bacterial growth. In the REMA test the
MIC values were 0.34, 11.89, 1.82 and 5.29 µg/mL for the compounds 14, 15, 16 and
18, respectively and in the LORA assay the MIC values were 1.77, 2.07, 2.35 and 1.78
µg/mL, respectively. These results show that the peripheral groups of the hydrazones
play a role on the activity against the active bacteria, since different values were
observed. However, in the case of the latent bacteria, the compounds were active by the
same magnitude, indicating that the basic structure of compounds is related to their
activity. These findings point out that these hydrazones are promising, because they act
on the two metabolic states of the bacterium and could become a good option for TB
therapy.

Keywords: MIC, REMA, LORA.

Support: CAPES, FAPESP JP 2013/14957-5.

479
Preliminary test for kinetic study of fermentative processes of
lactic acid producing Metschnikovia koreensis G18
Diego Alves Monteiro1*; Vitória Gonçalves Navarrete1; Marcella Donofre Lousa1; Raquel Arantes
Megid1; Roberto da Silva1; Eleni Gomes1

Biosciences, Languages and Exact Sciences Institute – (IBILCE), Júlio de Mesquita Filho University -
1

UNESP, São José do Rio Preto, SP, Brazil

*[email protected]

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
The yeast Metschnikovia koreensis G18 was isolated in the Laboratory of Biochemistry
and Applied Microbiology (Ibilce / Unesp). This is a promising strain for
biotechnological applications due to its ability to produce high value added chemicals,
such as lactic acid, from xylose as a substrate. It is fundamental to know the kinetics of
product formation, substrate consumption, and biomass formation to the development of
an industrial process for this microorganism. However, beforehand it is important to
establish, in a simple way, a strategy that avoids excessive sampling. Therefore, the
technique of 96-well plate culture with automatic optical density readings in a
spectrophotometer was chosen. M. koreensis G18 was grown in 200μL of medium with
2% xylose, at 29ºC and under pH 4.5, 6.5, and 8.5. The incubation time was 70h, and
hourly readings were performed. It was possible to identify the main stages of growth
(lag, exponential and stationary) in all plate cultures at different pH. In the working
conditions of this study, the growth curve shows that the best points for sample
collection are at 0h, 5h, 10h, 20h, 30h, 40h, 50h and 60h. These collection points
guarantees a set of aliquots that allow a wide kinetic study of the fermentative processes
of M. koreensis G18, under the conditions of pH and source of carbon and energy
tested, because it contemplates all the stages of growth.

Keywords: yeast; biotechnology; xylose; fermentation

480
The influence of edible fungi in the total and digestible protein
using agro-industrial wastes as substrate
Eduardo Marin Morales1; Holger Zorn2; Dejanira de Franceschi de Angelis1
1
Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho – UNESP, campus Rio Claro. *e-mail:
[email protected] (autor para correspondência):
Justus-Liebig – Giessen Universität, Institute of Chemistry and Biotechnology of Food, Giessen -
2

Germany.

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ABSTRACT
The use of agro industrial wastes represents an interesting option to increase the
production food and to decrease the generation of wastes. Cassava bagasse (CB) and
leaves (CL) are discarded though they contain high amounts of carbohydrates, proteins,
fat and minerals. To evaluate the possibility of using wastes from cassava to obtain food
with high nutritional quality, a submerged fermentation (SbF) was performed using
edible fungi (Rhizopus oligosporus, Pleurotus ostreatus, Lentinula edodes and Agaricus
blazei) at 24°C. The total amount of protein was evaluated by Kjeldahl method and the
digestibility of the protein was assessed by the growth of the bacterium Enterococcus
zymogenes, an organism that present essential amino acids necessity similar to human
diet. The results obtained to cassava leaves showed the high amount of protein and
digestibility in samples fermented by Pleurotus ostreatus (48.2±6.2 and 38.3±4,9,
respectively); followed by Lentinula edodes (43.5±1.6 and 31.3±1.2); Agaricus blazei
(41.2±1.2 and 29.7±0.8); and Rhizopus oligosporus (41.0±1.4 and 28.7±1.0). The
fermentation of cassava bagasse exhibited a different sequence comparing the fungi
where the highest amount of protein and digestibility was observed in samples
fermented by L. edodes (15.4±1.1 and 11.1±0.8); P. ostreatus (14.6±0.3 and 11.6±0.2);
A. blazei (14.6±0.4 and 10.5±0.3); and R. oligosporus (9.6±0.4 and 6.7±0.3). The results
allowed concluding that the fermentation performed by P. ostreatus (10 days of
fermentation) and L. edodes (20 days of fermentation) could reach products with
interesting amounts of digestible protein with important amino acids, being the P.
ostreatus two times faster than L. edodes.

Keywords: Cassava Leaves; Cassava Bagasse; Relative Nutritional Value; Submerged

Fermentation; Food.

Support: CAPES

481
Production of extracellular biosurfactant/bioemulsifier among
heavy-metal tolerant bacteria

Elane Cristina dos Santos1; Amanda Lys Silva1; Ana Maria López1*
1
Laboratory of Biochemistry of Parasitism and Evironmental Microbiology (LBPMA), Institute of
Chemistry and Biotechnology (IQB) Federal University of Alagoas (UFAL). Campus A.C. Simões, s/n.
57072-900. Maceió-AL, Brazil. *e-mail: [email protected]
______________________________________________________________________________________________
ABSTRACT
Biosurfactants/bioemulsificants (BS/BE) are surface active agents, produced by
microorganisms and largely utilized on various industrial sectors. Such molecules has
been received a growing attention on last decades because of their advantages in
relation to chemical surfactants. The objective of this work was to evaluate the potential
of bacterial strains, isolated from effluent and sludge of Treatment Plant in a sugar-
alcohol industry (Coruripe-AL) and tolerant to heavy metal, to produce extracellular
biosurfactants/bioemulsificants. Eight strains tolerant to heavy metal were selected and
identified by biochemical and molecular characteristics as Pseudomonas EFI,
Arthrobacter EFII, Bacillus EFIII and EFIV, Clostridium EFV, Kurthia LOII
Corynebacterium LOI and LOIII. They were inoculated on minimal broth medium
supplemented with 2 % glucose, during 48 h (180 rpm, 30 ± 1 °C). Then, samples were
centrifuged and the supernatants free of cells used to determinate [H+], the
emulsification index (on toluene and kerosene), drop collapse and total-reducing glicids.
Arthrobacter EFII, Bacillus EFIII and Corynebacterium LOIII were positive for the
drop collapse test. Pseudomonas EFI, Arthrobacter EFII and Clostridium EFV
emulsified the toluene, and Arthrobacter EFII also emulsified kerosene, showing the
best emulsification index (E24= 78.75 ± 0.01 % on toluene and E24= 15.62 ± 0.03 % on
kerosene). Pseudomonas EFI and Arthrobacter EFII consumed more glucose than
others strains under investigation during 48 h. All strains had [H+] close to neutrality,
and generally, neutral pH provides favorable conditions to BS/BE production. Amongst
the investigated strains, Arthrobacter EFII was the most promising for bioremediation
experiments of effluent and sludge.

Keywords: Surface active agents, Microorganisms, Sugar-alcohol industry.

Support: Usina Coruripe and CAPES.

482
 Antimicrobial/antioxidant activity of spices used in shrimp
preparation

Everton Martins1; Ana Maria López1*

1 Federal University of Alagoas (UFAL), Institute of Chemistry and Biotechnology (IQB), Laboratory of
Biochemistry Parasitism and Environmental Microbiology (LBPMA). Campus A.C Simões, s/n. Cidade
Universitária. Maceió-AL-Brasil.*[email protected]

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ABSTRACT
Shrimps are largely usedon gastronomy and once this product has a high content of
lipids and proteins, it can be a target of autolytic and microbial enzymes.The objective
of this work was to determine the antioxidant and antimicrobial activities of peppers
used as spices in shrimp preparation: Myracrodruon urundeuva (Rosa), Capsicum
frutescens (Malagueta), Capsicum baccatum var. pendulum (Dedo-de-Moça) and
Capsicum chinense (Cheiro). The antibiogram was performed using discs impregnated
with samples of the different peppers-hydroalcoholic extracts (10μL of the 20g.mL-1) or
5μg ofloxacin antibiotic (positive control), distributed on Müller Hinton Agar medium
inoculated via pour plate with one of 5 bacterial strains isolated from fresh shrimp
(1.5×108cells.ml-1 each), in Petri dishes. For the antioxidant analysis (content of
phenols, total flavonoids and antioxidant activity by the use of DPPH radical) was used
the spectrometry. The concentrations of the studied extracts were moderately sensitive
to some of the bacteria. In the antioxidant profile, the total phenol and
flavonoidscontents of the peppers “Malagueta” and “Rosa” presented higher
concentrations (58.3-82.6 μg.mL-1 and 200-194 μg.mL-1, respectively), in comparison to
the other species (“Pimenta-de-Cheiro” and “Dedo-de-Moça”). The pepper “Rosa”
presented a more significant antioxidant activity (5μg.mL-1) when compared to the other
peppers tested. Once it is worth mentioning that the content of phenols and flavonoids
can influence the antioxidant profile, the study demonstrates that peppers analyzed can
be used as natural antioxidants in food.
Keywords: Bacteria, Pepper, Hydroalcoholic extracts.

Support:“CNPq” and S. A. “UsinaCoruripeAçúcar e Álcool”

483
 Evaluation of bioactivity of essential oils and hydrolates in
control of Alternaria sp, phytopathogenic fungus isolated from
tomato plants

Fabiane Facchini1; Mariana Costa Pereira1; Rosemeire Bueno1

1
CEUNSP - Centro Universitário Nossa Senhora do Patrocínio ([email protected]).

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ABSTRACT
The tomato tree (Lycopersicum esculentum Mill), belonging to the family Solanaceae,
has a high nutritional value and has substantial agro economic importance. Fungal
diseases of tomato such as early blight, caused by Alternaria solani, consist on the
limiting factor for tomato production due to losses in productivity and quality of
products. To control or prevent most of the diseases, it is used the conventional
treatment with pesticides. However, the increasing demand for plant products free of
chemical residue contamination has encouraged the researching for alternative
methods of control. Thus, the goal of this study was evaluate the effect of hydrolates
and essential oils on phytopathogenic fungi Alternaria sp, previously isolated of
tomato tree, to select plant extracts with antifungal potential. For these, four
hydrolates, geranium (Pelargonium sp), lavender (Lavandula sp), cinnamon
(Cinnamomum zeylancum) and clove (Syzygium aromaticum) and two essential oils,
clove (Syzygium aromaticum) and eucalyptus (Eucalyptus sp) were tested, using
Agar’ Diffusion Methods (with discs and circular perforator). The microorganism test
used was a phytopathogenic fungus previously isolated from a tomato tree and
identified as Alternaria sp, after macro and microscopic analysis. For both evaluated
methods, clove essential oil and hydrolate and cinnamon hydrolate was most effective
in reducing 100% the micelial growth of Alternaria sp in 48 hours. This is indicate the
efficiency of essential oils and hydrolates as fungicides, which makes them a great
perspective as use for plant disease control, after new studies that establish a secure
inhibitory concentration for use in the field.

Keywords: Essential oils, hydrolates, Alternaria, tomato early blight.

484
 Experimental validation of an in silico approach for
prediction of new thermostable GH11 endo-xylanases
Felipe Cardoso Ramos1,2; Vinícius de Godoi Contessoto1; Letícia Maria Zanphorlin2; Vitor Barbanti
Pereira Leite1; Roberto Ruller2*

1
Universidade Estadual Paulista (UNESP) - Instituto de Biociências, Letras e
Ciências Exatas (IBILCE)
2
Centro Nacional de Ciência em Energia e Materiais (CNPEM) - Laboratório Nacional de Ciência e
Tecnologia do Bioetanol (CTBE), Campinas (SP) *E-mail: [email protected]

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
Processing of lignocellulosic biomasses for bioethanol production and others
applications on requires thermostable enzymes able of operating under high
temperatures and long incubation periods. Here, we report the preliminary validation of
an in silico approach for engineering hydrolytic enzymes towards thermostability.
Previous computational simulations of the GH11 endo-xylanase from Bacillus subtilis
(XBS) using the electrostatic interactions optimization (EIO) methodology indicated
three critical residues (K99, R122 and K154) for stability improvement through charge
replacement. In this context, we analyzed the effects of K99E mutation on XBS
biochemical and biophysical proprieties in order to evaluate its contribution for
thermostability and thermotolerance. Both wild-type (XBSWT) and mutant (XBSK99E)
enzymes were produced by heterologous expression using Escherichia coli BL21 cells
and purified by immobilized-metal affinity chromatography (IMAC). The endo-
xylanase activity was quantified through the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) method
employing oat spelt xylan 1 % as substrate, the enzymatic assays were performed on pH
range of 4 to 10, between 20-70 °C. For secundary structures analysis, we performed
circular dichroism (CD) experiments at 20 °C varying wavelength from 195 to 260 nm.
The thermal denaturation temperature (Tm) was obtained by monitoring the residual
molar ellipticity at 220 nm using an increasing temperature gradient (20-90 °C). The
results showed that the K99E mutation was able to increase Tm by approximately 1 °C
and improve enzyme termotolerance without alter XBS optimum conditions (pH 6,0
and 50 °C), suggesting that the EIO approach can be used as starting strategy for design
of new thermoactive endo-xylanases from GH11 family.

Keywords: GH11 endo-xylanase; thermostability; circular dichroism (CD); in silico

design; microbial enzymology

Support: CAPES, FAPESP and CNPq

485
Isolation of Bisphenol A degrading bacteria from an estuarine
environment

Felipe Silva de Santana1* Louise Hase Gracioso1 Bruno Karolski1 Maria Anita Mendes1,2 Jorge Alberto
Soares Tenório1,2 Claudio Oller do Nascimento1,2 Elen Aquino Perpetuo1,3

1 Environmental Research and Education Center, University of São Paulo, CEPEMA-POLI-USP, Conego
Domenico Rangoni Rd, 270 km, Cubatão, SP, Brazil; *[email protected]
2 Chemical Engineering Department, University of São Paulo, POLI-USP, Lineu Prestes Ave, 580, São
Paulo, SP, Brazil;
3 Department of Marine Sciences, Federal University of São Paulo, Imar-Unifesp, Alm. Saldanha da
Gama Ave, 89, Santos, SP, Brazil.

ABSTRACT
Bisphenol A (BPA) is a plasticizer substance present in many household objects made
from plastic. Since this compound is present in our daily routine, exposure to BPA
occurs frequently, mainly at low concentrations, caused by ingestion of food that was in
contact with plastic containers or packaging. Once in the environment, plastic objects
still release BPA which goes into water strengthened contact with people. Even in low
concentrations (ng.L-1) BPA exposure may cause severe damage to the endocrine
system binding to hormonal receptors acting as female hormone. As an important
environmental contaminant coming from uncountable sources spread all over the world,
mitigation studies to remove this contaminant from the environment are essential. One
of the alternatives to remove this xenobiotic from the environment is bioremediation by
selected bacteria isolated from a BPA impacted ambient. With this concept in mind, this
study explored sediments from Santos Estuary System (SES), which represents one of
the most important Brazilian examples of environmental degradation caused by the
largest port in South America (Port of Santos) and a large industrial pole located in
Cubatão city. Sediment analysis from SES revealed the presence of BPA confirming
contamination and microorganism exposition to it. We could isolate four different
aerobic bacteria strains which use BPA as carbon source. Between them, we could find
a strain identified as Shewanella halioti which is poorly related to aromatic
hydrocarbons biodegradation but was able to tolerate up to 100 mg.L-1 of Bisphenol A
and completely biotransform 75 mg.L-1 BPA in 6 hours.

Keywords: Bisphenol A; Bioremediation; Biodegradation

Support: CAPES

486
 Evaluation of Basidiomycetes secretomes in order to search
for new active carbohydrate esterases

Fernanda Lopes de Figueiredo¹; Marcelo Ventura Rubio1; César Rafael Fanchini Terrasan¹; André
Ricardo de Lima Damásio1

Department of Biochemistry and Tissue Biology, Institute of Biology, University of Campinas –

1

UNICAMP ([email protected])

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ABSTRACT
The second-generation ethanol obtained from the conversion of lignocellulosic
biomass to fermentable sugars has been the focus of research, in order to reduce the use
of fossil fuels and increase the use of renewable energy. The objective is to make
possible the use of both energy from plant biomass and by-products of raw material
hydrolysis to produce different chemical blocks. Filamentous fungi stand out in the
secretion of homologous and heterologous lignocellulolytic enzymes. Although
Ascomycetes are widely studied for the secretion of carbohydrate-active enzymes
(CAZymes), Basidiomycetes are still poor explored even they are known as excellent
plant biomass degraders. The role of some CAZymes classes in plant biomass
hydrolysis is still unknown, such as the carbohydrate esterases (CE). There are sixteen
CE families described and only two enzymes have been characterized in the CE16
family. A proteomics study of A. nidulans grown in sugarcane bagasse, carried out by
our research group, showed that a CE16 was the most abundant esterase in this
secretome and the fifth most abundant protein in general. These results suggest the
relevance of CE16 enzymes in plant biomass degradation. In order to analyze the
secretion of CEs in Basidiomycetes and comapare with Ascomycetes secretomes
(previously reported), the strains Trametes versicolor (white rot), Laetiphorus
sulphureus (brown rot) and Pycnoporus coccineus (white rot) will be grown on
microcrystalline cellulose (Avicel) and pretreated sugarcane bagasse. The main
objective is to compare the secretome of these strains to explore new CE16 targets.

Keywords: carbohydrate esterases, Basidiomycetes; CE16; secretome; filamentous

fungi;

Support: CAPES; FAPESP.

487
 Genome features of Serratia marcescens UENF 22-GI: a plant
growth promoting bacterium isolated from vermicomposted
material
Filipe P. Matteoli1, Pollyanna S. Lopes2, Fábio L. Olivares2, Thiago M Venancio1
1
Centro de Biociências e Biotecnologia – UENF – email: [email protected]
2
Núcleo de Desenvolvimento de Insumos Biológicos para a Agricultura – UENF

ABSTRACT

The ongoing increase in world's population and adoption of intensive farming

results in large amounts of organic waste and environmental contamination. In order to
mitigate these damages sustainable approaches are being tested worldwide, many of
these focused on soil management. In this context vermicomposting is a widely known
practice to biologically stabilize green wastes using earthworms to perform waste
stabilization. Further, vermicompost has been demonstrated to be a rich source of
microbial diversity, notably plant growth promoting rhizobacteria (PGPR). These
bacteria are able to promote plant growth both directly or indirectly. In this work we
report the sequencing and analysis of Serratia marcescens (strain UENF-22GI) isolated
from vermicomposted material. Paired end reads were sequenced in a Illumina HiSeq
2500 platform and assembled using Velvet, resulting in a 5,001,584 Mb assembly with
3,0 Mb N50. By annotating the genome with RAST, we found 4662 genes, 30
pseudogenes, 6 rRNAs, 84 tRNAs. We did a comparative genome analysis and
phylogenetics reconstruction using other publicly available Serratia marcescens
genomes, we also found PGPR genes like ipdC for auxin production, pqqBCDEF for
pyrroloquinoline biosynthesis involved in P solubilization, bcs and pga operons which
code biofilm proteins, and others genes related to soil survival and fungal competition.
As a whole, our results indicate a biotechnological potential of S. marcescens in plant
growth promoting products and shed light on a complex species formely known only as
human pathogen.

Keywords: Genomics, assembly, PGPR

Support: CAPES, FAPERJ.

488
 Evaluation of the anti-bacterial activity of vegetable oil esters
against Xanthomonas citri subsp. citri

Gabriela Mendonça Paula1, Gabrielle Vieira1, Luana Galvão Morão1, Henrique Ferreira1, Salvador Claro
Neto2, Daiane Cristina Sass1, Antônia Marli dos Santos1
1
Departamento de Bioquímica e Microbiologia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”, São Paulo, Brasil.*e-mail (autor para correspondência):[email protected]
2
Instituto de Químicade São Carlos, Universidade de São Paulo.

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ABSTRACT
As bacteria of the Xanthomonas genus affect important crops in Brazil and the control
of the diseases is carried out by practices with negative impacts on the environment and
health, alternative treatments for these phytopathogens are needed. Citrus canker, one of
the major concerns due to the great economic importance of citrus exports to the
country, is a disease caused by Xanthomonascitri subsp. citri. The present study aimed
to evaluate the inhibitory effect of a mixture of plantesters, provided by Cequil Central
de Industrialização e Desenvolvimento de Polímeros, in Xanthomonas citri subsp. citri.
The bacteria were cultivated in Nutrient (N) culture medium at 29ºC and 200 rpm
overnight for the bioassay. Analysis of the inhibiotry action of the esters against the
bacteria was performed by the Resazurin Microtiter Assay method (REMA), in
concentrations ranging from 3% to 96%. For positive control, kanamycin was used and
for negative control culture medium containing Xanthomonas citri subsp. citri. Growth
inhibition was verified through resazurin fluorescence; inhibition with the ester mixture
was greater than detected in positive controls, with a mean of 97.7% inhibition at esters
concentrations greater than 9%, while the mean of the positive control was 96%. The
esters of vegetable oil presented positive and satisfactory results in different applied
concentrations.

Keywords: Inhibition, Xanthomonas, bioassay, esters, citrus.

Support: FAPESP

489
 Ethanol fermentation of fungal extract by solid-state
cultivation of Trichoderma reesei from sugarcane bagasse
Gabriela Chaves da Silveira1; Beatriz Silva Campanhol1; Hiléia Camargo Ribeiro França1; Reinaldo
Gaspar Bastos1*
1
Centro de Ciências Agrárias (CCA), Universidade Federal de São Carlos (UFSCar).
*[email protected]

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ABSTRACT
Solid-state cultivation (SSC) may be defined as the microbial growth on solid supports
in conditions of absence of free water, i.e., mainly similar to the occurrence of fungi in
nature. In this sense, many lignocellulosic materials are used as solid supports and,
which when consumed by the microorganisms, lead to the release of part of the organic
carbon generally as glucose which could be recovered in a final extract. Trichoderma
reesei is a fungus with recognized capacity of hydrolytic enzyme production with
glucose release, which could be use in fermentation processes. Saccharomyces
cerevisiae PE-02 is a strain of yeast widely used ethanol fermentation from sugarcane
broths in Brazil, precisely because of its stability and resistance to industrial conditions.
Thus, the aim of this research was to evaluate the “second generation” ethanol
fermentation by Saccharomyces cerevisiae PE-02 of fungal extract obtained from SSC
of sugarcane bagasse by Trichoderma reesei. Fermentative assays were performed in
triplicate with 10 mL of fungal extract (culture medium) 100 rpm and 27°C. The
glucose consumed was determined by the enzymatic glucose oxidase-peroxidase
method, while ethanol produced was determined by gas chromatography. Results
indicated 0.22 g L-1 of ethanol in 48 hours with depletion of glucose, leading near the
stoichiometric yield. Thus, it can be suggested that there was no inhibitory component
in fungal extract, which indicates advantages of obtaining the “second generation”
ethanol when compared to the methods that use acid hydrolysates.

Keywords: ethanol fermentation, solid state cultivation, Trichoderma reesei,

Saccharomyces cerevisiae, sugarcane bagasse

Support: FAPESP

490
 Methodological adequacy to evaluate the reaction of common
bean cultivars to Pseudocercospora griseola

Gabriel Bonfante1*; Caléo Almeida1; Bianca Cristina de Deus2; Lucas Rossi Lazaretti Novo 1; Elaine
Aparecida de Souza3; Alisson Fernando Chiorato 1; Luciana Lasry Bechimol-Reis1.
1
Instituto Agronômico, Campinas, SP. *email: [email protected]
2
Instituto Biológico, Centro Experimental Central, Campinas, SP.
3
Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras, MG.

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ABSTRACT
The angular leaf spot, caused by Pseudocercospora griseola, is one of the most
important diseases in common bean. This study was carried out aiming to adequate the
methodology for selecting resistant genotypes. The experiment was performed in
factorial design 2 (cultivars) x 2 (isolated) x 2 (concentrations), with 3 repetitions. The
cultivars IAC-Milênio (susceptible) and AND 277 (resistant) were inoculated with the
Psg 51 and Psg 99 isolates, 2 x 104 and 4 x 104 conidia/mL, on the primary leaves, at the
end of V2 phenological stage. The severity of the disease was evaluated at 11, 12, 13,
14 and 15 days after inoculation using a diagrammatic scale (1 to 9) that was first used
for initial V2 stage, and the area below the disease severity progress curve was
calculated (AACPD). It was verified that both genotypes and AACPD was mostly
differentiated at the 15th day, corroborating with literature reports at initial V2 and/or
V3 stages. There was a significant interaction between isolate and cultivar factors, and
the AND 277 genotype was the most immune one, while the Psg 51 isolate provided the
highest severity scores at the 4 x 104 conidia.mL-1 concentration. This study allowed the
adjustment of the evaluation method for angular leaf spot, in common beans, at an the
initial V2 phenological phase, with plants less affected by other diseases. Due to the
evident parental contrasting feature, this approach may be used with superior efficiency
to phenotype the AND 277 x IAC-Milênio F3RC2 mapping population.

Keywords: Phytopathometry, Angular leaf spot, Breeding, Phaseolus vulgaris, Primary

leaves.

Support: FAPESP and CNPq/PIBIC.

491
 Construction of an ultrasensitive arsenic biosensor through
synthetic biology approaches
Gabriel Lencioni Lovate1, Letícia Magalhães Arruda2, Lummy Maria Oliveira Monteiro2, Luísa
Czamanski Nora2, Rafael Silva-Rocha2*
1
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
2
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
*e-mail (for correspondence): [email protected]

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ABSTRACT
The environmental pollutant arsenite is present in water fountains worldwide. For this
reason, cheap methods for its detection are of great interest. Due to its widely
distribution, several resistance systems can be found in microorganisms, such as the
arsRBC chromosomal operon from Escherichia coli. The Synthetic Biology approach
has the objective to design, build and test genic synthetic circuits using the
engineering’s rationale for biotechnological and biomedical applications. One of its
applications is the construction of whole cell-based biosensors. In this case, a cell reacts
to the presence of a substance with the production of a quantifiable signal. Using this
approach, the main objective of this work was the construction of an ultrasensitive
arsenite biosensor implementing a genic circuit with cascade amplification and dual-
reporter scheme. For this, we constructed a circuit divided in two vectors: pSEVA331-
ParsR::xylRΔA and pGLR2-Pu. The pSEVA331-ParsR::xylRΔA (the sensor module)
plasmid harbours the Pars/arsR system for arsenite detection and leads to the
expression of XylRΔA, which promotes the transcription of the reporter genes (GFP and
luxCDABE) in pGLR2-Pu (the reporter module). Using conventional molecular biology
techniques, pGLR2-Pu was built by inserting the Pu promoter amplified from
Pseudomonas putida mt-2 into pGLR2 plasmid. The sensor module is being built into
the high-copy number vector pSEVA242, until now the xylRΔA regulator from P. putida
and the Pars promoter from E. coli were cloned into pSEVA242, obtaining pSEVA242-
Pars::xylRΔA. The circuit built is innovative and must be ultrasensitive, while there is
no documented arsenite biosensor with its amplification architecture.

Keywords: Synthetic biology, arsenite, biosensor.

Support: FAPESP scholarship number 16/11093-8 to Gabriel Lencioni Lovate

492
 Growth and stability of immobilized Desmodesmus
subspicatus in alginate beads for cultivation in vinasse

Geise Cristina de Jesus1; Reinaldo Gaspar Bastos2; Mariana Altenhofen da Silva2

1
Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal e Bioprocessos Associados,
CCA/UFSCar, Araras/SP. Autor para correspondência: [email protected]
2
Universidade Federal de São Carlos, Departamento de Tecnologia Agroindustrial e Sócio Economia
Rural
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ABSTRACT
In biotechnology, immobilized microalgae shows a growing trend, being applied in
bioremediation of wastewaters, such as vinasse, aiming the incorporation of nutrients.
Advantages of immobilized cells are facilitation of biomass harvesting and possibility to
work in continuous systems. Desmodesmus subspicatus have been cultivated as free and
immobilized cells in wastewater showing high cell viability, tolerance to pH and
temperature fluctuations, and similar specific growth rates (µmax). Alginate beads (AB)
have physical characteristics dependent on factors including crosslinking agent (CA)
and cell type and concentration. The aim of this study was to develop AB for
immobilization of Desmodesmus subspicatus and evaluate its growth in vinasse.
Sodium alginate (5% w/v) and calcium chloride, CaCl2 (2, 5 and 10% w/v) were used as
biopolymer and CA, respectively. AB and immobilized microalgae beads (MB) were
made by ionotropic gelation. The stability of the beads was evaluated at 25°C for 120h
by immersion in sterilized vinasse. Average diameter and force to compression were
measured at pre-established intervals. Microalgae was immobilized using 5% CaCl2.
AB formed with 2% CaCl2 had higher swelling in vinasse compared to other CaCl2
concentrations. The use of 5% CaCl2 seems to be the most promising result since the
beads showed higher mechanical resistance and similar average diameter compared to
beads formed with 10% CaCl2. MB showed lower mechanical resistance and average
diameter than AB. Immobilized microalgae were able to growth in vinasse with a µmax
of 0.017 h-1, indicating good perspectives to the use of the MB in vinasse.

Keywords: Biopolymer, crosslinking agent, microalgae, wastewater.

Support: CAPES

493
 Trophic and microbiological conditions of an artificial
receiving system for aquaculture wastes
Gislaine Costa de Mendonça1,2*; Lúcia Helena Sipaúba-Tavares 1
1
University of São Paulo State-UNESP, Limnology and Plankton Production Laboratory.
2
Postgraduate Program in Aquaculture, Aquaculture Center, Postal Code 14884-900, Jaboticabal SP
Brazil.
∗ Corresponding author: [email protected]
______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
The expansion of aquaculture has transformed aquaculture into an important water
pollutant. The excessive accumulation of inorganic nutrients such as nitrogen and
phosphorus causes eutrophication and the degradation of water ecosystems. Pathogenic
microorganisms from incorporated or excreted wastes may be found in the water and
sediments of fish ponds. Current analysis, conducted in a fish pond that receives 65% of
effluents from an aquaculture farm, assesses the contamination of total coliforms and
the trophic conditions of an artificial receiving system for aquaculture wastes.
Fortnightly collections were undertaken during eight months at three different sites
(entrance, center with the greatest depth and exit) of the pond. Water was collected from
the surface in sterilized flasks and parameters measured on the spot. Concentration rates
of inorganic solids were higher than organic ones, with high rates of conductivity and
fluctuations similar at all sites. Phosphorus and total nitrogen showed a similar pattern.
High densities of total coliforms were reported with a gradual decrease between sites.
High rates of nutrients, conductivity and suspended solids at the pond´s entrance may
have been caused by high organic load, whereas decrease occurs at the center and exit,
with the dilution and assimilation of the organic material. However, there were no
significant differences (p>0.05) between the evaluated sites. Indexes classify the pond
as hypereutrophic with high microbiological contamination risks. The above reveals that
the system´s self-purification capacity is limited and water treatment should be
implemented prior to reuse or dejection into the receiving streams.

Keywords: water quality; trophic conditions; microbiological contamination;

aquaculture wastes.

Support: CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior.

494
 Poison and infections food caused by microbial agents
Igor Vaz dos Santos1; Rosana Oliveira Freguglia2*

1
Faculdade de Tecnologia “Deputado Roque Trevisan” – Fatec Piracicaba. *E-mail:
[email protected].
2
Faculdade de Tecnologia “Deputado Roque Trevisan” – Fatec Piracicaba.
______________________________________________________________________________________________
ABSTRACT

Foods are essential sources of macromolecules responsible for innumerable metabolic

functions, which play an important role in sustaining a living organism. However, food
may contain undesirable physical, chemical or biological substances, which may
represent a risk to public health, a biological risk, presents as the main cause of
diseases, the so-called DTA's. In the last decades, the dietary habits have undergone
changes and, therefore, strict standards for the control of the quality of the products are
required for the agribusiness. Since microbiological safety is a determinant factor for
the quality of food products and for public health, this work has the objective, through
the bibliographic review, mediated by the formulation of questions of the studio, by the
summarization, analysis and interpretation of articles And books, to explain the main
pathogenic microorganisms associated with food, Clostridium botulinum and
Salmonella enteritidis, and foods susceptible to their transmission. On the subject of
toxinfections and the risk of DTAs, one can point to the severity of food contamination
and its effect, either through outbreaks or in isolated cases, and it is observed the need
for an awareness by public agencies and related professionals To the area of food on the
importance in spreading this knowledge to the population, directly affected by this
serious public health problem.

Keywords: Foods; Food poisoning; Contamination; Clostridium botulinum; Salmonella

enteritidis.

495
 Oxygen transfer in heterotrophic cultivation of unicellular
and filamentous cyanobacterium from vinasse
Isabely Fernanda Pizarro1; Jéssica Cristina Fonte1; Reinaldo Gaspar Bastos1*
1
Centro de Ciências Agrárias (CCA), Universidade Federal de São Carlos (UFSCar).
*[email protected]

______________________________________________________________________________________________

RESUMO
Researches indicate heterotrophic metabolism in some strains of cyanobacteria,
allowing their application in the incorporation and consumption of organic molecules
and nutrients in wastewater. Some enzymes of the Krebs Cycle are detected with
extremely low activities and the metabolism in the dark is linked to the presence of
oxygen, and the main route is via pentose phosphate. On the other hand, few studies in
the literature evaluate the oxygen consumption by these microorganisms. Thus, the aim
of this research was to evaluate of the oxygen transfer and consumption in the
cultivation of unicellular cyanobacterium Aphanocapsa holsatica and filamentous
cyanobacterium Geitlerinema sp. in vinasse, which the main wastewater in the
sugarcane processing. Two liter volume of the vinasse with adjusted pH (7.6) and C/N
ratio (5) was added to the batch bioreactor with on-line monitoring of oxygen and
carbon dioxide. Experiments set up 300 mg L-1 of inoculum, 25oC, aeration 1 VVM and
200 rpm. Results for Aphanocapsa indicated the oxygen consumption according to zero
order kinetics (non-limiting), with a rate of 0.11 mg L-1 min-1, as the overall gas-liquid
oxygen transfer coefficient (kLa) around 0.0126 s-1. Geitlerinema present higher oxygen
rates (1.14 mg L-1 min-1), while kLa around 0.024 s-1. Although the oxygen
consumption, the bioreactor provides more oxygen than the demand both of
microorganisms, indicating an optimal aeration system and low consumption by
cyanobacteria, even in heterotrophic cultivation with medium rich in organic matter
such as vinasse.

Keywords: cyanobacterium, Aphanocapsa, Geitlerinema, vinasse, oxygen transfer

Support: CNPq

496
Microorganism isolation for enzymatic activity verification as
a form of waste industry process
Jair Rosário do Nascimento Junior1; Isabelle Moreira1; Francine Valenga1
1
Pontifícia Universidade Católica do Paraná. *e-mail: [email protected]

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
Due to the importance of enzymes in industrial environment and the constant search for
new biotechnological production routes, this work aims to isolate microorganisms in
order to test their enzymatic potential on biofuels waste. From beet and cabbage rotting
vegetables, isolations are being made through the striation method in solid medium,
using Agar Nutrient, Agar Saboraud and PDA. In all three of the media it was searched
for microorganisms that may produce enzymes such as lipase, protease, celullase and
xanthanase. A more specific media for the possible isolation of bacteria like
Xanthomonas campestris are being studied. Media for observation of enzymatic activity
was prepared using materials containing proper substrate in which the enzymes must
act, such as vegetable oils, skimmed-milk powder, carboxymethylcellulose and xanthan
gum. Certain types of colonies were isolated, however, mold with a cotton appearance
isolated from the beet has been the most promisor because of its intense lipolytic
activity. The phosphorescence of its medium when submitted to ultraviolet light proved
the presence of lipase in these molds. Some other yeasts colonies were isolated but all
of them have shown minimal or none significant enzymatic activity in the specific
media that were prepared. It is concluded that it is possible to find microorganisms with
commercial potential in natural sources. Besides, it is possible to attempt to use these
microorganisms to verify their effectiveness in wastes processing from industry, like
crude glycerol resultant from the biodiesel production, thus reducing the environmental
impacts caused by the disposal of processing residues.

Keywords: Enzymes. Enzymatic Potential. Industry Wastes.

Support: Pontifícia Universidade Católica do Paraná

497
 Use of MALDI-TOF mass spectrometry for bacteria
identification present in composting
Jamily de Almeida Nascimento Silva1*; Jéssica Marques Coimbra1; Rafael Carvalho Amaral1; Hebe
Freire1; Beatriz Ferreira Carvalho1; Leonardo de Figueiredo Vilela1; Rosane Freitas Schwan1
1
Departament of Biology, Federal University of Lavras, Lavras, MG, Brazil. *[email protected]

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT

The correct disposal of solid waste is currently one of the main environmental demands
on the planet. Thus, the treatment and final destination of solid waste has become an
issue in social and environmental policies. Composting is a simple option for growing
amounts treatment of solid waste, corresponding to a natural biological process
transforming organic waste into a stable product with a low amount of organic matter,
which can be recycled as fertilizer organic agriculture or as a corrective for degraded
soils. During this process, several groups of microorganisms act in the transformation of
organic compounds. Bacteria have the most important role in composting degradation,
degrading some compounds (such as sugars and carbohydrates), being also responsible
for the availability of nutrients and nitrogen fixation. Therefore, the objective of the
present study was to isolate and identify the bacteria present in organic waste
composting samples generated by the University Restaurant of the Federal University of
Lavras/MG. Isolation, morphological and biochemical characterization and
identification with matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) time-of-flight
(TOF) mass spectrometry (MS) of bacteria isolated from composting were performed.
From the biochemical tests, it was observed higher occurrence of microorganisms Gram
positive (90.3%), catalase positive (75%), oxidase negative (85%), motility positive
(90%) and sporulation positive (70%). MALDI-TOF results enable to identify 5 species,
Pseudomonas aeruginosa (1.5x104 CFU/g), Enterobacter asburiae (6.7x103 CFU/g),
Staphylococcus sciuri (2.3x103 CFU/g), Acinetobacter pitii (1.7x103 CFU/g) and
Stenotrophomonas maltophila (1.7x103 CFU/g), with the species P. aeruginosa
corresponding to approximately 39.5% of the population analyzed in this study.

Keywords: solid waste, composting, bacteria, MALDI-TOF

Support: CAPES, CNPq, FAPEMIG

498
 Use of waste coffee processing for carotenoids production
Jéssica Marques Coimbra1; Mariana Dias1; Marcela Magalhães Melo1; Rosane Freitas Schwan1; Cristina
Ferreira Silva1*.
1
Universidade Federal de Lavras * [email protected]

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ABSTRACT
The interest in the biotechnology area to obtain non-vegetable sources of dyes has been
growing in recent years, that natural pigments of microbial origin present is promising
alternative to other additives. Coffee is the second largest commodity traded in the
world and generates during processing and hulling large quantities of by-products such
as pulp and husk, which have limited applications such as fertilizers and animal feed. In
view of this, the objective of the work was to the use of extracts of pulp and coffee husk
as carbon source for the production of carotenoids by Rhodotorula mucilaginosa
CCMA 0156. The yeast strain used belong the Collection of Culture of Agricultural
Microbiology (CCMA/UFLA). Initially, the yeast was reactivated in 1 ml of YEPG
medium and incubated at 28°C for 48h. The inoculum, at concentration of 10% (v/v),
was transferred to two different fermentation media containing the pulp extract and the
coffee husk extract. Carotenoid production was performed in Erlenmeyer containing
300 ml of medium inoculated with 107 cells/ml and incubated at 28°C at 160 rpm for 5
days in the dark. The total carotenoid production by yeast in pulp extract was 16.36 mg
L-1 and in the husk extract was 21.35 mg L-1. Residues from coffee processing are cheap
and potential substrates for the production of yeast biomass and accumulation of
carotenoids. Further work will be carried out for chemical profiling of the carotenoid
obtained.

Keywords: Rhodotorula mucilaginosa, Pigments, Coffee husk, Coffee pulp.

Support: FAPEMIG, CNPq and CAPES.

499
Production of extracellular hydrolases and of bioflocculant of
Bacillus thurigiensis-BDLJ2

Jéssica Gouveia1; Amanda Lys Silva1; Elane Cristina dos Santos1; Everton Martins1; Ana Maria López*1
1
Laboratory of Biochemistry of Parasitism and Enviromental Microbiology (LBPMA), Institute of
Chemistry and Biotecnology (IQB), Federal University of Alagoas, Campus A.C. Simões, s/n, CEP
57072-970, Maceió-AL. *e-mail: [email protected]
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ABSTRACT
The genus Bacillus possess varied characteristics, especially its high growth rate and the
ability to secrete various products of industrial/commercial interest (enzymes,
biosurfactants, bioplastics and bioflocculants). In this work we evaluated the production
of extracellular cellulases, proteases and lipases, as well as bioflocculants, by Bacillus
thugiriensis-BDLJ2. The strain B. thugiriensis-BDLJ2 was isolated from soil (Atlantic
Forest,Coruripe-AL) and maintained in the bacterioteca from the LBPMA (“Laboratório
de Bioquímica do Parasitismo e Microbiologia Ambiental”,UFAL). It was inoculated
(1x108 cells/mL) and monitored for enzymatic activities and bioflocculant production in
the following media, before being incubated (160 rpm, dark, 37 °C, 120h): 1) Cellulase
(gL-1): CMC 10,0; Peptone 1,0; (NH4)2SO4 2,0; KH2PO4 2,0; Urea 1,0; MgSO4.7H2O
0,5; CaCl2.2H2O 0,4; Trace-element solution 1mL; 2) Protease (gL-1): Glucose, 5,0;
Peptone 7,5; MgSO4.7H2O 5,0; KH2PO4 5,0; FeSO4.7H2O 0,1; 3) Lipase (gL-1):
Glucose 10; NaCl 5; CaCl2.2H2O 0,1; Tween 80 (1:100); 4) Bioflocculant (gL-1):
Glucose 20,0; Urea, 0,5; Yeast extract 0,5; (NH4)2SO4 0,2; K2HPO4 5,0; KH2PO4 2,0;
NaCl 0,1; MgSO4.7H2O 0,2. Aliquots (4 mL) were collected every 24 h to check the dry
biomass, pH and tested activities. As the dry biomass increase significantly along the
time, in the different media, a parallel significant production of enzymes and
bioflocculant has occurred, just as the cells consume the energy reserves and adapted
themselves to the environment. The initial pH 7 has changed during 120 h, remaining
within the range of neutrality. The strain B.thugiriensis BDLJ2 has potential for the
wastewater treatment or in manufactures. More studies are being provided.
Keyword: flocculation, hydrolytic enzymes, bacteria
Sponsor: “CNPq” and “S.A. Usina Coruripe Açúcar e Álcool”

500
 Rosemary on polymicrobial biofilms of Candida albicans and
Streptococcus mutans
Jonatas Rafael de Oliveira1, Leandro Wagner Figueira1*; Luciane Dias de Oliveira1
1
Universidade Estadual Paulista (UNESP). Instituto de Ciência e Tecnologia (ICT). Departamento de
Biociências e Diagnóstico Bucal. Av. Francisco José Longo, 777 – Jardim São Dimas. São José dos
Campos/SP. *e-mail (autor para correspondência): [email protected]

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ABSTRACT
Rosemary comes from Mediterranean region, however, can be found all over the globe.
This plant presents several biological activities, such as antimicrobial, anti-
inflammatory and antioxidant. The present study evaluated the action of rosemary
extract on polymicrobial biofilm composed by C. albicans and S. mutans. For this end,
suspensions of C. albicans (ATCC 18804) and S. mutans (35688) were prepared in
saline solution (0.9% NaCl) at 107 CFU/mL (colony-forming units per milliliter). In a
microtiter plate, it was added 100 μL/well of each suspension and the biofilm was
formed for 48 h under agitation (75 rpm). Posteriorly, there was exposure for 5 min to
rosemary extract (200 mg/mL) or to saline (0.9% NaCl), with n = 10/group. The
antibiofilm activity this extract was analyzed by colorimetric test with MTT solution
(0.5 mg/mL PBS). After 1 h of incubation, the microplate was taken to the microplate
spectrophotometer (570 nm) and the data were statistically analyzed by T-Test (P ≤
0.05). The viability of polymicrobial biofilm was reduced to 48 ± 14% after treatment.
Thus, it can be concluded that the rosemary extract presented an antimicrobial effect
with effective reduction of polymicrobial biofilm formed by C. albicans and S. mutans.

Keywords: Antibiofilm activity; Mixed biofilms; Plant extract.

501
 Electrolytic Treatment of a Simulated Textile Effluent and
Toxicology Bioassay with Saccharomyces cerevisiae
José Rubens Moraes Júnior1*; Ederio Dino Bidoia1
1
UNESP – São Paulo State University, Department of Biochemistry and Microbiology, IB, 24 A avenue,
1515 - Bela Vista, Rio Claro - SP, Brazil. *[email protected]

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ABSTRACT
The textile industry discharges large amounts of colored effluent in water bodies during
its dyeing processes. Those effluents can cause environmental problems which can lead
to death of the aquatic life. The electrolytic process has been presenting as an alternative
to degrade color of textile effluents. The aim of this study was to degrade, by an
electrolytic process, the color of a synthetic textile effluent containing Acid Red 151 dye
and verify its toxicity with a Saccharomyces cerevisiae bioassay. The synthetic effluent
was prepared using sodium chloride, sodium carbonate, and the textile dye in deionized
water. The electrolytic process consisted on passing the synthetic effluent through a
commercial electrolytic cell. Samples were collected at 0, 3, 5, 15, 30 and 40 minutes.
Sample were submitted to a spectrophotometric analysis to verify the discoloration.
Sodium thiosulfate was added to neutralize residual chlorine generated during the
process. A suspension of S. cerevisiae cells was prepared by diluting commercial tablets
in deionized water. It was added 1 ml of the suspension in 9 mL of each sample and
incubated for 72 hours at 28 ± 0.1 °C. Samples were then colored with erythrosine and
dead cells were counted in a Neubauer chamber. The electrolytic process presented high
discoloring of the textile effluent and, within 15 minutes of treatment, no initial color
was detected. The bioassay with S. cerevisiae presented low toxicity for the entire
treatment. It was concluded that this electrolytic treatment is viable in degrading color
and do not increase toxicity.

Keywords: Advanced Oxidative Processes. Ecotoxicology. Wastewater. Textile Dye.

Support: The support of CAPES and CNPq is greatly acknowledged.

502
 Fermentative parameters in Saccharomyces cerevisiae

José Machado da Silva Neto1*; Margareth Batistote2

1
UFSCar/CCA, 13600-000, Araras – SP. *e-mail: [email protected]
2
UEMS, 79804-970, Dourados – MS.

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ABSTRACT
Brazilian power plants use Saccharomyces cerevisiae strain as fermentation agents.
During the process there are innumerable hostile conditions to which they are subjected.
Sugarcane ethanol stands out as a renewable biofuel of reference and Brazil is the
second largest producer. The Production involves a complex system where yeast plays
an important role and sugarcane broth is used for efficient conversion of its substrates
into ethanol. The objective of this study was to evaluate the fermentative performance
of industrial yeasts cultivated in sugarcane broth, as well as fermentation parameters,
biomass, viability and concentration and ethanol. The strain used were Pedra-2 and
Catanduva-1. For cell growth, the microorganisms were inoculated, and 0.10g of
lyophilized yeasts in 2% YPD medium and incubated at 30ºC for 24 hours. The
obtained biomass was used for the fermentation experiment based on sugarcane juice at
18º Brix concentration and incubated at 30ºC, at different intervals of aliquots were
withdrawn for the analysis of the biomass by spectrophotometer, cell viability by
counting in chamber of Neubauer under optical microscope and ethanol by gas
chromatography. The data show that the Pedra-2 strain obtained a higher biomass
production of 7.3mg/mL, a viability of 75% and a higher ethanol production of
3.56(v/v) than Catanduva-1. Therefore, the Pedra-2 strain presented the best yield.

Keywords: yeast, fermentation, sugarcane.

Support: UEMS/FUNDECT

503
 Biological treatment with microorganisms to reduce
phytotoxicity of agroindustrial wastewater
Josiane Ferreira Pires1*; Rosane Freitas Schwan2; Cristina Ferreira Silva3
1
Federal University of Lavras. *[email protected] (autor para correspondência):

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ABSTRACT
Several compounds found in wastewater from coffee fruit processing (WP), such as
phenolic compounds, may have a toxic effect on plants. Use of biological treatment
with microorganisms, prior to disposal, reduce the concentration of these compounds
and consequently decrease the phytotoxicity of the effluent. In this sense, the aim of this
work was to promote the biological treatment of WP with bacteria and to evaluate the
reduction of phytotoxicity of the effluent. The bacteria Serratia marcescens,
Corynebacterium flavescens and Acetobater indonesiensis were used in mixed inoculum
for the biological treatment of two wastewaters from the Brazilian Cerrado (WPc) and
Atlantic Forest (WPaf). After 6 days of incubation, the phytotoxicity of the two different
WP was evaluated on Allium cepa (onion) seeds. Five concentrations of fresh and spent
WP (12.5, 25, 50, 75 and 100%) plus distilled water (as control) were used. The
relationship between WP and control was used to calculate the relative germination
roots (RG), root length (RL) and germination index (GI). There was germination of the
seeds in all analyzed samples and RG, RL and GI presented an inverse correlation with
the WP concentration. It was observed reduction in the toxic effect of the seeds exposed
to both spent WP and the highest phytotoxicity occurred in seeds exposed to fresh
Wpaf, where the RL showed between 31 and 82%, the RL presented values between 14
and 62% and the GI ranged from 4 to 51%. We conclude that biological treatment with
mixed bacterial inoculum was able to reduce the phytotocity of WP.

Keywords: Bacteria, Mixed inoculum, Eflluent, Allium cepa, Coffee.

Support: Capes, CNPq e Fapemig.

504
 Production and studies of blended enzymatic cocktails for
sugarcane bagasse saccharification
Josiane Aniele Scarpassa1*; Eleni Gomes2; Roberto da Silva2; Izabel Zaparoli Rosa2, Amanda Silva de
Souza1; Felipe Cardoso Ramos1; Maísa Lopes Apolinário 1 Ricardo Rodrigues de Melo1; Claudia Maria
de Souza1; Roberto Ruller1
1
Brazilian Bioethanol Science and Technology Laboratory (CTBE), Brazilian Center for Research in
Energy and Materials (CNPEM), Zip Code 13083-970, Campinas, Sao Paulo, Brazil. *e-mail:
[email protected]
2
Universidade Estadual Paulista (UNESP/ IBILCE)
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ABSTRACT
The development low-cost enzymatic cocktails, with a high-performance for
saccharification of lignocellulosic materials to bioethanol production have a great
importance for bioeconomy. Enzymaic cocktail of fungi (Thermoascus aurantiacus,
Trichoderma reesei and two Ransamsonia sp species) were produced through solid state
fermentation (SSF) and submerged fermentation (SMF) and then evaluated by
hydrolysis of “in natura” sugarcane. We used the same substrate (wheat bran, corn
straw, and sugar cane bagasse) for both SSF and SMF during ten days for enzyme
productions. In the next, the total protein concentration and enzymatic activity of
Xylanase, β-glucosidase, CMCase, β-xylosidase were quantified. To evaluation of
blended enzymatic cocktails, the enzymatic extracts obtained were combined in
different proportions for hydrolysis of lignocellulose materials (with 5% of solids
content) at 60ºC for 24 hours. The enzymatic activity and saccharification assays were
evaluated utilizing the quantification of total reducing sugar released by the colorimetric
test. The individual samples cocktails and combination of enzymatic extracts obtained
by SSF shown a increased sugar release than enzymatic cocktail using SMF. The
individual enzymatic cocktail of T. aurantiacus showed a better hydrolysis efficiency of
both SSF and SMF protocols. In addition, T. aurantiacus enzymatic cocktail enhanced
the synergic together others fungus extracts evaluated. Our preliminary results evidence
a potential of enzymatic cocktail of the T. aurantiacus for composition of a blending of
thermostable enzymes. In the next steps, we will assess the combination of the
thermophilic cocktails using another pretreated biomasses challenging new applications
for the improvement of saccharification bioprocesses of lignocellulosic materials.
Keywords: filamentous fungi, thermophilic cocktail Thermoascus, enzymatic extracts,
hydrolysis.

Support: CAPES e CNPEM.

505
 Cultivation of fungus Pleurotus ostreatus (shimeji) in term
hydrolyzed sugarcane bagasse
Júlia Taíssa M. Gandolphi1; Dejanira de F. Angelis2; Octavio Antônio Valsechi1
1
Universidade Federal de São Carlos *[email protected]
2
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
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ABSTRACT
Bagasse is a co-product of sugarcane used for energy generation, as industrial feedstock
and as forage in bovine food, rich in polysaccharides as cellulose, hemicellulose and
lignin. This composition makes this presents a low digestibility, causing injuries to the
digestive tract of the animal, besides being poor in proteins, vitamins and minerals. An
alternative to circumvent this situation is a fungal (Pleurotus ostreatus) treatment, since
it produces enzymes capable of degrading lignocellulosic compounds and promotes a
significant increase in protein content. This study aimed to quantify crude protein in
bagasse by Kjeldahl method, in several treatment stages, establishing the optimal point
for this treatment. Tests were performed with term exploded sugarcane bagasse without
treatment, and 1% yeast extract enriched bagasse added of 4% Pleurotus ostreatus
inoculum. The untreated bagasse presented about 1.029% of protein, whereas the
bagasse with 3 days of incubation presented 1.989%, the 5 days incubation 4.271%, 7
days 4.635% and 10 days 5.237%. Based on the obtained data, it was concluded that
after 10 days of incubation the bagasse presents, on average, 5.4% of protein, which is
the optimal of the treatment.

keywords: Co-product, lignin, crude protein.

506
 Determination of the Minimum Inhibitory Concentration of
compounds belonging to the class N-acylidranzones and their
respective Silver(I) complexes against Mycobacterium
tuberculosis.
Júlia Araújo Grecco1; Camila Maringolo Ribeiro1; Paulo Victor Pinto dos Santos2; Alexandre Cuin2;
Fernando Rogério Pavan1*.
1
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara - Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho”.
*([email protected]).
2
Universidade Federal de Juiz de Fora - Departamento de Química.
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ABSTRACT
Overall, the tuberculosis mortality rate decreased by 47% between 1990 and 2015,
however, it is estimated that there were 1.4 million tuberculosis deaths in 2015. This
means that even with a declining mortality rate over the years, it is still considered one
of the top ten causes of death worldwide, and an important factor contributing to this
position is the appearance of drug-resistant bacteria. Aiming for new compounds with
potential to be used in the treatment of the disease, the objective of this work was to
evaluate the in vitro activity of the of the salizid, o-vanizid, m-vanizid and p-vanizid
ligands belonging to the class of N-acylhydrazones derived from natural aldehydes and
isoniazid, and their respective Silver (I) against Mycobacterium tuberculosis H37Rv
(ATCC 27294). Minimum Inhibitory Concentration (MIC90) was determined by the
Rezasurin Microtiter Analysis Method (REMA), without microdilution qualification in
96-well plates and residue as a revealing of cell viability obtaining, as a final result,
lower concentration of the compound capable of inhibiting 90% of growth. The
experiments were performed in biological triplicate and MIC90 values of the eight
compounds tested showed activity at concentrations lower than 0.581 ug / mL.
Considering that MIC90 values below 10 μg / mL are promising, the assays were tested
with excellent anti-Mycobacterium tuberculosis activity, with drug behaviors employed
in the therapy, which were used as control of the experiment. Thus this class of
compounds appears to be promising as potential antituberculosis drugs.

Keywords: Mycobacterium tuberculosis, new antibiotics, Minimum Inhibitory

Concentration.

Support: FAPESP (2013/14957-5)

507
 Evaluation of the structure and antibiotic activity of
fluorophore-labeled mastoparan Polybia-MPII
Kenny Umino Sato1*; Bibiana Monson de Souza1; Mario Sergio Palma1
1
UNESP – Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”. *e-mail: [email protected]

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Abstract
Wasp venoms have important pharmacological and immunological operations during
poisonings. The venom is a complex mixture of different compounds, wherein the
mastoparans comprise the most abundant components within the peptide group. Mast
cell degranulation is the main biological activity of mastoparans. However, the
mastoparan Polybia-MPII, isolated from the venom of the tropical wasp Polybia
paulista, presents an important antibiotic activity. It is very interesting to development
of new antibiotics. Besides, it is necessary to investigate the mode of action of this
mastoparan on the bacteria cell. Thus, a cysteine residue was inserted on the C-terminal
of Polybia-MPII primary sequence. This insertion permits the fluorophore (Alexa Fluor
488) couple, which permits the monitoring of labeled peptide inside the bacteria cell
using fluorescent microscope technique. The structural modification altered some
characteristics of this mastoparan like the increase of 58.34% of α-helix content in
water, 25.37% in trifluoroacetic acid (TFE) and 10.6% in sodium dodecyl sulfate
(SDS). in the same way, it causes an increase in the β-sheet structure in 20.51% in
water, 81.71% in TFE and 33.33% in SDS. However, the loop structure has a big
difference in TFE of 68.75% higher in Polybia-MPII than in C-Polybia-MPII. These
results can explain the drastic decrease of the antibiotic activity of the modified peptide
mainly in the Gram-negative bacteria. In this moment, we are studding another
mechanism to label this interesting mastoparan that does not alter drastically its original
antibiotic activity.
Keywords: circular dichroism; Polybia paulista; wasp venom; mass spectrometer;
HPLC; chemical synthesis of peptide.

Support: Cnpq - PIBIC

508
 Use of MALDI-TOF for wastewater fungi identification
Larissa de Souza Cardoso1; Josiane Ferreira Pires1; Cristina Ferreira Silva1;

1
Federal University of Lavras. *[email protected]
___________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
Wastewater from coffee processing (WP) has great polluting potential and should
receive treatment before disposal. Therefore, the identification of filamentous fungi of
the effluent, is essential for the knowledge of the microbiota and its potential use in the
biological treatment. The MALDI-TOF technique can be used to identify
microorganisms through protein analysis. The aim of this work was to evaluate the use
of the MALDI-TOF technique for proteomic characterization and identification of
filamentous fungi. For analysis in MALDI-TOF, 21 filamentous fungi were cultured on
BDA agar for 3 days and a fraction of hyphae and spores were transferred to microtubes
with distilled water. The preparation of samples for species identification was performed
using the standardized methodology, using ethanol, 70% organic acid and 100%
acetonitrile. Spectra were obtained and spectral proximity dendograms among the
isolates were created by the Microflex mass spectrometer (BrukerDaltonics). The 21
analyzed filamentous fungi were grouped into 3 large groups (A, B, C), according to the
genus, being possible to identify to the species 50% of the isolates. In group A
composed of 11 isolates, 3 were identified as Geotrichum silvicola and 2 as Geotrichum
candidum. Among the 8 isolates of group B, 7 were identified as Fusarium oxysporum.
And in group C, only Alternaria alternata was identified. The MALDI-TOF technique
proved to be an efficient tool for the clustering and identification of the filamentous
fungi present in the WP.

Keywords: Fungi; Polluting; Treatment; Protein; Methodology.

Support: CNPq; FAPEMIG; CAPES.

509
 Effect of rosemary (Rosmarinus officinalis L.) extract on
polymicrobial biofilm of Candida albicans and Enterococcus
faecalis
Leandro Wagner Figueira1*; Jonatas Rafael de Oliveira1; Luciane Dias de Oliveira1
1
Universidade Estadual Paulista (UNESP). Instituto de Ciência e Tecnologia (ICT). Departamento de
Biociências e Diagnóstico Bucal. Av. Francisco José Longo, 777 – Jardim São Dimas. São José dos
Campos/SP. *e-mail (autor para correspondência): [email protected]

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
Rosemary is a medicinal plant originated from Mediterranean, which currently can be
found and cultivated in all the continents. Some of its properties were considered such
as antioxidant, anti-inflammatory and antimicrobial. The aim of this study was to
evaluate the effect of rosemary extract on polymicrobial biofilm of C. albicans and E.
faecalis. For this, reference strains ATCC 18804 (C. albicans) and ATCC 4083 (E.
faecalis) were used. Suspensions of each microorganism were adjusted to 107 CFU/mL
(colony forming units per milliliter) and were added in microtiter plate (100
μL/well/suspension). The biofilm was formed during 48 h and exposed for 5 min to
rosemary extract (200 mg/mL) or 0.9% NaCl solution, being n = 10/group. To verify the
antibiofilm effect of the extract was used colorimetric test with MTT solution (0.5
mg/mL PBS) which was incubated for 1 h on the biofilm after the treatments. The data
obtained in microplate spectrophotometer (570 nm) were statistically analyzed by T-
Test (P ≤ 0.05). Exposure to rosemary extract provided a significant reduction of 58 ±
8% in the polymicrobial biofilm viability. Thus, it can be concluded that the rosemary
extract presented antimicrobial effect with effective reduction of polymicrobial biofilm
composed by C. albicans and E. faecalis.

Keywords: Rosmarinus officinalis; rosemary; Biofilm; Candida albicans; Enterococcus

faecalis.

510
 Xylanase production by Rhizoctonia solani AG-1 IA isolated
from bracharya, soybean and rice crop
Letícia Louzada Ferreira1*; Sirlene do Nascimento Senna1; Paulo Cézar Ceresini2; Heloiza Ferreira Alves
do Prado2
1
UNESP, Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”Campus de São José do Rio Preto.
*[email protected]
2
UNESP, Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”, Campus de Ilha Solteira.

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
Microorganisms produce hemicellulolytic and cellulolytic enzymes complex that are
involved in cell wall degradation, including xylanases. These enzymes may be related to
the mechanism of pathogenicity, and therefore have been widely studied. The fungi
Rhizoctonia solani AG-1 IA is considered a pathogen of cultures of global importance.
The objective of the present study is to evaluate the production of xylanase by R. solani
isolated from rice, brachiaria and soybean crops. Twenty isolates of brachiaria, rice and
soybean crops from different Brazilian states were evaluated, on solid-state cultivation
using wheat bran as a substrate and were incubated at 25 ºC for a period of 96 hours.
Extracellular xylanase production was determined by DNS method, and the isolates
potential to xylanolitic enzyme was evaluated. The analyses were done in triplicate and
the statistical analysis was done by means of a variance analysis using the SISVAR
program, through the Scott-Knott test among the means. Among the isolates evaluated,
the best results for xylanase production were of the isolates RR_A41 and RR_A24 with
values of enzymatic activity of 17,40 U g-1, MT_S085 with 17,60 U g-1and
MTAFUB03-1 with activity value of 18,47 U g-1, after ninety-six hours of solid-state
cultivation. The studied strains presented effectiveness in the production of the enzyme
of interest. The isolates of R. solani with brachiaria, rice and soybean crops
demonstrated potential in xylanolytic production, being that the rice isolates presented
higher enzymatic production than the isolates of the soybean and brachiaria cultures.

Keywords: Phytopathogenic fungus, microbial enzymes, solid state cultivation,

production.

Support: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

511
 Biotic and abiotic assessment of a wetland in a frog pond
effluent
Lorena Regina da Silva Peres1*; Lúcia Helena Sipáuba Tavares1;
1
Univ. Estadual Paulista/Centro de Aquicultura, Jaboticabal, SP, 14884-900, Brazil.
*e-mail: [email protected]
_____________________________________________________________________________________________

Growth systems of aquatic organisms require rich diets in nutrients which provide
organic and inorganic compounds that may produce eutrophication. Limnological
conditions, thermotolerant coliforms and removal efficiency from a wetland with
Eichhornia crassipes are assessed. The wetland lies in the effluent of a frog pond on an
aquaculture farm. Water collection was retrieved weekly during 90 days at different
sampling sites: boxes with macrophytes; entrance and exit of the wetland. Mean rates of
total coliforms were 479 NMP.100mL at the entrance and 92.3 NMP.100mL at the
wetland exit, with highest rates during the rainy period when temperature are highest.
There was a decrease in BOD/COD at the exit respectively with 63 and 59 mg/L-¹.The
highest rates of parameters occurred at the entrance and were related to the availability
of organic solids. Mean pH rate was 7.1 at the entrance of the wetland, whilst the
variables conductivity, STS and STD decreased gradually. Dissolved oxygen rates
throughout the wetland were lower than 3.84 mg/L-¹at the exit.The system proved to
have the best conditions to remove ammonia nitrogen and phosphorus. Efficiency of the
wetland with the aquatic plant E. crassipes was good for decreasing organic and
inorganic compounds from the frog culture pondon the analyzed aquaculture farm.

Keywords: thermotolerant coliforms; environmental management; limnological

aspects; microbiological aspects.

Support: Bolsa de mestrado concedida pela Coordenação de Aperfeiçoamento de

Pessoal de Nível Superior.

512
 Filamentous fungi diversity in Syrah grapes variety from
Jequitinhonha Valley
Lorena Dutra Silva1*; Elaine Andrade de Paulo1; Michelle Ferreira Terra1; Sirlei Cristina de Souza1;
Nathasha de Azevedo Lira1; Michele de Oliveira Aragão1; Anielli Souza Pereira1; Cláudio Márcio Pereira
de Souza2; Luís Roberto Batista1.

1
Federal University of Lavras - UFLA. Department of Food Science. *[email protected].
2 Federal University of Jequitinhonha and Mucuri Valleys - UFVJM. Department of Agronomy.

In the region of the Jequitinhonha Valley, Minas Gerais, winemaking has recently
began with prospects for promoting wine tourism. Different fungi genera are commonly
found in grapes, the main ones being Botrytis, Cladosporium, Alternaria, Aspergillus
and Penicillium. Some filamentous fungi are a matter of concern for producing
mycotoxins that are not eliminated in the process of wine production, being the genera
Aspergillus the major producer of ocratoxin A (OTA) in grapes. Therefore, this study
aimed to analyze the diversity of isolated fungi from Syrah grapes grown in
Diamantina. To this purpose, samples were collected at three equidistant points from the
winery, in July 2016, and were submitted to serial dilution followed by plating in
DRBC and DG 18 media for fungi isolation. After 7 days, the isolates were purified and
inoculated in specific media used for identification according to taxonomic keys. Also,
the study evaluated the production of mycotoxins by thin layer chromatography method
(TLC) in part of the isolates. The test results reported the presence of Aspergillus niger,
A. niger aggregate, A. flavus and A. ochraceus, Penicillium sclerotiorum and P.
glabrum, and complex formed by Cladosporium cladosporiodes, Alternaria sp and
Eupenicillium sp. So far, some of the isolates analyzed did not reveal toxigenic
potential. Despite the absence of mycotoxin production, the presence of these species in
the vineyard shows the importance of good management and the adoption of good
agricultural practices in grape processing, in order to reduce the risk of having
mycotoxins in the final product.

Keywords: Aspergillus, mycotoxin, wine.

Support: CAPES, CNPq, FAPEMIG and Winemakers.

513
 Production of fungal β-1,3-glucanase using vinasse

Luana do Amaral Bovi1*; Bruna Letícia Martins2; Cynthia Barbosa Rustiguel3; Geisiany Maria de
Queiroz-Fernandes2
1
Universidade do Sagrado Coração - Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação (PRPPG), Centro da
Saúde, Biomedicina, Bauru/SP. *e-mail: [email protected]
2
Universidade do Sagrado Coração - Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação (PRPPG), Programa de
Mestrado em Ciência e Tecnologia Ambiental, Bauru/SP.
3
Department of Biology, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto - USP/SP.
______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT

Growing world-wide generation of agro-industrial residues brings the concern to

develop techniques that make possible to reuse it, which make the application of these
remainders in fermentative processes for acquirement of enzymes a huge
biotechnological progress, including sustainable and low cost features, mostly, if we
consider the necessary investments for enzymes production as β-glucanases, for
example. The aim of this study was to produce β-1,3-glucanase using the fungus
Aspergillus niger and vinasse. The enzyme was obtained through submerged liquid
fermentation in shaker, using vinasse originating from a sugar cane industry from São
Paulo, in decreasing of the culture medium; the conditions of the production are
described in literature. The residue was added to the medium in the concentrations: 2%,
14%, 42%, 70% e 82% and the period of production was realized in 2, 4, 8, 12 e 14
days; the results were analyzed by factorial design. It was observed that range of
variables that has induced the best enzyme activity were in concentrations of vinasse
among 2% and 42% and the period of production among 8 and 14 days. After these
results were valid, it was noted that the use of vinasse at 14% when the production was
realized for 12 days showed the best conditions to A. niger for secretion of β-1,3-
glucanase, demonstrated by specific activity equal to 6,85 U/mg. In summary, this
residue was able to promote the secretion of the enzyme with considerable specific
activity when used in low concentrations and in long periods of production.
Keywords: Aspergillus niger, industrial waste, optimization.
Support: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).

514
 Maintaining Escovopsis cultures in three preservation
methods
Luciana Simão Carneiro1*, Lorena Tigre Lacerda1, André Rodrigues1

1
Departamento de Bioquímica e Microbiologia, UNESP – Universidade Estadual Paulista, Rio Claro, SP.
*e-mail: [email protected]

______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT

The genus Escovopsis are considered specialized parasites of the symbiotic fungus
cultivated by attine ants. Long-term preservation of Escovopsis is important for future
systematic and applied studies, however, this fungus proved to be reluctant to ordinary
preservation methods. Here, we evaluated the efficiency of three methods for
Escovopsis preservation: Castellani, Cryopreservation (-80 °C) and Silica-gel. A total of
16 Escovopsis strains from the collection maintained at the UNESP-Microbial Resource
Center were used in this study. These strains show different spore colors and most likely
represent undescribed species. We analyzed the mycelial growth, spore viability and
morphological characters over four months of preservation. Ten strains sustained faster
growth rates (5.4 mm² day-1 in average) and higher spore viabilities (18% in average) in
Cryopreservation after four months in comparison to the other methods. This method
was effective for brown and yellow-spored strains, which produce colonies with
abundant spores compared to the pink-spored strains. In general, the Silica-gel
presented better results over Castellani, since all strains preserved in the latter method
sustained low spore viabilities (12% in average). However, three strains (pink and
white-spored) improved their growth rates after preservation under this technique.
Considering all methods, we observed that the longer the preservation time, the lower
the spore germination rate. Strains with low germination rates had reduced colony
growth compared to the controls. Overall, Escovopsis strains responded differently to
the preservation methods, but cryopreservation had the best performance. Monitoring of
Escovopsis strains will continue to check strain survival rates in long-term preservation.

Keywords: culture collection, long-term storage, fungi

Support: CNPq

515
 Antifungal potential of compounds produced by
actinobacteria
Luís Claudio Martins1; Gislaine Vicente dos Reis1; Simone Possedente de Lira1

Department of Exact Sciences. Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ/USP). *e-
1

mail: [email protected]
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ABSTRACT
Diseases are one of the main causes responsible for limiting the yield of agricultural
crops. Anthracnose affects several cultures, including guarana, and the causative agent
is the fungus Colletotrichum gloeosporioides. Thus, the present work aimed to isolate
antifungal compounds produced by actinobacterias against C. gloeosporioides. So,
Streptomyces sp. AM3 was grown in BD medium at 150 rpm and 28 °C for 11 days.
After culturing, the metabolite medium was partitioned with ethyl acetate. The ethyl
acetate fraction was subjected to column chromatography with silica gel stationary
phase and mobile phase in gradient of dichloromethane, ethyl acetate and methanol. All
chromatographic steps were monitored in bioassays to antifungal activity by the paper
disc diffusion method. Percent inhibition was calculated using the ImageJ program. The
acetate fraction (A3), which presented activity of 78.34%, was subjected to further
chromatographic separation under same conditions. Among the 8 fractions obtained, the
fraction A3a presented the percentage of inhibition of 50.93%. In the second separation
using the same stationary phase and the same mobile phase as the previous one, nine
fractions were obtained, and the fraction A3a3 inhibited in 16.90% the pathogen. The
final purification was performed in HPLC, with 3 fractions obtained. The fraction
A3a3b with retention time in 11.1 min showed an inhibitory percentage of 50.50%. In
this study, it was presented the antifungal activity of a compound produced by
Streptomyces sp. AM3 in the control of C. gloeosporioides. At present, spectroscopic
techniques are being employed for structural elucidation of this compound.

Keywords: antagonistic activity, bioactive compounds, secondary metabolites and

anthracnose.

Support: FAPESP Regular Project 2014/1576-3, FAPESP Thematic 2013/50228-8.

516
 Obtention of Fuji apple cutin and qualitative screening for
filamentous fungi cutinase producers
Lusiane Malafatti Picca1; Dejanira de Franceschi de Angelis1; Derlene Attili de Angelis2
1
Instituição. Center for Environmental Studies, UNESP - Univ Estadual Paulista, 24-A Av., 1515, 13506-
900, Rio Claro-SP, Brazil.
*e-mail (autor para correspondência): [email protected]
2
Instituição. Division of Microbial Resources, CPQBA – Univ Estadual de Campinas, Alexandre
Cazellato Street, 999, 13148-218, Paulínia-SP, Brazil.
_____________________________________________________________________________________________
RESUMO

Aerial parts of the plants are covered by protection layer called cuticle, wich has
an insoluble biopolyester, the cutin, a polyester composed of hydroxy and epoxy fatty
acids. The fatty acids of cutin are composed by C16 and C18 and contain one to three
hydroxyl groups. Many fungi have been reported to produce cutin-degrading enzymes,
cutinases that are hydrolytic enzymes produced mainly by pathogenic plant fungi.
Cutinases catalyse hydrolysis and synthetic reactions and have potential use in food,
pharmaceutical and oleochemical industries. The objective of this study was to perform
a qualitative screening in plate for fungi cutinase producers. For this, cutin was
extracted from Fuji apples peels purchased at the local market in Soxhlet extractor with
chloroform and added to the Czapek Dox culture medium, as the sole source of carbon
at the concentration of 0.2%, supplemented with phenolred 0.05%. Twenty-one
filamentous fungi strains were tested of the genera: Penicillium sp (6);
Microsphaeropsis sp (3); Curvularia sp (3); Trichoderma sp (3); Fusarium sp (2);
Pycnidiophora sp (2); Mucor sp and Aspergillus sp (one for each). For the results, the
fungi that presented growth and formation of yellow halo would be cutinase producers.
Six fungi were able to produce cutinase: Penicillium sp (2); Microsphaeropsis sp (2);
Fusarium sp (1) and Pycnidiophora sp (1). Data reported consider some species of these
genera as pathogenic (Penicillium and Fusarium) or endophytic, whose infection plant
are latent or asymptomatic (Microsphaeropsis and Pycnidiophora), which justifies the
results obtained.

Keywords: cutin, fruit, hydrolases, fungi, screening.

Support: Capes for the grant.

517
 Bioprospecting of thermophilic fungi and producing enzymes
for saccharification of lignocellulosic biomass
Maísa Lopes Apolinário1*; Josiane Scarpassa1; Roberto Ruller1
1
National Laboratory of Science and Technology of Bioethanol - National Center for Research in Energy
and Materials, Campinas. *e-mail: [email protected]

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ABSTRACT
Faced with the decline of oil reserves, environmental problems associated with its
extensive use, and political and economic impasses related to the control of this
resource, researchers around the world have been searching for alternatives that provide
energy security and sustainability. Second generation bioethanol, obtained from cane
bagasse biomass sugars, presents energy, economic and environmental advantages,
being considered one of the most promising alternatives to fossil fuels. In view of the
need to improve the enzymatic hydrolysis step to facilitate the commercialization of
cellulosic ethanol, this work proposes to search in nature thermophilic fungi capable of
producing enzymes effective for hydrolysis of lignocellulosic material, such as
sugarcane. Thus, samples of soil and sugarcane bagasse in natura at different points of
the campus were collected and subjected to selection by culture at 50 ºC in media with
different carbon sources (glucose, carboxymethylcellulose, celufloc and bagasse in
natura). By the red congo test, the best hydrolyzed carboxymethyl cellulose (CMC)
were determined, and were directed to a liquid fermentation. The enzymatic extract
(thermophilic cocktail) produced by each of the isolated fungi had determined the
activities of avicellase, CMCase, FPase, HMCase and xyloglucanase. Thus, of the 36
isolates, 17 were fermented and of these the 5 that presented value of enzymatic and
protein activity were identified by sequencing of the ITS region. The ITS DNA
sequences of the obtained isolates were analyzed in database (nBLAST), being
classified as the thermophilic fungi Thermoascus aurantiacus var. Levisporus and
Rasamsonia emersonii.

Keywords: Cellulosic Ethanol, Thermoascus aurantiacus, Rasamsonia emersonii,

Enzymatic hydrolysis.

Support: CNPEM and CNPq/PIBIC.

518
 Microorganisms isolated from solid residue of olive oil
production

Marcela Magalhães Melo1*; Jéssica Marques Coimbra1; Cristina Ferreira Silva e Batista1; Rosane Freitas
Schwan1
1
University Federal of Lavras - UFLA*e-mail ([email protected]):

ABSTRACT

During the processing of olive oil different types of waste are produced, olive pomace,
olive mill wastewater and solid residue or alperujo, which are produced in large
quantities. Of these, the solid residue is generated in the proportion from 800 to 950 kg
of residue for each 1000 kg of olives used in the extraction of olive oil. These residues
are rich in phenolic compounds and organic compounds that when disposed directly in
the environment, can cause serious environmental problems. Not much is known about
the microbiota present in this solid residue. Therefore, the objective of this work was to
isolate and characterize morphologically microorganisms found in the solid residue
from the olive oil production of Maria da Fé (MG). From the residue was carried out a
serial decimal dilution and plated on nutrient agar with nystatin (AN) for bacterial
isolation, YEPG at pH 3.5 for yeast isolation, Dichloran Rose Bengal Agar (DRBC) and
Agar Dextrose Potato (BDA) for fungi filamentous isolation. When necessary,
enrichment technique was used for isolation. After the incubation period, the colonies
were classified according to colony and cell morphological characteristics. It was
obtained 122 isolates of yeasts, 63 isolates of bacteria and 13 isolates of filamentous
fungi. MALDI - TOF will be performed to identify these isolates.

Keywords: Agroindustrial; Bacteria; Yeast; Residue of olive oil.

Support: FAPEMIG, Capes e CNPq.

519
 Influence of different N-glycans in carbohydrate active
enzymes secretion, folding and functional activity
Marcelo V. Rubio1*; Mariane P. Zubieta1; Fabiano J. Contesini1; César R. F. Terrasan1; Jaqueline A.
Gerhardt1; André R. L. Damásio1
1
Institute of Biology, University of Campinas (UNICAMP), Campinas-SP, Brazil. *e-mail
([email protected]):
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ABSTRACT
Filamentous fungi such as Aspergillus sp. and Trichoderma sp. are frequently used to
produce carbohydrate active enzymes (CAZymes) due to great enzymatic repertoire and
high protein secretion. In Eukaryotes the majority of proteins synthesized in the
endoplasmic reticulum are glycoproteins. Glycosylation is one of the most common
posttranslational modification to occur in protein biosynthesis which glycans are
attached to proteins or lipids. The attachment of glycans into nascent peptides can be N-
linked or O-linked. N-linked glycans enhance proper folding, intracellular tracking,
secretion, thermostability, reduce aggregation, promote secondary structure formation
and, consequently, affect functional properties. In recent years, the structure of protein-
linked carbohydrates of many fungal proteins has been elucidated, showing the
prevalence of high-mannose chains, sometimes with typical fungal modifications. The
different configurations of the N-linked glycan are not simply intermediates in a
biosynthesis pathway but instead have specific functions by their own. Here, we
propose to understand if the N-glycan pattern of glycoside hydrolases can interfere with
protein secretion and function in A. nidulans by designing knockout strains to some
genes related to N-glycan biosynthesis. The canonical N-glycan precursor in fungi has
14 sugars (Glc3Man9GlcNAc2) and after the knockout of Alg6, Alg2, Alg1, Alg11 and
Alg14 genes the precursor of our strains were, theoretically, changed to Man9GlcNAc2,
Man1GlcNAc2, GlcNAc2, GlcNAc1 and no sugar attachment, respectively. Moreover,
we do not detected growth differences among knockout and control strains. The
knowledge and modulation of A. nidulans N-glycosylation process is a strategy that can
allow improvement in the secretion of target enzymes.

Keywords: Fungi, Glycoside hydrolases, Enzymes secretion, N-glycosylation, N-

glycan biosynthesis.

Support: FAPESP and CNPq

520
 Systemic infection by Candida spp. and its tropism to the
central nervous system in a murine model
Marcelo D’Alessandre Sanches1*; Thais Fernanda de Campos Fraga da Silva2; Luiza Ayumi Nishiyama
Mimura2; Larissa Lumi Watanabe Ishikawa2; Sofia Fernanda Gonçalves Zorzella-Pezavento2;
Alexandrina Sartori2; Cilmery Suemi Kurokawa1.
1
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Faculdade de Medicina de Botucatu,
Botucatu, São Paulo, Brasil.
2
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências de Botucatu,
Botucatu, São Paulo, Brasil.
*e-mail: [email protected]

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ABSTRACT
The genus Candida comprises commensal fungi with capacity to cause systemic
infection that may involves the central nervous system (CNS). It has recently been
suggested that these fungi aggravate or trigger CNS pathologies. The present study was
designed to establish if a systemic infection by Candida spp. in mice could spread to the
brain. Adult female C57BL/6 mice were infected by intravenous route with 5x106 viable
C. glabrata, C. krusei and C. parapsilosis yeasts. Body weight was daily recorded until
the 14th day post-infection. Fungal load was assessed in brain, spleen and kidney
samples, cytokine production was analyzed in spleen cell cultures and histopathological
analysis was performed in brain samples on days 3 and 14 post-infection. Only C.
krusei infection resulted in body weight loss. The three Candida spp. spread to the
brain, spleen and kidney, being C. glabrata higher in the brain at the beginning of the
infection. At the 3rd day post-infection C. krusei resulted in a higher production of TNF-
α, C. glabrata in a higher production of IFN-γ and C. parapsilosis in a higher
production of IFN-γ and IL-10. At the 14th day post-infection the fungal load decreased
in all organs, but the C. parapsilosis persisted in the kidneys. Cytokine production and
inflammatory infiltration were similarly lower at this time point. Even though the three
Candida spp. presented differences related to fungal persistence and immune response,
they were equally able to reach the CNS.

Keywords: candidiasis, systemic experimental infection, C57BL/6 mice, brain, immune

response.

521
 Aspergillus nidulans as a platform for recombinant
production of cellulases and oxidative enzymes for biomass
degradation

Marco A. S. Kadowaki1*; Rolf A. Prade2; Igor Polikarpov1

1
Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo, Av. Trabalhador São-carlense, 400, São
Carlos, SP. Autor para correspondência: [email protected]
2
Department of Microbiology and Molecular Genetics, Oklahoma State University, OK, United States.

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ABSTRACT
Biomass is a universally abundant, renewable resource useful for the production of
biofuels and starting biochemicals that can be converted into plastics and other
commercial composites. Enzymatic degradation of biomass polymers into fermentable
sugars is a recalcitrant process for which a complete efficient breakdown mechanism
remains to be discovered. So far current commercial enzymes that breakdown biomass
polymers are of the hydrolytic type using the classic acid/base catalysis mechanism.
This mechanism for the degradation of plant polysaccharides has recently been
challenged by the landmark discovery of oxidoreductase systems such as fungal lytic
polysaccharide monooxygenases (LPMOs) that directly oxidize cellulose and cellobiose
dehydrogenase, glyoxal- and putative GMC oxidoreductases that oxidize cellobiose,
aldehydes and aromatic compounds. These enzymes reduces molecular oxygen and
produce excessive amounts of hydrogen peroxide and oxygen radicals that results in
non-selective Fenton like oxidation of glycosidic bonds. Filamentous fungi are able to
secrete an array of oxidoreductases and to express high levels of cellulases been
potential hosts to heterologous protein secretion. However, the production of high-yield
and purity enzymes is a biotechnological challenge. Aspergillus nidulans has been used
to express cellulases and can offer an alternative option to express oxidative enzymes.
In this work we establish a pipeline to clone, express and purify a sort of hydrolytic as
well as oxidative enzymes using A. nidulans as cell factory. We also show the successful
expression and purification of cellulases from Neurospora crassa and Chaetomium
globosum as well as active Lpmos from the thermophilic Myceliophthora thermophila.

Keywords: Heterologous expression, oxidoreductases, lytic polysaccharide

monooxygenases.

Support: FAPESP, CAPES e CNPq.

522
Influence of growth temperature on the antimicrobial activity
of eugenol and thymol against Staphylococcus aureus

Mariana Silva Coelho1; Roberta Hilsdorf Piccoli1*

1
Federal Unversity of Lavras - Minas Gerais, Brazil. *e-mail:[email protected]

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ABSTRACT
Essential oils are gaining increasing interest in their antimicrobial properties and the
major compounds are well known for their antimicrobial activity. Eugenol and thymol
have been extensively studied due to their effective against pathogens and deteriorating
microorganisms. Enterotoxigenic Staphylococcus aureus are still an important cause of
foodborne intoxications worldwide. Lack of proper hygienic measures during
preparation of food is a major risk of contamination, and staphylococcal food poisoning
is often associated with manually prepared food. This study evaluated the influence of
growth temperature on the antimicrobial activity of eugenol and thymol on
Staphylococcus aureus. To determine the minimum inhibitory concentration (MIC), 20;
30 and 37°C, Brain Heart Infusion (BHI) containing 0.5% (v/v) Tween 80 was used.
The broth was added in polystyrene microplates with 96 wells. Different concentrations
were obtained by homogenization of the antibacterial agents with culture media: 0,5;
0,9; 1,9; 3,9; 7,8; 15,6; 31,2 and 62,5 mg mL-1. The incubation temperatures studied
were 20, 30 and 37 °C. The MIC of eugenol was 7,8 mg mL-1 at 20 °C; 3,9 mg mL-1 at
30 °C and 15,6 mg mL-1 at 37 °C for thymol the MIC was 3,9 mg mL-1 in all
temperatures studied. This study demonstrated that growth temperatures influence MIC
values of eugenol. However, for thymol the MIC values were the same. This difference
can be observed because the antimicrobials studied are of different chemical classes,
eugenol belongs to the phenylpropanoid group, while thymol belongs to the terpene
group.

Keywords: MIC, major compounds, essential oil.

Support: FAPEMIG, CNPq, CAPES.

523
 tris-(1,10-phenanthroline) iron(II): drug repositioning in the
treatment of Tuberculosis
Mariana Cristina Solcia1*; Débora Leite Campos1; Patrícia Bento da Silva1; Fernando Rogério Pavan1
*e-mail: [email protected]
1
Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho” – Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara -
Laboratório de Pesquisa em Tuberculose
______________________________________________________________________________________________

ABSTRACT
Tuberculosis (TB) is responsible for about 2 million deaths and 9 million new cases
every year. One factor that contributes to these high rates is the appearance of drug
resistant bacteria. Thus, the need for new forms of treatment is clear. This work aims to
evaluate the activity of the metal complex, tris-(1,10-phenanthroline)iron(II)
([Fe(fen)3]2+) against Mycobacterium tuberculosis (MTB). [Fe(fen)3]2+ acts as precursor
to a series of chemical reactions. In order to evaluate their in vitro activity, the Minimal
Inhibitory Concentration (MIC90) in H37Rv sensitive MTB strains was determined using
the Rezasurin microtiter assay (REMA) method, and the cytotoxicity (IC50) in J774A.1
and MRC-5 cells using as a control rifampicin and doxorubicin, respectively. For the
assays, microdilution was used in 96-well plates and resazurin was used as a developer
of cell viability. Three independent trials were performed and the results are presented
as mean and standard deviation. The MIC90 of the complex, capable of inhibiting 90%
growth was 5.0μg/mL and complex concentrations in which 50% of the cells remained
viable were >500μg/mL for J774A.1 and MRC-5 in 24h, 48h and 72h.
It was also determined the selectivity index (SI=IC50/MIC90). These results were
satisfactory, because the complex showed a high SI, in whichthe active concentration
against the mycobacteria is very distant from the cytotoxic concentration, being a
promising candidate for the treatment of TB. However, more studies will be carried out,
such as determination of activity in resistant strains and search for the mechanism of
action to ensure its efficacy and safety.

Key words: Mycobacterium tuberculosis, cytotoxicity, REMA, new antibiotics.

Financial Support: CNPQ, 147308/2016-0 and FAPESP, JP 2013/14957-5

524
 Ochratoxigenic fungi isolated from different agricultural
products belonging to the EPAMIG-URESM and CCDCA-
UFLA cultural collections
Mariana Lino de Souza1*; Sara Maria Chalfoun2; Luís Roberto Batista3, Cristina Ferreira Silva1

1
Departamento de Biologia, Setor de Microbiologia Agrícola, Universidade Federal de Lavras, caixa
postal 3037,CEP 37200-000, Lavras, Minas Gerais, Brazil.*e-mail: [email protected]
2
Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais- EPAMIG -Unidade Regional do Sul de Minas,
Lavras, Minas Gerais, Brazil.
3
Departamento de Ciência de Alimentos, Universidade Federal de Lavras, Lavras, Minas Gerais, Brazil.

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ABSTRACT
The development of fungi of the genera Aspergillus can cause undesirable effects on
agricultural products, including mycotoxin contamination. Ochratoxin A (OTA) is
produced by species of the Aspergillus, which may have detrimental effects on human
health. This study aimed to evaluate the production of OTA by fungi belonging to the
Collection Cultures (Epamig-URESM) and Collection of Culture of Microorganisms of
the Department of Food Sciences of the Federal University of Lavras (CCDCA-UFLA).
Eighteen isolates were tested: Aspergillus carbonarius (6), Aspergillus niger (4) and
Aspergillus ochraceus (8). To evaluate the toxigenic potential we used the agar plug
method on thin layer chromatography, the assessment was based on retention factor
(RF) and spot fluorescence similar to the OTA standard. After obtaining pure cultures in
MA (Malt Agar), the fungal isolates were inoculated in CYA (Czapek Yeast Agar) at 25
°C by 10 days. The confirmation for the production of OTA was performed in
ultraviolet light with a wavelength between 264nm and 366nm using a cromatovisor
CAMAG (UF-BETRACHTER). The result was that 83%, 75% and 50% of the isolates
of A.carbonarius, A.ochraceus and A.niger, respectively had a fluorescence spot similar
to the standard of OTA. It was observed that most of OTA producing species was
A.ochraceus and A.carbonarius. These results indicate the need for monitoring of
mycotoxins and toxigenic fungi in coffee beans, grapes and cocoa.

Keywords: Aspergillus sp, Ochratoxin A, food.

Support: CAPES; CNPq; FAPEMIG.

525
 Growth of xylose fermenters S. cerevisiae in sugarcane
bagasse hydrolyzed

Mariane Soares Raposo1*; Camila de Souza Varize1; Ricardo Luiz Dalia1; Carolina Tieppo Camarozano1;
Renata Maria Christofoleti-Furlan1; Thalita Peixoto Basso1; Luiz Carlos Basso1
1
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”. ESALQ/USP *e-mail ([email protected])

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ABSTRACT
The growth and fermentation of hydrolyzate obtained from lignocellulosic
residues presents difficulties, such as: substrate with mixture of pentoses and hexoses
and presence of toxic substances generated in hydrolysis process. In addition, S.
cerevisiae has no capacity of metabolizing xylose. Three S. cerevisiae strains 272, 272-
1A and SA-1 were modified from the integration of three genes: xylose reductase
(XYL1), xylitol dehydrogenase (XYL2) and xyluloquinase (XYL3). We aimed to
evaluate the growth and cell viability of these strains in a media formulated with
molasses and bagasse hydrolyzate from sugarcane. Aliquots (100 µL) of the strains
were resuspended in 6 mL of HM media (Sucrose 5.98 g.L-1; Glucose 5.07 g.L-1;
Fructose 0.71 g.L-1; Xylose 148.83 g.L-1; Arabinose 6.61 g.L-1; Formic Acid 1.39 g.L-1;
Acetic Acid 17.54 g.L-1; HMF 0.18 g.L-1; Furfural 5.04 g.L-1; Ethanol 3%; Yeast
Extract 5 g.L-1; Ammonium Sulphate 2.301 g.L-1; Potassium Chloride 0.785 g.L-1;
Potassium Sulphate g.L-1; Magnesium Sulphate 0.304 g.L-1; Zinc Sulfate 0.0165 g.L-1;
Manganese Sulfate 0.0012 g.L-1; Copper Sulfate 0.0015 g.L-1), with 3 dilutions: 1:5 (A),
1:4 (B) and 1:3 (C) (30°C and 160 rpm). The media C allowed greater growth for all
strains after 72 hours, where 2721A presented D.O. (600nm) 18.69, followed by the
SA-1 18.36 and 272 17.40. The cell viability started with 100% and maintained stable
until the end of the growth, in the three means tested. It was possible to conclude that
the C media allowed a better growth and did not depreciate the viability of studied
strains.

Keywords: Second generation etanol; Hydrolyzate inhibitors; Pentose; Lignocellular.

Support: Comissão de Aperfeiçoamento de Pessoal do Nível Superior (Capes).

526
 Different concepts for identification of species within
Fusarium fujikuroi complex associated with Pokkah boeng
of sugarcane
Marileide M. Costa1; Maruzanete P. Melo2; Claudia M. O; Veiga1; Sarah S. Costa; Ludwig H. Pfenning1.

1
Departamento de Fitopatologia, UFLA, 37200-000, Lavras MG. *E-mail:[email protected]
2
Departamento de Fitotecnia, UFPI, 64049-550 Teresina PI
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ABSTRACT
Pokkah-boeng is a disease of sugar cane (Saccharum officinarum) caused by species
belonging to the Fusarium fujikuroi species complex (FFSC). The most typical
symptoms of the disease are a morphological deformation of the plant, but also stem rot.
While the occurrence of symptoms is eventually reported in plantations in Brazil, no
official reports of the disease exist. The morphological, biological and phylogenetic
species concept were applied for a consistent identification of species of the FFSC
associated with symptoms of Pokkah boeng in sugarcane from Brazil, using molecular
phylogeny, sexual compatibility and analysis of morphological markers. Twenty two
monosporic isolates were obtained from states Maranhão, Minas Gerais and Paraíba.
The tree inferred from EF-1-, generated by Maximum parsimony analysis revealed
that strains studied formed a single, strongly supported clade with reference material of
F. sacchari. Field isolates were crossed with F. sacchari female fertile tester strains and
produced fertile perithecia and viable ascospores. The morphological markers of the
species were also observed, like conidia formed in the aerial mycelium on polyphialides
only in false heads. In the Brazilian literature the pathogen is referred as “F.
moniliforme”. However, this name is invalid as it was dismembered in several
phylogenetic and biological species within FFSC. This is the first report of F. sacchari
associated with Pokkah boeng in sugarcane in Brazil. The results contribute with basic
knowledge about the etiology of the disease and for the development of strategies for
diagnosis and monitoring.

Keywords: Saccharum officinarum. Molecular Phylogeny. Mating Population.

Support: CNPq; CAPES

527
 Sediment profile influences on methane cycle communities in
Amazonian wetlands
Mariley de Cássia da Fonseca1*; Júlia Brandão Gontijo1; Aline Giovana da França1; Andressa Monteiro
Venturini1; Elisa Costa Nadalini1; Fernanda Mancini Nakamura1 Siu Mui Tsai 1
1
Instituição: Centro de Energia nuclear na Agricultura – CENA/USP *e-mail: [email protected]
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ABSTRACT

Wetlands are one of the largest natural sources of methane found in the atmosphere and
account for 20% of the total area of the Brazilian Amazon. River sediments are an
example of a unique type of ecosystem, where methane produced in anaerobic zones by
methanogenic Archaea is oxidized to CO2 by methanotrophic Bacteria. Thus, the
present work aimed to quantify the total microbial community through the Archaea and
Bacteria 16S rRNA genes, in addition to the mcrA and pmoA functional genes, related
to methanogenic Archaea and methanotrophic Bacteria, respectively, along the
sediment profile. The sampling was done during October 2016 (dry season), in three
wetland areas from Amazonas and Tapajós rivers from 0 to 10 and 10 to 20 cm depth in
the top sediment layer, in four points of each area, used to physicochemical and
molecular analysis. The abundance of 16S rRNA genes of Archaea and Bacteria, mcrA
and pmoA genes was measured in triplicate by quantitative real-time PCR (qPCR) using
the specific sets of primers for each gene. Data were submitted to the Kruskal-Wallis
test and correlated with the Spearman test. Regardless of the depth, the abundance of
mcrA was higher in relation to pmoA in all areas, evidencing the methane emission
potential of wetlands. Along the sediment profile, changes occurred in the
physicochemical patterns and in the abundance of the 16S rRNA genes of Archaea and
Bacteria, mcrA and pmoA genes, suggesting that the microbial community involved in
the CH4 cycle is shaped by environmental characteristics.

Keywords: microbial ecology, methanogenes, methanotrophs , qPCR.

Support: FAPESP / CAPES / CNPq

528
 Diversity of filamentous fungi in the south of Minas Gerais
vineyards
Michele de Oliveira Aragão1*; Nathasha de Azevedo Lira1; Fábia Paulino de Deus1; Danielle Aparecida
da Silva1; Luiz Gustavo Condé Lima1; Lorena Dutra Silva1; Anielli Souza Pereira1; Fabiana Reinis Franca
Passamani1; Luís Roberto Batista1
1
Federal University of Lavras – UFLA. Departament of Food Science *[email protected]

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ABSTRACT

Minas Gerais recently gained prominence in wines production with new techniques of
cultivation, such as invert vine cycle, enable crops in winter with better weather. Some
microorganisms, for example filamentous fungi, present in the soil, air, leaves and
berries of grapes influence the quality of the wines, altering desirable or the undesired
the product. This study aimed to isolate and identify filamentous fungi in the air and
leaves of vineyard located in Três Pontas and Três Corações. We used spontaneous
sedimentation in Petri’s board for isolation of air fungi and serial dilution in DRBC and
DG18 medias for analysis of the leaves. Following the purification in MA media, the
isolates were inoculated in specific media and identified using the identification
manuals. It was identified 120 air fungi: Alternaria sp (12), Aspergillus niger (1),
Cladosporium cladosporioides complex (70) Epicoccus nigrum (12), Fusarium
semitectum (11) F. oxysporum (4), Penicillium corylophilum (1) P. solitum (1),
Rhyzopus sp. (3). From the leaf samples were identified 164 fungos: Alternaria sp (15)
A. aculeatus (2) A. japonicus (1) A. tubingensis (1) C. cladosporioides complex (106) E.
sp (3) F. decemcellulare (1), M. semitectum (2), F. sp (2), P. funiculosum (2) P. sp (4), P.
crust (1) P. paxilli (1), Ulocladium sp.(7). It was observed greater incidence of
Cladosporium cladosporioides complex species in both samples. Those species cause
bunch rot, being commonly distributed in wine regions. In Chile more than 50% of
grapes present contamination with C. herbarum and C. cladosporioides, which cause
dehydration of the berries.

Keywords: wine, Cladosporium cladosporioides, mycobiota terroir

Support: Capes, CNPq, FAPEMIG

529
 Archaeal, bacterial and fungal responses to vinasse and
nitrogen application to the sugarcane soil
Miriam Gonçalves de Chaves1; Siu Mui Tsai1; Acacio Aparecido Navarrete2*

1
Laboratório de Biologia Celular e Molecular, Centro de Energia Nuclear na Agricultura CENA-USP,
Piracicaba, SP, Brasil.
2
Centro de Ciências e Tecnologias para a Sustentabilidade (CCTS), Departamento de Ciências
Ambientais, Universidade Federal de São Carlos UFSCar, Sorocaba, SP, Brasil.
* [email protected]

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ABSTRACT

Studies from the late 1980s have recommended the use of nitrogen (N) fertilizer in
combination with vinasse (V; a by-product of the sugar-ethanol industry) in sugarcane
fields. Here we focused on the effects of combined applications of V and N fertilizer to
the soil on the taxonomic groups of Archaea, Bacteria and Fungi in sugarcane-
cultivated soils in a greenhouse mesocosm experiment monitored for chemical factors.
Across 21 soil metagenomic datasets, effects of N+V fertilization were observed, in
which no change in total bacterial abundance was revealed during the experiment, while
that of Archaea e Fungi decreased and increased, respectively. Differences in relative
abundance of metagenomic sequences were mainly revealed (P<0.01) for archaeal
phylum – Euryarchaeota, and bacterial phyla – Acidobacteria, Chlamydiae,
Chloroflexi, Deltaproteobacteria, Firmicutes, Poribacteria and Verrucomicrobia
between 7 and 150 days after N+V application to the soil. Increase in abundance was
observed for fungal phyla after 150 days of the experiment for N+V amended soil, but it
was not statistically significant. Chemically, N+V fertilization increased soil pH, total
carbon and sulfur concentration, whereas decreased soil organic matter. These
differential response for microbial groups are being interpreted together with data
obtained using a high density functional gene array contains 101,796 distinct probes
belonging to microbial genes of known function. We expected provide in a near future
a better understanding about the effect of combined applications of N+V fertilizer to the
soil on the microbial community and mediated processes not only essential to
ecosystem function but also for the sustainable management of agroecosystems.

Keywords: metagenome, bulk-soil, microbiome, sustainable agriculture.

Support: Capes (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior).

530
 Comparative analysis of the action of the adsorbents
hydrotalcite, Moringa oleifera and activated carbon in the
treatment of landfill leachate
Nair Conde de Almeida1*, Valdenilson José Alves de Oliveira2, Dejanira Franceschi de Angelis3
1,2,3
Department of Biochemistry and Microbiology - Institute of Biosciences - São Paulo State University,
UNESP. *[email protected]

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ABSTRACT
Landfill leachate is formed by organic and inorganic toxic compounds, it has high salt
concentration and pathogenic organisms that can cause environmental damages.
Hydrotalcites, activated carbon and M. oleifera seeds have been used for adsorption and
water purification. The landfill leachate was submitted to physicochemical and
microbiological analyzes before and after treatments with these adsorbents. The
leachate characterization found small number of heterotrophic bacteria and fungi,
indicating unfavorable conditions for microbiological growth. Total coliforms and E.
coli reached mean values of 17900 and 890 NMP/100mL respectively. The leachate
physicochemical analyzes indicated high values for conductivity, color, turbidity, COD,
BOD5, ammonia, boron, sodium and chlorides. The treatment with hydrotalcite
produced the best results for the removal of the mentioned parameters, but pH
increased. 4% activated carbon obtained better results for color and COD removal but
didn’t remove boron and ammonia efficiently. M. oleífera seed obtained unsatisfactory
results. All adsorbents decreased by about 10 times the heterotrophic bacteria amount.
Total coliforms and E. coli didn’t resist the treatments. None of the adsorbents removed
sodium, chloride or leachate toxicity for Daphnia similis.

Keywords: Landfill leachate, boron adsorption, hydrotalcite, Moringa oleifera,

activated carbon

Support: Capes

531
Extraction of a yeast lipase from Antarctic environment using
Aqueous Two-Phase System
Natália Melani1; Lara Sette2; Elias Tambourgi1; Edgar Silveira3
1
Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química. *e-mail (autor para
correspondência): [email protected]
2
Universidade Federal de Uberlândia, Instituto de Genética e Bioquímica.
3
Universidade Estadual Paulista Campus Rio Claro, Departamento de Bioquímica e Microbiologia.

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ABSTRACT
Lipases are enzymes that catalyse the hydrolysis of the ester bonds in the molecules of
triglycerides, liberating free fatty acids (FFAs) and glycerol under natural conditions
and have the potential to intermediary different biochemical reactions such as
hydrolysis, transesterification, interesterification, esterification, alcoholysis and
acidolysis. These properties confers to lipases a huge range of industrial applications,
with emphasis on food processing, pharmaceutical, cosmetic and fine chemicals
industries. They can be produced by animmals, plants, bacterias and fungi, altought
microbial enzymes are desirable since they present high stability and selectivity.
Efficient downstream processing techniques are essential for commercial production of
enzymes, and Aqueous Two-Phase System (ATPS) shows great promise specially due to
advantages such as high biocompatibility, continuous mode of operations, potential for
scaling up, and low toxicity of phase-forming chemicals. The main purpose of this work
was analyze by Full Factorial Design 25 the influence of five factors on enzyme
partitioning of a yeast lipase derived from Antarctic environmet using ATPS composed
by Polyethylene glycol (PEG)/phosphate. The five factors studied were: molecular mass
of PEG, PEG concentration, Salt concentration, pH and sample volume. The main
studies indicated lipase has tendency to partition in PEG-rich phase. The sample volume
and salt concentration had significant effect (p < 0.05) on enzyme and protein partitions.
These resuts demonstrate lipase can be extracted using PEG/phosphate ATPS, altought,
it still is necessary design new experiments to optmize the system and find the best
conditions to extraction.

Keywords: Downstream processing, Polyethylene glycol, Liquid-liquid extraction

Support: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

532
Sensory analysis of fermented beverages from different yeasts
Paulo Renato Matos Lopes1*; Alessandra Baroni Rodrigues Neves1; João Vitor França Pirola1
1
Faculdade de Ciências Agrárias e Tecnológicas, UNESP - Universidade Estadual Paulista, Câmpus de
Dracena. Rodovia Comandante João Ribeiro de Barros, km 651, CEP 17900-000, Dracena, Brasil.
*
[email protected]

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ABSTRACT
The purpose of this work was to sensorially evaluate alcoholic beverages fermented
from two fruits by different yeasts. Six types of alcoholic beverages were prepared from
grape and jabuticaba by three yeast strains: W) wild, present in fruit itself; B) bakery,
acquired as baker’s yeast; and AB) of alcoholic beverages, specific for mead production.
Initially, 1.0 kg of fruit was manually macerated and the wort produced was chaptified
and it was added 0.15 g.L-1 of sodium metabisulfite. Then, yeasts were reactivated by
hydration and inoculated in plastic containers with airlock system, i.e., without air
entering. Two transfuges were performed during 70 days of fermentation process. In
order to indirectly determine sugars concentration in wort, ºBrix measurements were
conducted by refractometer at each process step. After the preparation period, the six
beverages were evaluated by FCAT/UNESP academic community by sensory analysis
cards. Four parameters were rated from 1 to 5 in ascending order: appearance, aroma,
flavor and final evaluation. Furthermore, it was identified the preference among
beverages made from the same fruit and fermented by different yeasts. Results revealed
a higher preference for beverages from wild yeast both for grape (45.7%) and jabuticaba
(64.7%). Regarding sensory parameters, it was observed that: Appearance had 77.2% of
4 and 5 rating; Flavor demonstrated a rejection for beverages produced with jabuticaba;
Aroma had an excellent evaluation in grape beverages. Lastly, the averages in final
evaluation for the fermented beverages from jaboticaba and grape were 2.74 and 3.09,
respectively.

Keywords: aroma; flavor; grape; jabuticaba; yeast strain.

533
Prospecting of yeast of biotechnological interest from residual
activated sludge
Rafaela Cabestré1*; Geisiany Maria de Queiroz-Fernandes2.
1
Universidade do Sagrado Coração- Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação (PRPPG), Centro da
Saúde, Biomedicina, Bauru/SP. *e-mail: [email protected]
2
Universidade do Sagrado Coração- Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação (PRPPG), Programa de
Mestrado em Ciência e Tecnologia Ambiental, Bauru/SP.
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ABSTRACT

Biotechnological advances has contributed to the development of knowledge on

biodiversity and the prospect of new micro-organisms allowing economic development
and scientific enrichment. Activated sludge systems are used in the treatment of waste
industrial, representing a source of micro-organisms that may has capacity to produce
enzymes of biotechnological interest as proteases, which are used in different industries
and in diagnostic kits. This study aimed to prospect yeast producer of enzymes in
residual activated sludge, donate by a cellulose industry from state of São Paulo. This
material was collected after the treatment process of waste generated in the cellulose
bleaching steps. Isolation of fungi was performed using the culture medium
Sabouraud’s agar with chloramphenicol; after isolation, the maintenance of these fungi
was realized in sterile distilled water according methodology described in scientific
literature. The presumptive identification of fungi was carried out through optical
microscopy direct and micro-cultivation. Correlating the macroscopic, microscopic,
growing conditions characteristics and comparing with atlas mycological were
identified five yeast colonies corresponding to Candida krusei, Candida tropicalis,
Geotrichum sp. and Rhodotorula sp.

Keywords: Biodiversity. Bioprospecting. Enzymes. Yeast fungi.

534
 Biodegradation of perfluorinated compounds and their
impact in soil microbiota compared to plant toxicity datasets
Renato Nallin Montagnolli1,*; Jaqueline Matos Cruz1; José Rubens de Moraes Júnior1; Elis Marina Turini
Claro1; Gabriela Mercuri Quitério1; Ederio Dino Bidoia1

1
UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências,
Departamento de Bioquímica e Microbiologia. Avenida 24-A, 1515, Bela Vista, 13506-900. Rio Claro,
SP, Brasil. *[email protected]
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RESUMO
The use of fluoride based foams increases the effectiveness of fire-fighting operations,
but they are also accompanied by major drawbacks regarding environmental safety of
perfluorinated compounds (PFCs). There is a significant knowledge gap on PFC
toxicity, even though such data could be useful towards bioremediation procedures. It is
consensus that a realistic assessment of fire-fighting foam toxicity should cover as many
test organisms as possible, however, few studies combine the performance of
ecotoxicological tests with a detailed study of microbial communities in soil
contaminated with firefighting foams. Our research evaluated the effects of natural
attenuation of PFCs on the development of lettuce seeds and in soil microbiota using the
2,6 dichlorophenol-indophenol redox dye as microbial metabolism indicator. We aimed
to determine whether aqueous film forming foams toxicity increased or decreased over
time in a simulated contamination scenario. The phyto-toxicity of PFCs to lettuce was
high, increasing as a function of the concentration and decreasing as a function of
exposure time to the environment. However, very specific concentrations throughout
biodegradation result in the formation of non-inhibiting intermediates. Therefore,
variable biodegradation-dependent germination rates may be misleading on non-time-
based monitoring approaches. We also proposed that the colorimetric data modelling
could also establish a novel toxicity parameter to evaluate the release impacts to soil and
biota. The combined assays allowed the monitoring of PFCs during long term
exposition to plants as well as their immediate effects on the same soil microbiota.

Palavras-chave: AFFF, perluorinated compounds, germination, response surface

analysis, soil toxicity

Apoio Financeiro: ANP-PRH-05/Petrobrás, CNPq, CAPES, UNESP.

535
 Novel Biotechnological Spray Formulation for Fungi and
Bacteria control
Roberta Cavalcante Tenorio Almeida¹; Adriana Todaro²; Cícero Eduardo Ramalho Neto ¹

¹Molecular Genetics and Proteomics Laboratory – GEMPRO, Federal University of Alagoas.

*[email protected]
²Federal University of Alagoas.
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ABSTRACT
Bacterial and fungal infections are commonly reported in tropical countries and
represent an important public health problem. Plant diseases are also considered one of
the main factors responsible for the reduction of food production around the world. In
the last three decades the incidence of infections caused by bacteria and fungi has
increased considerably. This is one of the reasons why there is a strong worldwide
biotechnological interest to search for new substances and biocompounds with
antimicrobial activities. This work intended to present a spray formulation containing a
biocompoud (Monella1) produced by endophytic filamentous fungus A1a. The
formulation has shown to be effective against different genus of bacteria and fungi. The
biocompound was obtained from culture filtrates of A1a. Antagonism tests revealed
inhibitory halo formation against human pathogenic bacteria like Proteus mirabilis,
Salmonella typhi ATCC 14028, Shigella sp., Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 and
Streptococcus pyogenes by using mini-gel-blocks from A1a. We also carried out tests of
antagonism by using the dual culture method against important phytopathogens like
Fusarium oxyporum, F. solani, Macrophomina phaseolina, Magnaphorte orysae,
Colletotrichum gossipi and Sclerotium rolfsii. We have devoloped a spray solution
containg 5% of biocompound in ethanol 54° GL.

Keywords: Antiseptical Spray, Applied Biotechnology, Bacteria and Fungi infections.

Support: Universidade Federal de Alagoas

536
 Fungal strains identification for gold nanoparticles
biosynthesis
Rodrigo Ken Kawassaki1,2; Leilane Hespporte Iwamoto1; Sérgio Fernandes1; Cristiane Angélica Ottoni1,3*
1
Laboratório de Biotecnologia Industrial - Instituto de Pesquisas Tecnológicas (LBI-IPT).
2
Instituto de Química - Universidade de São Paulo (IQ-USP).
3
Instituto de Biociências - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (IBCLP-UNESP).
* [email protected].

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ABSTRACT
Metallic nanoparticles present unique properties that are different from the bulk
material. Hence, their application has been explored in various fields, such as
biomedicine, electrochemistry and environment. The biological synthesis of these
nanoparticles is interesting, since it avoids the use of toxic chemicals and high energy
demand. The aim of this study was to identify isolated fungal strains for gold
nanoparticles (AuNPs) biosynthesis. Extracelullar fungal extract was used to reduce
HAuCl4 to AuNPs in 48 h at 30 °C. Four out of seven screened fungal strains carried on
the biosynthesis in such conditions. The nanoparticles biosynthesized by IPT1011,
IPT1013, IBCLP11 and IBCLP15 strains were characterized by UV-vis and Fourier
transform-infrared (FT-IR) spectroscopies and dynamic light scattering. The UV-vis
analysis presented absorption peaks ranging from 533 to 566 nm and near 280 nm,
which were attributed to the surface plasmon resonance band of the AuNPs and the
electronic excitation of aromatic amino acid residues in proteins, respectively. The
AuNPs average sizes and zeta potential ranged from 51 to 211 nm and -38,33 to -6,33
mV, respectively. The FT-IR analysis indicated the presence of proteins as capping
agents. The synthesis process using IBCLP11 strain will be optimized in order to obtain
particles smaller than 100 nm for further application. IPT1013 strain yielded AuNPs of
desired profile with 95 nm size and -38,33 mV zeta potential, which indicated stable
nanoparticles. Whole AuNPs characterization is underway. This work identified four
fungal strains for promising eco-friendly and cost-effective method for AuNPs
biosynthesis.

Keywords: metallic nanoparticle, mycosynthesis, fungal extract, nanoparticle

characterization.

Support: Fipt.

537
 Production and Evaluation of the Activity of Chitinase by
Trichoderma reesei and Penicillium simplicissimum

Rodrigo Sorrechia1*; Vanessa Raquel Greatti1; Rafaela Regina Fantatto1; Lucas Barbosa Cristovão1;
Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro1

Department of Drugs and Medicines. School of Pharmaceutical Sciences – UNESP, Araraquara, SP,
1

Brazil . *E-mail: [email protected]

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ABSTRACT
Chitinases are endoglycosyl hydrolases that break glycosidic bonds in chitin a
component of the cell walls of fungi and exoskeletal of some animals including worms
and arthropods. Chitinases can be applied in biocontrol as a protective agent against
phytopathogenic fungi and in production of oligosaccharides as biologically active
substances.The aim of this study was the production and evaluation of the enzyme
chitinase of two fungi Trichoderma reesei (RUT C30) and Penicillium simplicissimum
(FAT 7686).Submerged fermentation was carried out in erlenmeyers with spore
inoculum (107) for seven days at 28°C with 120 rpm agitation using the liquid culture
media (KH2PO4 2g/L, NaH2PO4 6,9g/L, (NH4)2SO4 4,2g/L, MgSO4.7H2O 0,3g/L,
CaCl2.2H2O 0,002g/L, ZnSO4 0,0014g/L, FeSO4.7H2O 0,005g/L, Tween80 0,02mL/L,
Colloidal Chitin (enzymatic inductor) 10g/L). To separate the supernatants from the
mycelium the culture was vacuum filtrated through filter paper. The Bradford Assay
was used to determinate the total protein concentration and the chitinase activity assay
was performed using colloidal chitin where the reducing sugar formed was detected at
540 nm by the DNS method according to Miller (1959).The total protein concentration
produced by T. reesei was 0, 14 mg/mL and the chitinase activity was 0,15 U/min/mL
that provided a specific activity of 1,07 mg/mL. The P. simplicissimum didn´t produce
the enzyme in these experimental conditions. The genus Trichoderma and
Penicillium are good producers of enzymes but in this study we observed that P.
simplicissimum was not able to produce the enzyme chitinase. To improve T. reesei
production, new fermentation parameters can be evaluated.

Keywords: enzyme, fermentation, chitinase, Trichoderma reesei, Penicillium

simplicissimum

Support: UNESP

538
 Diversity and ligninolytic activity of fungi from regions with
different states of conservation of the Iguazu National Park

Samantha Beatríz Esparza Naranjo1; William Bartolomeu de Medeiros1; Michel Rodrigo Zambrano
Passarini1; Rafaella Costa Bonugli-Santos1*
1
Universidade Federal da Integração Latino-Americana. *[email protected]
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ABSTRACT
The fungal diversity has a main role in vegetal compounds degradation and despite the
importance of fungal diversity, the microbiota of the soil in the Iguazu National Park
(INP) – Paraná is virtually unknown. Furthermore, the assessment of the genetic and
functional diversity, like ligninolytic enzymes, of fungi from this environment is
important for ecological understanding and environmental recovery activity. Therefore,
the present study has the main goal to assess the soil fungal diversity and its potential
expression of ligninolytic enzymes in two points of the INP: 1. area in environmental
recovery to more than 10 years; 2. area currently impacted. All isolating process was
made by two treatments: with 4mM of guaiacol reactive (selection of ligninolytic fungi)
and without it. So far, 21 fungi were isolated, 10 in MA2 (malt extract) and 11 using
PDA (potato dextrose agar). The isolated genera are common groups of soil fungi,
stands out the presence of the genus Penicillium identified only from the local in
environmental recovery and Aspergillus and Fusarium from the impacted area. In both
places, fungi were identified with reproductive structures of the chlamydosconidium
type. Only fungi from the region under environmental recovery showed ligninolytic
activity. The results obtained show a possible correlation between the conservation
status of this area and diversity (relatively low) and ligninolytic activity, important for
the current works of management and recovery of INP and for understanding the
cycling of vegetal organic matter.

Keywords: soil fungal diversity, ligninolytic fungi.

Support: UNILA

539
 Selection of fungi for xylanase production

Sirlene do Nascimento Senna1; Leticia Ferreira Louzada¹; Vanina Lilián Castroagudin² ; Heloiza Ferreira
Alves Prado2*
1
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Fillho “Câmpus de São José do Rio Preto” *e-mail:
[email protected]
2
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho “Câmpus de Ilha Solteira”.

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ABSTRACT
The enzymatic depolymerization of hemicellulose in monomeric sugars requires the
synergistic action of multiple enzymes. Xylanases exercise a vital function in the
depolymerization of xylan, the main component of hemicellulose. The aim of this study
was the isolation of filamentous fungi from a Cerrado area in the city of Inocência-MS.
About eleven strains with growth at 30 °C were analyzed for potential xylanase
production. The best activities were obtained by isolates IPS 9.1, IPS 8.2 and IPS 14.3.
Later, for this species, was realized the study of the effect of the carbon source using
different substrates, such as: wheat bran, passion fruit peel, corn straw, box card,
brachiaria, corn cob with different grain sizes, sawdust and sugarcane bagasse under
solid fermentation. The isolate IPS 8.2 was identified by amplification of the rDNA
using ITS1 and ITS4 primers. The comparative analysis of the sequence obtained and
those available in GenBank showed that the IPS8.2 isolated is closely related to the
Gongronella butleri specie. The xylanases production profile was analyzed along the
cultivation time using the best substrate Gongronella butleri presented the highest
production of xylanases (49.35 U/ml) when grown on wheat bran under solid
fermentation. Analyzing the production profile was observed a decline in the xylanases
production over 72 h. The Gongronella butleri has shown great potential for the
production of xylanases under solid fermentation, at 72 h. The others isolates showed
that the Cerrado area under study favored the isolation of differents fungal strains with
potential for xylanases production.

Keywords: Xylanase, Cerrado biome, agro-industrial waste, solid fermentation, fungal

Support: Capes

540
 Isolation and identification of yeasts in homemade frescal
minas cheese

Suemis Maria Parenti de Souza*1; Daelen Rezende de Oliveira2; Mauro Guilherme Barros Cardoso1;
Lisiane Furtado Fonseca1; Thiago Oliveira Condé1; Anielli Souza Pereira1; Beatriz Carvalho1, Rosane
Freitas Schwan1

1
Instituição. University Federal of Lavras - UFLA *e-mail: [email protected]
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ABSTRACT
The yeasts present high physiological diversity and can be found in different
environments. Yeasts metabolism enable them to participate in several fermented foods,
for production of beer, vine, cheese, breads among others. In cheese production, yeasts
have on important role because their ability to ferment or assimilate lactose, galactose,
production of alkaline metabolites, and aromatics compounds, growth in low
temperature and high salinity tolerance. The yeasts counting and isolation from cheese
were done utilizing the spread plate technique in YEPG agar medium (Yeast extract 1%,
glucose 2%, peptone 2% and agar 1,5%) added chloranphenicol and pH modified for
3,5, the experiment can realized in duplicate and incubates for 48h and 30°C. The
Frescal cheese were purchased at local market and presented yeast population of 1.4 x
103 UFC/g. The different morphotypes found were purified for biochemical tests with
carbohydrate fermentation, osmolarity, temperature, sporulation, urea hydrolysis, DBB
and starch hydrolise. The identification was done by use of virtual identification key
CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre and confirmed by MALDI TOF technique. The
results of biochemical tests allowed the identification of genus Candida,
Aureobasidium, Malassezia, Endomyces and Rhodotorula. Using MALDI TOF
technique, it was possible to identify at the species level the yeast Rhodotorula
mucilaginosa, that presented 2,171 of confiability score. Therefore, the present work
presented that yeasts found in cheese, can be originating of milk, or the manufacture
process, which earn attention of producers, because some species found can be
pathogenic.

Keywords: MALDI-TOF, Fermentation, biochemical tests .

Support: FAPEMIG, Capes and CNPQ.

541
Taxonomic assessment and antimicrobial screening of isolated
bacteria from marine and terrestrial Antarctic samples
Tiago R. Silva 1,2, Alysson W. F. Duarte3, Michel R. Z. Passarini4, Ana Lucia T. G. Ruiz5, Caio Haddad
Franco7, Carolina Borsoi Moraes7, Fabiana Fantinatti-Garboggini12, Itamar Soares Melo8, Rodney A.
Rodrigues6 and Valéria M. de Oliveira
1
Instituto de Biologia, Universidade de Campinas s – UNICAMP 13083-970, Campinas, SP, Brasil.
[email protected]
2
Divisão de Resursos Microbianos, CPQBA UNICAMP, Campinas, Brasil.
3
Universidade Federal de Alagoas UFAL, Alagoas, Brasil
4
Universidade da Integração Latino-Americana, UNILA, Foz do Iguaçu, Brasil
5
Divisão de Farmacologia e Toxicologia, CPQBA UNICAMP, Campinas, Brasil.
6
Divisão de Química de Produtos Naturais, CPQBA UNICAMP, Campinas, Brasil.
7
Laboratório Nacional de Biociências, Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais, Campinas,
Brasil
8
Laboratório de Microbiologia Ambiental EMBRAPA Jaguariúna, Brasil.

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ABSTRACT
Microorganisms dominate most of Antarctic ecosystem and play a crucial role in its
functioning. They are called extremophilic microorganisms with unique and versatile
metabolic properties with possible biotechnological applications in several areas. The
aim of the present study was to taxonomically characterize psychrophilic
microorganisms from Antarctic continent samples and to screen them for antimicrobial
effects. Phylogenetic analysis revealed that most isolates shared 98–100 % sequence
similarity to recognized species, including those recovered previously from the
Antarctica environment, which belong to the major phyla Firmicutes, Bacteroidetes,
Actinobacteria and Proteobacteria (classes Alpha and Gammaproteobacteria). A total of
361 bacteria strains, distributed in 38 different genera, were recovered and identified
based on sequencing of the 16S rRNA gene. The main representative genera were
Arthrobacter (29%), Psychrobacter (19%), Pseudoalteromonas (10%) and Rhodococcus
(4%). Antimicrobial screening of 600 bacteria revealed sixteen strains capable of
inhibiting growth of at least one of the strains: E.coli, Micrococcus luteus,
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis and Candida albicans. One psychrotolerant
bacterium, Pseudomonas mandelii strain 99, showed a broad antimicrobial range and
was selected for further antiproliferative and antiparasitic tests due to low values in
Minimal Inhibitory Concentration assay. Results demonstrated that the extremophiles
from Antarctica represent an untapped source of diverse microorganisms capable of
antimicrobial metabolite production.

Keywords: Antimicrobial activity, Antarctica, Bacterial taxonomy, Antiproliferative

effect, 16S rRNA genes.

Support: FAPESP process number 2014/17936-1

542
 Comparison between culture media submitted with different
microorganisms by the ecometric test

Valéria França de Souza1*; Laura de Queiroz Bomdespacho2; José Luís Ramirez Ascheri3

1
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, RJ. *e-mail ([email protected])
2
Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, SP
3
Pesquisador da Embrapa Agroindústria de Alimentos, RJ.

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ABSTRACT
Quality Control aims to ensure reliable results. The objective was to use the ecometric
test and to evaluate the quality of the different types of culture medium. The culture
media were tested by the ecometric method. The research was performed in four culture
media: Hektoen, crystal violet bile Agar (VRB), Bacillus cereus, PCA and six
microorganisms were used: Pseudomonas fluorescens, Bacillus cereus, yeast,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Salmonella typhimurium. The results
obtained for the microorganisms (Bacillus, yeast and Pseudomonas) in media and
temperature at 30 ° C. In the selected microorganism "Bacillus" for the media VRB and
Hektoen the results not showing growth. The PCA medium obtained the best result,
followed by the selective medium for Bacillus cereus. For the "yeast" the analyzed
media (Hecktoen, PCA and Bacillus cereus) not satisfactory results. For
"Pseudomonas" presented satisfactory growth in the media (VRB, Hecktoen, PCA and
Bacillus cereus) with differentiated aspects of the colony. The microorganisms (S.
aureus, E.coli and Salmonella in media and temperature at 36ºC showed the results: for
the S. aureus in the media VRB and Hecktoen did not present satisfactory results
because the VRB presented the highest growth index (A and B), which showed no
satisfactory growth index in the other mediums (PCA and B.cereus). It was concluded
that the ecometric test can be useful in the monitoring of culture mediums, and that the
growth of Salmonella can be useful in the monitoring of culture mediums (VRB, PCA,
Bacillus cereus).

Keywords: Microbiological control. Isolation methodology. Legislation.

Support: CAPES, UFRRJ.

543
 Microbiological evaluation of leafy vegetables produced by
organic and conventional farming systems
Vanessa Merlini1; Giselle Pereira1; Larissa da Silva1; Franciele da Silva2, Rafaela Rossi3, Fabíola Pena1;
Adriane Antunes1

1
Faculdade de Ciências Aplicadas FCA/UNICAMP*e-mail ([email protected])
2
Faculdades Integradas Einstein de Limeira/ FIEL
3
Faculdade Herminio Ometto/ FHO
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ABSTRACT

Alternative production systems have been increasing food supply, following a healthy
trend as the guiding criterion of food choices. However, during the fertilization of
vegetables, both organic and conventional, animal manures are used, presenting a
potential source of microbiological contamination. In view of the above, the objective of
this work was to evaluate the microbiological contamination of leafy vegetables
produced by organic and conventional farming systems. In this work, seven types of
leafy vegetables produced by organic and conventional farming systems were evaluated,
and five units of each vegetable were analyzed, totaling 70 samples. Mesophilic
aerobes, molds and yeasts, coliforms 30 and 45°C counts were made; the presence of
Salmonella sp. evaluated and biochemical identification of Enterobacteria, were
performed using miniaturized biochemical kits. Greater microbiological contamination
was observed in the vegetables produced by conventional cultivation when compared to
organic vegetables. Enterobacteria were found in 4 types of organic vegetables, as well
as in 4 conventional cultivation. The presence of Salmonella sp. was not observed in
any of the vegetable of both crops systems. Lettuces crespa Vanda and Americana
varieties of the conventional cultivation presented counts for coliforms 45°C higher than
those established by RDC Nº 12 (10² NMP/g), being inadequate according to the
legislation. All organic vegetables analyzed complied with Brazilian legislation,
possibly due to composting of the manure used and good agricultural practices during
cultivation. Contrary to expectations, microbial counts were statistically higher for
conventional plants compared to those produced by organic cultivation.

Keywords: Healthyness, vegetables, contamination, enterobacteria, fo

544
 Liquid agroindustrial waste in production of cellulase
Vanessa Fernanda Stati*¹, Bruna Letícia Martins1, Cynthia Rustiguel2, Geisiany Maria Queiroz-
Fernandes1
1Universidade do Sagrado Coração- Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação (PRPPG), Programa de Mestrado em
Ciência e Tecnologia Ambiental, Bauru/SP. *e-mail (autor para correspondência): [email protected].
2Department of Biology, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto - USP/SP.

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ABSTRACT
An alternative to reduce environmental damage related to the increase of industrial
waste generation is to find possibilities of your reuse, a common example is the
combustion of organic waste for the production of heat and energy. In the process of
obtaining cellulose, high quantity of chemical products is used, causing contaminations
and generating concerns to its proper disposal. Therefore, considering the high cost of
production of cellulase on a large scale, this research aimed to produce the enzyme
through submerged liquid fermentation using Aspergillus niger inoculated in culture
medium with two residues from the pulp industry, one acid and the other alkaline,
separately, to verify the cellulase indution capacity in the production. The production
conditions are described in the literature. The proportions the residues added to the
culture medium varied at concentrations of 0, 50 and 100% and the carbon source at
concentrations of 0.5g and 1.0g searching to reduce the cost of production. After the
production and recovery of the enzymatic extract, protein was quantified by Bradford
method and cellulase activity was quantified using carboxymethylcellulose as substrate.
The results indicated better production when used 0.5g of carbon source, 14% of acid
residue and 50% of alkaline residue. These results showed the ability of residues to
induce fungus to produce cellulase, allowing the steps following of optimization.

Keywords: Aspergillus niger, submerged liquid fermentation, enzymes.

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