Relatório 6 Bioquímica

Universidade Estadual de Campinas
FEA-Faculdade de Engenharia de Alimentos
TA 514 - Bioquímica de Alimentos

Turma A
Estudo da Termoestabilidade de uma Enzima
Alessandra Sayuri de Almeida Silva (073860)

Isabela Jorge Trad (074108)
Grupo 10
Hélia Harumi Sato
Campinas, 4 de Maio 2009

1 INTRODUÇÃO
Em geral as enzimas são mais estáveis em temperatura baixa. Existem poucas enzimas
que são mais instáveis a 0-10oC que a 20-30oC, devido aos tipos de ligações que unem as
subunidades. Há também grande diferença entre enzimas e sua susceptibilidade ao calor.
As enzimas termoestáveis já têm sido usadas como ferramenta para a Biologia
Molecular (Taq polimerase), como aditivo de detergentes e sabões (proteases e celulases) e na
indústria de polpa e papel (xilanase) e surgem como alternativas de interesse em outros
bioprocessos, como o de síntese orgânica (lipases, proteases, oxidorredutases), no setor de
diagnóstico e no tratamento de resíduos [1]. Na indústria de alimentos, as amilases são
empregadas na liquefação e sacarificação do amido para a obtenção de glicose, em produtos
de panificação, em cervejarias e bebidas fermentadas, em cereais para alimentação infantil
como também são aplicadas na ração animal [8]. SPIER et al (2004) também relatam vários
exemplos da utilização das enzimas amilolíticas com o objetivo de modificar matérias-primas
amiláceas e/ou obter produtos específicos, destacando-se os usos na indústria de alimentos
(modificação de farinhas utilizadas em panificação, na modificação enzimática de materiais
amiláceos para a obtenção de açúcares, na fabricação de bebidas (fermentadas), na etapa de
degomagem na indústria têxtil, na indústria de papel, na indústria química e farmacêutica
além de seu emprego na indústria de ração animal.
SZAKACS (2004) relata que as enzimas microbianas também são aplicadas na
indústria de alimentos, em sabão em pó e detergentes, na fabricação de papel e tecidos, em
sínteses orgânicas, diagnósticos e outros.
As enzimas termoestáveis, de maneira geral, apresentam vantagens para a aplicação na
indústria, visto que processos biotecnológicos conduzidos em elevadas temperaturas têm o
risco de contaminação por microrganismos mesófilos, que são a maioria em um ambiente
industrial, significativamente reduzido [1].
A maioria dos processamentos industriais do amido envolve a hidrólise desse
polímero. Os chamados "hidrolisados de amido" englobam todos os produtos resultantes do
fracionamento do amido, independentemente do catalisador ou do grau de fracionamento. São
incluídos nesta denominação diferentes tipos de produtos, como xaropes de glicose, maltose,
frutose, maltotetrose, dextrinas e ciclodextrinas. A composição de um hidrolisado que se
deseja obter é definida em função do direcionamento da aplicação do mesmo. Cada tipo de
xarope requer, portanto, diferentes combinações de enzimas amilolíticas [1].
Durante muito tempo, o amido foi hidrolisado quimicamente, por ação de ácidos. Esse
processo, no entanto, gerava subprodutos indesejáveis, como compostos coloridos ou de
"flavor", além de dificultar o controle dos teores dos produtos finais. Nos últimos 30 anos, as
amilases substituíram o tratamento ácido [1].
Aα -amilase termoestável de Bacillus licheniformis ou de Bacillus stearothermophilus
hidrolisa parcialmente as ligações α -1,4, liberando maltodextrinas, com redução acentuada
da viscosidade [1].
As condições de pH e temperatura do processamento dos xaropes foram definidas de
modo a evitar subprodutos indesejáveis e, principalmente, levando em consideração
condições ótimas de atividade e de estabilidade das enzimas [1].
2 OBJETIVOS
Determinar a termoestabilidade da α -amilase fúngica (Aspergillus oryzae) e α -amilase

bacteriana (Bacillus liquiniformes).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Materiais:
3.2 Métodos:
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Resultados
A Tabela 1 apresenta os resultados obtidos pela leitura no espectrofotômetro II das

absorbâncias das amostras dos tubos teste e do tubo controle.
Tabela 1. Absorbância a 620nm para a-amilase bacteriana
Temperatura (oC) Abs 620nm

Sem tratamento 0,022
30 0,015
50 0,031
60 0,014
70 0,016
80 0,043
Ebulição 0,402
Controle 0,604
Como uma unidade de atividade é a diminuição de 0,001 da absorbância por minuto

por mL da enzima α -amilase, utilizou-se a seguinte fórmula para calcular os valores de
atividade enzimática em U/mL.
Ativ.(U/mL) = _______∆ Abs__________ x 103

(5min) x (Volume enzima)
Onde ∆ Abs é a diferença entre os valores de Abs do tubo controle e da amostra dos
tubos teste e:
Volume de enzima = (0,2mL) x 1 = 4,76 x 10-5 mL de enzima para α -amilase bacteriana

4200
Volume de enzima = (0,2mL) . (5 x 10-3mL) = 5 x 10-6mL de enzima para α -amilase

fúngica
200mL
A atividade relativa foi calculada em relação ao maior valor de atividade enzimática

que assume o valor de 100%. Os outros valores são proporcionais a este.
Assim, se obtém a Tabela 2 abaixo, que apresenta os valores calculados de unidade de
atividade e atividade relativa da enzima α -amilase bacteriana.
Tabela 2. Efeito da temperatura na atividade da α -amilase bacteriana
Unidade de
Temperatura % de Atividade
Atividade de a-
(oC) Residual
amilase (U/mL)
Sem tratamento 2444400 98,64
30 2473800 99,83
50 2406600 97,12
60 2478000 100,00
70 2469600 99,66
80 2356200 95,08
Ebulição 848400 34,24
Controle 0 0,00
Para efeito de comparação, tem-se abaixo a Tabela 3, com os dados adquiridos do

Grupo 7, que trabalhou com a α -amilase fúngica.
Tabela 3. Efeito da temperatura na atividade da α -amilase fúngica
Unidade de
% de
Temperatura Abs Atividade de
Atividade
(oC) 620nm α -amilase
Residual
(U/mL)
Sem
tratamento 0,036 24240000 98,54
30 0,031 24440000 99,35
50 0,027 24600000 100,00
60 0,121 20840000 84,72
70 0,510 5280000 21,46
80 0,558 3360000 13,66
Ebulição 0,582 2400000 9,76
Controle 0,642 0 0,00
A partir dos dados das Tabelas 2 e 3, é possível construir o Gráfico 1, de % de

atividade residual x temperatura.
Gráfico 1. Atividade Residual x Temperatura

4.2 Discussões
Segundo a literatura, a enzima α -amilase bacteriana tem alta termoestabilidade a

partir de 40oC, sendo ótima a 70oC. Em aula prática, obteve-se termoestabilidade na faixa de
25 a 70oC, sendo ótima na faixa de 60 a 70oC, de acordo com o esperado.
A enzima α -amilase fúngica possui termoestabilidade na faixa de 55 a 70oC, a partir
disso, sua atividade diminui muito, tendendo a zero. Em aula prática, o Grupo 7 obteve
termoestabilidade na faixa de 25 a 50oC e queda brusca na atividade residual a partir de 60oC.
Essa pequena alteração pode ter ocorrido devido a erros experimentais.
Miller et al (1953) estudaram a estabilidade da enzima com o aumento da temperatura
até 80ºC. As amilases fúngicas perderam sua atividade e em 80ºC somente alcançou 1% de
sua atividade, enquanto nessa mesma temperatura, as amilases bacterianas preservaram 92%
de sua atividade.
As α -amilases atuam na hidrólise das moléculas do amido, decompondo-o em resíduos
de glicose. Essas enzimas são produzidas por diversos fungos, bactérias e vegetais.
Dentre os microorganismos, destaca-se o Bacillus subtilis por produzir enzimas
termoestáveis que permitem a sacarificação em temperaturas elevadas, o que acelera o
processo e minimiza a ação de possíveis contaminantes (BEZERRA et al, 2004).
Amilases fúngicas normalmente obtidas a partir de Aspergillus oryzae, Asprgillus
niger, Aspergillus awamori ou espécies de Rhizophus têm sido utilizadas como suplemento na
atividade amilolítica. Enzimas desta origem têm como finalidade o aumento dos níveis de
monossacarídeos e dissacarídeos fermentáveis, promovendo uma melhor condição ao
fermento (NAGODA WITHANA; REED, 1993).
A α -amilase de Bacillus licheniformis é uma enzima termoestável. Estas enzimas, de
maneira geral, apresentam vantagens para a aplicação na indústria, visto que processos
biotecnológicos conduzidos em elevadas temperaturas têm o risco de contaminação por
microorganismos mesófilos, que são a maioria em um ambiente industrial, significativamente
reduzido (GOMES et al, 2005).
5 CONCLUSÃO
Pela aula prática os objetivos foram alcançados, comprovando que a α -amilase

bacteriana é mais termoestável que a α -amilase fúngica.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1- GOMES, E.; Guez, M. A. U.; MARTIN, N.; SILVA, R. Enzimas termoestáveis: fontes,
produção e aplicação industrial, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas,
Universidade Estadual Paulista - São José do Rio Preto – SP, 2007. Disponível em:
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-40422007000100025&script=sci_arttext
Acessado em: 30/04/2009.
2- BEZERRA, R. P.; BORBA, F. K. S. L.; MOREIRA, K. A.; LIMA J. L.; PORTO A. L. F.;
CHAVES A. C., Extração líquido-líquido da amilase produzida pelo Bacillus Subtilis no
sistema de duas fases aquosas, Instituto de Ciências Biológicas - UPE, Recife – PE, 2004.
3- GOMES, E.; GUEZ, M. A. U.; MARTIN, N.; SILVA, R., Enzimas termoestáveis:
fontes, produção e aplicação industrial, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas,
Universidade Estadual Paulista, 2005.
4- NAGODAWITHANA, T.; REED, G., Enzymes in Food Processing. 3 ed. Academic

Press Inc., 1993;
5- UFPR – Universidade Federal do Paraná - Efeito da Temperatura na Cinética de
Crescimento de rhizopus oryzae em Cultivo no Estado Sólido. Disponível em:
http://dspace.c3sl.ufpr.br/dspace/bitstream/1884/2803/1/TESE.pdf Acesso em: 23/04/2009
6- USP – Universidade de São Paulo – Enzimas em alimento. Disponível em:

http://www.fcf.usp.br/Ensino/Graduacao/Disciplinas/Exclusivo/Inserir/Anexos/LinkAnexos/T
exto%20sobre%20Enzimas%20em%20Alimentos.htm Acesso em: 23/04/2009
7- Slides de aula da Profa Hélia Harumi Sato
8- SPIER, M. R.; Produção de enzimas amilolíticas fúngicas a-amilase e amiloglucosidase

por fermentação no estado sólido, Universidade Federal do Paraná, 2005. Disponível em:
http://dspace.c3sl.ufpr.br/dspace/bitstream/1884/4684/1/Disserta%C3%A7%C3%A3o%20de
%20Mestrado%20-%20Michele%20Rigon%20Spier.pdf Acessado em: 30/04/2009.
9- SPIER, M.R. ; WOICIECHOWSKI, A. L. ; SOCCOL, C. R. Produção de α-Amilase por

Aspergillus em Fermentação no Estado Sólido de Amido de Mandioca e Bagaço de
Cana-de-Açúcar. VI SEMINÁRIO BRASILEIRO DE TECNOLOGIA ENZIMÁTICA.
Anais Enzitec 2004. Rio de Janeiro
10- SZAKACS, G. Production of Industrial Enzymes in Solid-State Fermentation. In:

Anais International Congress on Bioprocess in Food Industries, Clermont-Ferrand, France.
2004. v. 1. p. 20
11- REED, G. Enzymes in Food Processing. 2.ed. New York: Academic Press Inc., 1975. p.
62-87.

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Hélia Harumi Sato

Campinas, 4 de Maio 2009

Determinar a termoestabilidade da α -amilase fúngica (Aspergillus oryzae) e α -amilase

A Tabela 1 apresenta os resultados obtidos pela leitura no espectrofotômetro II das

Temperatura (oC) Abs 620nm

Como uma unidade de atividade é a diminuição de 0,001 da absorbância por minuto

Ativ.(U/mL) = _______∆ Abs__________ x 103

Volume de enzima = (0,2mL) x 1 = 4,76 x 10-5 mL de enzima para α -amilase bacteriana

Volume de enzima = (0,2mL) . (5 x 10-3mL) = 5 x 10-6mL de enzima para α -amilase

A atividade relativa foi calculada em relação ao maior valor de atividade enzimática

Para efeito de comparação, tem-se abaixo a Tabela 3, com os dados adquiridos do

A partir dos dados das Tabelas 2 e 3, é possível construir o Gráfico 1, de % de

Gráfico 1. Atividade Residual x Temperatura

Segundo a literatura, a enzima α -amilase bacteriana tem alta termoestabilidade a

Pela aula prática os objetivos foram alcançados, comprovando que a α -amilase

4- NAGODAWITHANA, T.; REED, G., Enzymes in Food Processing. 3 ed. Academic

6- USP – Universidade de São Paulo – Enzimas em alimento. Disponível em:

7- Slides de aula da Profa Hélia Harumi Sato

8- SPIER, M. R.; Produção de enzimas amilolíticas fúngicas a-amilase e amiloglucosidase

9- SPIER, M.R. ; WOICIECHOWSKI, A. L. ; SOCCOL, C. R. Produção de α-Amilase por

10- SZAKACS, G. Production of Industrial Enzymes in Solid-State Fermentation. In:

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