Protocolo PCR

Número:
PROTOCOLO DE AULA PRÁTICA LAB-PAP-XX

CURSO: Biomedicina e Farmácia Aprovação:
Diretoria Acadêmica
DISCIPLINA: Biologia Molecular
Ser Educacional
ELABORADO POR: DATA: Revisão:
Valeska Santana de Sena Pereira 20/11/2017 00
NOME DA PRÁTICA:
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
OBJETIVOS DA PRÁTICA:
 Realizar a amplificação de um segmento de DNA pela técnica de PCR.
 Identificar os componentes necessários para a reação de PCR.
OBS.: A quantidade (qtd) material listada abaixo é estimada para apenas um grupo de alunos. A
quantidade de grupos, por aula, deve ser definida pelo professor. Sugestão (4 – 6) aluno por grupo.
QTD DESCRIÇÃO DAS VIDRARIAS QTD REAGENTES E SOLUÇÕES
10 Ponteiras de 200 µL (amarelas) 01 PCR SuperMix invitrogen (75 µL)
10 Ponteiras de 0,1 a 10 µL 01 Água free nucleasse (51 µL)
6 Microtubos para PCR de 200 µL 01 Primer PC03 (forward) para o gene da ß-
globina humana (6 µL)
01 Microtubo de 1,5 mL Primer PC04 (reverse) para o gene da ß-
globina humana (6 µL)
QTD MATÉRIA-PRIMA/INSUMO OU ANALITO QTD EQUIPAMENTOS POR GRUPO
1 DNA humano (12 µL) 01 Termociclador*
01 Cabine de segurança biológica*
01 Micropipeta automática de 2 – 20 µL
01 Micropipeta automática de 20 -200 µL
MÉTODO EXPERIMENTAL/PROCEDIMENTO
1. Limpar a cabine de segurança biológica com álcool 70 %, colocar os equipamentos e vidrarias

dentro, e ligar a luz ultravioleta por 15 minutos.
2. Separar um número de microtubos de 200 µL de acordo com a quantidade de amostras a ser
analisas e identifica-los, deixando um para ser o controle negativo.
3. Em um microtubo de 1,5 mL, preparar o mix para a quantidade total de amostras, adicionando:
3.1. 12,5 µL de SuperMix por amostra, para 6 amostras, colocar 75 µL;
3.2. 8,5 µL de água free nuclease, para 6 amostras, colocar 51 µL;
3.3. 1 µL do primer PC03 (forward), para 6 amostras, colocar 6 µL;
3.4. 1 µL do primer PC04 (reverse), para 6 amostras, colocar 6 µL;
4. Homogeneizar o mix e distribuir 23 µL nos 6 microtubos de 200 µL.
5. Retirar os tubos da cabine de segurança biológica, e adicionar 2 µL das amostras de DNA humano
e cada tubo. Deixar um tubo como controle negativo, contendo apenas o mix.
6. Colocar as amostras no termociclador com o programa:
6.1. Desnaturação inicial: 95ºC por 4 minutos;
6.2. 40 Ciclos de:
Desnaturação: 95ºC por 1 minuto;
Hibridização: 50ºC por 1 minuto;
Extensão : 72ºC por 1 minuto;
6.3. Extensão final: 72ºC por 5 minutos.
* Equipamentos de uso coletivo da turma.
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Antes de imprimir, pense na Natureza.
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CURSO: Biomedicina e Farmácia Aprovação:
Diretoria Acadêmica
DISCIPLINA: Biologia Molecular
Ser Educacional
ELABORADO POR: DATA: Revisão:
Valeska Santana de Sena Pereira 20/11/2017 00
PREPARO DOS REAGENTES E SOLUÇÕES

PRIMERS:
Primer PC03 (forward) d(ACACAACTGTGTTCACTAGC)
Primer PC04 (reverse) d(CAACTTCATCCACGTTCACC)
Produto de amplificação: 110 pb.
Preparar solução estoque de 100 pmol / µL, em água deionizada, de acordo com a concentração de
cada primer.
DNA:
Diluir em 1:20 ou 1:50, de acordo com a quantidade de DNA extraído.
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PROTOCOLO DE AULA PRÁTICA LAB-PAP-XX

 Realizar a amplificação de um segmento de DNA pela técnica de PCR.

 Identificar os componentes necessários para a reação de PCR.

1. Limpar a cabine de segurança biológica com álcool 70 %, colocar os equipamentos e vidrarias

* Equipamentos de uso coletivo da turma.

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